Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетический анализ и биологическая характеристика полевых изолятов вируса лейкоза птиц, циркулирующих на территории Российской Федерации

ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетический анализ и биологическая характеристика полевых изолятов вируса лейкоза птиц, циркулирующих на территории Российской Федерации"

На правах рукописи

ПЛОТНИКОВ Вадим Алексеевич

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ И БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЛЕВЫХ ИЗОЛЯТОВ ВИРУСА ЛЕЙКОЗА ПТИЦ, ЦИРКУЛИРУЮЩИХ НА ТЕРРИТОРИИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

03.02.02 - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

31 ИЮЛ 2014

МОСКВА-2014

005550909

Работа выполнена в ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского» Минздрава России.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор АЛИПЕР Тарас Иванович

Официальные оппоненты:

- доктор биологических наук, профессор ВАЛИХОВ Алексей Федорович

- кандидат биологических наук ЗУЕВ Юрий Владиславович

Ведущая организация - Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко Россельхозакадемии (ГНУ ВИЭВ Россельхозакадемии, г.Москва).

Защита состоится «06» октября 2014 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 208.131.01 при ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского» Минздрава Российской Федерации по адресу: 123098, г.Москва, ул. Гамалеи, 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского» Минздрава РФ (123098, г.Москва, ул. Гамалеи, 16).

Автореферат разослан « ¿Г/ » / 2014 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

доктор медицинских наук

Бурцева Елена Ивановна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Наиболее широко встречающийся в природе ретровирус, вызывающий неопластические заболевания домашней птицы - это вирус лейкоза птиц (ВЛП). Кроме индуцирования опухолей и негативного влияния на продуктивность птицы, ВЛП является потенциальным контаминирующим агентом живых вирусных вакцин.

Экономические потери птицефабрик, связанные с болезнью, вызываемых ВЛП, складываются из-за увеличения смертности и развития субклинической инфекции. Смертность из-за индуцирования новообразований у птиц может достигать до 20% (А. М. Fadly, 1999), а субклиничекая инфекция вызывает понижающее действие на большое количество показателей производительности, таких как яйценоскость и качество яиц (J. S. Gavora, 1987; J. S. Gavora et al, 1980; N. L.Stedman et al, 1999). Совокупный эффект болезни наносит экономические потери, исчисляемые миллионами долларов ежегодно в США (L. N. Payne, 1991). В 1990-х годах бройлерные хозяйства США охватили вспышки миелоидного лейкоза, экономические потери от которых поставили под угрозу целую бройлерную отрасль птицеводства (L. N. Payne, 1998] L. N. Payne et al, 1982; L. N. Payne, 1991; N. L.Stedman et al, 1999).

На данный момент накоплено недостаточно информации о распространении ретровирусов в птицеводческих хозяйствах Российской Федерации. Исследования, направленные на изучение распространения ВЛП были проведены сотрудниками НПО «НАРВАК» в 2001-2003 гг. Частота ВЛП-пораженных хозяйств составила 50% в 2001; 64,7% в 2002; более 80% в 2003. Антиген ВЛП выявлен у птицы в возрасте от 7 до 480 дней (Т. В. Гребенникова, 2003).

Кроме того, во многих вакцинах медицинского и ветеринарного применения в качестве субстрата для размножения вируса обычно используются эмбрионы кур и культуры клеток куриных фибробластов. Отсутствие периодического контроля куриных эмбрионов и клеток куриного происхождения, использующихся для культивирования вирусов, может привести к контаминации

вирусами животных создаваемых вакцинных препаратов для людей. Поэтому создание эффективной и быстрой тест-сисгемы для выявления ВЛП в различных биологических образцах является актуальной темой.

Цель исследования: молекулярно-генетический анализ и биологическая характеристика полевых изолятов ВЛП, циркулирующих в птицеводческих хозяйствах Российской Федерации, а также разработка тест-системы ПЦР для выявления и дифференциации различных подтипов генома вируса. Задачи исследования:

1. Провести широкомасштабный мониторинг наличия ВЛП и антител к нему в коммерческих птицеводческих хозяйствах РФ;

2. Разработать тест-систему для выявления и дифференциации ВЛП подтипов А-Б и I методом полимеразно-цепной реакции, оценить ее чувствительность и специфичность;

3. Оценить значимость разработанной тест-системы ПЦР для диагностических исследований. Разработать Методические рекомендации по выявлению вируса лейкоза птиц в куриных эмбрионах и культурах клеток куриного происхождения методом ПЦР;

4. Получить банк полевых изолятов ВЛП, циркулирующих на территории РФ и определить их биологические свойства;

5. Провести молекулярно-генетический анализ полевых изолятов ВЛП, выделенных на территории РФ, проанализировать филогенетические отношения российских и зарубежных полевых изолятов.

Объект исследвания. Исследование посвящено изучению вируса лейкоза птиц (ВЛП) - ретровируса, вызывающего неопластические заболевания домашней птицы. Кроме индуцирования опухолей и негативного влияния на продуктивность птицы, он является потенциальным контаминирующим агентом живых вирусных вакцин.

Предмет исследования. Основные результаты получены в процессе изучения распространения ВЛП в комммерческих птицеводческих хозяйствах РФ, а также исследования молекулярно-генетических и биологических свойств

полевых изолятов ВЛП, при разработке чувствительной и специфичной тест-системы ПЦР для выявления и дифференциации различных подгрупп ВЛП.

Теоретические и методологические основы исследования. В основу научно-квалификационного исследования легли вопросы вирусологии, молекулярной вирусологии, лабораторной диагностики ВЛП. В процессе работы применялись современные молекулярные и вирусологические методы исследования, методы лабораторной диагностики, эпидемиологические методы. Для анализа значимости выявленных закономерностей применялись современные методы оценки.

Информационная база исследования. В качестве информационных источников использовались научные публикации российских и зарубежных исследователей, материалы конференций, нормативные документы, инструкции к использованным в работе тест-системам, собственные результаты исследований.

Основные научные результаты исследования, полученные лично автором. Автор участвовал в сборе биологических образцов, выполнении исследований по молекулярной и серологической диагностике ВЛП в биологических материалах, участию в разработке и тестировании диагностической тест-системы на основе ПЦР, изучению молекулярно-биологических характеристик полевых изолятов ВЛП.

Получена новая информация о распространенности лейкоза птиц в коммерческих птицеводческих хозяйствах Российской Федерации в период 20052011 г.г.

Проведен молекулярно-биологический анализ российских вирусных изолятов ВЛП, выделенных в 2009-2011 гг., проведено сравнение с зарубежными штаммами. Впервые проведен филогенетический анализ полевых изолятов ВЛП. Установлено, что выделенные нами отечественные изоляты ВЛП, незначительно отличаются от зарубежных.

Впервые в РФ разработана «Тест-система для выявления и дифференциации ВЛП подтипов А-Б и I методом полимеразно-цепной реакции». Тест-система предназначена для выявления и дифференциации генома ВЛП в сыворотке крови,

в образцах тканей и опухолей, полученных от птиц, а также для анализа качества эмбрионов и клеточных культур птичьего происхождения. Положения, выносимые на защиту:

- Широкомасштабный мониторинг птицеводческих хозяйств РФ на наличие вируса лейкоза птиц (ВЛП) и антител к нему методами ИФА и ПЦР помогут выявить эпизоотическую ситуацию по распространению ВЛП и антител к нему на территории Российской Федерации;

- Разработанная «Тест-система для выявления и дифференциации ВЛП подтипов А-Б и I методом полимеразно-цепной реакции» характеризуется аналитической чувствительностью 10 копий РНК/мкл, специфичностью 100% и позволяет определять возбудителя в культуре клеток и в биологическом материале;

- Разработанная тест-система ПЦР позволяет проводить диагностику вируса птичьего лейкоза различных подгрупп, как для единичной особи, так и для группы птиц. Своевременная диагностика вируса птичьего лейкоза может существенно улучшить состояние поголовья в птицеводческих хозяйствах. -Создание банка полевых изолятов ВЛП, выделенных на территории Российской Федерации в 2009-2011 г.г. позволит провести их биологический и молекулярно-генетический анализ;

- Филогенетический анализ первичной структуры фрагмента ете1оре-тена ВЛП показал, что выделенные нами отечественные изоляты ВЛП, незначительно отличаются от изолятов, выделенных на территории других стран, что наводит на мысль об общем предшественнике.

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты, полученные при выполнении диссертации, позволили охарактеризовать эпизоотическую ситуацию по лейкозу птиц в птицеводческих хозяйствах РФ. Изолированный и охарактеризованный штамм ВЛП «2/11», представляющий подгруппу I, депонирован в государственную коллекцию вирусов Российской Федерации (ФГБУ "НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России).

Разработан и утвержден комплект нормативно-технической документации (инструкция по применению от 21.05.2009 и ТУ 9388-003-42418073-04, изв. №1 от 20.05.2009) «Тест-системы для выявления и дифференциации ВЛП подтипов A-D и J методом полимеразно-цепной реакции». Данная тест-система может использоваться в региональных ветеринарных и медицинских диагностических лабораториях для мониторинга ВЛП. Подготовлен проект Методических рекомендаций по выявлению вируса лейкоза птиц в куриных эмбрионах и культурах клеток куриного происхождения методом полимеразной цепной реакции. Методические рекомендации предназначены для использования организациями, зарегистрированными в Российской Федерации, выпускающими и контролирующими медицинские, ветеринарные иммунобиологические, профилактические препараты, и специалистами научных лабораторий. Методические рекомендации находятся на рецензии в Роспотребнадзоре.

Апробация работы. Результаты работы представлены на IX международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 27-30 ноября 2008 г.), на VI Международном ветеринарном конгрессе по птицеводству (Москва, 26-29 апреля 2010), на семинарах USDA-ARS Avian disease and Oncology Laboratory (ADOL) (13 сентября 2009 г. и 20 мая 2011 г.). Материалы диссертации доложены и рассмотрены на заседаниях ученого совета ФГБУ «НИИ Вирусологии им. Д. И. Ивановского» в 2005-2008 г.г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ, из них 2 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК МинОбрНауки России.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 146 стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 2 глав собственных исследований их обсуждения, выводов, практических предложений, списка литературы. Работа иллюстрирована 9 таблицами, 2 гистограммами, 8 рисунками и 3 приложениями. Список литературы включает 279 источников, состоящий из 9 работ отечественных и 270 зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Штаммы и изоляты вирусов ВЛП. В работе были использованы референтные штаммы ВЛП: штамм ЯЛУ-1 - представитель ВЛП подгруппы А; штамм ЫАУ-2 -представитель ВЛП подгруппы В; штамм 11АУ-49 - представитель ВЛП подгруппы С; штамм ИАУ-50 - представитель ВЛП подгруппы Б; штамм ЯАУ-О -представитель ВЛП подгруппы Е; штамм АБОЬ-Нс1 - представитель ВЛП подгруппы I. Выделенные изоляты, исследованные в данной работе, представлены в табл. 1.

Таблица 1

Полевые изоляты ВЛП, исследованные в данной работе

Jtt Изолят Материал Месяц/Год выделения Регион

1 132 кровь 06,10 ; Липецкая область

2 346 кровь 01/10 Московская область

3 138 кровь 09/10 Ростовская область

4 130 кровь 01/10 Владимирская область

5 76 кровь 03/10 Владимирская область

6 11 кровь Об/И Владимирская область

7 9 кровь 06/11 Владимирская область

8 7 кровь .06/11 Владимирская область

9 5 кровь . 06/11 Владимирская область

10 2 кровь 06/11 Владимирская область

11 3 кровь 06/11 Владимирская область

12 8 кровь 03/11 Тульская область

13 654 кровь 11/09 Новосибирская область

Методы. Сбор образцов. Для изоляции и идентификации ВЛП использовалась цельная кровь или плазма.

Выявление группоспецифического антигена р27 ВЛП в сыворотке крови кур методом ИФА. Наличие группоспецифического антигена р27 ВЛП в

исследуемых образцах и подтверждения выделения вирусных изолятов проводили с использованием коммерческого ИФА-набора производства фирмы «Synbiotics» (Франция) по методике производителя.

Выявление антител к вирусу лейкоза птиц подгруппы J. Наличие антител к ВЛП подгруппы-J определяли с использованием коммерческого ИФА-набора «Avian leukosis virus subgroup J antibody test kit» («Synbiotics», Франция) в соответствии с прилагаемой инструкцией.

Полимеразная цепная реакция, совмещенная с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Для амплификации были использованы праймеры, специфичные к определенным участкам гена envelope ВЛП. Праймеры были проверены в ОТ-ПЦР на матрице РНК референтных штаммов вирусов. Затем, праймеры были использованы в ОТ-ПЦР с использованием биологических проб от птиц. ОТ-ПЦР была проведена в объеме 25 мкл. Реакционная смесь для ПЦР содержала 5 мкл суммарной РНК, 10 пмоль каждого праймера, 1,25 ед. Taq-полимеразы, 1,25 ед. MMLV-ревертазы, Трис - HCl 67 мМ, pH 8,8, 16,6 мМ (NH4)2S04, 0,01 % Tween-20, 1.5 мМ MgCl2. Для реамплификации использовали 3 мкл ПЦР-продуктов первой реакции.

Секвенирование амплифицированных фрагментов кДНК. Для секвенирования амплифицированных ПЦР-фрагментов использовали те же праймеры, что и для проведения ПЦР. Данные секвенирования были отредактированы программным обеспечением MacVector/Assemblilign (Eastman Kodak). Для выравнивания нуклеотидных последовательностей использовали пакет программ Lasergene 6, MegEling («Lasergen Inc.», США) Построение филогенетической дендрограммы осуществляли на основе алгоритма Clustal W methods.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

Мониторинг птицеводческих хозяйств на наличие ретровирусных инфекций на территории Российской Федерации. Обследование, совместно с коллегами из ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» проводили

в 2005-2011 годах в птицеводческих хозяйствах из 47 регионов России. Было исследовано 223 хозяйства: 89 -яичного, 112 - бройлерного и 22 - племенного направлений. В ходе исследований проанализировано более 10 000 сывороток крови на содержание оз-антигсна ВЛП и антител к ВЛП подгруппы 1. Исследуемые регионы РФ представлены на Рис. 1.

Рис. 1. Регионы РФ, в которых проводили серомониторинг инфекции ВЛП: интенсивность окрашивания отображает количество птицеводческих хозяйств с серопозитивным поголовьем в данном регионе

Анализ банка сывороток, собранных за период с 2005 по 2011 год, подтвердил, что практически все (97%) обследованные фабрики яичного направления (87 птицехозяйств) и более чем 50% (57 птицехозяйств) бройлерных хозяйств инфицированы ВЛП.. Антитела против ВЛП подгруппы I выявили в образцах сывороток, собранных при обследовании 70% исследованных фабрик, как яичного, так и бройлерного направления. В сыворотках, полученных из 8 хозяйств (9% от обследованных), антитела против ВЛП-1 не обнаружили. Таким

образом, данные исследования указывают на широкое распространение инфекции лейкоза птиц на территории Российской Федерации.

Для анализа инфицированности птицы и наличия антител к ВЛП подгруппы 3 в зависимости от возраста поголовья и направления использования птицы собранные сыворотки ранжировали по семи возрастным группам для яичных и бройлерных хозяйств.

Увеличение доли положительных на gs-aнтигeн ВЛП сывороток (Рис. 2) наблюдали до возраста 101-130 сут., далее этот показатель постепенно уменьшался до 50% уровня. Наибольший рост числа образцов, в которых детектировали ВЛП, в птицеводческих хозяйствах яичного направления отмечали в одной возрастной группе (101-130 сут. до 67 %), бройлерного — в двух группах (41-100 сут. - 68 %; 101-130 сут. - 66 %).

Рис. 2. Результаты исследования сывороток птиц на наличие gs-aнmuгeнa ВЛП. По вертикали: процент положительных сывороток от общего числа исследованных сывороток в различных возрастных группах кур в птицефабриках яичного (синие столбцы) и бройлерного (зеленые столбцы) направлений. По горизонтали: отображены семь возрастных групп кур в днях.

Количество сывороток положительных на наличие антител против ВЛП-.1 (Рис. 3) у птицы из хозяйств яичного направления повышалось до 130-суточного

возраста, после чего доля серопозитивных особей резко снижалась (до 7 %) и затем достигала максимального значения (46 %) в старшей возрастной группе (более 300 сут). В бройлерных хозяйствах титр антител с возрастом птицы постоянно увеличивался. Наибольший процент сероположительных по ВЛП-1 сывороток для обоих типов птицеводческих хозяйств отмечали в старшей возрастной группе (более 300 сут); для яичного и бройлерного направления значения составили соответственно 46 и 49 %.

Рис. 3. Результаты исследования сывороток на наличие антител к ВЛП подгруппы J. По вертикали: процент положительных сывороток от обгцего числа исследованных сывороток в различных возрастных группах кур в птицефабриках яичного (синие столбцы) и бройлерного (зеленые столбцы) направлений. По горизонтали: отображены семь возрастных групп кур в днях.

Разработка метода выявления и дифференциации вируса лейкоза птиц подгрупп A-D и J. Набор специфических праймеров был разработан и подобран на основе опубликованных первичных последовательностей геномов референтных штаммов ВЛП RAV-1, RAV-2, RSV-Pr-C, SR-RSV-D, RAV-0 и HPRS-103 (Таблица 2). Праймеры были подобраны на область гена envelope. При помощи компьютерной программы данные праймеры были проверены на

специфичность и универсальность со всеми известными референтными штаммами и изолятами ВЛП, нуклеотидные последовательности которых были опубликованы в Генбанке.

Таблица 2

Праймеры, используемые для диагностики ВЛП подгрупп А-Б и .)

Название праймера Последовательность (5' —> 3')

АЛ 1 СКЮ А(Ю Твв СТО АСТ СТв Т

Н5 ввА ТСА СХ}Т вАС ТАА вАА Ав

Н 7 СвА АСС ААА СХУГААС АСА Сй

Поскольку геном ВЛП состоит из двухцепочечной РНК, а также ДНК копии, встроенной в геном птицы-хозяина, необходимо было подобрать эффективные условия для обратной транскрипции (ОТ) синтеза кДНК и ПЦР. ОТ-ПЦР проводили в одной пробирке. Был подобран следующий температурный режим (ОТ) 50°С - 45 мин., 95°С - 5 мин, (ПЦР) 95°С - 30 сек.; 5ГС - 30 сек.; синтез кДНК 72°С - 45 сек,- 30 циклов.

Был сконструирован генно-инженерный положительный контроль для тест-системы по обнаружению и дифференциаций ВЛП типов А-Б и 1 с помощью диагностических праймеров: для дифференциации лейкоза птиц типов АО- Н5 и АБ1, для дифференциации лейкоза птиц типа 1 - Н5 и Н7.

Была проведена работа по определению возможности использования смеси плазмид и их оптимальных концентраций для проведения ОТ-ПЦР.

Проверка тест-системы показала 100% специфичность и отсутствие перекрестных реакций с другими вирусами птиц. Данная тест-система позволяет надежно дифференцировать ВЛП от других вирусов птиц.

Предел чувствительности разработанной тест-системы обнаружения РНК ВЛП составил 102 ТЦД50/мл (Рис.4).

Рис. 4. Обнаружение РНК ВЛП: дорожка 1 — исходный штамм АБОЬ Нс1 (105 ТЦД50/мл); дорожки 2-6 - последовательные разведения штамма АБОЬ Нс1 от 104 до 1 ТЦД^о/мл; дорожка 7 - штамм вируса ЙАУ-2 (105 ТЦД50/мл); дорожки 8-12 - разведения вируса ИАУ-2 от 104 до 1 ТЦД50/МЛ

Аналитическую чувствительность оценивали при тестировании серийных десятикратных разведений рекомбинантной плазмиды с известным содержанием целевых копий ДНК. Аналитическая чувствительность тест-системы составила 10' 15 г РНК.

Также была определена относительная чувствительность путем сравнения разработанной тест-системы ПЦР с коммерческим ИФА-набором для обнаружения группоспецифического р27-антигена («БупЬюйсв», Франция) (Табл.

3).

Таблица 3

Сравнение чувствительности тест-систем ПЦР и ИФА

ТЦДю/мл (шт. RAV-2, шт. ADOL-Hcl) Метод Количество дней после инокуляции КК ФЭК

1 2 3 7

104 ПЦР ИФА + + + + +

10J ПЦР ИФА - + + + +

102 ПЦР ИФА + + + +

10 ПЦР ИФА - - +

Провирусная ДНК ВЛП в КК ФЭК, инокулированных вирусом с титром инфекционное™ 100 ТЦД5о/мл и более, детектировали на второй день после инокуляции вирусом при помощи разработанной тест-системы ПЦР. Группоспецифический антиген р27 обнаруживался методом ИФА только на 7-ые сутки после инокуляции.

Изоляция и характеристика полевых изолятов вируса лейкоза птиц, циркулирующих на территории России в 2009-2011 гг. Из 186 исследованных проб крови удалось выделить 13 изолятов из различных областей Российской Федерации. Выделенные изоляты, время, место изоляции, а также характеристика биологических проб, из которых они были выделены, представлены в табл. 1 (см. материалы и методы).

Изоляты ВЛП размножались в КК ФЭК с титром инфекционности 4,0-6,0±0,2 ТЦП50/мл. Контаминацию вирусами БМ, ВРЭ исключили методом РИФ.

Штамм ВЛП «2/11», представляющий подгруппу J, депонирован в государственную коллекцию вирусов РФ (ФГБУ "НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России).

Определение и сравнительный анализ первичной структуры вариабельной области гена envelope изолятов вируса лейкоза птиц, выделенных на птицефабриках России в 2009-2011 гг.. Для выявления генома вируса лейкоза птиц из инокулированных культур клеток ФЭК была выделена РНК, которую использовали как матрицу в ОТ-ПЦР. В результате амплификации с системой праймеров для выявления и дифференциации вируса лейкоза A-D синтезировали вирусспецифический фрагмент кДНК размером 314 п.н. и 738 п.н. - в результате амплификации с праймерами для лейкоза J. Фрагменты в 314 и 738 нуклеотидных пар, соответствующие вариабельному 5'-концевому участку гена envelope.

4

4:

-с

HZ

-Е

№76 №132

China SD0501 US AY013303 №8

S. Korea QQ500007 US AY013304

ALV Vladimir AD France 363745 France RSA US PDRC-1039 US PDRC-3246 US PDRC-3249 UK MQNCSU №130 US LR-9

Japan AB112960 Japan TymS90 №9 №346 №7 №5 №2 №138 №654 №3 №11

YJ_Vladimir

China SD07LK1

China SD07LK2

China SD07LK1

China NX0101

US HPRS103 (subgroup J)

MJ Vladimir

Рис. 5. Филогенетическая дендрограмма, построенная на основании первичной структуры фрагмента кДНК гена envelope ВЛП

18 16 14 12 10 8 6 4 2 О Доля нуклеотидных замен (х100)

Анализ филогенетической дендрограммы показал (Рис. 5), что изоляты 130, 76, 132, 8, образуют с известными ранее изолятами одну генетическую группу, с уровнем внутригрупповых отличий не превышающих 5%.

Изоляты 9, 7, 2, 5, 3, 11, 138, 346 и 654 образуют вторую обширную генетическую группу с изолятами ВЛП подгруппы J, выделенных на территории Китая, Франции и США. Внугригрупповые отличия в данной группе превышают 10%.

ВЫВОДЫ

1. Исследование птицеводческих хозяйств различных регионов Российской Федерации показало, что 97% фабрик яичного направления и более чем в 50% бройлерных хозяйств инфицированы ВЛП.

2. Антитела против ВЛП подгруппы J выявили в образцах сывороток, собранных при обследовании 70% исследованных фабрик, как яичного, так и бройлерного направления. Наибольший процент сероположительных сывороток отмечали в старшей возрастной группе (более 300 сут); для яичного и бройлерного направления значения составили соответственно 46 и 49 %.

3. Показано, что максимальное количество образцов, в которых детектировали gs-антиген ВЛП, в птицеводческих хозяйствах яичного направления отмечали в возрастной группе (101-130 сут. до 67 %), а бройлерного — в двух группах (41100 сут. - 68 %; 101-130 сут. - 66 %).

4. Показано, что разработанная тест-система для обнаружения и дифференциации ВЛП подгрупп A-D и J методом полимеразно-цепной реакции может быть использована для выявления и дифференциации различных подтипов ВЛП в птицеводческих хозяйствах РФ. Специфичность тест-системы составляет 100%, аналитическая чувствительность 10"15 г РНК.

5. Установлено, что 13 полевых изолятов, выделенных на территории России в течение 2009-2011 гг., согласно нуклеотидной последовательности вариабельной части гена envelope, принадлежат к различным подтипам ВЛП и формируют 2 генетические группы.

6. Методом филогенетического анализа установлено, что российские изоляты ВЛП на 5-10% нуклеотидных замен отличаются от зарубежных, что прямо указывает на один общий предшественник.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Разработана нормативно-техническая документация (инструкция по применению от 21.05.2009 и ТУ 9388-003-42418073-04, изв. №1 от 20.05.2009), утвержденная в Россельхознадзоре. Производство тест-системы передано в ООО «ВЕТБИОХИМ». '

2. «Тест-система для обнаружения и дифференциации вирусов лейкоза птиц подтипов AD и J» используется более 5 лет в ветеринарных региональных лабораториях.

3. Разработаны «Методические рекомендации по выявлению вируса лейкоза птиц в куриных эмбрионах и культурах клеток куриного происхождения методом полимеразной цепной реакции», которые находятся на рецензии в Роспотребнадзоре.

4. Создан банк данных нуклеотидных последовательностей вариабельной области гена envelope отечественных изолятов вируса лейкоза птиц, выделенных на территории РФ в 2009-2011 годах.

5. Изолированый и охарактеризованный штамм ВЛП «2/11», представляющий подгруппу J, депонирован в государственную коллекцию вирусов (ГКВ) Российской Федерации (ФГБУ "НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России) (удостоверение о депонировании в ГКВ от 09.07.2014).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в резензируемых изданиях, рекомендованных ВАК

1. Плотников В.А, Гребенникова Т.В., Южаков А. Г., Дудникова Б.К., Норкина С.Н., Забережный А. Д., Алипер Т.И., Фадли А. М. Молекулярно-генетический

анализ полевых изолятов вируса лейкоза птиц, циркулирующих на территории РФ // Вопросы вирусологии. -2012, Т. 57, -№. 5. -С. 39-43.

2. Плотников В. А., Гребенникова Т. В, Дудникова Е. К, Шульпин М. И, Лазарева С. П, Никонова 3. Б, Меныцикова А. Э., Норкина С. Н, Алипер Т. И. О распространении вируса лейкоза птиц в птицеводческих хозяйствах на территории России.// Сельскохозяйственная биология. - 2013. - №6.- С. 36-42

Публикации в других изданиях

3. Плотников В. А., Алипер Т. И, Дудникова Е. К, Норкина С. Н, Гребенникова Т. В. Распространение вируса лейкоза птиц на территории Российской Федерации. // Труды IX международного конгресса «Здоровье и образование в XXI веке». -27-30 ноября 2008 г. - С. 415.

4. Плотников В.А., Гребенникова Т.В, Норкина С.Н, Дудникова Е.К, Алипер Т.Н. Филогенетический анализ изолятов вируса лейкоза птиц, циркулирующих на территории Российской Федерации.// Материалы VI международного ветеринарного конгресса по птицеводству, 26-29 апреля 2010 г, г. Москва, С. 4448.

5. Гребенникова Т.В, Плотников В.А., Алипер Т.П., Непоклонов Е. А. Методические рекомендации по выявлению вируса лейкоза птиц в куриных эмбрионах и культурах клеток куриного происхождения методом полимеразной цепной реакции. - 2013 - 17с. (на утверждении в Роспотребнадзоре).

Подписано в печать « 16 » июля 2014 г. Формат 60x84/16 Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 218 КОПИ-ЦЕНТР св.: 77 007140227 г. Москва, ул. Енисейская, д. 36. тел.: 8-499-185-79-54, 8-906-787-70-86 www.kopirovka.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Плотников, Вадим Алексеевич, Москва

ФГБУ «НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВИРУСОЛОГИИ ИМ. Д.И. ИВАНОВСКОГО» МИНЗДРАВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

04201460890 На правах рукописи

ПЛОТНИКОВ ВАДИМ АЛЕКСЕЕВИЧ

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ И БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЛЕВЫХ ИЗОЛЯТОВ ВИРУСА ЛЕЙКОЗА ПТИЦ, ЦИРКУЛИРУЮЩИХ НА ТЕРРИТОРИИ РОССИЙСКОЙ

ФЕДЕРАЦИИ

Специальность 03.02.02 - вирусология

ДИССЕРТАЦИЯ На соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель-доктор биологических наук, профессор Алипер Т. И.

Москва-2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.....................................................................................5

ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................................7

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ......................................................................15

1.1. Историческая справка.............................................................................15

1.2. Характеристика ВЛП................................................................................17

1.2.1. Классификация.....................................................................................17

1.2.2. Морфология и физические свойства..................................................19

1.2.3. Организация генома и свойства кодируемых белков.......................20

1.2.4. Репликация вируса................................................................................22

1.2.5. Устойчивость......................................................................................25

1.2.6. Антигенные свойства..........................................................................26

1.2.7. Культивирование..................................................................................28

1.3. Генетическая вариабельность штаммов ВЛП.....................................29

1.3.1. Сравнительный нуклеотидный анализ гена env вирусных изолятов ВЛП подгрупп A-J...........................................................................................30

1.3.2. Филогенетические отношения изолятов ВЛП.................................32

1.4. Клинические признаки.............................................................................33

1.5. Паталогоанатомические и гистологические изменения.................36

1.6. Эпизоотологические особенности ВЛП...............................................39

1.6.1. Распространение..................................................................................41

1.6.2. Вирусоносителъство............................................................................43

1.6.3. Пути передачи......................................................................................44

1.7. Методы диагностики ВЛП......................................................................47

1.8. Иммунитет..................................................................................................50

1.9. Меры борьбы и профилактики..................................................................53

1.10. Заключение по обзору литературы.......................................................55

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..............................................................58

2.1. Материалы..................................................................................................58

2.1.1. Штаммы и изоляты вирусов ВЛП.....................................................58

2.1.2. Культуры клеток.................................................................................59

2.1.3. Растворы и реагенты..........................................................................60

2.1.4 Реагенты и наборы для молекулярной биологии................................61

2.2. Методы........................................................................................................63

2.2.1. Сбор образцов.......................................................................................63

2.2.2. Приготовление культур клеток.........................................................64

2.2.3. Выделение и идентификация ВЛП.....................................................64

2.2.4. Выявление группоспецифического антигена р27 ВЛП в сыворотке крови кур методом ИФА...............................................................................65

2.2.5. Выявление антител к вирусу лейкоза птиц подгруппы-3...............65

2.2.6. Определение стерильности................................................................65

2.2.7. Замораживание клеток.......................................................................65

2.2.8. Выделение суммарной РНК.................................................................66

2.2.9. Полимеразная цепная реакция, совмещенная с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР).............................................................................67

2.2.10. Электрофорез ДНК в агарозном геле..............................................67

2.2.11. Конструирование рекомбинантной плазмиды...............................68

2.2.13. Секвенирование амплифицированных фрагментов кДНК.............71

2.2.14. Компьютерный анализ и сравнение первичных нуклеотидных последовательностей....................................................................................72

2.2.15. Статистическая обработка результатов....................................72

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ...................73

3.1. Мониторинг птицеводческих хозяйств на наличие ретровирусных инфекций на территории Российской Федерации.....................................73

3.2. Разработка тест-системы на основе ПЦР для выявления и дифференциации вируса лейкоза птиц подгрупп А-О и 3..........................81

3.3. Изоляция и характеристика полевых изолятов вируса лейкоза птиц, циркулирующих на территории России в 2009-2011 гг.............................92

3.4. Определение и сравнительный анализ первичной структуры вариабельной области гена envelope изолятов вируса лейкоза птиц, выделенных на птицефабриках России в 2009-2011 гг..............................97

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ....................................................101

ВЫВОДЫ.............................................................................................................109

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...................................................................................111

ПРИЛОЖЕНИЯ...................................................................................................139

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АГ - антиген; АТ - антитела;

БСА - бычий сывороточный альбумин;

ВЛП - вирус лейкоза птиц;

ВРЭ - вирус ретикулоэндотелиоза птиц;

ВСР - вирус саркомы Рауса;

ДСН - додецилсульфат натрия;

ДМСО - диметилсульфоксид;

ИФА - иммуноферментный анализ;

КЭ - куриные эмбрионы;

КК - культура клеток;

ЛЛ - лимфоидный лейкоз;

ЛС-комплекс- лейкозно-саркомный комплекс;

мРНК - матричная РНК;

МАТ - моноклональные антитела;

МПА - мясо-пептонный агар;

МПБ - мясо-пептонный бульон;

МППБ - мясо-пептонный печеночный бульон;

МСК - метод связывания комплимента;

н/о - не обнаружен;

ОТ - обратная транскриптаза;

п.н - пар нуклеотидов;

ПЦР - полимеразно-цепная реакция;

РИФ - реакция иммунофлюоресценции;

РН - реакция нейтрализации;

РЭК - развивающиеся эмбрионы кур;

РНИФ — реакция непрямой иммунофлюоресценции;

РФ - Российская Федерация;

СПФ - свободные от патогенного фактора;

ТС - тканевая среда;

ФБР - фосфатно-буферный раствор;

ФС - метод фенотипического смешивания;

ФЭК - фибробласты эмбрионов кур;

ЦНС - центральная нервная система;

ЭДТА - этилендиаминотетраацетат;

ADOL - лаборатория онкогенных болезней птиц, США;

dNTP - дезоксорибонуклеотидтрифосфат;

dATP - дезоксиаденозинтрифосфат;

ELISA - enzyme-linked immunosorbent assay

ВВЕДЕНИЕ

Наиболее широко встречающийся в природе ретровирус, вызывающий неопластические заболевания домашней птицы - это вирус лейкоза птиц (ВЛП). Кроме индуцирования опухолей и негативного влияния на продуктивность птицы, он является потенциальным контаминирующим агентом живых вирусных вакцин.

ВЛП является членом лейкозно-саркомной (ЛС) группы, относящейся к подсемейству Онкоге1гоутпае семейства Яе1гоутс1ае [207], и по свойствам гликопротеинов вирусной оболочки классифицируется на шесть подгрупп: А, В, С, Б, Е и ] [53, 186]. Экзогенные (подгруппы А, В, С, Б и I) и эндогенные вирусы (подгруппа Е) имеют полностью сформированный геном, т.е. не являются дефектными и для трансформации клеток требуют активации генов хозяина (протоонкогенов) [55, 88].

Экзогенные ВЛП способны индуцировать различные формы новообразований; в естественных условиях самым распространенным видом опухолей, вызываемых этой группой, является лимфоидный лейкоз (ЛЛ) или В-клеточная лимфома, первично-образующаяся в Фабрициевой сумке и инициирующая образование метастазов в висцеральных органах [87, 186]. Экзогенные ВЛП передаются обычно как вертикально, так и горизонтально, в процессе, требующем наличия полной инфекционности вируса.

Эндогенные вирусные гены (еу) наследуются, как гены хозяина и могут быть, или не быть экспрессированы [24, 61]. Полностью инфекционные эндогенные вирусы могут предаваться конгенитально, горизонтально или генетически. Экспрессия эндогенных ВЛП (ВЛП-Е) изменяет восприимчивость цыплят, увеличивая продолжительность виремии и последующей толерантности к инфицированию вирусами подгруппы А [9, 61,88].

Экономические потери птицефабрик, связанные с болезнью, вызываемых ВЛП, складываются из-за увеличения смертности и развития субклинической инфекции. Смертность из-за индуцирования новообразований у птиц может достигать до 20% [94], а субклиничекая инфекция вызывает понижающее действие на большое количество показателей производительности, таких как яйценоскость и качество яиц [108, 109, 242]. Совокупный эффект болезни наносит экономические потери, исчисляемые миллионами долларов ежегодно в США [184]. В 1990-х годах бройлерные хозяйства США охватили вспышки миелоидного лейкоза, экономические потери от которых поставили под угрозу целую бройлерную отрасль птицеводства [182, 189, 190, 242].

На данный момент накоплено недостаточно информации о распространении ретровирусов в птицеводческих хозяйствах Российской Федерации. Исследования, направленные на изучение распространения вируса лейкоза птиц были проведены сотрудниками НПО «НАРВАК» в 20012003 гг. Частота ВЛП-пораженных хозяйств составила 50% в 2001; 64,7% в 2002; более 80% в 2003. Антиген ВЛП выявлен у птицы в возрасте от 7 до 480 дней [3].

Лечение ретровирусных инфекций не приводит к значительному положительному результату, также не существуют эффективных вакцин против ВЛП. Поэтому основной контроль данных инфекций основан на выявлении и удалении из стада инфицированной птицы [87]. Именно поэтому необходимо совершенствовать и внедрять методы диагностики.

Кроме того, во многих вакцинах медицинского и ветеринарного применения в качестве субстрата для размножения вируса обычно используются эмбрионы кур и культуры клеток куриных фибробластов. Применение этих субстратов в качестве компонентов для производства вакцин требует особого контроля в связи с широким распространением в птицеводческих хозяйствах нашей страны и других стран мира (Европа, Америка, Азия) разных вирусных инфекций с латентным и острым течением,

в том числе вызываемых вирусами лейкоза птиц, вирусами анемии цыплят. Кроме того, отсутствие периодического контроля куриных эмбрионов и клеток куриного происхождения, использующихся для культивирования вирусов, может привести к контаминации вирусами животных создаваемых вакцинных препаратов для людей. Поэтому создание эффективной и быстрой тест-системы для выявления вируса лейкоза птиц в различных биологических образцах является актуальной темой.

Цели и задачи исследований.

Цель исследования - молекулярно-генетический анализ и биологическая характеристика полевых изолятов вируса лейкоза птиц, циркулирующих в птицеводческих хозяйствах Российской Федерации, а также разработка тест-системы ПЦР для выявления и дифференциации различных подтипов генома вируса.

Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:

- провести широкомасштабный мониторинг наличия ВЛП и антител к нему в коммерческих птицеводческих хозяйствах РФ;

- разработать тест-систему для выявления и дифференциации ВЛП подтипов А-0 и I методом полимеразно-цепной реакции, оценить ее чувствительность и специфичность;

оценить значимость разработанной тест-системы ПЦР для диагностических исследований. Разработать Методические рекомендации по выявлению вируса лейкоза птиц в куриных эмбрионах и культурах клеток куриного происхождения методом ПЦР;

- получить банк полевых изолятов ВЛП, циркулирующих на территории РФ и определить их биологические свойства;

- провести молекулярно-генетический анализ полевых изолятов ВЛП, выделенных на территории РФ, проанализировать филогенетические отношения российских и зарубежных полевых изолятов.

Объект исследвания. Исследование посвящено изучению вируса лейкоза птиц (ВЛП) - ретровируса, вызывающего неопластические заболевания домашней птицы. Кроме индуцирования опухолей и негативного влияния на продуктивность птицы, он является потенциальным контаминирующим агентом живых вирусных вакцин.

Предмет исследования. Основные результаты получены в процессе изучения распространения ВЛП в комммерческих птицеводческих хозяйствах РФ, а также исследования молекулярно-генетических и биологических свойств полевых изолятов ВЛП, при разработке чувствительной и специфичной тест-системы ПЦР для выявления и дифференциации различных подгрупп ВЛП.

Теоретические и методологические основы исследования. В основу научно-квалификационного исследования легли вопросы вирусологии, молекулярной вирусологии, лабораторной диагностики ВЛП. В процессе работы применялись современные молекулярные и вирусологические методы исследования, методы лабораторной диагностики, эпидемиологические методы. Для анализа значимости выявленных закономерностей применялись современные методы оценки.

Информационная база исследования. В качестве информационных источников использовались научные публикации российских и зарубежных исследователей, материалы конференций, нормативные документы, инструкции к использованным в работе тест-системам, собственные результаты исследований.

Личный вклад автора состоит в сборе биологических образцов, выполнении исследований по молекулярной и серологической диагностике ВЛП в биологических материалах, участию в разработке и тестировании диагностической тест-системы на основе ПЦР, изучению молекулярно-биологических характеристик полевых изолятов ВЛП. Автором лично выделены и изучены молекулярно-биологические свойства 13 полевых

изолятов ВЛП. Все материалы, представленные в диссертационной работе, были обобщены и проанализированы лично автором.

Научная новизна. Получена новая информация о распространенности лейкоза птиц в коммерческих птицеводческих хозяйствах Российской Федерации 2005-2011 г.г.

Проведен молекулярно-биологический анализ российских вирусных изолятов ВЛП, выделенных в 2009-2011 гг., проведено сравнение с зарубежными штаммами. Впервые проведен филогенетический анализ полевых изолятов ВЛП. Установлено, что выделенные нами отечественные изоляты ВЛП, незначительно отличаются от зарубежных.

Впервые в РФ разработана «Тест-система для выявления и дифференциации ВЛП подтипов А-0 и I методом полимеразно-цепной реакции». Тест-система предназначена для выявления и дифференциации генома ВЛП в сыворотке крови, в образцах тканей и опухолей, полученных от птиц, а также для анализа качества эмбрионов и клеточных культур птичьего происхождения.

Основные положения, выносимые на защиту.

- Широкомасштабный мониторинг птицеводческих хозяйств РФ на наличие вируса лейкоза птиц (ВЛП) и антител к нему методами ИФА и ПЦР поможет выявить эпизоотическую ситуацию по распространению ВЛП и антител к нему на территории Российской Федерации;

- Разработанная «Тест-система для выявления и дифференциации ВЛП подтипов А-Б и 1 методом полимеразно-цепной реакции» характеризуется аналитической чувствительностью 10 копий РНК/мкл, специфичностью 100% и позволяет определять возбудителя в культуре клеток и в биологическом материале.

- Разработанная тест-система ПЦР позволяет проводить диагностику вируса птичьего лейкоза различных подгрупп, как для единичной особи, так и для группы птиц. Своевременная диагностика вируса птичьего лейкоза может существенно улучшить состояние поголовья в птицеводческих хозяйствах.

-Создание банка полевых изолятов ВЛП, выделенных на территории Российской Федерации в 2009-2011 г.г. позволит провести их биологический и молекулярно-генетический анализ.

- Филогенетический анализ первичной структуры фрагмента ете1оре-гена ВЛП показал, что выделенные нами отечественные изоляты ВЛП незначительно отличаются от изолятов, выделенных на территории других стран, что наводит на мысль об общем предшественнике.

Практическая значимость.

Результаты, полученные при выполнении диссертации, позволили охарактеризовать эпизоотическую ситуацию по лейкозу птиц в птицеводческих хозяйствах РФ.

Изолированый и охарактеризованный штамм ВЛП «2/11», представляющий подгруппу I, депонирован в государственную коллекцию вирусов Российской Федерации (ФГБУ "НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России).

Разработан и утвержден комплект нормативно-технической документации (инструкция по применению от 21.05.2009 и ТУ 9388-00342418073-04, изв. №1 от 20.05.2009) «Тест-системы для выявления и дифференциации ВЛП подтипов А-0 и ] методом полимеразно-цепной реакции». Данная тест-система может использоваться в региональных ветеринарных и медицинских диагностических лабораториях для мониторинга ВЛП.

Результаты мониторинга птицеводческих хозяйств РФ помогут улучшить контроль чистоты куриных эмбрионов и клеток куриного происхождения, использующихся для культивирования вирусов, при производстве вакцинных препаратов для людей и животных.

Тест-система может также быть использована для проведения научно-практических занятий в Университетах и Институтах медицинского и ветеринарного профиля Министерства Образования РФ.

Подготовлен проект Методических рекомендаций по выявлению вируса лейкоза птиц в куриных эмбрионах и культурах клеток куриного происхожд