Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетическая характеристика штаммов вируса миксомы кроликов

ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетическая характеристика штаммов вируса миксомы кроликов"

На правах рукописи

*С!' (у

Синдрякова Ирина Петровна

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ ВИРУСА МИКСОМЫ КРОЛИКОВ

03.02.02 Вирусология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

12 СЕН 2013

005532881

Покров-2013

005532881

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии)

Научный руководитель:

доктор ветеринарных наук,

профессор, директор института Колбасов Денис Владимирович

ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, Еремец Владимир Иванович

профессор,

заместитель директора ГНУ ВНИТИБП Россельхозакадемии

заведующий отделом Вирусологии ФГБУ«ВГНКИ»

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетно учреждение Федеральный центр токсикологической, радиационной биологической безопасности (ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ»), г. Казань.

Защита диссертации состоится «10» октября 2013 г. в «10—» часов на заседании диссертационного совета Д 006.003.01 при Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии по адресу: 601120, Владимирская обл., Покров. Тел/факс: (49243) 62125.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

Автореферат разослан «29» августа 2013 г. и размещён на официальном сайте ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии www.vniiwim.ru и на официальном сайте ВАК России www.vak2.ed.gov.ru

Учёный секретарь диссертационного совета

доктор ветеринарных наук, профессор,

Уласов Валентны Ильич

ГНУ ВНИИВВИМ Россельхозакадемии, кандидат биологических наук

Балашова Елена Алексеевна

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ 1.1 Актуальность проблемы

Миксоматоз кроликов (Myxomatosis cuniculorum)- остро протекающая высококонтагиозная болезнь, вызываемая ДНК содержащим вирусом рода Leporipoxvirus семейства Poxviridae. Заболевание характеризуется серозно-гнойным конъюнктивитом, воспалением слизистых оболочек, образованием опухолевых узелков на коже и появлением в терминальной стадии студенистых отеков в области головы, спины, половых органов, часто заканчивается летальным исходом [Сюрин, 1998].

Лабораторная диагностика миксоматоза кроликов в Российской Федерации заключается в гистологическом исследовании патологического материала. При отрицательном результате этого исследования и отсутствии характерных клинических признаков прибегают к биопробе на кроликах.

Эффективность мероприятий по борьбе с миксоматозом зависит от специфической вакцинопрофилактики, своевременного выявления возбудителя, контроля его распространения и изменчивости.

Для специфической профилактики используются живые аттенуированные вакцины. В связи с этим, при обнаружении у животных вируса миксомы кроликов возникает необходимость в его дифференциации.

Однако в отечественной литературе нет данных, о методах позволяющих различить штаммы и изоляты вируса миксомы кроликов.

Работы М. Morales, Jia Liu, P.J.Kerr, основанные на молекулярно-генетических исследованиях показали, что изучение генов, являющихся факторами вирулентности, позволяет выявлять локусы, которые могут быть использованы для дифференциации штаммов и изолятов вируса миксомы кроликов [М. Morales, 2008, Jia Liu, 2012, P.J.Kerr,2012],

В этой связи, изучение молекулярно-генетической характеристики вируса, разработка тест-систем на основе ПЦР для идентификации и дифференциации штаммов вируса миксомы кроликов, внедрение их в практику рутинных исследований является актуальной задачей.

1.2 Степень разработанности проблемы

В Российской Федерации опубликован ряд рекомендаций по борьбе с миксоматозом кроликов, разработана вакцина на основе штамма В-82 против

миксоматоза кроликов и изучены ее свойства (Кузнецова Г.Д., 1988). Предложены системы ПЦР и ПЦР в режиме реального времени для выявления генома вируса миксомы кроликов (Моргунов С.Ю., 2010, Бурмакина Г.С.,2013).

Но отсутствуют данные молекулярно-генетических характеристик штаммов вируса миксомы кроликов, а также тест системы, позволяющие выявлять и дифференцировать геном вируса.

1.3 Цели и задачи исследования

Основной целью исследований являлось изучение молекулярно-генетических характеристик штаммов вируса миксомы кроликов.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Подобрать праймеры и режимы амплификации различных участков генома вируса миксомы кроликов.

2. Определить нуклеотидные последовательности амплифицированных фрагментов.

3. Провести филогенетический анализ штаммов и полевых изолятов вируса миксомы кроликов.

4. Определить генетические маркеры производственного вакцинного штамма В-82 вируса миксомы кроликов.

5. Разработать тест-систему на основе ПЦР для выявления и дифференциации генома вакцинных штаммов и полевых изолятов вируса миксомы кроликов.

1.4 Научная новизна исследований

Впервые в Российской Федерации определены нуклеотидные последовательности фрагментов генов М007Ь, МОЮЬ, М061Л, М13011 ,М135Я, М 15211 штаммов МР, В-82, Микс-98 и изолятов вируса миксомы кроликов, циркулирующих на территории страны.

Определен участок генома, несущий генетические маркеры вакцинного штамма В-82 вируса миксомы кроликов.

Проведен филогенетический анализ по гену М13011 вируса миксомы кроликов, в результате которого выяснено, что вакцинный штамм В-82 и его дериват Микс-98, а также матричные расплодки закладок вакцинного штамма В-82 1992 и 2010 гг. формируют отдельную ветвь филограммы.

Установлено, что эпизоотические изоляты, циркулирующие на территории Российской Федерации, идентичны друг другу и имеют сходство 99% с группой вирусов, выделенных на территории Европы и Австралии.

Впервые в Российской Федерации разработан комплекс методов для выявления и дифференциации полевых изолятов и вакцинных штаммов вируса миксомы кроликов на основе различных вариантов ПЦР (ПДРФ-анализ, ПЦР в режиме реального времени).

1.5 Теоретическая и практическая значимость работы

Проведено секвенирование штаммов MP, В-82 и Микс-98, депонированных в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, и трех изолятов вируса миксомы кроликов, выделенных в различных регионах Российской Федерации в период с 2009-2012 гг.

Разработана методика выявления генома вируса миксомы кроликов методом ПЦР в формате электрофоретической детекции.

Разработана методика выявления и дифференциации ДНК вакцинных штаммов и полевых изолятов вируса миксомы кроликов методом ПДРФ анализа продуктов ПЦР.

Разработана методика выявления и дифференциации ДНК вакцинных штаммов и полевых изолятов вируса миксомы кроликов методом ПЦР с детекцией в режиме реального времени.

Результаты экспериментальной работы использованы при разработке следующих документов:

- «Методические рекомендации по выявлению ДНК вируса миксомы кроликов методом полимеразной цепной реакции», которые утверждены Академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии A.M. Смирновым 16.11.2011 г.;

- «Методические рекомендации по выявлению и дифференциации вакцинных штаммов и полевых изолятов вируса миксомы кроликов методом ПДРФ анализа» и «Методические рекомендации по выявлению и дифференциации вакцинных штаммов и полевых изолятов вируса миксомы кроликов методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени», которые утверждены директором ГНУ ВНИИВВИМ Россельхозакадемии Д.В. Колбасовым 05.07.2013 г.

1.6 Степень достоверности и апробация работы

Степень достоверности результатов проведённых исследований подтверждена статистическими исследованиями и комиссионными испытаниями. Акты комиссионных испытаний утверждены директором ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии 16.11.2011 г., 04.0~.2013 г. Статистическая обработка включала расчёты средних арифметических значений, стандартных отклонений результатов полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, вычисления эволюционных дистанций с помощью программы МЕвА 5,0. Научные положения, выводы и практические предложения диссертационной работы аргументировано отражают содержание диссертации.

Результаты диссертационной работы представлены и обсуждены на Международной научно-практической конференции «Задачи ветеринарной науки в реализации доктрины продовольственной безопасности Российской Федерации» (Покров, 2011 г.), Международной научно-практической конференции «Ветеринарная медицина XXI века. Инновации, опыт, проблемы и пути их решения» (г. Ульяновск, 2011 г.), а также в рамках заседания секции «Инфекционная патология животных» Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (Москва, 2011 гг.).

1.7 Публикация научных исследований

По теме диссертации опубликовано 2 научные работы, в том числе 1 статья в журнале «Ветеринарная патология», включенном в перечень изданий, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.

1.8 Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

1. Данные нуклеотидных последовательностей шести участков генома (М007Ц М010Ц М061Ц М13011, М13511, М15211) позволяют установить степень гомологии штаммов МР, В-82 и Микс-98 и трех изолятов вируса миксомы кроликов, циркулирующих на территории Российской Федерации с последовательностями, имеющимися в базе данных ОепВапк.

2. Определен участок генома, несущий генетические маркеры вакцинного штамма В-82 вируса миксомы кроликов.

3. Анализ геномов вакцинных штаммов вируса миксомы кроликов позволяет с высокой степенью вероятности утверждать о генетической стабильности вакцинного штамма В-82 за период 1992 г. по настоящее время.

4. Результаты филогенетического анализа вакцинных штаммов и полевых изолятов по гену M130R вируса миксомы кроликов, позволяют утверждать, что вакцинный штамм В-82 и его дериват Микс-98, а также матричные расплодки закладок вакцинного штамма В-82 1992 и 2010 гг. формируют отдельную ветвь филограммы и отличаются от нуклеотидных последовательностей данного участка полевых изолятов, циркулирующих на территории Российской Федерации.

5. Установлено, что эпизоотические изоляты, циркулирующие на территории Российской Федерации, идентичны друг другу и имеют сходство 99% с группой вирусов, выделенных на территории Европы и Австралии.

6. Тест-система на основе ПЦР с электрофоретической детекцией для идентификации генома вируса миксомы кроликов.

7. Тест-система на основе ПДРФ анализа, позволяющая в течение 3,5 часов выявить и дифференцировать геном вируса миксомы кроликов.

8. Тест-система ПЦР с детекцией в режиме реального времени, позволяющая в течение 2 часов выявить и дифференцировать геном вируса миксомы кроликов.

1.9 Структура и объём диссертационной работы

Диссертация изложена на 127 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение, выводы, практические предложения, список использованной литературы, включающий 15 отечественных и 139 иностранных источников; дополнена приложениями. Диссертация содержит 8 таблиц и 33 рисунка. В приложении представлены документы, подтверждающие достоверность результатов работы, её научную и практическую значимость.

1.10 Личный вклад

Основной объем исследований проведен автором самостоятельно. Консультативную и методическую помощь при выполнении отдельных этапов работы оказывали следующие сотрудники института: к.б.н. И.М. Калабеков, м.н.с. И.А. Титов, к.в.н. С.П. Живодеров, E.H. Глухарева.

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Материалы

2.1.1 Вирусы

В работе использовали штаммы из коллекции ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии: лиофилизированный материал, содержащий штамм MP вируса миксомы; лиофилизированный культуральный материал (CV-1), содержащий штамм Микс-98 вируса миксомы; производственный штамм В-82, с активностью 3,5 - 4,5 lg TCIDso/см3; культуральный материал (ФЭК), содержащий штамм В-82 вируса миксомы; культуральный материал (RK-13/2-03); а также ДНК вируса миксомы штамм Lausanne, любезно предоставленную GRANT MCFADDEN Professor, Dept.Molekular Genetics& Microbiology, College of Mdicine, University of Florida, США.

В работе использовали лиофилизированный материал, содержащий вирус фибромы Шоупа из коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

В качестве отрицательных контролей использовали ДНК культурального вируса оспы овец штамм Б5/96, клонированный вариант штамма НИСХИ.

Кроме того, в работе для выделения генома использованы пробы органов (подкожная клетчатка, селезенка, печень, цельная кровь), полученные от павших или подозреваемых на миксоматоз (вынужденно убитых) кроликов.

2.1.2 Культуры клеток

Для наработки вируса использовали перевиваемые линии клеток почки кролика (RK-13), культуру клеток фибробластов эмбрионов кур (ФЭК), перевиваемую линию клеток африканской зеленой мартышки (CV-1), которые получали в лаборатории Биотехнологии ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

В качестве отрицательных контролей для ПЦР использовали ДНК, выделенную из перевиваемых линий клеток почки кролика RK-13, культуры клеток ФЭК, культуры клеток CV-1.

2.1.3 Бактериальный штамм и плазмида

Для трансформации использовали компетентные клетки E.coli штамма Тор 10 (Invitrogen, США), а в качестве вектора для клонирования - плазмидный вектор pGEM -Т Easy (Promega, США).

2.2 Методы

2.2.1 Выделение нуклеиновых кислот

Для выделения нуклеиновых кислот из проб цельной крови, суспензий органов использовали методику нуклеосорбции на силикагеле Boom et al (1991), гуанидин тиоционат-фенол-хлороформную экстракцию и коммерческий реагент Trizol LS («Invitrogen», США).

2.2.2 Постановка полимеразной цепной реакции

Для постановки классического варианта ПЦР использовали амплификаторы "Терцик - MC 2" (ЗАО "НПФ ДНК-технология", Россия) и "Palm Cycler" (Corbett Research, Австралия). ПЦР проводили в реакционной смеси объёмом 25 мкл, содержащей необходимые компоненты для амплификации.

2.2.3 Электрофоретическая детекция продуктов ПЦР

Анализ продуктов ПЦР проводили методом электрофорезной детекции в 1,5 — 2,0 % агарозном геле, содержащем 0,4-0,5 мкг/мл интеркалирующего красителя бромистого этидия. Электрофорез проводили, используя трис -ацетатный или трис - боратный буфер при напряжении 15 В/см длины геля в течение 20 минут. Учет результатов электрофореза проводили по определению размера ПЦР-продуктов при сравнении с маркером молекулярного веса ДНК с помощью гель-документирующей системы GelDoc (BioRad, США).

2.2.4 Выделение и очистка продуктов ПЦР

Выделение и очистку продуктов ПЦР проводили с помощью этанольной преципитации, непосредственно из реакционной смеси, а также из агарозного геля. Использовали метод фенольной экстракции, после механического разрушения геля и метод нуклеосорбции, после растворения геля буфером на основе иодида натрия, а также набор Quagen.

2.2.5 Нуклеотидное секвенирование

Секвенирование проводили на автоматическом анализаторе Applied Biosystems Genetic Analyzer 3130 с использованием наборов для секвенирования Big Dye terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit.

2.2.6 Клонирование фрагментов генов

Методом электропорации трансформировали рекомбинантной плазмидой компетентные клетки Е. coli, штамм Тор 10 (Invitrogen, США). Методом

щелочного лизиса из 1,5 -2 мл бактериальной культуры каждого клона выделяли плазмидную ДНК, которую затем проверяли методом ПЦР на наличие вставки требуемой нуклеотидной последовательности.

2.2.7Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей

Множественное выравнивание нуклеотидных последовательностей проводили с использованием алгоритма "Clustal W" программы "Bio Edit 7.0.0". Для разработки олигонуклеотидных праймеров и зондов использовали программы "Oligo 6.0" и "Primer Express". Специфичность рассчитанных олигонуклеотидов проверяли при помощи интернет - сервиса BLAST (http://www.ncbi.gov.nIm.com). Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей проводили с помощью программы "Mega 5.0".

3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Секвенирование нуклеотидных последовательностей различных участков генома вируса миксомы кроликов

Первым этапом нашей работы был сравнительный анализ всех нуклеотидных последовательностей вируса миксомы кроликов, представленных в базе данных GenBank. По результатам проведенного анализа, нами было отобрано шесть участков генома для секвенирования (таблица 1).

Далее, для обнаружения генетических маркеров вируса миксомы кроликов, мы использовали штаммы, заложенные в коллекцию микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, и изоляты, полученные из Ивановской, Смоленской и Хабаровской областей во время вспышек заболевания.

3.2 Секвенирование участка M007L/R.

Данный участок находится в левой вариабельной области генома, кодирует белок, который является гомологом рецепторов интерферона гамма (INF-y). Данный белок разрушает хемокин-гликозоаминогликиновые взаимодействия, кроме вирус - инфицированных клеток, приводящие к прекращению важных хемокиновых градиентов[1Лиа, J.,2010].

Участок был амплифицирован специфичными праймерами, фланкирующими участок гена длиной 962 п.о.

Таблица 1 -Участки генома коррелирующие с факторами вирулентности BHpyca[B.Moss, 2001, Jean-Luc Guerin,2001, J.W. Barrett, 2009, Marianne M. Stanford, 2006]____

Ген Тип промотора Функция гена Позиция в геноме (5-3) Размер ампликона (п.о.)

M007L/R Ранний Гомолог рецептора 1№-у, фактор вирулентности 78918853/153864152902 962

MOI 0L Ранний ЕОР-похожий фактор роста, фактор вирулентности 13291-14199 908

M061L Ранний Ген тимидинкиназы, фактор вирулентности 57797-58333 537

M130R Ранний фактор вирулентности 122377-122742 365

M135R Ранний Рецептор альфа/бета интерферона (ІРИ-а/р), фактор вирулентности 131566-132308 742

M152R Ранний Эегрт-З, фактор вирулентности 147688-148488 801

Для детальной характеристики, полученные фрагменты были секвенированы, выравнены и сопоставлены с полногеномной последовательностью штамма Lausanne, которая выложена в GenBank под номером AF 170 726, при помощи программы BioEdit.

В результате анализа было выяснено, что вирулентный штамм МР имеет 2 замены в нуклеотидном составе, по сравнению со штаммом Lausanne, в 13 позиции гена гуанин заменен на тимин, в 652 - цитозин заменен на аденин, в то время как, штамм В-82 имеет лишь одну замену в позиции 474 - аденин заменен на гуанин.

Для определения значимости нуклеотидных замен, мы перевели нуклеотидные последовательности в аминокислотные, и сравнили их с аминокислотым составом штамма Lausanne, в результате чего было выснено, что штамм МР имеет замену в аминокислотном составе - треонин заменен на лизин. Согласно шкале Р.Грэнтсема, рассчитавшего физико-химические дистанции для аминокислотных замен и определившего их влияние на

возможные изменения структур и функций белка, данная мутационная замена не приведет к значительным изменениям.

3.3 Секвенирование участка M010L

Участок гена M010L (myxoma growth factor), находящийся в левой вариабельной области генома вируса, являющийся фактором роста вируса миксомы кроликов [A.Opgenorth, 1992], был амплифицирован специфичными праймерами, фланкирующими участок гена длиной 902п.о. Для детальной характеристики, полученные фрагменты, были секвенированы, выравнены и сопоставлены с полногеномным штаммом Lausanne.

Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм В-82 имеет 3 замены и одну инсерцию в своем нуклеотидном составе, в следующих позициях генома: 13394 аденин заменен на тимин, 13395 тимин на гуанин, 13397 гуанин на тимин, 13618 произошла вставка гуанина.

Для определения значимости нуклеотидных замен, мы перевели нуклеотидные последовательности в аминокислотные и сравнили их с аминокислотам составом штамма Lausanne.

В результате анализа было выяснено, что имеются замены аминокислотном составе вакцинного штамма В-82: треонин заменен на аспарагин, изолейцин на гистидин. Согласно таблице Р.Грэнтсема, первая из замен является не существенной и не приведет к структурным и функциональным изменениям белка, вторая замена является значимой и может привести к изменению белка, поскольку изолейцин - это гидрофобная аминокислота, в то время как гистидин - гидрофильная.

3.4 Секвенирование участка M061R

Участок M061R в правой вариабельной области генома, нуклеотидная последовательность которого кодирует тимидинкиназу [C.Cameron, 1999]. На данный участок нами были подобраны праймеры, фланкирующие участок гена длиной 537п.о. Для детальной характеристики, полученные фрагменты были секвенированы, нуклеотидные последовательности выравнены и сопоставлены с полногеномным штаммом Lausanne.

В ходе проведенного нами анализа, было обнаружено 2 замены в нуклеотидном составе вакцинного штамма В-82 и его деривата Микс-98 в

следующих позициях гена: в 136 цитозин заменен на тимин, 158 цитозин на гуанин.

Для определения значимости этих замен мы перевели нуклеотидные последовательности в аминокислотные, и сравнили их с аминокислотам составом штамма Lausanne.

В результате анализа было выяснено, что в аминокислотном составе вакцинных штаммов произошла 1 замена, но данная мутация является не значимой и не приведет к существенным изменениям структуры и функции белка, закодированным последовательностью данного участка.

3.5 Секвенирование участка M135R

Данный участок находится в правой вариабельной области генома, кодирует белок, имеющий 23% идентичности с белком B18R вируса коровьей оспы. Белок B18R является рецептором альфа/бета интерферона (IFN-a/ß), который предотвращает IFN-a/ß противовоспалительный ответ хозяина. Согласно последним исследованиям, данный участок является фактором вирулентности вируса миксомы кроликов[.1.\У.Barrett, 2007].

Для детальной характеристики, полученные фрагменты были секвенированы, нуклеотидные последовательности выравнены и сопоставлены с полногеномным штаммом Lausanne.

В результате проведенного нами анализа было выяснено, что замен в нуклеотидном составе данного участка нет.

3.6 Секвенирование участка M152R

Участок M152R находится в правой вариабельной области генома вируса. Данный участок гена кодирует белок SERP-3, являющийся фактором вирулентности вируса миксомы кроликов [Jean-Luc Guerin, 2001].

Нами были подобраны праймеры, фланкирующие участок гена длиной 801 п.н. Для детальной характеристики, полученные фрагменты были секвенированы, нуклеотидные последовательности выровнены и сопоставлены с полногеномным штаммом.

В результате сопоставления у вакцинного штамма В-82 и его деривата Микс-98 обнаружено 5 инсерций нуклеотидов и 5 замен в нуклеотидном составе: в позиции 96 аденин заменен на цитозин, 484 цитозин на тимин, 571 аденин на гуанин, 617 цитозин на аденин, 632 аденин на гуанин, в 54, 55, 56

произошла вставка 2 тиминов и гуанина соответственно, 618 цитозина, 619 гуанина, в то время как у вирулентных штаммов, изменений нет.

Для определения значимости нуклеотидных замен, полученные последовательности были преобразованы в аминокислотные, и сравнены со штаммом Lausanne по данному участку.

В результате анализа аминокислотных последовательностей было установлено, что штаммы Mix 98 и В-82, по сравнению со штаммом Lausanne, имеют замены, которые согласно шкале Р.Грэнтсема являются значимыми.

Для наглядности данных изменений, мы отразили их при помощи шкалы гидрофильности Ноор&Woods (рисунок 1)

штаммы отображены голубым цветом, вирулентные - синим.

3.7 Секвенирование участка M130R

Участок M130R находится в правой вариабельной области генома, является геном гомологом tat белка вируса иммунодефицита (ВИЧ) человека [B.Spiesschaert, 2011]. Нами были подобраны специфичные оригинальные праймеры, фланкирующие участок гена длиной 549 п.о. Для сравнительной характеристики, полученные фрагменты были секвенированы, нуклеотидные последовательности выравнены и сопоставлены с полногеномным штаммом.

В результате анализа полученных нами нуклеотидных последовательностей, были выявлены множественные замены в нуклеотидном составе вакцинного штамма В-82 и его деривата Микс-98(таблица 2).

Таблица 2 - Замены, произошедшие в нуклеотидном составе вакцинных

штаммов В-82 и Микс-98, по сравнению с вирулентным штаммом МР

Позиция МР В-82 и Микс-98 Позиция МР В-82 и Микс-98

30 Гуанин Аденин 243 Гуанин Цитозин

39 Аденин Тимин 248 Аденин Гуанин

42 Тимин Цитозин 250 Гуанин Аденин

48 Тимин Цитозин 251 Аденин Цитозин

57 Тимин Цитозин 252 Аденин Цитозин

60 Аденин Гуанин 253 Аденин Гуанин

63 Цитозин Тимин 255 Тимин Гуанин

78 Цитозин Тимин 257 Гуанин Аденин

80 Аденин Цитозин 258 Цитозин Тимин

93 Тимин Цитозин 261 Аденин Гуанин

119 - Гуанин 262 Цитозин Гуанин

120 - Аденин 263 Цитозин Аденин

121 - Гуанин 265 Гуанин Аденин

130 Тимин Цитозин 273 Тимин Аденин

138 Тимин Цитозин 274 Цитозин Гуанин

140 Аденин Цитозин 277 Цитозин Тимин

148 Аденин Гуанин 279 Гуанин Цитозин

149 Гуанин Аденин 283 Гуанин Аденин

150 Тимин Цитозин 288 Цитозин Гуанин

179 Гуанин Аденин 289 - Гуанин

183 Тимин Цитозин 290 Аденин

194 Гуанин Тимин 291 Цитозин

201 Гуанин Аденин 292 Гуанин

203 Гуанин Тимин 293 Аденин

209 Цитозин Аденин 294 Аденин

216 - Тимин 295 Аденин

217 - Гуанин 296 Цитозин

218 - Цитозин 297 Цитозин

221 Аденин Гуанин 299 Гуанин Тимин

228 Тимин Аденин 300 Гуанин Цитозин

230 Цитозин Тимин 303 Тимин Цитозин

231 Аденин Гуанин 308 Аденин Цитозин

232 Цитозин Тимин 342 Гуанин Аденин

233 Цитозин Тимин 343 Гуанин Цитозин

Для определения устойчивости данных изменений нами было дополнительно проведено секвенирование матричных расплодок закладок производственного вакцинного штамма 1992 и 2010гг, а также серий вакцин полученных при их использовании.

В результате исследований нами было выяснено, что замены в нуклеотидном составе производственного вакцинного штамма устойчивые и

присутствуют как в матричных расплодках закладок вакцинного штамма В-82 так и в вакцинах полученных при их использовании.

Для определения значимости замен, полученные нуклеотидные последовательности преобразованы в аминокислотные, и сравнены с аминокислотным составом полногеномного штамма (рисунок 2).

I'' " I '1 ' ' I " " I " " I " " I " '' I' ' ' 1 I " '' I "" ...............,,, ,,

Я а за <о 5с ее 7« «о 90

ШетУЕВ'ЛПКЇОІЯітшІЮїИСОЕтПЕОІМШЕЕЕНСТтмтЛІООтВЕвШШ

Муши vlnif strjüs Liiisasae йуиш virus IwUa SawfensMäll Муши virus ivhi' Habarowk^ö09 Муьшз virus («iate (vanöyo-2C12 Мушы virus шіаМР Myüütu virus ягііи Mi* ії Му»ш vl-us striia ß-82 Мувш virus smHB«U'3'K Мтш virus «ян e-85 20ta Myajiruwsis mau 45, 2УИ2Ш MyümiUisis мши Чб, ЗОЛИОвЗ Мукезшікй пкШ 22J063012

"ed. gedg gedg gedg

gedg gedg ."ed"

pltvddhlpyden

pltvddhlpydeü

pltvddhlpyden pltvddhlpyden pltvddhlpydes

pltvddhlpyden pltvddhlpydes

ftkpykpvdelkk.ta f 1kpykpvde lkk. ta f1kpykpvdelkk ta fikpykpvdelkk.ta fikpykpvdelkk.ta fikpykpvdelkk.ta flkpykpvdelkk ta

dglftkd dglftkd dglftkd dglftkd dglftkd d"lftkd d lftkd

etedtdkeedskkadetv etedtdkeed skkadetv etedtdkeedskkadetv etedtdkeedskkadetv etedtdkeedskkadetv etedtdkeedskkadetv etedtdkeedskkadetv

qtitdedkkklat qt і tdedkkklat .qtitdedkkklat qtitdedkkklat qtitdedkkklat qtitdedkkklat .qtitdedkkklat

Рисунок 2 - Аминокислотные последоваательности гена M130R вируса миксомы

На представленном рисунке штаммы Mix 98 и В-82, по сравнению с полногеномным штаммом Lausanne, имеют 66 замен и 5 вставок в аминокислотном составе, из которых 33 замены являются радикальными. Кроме того, произошло увеличение белка 5 а.о.

Для наглядности данных изменений, мы отразили их по шкале гидрофильное™ Hoop&Woods(pHcyHQK 3).

Рисунок 3- Шкала гидрофильности/гидрофобности по Ноор&\Уоо<1з. Вакцинные штаммы отображены розовым цветом, вирулентные - черным 3.8 Филогенетический анализ исследованных штаммов и изолятов

вируса миксомы кроликов по участку М13(Ш вируса миксомы кроликов

Для определения родственных взаимоотношений исследуемых штаммов и изолятов вируса, а также штаммов и изолятов вируса миксомы кроликов из стран Европы, известных в настоящее время (нуклеотидные последовательности получены из базы данных ОепеВапк), проводили филогенетический анализ на основе алгоритма "ближайшего соседа" в рамках двухпараметрической модели

М. Кимуры с последующим 1000-кратным ресэмплингом (MEGA 5.0) (рисунок 4).

В результате проведенного филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей по участку гена M130R штаммов, депонированных в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, и изолятов вируса миксомы кроликов, циркулирующих на территории Российской Федерации, было установлено, что они имеют наибольшее сходство с группой вирусов, выделенных на территории Европы. Вакцинные штаммы В-82 и его дериват Микс-98, а также матричные расплодки закладок 1992 и 2010 гг., относятся к отдельной ветви филограммы, что, возможно, связано с адаптацией данных штаммов и длительным пассированием их в культурах клеток.

м Myxoma virus isolate WS6 1071 complete genome. ' Myxoma virus isolate Gungahlincomplete genome.

solate_BRK_complete genome. solate_Comwall_compIete genome. soiate_Glenfield_complete_genome. solate KM13 complete genome-isolate LuCSL complete genome, solate Mebv complete genome. solate Nottingham attenuated complete genome, solate OBI 406 complete genome, solate SLS (Moses strain/strain B) complete genome, solate SWH 8-2-93 complete genome. solate_SWH_complete_genome. solate_Uriarra_complete_genome. solate WS 1 234 complete genome. isolate_WS 1 328 complete genome. solate WS6 346 complete genome-isolate Wellington complete genome. rus_isolatc_SWH_ 1209 complete genome-isolate BD23 complete genome. Myxoma_virus_is olate_BRK_ 12-2-93_comp lete genome. A. Myxoma_virus_isolate_Ivanovo_2012 ▲ Myxoma_virus_isolate_Habarovsk_2009 Myxoma_virus_strain_Lausanne Myxoma_virus_strain_MP Myxoma_virus_isolate_Smolensk_2011 Myxoma_virus_isoIate_Bendigo_complete_genomc. Myxo ma_virus_comp lete genome. Myxoma_virus_strain_Mix-98 Myxoma_virus_strain_B-82 Myxoma_virus_strain_B-82_ 1992 Myxoma_virus_strain_B-82_2010

Рисунок 4 - Филогенетическое древо, построенное на основании данных гомологии нуклеотидных последовательностей фрагмента M130R штаммов и изолятов вируса миксомы кроликов. Треугольниками отмечены штаммы и изоляты, циркулирующие на территории Российской Федерации.

3.9 Разработка тест-системы для выявления ДНК вируса миксомы кроликов методом полимеразиой цепной реакции

Данный раздел работы был выполнен совместно с м.н.с. Моргуновым

С.Ю.

В результате анализа опубликованных в ОепВапк первичных последовательностей геномов изолятов возбудителя миксомы, были сконструированы специфические праймеры на область гена М022Ц кодирующего оболочечный белок, которые фланкировали участок геномной ДНК размером 550 п.н.

Оптимизацию ПЦР проводили по следующим параметрам: температуру отжига подбирали в диапазоне 50°С - 66°С с шагом в 4°С.

В процессе оптимизации температурных режимов реакции, было установлено, что пара праймеров на область гена, кодирующего оболочечный белок, позволила не только идентифицировать исследуемые штаммы вируса миксомы, но и дифференцировать вакцинный штамм В-82.

Аналитическую специфичность тест-системы оценивали на панели заведомо положительных и отрицательных образцов.

В результате исследований, положительный результат визуализировали только для образцов, содержащих ДНК вируса миксомы кроликов, отрицательные и ложноположительные образцы отсутствовали.

Аналитическую чувствительность метода определяли относительно активности вирулентного штамма вируса миксомы кроликов, выраженной в ^ 5о/смз- С этой целью осуществляли ПЦР на матрицах ДНК вирулентного штамма (штамм МР, титр 4,0 ЬБ 5о/смз), выделенных из последовательных десятикратных разведений исходных образцов, с последующей амплификацией и детекцией полученных ампликонов в агарозном геле.

В результате определения аналитической чувствительности, ДНК вируса миксомы штамма МР обнаружили в разведении 1:104, что соответствует 0,5 ЬЭзо/смз (исходный титр 4,0 ^ ЬО 5о/смз)-

По итогам исследования, на базе лаборатории Биофизики ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, были проведены комиссионные испытания «Тест-системы для выявления ДНК вируса миксомы кроликов методом полимеразной цепной реакции», использование которой позволяет выявлять геном вируса. Также разработаны методические положения по её применению, утверждённые директором ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии и академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины

Россельхозакадемии Смирновым А.М.

3.10 Разработка тест-системы для дифференциации вакцинных штаммов и полевых изолятов на основе ПДРФ-анализа участка M130R вируса миксомы кроликов

В результате анализа нуклеотидных последовательностей гена M130R и построения их рестрикционной карты, было установлено, что вставка нуклеотидов у вакцинного штамма сопровождается появлением сайта специфического расщепления, узнаваемого рестриктазой BamHI в положении 170 п.н., в то время как, у вирулентных штаммов и полевых изолятов данный сайт отсутствует (рисунок 5).

Эти наблюдения использовались в разработке метода, основанного на рестрикционном анализе продуктов ПЦР и позволяющего отличать вакцинный штамм вируса миксомы кроликов от полевых изолятов.

Вакцинный штамм В-82 вируса миксомы кроликов

Полевые шоляты вируса миксомы кроликов

549n.ii.

Рисунок 5- Схема рестрикционной карты участка M130R вируса миксомы кроликов

Как видно из рисунка вакцинные штаммы вируса миксомы кроликов содержат на данном участке генома сайт рестрикции BamHI, а эпизоотические изоляты вируса миксомы кроликов - не имеют этого сайта. Сайт рестрикции расположен в ампликоне, таким образом, что рестриктаза BamHI должна расщеплять амплифицированный участок генома вакцинных штаммов вируса миксомы кроликов на 2 фрагмента длиной 170 п.н. и 394 п.н. Для полевых изолятов вируса миксомы кроликов, в пределах амплифицированного участка генома, сайты для рестриктазы BamHI отсутствуют, поэтому расщепления ампликона происходить не должно. В этом случае электрофорез в геле должен показать наличие в пробе единственного фрагмента исходной длины.

Аналитическую специфичность данного метода оценивали на панели из шестнадцати образцов (таблица 3).

170п.н. Bi,mHI 394n.ii.

1

564п.н.

На первом этапе проводили классическую ПЦР, в результате которой у всех проб, содержащих ДНК вируса миксомы кроликов, был амплифицирован участок генома, кодирующий ген М130Я, соответствующий расчетной длине 550п.о.

Полученные ампликоны обрабатывали эндонуклеазой ВатН1. Продукты рестрикции анализировали путем электрофореза в 2%-ном агарозном геле. В

итоге рестрикционного анализа ампликонов, были подтверждены ожидаемые результаты для 16 из 16 исследованных образцов (рисунок 6). __Таблица 3- Перечень исследованных образцов_

№ Наименование материалов

1 Кровь от интактного кролика

2 Кровь, отобранная на 3 день после вакцинирования производственным штаммом В-82 в дозе 1000 ИД 50/см3

3 Кровь, отобранная на 4 день после вакцинирования производственным штаммом В-82 в дозе 1000 ИД 50/см3

4 Кровь, отобранная на 5 день после вакцинирования производственным штаммом В-82 в дозе 1000 ИД 50/см3

5 Лиофилизированный материал (СУ-1), содержащий штамм Микс-98 вируса миксомы кроликов, инфекционная активность 4,0 ТЦЦ 50/см3

6 Культуральный материал (ПК), содержащий штамм В-82 вируса миксомы кроликов, инфекционная активность 5,0 ИД 50/см3

7 Лиофилизированный материал, содержащий штамм В-82 вируса миксомы кроликов, инфекционная активность 4,1 ^ ИД 50/см3

8 Лиофилизированный материал, содержащий штамм МР вируса миксомы кроликов, инфекционная активность 4,5 1й ИД 50/см3

9 Ассоциированная вакцина против ВГБК и миксоматоза кроликов

10 Полевой материал Хабаровск -2009

11 Полевой материал Смоленск-2011

12 Полевой материал Иваново -2012

13 Культура клеток ФЭК

14 Культура клеток ЮС-13

15 Вирусвакцина против оспы овец сухая культуральная (сер. № 02-13)

16 Лиофилизированный материал вируса фибромы Шоупа, инфекционная активность 4,1ИД 50/см3,от 17.05.2004

Для вакцинного штамма «В-82», его деривата Микс-98, крови, отобранной у кроликов на 3,4,5 сутки после вакцинирования, ассоциированной вакцины против ВГБК и миксоматоза, в результате рестрикции амплифицированного участка генома, появлялось два фрагмента в положениях: 170п. н. и 394 п.н. (треки 3,5,7,9,12,14,16) для всех полевых изолятов и вакцинных штаммов - только один фрагмент (треки 1,2,8,10).

Рисунок 6 - Электрофореграмма результатов рестрикциии. Треки: 1- Полевой материал Смоленск-2011, 2-Полевой материал Иваново -2012, 3-кровь, отобранная на 5 день после вакцинирования,4- культура клеток ЯК-13, 5-лиофилизированный материал (СУ-1), содержащий штамм Микс-98 вируса миксомы кроликов, 6-лиофилизированный материал вируса фибромы Шоупа, 7- лиофилизированный материал, содержащий штамм В-82 вируса миксомы кроликов, 8- лиофилизированный материал, содержащий штамм МР вируса миксомы кроликов, 9- Ассоциированная вакцина против ВГБК и миксоматоза кроликов, 10- Полевой материал Хабаровск -2009, 11-кровь от интактного кролика, 12-кровь, отобранная на 3 день после вакцинирования,13- культура клеток ФЭК, 14-кровь, отобранная на 4 день после вакцинирования, 15- вирусвакцина против оспы овец сухая культуральная (сер. № 02-13), 16-культуральный материал (ПК), содержащий штамм В-82 вируса миксомы кроликов.

Аналитическую чувствительность метода определяли относительно активности вакцинного штамма вируса миксомы кроликов, выраженной в ^ ИД5о/смз- С этой целью осуществляли ПЦР на матрицах ДНК вакцинного штамма (штамм В-82, титр 4,5 ^ ИД50/смз), выделенных из последовательных десятикратных разведений исходных образцов, с последующей амплификацией и рестрикцией полученных ДНК. Пределом чувствительности считали максимальное разведение, при котором регистрировали положительный результат.

При определении аналитической чувствительности, ДНК вакцинного штамма обнаружили в разведении 1:1000 (исходный штамм В-82, титр 4,5 ^ ИД5о/смз), ЧТО СООТВеТСТВуеТ 1,5 1§ ИД5о/смЗ-

По итогам исследования, на базе лаборатории Биофизики ГНУ ВНИИВВиМ Россельхъозакадемии были проведены комиссионные испытания «Тест-системы для выявления и дифференциации вакцинных штаммов и полевых изолятов вируса миксомы кроликов методом ПДРФ анализа», использование которой позволяет выявлять и дифференцировать геном вируса. Также разработаны методические положения по её применению, утверждённые директором ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

3.11 Разработка тест-системы для выявления и дифференциации ДНК вакцинных штаммов и полевых изолятов вируса миксомы кроликов методом ПЦР в режиме реального времени

Разработка тест - системы для выявления и дифференциации ДНК вируса миксомы кроликов в режиме реального времени, была вызвана необходимостью сокращения времени анализа результатов и трудозатрат. Кроме того, использование этого метода значительно уменьшает риск контаминации ампликонами. Разработка включала в себя расчёт штаммоспецифических праймеров и зондов, подбор условий проведения реакции (состав ПЦР-смеси и температурный режим реакции) и оценку специфичности и чувствительности тест-системы.

Для выявления генома вируса миксомы кроликов использовали специфические олигонуклеотидные праймеры и зонд, подобранные на участок гена M151R, амплифицирующие фрагмент гена длиной 150 п.о.

Расчёт праймеров и зонда для дифференциации генома вакцинного штамма вируса миксомы кроликов осуществляли на основании данных, полученных при анализе нуклеотидных последовательностей гена M130R. Для амплификации был выбран участок размером 158 п.н., поскольку он являлся оптимальным для всех проанализированных нами последовательностей данного гена.

Детекцию продуктов амплификации осуществляли с использованием технологии TaqMan. Использование разных красителей при синтезе зондов (краситель FAM присоединён к 5'-концу зонда, комплементарному фрагменту генома вируса миксомы кроликов, и краситель R6G — к 5'-концу зонда, комлементарному участку генома вакцинных штаммов) дало возможность одновременной идентификации и дифференциации ДНК вируса, за счёт неперекрывающихся спектров флуоресценции и, как следствие, детекции флуоресцентных сигналов по отличающимся друг от друга каналам. Канал Green - для выявления генома вируса и канал Yellow - для ДНК вакцинных штаммов.

На следующем этапе исследования оптимизировали параметры постановки ПЦР-РВ. В результате проведенных исследований, был определён оптимальный состав ПЦР смеси объёма 25 мкл: 5-кратный ПЦР буфер,

содержащий 5 мМ ацетат магния, 0,3 М каждого праймера, 0,1 мМ каждого из четырех трифосфатов, 0,25 ед. Taq полимеразы, 0,25 мкг БСА, 5 мкл исследуемой ДНК. Оптимальный температурный режим и количество циклов составил: 95°С - 3 мин (1 цикл); 94'С - 15 сек, 58 °С - 20 сек, 72 ° С - 20 сек (5 циклов); 94°С - 15 сек, 58°С - 20 сек - детекция,72°С - 20 сек (35 циклов). Флуоресценцию измеряют при 58°С по каналу Green и Yellow. Учёт результатов проводили по анализу кривых накопления флуоресцентного сигнала по обоим каналам, с помощью программного обеспечения используемого прибора.

Аналитическую специфичность метода оценивали по результатам ПЦР-РВ с использованием в качестве матрицы ДНК четырех штаммов вируса миксомы кроликов, трёх проб ДНК, выделенных из полевого материала, трех проб крови отобранных на 3, 4 и 5 сутки после вакцинации животных. Также использовали ДНК, выделенную из ассоциированной вакцины против ВГБК и миксоматоза кроликов. Кроме того, для исследования были взяты две пробы, содержащие ДНК близкородственных поксвирусов, и три интактные пробы. При этом, положительный результат получили только для образцов вируса миксомы кроликов, тогда как для остальных исследованных проб кривые накопления флуоресцентного сигнала не превышали пороговую линию (рисунок 7).

В ходе проведённой ПЦР-РВ регистрировали амплификацию ДНК по каналу Green в образцах, содержащих геном вируса миксомы кроликов, в то время как, по каналу Yellow регистрировали амплификацию ДНК только вакцинных штаммов.

Отрицательный результат был получен для интактных образцов и образцов, содержащих ДНК близкородственных поксвирусов.

Рисунок 7 - Результаты оценки специфичности тест системы для выявления дифференциации ДНК вакцинных штаммов (канал Yellow) и полевых изолятов (канал Green) вируса миксомы кроликов. 1- полевой материал Смоленск-2011, 2- полевой материал Иваново -2012, 3- кровь, отобранная на 4 день после вакцинирования, 5 -лиофилизированный материал (CV-1), содержащий штамм Микс-98 вируса миксомы кроликов, 7- лиофилизированный материал, содержащий штамм В-82 вируса миксомы кроликов, 8- лиофилизированный материал, содержащий штамм MP вируса миксомы кроликов, 9- ассоциированная вакцина против ВГБК и миксоматоза кроликов, 10- полевой материал Хабаровск -2009, 12- кровь, отобранная на 3 день после вакцинирования, 14-кровь, отобранная на 5 день после вакцинирования, 16- культуральный материал (ПК), содержащий штамм В-82 вируса миксомы кроликов

Аналитическую чувствительность ПЦР-РВ определяли относительно активности вирулентного и вакцинного штамма вируса миксомы кроликов, выраженной в lg ИД50/см3. С этой целью осуществляли ПЦР-РВ на матрицах ДНК вирулентного штамма вируса миксомы кроликов (штамм MP, титр 5,0 lg ИДзо/смз) и вакцинного штамма (штамм В-82, титр 4,5 lg ИД50/смз)> выделенных из последовательных десятикратных разведений исходных образцов, с последующей амплификацией полученных ДНК. Пределом чувствительности считали максимальное разведение, при котором регистрировали положительный результат.

При определении аналитической чувствительности, ДНК вирулентного штамма обнаружили в разведении 1:10 000 (исходный штамм MP, титр 5,0 lg ТЩЬо/смз), что соответствует 1,0 lg ИД50/Смз. Геном вакцинного штамма вируса выявили в разведении 1:1000 (исходный штамм В-82, титр 4,5 lg ИД50/смз), что СООТВеТСТВуеТ 1,5 lg ИД50/СМЗ.

Возможности «Тест-системы» апробировали на материале, полученном от экспериментально вакцинированных кроликов. Материалом для исследований

служила кровь, отобранная в разные сроки после вакцинирования животных штаммом В-82 вируса миксомы кроликов с титром 4,0- 4,5 ^ ИД 50/см3.

С этой целью суспензию вируссодержащего материала вводили кроликам подкожно в область лопатки в дозе 1,0 см3.

Ежедневно, в течение 9 суток, проводили отбор проб крови кроликов, из которых выделяли тотальную ДНК и амплифицировали фрагменты генома вируса с помощью специфических праймеров (рисунок 8).

Канал Оггееп гт ци /

Е/ / 1

/Л 1.2.6.7.8.9 ]

Порог

Канал Уе11о\у /< (V 0/ / /

Порол [" 1.2,6,7.8.9

15 Я Цга___

! 13 В 25 25 Я !5

_______

Рисунок 8 - Результаты проверки крови. Номера соответствуют дням отбора крови после вакцинирования.

Как видно из рисунка, разработанная тест-система позволяет выявить геном вируса миксомы кроликов в крови животных с 3 по 5 сутки после вакцинации.

По итогам исследования, на базе лаборатории Биофизики ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии были проведены комиссионные испытания «Тест-системы для выявления и дифференциации вакцинных штаммов и полевых изолятов вируса миксомы кроликов методом мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени», использование которой позволяет выявлять и дифференцировать геном вируса. Также разработаны методические положения по её применению, утверждённые директором ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

4 ВЫВОДЫ

1. Подобраны праймеры и режимы амплификации для участков генома, коррелирующие с факторами вирулентности вируса миксомы кроликов (М0071Ж, МОЮЬ, М061Ь, М130Я, М135Я, М152Я).

2. Определены нуклеотидные последовательности шести участков генома для штаммов МР, В-82, Микс-98 и трех изолятов вируса миксомы кроликов, циркулирующих на территории Российской Федерации.

3. Определен участок генома, несущий генетические маркеры вакцинного штамма В-82 вируса миксомы кроликов.

4. Анализ геномов вакцинных штаммов вируса миксомы кроликов позволяет с высокой степенью вероятности утверждать о генетической стабильности вакцинного штамма В-82 за период с 1992 г. по настоящее время.

5. Результаты филогенетического анализа вакцинных штаммов по гену М13(Ж вируса миксомы кроликов, позволяющие утверждать, что вакцинный штамм В-82 и его дериват Микс-98, а также матричные расплодки закладок вакцинного штамма В-82 1992 и 2010 гг. формируют отдельную ветвь филограммы.

6. Установлено, что эпизоотические изоляты, циркулирующие на территории Российской Федерации, идентичны друг другу и имеют сходство 99% с группой вирусов, выделенных на территории Европы и Австралии.

7.Разработана тест-система на основе ПЦР с электрофоретической детекцией для идентификации генома вируса миксомы кроликов с аналитической чувствительностью до 0,5 1ц ТСШ50/см3 или 0,5 ^ ЬЭ50/см3.

8. Разработаны тест-системы на основе ПЦР для выявления и дифференциации генома вакцинных штаммов и полевых изолятов вируса миксомы кроликов методом ПДРФ анализа и в режиме реального времени с аналитической чувствительностью 1,5 ^ ИД 50/см3

5 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ Специфические оригинальные олигонуклеотидные праймеры предлагаются для использования при определении нуклеотидных последовательностей участков генома вируса миксомы кроликов, проведения генетической характеристики штаммов и изолятов возбудителя, создания генетических паспортов вакцинных штаммов в научно-исследовательских и диагностических лабораториях.

Рекомендуются в практику научно-исследовательских учреждений и специализированных ПЦР лабораторий следующие разработанные методики: «Методические положения по выявлению генома вируса миксомы кроликов

методом полимеразной цепной реакции», «Методические положения по выявлению и дифференциации ДНК вакцинных штаммов и полевых изолятов вируса миксомы кроликов методом ПДРФ анализа», «Методические положения по выявлению и дифференциации вакцинных штаммов и полевых изолятов вируса миксомы кроликов методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени».

6 СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Разработка тест-системы для выявления ДНК вируса миксомы / И.П. Синдрякова, С.Ю. Моргунов, Н.И. Сальников, С.Ж. Цыбанов, Д.В. Колбасов // Ветеринарная патология,- 2011.-№4.- С.59-64.

2. Конструирование положительного контроля к тест-системе для выявления ДНК вируса миксомы методом ПЦР / И.П. Синдрякова, С.Ю. Моргунов Н.И. Сальников, Д.В. Колбасов // Ветеринарная медицина XXI века Инновации, опыт, проблемы и пути их решения: Международная научно-практическая конференция.-Ульяновск, 2011.-Т.1. -С.171-174.

7 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ДНК - дезоксиробонуклеиновая кислота

ПДРФ - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЦР-РВ — полимеразная цепная реакция в режиме реального времени

Отпечатано в типографии ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, г. Покров Владимирской области. Тираж 80 экз.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Синдрякова, Ирина Петровна, Покров

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВЕТЕРИНАРНОЙ ВИРУСОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ (ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии)

На правах рукописи

Синдрякова Ирина Петровна

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ

ВИРУСА МИКСОМЫ КРОЛИКОВ

03.02.02 Вирусология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук, профессор Колбасов Денис Владимирович

04201362386

Покров - 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

1 ВВЕДЕНИЕ......................................................................................................5

1.1 Актуальность проблемы.................................................................................5

1.2 Степень разработанности проблемы.............................................................6

1.3 Цель и задачи исследования...........................................................................6

1.4 Научная новизна исследований.....................................................................7

1.5 Теоретическая и практическая значимость работы.....................................7

1.6 Степень достоверности и апробация работы................................................8

1.7 Публикация научных исследований..............................................................9

1.8 Соответствие содержания диссертации паспорту специальности, по которой она рекомендуется к защите....................................................................9

1.9 Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту 10

1.10 Структура и объём диссертационной работы.............................................11

1.11 Личный вклад.................................................................................................11

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.................................................................................12

2.1 Общая характеристика семейства Рохушёае.............................................12

2.2 Особенности репликации поксвирусов.......................................................14

2.3 Геномная организация семейства поксвирусов.........................................16

2.4 Род Ьеропрохуи-ш.........................................................................................17

2.5 Вирус миксомы кроликов.............................................................................18

2.6 Характеристика вириона вируса миксомы кроликов................................18

2.7 Антигенные свойства вируса.......................................................................21

2.8 Локализация вируса.......................................................................................21

2.9 Строение генома вируса миксомы кроликов..............................................22

2.10 Патогенез и клинические проявления миксоматоза..................................34

2.11 Лабораторная диагностика миксоматоза....................................................36

2.12 Методы идентификации и дифференциации поксвирусов на примере ортопоксвирусов....................................................................................................37

2.13 Методы типирования вируса миксомы кроликов......................................40

2.13.1 Физическое картирование генома вируса миксомы кроликов с помощью рестрикционного анализа....................................................................40

2.13.2 Метод анализа полиморфизма длин амплифицированных фрагментов терминальных инвертированных повторов вируса миксомы кроликов..................................................................................................................41

2.14 Специфическая профилактика миксоматоза кроликов.............................43

2.15 Заключение по обзору литературы..............................................................44

3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.........................................................................46

3.1 Материалы......................................................................................................46

3.1.1 Вирусы............................................................................................................46

3.1.2Культуры клеток............................................................................................46

3.1.3Образцы патологического материала..........................................................46

3.1.4Животные.......................................................................................................47

3.1.5Соли, реагенты для приготовления растворов, буферных смесей...........47

3.1 .бРастворы и реактивы.....................................................................................47

3.1.7Бактериальный штамм и плазмида..............................................................49

3.1.8 Ферменты.......................................................................................................49

3.1.9Лабораторное оборудование........................................................................49

3.2 Методы...........................................................................................................51

3.2.1 Подготовка органов для выделения генома вируса...................................51

3.2.2Выделение нуклеиновых кислот..................................................................51

3.2.3Постановка полимеразной цепной реакции................................................53

3.2.1Электрофоретическая детекция продуктов ПЦР.......................................53

3.2.8Нуклеотидное секвенирование....................................................................53

3.2.9Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей...................54

3.2.10 Клонирование ПЦР-продуктов.............................................................54

4 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ..............................57

4.1 Секвенирование нуклеотидных последовательностей различных участков генома вируса миксомы кроликов.......................................................57

4.1.1 Секвенирование участка М007Ь/Я..............................................................58

4.1.2Секвенирование участка МОЮЬ..................................................................61

4.1.3Секвенирование участка М061Я.................................................................63

4.1.4Секвенирование участка М13511.................................................................66

4.1.5Секвенирование участка М152Я.................................................................68

4.1 .бСеквенирование участка М130Я.................................................................72

4.2 Филогенетический анализ исследованных штаммов и изолятов вируса миксомы кроликов по участку М13011 вируса миксомы кроликов.................76

4.3 Разработка тест-системы для выявления ДНК вируса миксомы кроликов методом полимеразной цепной реакции.............................................................78

4.4 Разработка тест-системы для дифференциации вакцинных штаммов и полевых изолятов на основе ПДРФ-анализа участка М13(Ж вируса миксомы кроликов.................................................................................................................82

4.5 Разработка тест-системы для выявления и дифференциации ДНК вакцинных штаммов и полевых изолятов вируса миксомы кроликов методом ПНР в режиме реального времени.......................................................................86

4.6 Конструирование рекомбинантных контролей амплификации ДНК к тест-системе для выявления и дифференциации вакцинных штаммов и полевых изолятов вируса миксомы кроликов на основе полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.................................................................92

5 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ..............................95

6 ВЫВОДЫ.....................................................................................................105

7 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ........................................................106

8 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ...................................107

9 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ..............................................................................126

10 ПРИЛОЖЕНИЯ..............................................................................................128

1 ВВЕДЕНИЕ

1.1 Актуальность проблемы

Миксоматоз кроликов (Myxomatosis cuniculorum)- остро протекающая высококонтагиозная болезнь, вызываемая ДНК содержащим вирусом рода Leporipoxvirus семейства Poxviridae. Заболевание характеризуется серозно-гнойным конъюнктивитом, воспалением слизистых оболочек, образованием опухолевых узелков на коже и появлением в терминальной стадии студенистых отеков в области головы, спины, половых органов, часто заканчивается летальным исходом [Сюрин, 1998].

Лабораторная диагностика миксоматоза кроликов в Российской Федерации заключается в гистологическом исследовании патологического материала. При отрицательном результате этого исследования и отсутствии характерных клинических признаков прибегают к биопробе на кроликах.

Эффективность мероприятий по борьбе с миксоматозом зависит от специфической вакцинопрофилактики, своевременного выявления возбудителя, контроля его распространения и изменчивости.

Для специфической профилактики используются живые аттенуированные вакцины. В связи с этим, при обнаружении у животных вируса миксомы кроликов возникает необходимость в его дифференциации.

Однако в отечественной литературе нет данных, о методах позволяющих различить штаммы и изоляты вируса миксомы кроликов.

Работы М. Morales, Jia Liu, P.J.Kerr, основанные на молекулярно-генетических исследованиях показали, что изучение генов, являющихся факторами вирулентности, позволяет выявлять локусы, которые могут быть использованы для дифференциации штаммов и изолятов вируса миксомы кроликов [М. Morales, 2008, Jia Liu, 2012, P.J.Kerr, 2012].

В этой связи, изучение молекулярно-генетической характеристики вируса, разработка тест-систем на основе ПЦР для идентификации и

дифференциации штаммов вируса миксомы кроликов, внедрение их в практику рутинных исследований является актуальной задачей. 1.2 Степень разработанности проблемы

В Российской Федерации опубликован ряд рекомендаций по борьбе с миксоматозом кроликов, разработана вакцина на основе штамма В-82 против миксоматоза кроликов и изучены ее свойства (Кузнецова Г.Д., 1988). Предложены системы ПЦР и ПЦР в режиме реального времени для выявления генома вируса миксомы кроликов (Моргунов С.Ю., 2010, Бурмакина Г.С., 2013).

Но отсутствуют данные молекулярно-генетических характеристик штаммов вируса миксомы кроликов, а также тест системы, позволяющие выявлять и дифференцировать геном вируса. 1.3 Цель и задачи исследования

Основной целью исследований являлось изучение молекулярно-генетических характеристик штаммов вируса миксомы кроликов.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Подобрать праймеры и режимы амплификации различных участков генома вируса миксомы кроликов.

2. Определить нуклеотидные последовательности амплифицированных фрагментов.

3. Провести филогенетический анализ штаммов и полевых изолятов вируса миксомы кроликов.

4. Определить генетические маркеры производственного вакцинного штамма В-82 вируса миксомы кроликов.

5. Разработать тест-систему на основе ПЦР для выявления и дифференциации генома вакцинных штаммов и полевых изолятов вируса миксомы кроликов.

1.4 Научная новизна исследований

Впервые в Российской Федерации определены нуклеотидные последовательности фрагментов генов M007L, M010L, M061R, M130R, M135R, М 152R штаммов МР, В-82, Микс-98 и изолятов вируса миксомы кроликов, циркулирующих на территории страны.

Определен участок генома, несущий генетические маркеры вакцинного штамма В-82 вируса миксомы кроликов.

Проведен филогенетический анализ по гену M130R вируса миксомы кроликов, в результате которого выяснено, что вакцинный штамм В-82 и его дериват Микс-98, а также матричные расплодки закладок вакцинного штамма В-82 1992 и 2010 гг. формируют отдельную ветвь филограммы.

Установлено, что эпизоотические изоляты, циркулирующие на территории Российской Федерации, идентичны друг другу и имеют сходство 99% с группой вирусов, выделенных на территории Европы и Австралии.

Впервые в Российской Федерации разработан комплекс методов для выявления и дифференциации полевых изолятов и вакцинных штаммов вируса миксомы кроликов на основе различных вариантов ПЦР (ПДРФ-анализ, ПЦР в режиме реального времени).

1.5 Теоретическая и практическая значимость работы

Проведено секвенирование штаммов МР, В-82 и Микс-98,

депонированных в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, и трех изолятов вируса миксомы кроликов, выделенных в различных регионах Российской Федерации в период с 2009-2012 гг.

Разработана методика выявления генома вируса миксомы кроликов методом ПЦР в формате электрофоретической детекции.

Разработана методика выявления и дифференциации ДНК вакцинных штаммов и полевых изолятов вируса миксомы кроликов методом ПДРФ анализа продуктов ПЦР.

Разработана методика выявления и дифференциации ДНК вакцинных штаммов и полевых изолятов вируса миксомы кроликов методом ПЦР с детекцией в режиме реального времени.

Результаты экспериментальной работы использованы при разработке следующих документов:

- «Методические рекомендации по выявлению ДНК вируса миксомы кроликов методом полимеразной цепной реакции», которые утверждены Академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии A.M. Смирновым 16.11.2011 г.;

- «Методические рекомендации по выявлению и дифференциации вакцинных штаммов и полевых изолятов вируса миксомы кроликов методом ПДРФ анализа» и «Методические рекомендации по выявлению и дифференциации вакцинных штаммов и полевых изолятов вируса миксомы кроликов методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени», которые утверждены директором ГНУ ВНИИВВИМ Россельхозакадемии Д.В. Колбасовым 05.07.2013 г.

1.6 Степень достоверности и апробация работы

Степень достоверности результатов проведённых исследований подтверждена статистическими исследованиями и комиссионными испытаниями. Акты комиссионных испытаний утверждены директором ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии 16.11.2011 г., 04.07.2013 г. Статистическая обработка включала расчёты средних арифметических значений, стандартных отклонений результатов полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, вычисления эволюционных дистанций с помощью программы MEGA 5,0. Научные положения, выводы и практические предложения диссертационной работы аргументировано отражают содержание диссертации.

Результаты диссертационной работы представлены и обсуждены на Международной научно-практической конференции «Задачи ветеринарной

науки в реализации доктрины продовольственной безопасности Российской Федерации» (Покров, 2011 г.), Международной научно-практической конференции «Ветеринарная медицина XXI века. Инновации, опыт, проблемы и пути их решения» (г. Ульяновск, 2011 г.), а также в рамках заседания секции «Инфекционная патология животных» Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (Москва, 2011 гг.).

1.7 Публикация научных исследований

По теме диссертации опубликовано 2 научные работы, в том числе 1 статья в журнале «Ветеринарная патология», включенном в перечень изданий, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.

1.8 Соответствие содержания диссертации паспорту

специальности, по которой она рекомендуется к защите В соответствии с формулой специальности 03.02.02 Вирусология, охватывающей проблемы исследования генетики вирусов, структурной организации генома вирусов, картирования вирусного генома, изменчивости вирусов, генной инженерии, биохимических и молекулярно-генетических аспектов, разработки мер диагностики, вызываемых вирусами заболеваний, совершенствование лабораторных диагностических систем. В диссертационной работе описано проведение секвенирования шести участков генома штаммов МР, В-82 и Микс-98 вируса миксомы кроликов депонированных в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, а также трех изолятов, выделенных на территории Российской Федерации. Выявлен участок генома, несущий генетические маркеры вакцинного штамма В-82 вируса миксомы кроликов. Проведены исследования по созданию тест-систем на основе ПЦР, использование которых позволяет проводить идентификацию и дифференциацию ДНК вируса миксомы кроликов. Разработаны рекомбинантные конструкции на основе плазмидного вектора, применяемые в качестве положительных контролей амплификации в данных тест-системах.

Результаты научного исследования соответствуют пунктам паспорта специальности 4, 5, 10.

1.9 Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту

1. Данные нуклеотидных последовательностей шести участков генома (М007Ь, МОЮЬ, М061Ь, М130Я, М13511, М152Я) позволяют установить степень гомологии штаммов МР, В-82 и Микс-98 и трех изолятов вируса миксомы кроликов, циркулирующих на территории Российской Федерации с последовательностями, имеющимися в базе данных ОепВапк.

2. Определен участок генома, несущий генетические маркеры вакцинного штамма В-82 вируса миксомы кроликов.

3. Анализ геномов вакцинных штаммов вируса миксомы кроликов позволяет с высокой степенью вероятности утверждать о генетической стабильности вакцинного штамма В-82 за период 1992 г. по настоящее время.

4. Результаты филогенетического анализа вакцинных штаммов и полевых изолятов по гену М13011 вируса миксомы кроликов, позволяют утверждать, что вакцинный штамм В-82 и его дериват Микс-98, а также матричные расплодки закладок вакцинного штамма В-82 1992 и 2010 гг. формируют отдельную ветвь филограммы и отличаются от нуклеотидных последовательностей данного участка полевых изолятов, циркулирующих на территории Российской Федерации.

5. Установлено, что эпизоотические изоляты, циркулирующие на территории Российской Федерации, идентичны друг другу и имеют сходство 99% с группой вирусов, выделенных на территории Европы и Австралии.

6. Тест-система на основе ПЦР с электрофоретической детекцией для идентификации генома вируса миксомы кроликов.

7. Тест-система на основе ПДРФ анализа, позволяющая в течение 3,5 часов выявить и дифференцировать геном вируса миксомы кроликов.

8. Тест-система ПЦР с детекцией в режиме реального времени, позволяющая в течение 2 часов выявить и дифференцировать геном вируса миксомы кроликов.

1.10 Структура и объём диссертационной работы

Диссертация изложена на 127 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литера