Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка молекулярно-биологических методов диагностики реовирусной инфекции кур и изучение изолятов, выявленных на территории Российской Федерации
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология
Автореферат диссертации по теме "Разработка молекулярно-биологических методов диагностики реовирусной инфекции кур и изучение изолятов, выявленных на территории Российской Федерации"
на правах рукописи
АНДРЕЙЧУК Дмитрий Борисович
РАЗРАБОТКА МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ РЕОВИРУСНОИ ИНФЕКЦИИ КУР И ИЗУЧЕНИЕ ИЗОЛЯТОВ, ВЫЯВЛЕННЫХ НА ТЕРРИТОРИИ РОССИЙСКОЙ
ФЕДЕРАЦИИ
03.00.06 «Вирусология»
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Владимир - 2005
Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Федеральный центр охраны здоровья животных»
Научный руководитель: кандидат биологических наук,
старший научный сотрудник
Дрыгин Владимир Викторович
Официальные оппоненты:
- Пономарев Алексей Петрович, доктор биологических наук, старший научный сотрудник ФГУ ВНИИЗЖ (г. Владимир),
- Зуев Юрий Вячеславович, кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник ВГНКИ (г. Москва).
Ведущая организация - Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВПИИВВиМ, Россельхозакадемии, г. Покров).
Зашита диссертации состоится« » ИН'Ки,- 2005 г. в IV часов на
заседании диссертационного совета 220.015.01 в ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» по адресу: 600901, г. Владимир, п. Юрьевец С диссертацией можно ознакомится в библиотеке ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»
Автореферат разослан « У » 2005
г.
Ученый секретарь диссертационного совета,
Семенова Г.М.
1. Общая характеристика работы
Актуальность темы. Реовирусная инфекция широко распространена в стадах коммерческой птицы (куры-несушки и бройлеры) в птицеводческих хозяйствах разных стран мира. Патогенные штаммы реовируса кур (род Orthoreovirus, сем. Reoviridae), как правило, ассоциированы с хроническими заболеваниями, экономическое значение среди которых имеют теносиновит и малабсорбционный синдром. В некоторых случаях уменьшение прибыли при реовирусных инфекциях достигало 20% [van Loon A.A., 2002].
Диагностика реовирусных заболеваний осложняется тем, что патолого-анатомические и клинические признаки не являются специфическими для реовирусной инфекции и могут вызываться другими патологическими агентами (Mycoplasma synoviae, Staphylococcus aureus, E. coli, некоторые виды Eimeria). Применение комплекса молекулярно-биологических методов (обратная транскрипция, полимеразная цепная реакция, секвенирование кДНК) дает возможность провести быстрое выявление генома, дифференциацию и генотипирование изолятов реовируса кур. Спектр возможных коинфектантов, усиливающих патологические изменения при реовирусных инфекциях, также может быть выявлен с помощью ПНР.
К настоящему времени проведены исследования фрагментов генома штаммов реовируса кур, выделенных на территории США, Тайваня, Японии, Австралии и Европейских стран [Jones R.C., 2000; Liu H.J., et al. 2003]. Последовательности этих фрагментов представлены в базе данных GenBank. Однако, молекулярно-биологические исследования изолятов, выявленных на территории России, ранее не проводились.
Вместе с тем, по результатам серологического мониторинга, проведенного в 2000-2002 гг. в ФГУ ВНИИЗЖ (г.Владимир) А.И. Куприяновым и В.И. Шкирей, установлено, что реовирус широко распространен в птицеводческих хозяйствах на территории РФ. У невакцинированных кур-несушек и бройлеров повсеместно регистрировали специфические антитела к реовирусу.
Таким образом, выявление и изучение изолятов реовируса кур на территории РФ является в настоящее время актуальной задачей.
Цель и задачи исследования. Главная цель исследований состояла в разработке методов выявления и дифференциации изолятов реовируса кур с помощью ОТ-ПЦР, нуклеотидного секвенирования амплифицированных фрагментов, а также генетической характеристике выявленных на территории Российской Федерации изолятов реовируса кур.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
разработать ПЦР-методы выявления реовируса кур в различных вируссодержащих образцах;
определить распространение реовируса кур в птицеводческих хозяйствах Российской Федерации;
оптимизировать молекулярно-биологические методы для дифференциации выявленных изолятов реовируса кур; провести анализ нуклеотидной последовательности участков высоковариабельных генов выявленных изолятов; - создать банк нуклеотидных последовательностей участков генома выявленных изолятов реовируса кур.
Научная новизна исследования. Разработаны методы индикации генома реовируса кур на основе ОТ-ПЦР фрагментов генов S1 и S3.
Разработаны методы дифференциации выявленных изолятов реовируса кур на основе секвенирования амплифицированных в ОТ-ПЦР кДНК фрагментов генома.
Проведено генотипирование и определен спектр генотипических групп выявленных изолятов, циркулирующих на территории Европейской части РФ.
Создан банк нуклеотидных последовательностей участков генов S1 и S3 выявленных изолятов.
Практическая значимость исследования. Разработаны следующие методики индикации и дифференциации изолятов реовируса кур: «Методика индикации генома птичьего ортореовируса с использованием полимеразной цепной реакции» (2000г.), «Методика индикации генома и дифференциации штаммов и изолятов птичьего ортореовируса с использованием полимеразной цепной реакции» (2002г.), «Методические указания по выделению, титрованию и идентификации авиреовирусов птиц» (2002г.). Данные методики и методические указания одобрены ученым советом, утверждены директором ФГУ ВНИИЗЖ и рекомендованы для использования в практике.
Предложенные методики позволили выявить геном реовируса кур в различных вируссодержащих образцах. С помощью указанных методик проведен анализ участков генов S1 и S3 у 61-го изолята, выявленного на территории РФ в 1999-2004 г.г., 5-и изолятов, выделенных на территории Италии в 1998 г., референтного штамма Fachey-Crowley и вакцинного штамма ВНИВИП-РЕО.
Создан банк нуклеотидных последовательностей участков генома изолятов реовируса кур, который используется для генотипирования и дифференциации вновь выявляемых изолятов.
Положения, выносимые на защиту:
1. Метод выявления реовируса кур с помощью ОТ-ПЦР.
2. Результаты выявления реовируса кур с помощью ОТ-ПЦР в пробах
патологического материала, полученного из птицеводческих хозяйств
центрального федерального округа РФ.
3. Методы генетической дифференциации изолятов реовируса кур.
4. Банк данных нуклеотидных последовательностей фрагментов генов S3 и S1 изолятов реовируса кур, выявленных в 1999-2004 г.г. на территории РФ.
5. Результаты анализа нуклеотидных последовательностей фрагментов генов S3 и S1 изолятов реовируса кур, выявленных в 1999-2004 г.г. на территории РФ.
Исследования по диссертационной работе выполнены в 1999-2004 г.г. в ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (г. Владимир).
Публикация научных работ. По теме диссертации опубликовано 6 научных работ.
Апробация работы. По основным результатам диссертации представлены доклады на Всероссийской научно - практической конференции молодых ученых «Достижения молодых ученых в ветеринарную практику» (Владимир, 2000г.), Международной научно -практической конференции «Современные проблемы селекции, ветеринарной генетики и зашиты животных от болезней» (Витебск, 2001 г.), V Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (Москва, 2004 г.).
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 177 страницах
и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы, практические предложения, список литературы, приложения. Список литературы включает 188 источников. Работа иллюстрирована 27 рисунками и 28 таблицами.
Автор выражает особую благодарность сотрудникам ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» к.б.н. Батченко Г.В. и к.б.н. Колосову С.Н. за оказанную помощь при выполнении данной работы.
2. Собственные исследования 2.1. Материалы и методы
Вирусы. В работе использовали штаммы реовируса кур S1133, Fachey-Crowley, ВНИВИП-РЕО, пять изолятов, выделенных на территории Италии и любезно предоставленых док. Дж. Тоззи (IZSLE, г. Брешиа, Италия), 151 проба патологического материала от больной птицы из разных птицеводческих хозяйств РФ.
Вакцинный штамм вируса инфекционной бурсальной болезни Winterfield-2512.
Микоплазмы. Референтный штамм WVU-1853 Mycoplasma synoviae.
Реактивы. В работе были использованы реактивы фирм Promega, Fluka, Sigma и отечественные реактивы марки «о.с.ч.».
Методы.
Расчет праймеров выполнялся с помощью программы Oligo (v.3.3).
Выделение суммарной нуклеиновой кислоты из патологического материала проводили с помощью коммерческого набора с сорбентом NucleoS+™ (Биоком, Москва). Перед выделением нуклеиновой кислоты к 100 мкл суспензии патологического материала добавляли 10 мкл препарата вакцинного штамма ВИББ Winterfield-2512 (104 ТЦД50/мл).
Обратную транскрипцию проводили при 53°С (20 мин.). ПЦР проводили в две стадии (первая амплификация и вторая «гнездовая» амплификация) согласно общей схеме для всех прехтоженных систем праймеров: 1 стадия - 35 циклов, с параметрами цикла - 94°С (30 с), 55°С (30 с), 72°С (30 с), 2 стадия - 25 циклов, с параметрами цикла - 94°С (30 с), 55°С (30 с), 72°С (30 с). При постановке первой стадии ПЦР температура отжига пар праймеров в системах РК^3Б-ВКО и PK-S1 была 57°С. При постановке первой и второй стадий ПЦР длительность элонгации в системе PK-S1 составляла 120 и 60 с, соответственно.
Очистку продуктов реакции проводили или с помощью набора «Wizard PCR-Preps DNA Purification System» (Promega).
Реакцию секвеннрования проводили с использованием радиоактивно-меченого дАТФ с помощью набора "fmol DNA Cycle Sequencing System" (Promega).
Клонирование фрагментов гена S1 проводили с использованием набора "pGEM-T Easy Vector System" (Promega).
Для анализа нуклеотидных последовательностей использовали пакеты прикладных программ BioEdit [v.5.0.6., 6.0.6.(2001 -2004г)], DNASIS-MAX[v.l.01,1999r.]
Для определения подвижности гетеродуплексов кДНК ПЦР-ампликонов смешивали по 4 мкл от 2 проб со второй стадии ПЦР (система РК^ЗБ), нагревали смесь при 95°С в течение 5 минут, быстро охлаждали при 0°С и выдерживали при 4°С - 30 минут. Электрофорез охлажденной смеси проводился в 5% полиакриламидном геле в аппарате Thermo EC-120 Mini Vertical Gel System (Bio-Rad) с буферной системой ТВЕ. Гель документировали с помощью видеосистемы DNA Analyzer. Значение относительной подвижности гетеродуплексов рассчитывали по формуле:
- (migration) относительная подвижность гетеродуплексов, - расстояние от дна кармана геля до фракции гетеродуплексов, -расстояние от дна кармана до фракции гомодуплексов. Результаты анализировали с помощью пакета программ Statistica (v.4.3,1993 г.).
Выделение изолятов РК проводили в куриных SPF-эмбрионах (КЭ) заражением в желточный мешок и в культуре фибробластов куриного SPF-эмбриона (КФКЭ). Наличие реовируса кур в пассированных пробах подтверждалось в реакции диффузионной преципитации с антисывороткой на штамм S1133 реовируса кур, электронномикроскопически с помощью микроскопа JEM-100CX (Jeol, Япония), с помощью ПЦР с системой праймеров PK-S3E на ген S3 реовируса кур.
2.2. Результаты исследований
Выбор праймеров для амплификации участков сегментов 81 и 83 генома РК. По последовательностям двух сегментов генома реовирусов птиц - 83 и 81 выбраны праймеры, фланкирующие вариабельные области (рис.1).
Праймеры были оптимизированы по температуре отжига. Выбранные праймеры использованы в трех ОТ-ПЦР системах: РК-83А (пары праймеров на ген 83 Р8-Я486 (1 стадия ПЦР), Р40-Я442 (2 стадияПЦР)), РК-83Б (пары праймеров на ген 83 Р559-Я928 (1 стадия), Р634-Я878 (2 стадия)) и РК-81 (пары праймеров на ген 81 Р302-Я1608 (1 стадия), Р648-Я1584, Р672-Я1584 (2 стадия)).
Рис.1 Расположение праймеров на последовательности генов S3 (А) и S1
(Б).
Позиции нуклеотидов обозначены цифрами над шкалой. Границы генов обозначены буквой 8. Направление синтеза кДНК с праймера показано стрелками.
Для ПЦР-индикации генома М. 8упах1ав, как наиболее вероятного сопутствующего патологического агента при вирусном теносиновите, использовали праймеры на ген 1б8 рРНК, предложенные Раиегшап Ь.И. и др. в 1993 году.
Для оценки влияния факторов, снижающих эффективность ОТ-ПЦР была предложена оригинальная система внутреннего контрольного образца (ВКО), включающая в себя тест-объект, вводимый в пробу перед выделением
нуклеиновой кислоты, и пару праймеров, амплифицирующих участок генома тест-объекта. В качестве тест-объекта ВКО был выбран шт. ШмвфвШ 2512 вируса инфекционной бурсальной болезни (ВИББ). Вирус инфекционной бурсальной болезни обладает высокой устойчивостью при хранении и многократном размораживании, что делает его перспективным для применения в качестве тест-объекта. К тому же одинаковая структура геномной РЖ реовируса и ВИББ создает оптимальные условия для контроля обратной транскрипции генома реовируса. Объем вводимого в пробу препарата ВИББ составлял 1/10 от объема пробы. Титр ВИББ в исходном препарате - 104 ТЦДи/мл. С помощью пары праймеров, выбранной по последовательности гена УР-1 ВИББ, амплифицировался участок гена величиной 551 п.н. в первой стадии ПНР. Праймеры для амплификации участка гена ВКО включены в реакционную смесь первой стадии ПЦР с системой праймеров РК-83Б (вариант РК-83Б-БКО). При положительном результате амплифицировалась кДНК реовируса и внутреннего контрольного образца. При отрицательном результате амплифицировалась только кДНК ВКО. При ложноотрицательном результате не амплифицировалась ни кДНК ВКО. ни кДНК реовируса.
Максимальная аналитическая чувствительность ОТ-ПЦР достигалась при использовании системы РК-83Б: положительный результат получали при разведении исходного вируссодержащего препарата (штамм 81133 с инфекционным титром 107 ТЦЩо/мл ) до 1:10 при постановке первой реакции и до 1:108 при постановке второй реакции. Наименьшая аналитическая чувствительность была при использовании системы РК-81 (1:10" в первой ПЦР и 1:105 во второй ПЦР). Система ОТ-ПЦР РК-83А занимала промежуточное положение по аналитической чувствительности.
Мы исследовали относительную диагностическую чувствительность предложенных систем ОТ-ПЦР, то есть количество положительных проб, выявленных при использовании каждой системы в анализе 17-и препаратов пассированных изолятов реовируса кур. Двенадцать изолятов были выделены
нами из патологического материала, поступившего из птицефабрик РФ. Пять изолятов реовируса кур выделены на территории Италии и предоставлены Институтом зоопрофолактики (IZSLE, г. Брешиа, Италия). С помощью системы PK-S3Б получены положительные результаты с пробами всех данных изолятов. С помощью систем PK-S3A и PK-S1 выявлялось 16 и 10 изолятов соответственно. Поэтому для диагностических целей с 2002 года использовалась только система PK-S3Б.
Исследование патологического материала. Нами были исследованы пробы патологического материала (ткани скакательного сустава, печени, почек, кишечника, легких, селезенки) от птицы с клиническими признаками и патол ого-анатомическими изменениями, характерными для теносиновита, энтерита, гепатита и респираторных заболеваний. При исследовании проб патологического материала максимальное количество изолятов было выявлено с использованием системы праймеров PK-S3Б. Наиболее низкая диагностическая чувствительность системы PK-S1 была подтверждена при сравнении результатов тестирования материала, поступившего в 2001-2002 годах, - реовирус кур был выявлен в 40% проб, положительных с системой PK-S3Б. За этот промежуток времени системой праймеров PK-S3A реовирус не был выявлен в 3 пробах, положительных с системой PK-S3Б.
При исследовании проб патологического материала в течение 2003 года с помощью системы S3Б с внутренним контрольным образцом, были получены 2 ложноотрицательных результата (9% исследованных в 2003 году проб), что не выходит за пределы ожидаемой частоты ложноотрицательных результатов - от 1 до 18 % от общего количества проб [Rosenstraus M., 1998]. После десятикратного разбавления ложноотрицательной пробы буфером, последующей однократной экстракции хлороформом перед выделением РНК и повторной постановкой ОТ-ПЦР, ложноотрицательных результатов отмечено не было.
При исследовании 151 пробы патологического материала, поступившего из 103 птицеводческих хозяйств 44 регионов РФ, геном
реовируса кур выявлялся в 84 пробах из 58 прицеводческих хозяйств 31 региона РФ.
Наибольшее число случаев реовирусной инфекции было ассоциировано с развитием теносиновита (45 случаев). Теносиновит без сопутствующих патолого-анатомических изменений в органах брюшной полости и респираторном тракте наблюдался достаточно редко (7 случаев) и только у кур-несушек. Гораздо чаще теносиновит сопровождался патолого-анатомическими изменениями в пищеварительном и респираторном трактах, печени, почках, перикарде и бурсе (38 случаев). В 39 случаях при выявлении реовируса теносиновит не наблюдался. При этом отмечались энтериты, нефриты и гепатиты.
Проведенные исследования подтвердили ранее установленные факты [Jones R.C., 2000] возрастной резистентности кур к реовирусной инфекции: у кур младших возрастов теносиновит встречался гораздо чаще, чем в более старшем возрасте. При этом, у несушек до наступления периода яйцекладки развивалась лишь легкая форма теносиновита. У бройлеров наблюдались все формы теносиновита, однако, легкая форма встречалась наиболее часто.
При анализе полученных нами результатов комплексного ПЦР-исследования в 78% проб, положительных на реовирус кур, выявлены ассоциированные с реовирусом патологические агенты. Наиболее часто вместе с реовирусом выявлялись Mycoplasma synoviae (38% случаев), М. gallisepticum (32% случаев) и вирус инфекционного бронхита кур (32% случаев).
Результаты наших исследований также подтверждают важную роль ассоциированной инфекции М. synoviae и реовируса в развитии тяжелых патолого-анатомических изменений теносиновита. Легкая форма теносиновита (20 случаев) характерная для младшего возраста птицы, как правило, не сопровождалась инфекцией М. synoviae (5 случаев коинфицирования), тогда как при тяжелых формах теносиновита (25 случаев) зарегистрировано 12 случаев коинфекции М. synoviae.
В 13% случаев от общего числа исследованных проб теносиновит был связан с инфекцией M.synoviae при отсутствии других инфицирующих агентов. У 23% поступившей на исследование птицы не выявлено ни M.synoviae, ни реовируса. Возможно, что артрит/теносиновит в этих случаях был вызван инфекционными агентами бактериальной природы, поскольку в 42% этих случаев зарегистрирован колибактериоз. Ранее было показано, что Staphylococcus aureus или Е. coli также являются возбудителями артрита/теносиновита (Jones R.C., 2000, McNamee P.T. et al, 2000).
Анализ последовательностей участков генов S1 и S3 выявленных изолятов. Вариабельность фрагментов генов S1 и S3. Анализировались последовательности кДНК фрагментов генов S1 и S3 реовируса кур, полученные в системах ОТ-ПЦР PK-S3A, PK-S3B (PK-S3B-BKO), PK-S1. Установлено, что вариабельность фрагментов кДНК гена S1 выявленных изолятов гораздо выше, чем кДНК фрагментов гена S3.
Максимальный уровень нуклеотидных отличий составлял 59,4%. Количество синонимических замен в последовательностях 5'-фрагментов кДНК гена S1 было примерно одинаковым с количеством значимых замен.
При анализе последовательностей кДНК фрагментов S3A и S3Б большинство замен (70-80%) являлись синонимическими. Максимальные отличия последовательностей кДНК ампликонов S3A и S3Б имеют близкие значения и составляют 21,4 и 24,3%, соответственно.
Сравнительный анализ полных последовательностей гена S1 трех выявленных изолятов реовируса кур. С помощью праймеров S1-F302 и S1-R1608 методом прямого секвенирования амплифицированных кДНК были полностью отсеквенированы ампликоны изолятов 04/02, 07/02, 10/02, выявленных в 2002 году. Размер гена у всех трех изолятов оказался одинаковый - 975 н., меньше на один триплет гена S1 штаммов, выделенных на территории США, Тайваня, Японии, Германии и Нидерландов (978 н.). При анализе аминокислотной последовательности белка сигма-С данных изолятов установлено относительно высокое сходство данного белка со
штаммами, представленными в ОепБапк, на участке пьедестального гидрофобного домена Т1 (1-30 а.к., 80-87% сходства с референтным штаммом 81133) и С-концевого апикального Н-домена прикрепления (200329 а.к., 50-64% сходства со штаммом 81133). В то время как вариабельность гидрофобных позиций хвостового домена (40-180 а.к.) была значительно выше. Однако, соблюдается консервативность 1 и 4 позиций гептадных повторов региона Т2, достаточных для сохранения тримерной суперспиральной структуры хвостового домена.
Таким образом, последовательность основных структурных регионов белка сигма-С данных изолятов значительно отличается от известных штаммов. Однако, основные элементы, поддерживающие характерную для данного белка реовируса кур вторичную структуру, сохраняют свою консервативность.
Дифференциация выявленных изолятов и вакцинного штамма 81133 с помощью секвенирования последовательностей кДНК участков 83А и 83Б.
Большинство выявленных изолятов при анализе участков гена 83 формируют несколько отдельных генетических групп. Закономерность между распределением изолятов на дендрограммах 83А и 83Б и датой их выявления отсутствует.
Последовательности кДНК фрагмента 83Б всех выявленных изолятов генетически отличались от вакцинного штамма 81133 на 8,5-19% (рис.2). Однако, при анализе последовательностей фрагмента 83А (рис.3) выявленные изоляты формировали две генетические группы - близкую к вакцинному штамму (0-1,5% отличий) и отличающуюся от него (11-15% отличий). Для уточнения генетических отличий некоторых изолятов, гомологичных штамму 81133 по участку 83 А, проведена двухстадийная амплификация кДНК участка гена 83 с гибридной системой праймеров 83-Р8, 83-Я928 (внешняя пара) и 83-Р40, 83-Я878 (внутренняя пара). При анализе ампликонов Р40-Я878 участки последовательностей,
комплементарные обратным праймерам S3-R442 и S3-R486 системы PK-S3A, содержали от 1 до 5 замен, что снижало сродство данных праймеров к фрагментам к ДНК полевого изолята по сравнению с штаммом S1133. Таким образом, более вероятен факт, что в исследуемых пробах присутствовал как полевой изолят с оригинальной структурой генома, так и изолят гомологичный вакцинному штамму S1133.
Анализ генетических групп, установленных при анализе 5'-концевого фрагмента гена S1 выявленных изолятов. Проведен сравнительный анализ последовательностей 5'-концевого участка гена S1 (150 п.н.) штаммов, представленных в GenBank, и изолятов, выявленных на территории РФ (Рис.4).
Среди известных штаммов реовируса кур наиболее представительна генетическая группа, близкая к штамму S1133, выделенному на территории США. В группу входят штаммы, циркулирующие на территории Тайваня, Японии, Германии и Нидерландов. Относительно обособлены группы европейских изолятов, не гомологичных вакцинному штамму S1133. Гетерогенность этих групп указывает на перекрестное распространение изолятов между птицеводческими хозяйствами разных европейских стран. Не исключено общее происхождение этих вирусов и их возможный занос при импорте коммерческой птицы.
Большинство выявленных на территории РФ изолятов формируют две отдельные генетические группы. Первая группа представлена изолятами, выявленными в 2000-2002 годах (05/00, 15/01, 04/01, 08/01, 12/01, 04/02, 10/02). Во вторую группу попадают изоляты 02/00а, 02/00Ь, 03/00, 01/02 02/02, 07/02, а так же 2 австралийских штамма (RAM-1, SOM-4), штамм GEL10-97M, выделенный на территории Германии и штаммы 1017-1 и 918, выделенные на территории Тайваня. Изоляты 01/00 и 16/01 попадают в группы зарубежных штаммов. Наличие генетически гомогенных и смешанных групп изолятов, выявленных на территории РФ, указывает на разные источники их происхождения.
Рис. 2 Дендрограмма, отражающая гомологию последовательностей участка S3Б (622-833 н.) гена S3 штаммов и изолятов реовируса кур, представленных в GenBank и выявленных на территории РФ (отмечены стрелкой « ^ »).
процент нуклеотндных отличий
Рис. 3 Дендрограмма, отражающая гомологию последовательностей участка S3A (61-375 н.) гена S3 штаммов и изолятов реовируса кур, представленных в GenBank и выявленных на территории РФ (отмечены стрелкой « С—1 »).
Рис. 4 Дендрограмма, отражающая гомологию нуклеотидных последовательностей 5'-концевого фрагмента (700-850 н.) гена S1 штаммов, представленных в GenBank и вылепленных на территории РФ изолятов реовируса кур (отмечены стрелкой
Сравнительный генетический анализ выявленных изолятов по последовательностям участков генов и ЯЗ. При сравнении последовательностей фрагментов Б3Б и установлено, что генетическая группировка некоторых изолятов по гену не совпадает с группировкой по гену Б3. При анализе фрагмента гена выделяются 3 группы наиболее генетически близких изолятов - 02/02 и 07/02 (6,8% отличий); 04/02, 15/01 (до 3% отличий); 05/00 и 08/01 (12% отличий). Однако, по гену Б3 уровень отличий этих изолятиов был гораздо выше. Так, изоляты 04/02.и 15/01 отличались на 2,9% по гену и 17,2% по гену Б3. Значительные отличия этих изолятов по гену Б3 и высокое сходство по гену можно объяснить коциркуляцией изолятов, принадлежащих к разным генетическим группам.
Штамм 138, выделенный на территории США, оказался близким по последовательности гена Б3 к выявленным изолятам. Однако, по гену он значительно отличался от этих изолятов и принадлежал к генетической группе штаммов, выделенных на территории США и Европы. В этом случае можно предположить факт реассортации предковых форм штамма 138 и выявленных изолятов по сегментам генома Б3 и Б1.
Генетический анализ изолятов, выявленных в одном птицеводческом хозяйстве. Установлен факт одновременной циркуляции двух разных изолятов у птицы, поступившей из одного цеха птицефабрики «Владимировская» Астраханской области. При секвенировании кДНК фрагментов гена изолята 02/00 выявлено большое количество локусов неспецифической терминации синтеза. Было проведено клонирование данного фрагмента в вектор рвЕМ-Т. При секвенировании 10 клонов было установлено, что популяция изолята 02/00 гетерогенна и представлена как минимум двумя субпопуляциями (02/00а и 02/00б), отличающимися по гену Б1на 21%.
С использованием системы РК-Б3Б проведен анализ проб, полученных от птицы из определенных птицеводческих хозяйств в разное время (рис.2). Для каждого птицеводческого хозяйства исследовались пробы, отобранные в
течение 1-2 лет. Пробы поступали с 1999 по 2003г.г. Было исследовано 8 птицефабрик Владимирской, Волгоградской, Вологодской, Курской, Нижегородской, Свердловской, Ярославской областей. Наибольшее количество изолятов было выявлено в пробах с птицефабрик Свердловской (3 изолята) и Ярославской (5 изолятов) областей.
В каждом случае формировалась группа близкородственных изолятов с уровнем внутригрупповых отличий, не превышающим 5%: изоляты 04/99 и 07/01 (Свердловская область), изоляты 03/99, 09/99, 08/01, 13/01 (Ярославская область), изоляты 14/99 и 11/01 (Вологодская область). Установленные факты могут являться подтверждением как длительной совместной персистенции изолятов, принадлежащих к одной генетической группе, так и появлением дериватов одного изолята на протяжении длительной циркуляции вируса в определенном хозяйстве.
Остальные изоляты принадлежали к разным генетическим группам. Изоляты с одной птицефабрики в этом случае отличались более, чем на 8%. В двух случаях изоляты с разных птицефабрик принадлежали к одной группе. Так, изолят 03/01 с птицефабрики Ярославской области, отличающийся от других изолятов данного птицехозяйства, принадлежал к группе изолятов, выявленных у птицы с птицефабрики Свердловской области (до 3% отличий). Изоляты 01/01 (птицефабрика Владимирской области) и 07/02 (птицефабрика Волгоградской области) также принадлежали к одной генетической группе (2% отличий).
В заключении можно отметить, что показанная нами возможность совместной персистенции изолятов и возникновения реассортантов значительно ускоряет темп изменчивости полевого вируса и появление изолятов с новыми биологическими свойствами.
Таким образом, в диагностической практике достаточно актуальны задачи по дифференциации и генетической характеристике полевых изолятов реовируса кур. Для этих целей в конце 1990-х годов предложены
молекулярно-биологические методы секвенирования и анализа подвижности рестрикционных фрагментов [Liu, H.J., et al., 1997, 1999; Lee L.H., et al., 1998], которые имеют ряд существенных недостатков, ограничивающих их широкое распространение - высокая стоимость оборудования для проведения секвенирования, использование радиоактивной метки в процессе ручного секвенирования; низкая точность анализа подвижности рестрикционных фрагментов и необходимость манипуляций с большим количеством рестриктаз.Для проведения быстрой дифференциации изолятов реовируса кур мы предложили отимизированный метод анализа подвижности гетеродуплексов кДНК (АПГ). Для дифференциации штаммов и изолятов реовируса кур этот метод ранее не применялся. Метод АПГ использовали для дифференциации штаммов вирусов болезни Ньюкастла, гриппа [Berinstein A. et al., 2001; Ellis J.S., Zambón M.C., 2001].
Дифференциация изолятов реовируса кур с помощью анализа подвижности гетеродуплексов кДНК. Анализ подвижности гетеродуплексов выгодно отличается простотой постановки и позволяет определить уровень нуклеотидных отличий кДНК двух разных ПЦР-ампликонов, не проводя секвенирование. Образующиеся при нагревании и быстром охлаждении гетеродуплексы кДНК смеси двух ПЦР-проб отделяются от гомодуплексов электрофорезом в полиакриламидном геле. Элекрофоретическая подвижность гетеродуплекса меньше подвижности гомодуплекса и обратно пропорциональна количеству нуклеотидных отличий в кДНК, составляющих гетеродуплекс. По фореграмме расчитывается относительная подвижность гетеродуплексов. При исследовании в АПГ изолятов с известной последовательностью участка генома можно вывести уравнение линейной регрессии, позволяющее определить уровень нуклеотидных отличий в парном сравнении изолятов по относительной подвижности гетеродуплексов.
При выполнении данной работы АПГ был оптимизирован для проведения анализа кДНК (263 п.н.), полученной с праймерами S3-F634 и S3-R878.
С помощью АПГ были проанализированы 3 изолята, выделенные на территории Италии (01/98ita, 02/98ita, 03/98ita), 2 изолята (14/01, 04/02), выделенные на территории РФ, референтный штамм Fachey- Crowley, вакцинный штамм S1133, а также вакцинный штамм ВНИВИП-РЕО, выделенный на территории РФ. Большинство исследованных изолятов и штаммов отличались друг от друга. При сравнении результатов анализа подвижности гетеродуплексов и секвенирования кДНК уровень отличий последовательностей, установленный этими методами, был сопоставим в интервале от 5,7 до 18% (табл.1).
Таблица 1
Результаты сравнения подвижности гетеродуплексов и уровня
нуклеотидных отличий кДНК штаммов и изолятов реовируса кур.
№ Проба (парные Относительная Нуклеотидные Прогнозирован
комбинации подвижность отличия (%), по ный уровень
штаммов и гетеродуплексов результатам нуклеотидных
изолятов в АПГ) секвенирования отличий(%)
1 S1133+14/01 82,0 17,4 18,7
2 04/02+ 03/98ita 83,2 18,4 17,7
3 S1 133+ 04/02 83,6 17,0 17,3
4 F-C + 04/02 85,0 15,5 16,1
5 S1133 + 02/98ita 87,3 11,3 14,0
6 S1133 + 01/98ita 87,6 13,2 13,8
7 F-C + 02/98ita 90,8 11,8 10,9
8 F-C + 03/98ita 95,0 8,0 7,1
9 S1133 + F-C 95,7 6,6 6,6
10 01/98ita + 02/98ita 96,6 5,7 5,8
11 S1133 + 03/98ita 100 2.4 2,7
12 ВНИВИП-РЕО+ S1133 100 0,0 2,7
По результатам сравнения нуклеотидных последовательностей кДНК и относительной подвижности гетеродуплексов получено уравнение линейной регрессии, позволяющее расчитать уровень нуклеотидных отличий между двумя последовательностями кДНК по электрофоретической подвижности гетеродуплекса в полиакриламидном геле: у = 91,726 - 0,89-х, где у - уровень нуклеотидных отличий (%), х - относительная подвижность гетеродуплекса (%). Расчет может производится также с помощью кривой линейной регрессии, построенной по данному уравнению (рис. 5).
Нуклео- » тидные отличия и (%)
' I»
«' ....... ■ -
«■? »» »в » )•»
Относительная подвижность гетеродуплексов (%)
Рис. 5 График зависимости относительного количества нуклеотидных замен в последовательностях кДНК от подвижности гетеродуплексов. Маркировка экспериментально полученных точек на графике соответствует номерам проб в таблице 1.
Минимальными отличиями, выявленными в АПГ (5,7%), обладали штаммы 01/98йя и 02/98ita (Италия).
Следует отметить, что при отсутствии различий в подвижности гомо- и гетеродуплексов (при значении относительной подвижности 100%), расчетное значение уровня нуклеотидных отличий не равно нулю и составляет 2,7%. Очевидно, это значение отражает предельную чувствительность метода - минимальные отличия кДНК, которые можно
установить с помощью АПГ при наиболее оптимальных условиях разделения в ПААГе. При значениях уровня нуклеотидных отличий кДНК, входящих в гетеродуплекс, от 0 до 2,7% подвижности гетеро- и гомодуплексов будут совпадать, что было подтверждено 100% сходством в АПГ электрофоретическоП подвижности гетеродуплекса штамма S1133 и изолята 03/98ita и соответствующих гомодуплексов, при уровне нуклеотидных отличий между штаммами - 2,4%.
Штаммы ВНИВИП-РЕО и S1133 оказались идентичными как в АПГ, так и при анализе секвенированных последовательностей кДНК.
Полевые изоляты 04/02 и 14/01, выделенные на территории РФ, значительно отличались в АПГ друг от друга и от референтных штаммов S1133 и Fachey-Crowley, выделенных на территории США и Канады.
Анализ статистических критериев показал, что полученная модель линейной регрессии позволяет с высокой достоверностью оценить количество нуклеотидных отличий в интервале от 2,7 до 20% при сравнении разных проб амплифицированной кДНК.
Таким образом, разработан простой экспресс-метод дифференциации штаммов и изолятов реовируса кур на основе ОТ-ПЦР и АПГ. Близкие к вакцинному штамму изоляты для уточнения нуклеотидных замен могут быть секвенированы.
3. Выводы
1. Разработаны и оптимизированы методы выявления и дифференциации изолятов реовируса кур с помощью амплификации с использованием внутреннего контрольного образца и секвенирования участков генов S3 и S1.
2. Установлено, что наибольшей аналитической и диагностической чувствительностью обладает метод ОТ-ПЦР PK-S3Б. Данный метод предложен как основной для индикации генома реовируса кур, а методы PK-S3A и PK-S1 как вспомогательные для генетического анализа выявленных изолятов.
3. Исследована 151 проба патологического материала, поступившего из 105 птицеводческих хозяйств Центрального федерального округа Российской Федерации за период с 1999 по 2004 г.г.. Геном реовируса кур выявлен в 56% проб.
4. Установлено, что максимальный уровень отличий по последовательностям фрагментов гена 83 выявленных изолятов вируса составлял 21-24%. Уровень отличий выявленных изолятов по участку гена 81 был гораздо выше -до 60%.
5. Показано, что все выявленные изоляты реовируса кур генетически отличались от вакцинного штамма 81133 и формировали отдельные группы. Выявлены факты одновременной циркуляции в птицеводческом хозяйстве вируса, близкого к вакцинному штамму 81133, и полевого вируса, а также полевых вирусов, принадлежащих к одной или к разным генетическим группам.
6. Создан банк данных нуклеотидных последовательностей генов 81 и 83, позволяющий проводить сравнительный генетический анализ и устанавливать групповую принадлежность вновь выявляемых изолятов.
7. Оптимизирован метод анализа подвижности гетеродуплексов кДНК для быстрой дифференциации изолятов реовируса кур.
4. Практические предложения Для практического использования предлагаются «Методика индикации генома и дифференциации штаммов и изолятов птичьего ортореовируса с использованием полимеразной цепной реакции» (2002г.), и «Методика индикации генома птичьего ортореовируса с использованием полимеразной цепной реакции» (2000г.) которые используются в ФГУ ВНИИЗЖ для выявления и штаммовой дифференциации реовируса кур с помощью амплификации и секвенирования участков гена 83.
Для практического использования также предлагаются «Методические указания по выявлению, титрованию и идентификации авиреовирусов птиц» (2002г.), которые используются в ФГУ ВНИИЗЖ при выделении изолятов реовируса кур.
Созданный банк нуклеотидных последовательностей участков генов 81 и 83 изолятов реовируса кур, выявленных на территории РФ и Италии, используется для изучения генома реовируса кур и дифференциации новых изолятов.
5. Список научных работ, опубликованных по материалам диссертации
1. Андрейчук Д.Б., Щербакова Л.О., Колосов С.Н. и др. Обнаружение . генома птичьего реовируса с помощью полимеразной цепной реакции
// Достижения молодых ученых в вет. практ. (Матер, конф. молодых ученых).- Владимир, 2000.- с.190-196.
2. Андрейчук Д.Б., Куприянов А.И., Фалина Г.М. и др. Метод концентрирования и очистки птичьего реовируса для молекулярно-биологических исследований // Актуальн, пробл. патол. с.-х. животных: матер, междунар. науч.- практ. конф.- Минск, 2000.- с.43-44.
3. Куприянов А.И., Шкиря В.И., Андрейчук Д.Б. и др. Трансовариальный иммунитет при авиреовирусной инфекции (теносиновите кур) // Аграрная Россия.- 2001.- №3.- с. 56-59.
4. Андрейчук Д.Б., Колосов С.Н., Дрыгин В.В., Старое С.К. Обнаружение генома птичьего реовируса с помощью полимеразной цепной реакции // Уч. зап. Витебск, гос. акад. вет. мед.- Витебск, 2001.- т.37, ч.1.- с.5-7.
5. Андрейчук Д.Б., Колосов С.Н., Дрыгин В.В. Оценка эффективности использования разных систем праймеров для проведения индикации и дифференциации российских изолятов ортореовируса кур методами ПЦР и прямого секвенирования // Генодиагностика инфекционных
заболеваний: Сб. тез. 4-ой Всерос. науч.- практ. конф.- М., 2002.- с. 318-320.
6. Андрейчук Д.Б., Батченко Г.В., Волкова М.А., Дрыгин В.В. Молекулярно-биологическая и вирусологическая характеристика двух изолятов реовируса птиц, выделенных на территории РФ // Генодиагностика инфекционных болезней: Сб. тр. 5-ой Всерос. науч.-практ. конф.- М., 2004.- т.2.- с. 196-198.
Отпечатано на полиграфической базе ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных», 90 экз., апрель 2005 г.
о 7 МДй 2005
( îï№2
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Андрейчук, Дмитрий Борисович
1. ВВЕДЕНИЕ
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. Реовирусные заболевания кур
2.1.1. Распространенность реовирусных заболеваний среди коммерческой птицы
2.1.2. Вирусный теносиновит
2.1.3. Малабсорбционный синдром
2.1.4. Патотипы реовируса кур
2.1.5. Возрастная и породная резистентность
2.1.6. Иммунный ответ при теносиновите и малабсорбционном синдроме
2.2. Эффективность вакцинопрофилактики против реовирусных инфекций
2.3. Методы диагностики реовирусных заболеваний и характеристика выделенных изолятов
2.4. Молекулярно-биологическая характеристика реовирусов рода Orthoreovirus
2.4.1. Краткая характеристика семейства Reoviridae
2.4.2. Структура вириона представителей рода Orthoreovirus
2.4.3. Сруктура генома ортореовирусов
2.4.4. Белки ортореовируса
2.4.5. Репликация ортореовирусов
2.4.6. Генетическая изменчивость реовируса
2.5. Выявление генома и дифференциация штаммов реовируса кур молекулярно-биологическими методами
Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка молекулярно-биологических методов диагностики реовирусной инфекции кур и изучение изолятов, выявленных на территории Российской Федерации"
Реовирусная инфекция широко распространена среди коммерческой птицы в птицеводческих хозяйств разных стран мира. Патогенные штаммы реовируса кур (РК) (род Orthoreovirus, сем. Reoviridae), как правило, ассоциированы с множеством заболеваний, экономическое значение среди которых имеют теносиновит и малабсорбционный синдром [173]. Реовирус также ассоциирован с респираторными заболеваниями, гепатитом, поражениями миокарда и перикардитом у молодых бройлеров, синдромом внезапной гибели [49,73].
Реовирусные заболевания протекают, как правило, в хронической форме. Экономический ущерб от реовирусных заболеваний обусловлен снижением прироста массы тела и отбраковкой тушек [41]. В некоторых птицеводческих хозяйствах европейских стран уменьшение прибыли по сравению с ожидаемой достигало 20% [176].
Диагностика заболеваний осложняется тем, что патолого-анатомические и клинические признаки не патогномоничны и могут вызываться другими патолого-анатомическими агентами (Mycoplasma synoviae, Staphylococcus aureus, E.coli, некоторые виды Eimeria), а также сопровождаться ассоциированной инфекцией вирусами инфекционной бурсальной болезни, анемии птиц, аденовирусами [12,73]. Как правило, ассоциированные патологические агенты усиливают проявление заболевания. Для постановки правильного диагноза необходимо выявление всего комплекса этиологических агентов при этих заболеваниях, что делает лабораторную ИФА- и ПЦР-диагностику достаточно актуальной [73].
Применение комплекса молекулярно-биологических методов обратной транскрипции, полимеразной цепной реакции, секвенирования амплифицированной кДНК и анализа подвижности рестрикционных фрагментов дает возможность провести быстрое выявление генома возбудителя, дифференциацию и генотипирование выявленных изолятов реовируса кур. Комплексный ПЦР-анализ проб позволяет выявить не только геном РК, но и ассоциированные вирусные и бактериальные инфектанты. Так, предложена мультиплекс-ПЦР для одновременной детекции реовируса кур, аденовируса, вирусов инфекционной бурсальной болезни и инфекционной анемии кур [26], что облегчает постановку окончательного диагноза при подозрении на малабсорбционный синдром. Однако, несмотря на разработанные в 1990-х годах ПЦР-методы индикации генома M.synoviae [90, 179], отсутствуют сообщения о комплексном ПЦР-исследовании патолого-анатомического материала от кур с признаками теносиновита на наличие микоплазмы и реовируса.
Среди реовирусов кур существуют штаммы и изоляты, занимающие промежуточное положение между серотипами. В настоящее время некоторые авторы предполагают отсутствие устойчивых серотипов при наличии многочисленных субтипов реовирса кур [1, 2, 13, 73, 185]. Четкие серотипические отличия выявлены лишь при сравнении реовирусов разных видов птиц - реовирусов кур, индеек, водоплавающих птиц (уток и гусей) [13,73]. Этот факт значительно осложняет серологическую классификацию вирусов определенного хозяина. Сложность серотипирования связана с положением эпитопов нейтрализации вируса на разных белках внешнего капсида - они располагаются на поверхности белков сигма-С, сигма-В и лямбда-С, которые кодируются разными сегментами генома [183]. Реассортация геномных сегментов при смешанной инфекции несколькими изолятами приводит к возникновению новых субтипов [125, 126]. Задача классификации реовирусов кур может быть решена с помощью генотипирования по разным сегментам генома и установления фактов реассортации.
В отличие от зарубежных стран, в России молекулярно-биологические исследования изолятов реовируса кур не проводились, что не позволяет сделать вывод о филогенетичеких отношениях и генетическом разнообразии штаммов этого вируса персистирующих на птицефабриках РФ.
Тем не менее, результаты серологического мониторинга, проведенного в 2000 - 2002г.г. Куприяновым А.И. и Шкирей В.И. [7, 11] свидетельствуют, что реовирус распространен повсеместно на территории РФ. В каждом птицеводческом хозяйстве, где не применялась вакцина против реовируса кур, у птицы регистрируются достаточно высокие титры специфических антител, что говорит о персистенции полевого изолята в птичьем стаде.
Таким образом, совершенствование методов выявления генома и дифференциации выявленных изолятов на основе ОТ-ПЦР и секвенирования, а так же генетический анализ выявленных изолятов по разным сегментам генома являются достаточно актуальными задачами.
Цель и задачи исследования
Главная цель исследований состояла в разработке методов выявления и дифференциации изолятов реовируса кур с помощью ОТ-ПЦР, нуклеотидного секвенирования амплифицированных фрагментов, а так же генетической характеристике выявленных на территории Российской Федерации изолятов реовируса кур.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: разработать ПЦР-методы выявления реовируса кур в различных вируссодержащих образцах; определить распространение реовируса кур в птицеводческих хозяйствах Российской Федерации; оптимизировать молекулярно-биологические методы для дифференциации выявленных изолятов реовируса кур; провести анализ нуклеотидной последовательности участков высоковариабельных генов выявленных изолятов; создать банк нуклеотидных последовательностей участков генома выявленных изолятов реовируса кур.
Научная новизна исследования
Разработаны методы индикации генома реовируса кур на основе ОТ-ПЦР фрагментов генов S1 и S3.
Разработаны методы дифференциации выявленных изолятов реовируса кур на основе секвенирования амплифицированных в ОТ-ПЦР кДНК фрагментов генома.
Проведено генотипирование и определен спектр генотипических групп выявленных изолятов, циркулирующих на территории Европейской части РФ.
Создан банк нуклеотидных последовательностей участков генов S1 и S3 выявленных изолятов.
Практическая значимость исследования
Разработаны следующие методы индикации и дифференциации изолятов реовируса кур: «Методика индикации генома птичьего ортореовируса с использованием полимеразной цепной реакции» (2000г.), «Методика индикации генома и дифференциации штаммов и изолятов птичьего ортореовируса с испрользованием полимеразной цепной реакции» (2002г.), «Методические указания по выделению, титрованию и идентификации авиреовирусов птиц» (2002г.). Данные методики и методические указания одобрены ученым советом и утверждены директором ФГУ ВНИИЗЖ.
Разработанный метод выявления и дифференциации изолятов реовируса кур с помощью ОТ-ПЦР и секвенирования участка гена S3 (634878 н.) в настоящее время применяется в диагностических целях.
Предложенные методы позволили выявить геном реовируса кур в различных вируссодержащих образцах.
С помощью разработанных методов проведен анализ участков генов S1 и S3 у 61-го изолята, выявленного на территории РФ в 1999-2004г.г., 5-и изолятов, выделенных на территории Италии в 1998г., референтного штамма Fachey-Crowley и вакцинного штамма ВНИВИП-РЕО. Созданный банк полученных нуклеотидных последовательностей участков генома реовируса кур используется для генотипирования и дифференциации выявляемых изолятов.
Публикация научных работ
По теме диссертации опубликовано 6 научных работ. Апробация работы
По основным результатам диссертации представлены доклады на Всероссийской научно - практической конференции молодых ученых «Достижения молодых ученых в ветеринарную практику» (Владимир, 2000г.), Международной научно - практической конференции «Современные проблемы селекции, ветеринарной генетики и защиты животных от болезней» (Витебск, 2001г.), V Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (Москва, 2004г.).
Структура и объем работы
Диссертация изложена на 177 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение выводы, практические предложения. Список литературы включает 188 источников. Работа иллюстрирована 27 рисунками и 28 таблицами.
Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Андрейчук, Дмитрий Борисович
6. Выводы
1. Разработаны и оптимизированы методы выявления и дифференциации изолятов реовируса кур с помощью амплификации с использованием системы внутреннего контрольного образца и секвенирования участков генов S3 и S1.
2. Установлено, что наибольшей аналитической и диагностической чувствительностью обладает метод ОТ-ПЦР PK-S35. Данный метод предложен как основной для индикации генома реовируса кур, а методы PK-S3A и PK-S1 как вспомогательные для генетического анализа выявленных изолятов.
3. Исследована 151 проба патологического материала, поступившего из 105 птицеводческих хозяйств Центрального федерального округа Российской Федерации за период с 1999 по 2004 г.г. Геном реовируса кур выявлен в 56% проб.
4. Установлено, что максимальный уровень отличий по последовательностям фрагментов гена S3 выявленных изолятов вируса составлял 21-24%. Уровень отличий выявленных изолятов по участку гена S1 был гораздо выше - до 60%.
5. Показано, что все выявленные изоляты реовируса кур генетически отличались от вакцинного штамма S1133 и формировали отдельные группы. Выявлены факты одновременной циркуляции в птицеводческом хозяйстве вируса, близкого к вакцинному штамму S1133, и полевого вируса, а также полевых вирусов, принадлежащих к одной или к разным генетическим группам.
6. Создан банк данных нуклеотидных последовательностей генов S1 и S3, позволяющий проводить сравнительный генетический анализ и устанавливать групповую принадлежность вновь выявляемых изолятов.
7. Оптимизирован метод анализа подвижности гетеродуплексов кДНК для быстрой дифференциации изолятов реовируса кур.
7. Практические предложения
Для практического использования предлагаются «Методика индикации генома и дифференциации штаммов и изолятов птичьего ортореовируса с использованием полимеразной цепной реакции» (2002г.), и «Методика индикации генома птичьего ортореовируса с использованием полимеразной цепной реакции» (2000г.) которые используются в ФГУ ВНИИЗЖ для выявления и штаммовой дифференциации реовируса кур с помощью амплификации и секвенирования участков гена S3.
Для практического использования также предлагаются «Методические указания по выявлению, титрованию и идентификации авиреовирусов птиц» (2002г.), которые используются в ФГУ ВНИИЗЖ при выделении изолятов реовируса кур.
Созданный банк нуклеотидных последовательностей участков генов S1 и S3 изолятов реовируса кур, выявленных на территории РФ и Италии, используется для изучения генома реовируса кур и дифференциации новых изолятов.
5. Заключение
В качестве объектов для ПЦР-исследования были выбраны наиболее частые этиологические агенты теносиновита/артрита - реовирус кур и Mycoplasma synoviae.
Выбор праймеров для индикации и дифференциации изолятов реовируса кур с помощью ОТ-ПЦР осуществлялся по последовательностям наиболее вариабельных сегментов генома - S1 и S3. Для проведения двухстадийной гнездовой ОТ-ПЦР были выбраны 3 системы праймеров: система праймеров S3A, фланкирующих 5'-концевой регион сегмента S3 (40-442 н.), система праймеров S3B, фланкирующих З'-концевой регион сегмента S3 (634-878 н.) и система для амплификации участка сегмента S1, фланкирующая 90% последовательности гена S1 (672-1584 н.).
Наиболее удачной оказалась система праймеров S3B. При исследовании патолого-анатомического материала с помощью данной системы были выявлены изоляты, которые не удалось выявить другими системами праймеров. Метод ОТ-ПЦР на основе системы S3B показал максимальную аналитическую чувствительность по сравнению с другими предложенными системами.
Для повышения надежности разработанной ОТ-ПЦР-системы индикации генома реовируса кур S3B предложена оригинальная система внутреннего контрольного образца, защищенного от действия РНК-аз, включающая тест-объект - вакцинный штамм вируса инфекционной бурсальной болезни Winterfield-2512 и систему праймеров для амплификации участка гена VP-1 данного вируса в первой стадии ПЦР.
С помощью внутреннего контрольного образца удалось идентифицировать ложноотрицательные результаты при исследовании проб в 2002 году. При повторном исследовании этих проб после десятикратного разбавления суспензии тканей и однократной обработки хлороформом ложноотрицательных результатов не отмечено.
Для индикации генома М. synoviae был использован разработанный в 1993 г. Lauerman L.H. ПЦР-метод.
С использованием культуральных препаратов штаммов реовируса кур S1133, Fachey-Crowley, изолята 04/02 и штамма М. synoviae WVU-1853 постановка ПЦР была оптимизирована по температуре отжига праймеров. Для достижения максимальной аналитической чувствительности ОТ-ПЦР был найден оптимальный способ выделения дцРНК.
С помощью предложенных методов в период с 1999 по 2004 г.г. была исследована 151 проба патолого-анатомического материала, поступившего из 105 птицеводческих хозяйств центральной части Российской Федерации. Геном реовируса кур удалось выявить в 56% проб из 58 прицеводческих хозяйств 31 региона РФ.
Анализ результатов показал, что общее количество положительных проб на реовирус и микоплазму примерно одинаково - 84 (56%) и 74 (49%) пробы, соответственно, что говорит о значительном распространении как реовирусной инфекции, так и микоплазмоза. Ассоциированная инфекция реовирусом и микоплазмой встречалась достаточно часто - в 44 случаях (29%). Наличие реовируса без ассоциированный патологический агента у больной теносиновитом птицы установлено в 40 случаях. Инфекция микоплазмой без ассоциированной инфекции реовирусом зарегистрирована в меньшем числе случаев (32 случая), что подтверждает важную роль реовируса как этиологического агента теносиновита кур в птицеводческих хозяйствах РФ.
В 35 случаях (23%) данных патолого-анатомических агентов не выявлено. Очевидно, в этих случаях патолого-анатомические изменения, характерные для реовирусных заболеваний, вызваны другими патолого-анатомическими агентами, т.к. сопутствующие патолого-анатомические изменения не патогномоничны.
Наибольшее число случаев теносиновита сопровождалось энтеритами, гепатитами, нефритами и респираторными заболеваниями (38 случаев). Теносиновит при отсутствии других патолого-анатомических изменений встречался гораздо реже (7 случаев). Значительное количество случаев выявления реовируса (39 случаев) не было связано с развитием теносиновита и сопровождалось другими патолого-анатомическими изменениями.
Наиболее часто у несушек и бройлеров встречалась легкая форма теносиновита, которая не сопровождалась микоплазменной инфекцией и была характерна для птицы возрастом до 40 дней. Более тяжелые формы синовита встречаются реже и характерны для птицы старшего возраста. Как правило эти формы сопровождались смешанной инфекцией реовируса и микоплазмы.
Наиболее часто вместе с РК выявлялись Mycoplasma synoviae, М. gallisepticum и вирус инфекционного бронхита кур. В 22% случаев не установлено наличия ассоциированный патологический агентов в патолого-анатомическом материале. Достаточно высокая встречаемость реовируса с вирусом ИБК и микоплазмами объясняет частую респираторную клинику при выявлении реовирусов.
Для 44% поступившей на исследование птицы не установлено наличие реовирусной инфекции. M.synoviae выявлена у 48% реовирус-негативной птицы. При этом в 60% случаев микоплазмоз сопровождался синовитом разной степени тяжести. Таким образом 13% случаев теносиновита от общего числа исследованных проб было связано с инфекцией M.synoviae без ассоциированный патологический агентов.
В результате выделения реовируса кур из проб положительного в ОТ-ПЦР патолого-анатомического материала были получены 12 изолятов. Изоляты отличались по вирулентности для куриных эмбрионов. Были выделены как низковирулентные, так и высоковирулентные изоляты. Вирулентность для куриных эмбрионов коррелировала с вирулентностью для однодневных SPF-цыплят, что доказано при экспериментальном заражении SPF-цыплят.
При заражении однодневных SPF-цыплят низковирулентным и высоковирулентным изолятами перорально и инъекцией в подушку лапы показано, что низковирулентный изолят не вызывал значительных патолого-анатомических и клинических изменений в органах, однако достоверно снижал прирост зараженных цыплят на 15-20%. Во втором случае наблюдали сильные поражения разных органов (печени, почек, селезенки, сердца, тканей кишечника, бурсы, суставной сумки), высокую раннюю смертность при любом способе заражения, клинические признаки теносиновита и выраженную редукцию прироста массы тела на 40-60%. Таким образом, низковирулентный изолят проявлял патотип синдрома малабсорбции, а высоковирулентный - смешанный патотип, который характерен для большинства высоковирулентных изолятов реовируса кур.
Был проведен сравнительный анализ последовательностей участков генов S1 и S3 выявленных изолятов. Уровень отличий последовательностей S3A и S35 был примерно одинаков - 21,4 и 24,3%. Уровень отличий выявленных изолятов по участку гена S1 был гораздо выше - до 59,4%.
Отсеквенированы полные последовательности гена S1 у трех выявленных в 2002 году изолятов. Размер гена был одинаков - 975 н. По сравнению с вакцинным штаммом S1133 (978 н.) наблюдалась делеция одного триплета в гене S1 в области хвостового домена во всех трех случаях. В целом, данные изоляты отличались на 45-48% от штамма S1133 по гену S1 и на 59-69% по белку сигма-С. Белок сигма-С демонстрирует относительно высокую структурную консервативность регионов Т1 и Н и низкую консервативность последовательности хвостового домена.
Все выявленные изоляты отличались от вакцинного штамма на 8,519% по последовательности участка S3B гена S3 и более чем на 30% по участку гена S1 (700-850 н.).
С использованием двух систем праймеров на ген S3 выявлена одновременная циркуляция как вакцинного штамма, так и полевого изолята в птицеводческих хозяйствах. Показано, что обратные «Fb-праймеры системы S3A в этом случае не имеют гомологии с соответствующими подпраймерными областями гена S3 полевого изолята и выявляют только геном вакцинного штамма S1133, коциркулирующий с полевым вирусом.
Большинство выявленных изолятов на дендрограммах S3A и S3B образуют несколько генетических групп. В группы входит по 2-6 изолятов.
Группа изолятов, выделенных на территории Италии, наиболее близка из зарубежных штаммов к выявленным изолятам. Не исключено существование общих предковых форм выявленных российских и европейских штаммов.
Корреляция между топологией изолятов на дендрограммах S3A и S3B и датой выявления отсутствует.
При исследовании участка гена S1 большинство выявленных на территории РФ изолятов формировали четыре отдельные генетические группы с высокой статистический вероятностью топологии (значение bootstrap-показателя 84-100%). Внутригрупповые отличия составляют 725%. Однако, уровень отличий от вакцинного штамма S1133 достигает 45%. Выделялись как гомогенные группы, представленные только российскими изолятами, так и группы, включающие изоляты, выделенные на территории Австралии, Германии и Нидерландов. Не исключено общее происхождение этих штаммов и изолятов.
При анализе дендрограмм S3B и S1 выявленных изолятов установлено, что генетические группы, выявленные по одному сегменту, для другого сегмента не сохраняются, что может быть следствием либо реассортации S1 и S3 сегментов либо коциркуляции генетически отличных по генам S1 и S3 изолятов. Так, изоляты с уровнем отличий менее 10% по гену S3 отличаются друг от друга более чем на 40% по гену S1.
Случаи реассортации/коциркуляции для реовируса кур по видимому встречаются достаточно часто и были отмечены ранее при выявлении изолятов реовируса в птицеводческих хозяйствах на территории Тайваня.
При анализе последовательностей фрагментов S3A и S3B сегмента S3 установлена генетическая близость штамма 138, выделенного на территории США, и некоторых российских изолятов. Однако, при анализе участка гена S1 данный штамм был близок к lijt.S1133 и имел значительные отличия (более 30%) от выявленных изолятов. Не исключено, что часть РФ-изолятов являются дериватами одного или нескольких штаммов, близких к штамму 138, которые могли быть завезены при импорте репродуктивного стада или эмбрионов из США и Европы в птицеводческие хозяйства России.
Установлен факт одновременной циркуляции двух разных изолятов у птицы, поступившей с одного цеха птицефабрики «Владимировская» Астраханской области. При секвенировании 10 клонов фрагмента S1 было обнаружено, что популяция изолята 02/00, первоначально выявленного в птицехозяйстве, гетерогенна и представлена как минимум двумя субпопуляциями (02/00а и 02/006), отличающимися по гену S1 на 21%.
При исследовании с помощью системы ОТ-ПЦР PK-S3B проб, поступавших с одной и той же птицефабрики в течение 2-3 лет, выявлялись разные циркулирующие изоляты. Наибольшее количество изолятов было выявлено в пробах с птицефабрик «Кировоградская» (3 изолята) и «Ярославский бройлер» (5 изолятов). В каждом случае формировалась группа близкородственных изолятов, выявленных в 1999-2001 годах с уровнем внутригрупповых отличий, не превышающими 5%.
Установленные факты могут подтверждать как длительную совместную персистенцию близкородственных изолятов так и изменение генома в результате многолетней циркуляции вируса в птицехозяйстве.
Однако, выявлялись изоляты, попадающие в разные генетические группы. При этом изоляты с одной птицефабрики отличались более чем на 8%. В этом случае разные циркулирующие изоляты возможно были занесены при комплектации родительского стада из разных источников или при смене племрепродуктора при поставках цыплят. В двух случаях изоляты с разных птицефабрик принадлежали к одной группе. Генетическая близость изолятов с разных птицефабрик, вероятно, связана с поступлением эмбрионов или цыплят, зараженных определенным изолятом, из одного источника.
При генетическом анализе последовательностей изолятов с определенными биологическими свойствами не установлено закономерности в их генетической группировке и отнесением к определенному патотипу.
Однако, установлена связь между генетической группировкой 14 изолятов и патолого-анатомическими изменениями у кур, инфицированных данными изолятами. Эти изоляты формировали отдельную генетическую группу. Каждый изолят был выделен от птицы с респираторной клиникой. При этом в большинстве случаев отсутствовала ассоциированная инфекция ВИБК. При анализе аминокислотных позиций участка S3B, выявлена одна замена, уникальная для всех 14-и изолятов, формирующих данную группу - наличие пролина в позиции 229 белка сигма-В. Указанная замена отсутствует у остальных российских изолятов. На основании полученных результатов можно предположить, что в пределах участка S3B имеются генетические маркеры, характерные для изолятов реовируса кур, вызывающих комплекс респираторных патолого-анатомических изменений. Возможно, пролин в позиции 229 является одним из таких маркеров.
Случаи выделения генетической группы изолятов реовируса кур, выявленных у птиц с респираторной клиникой ранее не описывалось.
На основе анализа гетеродуплексов кДНК разработан метод быстрой дифференциации штаммов и изолятов, отличающихся друг от друга более чем на 2,7%. Хотя метод не является полной заменой секвенированию кДНК, но с его помощью можно дифференцировать полевые изоляты реовируса кур от вакцинного штамма, поскольку, по результатам секвенирования, все выявленные изоляты при использовании системы РК-S3B отличались от вакцинного штамма более чем на 5%.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Андрейчук, Дмитрий Борисович, Владимир
1. Абдилазиз Ф. А. Биологические свойства авиреовирусов, диагностика вызываемых ими заболеваний // автореф. канд. дис. на соиск. уч. ст. канд. вет. наук.- Киев.- 1990.
2. Абдилазиз Ф. А. Изучение биологических свойств реовирусов, выделенных от кур и индеек // Ветеринария.- 1990.- вып.65.- с.104-107
3. Абдильазиз Ф., Герман В.В. Изучение в реакции диффузной преципитации в геле реовирусов, выделенных от кур и индеек // Современные средства и методы борьбы с разными болезнями сельскохозяйственных птиц: Сб. Науч. Тр.- Л.:1988.- ч.1с.64-69.
4. Грибанов О.Г., Щербаков А.В., Перевозчикова Н.А., Гусев А.А. Использование Аэросила А-300 и фильтров GF/F (GF/C) Для очистки ДНК-фрагментов, плазмидной ДНК и РНК//Биохимия.- 1996.- вып. 61(6).-с.1064-1070.
5. Жбанова С.Ю. Эпизоотология инфекционной бурсальной болезни и реовирусного теносиновита кур на птицефабрике яичного направления // автореф. канд. дис. на соиск. уч. ст. канд. вет. наук.- СПб.- 2003.
6. Коровина В.В. Изучение распространения и антигенных взаимоотношений штаммов реовируса теносиновита кур // автореф. канд. дис. на соиск. уч. ст. канд. вет. наук.- СПб.- 2001.
7. Куприянов А.И., Волкова И.А., Шкиря В.В. и др. Серологический мониторинг птицехозяйств Российской Федерации по авиреовирусной инфекции и синовиальному микоплазмозу // Аграрн. Россия.- 2002.- №2.-с.20-24
8. Нваджей Б. Свойства реовирусов, изолированных при теносиновите птиц и смешанной инфекции с Mycoplasma synoviae // Автореф. дисс. На соиск. уч.степ, кандидата вет. наук.- Москва, 1991.
9. Сарбаева Н.В. Сравнительная характеристика вакцинного и эпизоотических штаммов реовируса теносиновита кур // автореф. канд. дис. на соиск. уч. ст. канд. вет. наук.- М.-1997.
10. Шкиря В.И., Куприянов А.И., Старов С.К., Маркина М.И. Эпизоотический мониторинг авиреовирусной инфекции в птицеводческих хозяйствах Российской Федерации // Достижения молодых ученых в вет. практику.- Владимир: 2000.- с. 70-74
11. Abbas A., Amer М., Bastami М., El Mahdi S.A. Detection of infectious causes of arthritis in breeder chicken flocks // in Book of Abstracts "XXII World's poultry congress, 8-13 june 2004, Istanbul, Turkey".- Istanbul, 2004,-p.775
12. Adair B.M., Burns K., McKillop E.R. Serological studies with reoviruses in chickens, turkeys and ducks. // J Comp Pathol.- 1987.- v.97.- p.495-501.
13. Agwale S.M., Robbins K.E., Odama L., et al. Development of an env gp41-based heteroduplex mobility assay for rapid human immunodeficiency virus type 1 subtyping//J.Clin.Microbiol.-2001.-v.39.-p.2110-2114.
14. Al Afaleq A.I., Jones R.C. Localisation of avian reovirus in the hock joints of chicks after entry through broken skin. // Res Vet Sci.- 1990.- v.48.- p.381-382.
15. Al-Afaleq A., Jones R.C. Pathogenicity of three turkey and three chicken reoviruses for poults and chicks with particular reference to artritis/tenosynovitis //Avian pathol.- 1989,- v. 18.- p.433-440
16. Alderson M., Nade S. Natural history of acute septic arthritis in an avian model // J.Orthop. Res.-1987.- v.5.- p.261-274
17. Ballagi-Pordany A., Belak S. The use of mimics as internal standards to avoid false negatives in diagnostic PCR // Mol. Cell. Probes. 1996. -v.10. -p.159-64.
18. Bartlett N.M., Joklik W.K. The sequence of the reovirus serotype 3 L3 genome segment which encodes the major core protein A1 // Virology. 1988. - v.167. - p.31-37.
19. Berinstein A., Sellers H.S., King D.J., Seal B.S. Use of a heteroduplex mobility assay to detect differences in the fusion protein cleavage site codingsequence among newcastle disease virus isolates // J.Clin.Microbiol. 2001.-Vol. 39.- P. 3171-3178.
20. Bisaillon M., Bergeron J., Lemay G. Characterization of the nucleoside triphosphate phosphohydrolase and helicase activities of the reovirus lambdal• protein. // J Biol Chem.- 1997.- v.272.-p.18298-18303.
21. Bodelon G., Labrada L., Martinez- Costas J., Benavente J. The avian reovirus genom segment S1 is a functionally tricistronic gene that express one structural and two nonstructural proteins in infected cells // Virology. 2001. -v.290. - p.181- 191.
22. Bodelon G., Labrada L., Martinez-Costas J., Benavente J. Modification of late membrane permeability in avian reovirus-infected cells: viroporin activity of the S1-encoded nonstructural p10 protein. // J Biol Chem.- 2002.- v.277.-p.17789-17796.
23. Braunius W.W. Respiratory problems in reovirus infection in broiler chicks // Tijdschr Diergeneeskd.- 1992.- v. 117.- p.390-391.
24. Bustin S.A. Quantification of mRNA using real- time reverce transcription PCR (RT-PCR): trends and problems // J. Mol. Endocrinol. 2002. - v.29 - p. 23-39.
25. Caterina K.M., Frasca S Jr, Girshick Т., Khan M.I. Development of a multiplex PCR for detection of avian adenovirus, avian reovirus, infectious bursal disease virus, and chicken anemia virus. // Mol Cell Probes.- 2004.-v.18.- p.293-298.
26. Chappel J.D., Goral M.I., Rodgers S.E., et al. Sequence diversity within the reovirus S2 gene: reovirus genes reassort in nature, and their termini are predicted to form a panhandle motif//J. Virol. -1994. v.68. - p.750-756.
27. Clark F. D., Ni Y., Collisson E.W., Kemp M.C., Characterization of avian reovirus strain specific polimorphisms // Avian Dis. 1990. - v.34. - p.304-314.
28. Cook M.E., Springer W.T. Effect of reovirus infection and dietary levels of selected vitamins on immunocompetence of chickens. // Avian Dis.- 1983,-v.27.- p.367-377.
29. Cook M.E., Springer W.T., Hebert J.A. Enhanced incidence of leg abnormalities in reovirus WVU 2937-infected chickens fed various dietary levels of selected vitamins. //Avian Dis.- 1984.- v.28.- p.548-561.
30. Cook M.E., Springer W.T., Kerr K.M., Hebert J.A. Severity of tenosynovitis in reovirus-infected chickens fed various dietary levels of choline, folic acid, manganese, biotin, or niacin. //Avian Dis.- 1984.- v.28.- p.562-573.
31. Coombs K.M. Stoichiometry of reovirus structural proteins in virus, ISVP, and core particles. //Virology.- 1998.- v.243.- p.218-28.
32. Czekaj H., Samorek-Salamonovicz E., Koizdrun W. Properties of avian reoviruses isplated from chickens in Poland // Bull. Vet. Inst. Pulawy.- 1999.-v.43.- p.3-10
33. Decaesstecker M., Charlier G., Meulemans G. Significance of parvoviruses, entero-like viruses and reoviruses in the aetiology of the chicken malabsorption syndrome //Avian Pathol.- 1986.- v.15.- p.769-782
34. Dermody T.S., Nibert M.L., Bassel-Duby R., Fields B.N. Sequence diversity in S1 genes and S1 translation products of 11 serotype 3 reovirus strains. // J Virol.- 1990.- v.64.- p.4842-4850.
35. Dhillon A.S., Kibenge F.S., Page R.K. Viral arthritis in fryers related to reovirus infection in breeders. //Avian Dis.- 1986.- v.30.- p.613-616.
36. Dingle K.E., Crook D., Jeffry K. Stable and noncompetitive RNA internal control for routine clinical diagnostic reverce transcription- PCR // J. Clin. Microbiol.- 2004.- v.42.- p.1003-1011.
37. Dobson K.N., Glisson J.R. Economic impact of a documented case ofreovirus infection in broiler breeders. //Avian Dis.- 1992.- v.36.- p.788-791.
38. Drosten C., Seifried E., Roth W. K. TaqMan 5'-Nuclease Human Immunodeficiency Virus Type 1 PCR Assay with Phage-Packaged Competitive Internal Control for High-Throughput Blood Donor Screening // J.
39. Clin. Microbiol.- 2001v.39.- p.4302-4308.
40. Duncan R. Extensive sequence divergence and filogenetic relationships between fusogenic and nonfusogenic orthoreoviruses: a special proposal // Virology.- 1999.- v.260.- p.316- 328.
41. Duncan R., Corcoran J., Shou J., Stoltz D. Reptilian reovirus: a new fusogenic orthoreovirus species //Virology.- 2004.- v.319.- p. 131-140.
42. G.S., Dermody T.S. Adaptation of reovirus to growth in the presence of protease inhibitor E64 segregates with a mutation in the carboxy terminus of viral outer-capsid protein sigma3. // J Virol.- 2001.- v.75.- p.3197-3206.
43. Ellis J.S., Zambon M.C. Combined PCR-heteroduplex mobility assay for detection and differentiation of influenza A viruses from different animal species // J.Clin.Microbiol. 2001.- v. 39.- p.4097-4102.
44. Elmubarak A.K., Kheir S.A., Abuelgasim A.I. Occurrence of runting and stunting syndrome in broiler chickens in the Sudan. // Rev Elev Med Vet Payse Trop.- 1990.- v.43.- p.317-322.
45. Fachey J.E., Crowley J.F. Studies of cronic respiratory disease of chickens. II Isolation of a virus//Can. J. Сотр. Med -1954.-v.18.- p.13-21.
46. Farsetta D.L., Chandran KM Nibert M.L. Transcriptional activities of reovirus RNA polymerase in recoated cores. Initiation and elongation are regulated by separate mechanisms. // J Biol Chem.- 2000.- v.275.- p.39693-39701.
47. Georgiades G., lordanidis P., Koumbati M. Cases of swollen headsyndrome in broiler chickens in Greece. // Avian Dis.- 2001.- v.45.- p.745-750.
48. Gerganov G, Veselinova A, Popov G, Markarian M. Demonstration of a reovirus in helicopter disease of broilers // Vet Med Nauki.- 1987.- v.24.- p.21
49. Giambrone J.J., Solano W. Serologic comparison of avian reovirus isolates using virus neutralization and an enzyme-linked immunosorbent assay. // Avian Dis.- 1988,- v.32.- p.678-680.
50. Glavits R., Molnar E., Ratz F., Saghy E., Fehervari Т., Meder M. Pathological studies in chicken embryos and day-old chicks experimentally infected with avian reovirus. // Acta Vet Hung.- 1984.- v.32.- p.23-37.
51. Gouvea V.S., Schnitzer T.J. Polimorphism of the migration of double-stranded RNA genome segments of avian reoviruses // J.Virol.- 1982.- v.43.-p.465-471.
52. Grande A., Benavente J. Optimal conditions for the growth, purification and storage of the avian reovirus S1133. // J Virol Methods.- 2000.- v.85.- p.43-54.
53. Grande A., Rodriguez E., Costas C., Everitt E., Benavente J. Oligomerization and cell-binding properties of the avian reovirus cell-attachment protein sigmaC. //Virology.- 2000.- v.274.- p.367-377.
54. Hazelton P.R., Coombs K.M. The reovirus mutant tsA279 L2 gene is associated with generation of a spikeless core particle: implications for capsid assembly. // J Virol.- 1999.- v.73.- 2298-2308.
55. Heggen-Peay C.L., Cheema M.A., Ali R.A., et al. Interactions of poult enteritis and mortality syndrome-associated reovirus vith various cell types in vitro // Poult Sci.- 2002.- v.81.- p.1661-1667
56. Hieronimus D.R.K., Villegas P., Kleven S.H. Characteristics and pathogenicity of two avian reoviruses isolated from chickens with leg problems //Avian dis.- 1982.- v.27.-p.255-260
57. Hieronymus D.R., Villegas P., Kleven S.H. Identification and serological differentiation of several reovirus strains isolated from chickens with suspected malabsorption syndrome. //Avian Dis.-1983.- v.27.- p.246-254.
58. Hill J.E., Rowland G.N., Glisson J.R., Villegas P. Comparative microscopiclesions in reoviral and staphylococcal tenosynovitis. //Avian Dis.- 1989.- v.33.-p.401-410.
59. Hill J.E., Rowland G.N., Steffens W.L., Ard M.B. infrastructure of the gastrocnemius tendon and sheath from broilers infected with reovirus. // Avian• Dis.- 1989.- v.33.-p.79-85.
60. Hsiao J., Martinez- Costas J., Benavente J., Vakharia V.N. Cloning, expression and characterization of avian reovirus guanililtransferase // Virology.- 2002.- v.296.- p.288-299.
61. Ide P.R. Avian reovirus antibody assay by indirect immunofluorescence using plastic microculture plates. // Can J Comp Med.- 1982.- v.46.- p.39-42.
62. Ide P.R. Sensitivity and specificity of the fluorescent antibody technique for detection of infectious laryngotracheitis virus. // Can J Comp Med.- 1978.-v.42.- p.54-62.
63. Ide P.R., Dewitt W. Serological incidence of avian reovirus infection inbroiler-breeders and progeny in Nova Scotia. // Can Vet J.- 1979.- 20.- 348353.
64. Islam M.R., Jones R.C., Kelly D.F. Pathogenesis of experimental reovirus tenosynovitis in chickens: influence of the route of infection. // J Comp Pathol.-1988.-v.98.- p.325-336.
65. Jane-Valbuena J., Breun L.A., Schiff L.A., Nibert M.L. Sites and determinants of early cleavages in the proteolytic processing pathway of reovirus surface protein sigma3. // J Virol.- 2002.- v.76.- p.5184-5197.
66. Joklik W.K., Roner M.R. What reassorts when reovirus genome segments reassort?//J Biol Chem.- 1995.-v.270.- p.4181-4184.
67. Joklik W.K.The Members of the family reoviridae // in: Joklik W.K. The Reoviridae.- New York: Plenum Press.- 1983,- p. 1-6.
68. Jones R.C. Avian reovirus infections // Rev. sci. tech. Off. Int. Epiz.- 2000.-v.19.- p.614-625
69. Jones R.C., Georgiou K., Guneratne J.R. Rupture of digital flexor tendons ф of chickens after infection with reovirus. // Vet Rec.- 1980.- v.107.- p.180.
70. Jones R.C., Guneratne J.R., Georgiou K. Isolation of .viruses from outbreaks of suspected tenosynovitis (viral arthritis) in chickens. // Res Vet
71. Sci.-1981.- v.31.- p.100-103.
72. Jones R.C., Nwajei B.N. Reovirus-induced tenosynovitis: persistence of homologous challenge virus in broiler chicks after vaccination of parents. // Res Vet Sci.- 1985.- v.39.- p.39-41.
73. Jones R.S., Islam M.R., Kelly D.F. Early pathogenesis of experimental reovirus infection in chickens. //Avian pathol.- 1989.- v.18.- p.239- 253.
74. Jordan F.T. Mycoplasma-induced arthritis in poultry // Isr. J. Med. Sci.-1981.- v.17.- p.622-625
75. Kaji Т., Nonomura I., Sato S., Kobayashi H., Shoya S. Pathogenicity of avian reovirus and its influence on the infection of Mycoplasma gallisepticum in chickens. // Natl Inst Anim Health Q (Tokyo).- 1970,- v.10.- p.49-57.
76. Kant A., Balk F., Born L., van Roozelaar D., Heijmans J., Gielkens A., ter Huurne A. Classification of Dutch and German avian reoviruses by sequencing the sigma С protein. //Vet Res.- 2003.- v.34.- p.203-212.
77. Kapczynski D.R., Sellers H.S., Simmons V., Schultz-Cherry S. Sequence analysis of the S3 gene from a turkey reovirus. // Virus Genes.- 2002.- v.25.-p.95-100.
78. Kedl R., Schmechel S., Schiff L. Comparative sequence analysis of the reovirus S4 genes from 13 serotype 1 and serotype 3 field isolates. // J Virol.-1995.- v.69.- p.552-559.
79. Kibenge F.S.B., Dhillon A.S. A comparison of the pathogenicity of four avian reoviruses in chickens //Avian Dis.- 1986.- v.31.- p.39-42
80. Kovarova M., Draber P. New specificity and yield enhancer of polymerase % chain reactions // Nucl.ac.res.- 2000.- v.28.- p.70-74
81. Kumar R., Singhal L.K., Singh A.K., Chauhan R.S. Seroprevalence of reovirus infection in poultry in Uttaranchal // J. Immunol. Immunopathol.2002.- v.4.- р.62-63
82. Gruys E. The role of various agents in chicken amyloid arthropathy. // Amyloid.- 1998.- v.5.- p.266-278.
83. Lauerman L.H., Hoerr R.J., Sharpton A.R. et al. Development and application of polimerase chain reaction assay for Mycoplasma synoviae // Avian dis.- 1993.- v.37- p.829-834
84. Le Gall-Recule G., Cherbonnel M., Arnauld C., Blanchard P., Jestin A., Jestin V. Molecular characterization and expression of the S3 gene of muscovy duck reovirus strain 89026. // J Gen Virol.-1999.- v.80.- p.195-203.
85. Lee L.H., Shien J.H., Shieh H.K. Detection of avian reovirus RNA and comparison of a portion of genome segment S3 by polymerase chain reaction and restriction enzyme fragment length polymorphism. // Res Vet Sci.- 1998.-v.65.- p.11-15.
86. Lee L.H., Wang Y.H., Shien J.H. Comparison of the labeled avidin-biotin and the conventional enzyme-linked immunosorbent assay for detecting antibody to reovirus in chickens. // J Virol Methods.- 1994.- v.48.- p.343-347.
87. Lin Yu-Wen, Wang Kuan-Ju, Lei Huan-Yao et all. Virus Replication and
88. Cytokine Production in Dengue Virus-Infected Human В Lymphocytes // J Virol.- v.76.- p.12242-12249.
89. Liu H.J., Chen J.H., Liao M.H., Lin M.Y., Chang G.N. Identification of thesigma C-encoded gene of avian reovirus by nested PCR and restriction endonuclease analysis. //J Virol Methods.-1999.- v.81.- p.83-90.
90. Liu H.J., Giambrone J.J., Nielsen B.L. Molecular characterization of avian reoviruses using nested PCR and nucleotide sequence analysis. // J Virol Methods.- 1997.- v.65.- p.159-167.
91. Liu H.J., Huang P.H. Sequence and phylogenetic analysis of the sigmaA-encoding gene of avian reovirus. // J Virol Methods.- 2001.- v.98.- p.99-107.
92. Liu H.J., Lee L.H., Hsu H.W., Kuo L.C., Liao M.H. Molecular evolution of avian reovirus: evidence for genetic diversity and reassortment of the S-class genome segments and multiple cocirculating lineages. // Virology.- 2003.-v.314.- p.336-349.
93. Luongo C.L., Dryden K.A., Farsetta D.L., Margraf R.L., Severson T.F., Olson N.H., Fields B.N., Baker T.S., Nibert M.L. Localization of a C-terminal region of Iambda2 protein in reovirus cores. // J Virol.- 1997.- v.71.- p.8035-8040.
94. Mabrouk Т., Danis C., Lemay G. Two basic motifs of reovirus sigma 3 protein are involved in double-stranded RNA binding. // Biochem Cell Biol.-1995.- v.73.- p.137-145.
95. Mabrouk Т., Lemay G. Mutations in a CCHC zinc-binding motif of the reovirus sigma 3 protein decrease its intracellular stability. // J Virol.- 1994.-v.68.- p.5287-5290.
96. Marquardt J., Hermanns W., Schulz L.C., Leibold W. A persistent reovirus infection of chickens as a possible model of human rheumatoid arthritis (RA). // Zentralbl Veterinarmed В.- 1983.- v.30.- p.274-282.
97. Martinez-Costas J., Gonzalez-Lopez C., Vakharia V.N., Benavente J. Possible involvement of the double-stranded RNA-binding core protein sigmaA in the resistance of avian reovirus to interferon. // J Virol.- 2000.- v.74.- p.1124-1131.
98. Martinez-Costas J., Grande A., Varela R., Garcia-Martinez C., Benavente J. Protein architecture of avian reovirus S1133 and identification of the cell attachment protein. // J Virol.-1997.- v.71.- p.59-64.
99. Mayerat C., Rgisser Ph. B.U., Lavanchy D. et all. Comparison of a Competitive Combined Reverse Transcription-PCR Assay with a Branched-DNA Assay for Hepatitis С Virus RNA Quantitation // J Clin Microbiol.- 1996.-p.2702-2706.
100. McNamee P.T., Smith J.A. Bacterial chondronecrosis with osteomyelitis (femoral head necrosis) of broiler chickens: a review // Avian pathol.- 2000.-v.29.- p.477-495
101. Meanger J., Wickramasinghe R., Enriquez C.E., Wilcox G.E. Immune response to avian reovirus in chickens and protection against experimental infection. // Aust Vet J.-1997.- v.75.- p.428-432.
102. Mochow- Grundy M., Dermody T.S. The reovirus S4 gene 3' nontranslated region contains a translational operator sequence // J.Virol.- 2001.-v.75.-p.6517-6526.
103. Montgomery R.D., Villegas P., Dawe D.L., Brown J. A comparison between the effect of an avian reovirus and infectious bursal disease virus on selected aspects of the immune system of the chicken. // Avian Dis.- 1986.- v.30.-p.298-308.
104. Montgomery R.D., Villegas P., Dawe D.L., Brown J. Effect of avian reoviruses on lymphoid organ weights and antibody response in chickens. // Avian Dis.- 1985.- v.29.- p.552-560.
105. Montgomery R.D., Villegas P., Kleven S.H. Role of route of exposure, age,sex, and type of chicken on the pathogenicity of avian reovirus strain 81-176. // Avian Dis.- 1986.- v.30.- p.460-467.
106. Moradian A., Thorsen J., Julian R.J. Single and combined infections of specific-pathogen-free chickens with infectious bursal disease virus and an intestinal isolate of reovirus. //Avian Dis.- 1990.- v.34.- p.63-72.
107. Morris M.P., Fletcher O.J. Diagnostic summary of 1986 turkey, broiler breeders, and layer necropsy cases at the University of Georgia // Avian Dis.-1988.- v.32.- p.391-403
108. Mukiibi-Muka G., Jones R.C. Local and systemic IgA and IgG responses of chicks to avian reoviruses: effects of age of chick, route of infection and virus strain //Avian Pathol.- 1999.- v.28.- p. 54-60
109. Murphy G., Belda F.J., Chou-Pong P., et al. Discrimination of subtype В and non-subtype В strains of human immunodeficiency virus type 1 by serotyping: correlation with genotyping // J.Clin.Microbiol.- 1999.- v.37.-p.1356-1360.
110. Mustaffa-Babjee A., Spradbrow P.В., Omar A.R. Characterization of an avian reovirus isolated in Queensland. // J Comp Pathol.- 1973.- v.83.- p.387-400.
111. Nersessian B.N., Lukert P.D., Goodwin M.A. Antigenic comparisons of selected avian reoviruses by use of the plaque-reduction neutralization assay. //Am J Vet Res.-1989.- v.50.- p. 1475-1480.
112. Ni Y., Kemp M.C. A comparative study of avian reovirus pathogenicity: virus spread and replication and induction of lesions. // Avian Dis.- 1995.- v.39.-p.554-566.
113. Ni Y., Kemp M.C. Selection of genome segments following coinfection of chicken fibroblasts with avian reoviruses // Virology.- 1990.- v. 177.- p.625-633
114. Ni Y., Kemp M.C. Strain-specific selection of genome segments in avian reovirus coinfections. // J Gen Virol.-1992.- v.73.- p.3107-3113.
115. Ni Y., Ramig R.F., Kemp M.C. Identification of proteins encoded by avian reoviruses and evidence for post-translational modification. //Virology.- 1993.-v.193.- p.466-469.
116. Nibert M.L., Margraf R.L., Coombs K.M. Nonrandom segregation of parental alleles in reovirus reassortants. // J Virol.- 1996.- v.70.- p.7295-7300.
117. Nibert M.L., Schiff L.A., Fields B.N. Reoviruses and their replication // in Fields B.N. Fields virology. Vol.2.- Philadelphia: Lippincott-Raven.- 1995.-p.1557-1596.
118. Noble S., Nibert M.L. Core protein mu2 is a second determinant of nucleoside triphosphatase activities by reovirus cores. // J Virol.- 1997.- v.71.-p.7728-7735.
119. Odegard A.L., Chandran K., Liemann S., Harrison S.C., Nibert M.L. Disulfide bonding among micro 1 trimers in mammalian reovirus outer capsid: a late and reversible step in virion morphogenesis. // J Virol.- 2003.- v.77.-p.5389-5400.
120. O'Hara D., Patrick M., Cepica D., Coombs K.M., Duncan R. Avian reovirus major mu-class outer capsid protein influences efficiency of productive macrophage infection in a virus strain-specific manner. // J Virol.- 2001.- v.75.-p.5027-5035.
121. Olland A.M., Jane-Valbuena J., Schiff L.A., Nibert M.L., Harrison S.C. Structure of the reovirus outer capsid and dsRNA-binding protein sigma3 at 1.8 A resolution. // EMBO J.- 2001.- v.20.- p.979-989.
122. Page R.K., Fletcher O.J., Rowland G.N. Malabsorption syndrome in broiler chickens // Avian Dis.- 1982.- v.26.- p.618-624
123. D.B. Armored RNA Technology for Production of Ribonuclease-Resistant Viral RNA Controls and Standards. // J. Clin. Microbiol.- 1998.- v.36.- p.3590-3594.
124. Patel H., Nade S. Acute staphylococcal septic arthritis: the effect of cloxacillin therapy in an avian model //J.Orthop. Res.- 1988.- v.6.- p.63-72
125. Pertile T.L., Karaca K., Walser M.M., Sharma J.M. Suppressor macrophages mediate depressed lymphoproliferation in chickens infected with avian reovirus. //Vet Immunol Immunopathol.- 1996.- v.53.- p.129-145.
126. Pertile T.L., Sharma J.M., Walser M.M. Reovirus infection in chickens primes splenic adherent macrophages to produce nitric oxide in response to T cell-produced factors. // Cell Immunol.-1995,- v. 164,- p.207-216.
127. Pertile T.L., Walser M.M., Sharma J.M., Shivers J.L. Immunohistochemical detection of lymphocyte subpopulations in the tarsal joints of chickens with experimental viral arthritis. //Vet Pathol.- 1996.- v.33.- p.303-310.
128. Pringle C.R. Virus taxonomy- 1999//Arch.Virol.- 1999,-v.144.-p.421-429.
129. Reoviridae // in: Murphy F.A. Veterinary Virology.- London:Academic Press.-1999.- p.391-398.
130. Robertson M.D., Wilcox G.E., Kibenge F.S. Prevalence of reoviruses in commercial chickens. // Aust Vet J.- 1984.- v.61.- p.319-322.
131. Roessler D.E., Rosenberger J.K. In vitro and in vivo characterization of avian reoviruses. III. Host factors affecting virulence and persistence. //Avian
132. Dis.- 1989.- v.33.- p.555-565.
133. Rosenberger J.K., Olson N.O. Viral arthritis // Calnek B.W., et.al., Diseases of poultry, 10th ed. Mousby-Wolfe. - London.- 1997. - v.711-720.
134. Rosenberger J.К., Sterner F.J., Botts S., Lee K.P., Margolin A. In vitro and in vivo characterization of avian reoviruses. I. Pathogenicity and antigenic relatedness of several avian reovirus isolates. // Avian Dis.- 1989.- v.33.-p.535-544.
135. Rosenstraus M., Wang Z., Chang S.-Y., DeBonville D., Spadoro I.P. An internal control for routine diagnostic PCR: desighn, properties, and effect on clinical performance. // J. Clin. Microbiol.-1998.- v.36.- p.191-197.
136. Rozinov M.N., Fields B.N. Evidence for phenotypic mixing with reovirus in cell culture. //Virology.- 1996.- v.215.- p.207-210.
137. Sahu S.P., Olson N.O. Comparison of the characteristics of avian reoviruses isolated from the digestive and respiratory tract, with viruses isolated from the synovia. //Am J Vet Res.- 1975.- v.36.- p.847-850.
138. Seliger L.S., Zheng K., Shatkin A.J. Complete nucleotide sequence of reovirus L2 gene and deduced amino acid sequence of viral mRNA guanililtransferase // J.Biol.Chem.- 1987.- v.262.- p.16289-16293.
139. Sellers H.S., Linnemann E.G., Pereira L., Kapczynski D.R. Phylogenetic analysis of the sigma 2 protein gene of turkey reoviruses. //Avian Dis.- 2004.-v.48.- p.651-657.
140. Sharma J.M., Karaca K., Pertile T. Virus-induced immunosuppression in chickens. // Poult Sci.- 1994.- v.73.- p.1082-1086.
141. Shatkin A.J., Kozak M. Biochemical aspects of reovirus transcription and translation // in Joklik W.K. The Reoviridae.- New York: Plenum Press.- 1983.-p.79-100.
142. Shepard D.A., Ehnstrom J.G., Skinner P.J., Schiff L.A. Mutations in the zinc-binding motif of the reovirus capsid protein delta 3 eliminate its ability to associate with capsid protein mu 1. // J Virol.- 1996.- v.70.- p.2065-2068.
143. Shmulevitz M., Duncan R. A new class of fusion-associated small transmembrane (FAST) proteins encoded by the non-enveloped fusogenic reoviruses. // EMBO J.- 2000.- v.19.- p.902-912.
144. Enteropathogenicity of Dutch and German avian reoviruses in SPF white leghorn chickens and broilers. //Vet Res.- 2003.- v.34.- p.285-295.
145. Spinner M.L., Di Giovanni G.D. Detection and identification of mammalian reoviruses in surface water by combined cell culture and reverse transcription
146. PCR. // Appl Environ Microbiol.- 2001.- v.67.- p.3016-3020.
147. Sterner F.J., Rosenberger J.K., Margolin A., Ruff M.D. In vitro and in vivo characterization of avian reoviruses. II. Clinical evaluation of chickens infected with two avian reovirus pathotypes. //Avian Dis.- 1989.- v.33.- p.545-554.
148. Takase K., Nishikawa H.( Nonaka F., Yamada S. Pathogenic characteristics of highly virulent avian reovirus, strain 58-132, isolated from a chicken with tenosynovitis. // Nippon Juigaku Zasshi.- 1985.- v.47.- p.567-574.
149. Takehara K., Kiuchi H., Kuwahara M., Yanagisawa F., Mizukami M., Matsuda H., Yoshimura M. Identification and characterization of a plaque forming avian rotavirus isolated from a wild bird in Japan. // J Vet Med Sci.-1991.- v.53.- p.479-486.
150. Tang K.N., Fletcher O.J. Application of the avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) technique for detecting avian reovirus in chickens. // Avian Dis.- 1987.- v.31.- p.591-596.
151. Tang K.N., Fletcher O.J., Villegas P. Comparative study of the pathogenicity of avian reoviruses. //Avian Dis.- 1987.- v.31.- p.577-583.
152. Tang K.N., Fletcher O.J., Villegas P. The effect on newborn chicks of oralinoculation of reovirus isolated from chickens with tenosynovitis. // Avian Dis.-1987.- v.31.- p.584-590.
153. Tantawi H.H., Amina N. Youssef Y.I., Fawzia M., Al-Abdulla J.M., el-Batrawi A., el-Ghawas A., Nasser A.A., Reda I.M. Infectious tenosynovitis in broilers and broiler breeders in Egypt. //Vet Res Commun.- 1984.- v.8.- p.229-235.
154. Upchurch D.A., Shankarappa R., Mullins J.I. Position and degree of mismatches and the mobility of DNA heteroduplexes // Nucl.ac.res.- 2000.-v.28.- p.69-74.
155. Van der Heide L. The history of avian reovirus. // Avian Dis.- 2000.- v.44.-p.638-641.
156. Van Loon A.A., Koopman H.C., Kosman W., Mumczur J., Szeleszczuk O., Karpinska E., Kosowska G., Lutticken D. Isolation of a new serotype of avian reovirus associated with malabsorption syndrome in chickens. //Vet Q.- 2001.-v.23.- p.129-133.
157. Van Loon A.A., Suurland В., van der Marel P. A reovirus challenge model applicable in commercial broilers after live vaccination. // Avian Pathol.- 2002.-v.31.- p.13-21.
158. Van Loon A.A.W.M. Novel antigenic class of avian reoviruses // Eur. Patent № EP 1 024 189 A1, Application, # 00200256.6, date of filling: 25.01.2000
159. Vasserman Y., Eliahoo D., Hemsani E., Kass N., Ayali G., Pokamunski S., Pitcovskiad J. The influence of reovirus sigma С protein diversity on vaccination efficiency. //Avian Dis.- 2004.- v.48.- p.271-278.
160. Vielitz E., Conrad C., Voss M. The occurrence of a reovirus variant in a German broiler flock // Dtsch Tierarztl Wochenschr.- 1989.- v.96.- p.380-382.
161. Wang H., Fadl A.A., Khan M.I. Multiplex PCR for avian patogenic micoplasmas//Molecular and cellular probes.- 1997.- v.11.- p.211-216
162. White P.A., Zhai X., Carter I., et al. Simplified hepatitis С virus genotyping by heteroduplex mobility analysis // J.Clin.Microbiol.- 2000.- v.38.- p.477- 482.
163. Wiener J.R., Bartlett N.M., Joklik W.K. The sequences of reovirus serotype3 genome segments M1 and M3 encoding the major protein p2 and the major nonstructural protein pNS, respectively // Virology.- 1989.- v.169.- p.293-304.
164. Wiener J.R., Joklik W.K. Evolution of reovirus genes: a comparison of serotype 1, 2 and 3 M2 genome segments which encode the major structural capside protein p1C //Virology.- 1988.- v. 163.- p.603-613.
165. Wiener J.R., Joklik W.K. The sequences of the reovirus serotype 1, 2 and 3 L1 genome segments and analysis of the mode of divergence of the reovirus serotypes //Virology.- 1989.- v.169.- p. 194-203.
166. Wood G.W., Nicholas R.A.J., Hebert C.N., Thornton D.H. Serological comparison of avian reovirus // J.comp.path.- 1980.- v.90.- p.29-38.
167. Xie Z., Fade A.A., Girshik Т., Khan M.I. Amplification of avian reovirus RNA using the reverse transcriptase- polymerase chain reaction // Avian Dis.-1997.-v.41.- p.654- 660.
168. Zou S., Brown E.G. Identification of sequence elements containing signals for replication and encapsidation of the reovirus M1 genome segment // Virology.- 1992.- v. 186.- p.377-388.
-
Андрейчук, Дмитрий Борисович
-
кандидата биологических наук
-
Владимир, 2005
-
ВАК 03.00.06
- Биологические свойства реовируса типа I и разработка тест-системы ИФА для серологической диагностики реовирусной инфекции крупного рогатого скота
- Филогенетический анализ изолятов реовируса кур и изучение биологических свойств изолята ARV04/02rus, выделенного на территории РФ
- Разработка ассоциированной вакцины и иммуноферментных тест-систем на основе антигенов парво-, рео-, герпесвирусов и вируса вирусной диареи крупного рогатого скота
- Молекулярно-генетический анализ и биологическая характеристика полевых изолятов вируса лейкоза птиц, циркулирующих на территории Российской Федерации
- Изучение первичной структуры генома изолятов вируса высокопатогенного гриппа птиц A/H5N1, выделенных на территории Российской Федерации
