Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Выделение, идентификация и характеристика изолятов вирусов инфекционного бронхита кур и инфекционного ларинготрахеита птиц
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология
Автореферат диссертации по теме "Выделение, идентификация и характеристика изолятов вирусов инфекционного бронхита кур и инфекционного ларинготрахеита птиц"
На правах рукописи
БАТЧЕНКО Галина Владимировна
ВЫДЕЛЕНИЕ, ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ХАРАКТЕРИСТИКА ИЗОЛЯТОВ ВИРУСОВ ИНФЕКЦИОННОГО БРОНХИТА КУР И ИНФЕКЦИОННОГО ЛАРИНГОТРАХЕИТА ПТИЦ
03.00.06. «Вирусология»
Автореферет
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Владимир -2004
Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Федеральный центр охраны здоровья животных», г. Владимир.
Научный руководитель
- кандидат биологических наук Дрыгин Владимир Викторович
Официальные оппоненты:
- доктор ветеринарных наук, профессор, Узюмов Василий Лаврентьевич (ФГУ Федеральный центр охраны здоровья животных, г. Владимир);
- доктор биологических наук, профессор, Смоленский Владимир Иванович (ФГУ ВГНКИ, г.Москва)
Вед\шая организация : Государственное научное учреждение Всероссийский на>чно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии)
Зашита состоится января 2005 года в 10 часов на заседании
диссертационного совета Д220.015.01 при ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» по адресу: 600901, г. Владимир, п. Юрьевец, ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»
Автореферат разослан « » 2004 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник
Г.М Семенова
SU
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. В связи с постоянной интенсификацией промышленного птицеводства, выведением новых высокопродуктивных пород птицы, расширением международных экономических связей, включающих закупку племенной птицы за рубежом, на территории нашей страны регистрируются новые инфекционные болезни домашней птицы. Кроме того, появляются вариантные изоляты уже известных вирусов, способные вызывать заболевания даже у вакцинированной птицы. Поэтому постоянный мониторинг таких экономически значимых заболеваний, как инфекционный бронхит кур и инфекционный ларинготрахеит птиц, позволяет контролировать их распространение и обеспечивать эффективность профилактических мероприятий. Большое значение при этом имеют выделение изолятов вирусов и изучение их биологических свойств, в частности, для создания новых вакцин.
Инфекционный бронхит кур (ИБК) - высококонтагиозное заболевание, которое поражает птиц различного возраста в хозяйствах мясного и яичного направления и широко распространено во многих странах. Возбудителем заболевания является РНК-содержащий вирус ceu.Coronaviridae, рода Coronavirus. При развитии заболевания норажакмея респираторные органы, почки, а также репродукшвные органы и кишечник кур. Экономические потери связаны со снижением прироста массы тела у цыплят-бройлеров, снижением яичной продуктивности, ухудшением качества яиц у несушек и родительского поголовья кур.
Вирус ИБК исключительно разнообразен и имеет большое количество серотипов и вариантов (Сюрин В.Н.,1998, Garcia M., 2001, Liu S., 2004, Picault J.P., 1986, Schikora B.M., 2003, Wang C.H., 2000, Zanella A., 2003). Причиной такого антигенного многообразия вируса ИБК является его чрезвычайно высокая изменчивость. Антигенные различия между вирусами возникают в результате спонтанных мутаций в определенных участках структурных генов, кодирующих иммунодоминантные области. Известно большое количество серотипов вируса (по разным данным от 20 до 30), при этом иммунитет, приобретенный к одному серотипу, не дает перекрестной защиты от заражения другим серотипом, что значительно осложняет профилактику ИБК.
С середины 1990-х гг. в ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» проводится обследование птицехозяйств, расположенных в различных регионах РФ на наличие антител к вирусу ИБК. Было показано широкое распространение заболевания на птицефабриках России.
В результате исследования патологических материалов, полученных из птицехозяйств в 1999-2004 гг., методами ПЦР и секвенирования было выявлено и типнровано 57 изолятов вируса ИБК. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что спектр вирусов ИБК, циркулирующих в настоящее время в России, очень разнообразен. Наряду с изолятами группы Массачусетс, выявляемыми ранее (41%), и изолятами европейского происхождения (13%), широко распространены эндемичные для России вариантные изоляты (46%) (Борисов А.В , 2002).
Постоянное выявление и изучение новых изолятов вируса ИБК, а также широкий генетический спектр уже выявленных, указывают на необходимость изучения их иммуно-биологических свойств, получения на их основе живых и ннактивированных вакцин, а также мониторинга за данным заболеванием с использованием всех имеющихся диагностических методов исследований, что свидетельствует об актуальности работы.
Инфекционный ларинготрахеит птиц (ИЛТ) - контагиозная вирусная болезнь кур. индеек, цесарок, фазанов, характеризующаяся поражением слизистых оболочек верхних дыхательных путей и глаз. Заболевание вызывается вирусом ИЛТ, относящимся к сем. Негреэутбае, подсемейству В естественных
условиях к инфекционному ларинготрахеиту восприимчивы куры всех возрастных гр\пп. Вирус поражает кур-несушек, материнское поголовье, бройлеров. В настоящее время ИЛТ встречается повсеместно во всех странах мира (Бабкин В.Ф., 1986, Ттигкаап N.. 2003, Уап<1ег Кор М.,1993, \МеНсгко А., 2004).
Источником возбудителя при инфекционном ларинготрахеите являются больные, переболевшие, а также птицы с бессимптомным течением ИЛТ. После лереболевания ИЛТ у кур наблюдается длительное вирусносительство - до двух лет и более. После острой фазы инфекции может наступить латентный период с сохранением-» генехмчееквпу материала вируса в ДНК нейроцитов ганглия троГшичногЬ 198$, УПтаг Р., 2004).
Только в случае острой формы заболевания с высокой смертностью и о[харкиваиием крови, ларинготрахеит может быть точно диагностирован по клиническим симптомам. В случае легкого течения заболевания, а также при смешанной инфекции требуется лабораторное подтверждение диагноза. Основными методами диагностики ИЛТ являются обнаружение внутриклеточных телец-включений, выделение вируса на развивающихся куриных эмбрионах (КЭ), и идентификация инфицирующего агента в серологических реакциях (РДП, РН, РИД, ИФА) или методами электронной микроскопии. Все эти методы обладают различной чувствительностью и требуют предварительного пассирования вируса на КЭ. В результате постановка диагноза занимает длительное время. Поэтому разработка экспресс-методов диагностики ИЛТ, таких как ПЦР, является актуальной проблемой.
Цель и задачи исследования
Основная цель данных исследований заключалась в разработке методов выделения и идентификации изолятов вирусов ИБК и ИЛТ, определении первичной С1рук1уры вариабельных фрагмент» вирусных тшмои, в изучении биоло!ичсских свойств выделенных вирусов, таких как способность размножаться в чувствительных системах (куриных эмбрионах или культурах клеток), вирулентность и иммуногенность для восприимчивых животных, а также в совершенствовании методов диагностики ИЛТ.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие
задачи:
разработать комплексную методику выделения и идентификации изолятов вирусов ИБК и ИЛТ из различных вируссодержащих материалов; изучить биологические свойства изолятов вируса ИБК, выделенных из полевых образцов, для возможного использования их в составе инактивированной вакцины для профилактики ИБК в птицехозяйствах; оптимизировать условия постановки РДП для идентификации вируса ИЛТ; разработать метод индикации генома вируса ИЛТ в различных вируссодержащих материалах на основе ПЦР;
изучить биологические свойства изолятов вируса ИЛТ, выделенных в России, в сравнении с вакцинными отечественными и зарубежными штаммами вируса ИЛТ;
провести анализ нуклеотидной последовательности некоторых участков генома изолятов вируса ИЛТ, выделенных в России, а также вакцинных отечественных и зарубежных штаммов вируса ИЛТ.
Научная новизна исследования. Впервые определены нуклеотидные последовательности вариабельной области гена 81 изолятов вируса ИБК «Калужский» и «Таганрогский», выделенных во ВНИИЗЖ, и изучены и\ биологические свойства.
Штаммы депонированы в коллекции ВГНКИ под номерами «Калужский №-121-ДЕП», «Таганрогский №-120 ДЕП».
Разработан метод выявления генома вируса ИЛТ в различных вируссодержащих материалах на основе ПЦР.
Впервые определена нуклеотидная последовательность участков генов 1СР4 и ТК 18 изолятов и 9 вакцинных штаммов вируса ИЛТ.
Создан банк данных нуклеотидных последовательностей участков генов 1СР4 и ТК вируса ИЛТ.
Практическая значимость исследования. Разработаны комплексные методы выделения и идентификации изолятов вирусов ИБК и ИЛТ, позволяющие выделять вирус из различных вируссодержащих материалов и оценивать его биологические свойства. С помощью разработанных методов было проанализировано 79 проб патматериала, поступивших на исследование из птицехозяйств различных регионов России в течение 1999-2004 гг. с подозрением на ИБК и 85 проб патматериала с подозрением на ИЛТ. В 41 пробе был выявлен вирус ИБК, в 20 -вирус ИЛТ.
Разработан метод индикации генома вируса ИЛТ на основе ПЦР с праймерами, ограничивающими области генов 1СР4 и ТК, позволяющий выявлять геном возбудителя в различных вируссодержащих материалах в течение 4-6 часов без предварительного выделения вируса в куриных эмбрионах. С помошмо
разработанного метода проведено исследование 18 изолятов вируса ИЛТ, выявленных в натмагериалах, поступавших на исследование из различных птицефабрик России в 1999-2004 гг., а также 4 отечественных и 5 зарубежных вакцинных штаммов.
Методы выделения и идентификации изолятов вируса ИБК, выделения, титрования и идентификации вируса ИЛТ, индикации генома вируса ИЛТ с помощью полимеразной цепной реакции, одобрены ученым советом, утверждены директором ВНИИЗЖ и рекомендованы для использования в практике.
Публикация научных исследований. По теме диссертации опубликовано 10 научных работ.
Апробация работы. Основные материалы диссертации были доложены и опубликованы в материалах IV и V Всероссийских научно-практических конференций «Генодиагностика инфекционных заболеваний», Москва 2002 и 2004 гг., Международной научной конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии животных» ВНИИЗЖ, г. Владимир (2003 г.), Международной научной конференции молодых ученых «Проблемы мониторинга и генодиагностики инфекционных болезней животных» ВНИИЗЖ, г. Владимир ( 2004 г.).
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 156 страницах компьютерного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы и приложения. Список литературы включает 203 источника. Работа иллюстрирована 12 рисунками и 15 таблицами.
Основные положения, выносимые на защиту:
метод выделения, титрования и идентификации вирусов ИБК и ИЛТ:
метод индикации генома вируса ИЛТ, основанный на амплификации в ПЦР
фрагментов генов 1СР4 и ТК;
метод определения первичной структуры вариабельных участков генов 1СР4 и ТК, основанный на секвенировании амплифицированных в ПЦР фрагментов;
банк данных нуклеотидных последовательностей вариабельной области участков генов ICP4 и ТК вируса ИЛТ;
биологические свойства изолятов вирусов ИБК и ИЛТ, выделенных из патматериала, поступавшего на исследования из различных птицефабрик, расположенных на территории России.
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Материалы. Вирус ИБК. В исследовании были использованы 10 полевых изолятов вируса ИБК, выделенных из патматериапов, полученных из различных птицефабрик России в течение 1999-2004 гг., 2 полевых изолята, любезно предоставленных доктором Джованни Тоцци (институт Зоопрофилактики, г.Брепша, Италия), а также 8 вакцинных штаммов из коллекции ВГНКИ (г.Москва).
Вирус ИЛТ. В исследовании были использованы 14 изолятов вируса ИЛТ, выделенные в течение 2000-2004 гг. во ВНИИЗЖ, а также 4 вакцинных отечественных, 5 вакцинных зарубежных штаммов и 4 вирулентных штамма, пол\ченные из коллекции ВГНКИ (г.Москва).
В процессе выполнения работы были использованы следующие биологические модели: куриные SPF-эмбрионы, цыплята в возрасте 1 и 30 суток, кролики породы шиншилла массой 2,5-3,0 кг, морские свинки массой 250-300 г, первично-трипсинизированная культура клеток печени куриных эмбрионов (ПК ПКЭ). органная культура трахеи.
В работе были использованы реактивы производства Promega, Serva, Sigma, Fluka, Pharmacia, а также отечественные реаюпвы марки «о.с.ч.».
Методы. Выделение изолятов ИБК и ИЛТ, а также определение их инфекционного титра проводили с использованием 9-10 суточных SPF -КЭ. Очистку и концентрирование вирусов из вируссодержащих суспензий проводили методом центрифугирования в градиенте плотности хлористого цезия (ИБК) или осаждением на дно через слой сахарозы (ИЛТ).
Определение активности и специфичности антигенов проводили в непрямом варианте ИФА с набором стандартных контрольных сывороток с известным ттром, а
также в блокирующем варианте ИФА. Использовали наборы производства KPL и СИНКО-ИФА (ВНИИЗЖ).
Выделение суммарной ДНК и РНК, а также очистку продуктов ПЦР проводили по модифицированному методу Грибанова О.Г. и соавт.(1997) с использованием стекловолокнистых фильтров GF/F (Whatman).
Полимеразную цепную реакцию проводили в программируемом амплификаторе «Терцик» («ДНК-технология», Россия). Для определения первичных нуклеотидных последовательностей использовали метод прямого секвенирования с использованием набора «fmol DNA Sequencing System Sample» (Promega). Анализ нуклеотидных и соответствующих им аминокислотных последовательностей проводили, применяя пакет прикладных программ «SeqProgs» (Data handling for molecular epidemiology), версия 1.0 (N.J.Knowles, IFAH, Великобритания, 1992 г.).
Для изучения антигенных взаимоотношений эталонных штаммов и вирусных изолятов использовали штаммоспецифические гипериммунные сыворотки, полученные против испытуемых штаммов на кроликах и курах.
Реакцию нейтрализации ставили в двух вариантах (с разведением сыворотки и с разведением вируса) стандартными классическими методами на куриных эмбрионах, а также в органной культуре трахеи. Степень антигенного родства между вирусами рассчитывали по модифицированной формуле Архетти-Хорствала, устанавливая отношение индексов нейтрализации.
Морфологию вирусов изучали методом негативного контрастирования с использованием 4%-го раствора фосфорно-вольфрамовой кислоты. Анализ препаратов проводили под электронным микроскопом JEM-100B. Исследования проводили совместно с д.б.н. Пономаревым А.П.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Определение видовой принадлежности и выделение изолятов вируса ИБК «Калужский» и «Таганрогский» из полевых проб
За период с 1999 -2004 гг. было исследовано более 250 проб патматериалов из 149 птицехозяйств, в результате нами было выявлено 57 вариантных изолятов вируса ИБК. Нам предстояло выбрать из них те, которые обладали бы наиболее
отличающимися биологическими и генетическими свойствами от вакцинных штаммов, и в дальнейшем рекомендовать их для использования при производстве инактивированных вакцин.
Для дальнейших исследований выбраны 2 изолята, выделеные из патматериала, поступившего на исследование из птицефабрик «Калужская» Калужской области и «Таганрогская» Ростовской области.
Результатом исследований полученных проб в ПЦР с праймерами на ген был синтез специфического фрагмента длиной 571 п.н., что свидетельствовало о наличии генома вируса ИБК в обеих пробах. Нуклеотидную последовательность полученного фрагмента определяли методом прямого секвенирования.
Последовательность гена 81 высококонсервативна среди штаммов одного серотипа. Внутри серотипа гомология нуклеотидной последовательности составляет более 90%, тогда как между разными серотипами обычно ниже 80%. Сравнение полеченных данных с известными последовательностями зарубежных и российских изолятов, а также вакцинных штаммов вируса ИБК, имеющимися в СепВапк, показало отличие изолята «Калужский» более чем на 25%. Нуклеотидные замены. обнар\женные в результате секвенирования, в большинстве случаев являлись значимыми и приводили к аминокислотным заменам. Высокий уровень аминокислотных отличий в структуре основного антигенного белка изолята «Кал>жский» позволял предположить и должен был обеспечить заметные отличия его антигенных свойств. Изолят «Таганрогский» имел 97 % гомологию со штаммом 4/91 серотнпа 793/В и должен был иметь сходные антигенные свойства.
Для вирусовыделения обоих изолятов использовали куриные эмбрионы (БРР-КЭ) 10-суточной инкубации. Заражение БРР-КЭ проводили введением 0,2 мл вир\ссодержащей суспензии в аллантоисную полость.
Специфические изменения, характерные для ИБК наблюдали, начиная с 3 пассажа при заражении КЭ изолятом «Таганрогский» и с 5 пассажа у изолята «Калужский». В 14 пассаже до 50% зараженных эмбрионов погибали через 72 часа после заражения каждым изолятом. При последующих пассажах характер и степень поражения эмбрионов не изменялся. Для дальнейших исследований использовали 14 пассаж изолята «Калужский» с титром 6,5 ЭИД50/мл и 15 пассаж изолята «Таганрогский» с титром 6,0 ^ ЭИД50/мл.
Определение видовой принадлежности изолятов проводили в РН с использованием специфических сывороток к ИББ, ИЛТ, НБ, ИБК. Постановку РН осуществляли по стандартной методике с разведениями сыворотки. Доза вирусов составляла 102 ЭИДзо/мл. Выраженный в десятичных логарифмах индекс нейтрализации (ИН) для изолята «Таганрогский» составил 3,5, а для изолята «Калужский» 4,25. При этом ИН специфических сывороток к изучаемым составил более 2,0 а ИН гетерологичных сывороток (ИББ, НБ, ИЛТ) не превышал значения 1,0 что свидетельствует о принадлежности выделенных вирусов к вирусу ИБК.
01су1с1вие контаминации чужеродными вирусами определяли но 01сутствию неспецифических для вируса ИБК поражений БРЯ-КЭ, меч одами электронной микроскопии и в ПЦР.
При электронно-микроскопическом исследовании препаратов, содержащих изоляты «Таганрогский» и «Калужский», в поле зрения электронного микроскопа наблюдали полиморфные вирионы с короной с внешним диаметром от 80 до 105 им (без шипов от 60 до 80 нм).
Проведен контроль полученных вирусных препаратов на отсутствие бактериальной, грибной и микоплазменной контаминации.
В результате установлено, что препараты изолятов «Таганрогский» и «Калужский» не контаминированы другими вирусами и условно-патогенной микрофлорой.
Изучение антигенных свойств выделенных изолятов вируса ИБК в реакции перекрестной нейтрализации
Для изучения антигенных свойств изолята «Калужский» в реакции перекрестной нейтрализации получали гипериммунные сыворотки крови кроликов, а для изолята «Таганрогский» использовали сыворотки крови кур.
Активность полученных сывороток, определенная в непрямом варианте ИФА, составила не ниже 1:32000, а в РН со специфическими антигенами от 1:204 до 1:562. Такая активность обеспечивала возможность использования сывороток в реакции перекрестной нейтрализации для установления степени антигенного родства выделенных вирусов с другими штаммами и изолятами вируса ИБК.
Реакцию перекрестной нейтрализации осуществляли по стандартной методике с постоянной дозой сыворотки и разведениями вируса. При исследовании изолята «Калужский» использовали 6 штаммов вируса и специфических сывороток к ним -Mass 41 (серотип Массачусетс), Д-274 (серотип Д207), 4/91 (серотип 793/В), Connecticut, Italy -01, Italy-02, а при исследовании штамма «Таганрогский» - H-I20 (серотип Массачусетс), Д-274 (серотип Д207), 4/91 (серотип 793/В), «Калужский» (российский изолят).
Для постановки РН с изолятом «Калужский» в качестве тест-системы использовали 10-дневные SPF-КЭ, а с изолятом «Таганрогский» - трахеальную органную культуру (ТОК), полученную от 19-20 суточных SPF-КЭ. Результаты перекрестной РН представлены в табл. 1 и 2.
Таблица 1
Результаты неполной перекрестной нейтрализации изолята «Калужский»
вируса ИБК в РН,
_п=3, Р<0,05
Вирус Сыв-га \ Mass41 4/91 Connecticut Д274 Italy-01 Italy-02 Калуга Норм. Сыв-ка
Титры в ]g ЭЦДуДш
Mass41 i&oa - - - - - 4,77±0,17 6Д5±0,15
491 - 1,47*0,25 - - - - 4.09±0,14 6,QtO,19
Ccmxticut - - 2,06ь0,12 - - - 3,76*0,25 6,Ш22
, ДУ4 - - - - - 5,66*0,13 5,63±0,18
i hab-01 - - - - 2,06*0,12 - 3,57*0,17 6^5±027
1 haN-02 - - - - - 223*0,19 325*0.15 625*0,3
Кал\та 4,92±0,09 5Д4±027 4,92±0,09 4,77±0,04 4,82±0,12 1,72*025 6,5iO,12
На основании данных табл.1 определяли степень антигенного родства (R) нзолятов «Калужский» и «Таганрогский» по модифицированной формуле Архетти-Хорствала к каждому штамму, представителю определенного серотипа Степень антигенного родства (R) изолята «Калужский» штамму МВА (серотип Массачусетс») составила 0,05%, штамму «4/91» (серотип 793/В) - 0,11%, штамму «Коннектикут» - 0,3%, штамму Д274 (серотип Д207) - 0,06%, итальянскому изоляту ItaK - 01 - 0,4%, итальянскому изоляту Italy - 02 - 0,7%. Как следует из полученных данных, выделенный изолят не обнаруживал близкой гомологии ни с одним из референтных штаммов.
Таблица 2
Результаты неполной перекрестной нейтрализации изолята «Таганрогский»
вируса ИБК в РН
п=3, Р<0,05
Вирус Сыв-ка Н-120 4/91 Д274 Калужский Таганрогский Норм, сыв-ка
Титры в lg CDmol
11-120 1,50±0,14 - - - 6,00*0,18 6,05-t0,11
4/91 - 1,50±0,22 - - 1,66±0,23 6,00±0,09
Д274 - - 2,15±0,17 - 5,57±0,18 5,63±0,12
Калужский - - - 1,66±0,22 4,78±0,22 6,36±0,1
Таганрогский 4,80±0,23 2,33±0,67 3,78±0,12 3,66±0,34 1,95±0,22 5,76±0,3
По результатам, представленным в табл. 2, определяли степень антигенного родства (R) изолята «Таганрогский». Она составила - штамму «4/91» (серотип 793/В) 54 %, изоляту «Калужский» (российская группа изолятов ИБК) - 0,05%. штамм) Д274 (серотип Д207) - 0,04%, штамму «Н-120» (серотип Массачусетс) - 0,07%. Как следует из представленных данных, изолят «Таганрогский» имеет наиболее близкое антигенное родство к серотипу 793/В. Таким образом, сделанное нами предположение о связи аминокислотной структуры белка S1 вируса ИБК с его антигенными свойствами полностью подтвердилось.
Изучение способности выделенных изолятов ИНК к репродукции н куриных эмбрионах
Для изучения способности к репродукции в куриных эмбрионах и юля юн «Таганрогский» и «Калужский» использовали лиофильно высушенный препарат, полученный после 15 последовательных пассажей изолята «Таганрогский» и 14 пассажей изолята «Калужский».
Заражение эмбрионов проводили внесением вируссодержащего материала в аллантоисную полость 9-10 суточных SPF-КЭ, объем инокулята составлял 0,2 мл, а инфекционный титр равнялся в среднем 3,03 lg ЭИД50/мл. Инфицированные эмбрионы инкубировали в течение 48, 72, 96 и 120 часов. Накопление вируса в
жсфаэмбрионалыюй жидкое i и (ЭЭЖ). ХАО и тушке эмбриона исследовали меюдом титрования на КЭ.
На основании полученных результатов было сделано заключение, чго в качсс1Вс вируссодержаще! о сырья наиболее эффекшмно использоншь ')')Ж инфицированных эмбрионов через 72 часа инкубации.
Определение вирулентности выделенных изолятов вируса ИБК
Biipyjieiiiiiocib шшммов определяли путем постановки биопробы на 19 суточных цыплятах, полученных из птицефабрики «Кинешемская» Ивановской области. Перед заражением цыплят их сыворотки крови были исследованы в ИФА на наличие антител к вирусам ИБК, ИББ. Ньюкаслской болезни, гриппа птиц, мшефаломпелша, 11J1T. инфекционной анемии цьпшя!, реовирусу, М. synovia, M. galliscpticuin. Аш и I ел к эшм агешам не было обнаружено.
Для шклановки эксперимента формировали три группы по 10 цынля). Цыплятам 1 и 2 опытных групп интраназально инокулировали дозу, равную 4,0 lg ')ИДм1 толяIом «Калужский» и «Таганрогский», соотегегвенно, н смеси с М. Syno\ iac (ни. WVU1853. imp в РГА 1:64). Из данных лшерагуры извсспю, чю вирус ЦБК не несIда нызьшае! ocipyio клинику у подопытных цыплят, а при заражении il гни смесью вируса ИЬК и М.synovia или fc.coli клинические проявления усиливались. Третью группу не заражали и использовали в качестве контроля. За инфицированными цыплятами вели клиническое наблюдение в течение 10 суток.
Максимальное число больных в первой группе отмечалось на 8-сутки - (4 гол.), во второй - на 6 -е сутки (6 гол.). При этом наблюдали развитие респираторных признаков ИБК - хрипов, истечений из носа, кашель и чихание, сопровождаемое общим угнетением, взъерошенностью перьевого покрова. В обеих группах присутствовали птицы, выздоровевшие после переболевания (3 и 4 гол-соответственно). Клинические признаки у них были выражены умеренно и пропали к 10 дню наблюдения.
На 10 сутки после заражения был проведен убой всех цыплят. При вскрытии признаки ИБК, выраженные в разной степени, отмечали у 8 из 10 цыплят из каждой ф\ ним. кроме контрольной. Изменения наблюдали в трахеях и бронхах (oieK.
кровоизлияния, скопление слизи), в легких (очаги уплотнений с измененной окраской), в воздухоносных мешках, в почках (отложение уратов, кровоизлияния, увеличение размеров).
Персистенцию вируса в организме инфицированных птиц подтверждали исследованием органов, отобранных у цыплят, в ПЦР. Кроме того, проводили реизоляцию вируса на ТОК из трахеальных смывов, взятых на 9-сутки после заражения от трех цыплят с клиническими признаками заболевания и от трех условно «здоровых» птиц из обеих групп. Вирус был выделен от 4 цыплят из 6, в двух случаях был получен сомнительный результат (в обеих группах).
На основании наблюдаемых клинических признаков и патологоанатомических изменений следует заключить, что оба изолята, «Таганрогский» и «Калужский», обладают умеренной вирулентностью и способны реплицироваться в организме цыплят, не приводя к их гибели.
Определение антигенной активности выделенных изолятов вируса ИБК
Для проверки антигенной активности изолятов «Таганрогский» и «Калужский» формировали 5 групп из суточных SPF-цыиляг, но 10 голов в каждой. Цыпляч инфицировали каждым изолягом комбинированно - закапыванием в ротовую полость и окулярно н дозе 0,1 мл на голову (инфекционный тигр 3,0 lg ЭИД5о/мл). Заражение проводили двукратно с интервалом 10 суток. Группа №1 -контрольная, группа №2 -заражение изолятом вируса ИБК «Таганрогский» 15 пассажа, группа №3 - заражение изолятом вируса ИБК «Калужский» 14 пассажа, группа №4 -иммунизация вакцинным штаммом Н-52, группа №5 - иммунизация вакцинным штаммом 4/91. Через 21 сутки после второй иммунизации сыворотки крови опытных цыплят исследовали в непрямом варианте ИФА. Определяли титры антител в каждой исследуемой сыворотке и вычисляли их среднюю величину по группе. Планшеты сенсибилизировали антигенами вируса ИБК серотипа Mass (Н-52), а также изолятов «Калужский» и «Таганрогский». Результаты опыта представлены в табл. 3.
Таблица 3
Титры антител в крови цыплят, экспериментально зараженных изолятами «Калужский» и «Таганрогский», определенные в ИФА
Группа Титры" антител в сыворотках при использовании на подложке антигена
«Таганрогский» Н-52 П «Калужский»
Средний титр антител Кол-во положит, проб Средний титр антител Кол-во положит, проб Средний титр антител Кол-во положит, проб
Контроль 130* 0/10 137' 0/10 132* 0/10
«Таганрогский» 3762 10/10 3467 10/10 3524 10/10
«Калужский» 1297 7/10 1358 6/10 5876 10/10
Н-52 2165 10/10 2368 10/10 1986 10/10
4/91 1785 10/10 1546 10/10 1343 10/10
* - титр - величина, обратная разведению сыворотки
** - титры до 359 - отрицательные, от 360 до 724 -сомнительные, выше 725
положительные
Как следует из данных таблицы, на 21 день после заражения во всех группах уровень антител достигал значительных титров. Установлено, что при исследовании сывороток с использованием гомологичного вируса титры антител были выше по сравнению с гетерологичным.
Оба изолята можно считать антигенноактивными, поскольку титры антител у цыплят превышали минимальный положительный показатель и были не ниже, чем на введение вакцинных штаммов, применяемых для профилактики ИБК.
Индикация генома вируса ИЛТ с помощью амплификации фрагмента кДНК генов ТК и ICP4
Следующей задачей, поставленной перед нами, была разработка метола выявления генома вируса ИЛТ в патматериале на основе ПЦР. До настоящего времени для диагностики ИЛТ в России метод ПЦР не применялся, хотя за рубежом используется достаточно широко.
Для выбора праймеров, использующихся в ПЦР, проводили анализ последовательностей различных участков генома вируса ИЛТ вакцинных и внр\лентных штаммов: SA-2, CSW-I, Serva, Tom, Beijing Е2 (регистрационные номера в GenBank U 27243, U 27244, L32139, AF43543, S83714). В итоге, для
выявления генома вируса ИЛТ вакцинных штаммов и изолятов были рассчитаны 2 системы праймеров. Первая пара фланкирует фрагмент гена 1СР4 длиной 798 п.н., вторая ограничивает часть гена тимидинкиназы размером 649 п.н..
Оптимизацию условий амплификации проводили с использованием вакцинных штаммов «О» и «ВНИИБП» вируса ИЛТ. Для исследования готовили 30% суспензию из хориоаллантоисных оболочек КЭ, зараженных вирусами ИЛТ шт. «О» и «ВНИИБП», на дистиллированной воде. Параллельно проводили ПЦР-анализ лиофилизированных вакцин из штамма «О» и «ВНИИБП», которые разводили бидистиллированной водой. В качестве отрицательного контроля использовали 30% суспензию из ХАО интактных ЗРБ-эмбрионов. В дальнейшем при исследовании полевых проб готовили 30% суспензию из тканей трахей, отобранных у больной птицы.
Оптимизация условий постановки ПЦР заключалась в подборе оптимальных температурных и временных параметров для повышения специфичности реакции. Для реакции с праймерами на ген ТК проводили одну реакцию при следующих режимах: первоначальная денатурация ДНК при 95°С в течение 3 минут, 30 циклов, состоящих из 3 этапов - денатурация ДНК - 60 с при 94°С; отжиг праймеров - 90 с при 59°С, элонгация цепи - 90 с при 72° С. Затем проводили дополнительную достройк\ цепи в течение 10 минут при 72°С. В ходе реакций амплифицировался фрагмент ДНК длиной 649 п.н.
При использовании праймеров на ген 1СР4 реакцию проводили в дна этапа амплификация и «гнездовая» ПЦР. Программа амплификации состояла ич 35 циклов со следующими параметрами- денатурация ДНК - 30 с при 94°С, отжиг праймеров 30 с при 50°С, элонгация ДНК при 72°С в течение 50 с. При постановке «гнездовой» ПЦР проводили 25 циклов при следующих режимах: 30 с -94°С, 30 с -55°С и 40 с -72°С. В результате после первой реакции синтезировался специфический фрагмент размером 798 п.н, после второй -762 п.н.
Для определения чувствительности реакции проводили исследования десятикратных разведений вируссодержащей суспензии на буфере БТЕ (ХАО эмбрионов после заражения вирусом ИЛТ штамм «О», титр 6,5 ^ОИД5|/мл). Предельное разведение, в котором был выявлен вирусспецифический фрагмент с праймерами ТК1-2, было 1,5 ^ЭИД50/мл, после первой реакции с праймерами 1СР1-2
- 2,5 ^ЭИД5о/мл . При постановке гнездовой ПЦР с использованием пары внутренних праймеров 1СРЗ-4 чувствительность метода возрастала на 3 порядка и составляла 0,5 ^ЭИДзо/мл.
За период с 1999-2004 гг. с помощью разработанного метода было проанализировано 85 проб патологического материала, поступившего на исследования из 62 хозяйств с подозрением на ИЛТ. Основной причиной направления материалов на исследование являлось наличие у птицы симптомов заболевания, коюрыс мо1у! бьпь вызваны вирусом инфекционного ларипгофахеша Для исследования в лабораторию направляли живую шицу с клиническими признаками, |р\пы погибших особей или отобранный в хозяйстве пагмагериал. Вируссодержащим материалом являлись верхний отдел трахеи, глотка, ткань носовых пазух или ткань конъюнктивы, а также геморрагический трахеальный экссуда! или фибринозный фомб из верхних отделов трахеи.
Вирус выявляли в суспензии тканей трахей, гортаней, легких, печени, кшглиев тройничного нерва, отобранных от больной птицы, не проводя предварительного пассирования вируса на эмбрионах.
В результате проведенных исследований в 20 пробах из 20 хозяйств был выявлен геном вируса ИЛТ. ПЦР была положительна на оба гена в 18 случаях и в двух - положительна лишь на ген 1СР4. Поэтому исследование проб с подозрением на ИЛТ с помощью 11ЦР на оба гена увеличивает достоверность анализа.
Для доказательства специфичности реакции проводили ПЦР с системами праймеров на гены 1СР4 и ТК вируса ИЛТ с вирусами болезни Марека, оспы птиц, аденовирусом. Синтеза специфических фрагментов не наблюдали.
Секвенирование амплифицированных участков генов 1СР4 и ТК вируса ИЛТ и анализ генетической вариабельности
Для определения нуклеотидной последовательности амплифицированного фрагмента кДНК использовали циклическое секвенирование. Реакцию проводили с теми же праймерами, которые использовались для ПЦР. Для радиоактивного мечения праймеров использовали а- [32Р] -с)АТР. Матрицей для секвенирования являлись амп.шфнцнрованные фрагменты кДПК после очистки реакционной ПЦР-смесн.
Был оптимизирован температурно-временной режим реакции секвенирования, который включал следующие стадии: денатурация при 94°С в течение 30 с, отжиг праймеров при 55°С в течение 30 с, синтез кДНК при 72°С, в течение 60 с. Проводили 15 циклов реакции.
Разработанная методика определения нуклеотидной последовательности фрагментов генов ТК и 1СР4, включающая ПЦР и прямое секвенирование, была использована для анализа вариабельности фрагментов генов 1СР4 и ТК 9 вакцинных штаммов, 14 изолятов вируса ИЛТ, выделенных во ВНИИЗЖ, и 4 вирулентных штаммов из коллекции ВГНКИ.
В результате проведенных исследований все изученные вакцинные штаммы и изоляты были разделены на 2 группы по первичной структуре фрагмента гена 1СР4. Делений в этом фрагменте гена 1СР4, описанных зарубежными авторами, у исследованных нами штаммов и изолятов обнаружено не было. В каждой группе присутствовали как вакцинные, так и вирулентные штаммы и изоляты.
У всех представителей первой генетической группы были обнаружены замены в вариабельных участках гена 1СР4 и не было замен в гене ТК. Представители второй генетической группы не имели указанных замен в гене 1СР4, в то время как замена в гене ТК у них обнаруживалась. Однако, связи замен в гене ТК с вирулентностью штамма нами установлено не было - замены присутствовали как у вакцинных штаммов, так и у изолятов.
Во ВПИИЗЖ для профилактики ИЛТ производится живая вакцина из имамма «О», который относится к иной генетической группе по сравнению с другими отечественными вакцинными штаммами («ВНИИБП», «ЦНИИПП»). Методом секвенирования возможно различать эти вакцинные штаммы, однако он требует довольно длительного времени и является дорогостоящим. Поэтому для дифференциации выявленных генетических групп по структуре фрагмента гена 1СР4 нами разработана система праймеров для использования их в ПЦР. Анализируя участок гена, имеющий наибольшие отличия, нами был рассчитан праймер на вариабельную область. Фрагмент, полученный в ПЦР после 1 реакции с праймерами 1СР1-1СР2 амплифицировали во второй реакции с праймерами 1СР5-1СР4. В результате этой реакции либо синтезировался фрагмент размером 518 п.н., если вирус
относился к первой генетической группе, либо его синтез отсутствовал. Результаты ПЦР полностью совпадали с данными секвенирования.
Выделение вируса ИЛТ из полевых проб
Для вирусовыделения использовали только те пробы, в которых методом ПЦР был выявлен геном вируса ИЛТ. Исследовали 9 вакцинных штаммов и 4 вирулентных, полученных из коллекции ВГНКИ, а также 14 изолятов вируса ИЛТ, выделенных из проб патмагериала. Проводили не менее 3 пассажей на КЭ. После каждою пассажа отбирали ХАО, готовили из них 30% суспензию на аллантонсной жндкоаи зараженных эмбрионов. Суспензию дважды замораживали-оттаивали. за1ем осветляли ценфифугированием при 10000 % на микроцешрифуге (Еррепс1огГ) и суперна гантом проводили повторное заражение эмбрионов на ХАО.
Вирус ИЛТ вызывал поражения ХАО двух видов - крупноочаговые, формирующиеся на месте нанесения вируссодержащей суспензии, с некротическим центром и белой непрозрачной периферией (обозначенные нами как тип 1) и мелкоочаговые, распространенные по всей поверхности ХАО (тип 2).
Некоторые из вирусов вызывали видимые поражения ХАО после первого же пассажа, для других требовалось проведение двух или трех пассажей. В двух случаях репродукции вирусов в КЭ не наблюдали после проведения 3 пассажей. При этом корреляции между уровнем вирулентности и характером поражений ХАО установит ь не удалось. Среди вакцинных штаммов поражения типа 1 наблюдали в 4 случаях, типа 2 - в двух. Среди изолятов наблюдалась аналогичная картина - поражения типа 1 выявляли в 7 случаях, а типа 2 - в 5, у двух вирулентных штаммов наблюдались поражения 1 типа, у двух - второго. Связи характера поражений и гибели эмбрионов также не обнаружили. Корреляции между генетическими группами и различием в характере бляшек, образующихся на ХАО, не было установлено. По всей видимости, за эти функции отвечают другие участки генома вируса ИЛТ.
Штаммы вируса ИЛТ различаются по вирулентности для куриных эмбрионов. При наших исследованиях гибель от 30 до 50% вызывали вирулентные штаммы и 3 изолята, вакцинные штаммы не обладали летальностью для эмбрионов.
Идентификация выделенных вирусов средствами электронной микроскопии, в реакциях нейтрализации, РДП и ИФА
Препараты очищенного и концентрированного вируса ИЛТ исследовали под электронным микроскопом ШМ-ЮОВ при инструментальном увеличении в 30000 раз. Морфологически негативно контрастированные вирионы ИЛТ представляли собой нуклеокапсиды в суперкапсидной оболочке. Размеры вирионов варьировали от 120 до 300 нм, что соответствовало морфологии герпесвирусов.
Идентификацию выделенных изолятов вирусов ИЛТ проводили в реакции нейтрализации. Постановку РН осуществляли на КЭ с использованием гипериммунных сывороток кроликов. ИН < 1 при исследовании препаратов с гетерологичными сыворотками и ИН > 2 ^ при исследовании со специфической сывороткой свидетельствовал о принадлежности всех выделенных вирусов к вирусу ИЛТ.
Для изучения антигенной специфичности вируса ИЛТ проводили перекрестную реакцию нейтрализации. Использовали гипериммунные сыворотки кроликов, полученные на введение вакцинных препаратов из штаммов вируса ИЛТ «О» (вакцина пр-ва ВНИИЗЖ, генетическая группа 1), ВНИИБП (вакцина пр-ва ВНИИБП, генетическая группа 2), "8егуа"(вакцина пр-ва «1п1егуеЬ> Голландия, генетическая группа 2). Сыворотки имели титр антител в ИФА не ниже 1:12800 и ИН > 2. Полученные данные представлены в табл. 4.
Таблица 4
Различия в степени нейтрализации между вакцинными штаммами «О»,
«ВНИИБП» и «Serva»
воротка Вирус «О» «ВНИИБП» «Serva» Нормальная сыворотка
Титры в lg ЭИД50/МЛ
«О» 1,67 1,75 1,8 6,5
«ВНИИБП» 1,73 1,68 1,75 6,7
«Serva» 1,78 1,77 1,65 6,25
На основании данных табл. 4 определяли отношения индексов нейтрализации и устанавливали степень антигенного родства между штаммами. Она составила для «О» / «ВНИИБП» - 78%, для «О» / «Serva» - 74%, для «ВНИИБП» / «Serva» - 80 %.
Изучение степени нейтрализации вирусов ИЛТ, относящихся к разным I снстичсским группам, не выявило существенных различий в нейфализацин их специфическими гомологичными и гетерологичными сыворотками. На основании вышеизложенного можно сделать вывод о серологической однородности исследованных вирусов ИЛТ.
В традиционной схеме диагностики ИЛТ для выявления вируса используется реакция диффузионной преципитации. Для повышения чувствительности реакции нами разработана методика концентрирования исследуемых препаратов. Для этого 30% суспензию ХАО осветляли центрифугированием при 10000 g в течение 3 минут, к опернатангу добавляли 1/5 объема смеси 20% ПЭГ и 2,5 М ЫаС1, инкубировали в 1счение 30 минут при комнатной температуре и осаждали центрифугированием при 10000 е в течение 20 минуй Осадок растворяли в ФБР в 1/100 ог первоначального объема. Реакцию проводили в чашках Петри в 1% агарозе с добавлением 2% ПЭГ, 0.8°о ЫаС1 и 1% азида натрия. Центральную лунку заполняли гипериммунной сыворо1кой с [шром в ИФА не менее 1:12800, а окружающие - дссжикрашымн разведениями исследуемых препараюв. В результате чувстптелыккпь реакции повышалась в среднем в 4 раза.
При сравнении результаюв различных методов, используемых нами для диагностики ИЛТ, таких как вирусвыделение на КЭ, РДП, блокирующего варианта ИФА (Б-ИФА) и ПЦР исследовали 40 проб патматериала.
Наивысшую чувствительность имел метод ПЦР - 27 положительных результатов. При этом проб, положительных при вирусовыделении или в реакциях РДП. ИФА и отрицательных при исследовании в ПЦР не было обнаружено. ИФА и вир\свыделение показали одинаковую чувствительность - 25 положительных результатов из 40. В двух случаях при отрицательном вирусвыделении антитела в ИФА были обнаружены. Выявление преципитирующих антител в РДП было в 22 случаях из 40. Результаты проведенных исследований представлены в табл 5.
Таблица 5
Сравнение результатов внрусвыделения на КЭ, РДП, Б-ИФА и ПЦР при диагностике ИЛТ кур
№ п/п Название пробы Титр в lg ЭИД50/мл после 2 пас. на КЭ ПЦР РДП (0 Б-ИФА (Т)
ICP4 ТК
1 Ярославский бройлер, Яросл.обл. 5,0 + - Отр Отр.
2 «Красная поляна», Курская обл. 5,25 + + Отр. 200
3 «Юрьевецкая», Владимирской обл 5,5 + + Отр. Отр.
4 Штамм «24-А» 5,5 + + 1:2 800
5 «Ясные Зори»,Белгородская обл 5,75 + + 1:4 3200
6 «Русь», Белгородской обл. 6,0 + + 1:4 3200
7 Штамм «SA-2» 6,0 + + 1-8 12800
8 Вакцина ЦНИИПП 6,0 + + 1.2 200
9 «Платошинская», Пермской обл. 6,25 + + 1:4 800
10 «Заря-ОГО», Тульская обл. 6,25 + + 1:8 6400
11 Вакцина шт. «Serva» (Intervet) 6,25 + + 1 8 12800
12 «Лысконская», Нижеюролскпя обл. 6,25 ^ + 1-2 1:4 800 1600
13 «Калининская», Пермской обл 6,5 +
14 «Южная-Холдинг», Хабаровский край 6,5 + + 1 8 6400
15 «Ьогагшцсшжая», Московская обл. 6,5 1 i 1 8 6400 200
16 Вакцина шт. «О» (BI1ИИЗЖ) 6,5 + + 1-2
17 Вакцина ВНИИБП 6,5 + + 1 8 1600
18 Вакцина «TAD» 6,5 + + 1 8 3200
19 Вакцина «Shafit» 6,5 + + 1 8 6400
20 Вакцина «Bio-trach» 6,75 + + 1 8 6400
21 «Павловская», Нижегородской обл 6,75 + + 1 8 3200
22 «Россошанская», Воронежская обл. 6,75 + - 1 8 12800
23 Штамм «А» 7,0 + + 1 8 6400
24 «Братцевская», Московской обл. 7,25 + + 1 4 6400
25 Вакцина ЦНИИПП, кл.НТ 7,5 + + 1 8 6400
26 «Центральная», Владимирская обл Отр. + + Отр. 400
27 «Ковровская», Владимирской обл Отр. + + Отр 200
Учитывая результаты, приведенные в табл. 5, было проведено сравнение логарифмов титров, полученных при проведении Б-ИФА и РДП, и рассчитан коэффициент корреляции. Он составил 88 %.
Таким образом, с применением разработанных нами методов были изучены и охарактеризованы изоляты вирусов ИБК и ИЛТ, циркулирующие на территории России.
22
ВЫВОДЫ
1. Разработаны комплексный методы выявления, идентификации и дифференциации вирусов инфекционного бронхита кур и иифекцнонною ларингограхеита нтиц в пробах патологического материала, включающие в себя первичное выявление геномов вирусов в ПЦР, выделение вирусов в чувствительной системе и их последующую идентификацию в серологических реакциях и методом прямого секвенирования, что позволяет проводить надежную и быструю диагностику этих заболеваний.
2. Выделены два полевых изолята вируса ИБК, изучены их биологические свойства. Штаммы депонированы во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, применяемых в ветеринарии и животноводстве (ВГНКИ) и рекомендованы для использования в качестве производственных штаммов при изготовлении полиштаммной инактивированной вакцины против инфекционного бронхита кур.
3. Установлено, что выделенный изолят вируса И1Ж «Калужский», является илрианшым и имеет отличия более чем на 25% но первичной структуре фратмеша гена ог референтных штаммов, а изоляг вируса ИБК «Таганрогский» имеет 98% гомологию с европейскими изолятами и относится к серо типу 793/В.
4. При определении степени антигенного родства выделенных изоляюв в реакции перекрестной нейтрализации с известными референтными штаммами установлено, что изолят «Калужский» не обнаруживет близкого антигенного родства ни с одним из использованных референтных штаммов. Изолят «Таганрогский» имел наиболее близкое (54%) антигенное родство к штамму 4/91 (серотип 793/В).
5. Разработан метод индикации генома вируса инфекционного ларннготрахеита птиц на основе ПЦР с праймерами, ограничивающими фрагменты генов 1СР4 и ТК, позволяющий выявлять вирусный геном в течение 6-8 часов в различных вируссодержащих образцах.
6. Определена первичная нуклеотидная последовательность 18 полевых изолятов и 9 вакцинных штаммов вируса ИЛТ методом прямого секвенирования амплифнцированных в ПЦР фрагментов кДНК генов 1СР4 и ТК вируса ИЛТ.
7. Создан банк данных нуклеотидных и сосггветстующих аминокислотных последовательностей отечественных и зарубежных штаммов вируса ИЛТ. Среди исследованных вакцинных штаммов и изолятов вируса ИЛТ выявлены 2 генетические группы, отличающиеся по структуре вариабельного фрагмента гена 1СР4.
8. В результате применения разработанной методики концентрирования вируссодержащего сырья для идентификации вируса ИЛТ в РДП, чувствительность реакции увеличилась в среднем в 4 раза.
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
1. Для практического использования предлагаются следующие методические указания и методики, которые разработаны при выполнении научных исследований по теме, одобрены ученым советом и утверждены директором ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»:
- «Методические указания по выделению, титрованию и идентификации вируса
инфекционного ларинготрахеита» (2001 г.);
- «Методические указания по выделению и идентификации полевых изолятов виру са
инфекционного бронхита кур» (2001 г.);
- «Методика выявления генома вируса инфекционного ларинготрахеита птнн меюдом
полимеразной цепной реакции» (2004 г.).
2. Депонированы во Всероссийской коллекции штаммов микроорганизмов при ВГНКИ следующие штаммы: «Таганрогский №-120 ДЕП» и «Калужский №-121 ДЕП», которые разрешены к применению в ветеринарии и животноводстве и рекомендованы для использования при изготовлении инактивированной вакцины для профилактики инфекционного бронхита кур.
3. Создан банк нуклеотидных и соответствующих аминокислотных последовательностей фрагмента гена 1СР4 отечественных и зарубежных штаммов вируса ИЛТ, который может быть использован для идентификации штаммов вируса ИЛТ.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. Борисов А.В., Бочков Ю.А., Фролов С.В., Хлыбова Т.В., Батченко Г.В., Дрыгин В.В. Изучение спектра полевых изолятов вируса инфекционного бронхита кур в России с использованием молекулярно-биологических и серологических методов. // Птицеводство - мировой и отечественный опыт: Матер, конф. - М., 2002. -С. 23-24.
2. Луговская Н.Н., Луговской А.А., Бочков Ю.А., Батченко Г.В., Мудрак Н.С.. Дрыгин В.В., Борисов А.В., Борисов В.В., Гусев А.А. Разработка непрямою жидкофазного блокирующего иммуноферментного анализа для обнаружения антигена вируса инфекционного бронхита кур II Птицеводство - мировой и отечественный опыт: Матер, конф. -М., 2002. - С. 86-87.
3. Бочков Ю.А.. Щербакова Л.О., Батченко Г.В., Овчинникова Е.В., Манин Т.Б., Борисов А.В., Ирза В.Н., Дрыгин В.В. Молекулярная диагностика респираторных заболеваний кур - инфекционного бронхита и пневмовирусной инфекции в России Н Генодиагностика инфекционных заболеваний: Матер, конф. - М., 2002. - С. 324-327.
4. Botchkov Y., Borisov A., Irza V., Frolov S., Batchenko G., Schcrbakova L., Ovchinnikova II., Drygin V., Guseva E. Differentiation of avian infectious bionchilis virus field isolates in Russia using molecular-biological and serological methods // 1 l,h Europ. Poultry Conf.- Bremen, Germany, 2002. - P. 176.
5. Lougovskaia N., Lougovskoi A., Bochkov Y., Batchenko G., Mudrak N., Drygin V., Borisov A., Borisov V., Gusev A. Detection and estimation of avian infectious bronchitis virus antigen by a novel indirect liquid-phase blocking ELISA using chicken and rabbit affinity purified immunoglobulins // Avian Pathol.- 2002.- V.31, №6.- P.549-557.
6. Бочков Ю.А., Батченко Г.В., Луговская H.H., Фролов С.В., Борисов А.В , Дрыгин В.В. Изучение инфекционного бронхита кур в России: исторический аспект // Актуальные проблемы инфекционной патологии животных. Матер
Междунар. науч. конф. посвящ.45-летию ВНИИЗЖ, 30-31 октября, 2003. -Владимир,2003. - С. 294-302.
7. Бочков Ю.А., Борисов A.B., Фролов C.B., Дрыгин В.В., Ирза В.Н., Батченко Г.В., Луговская H.H., Овчинникова Е.В. Диагностика инфекционного бронхита кур: современное состояние проблемы // Ветеринария.- 2003,- №4,- С. 21-24.
8. Батченко Г.В., Дрыгин В.В. Разработка метода полимеразной цепной реакции для индикации вируса ИЛТ в пробах патматериала И Проблемы мониторинга и генодиагностики инф. болезней животных: Матер Междунар. науч. конф. молодых ученых. 24-26 марта, 2004. - Владимир, 2004.- С.123-125.
9. Батченко Г.В., Оковытая Т.В., Дрыгин В.В. Оптимизация условий постановки реакций диффузионной преципитации и ИФА для диагностики инфекционного ларипготрахеита птиц // Проблемы мониторинга и генодиагностики инф болезней животных: Матер междунар. науч. конф. молодых ученых. 24-26 марта. 2004. - Владимир, 2004.- С. 126 - 127.
10. Батченко Г.В., Дрыгин В.В. Применение ПЦР для диагностики ИЛТ // Генодиагностика инф. заболеваний: Матер, конф. - М., 2004. - С. 201-203.
Отпечатано на полиграфической базе ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных», 90 экз., декабрь 2004 г.
1180
РНБ Русский фонд
2005-4 49038
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Батченко, Галина Владимировна
1. ВВЕДЕНИЕ
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1. Инфекционный бронхит кур (ИБК)
2.1.1. Патогенез и эпизоотология инфекционного бронхита кур
2.1.2. Классификация и структура возбудителя
2.1.3.Антигенная вариабельность вируса ИБК 19 2.1.4 Антигенные свойства пепломерного белка S1 23 2.1.5. Характеристика изолятов вируса ИБК, выделенных на птицефабриках России
2.2. Инфекционный ларинготрахеит птиц
2.2.1. Патогенез и эпизоотология инфекционного ларинготрахеита
2.2.2. Классификация и физико-химические свойства вируса ИЛТ
2.2.3. Репликация вируса инфекционного ларинготрахеита
2.2.4. Диагностика инфекционного ларинготрахеита птиц
2.2.5. Дифференциация вакцинных штаммов ИЛТ и полевых изолятов
2.3.3аключение по обзору литературы
3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 54 3.1. Материалы
3.1.1. Вирус ИБК
3.1.2. Вирус ИЛТ
3.1.3. Химические реагенты
3.1.4. Ферменты
3.1.5. Праймеры
3.1.6. Оборудование
3.2. Методы
3.2.1. Очистка и концентрирование вируса ИБК
3.2.2. Очистка и концентрирование вируса ИЛТ
3.2.3. Титрование вирусов ИБК и ИЛТ
3.2.4. Контроль вируссодержащего сырья на отсутствие контаминации бактериальной и грибной микрофлорой
3.2.5. Контроль вируссодержащего материала на отсутствие контаминации микоплазмами
3.2.6. Непрямой вариант ИФА
3.2.7. Блокирующий вариант ИФА
3.2.8. Выделение суммарной ДНК и РНК
3.2.9. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
3.2.10. Прямое секвенирование амплифицированных фрагментов «ДНК
3.2.11. Компьютерный анализ первичных структур нуклеиновых кислот
3.2.12. Получение гипериммунных сывороток
3.2.13. Реакция нейтрализации
3.2.14. РДП для выявления вируса ИЛТ
3.2.15. Статистическая обработка полученных результатов 72 4. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И
ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
4.1. Определение видовой принадлежности и выделение изолятов вируса ИБК «Калужский» и «Таганрогский» из полевых
4.2. Изучение антигенных свойств выделенных изолятов вируса ИБК в реакции перекрестной нейтрализации
4.3. Изучение способности выделенных изолятов ИБК к репродукции в КЭ
4.4. Определение вирулентности выделенных изолятов вируса ИБК 91 т 4.5. Определение антигенной активности изолятов вируса ИБК
4.6. Индикация генома вируса ИЛТ с помощью амплификации фрагмента кДНК области генов ТК и ICP
4.7. Секвенирование амплифицированных участков генов ICP4 и ТК вируса ИЛТ и анализ генетической вариабельности
4.8. Выделение вируса ИЛТ из полевых проб
4.9. Идентификация выделенных вирусов средствами электронной т микроскопии, в реакциях нейтрализации, РДП и ИФА
Введение Диссертация по биологии, на тему "Выделение, идентификация и характеристика изолятов вирусов инфекционного бронхита кур и инфекционного ларинготрахеита птиц"
Актуальность темы. В связи с постоянной интенсификацией промышленного птицеводства, выведением новых высокопродуктивных пород птицы, расширением международных экономических связей, включающих закупку племенной птицы за рубежом, на территории нашей страны регистрируются новые инфекционные болезни домашней птицы, а также появляются вариантные изоляты уже известных вирусов, способные вызывать заболевания даже у вакцинированной птицы. Поэтому постоянный мониторинг таких экономически значимых заболеваний, в том числе инфекционного бронхита кур и инфекционного ларинготрахеита птиц, позволяет контролировать их распространение и обеспечивать эффективность профилактических мероприятий. Важное значение при этом имеют выделение изолятов вирусов и изучение их биологических свойств, в частности для создания новых вакцин с целью достижения максимальной эффективности профилактических мероприятий.
Инфекционный бронхит кур (ИБК) - высококонтагиозное заболевание, которое поражает птиц различного возраста в хозяйствах мясного и яичного направления и широко распространено во многих странах. Возбудителем заболевания является РНК-содержащий вирус сем. Coronaviridae, рода Coronavirus. При развитии заболевания поражаются респираторные органы, почки, а также репродуктивные органы и кишечник кур. Экономические потери связаны со снижением прироста массы тела у цыплят-бройлеров, снижением яичной продуктивности, ухудшением качества яиц у несушек и родительского поголовья кур.
Вирус ИБК исключительно разнообразен и имеет большое количество серотипов и вариантов. Причиной такого антигенного многообразия вируса ИБК является его чрезвычайно высокая изменчивость. Антигенные различия между вирусами возникают в результате спонтанных мутаций в определенных участках структурных генов, кодирующих иммунодоминантные области. Известно большое количество серотипов вируса (по разным данным от 20 до 30), при этом иммунитет, приобретенный к одному серотипу, не дает перекрестной защиты от заражения другим серотипом, что значительно осложняет профилактику ИБК. Это обуславливает постоянное проведение исследований по выявлению новых изолятов вируса ИБК, изучению их иммуно-биологических свойств и получению на их основе живых и инактивированных вакцин.
С середины 1990-х гг. в нашем институте проводится обследование птицехозяйств из различных регионов России на наличие антител к вирусу ИБК. Было показано широкое распространение заболевания на птицефабриках Российской Федерации.
В результате исследований более 250 проб патологического материала, полученных из птицехозяйств в 1999-2004 гг., методами ПЦР и секвенирования было выявлено и типировано 57 изолятов вируса ИБК. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что спектр вирусов ИБК, циркулирующих в настоящее время в России, очень разнообразен. Наряду с изолятами группы Массачусетс, выявляемыми ранее, и изолятами европейского происхождения, широко распространены эндемичные для России вариантные изоляты.
Постоянное выявление и изучение новых изолятов вируса, а также широкий генетический спектр уже выявленных, указывают на необходимость постоянного мониторинга за данным заболеванием с использованием всех имеющихся диагностических методов исследования, что говорит об актуальности работы.
Инфекционный ларинготрахеит птиц (ИЛТ) - контагиозная вирусная болезнь кур, индеек, цесарок, фазанов, характеризующаяся поражением слизистых оболочек верхних дыхательных путей и глаз. В естественных условиях к инфекционному ларинготрахеиту восприимчивы куры всех возрастных фупп. Чаще всего вирус поражает кур-несушек, материнское поголовье, однако регистрируются вспышки и у бройлеров. В настоящее время ИЛТ встречается повсеместно во всех странах мира. В крупных птицеводческих хозяйствах промышленного типа ИЛТ наносит значительный экономический ущерб.
Источником возбудителя при инфекционном ларинготрахеите является больная и переболевшая птица, а также птица с бессимптомным течением ИЛТ. После переболевания ИЛТ у кур наблюдается длительное вирусносительство - до двух лет и более. После острой фазы инфекции может наступить латентный период с сохранением генетического материала вируса в ДНК нейроцитов ганглия тройничного нерва.
Только в случае острой формы заболевания с высокой смертностью и отхаркиванием крови ларинготрахеит может быть точно диагностирован по клиническим симптомам. В случае легкого течения заболевания, а также при смешанной инфекции требуется лабораторное подтверждение диагноза. Основными методами диагностики ИЛТ являются обнаружение внутриклеточных телец-включений, выделение вируса на развивающихся куриных эмбрионах (КЭ) и идентификация инфицирующего агента в серологических реакциях (РДП, РН, РИД, ИФА) или методами электронной микроскопии. Все эти методы обладают различной чувствительностью и требуют предварительного пассирования вируса на КЭ. В результате постановка диагноза занимает длительное время. Поэтому разработка экспресс-методов диагностики ИЛТ, таких как ПЦР, является актуальной проблемой.
Цель и задачи исследования.
Основная цель данных исследований заключалась в разработке метода выделения и идентификации изолятов вируса ИБК и ИЛТ, определении первичной структуры вариабельных фрагментов вирусных геномов, изучении биологических свойств выделенных вирусов, таких как способность размножаться в чувствительных системах (куриных эмбрионах или культурах клеток), вирулентность, иммуногенность для восприимчивых животных, а также в совершенствовании методов диагностики ИЛТ.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: разработать комплексную методику выделения и идентификации изолятов вируса ИБК и ИЛТ из различных вируссодержащих материалов; изучить биологические свойства изолятов вируса ИБК, выделенных из полевых образцов, для возможного использования их в составе инактивированной вакцины для профилактики ИБК в птицехозяйствах; оптимизировать условия постановки реакции РДП для индикации ИЛТ; разработать метод индикации генома вируса ИЛТ в различных вируссодержащих материалах на основе ПЦР; изучить биологические свойства изолятов вируса ИЛТ, выделенных в России, и вакцинных отечественных и зарубежных штаммов вируса ИЛТ; провести анализ нуклеотидной последовательности некоторых участков генома изолятов вируса ИЛТ, выделенных в России, а также вакцинных отечественных и зарубежных штаммов вируса ИЛТ.
Научная новизна исследования.
Впервые изучены биологические свойства и определены нуклеотидные последовательности вариабельной области гена S1 изолятов вируса ИБК «Калужский» и «Таганрогский», выделенных во ВНИИЗЖ.
Штаммы депонированы в коллекции ВГНКИ под номерами «Калужский №-121-ДЕП» и «Таганрогский №-120 ДЕП».
Разработан метод выявления генома вируса ИЛТ в различных вируссодержащих материалах на основе ПЦР.
Впервые определена нуклеотидная последовательность участков генов ICP4 и ТК18 изолятов и 9 вакцинных штаммов вируса ИЛТ.
Создан банк данных нуклеотидных последовательностей участков генов ICP4 и ТК вируса ИЛТ.
Практическая значимость исследования.
Разработана методика выделения и идентификации изолятов вирусов ИБК и ИЛТ, позволяющая выделять вирус из различных вируссодержащих материалов и оценивать его биологические свойства. С помощью разработанной методики было проанализировано 79 проб патматериала, поступивших на исследование из птицехозяйств различных регионов России в течение 1999-2004 гг., с подозрением на ИБК и 85 проб патматериала с подозрением на ИЛТ. В 41 пробе был выявлен вирус ИБК, в 18 - вирус ИЛТ.
С помощью разработанного метода проведено выделение 18 изолятов вируса ИЛТ из патматериала, поступавшего на исследование из различных птицефабрик России в 1999-2004 гг, а также 4 отечественных и 5 зарубежных вакцинных штаммов.
Разработан метод индикации генома вируса ИЛТ на основе ПЦР с праймерами, ограничивающими области генов !СР4 и ТК, позволяющий выявлять геном возбудителя в различных вируссодержащих материалах в течение 4-6 часов без предварительного выделения вируса в куриных эмбрионах.
Методы выделения и идентификации полевых изолятов вируса ИБК, выделения, титрования и идентификации вируса ИЛТ, индикации генома вируса ИЛТ с помощью полимеразной цепной реакции одобрены Ученым советом и утверждены директором ВНИИЗЖ, а также Департаментом ветеринарии МСХ РФ и в настоящее время рекомендованы для использования в практике.
Публикация научных исследований.
По теме научных исследований опубликовано 10 научных работ. и
Апробация работы.
Основные материалы диссертации были доложены и опубликованы в материалах IV и V Всероссийских научно-практических конференций «Генодиагностика инфекционных заболеваний», Москва 2002 и 2004 гг., Международной научной конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии животных» ВНИИЗЖ, г. Владимир (2003 г.), международной научной конференции молодых ученых «Проблемы мониторинга и генодиагностики инфекционных болезней животных» ВНИИЗЖ, г. Владимир ( 2004 г.).
Структура и объем работы.
Диссертация изложена на 156 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы и приложение. Список литературы включает 203 источника. Работа иллюстрирована 12 рисунками и 15 таблицами.
Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Батченко, Галина Владимировна
6. ВЫВОДЫ
1. Разработаны комплексные методы выявления, идентификации и дифференциации вирусов инфекционного бронхита кур и инфекционного ларинготрахеита птиц в полевых изолятах, включающие в себя первичное выявление геномов вирусов в пробах патологического материала в ПЦР, дальнейшее выделение вирусов в чувствительной системе и их последующую идентификацию в серологических реакциях и методом прямого секвенирования, позволяющие проводить надежную и быструю диагностику инфекционного бронхита кур и инфекционного ларинготрахеита птиц.
2. Выделены два полевых изолята вируса ИБК, изучены их биологические свойства. Штаммы депонированы во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, применяемых в ветеринарии и животноводстве (ВГНКИ) и рекомендованы для использования в качестве производственных штаммов при изготовлении полиштаммной инактивированной вакцины против инфекционного бронхита кур.
3. Установлено, что выделенный изолят вируса ИБК «Калужский», является вариантным и имеет отличия более чем на 25% по первичной структуре фрагмента гена S1 от референтных штаммов, а изолят вируса ИБК «Таганрогский» имеет 98% гомологию с европейскими изолятами и относится к серотипу 793/В.
4. При определении степени антигенного родства выделенных изолятов в реакции перекрестной нейтрализации с известными референтными штаммами установлено, что изолят «Калужский» не обнаруживет близкого антигенного родства ни с одним из использованных референтных штаммов. Изолят «Таганрогский» имел наиболее близкое (54%) антигенное родство к штамму 4/91 (серотип 793/В).
5. Разработан метод индикации генома вируса инфекционного ларинготрахеита птиц на основе ПЦР с праймерами, ограничивающими фрагменты генов ICP4 и ТК, позволяющий выявлять вирусный геном в течение 6-8 часов в различных вируссодержащих образцах.
6. Определена первичная нуклеотидная последовательность 18 полевых изолятов и 9 вакцинных штаммов вируса ИЛТ методом прямого секвенирования амплифицированных в ПЦР фрагментов кДНК генов ICP4 и ТК вируса ИЛТ.
7. Создан банк данных нуклеотидных и соответстующих аминокислотных последовательностей отечественных и зарубежных штаммов вируса ИЛТ. Среди исследованных вакцинных штаммов и изолятов вируса ИЛТ выявлены 2 генетические группы, отличающиеся по структуре вариабельного фрагмента гена ICP4.
8. В результате применения разработанной методики концентрирования вируссодержащего сырья для идентификации вируса ИЛТ в РДП, чувствительность реакции увеличилась в среднем в 4 раза.
7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
1. Для практического использования предлагаются следующие методические указания и методики, которые разработаны при выполнении научных исследований по теме, одобренные Ученым советом и утвержденные директором ВНИИЗЖ:
- «Методические указания по выделению, титрованию и идентификации вируса инфекционного ларинготрахеита» (утверждены директором ВНИИЗЖ в 2001 г.).
- «Методические указания по выделению и идентификации полевых изолятов вируса инфекционного бронхита кур» (утверждены директором ВНИИЗЖ в 2001 г.)
- «Методика выявления генома вируса инфекционного ларинготрахеита птиц методом полимеразной цепной реакции» (утверждена директором ВНИИЗЖ в 2004 г.)
2. Депонированы во Всероссийской коллекции штаммов микроорганизмов при ВГНКИ следующие штаммы: «Таганрогский №-120 ДЕП» и «Калужский №-121 ДЕП, которые разрешены к применению в ветеринарии и животноводстве и рекомендованы для использования при изготовлении инактивированной вакцины для профилактики инфекционного бронхита кур
3. Создан банк нуклеотидных и соответствующих аминокислотных последовательностей фрагмента гена ICP4 отечественных и зарубежных штаммов вируса ИЛТ, который может быть использован для идентификации штаммов вируса ИЛТ.
5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В результате проведенных исследований нами была разработана комплексная методика выделения вирусов ИБК и ИЛТ из патматериала, которая включала в себя первичное выявление генома вирусов в пробах патологического материала в ПЦР со специфическими праймерами, дальнейшее выделение их в чувствительных системах (КЭ или культурах клеток) и последующую идентификацию выделенных вирусов в серологических реакциях, а также молекулярно-биологическими методами. Поскольку при выделении вируса из проб патологического материала при проведении первых пассажей не всегда проявляются видимые изменения, характерные для вирусного действия, приходится проводить слепые пассажи. Первичная индикация генома в патматериале методами ПЦР позволяет избежать ложноотрицательных результатов. Дальнейшее секвенирование выделенных вирусных образцов позволяет обратить особое внимание на некоторых представителей, как представляющих интерес для их более детального изучения.
С применением разработанных методов в период с 1999 по 2004 гг. нами было проанализировано 250 проб патматериала, поступившего на исследование с подозрением на ИБК из 149 птицехозяйств, и 85 проб из 80-хозяйств с подозрением на ИЛТ. В результате в 111 пробах из 111 хозяйств был выявлен вирус ИБК, в 20 из 20- вирус ИЛТ.
При анализе генетической вариабельности гена S1 вируса ИБК выявленных изолятов для дальнейших исследований нами были отобраны 2 изолята вируса ИБК, названные впоследствие «Калужский» и «Таганрогский». Изолят «Калужский» по результатам секвенирования был отнесен к вариантным изолятам и имел отличие от имеющихся в Genbank последовательностей более чем на 25%. Изолят «Таганрогский» имел высокую гомологию со штаммом 4/91 серотипа 793/В, относящегося к группе европейских штаммов.
Исследования спектра циркулирующих на территории России вирусов ИБК, проведенные в последние годы, показали, что имеется тенденция к увеличению числа изолятов, относящихся к европейским штаммам (4/91, D274). Основываясь на значениях уровня гомологии первичных структур гена S1, нельзя точно предсказать антигенных взаимоотношений вирусов, однако можно предположить, что чем выше гомология первичных последовательностей, тем больше вероятность сходства их антигенных свойств. Нами были изучены биологические свойства выделенных изолятов и полученные результаты подтвердили это предположение. Изолят «Калужский», имеющий отличия более 25% по первичной структуре фрагмента гена S1, по результатам проведения перекрестной реакции нейтрализации показал высокое серологическое отличие от референтных штаммов, относящимся к различным серотипам и имеющихся в нашем распоряжении. Изолят «Таганрогский» имел 95% гомологию первичной структуры фрагмента гена S1 с вакцинным штаммом 4/91(серотип 793/В). Серологические исследования также показали, что данный изолят относится к серотипу 793/В.
Оба изолята депонированы во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве как «Таганрогский №-120 ДЕП» и «Калужский №-121 ДЕП» и предложены для использования в качестве производственных штаммов при изготовлении инактивированной вакцины против инфекционного бронхита кур.
Разработанная нами методика ПЦР для первичного выявления вируса ИЛТ в пробах патматериала позволила уменьшить сроки постановки диагноза. Кроме того, отпадала необходимость проведения дорогостоящего вирусовыделения на КЭ в тех случаях, когда геном вируса ИЛТ первоначально не выявлялся в пробах патологического материала, поступающего на исследование. Методика обладает высокой специфичностью и чувствительностью, позволяя выявлять вирус даже в следовых количествах. При сравнении его с классическими методами (вирусовыделение и РДП) и ИФА была установлена его большая чувствительность.
Секвенирование амплифицированных фрагментов генов ICP4 и ТК и последующая компьютерная обработка данных позволили создать банк нуклеотидных последовательностей изолятов, выделенных на территории России, а также вакцинных отечественных и зарубежных штаммов вируса ИЛТ. По данным секвенирования фрагментов генов ICP4 и ТК все штаммы четко разделялись на две группы с отличием до 4,5 % по гену ICP4. По биологическим свойствам, а также в реакции нейтрализации не удалось провести корреляции с делением на антигенные группы.
Были изучены биологические свойства изолятов, выделенных на территории РФ за последние годы, и некоторых вакцинных штаммов вируса ИЛТ, применяемых для профилактики ИЛТ на территории РФ и за рубежом. Изучали способность к репродукции в КЭ, характер поражения ХАО, возможность выявления вируса ИЛТ из различных вируссодержащих материалов в реакциях ИФА и РДП.
Для идентификации выделенных штаммов вируса ИЛТ нами предложено включить в схему лабораторной диагностики РДП и блокирующий вариант ИФА. Совершенствование метода постановки классической РДП сводилось к разработке метода концентрирования исследуемой пробы, что позволило увеличить чувствительность реакции. Применение метода блокирующего варианта ИФА позволило оценивать активность и специфичность выделенного антигена.
Таким образом, с применением разработанных нами методов были выделены, изучены и охарактеризованы изоляты вирусов ИБК и ИЛТ, циркулирующие на территории России а также отечественные и зарубежные вакцинные штаммы вируса ИЛТ.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Батченко, Галина Владимировна, Владимир
1. Бабкин В.Ф. Инфекционный ларинготрахеит // Респираторные болезни с.-х. животных. М: Колос, 1986. С. 143 - 150.
2. Бирман Б.Я., Дягилев К.К., Громов И.Н. Инфекционный ларинготрахеит птиц // Минск. 2002. - 71 с.
3. Бочков Ю.А. Метод штаммовой дифференциации вируса инфекционного бронхита кур и анализ изолятов вируса, выделенных на территории России: Авт. дис.канд. биол.наук, Владимир. 1999. -26 с.
4. Бочков Ю.А., Батченко Г.В., Луговская Н.Н. и др. Изучение инфекционного бронхита кур в России: исторический аспект // Акт пробл. инфекц. патол. ж-ных.: Матер. Междунар. научн.конф. посвящ. 45-летию ВНИИЗЖ, 30-31 окт., 2003. Владимир, 2003. - С.
5. Бочков Ю.А., Борисов А.В., Фролов С.В. и др. Диагностика инфекционного бронхита кур // Ветеринария. 2003. - №4. - С.21 - 24.
6. Бочков Ю.А., Борисов А.В., Щербакова Л.О., Дрыгин В.В. Филогенетический анализ изолятов вируса инфекционного бронхита кур, выявленных в России //Аграрная Россия. 2002. - №2. - С. 11-16.
7. Бочков Ю.А., Щербакова Л.О., Батченко Г.В. и др. Молекулярная диагностика респираторных заболеваний кур инфекционного бронхита и пневмовирусной инфекции в России // Генодиагностика инфекционных заболеваний: Матер, конф. - М., 2002. - С. 324 - 327.
8. Вирусные болезни животных // Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьев Б.В., Фомина Н.В. М.-.ВНИТИБП, 1998. - С. 672 - 683.
9. Грибанов О.Г., Бочков Ю.А. Использование стекловолокнистых фильтров GF/F (GF/C) для выделения РНК вируса инфекционного бронхита кур II Пробл. инфекц. патологии е.- х. ж-ных: Тез. Докл. конф. Владимир, 1997. - С. 163.
10. Гуненкова Н.К., Чистова З.Я., Сюрин В.Н. Об антигенных вариантах вируса инфекционного бронхита птиц // Вирусн. болезни с,-х. ж-ных: Матер. 1-й Межвузов, вет. вирусол. конф. М., 1970. - 4.2. -С. 121 -122.
11. Данченко Л.К. Изучение некоторых биологических свойств штаммов вируса инфекционного ларинготрахеита кур: Авт.дис.канд.вет.наук, Персиановка. 1968. - 19 с.
12. Диагностика, профилактика и меры борьбы с вирусными, респираторными и малоизученными болезнями птиц в промышленном птицеводстве: Рекомендации// Герман В.В., Бабкин В.Ф., Соколенко Н.Т., Волосянко Е.В. Харьков, 1988. -18 с.
13. Дьяконова Е.В., Шубин В.А. Смешанное течение вирусного бронхита и респираторного микоплазмоза у цыплят II Акт. Вопр. Вет.вирусол.: Матер. Ill Всесоюзн. Вет. Вирусол. конф. М., 1967. - Ч. 2. - С. 201 - 202.
14. Зинковский Ю.В., Колосов С.Н., Дрыгин В.В. Программа построения профиля вариабельности гомологичных последовательностей биополимеров «SQ-МАХ» // Всерос. н-пр.конф.:пробл.инфекц.патологии с.-х. ж-ных. Владимир, 1997. - С. 42-44.
15. Котляр П.Ю. Иммуноферментный метод диагностики инфекционного ларинготрахеита птиц: Авт. Дис.канд.вет.наук, Санкт-Петербург. -1995. -18 с.
16. Куриленко А.Н., Крупальник В.Л., Якимчик Б.А. Инфекционный бронхит кур (обзор литературы) // Ветеринария. 1990. - №8. - С.36.
17. Куриленко А.Н., Чистова З.Я., Ромахова М.А. и др. Рекомендации по диагностике и профилактике инфекционного бронхита кур // М.,-1981.-35 с.
18. Луговская Н.Н., Мудрак Н.С., Дрыгин В.В., Борисов А.В. Иммуноферментная тест-система для определения антител к вирусу инфекционного бронхита кур // Роль вет. науки в разв. живот-ва: Матер, меиодун. научно-практ. конф. Алматы, 2000. - С.141-142.
19. Луговская Н.Н., Мудрак Н.С., Дрыгин В.В., Борисов А.В. Оптимизация условий проведения непрямой реакции ИФА для определения антител к вирусу инфекционного бронхита кур // Пробл. инфекц. патологии с.-х. ж-ных: Тез. докл. конф. Владимир, 1997. - С. 34-35.
20. Мазурина М.Г. Биологические свойства изолятов вируса ИБК // Совр. средства и мет. борьбы с заразными болезнями с.-х. птиц: Сб. науч. тр. Л., 1988. - 4.1. - С.7-14.
21. Мазурина М.Г., Терюханов А.Б. Патогенность отечественных штаммов вируса инфекционного бронхита кур для эмбрионов и цыплят // Акт. вопр. вет. вирусол. : Тез. Докл. IV Всесоюз. вет. вирусол. конф. Владимир, 1976. - 4.2. - С. 104 - 105.
22. Методические указания по патоморфологической диагностике инфекционных болезней птиц и эмбрионов / МСХ и ПРБ. ААН РБ. ВГАВМ. БелНИИЭВ.; Сост. Прудников B.C., Жаков М.С., Громов И.Н. и др. Минск, 2000. - 32 с.
23. Мисиров З.Г. Одновременное течение инфекционного бронхита кур и пуллороза // Акт. вопр. вет. вирусол.: Тез. Докл. IV Всесоюз. вет. вирусол. конф. Владимир, 1976. - 4.2. - С. 200 - 201.
24. Прокофьева М.Т., Бабкин В.Ф. Биологические свойства вируса инфекционного ларинготрахеита кур II Ветеринария. 1967.-№5.- С. 43-45.
25. Сушкова Н.К. Инфекционный ларинготрахеит. Лекция // Мос.гос.акад.вет. мед. и биотехнол. Им. Скрябина. Москва, 2001. -26 с.
26. Терюханов А.Б., Мазурина М.Г. Биологические свойства вируса инфекционного бронхита кур (штамм AM), использованного для приготовления вакцины II Акт. вопр. вет. вирусол.: Тез. докл. IV Всесоюз. вет. вирусол. конф. Владимир, 1976. - Ч. 2. - С. 72-73.
27. Токарских В.В., Мазурина М.Г., Терюханов А.Б. Характеристика изолятов вируса ИБК, выделенных от птиц яичного и мясного направления // Комплекс противоэпизоот. и спец. мероприятий по борьбе с болезнями птиц: Сб. науч. тр. Л., 1990. - С. 73 - 79.
28. Троценко Н.И., Белоусова Р.В., Преображенская Э.А. Практикум по ветеринарной вирусологии // «Колос», Москва. 1999. - С.114.
29. Цыбанова Т.С., Власов Н.А., Цыдыпов В.Ц. Применение непрямого варианта твердофазного ИФА для выявления антител к вирусу ИЛТ II Вирус, болезни е.- х. животных: Тез. докл.Всерос. науч. практ. конф., Владимир, 17 -21 апр. 1995. - Владимир. - 1995. -С.265.
30. Чистова З.Я., Гуненкова Н.К., Сюрин В.Н. Серологические исследования при диагностике инфекционного бронхита птиц // Вирусн. болезни с.-х ж-ных: Матер. 1-й Межвуз. вет. вирусол. конф4. 2.-М., 1970.-С. 119-121.
31. Чистова З.Я., Сюрин В.Н. Сравнительное изучение терморезистентности и динамики накопления трех штаммов вируса инфекционного бронхита кур в куриных эмбрионах II Тезисы докл. Всесоюз. межвуз. науч. конф. по вет. вирусол. М., 1973. - 4.1. С. 45.
32. Abbas F.; Andreasen J.R. Comparison of diagnostic tests for infectious laryngotracheitis II Avian Dis. -1996. V.40., N. 2. - P. 290-295.
33. Abbas F.; Andreasen J.R.jr; Jackwood M.W. Development of a polymerase chain reaction and a nonradioactive DNA probe for infectious laryngotracheitis virus II Avian Dis. -1996. V.40., N. 1. - P. 56-62.
34. Akira Tanemno, Takashi Honda, Eishi Sakai et al. Immunological properties of the cell-associated live infectious laryngotracheitis virus // J. Vet.Sci.-1990 V. 52, N.4. - P. 827 - 829.
35. Alexander H.S., Nagy E. Polymerase chain reaction to detect infectious laryngotracheitis virus in conjunctival swabs from experimentally infected chickens //Avian Dis. -1997. V. 41. - P.646 -653.
36. Andersen J.R., Glisson J.R., Goodwin M.A., et al. Studies of infectious laryngotracheitis vaccines: immunity in broilers II Avian Dis. -1989.-V.33.-P. 516-523.
37. Bagust T. J., Johnson M. A. Avian infectious laryngotracheitis: virus-host interactions in relation to prospects for eradication //Avian Pathol. -1995.-V.24.-P. 373-391.
38. Beach J.R., Schalm O.W. A filterable virus, distinct from that of laryngotracheitis, the cause of a respiratory disease of chicks II Poult. Sci. 1936. - V. 15.-P. 199-206.
39. Beaudette F.R. Infectious laryngotracheitis II Poult.Sci. 1937. -V.16.-P.103 -105.
40. Beaudette F.R., Hudson C.B. Cultivation of the virus of infectious bronchitis IIJ .Am .Vet. Med .Assoc. -1937. V.90. - P. 51 - 60.
41. Boursnell M.E., Binns M.M., Brown T.D. Sequencing of coronavirus IBV genomic RNA: three open reading frames in the 5' unique region of mRNA D II J. Gen. Virol. 1985. - V. 66. - P. 2253 - 2258.
42. Boursnell M.E., Binns M.M., Foulds I.J., et al. Sequences of the nucleocapsid genes from two strains of avian infectious bronchitis virus II J. Gen. Virol. 1985. - V. 66. - P. 573 - 580.
43. Boursnell M.E., Brown T.D., Binns M.M. Sequence of coronavirus IBV genomic RNA: a 195-base open reading frame encoded by mRNA В II Gene. 1984. - V. 29. - P. 87 - 92.
44. Boursnell M.E., Brown T.D., Binns M.M. Sequence of the membrane protein gene from avian coronavirus IBVII Virus Res. 1984. - V. 1. - P. 303-313.
45. Boursnell M.E., Brown T.D., Foulds I.J. et al. Completion of the sequence of the genome of the coronavirus avian infectious bronchitis virus // J. Gen. 1987. -V. 68. - P. 57 - 77.
46. Bushnell I.D., Brandly C.A. Laryngotracheaitis in chicks // Poultry Sci. 1933. - V. 12. - P. 55 - 60.
47. Brierley I., Digard P., Inglis S.C. Characterization of an efficient coronavirus ribosomal framesshifting signal: requirement for an RNA pseudoknot II Cell. 1989. - V. 57. - P.537 - 547.
48. Brown T.D., Boursnell M.E. Avian infectious bronchitis virus genomic RNA contains sequence homologies at the intergenic boundaries // Virus Res. 1988. - V.1. - P. 18 - 24.
49. Callison S.A., Jackwood M.W., Hilt D.A. Molecular characterization of infectious bronchitis virus isolates forein to the United States and comparison with United States isolates II Avian Dis. 2001. - V. 45, N. 2. - P. 492 - 499.
50. Capua I., Gough R.E., Manchini M. et al. A "novel" infectious bronchitis strain infecting broiler chickens in Italy // Zentralbl. Veterinarmed. -1994. V. 41. - P. 83 - 89.
51. Cavanagh D. Coronavirus IBV glykopolypeptides: size and their polypeptide motieties and nature of oligosaccharides // J. Gen. Virol. -1983.-V. 64.-P. 1187-1191.
52. Cavanagh D. Coronavirus IBV: futher evidence that the surfase projection are associated with two glycopolypeptides // J. Gen Virol. -1983. V. 64. - P.1787 - 1787 - 1791.
53. Cavanagh D. Coronavirus IBV: Structural characterization of the spike glycoproteins II J. Gen virol. -1983. -V. 64. P.2577 - 2583.
54. Cavanagh D. Structural characterization of infectious bronchitis virus glycoproteins II Adv. Exp. Med. Biol. -1984 V. 173. - P. 95 - 108.
55. Cavanagh D. Structural polypeptides of coronavirus infectious bronchitis virus II J. gen. Virol. -1981. V. 53. - P. 93 -103.
56. Cavanagh D., Derbyshire J.H., Davis P. et al. Induction of humoral neutralizing and haemagglutination inhibiting antibodies by the spikeprotein of avian infectious bronchitis virus II Avian Pathol. 1984. - V. 13.-P. 573-583.
57. Cavanagh D., Davis P.J. Sequence analisis of strain of avian infectious bronchitis coronavirus isolated during the 1960s in the U.K. II Arch. Virol. 1992. - V. 130. - P. 471 - 476.
58. Chang P.-C.; Shieh H.K.; Shien J.-H.; Kang S.-W. A homopolymer stretch composed of variable numbers of cytidine residues in the terminal repeats of infectious laryngotracheitis virus //AvianDis.-2000.-V.44.,N.1.-P.125-131.
59. Clavijo A., Nagy E. Differentiation of infectious laryngotracheitis virus strain by polymerase chain reaction II Avian Dis. 1996. - V. 41. - P. 241 -246.
60. Collins M.S., Alexander D.J. Avian infectious bronchitis virusstructural polypeptides: effect of different conditions of disruption and comparison of different strains and isolates II Arch. Virol. 1980. - V. 63. -P. 239-251.
61. Cook J.K. The classification of new serotypes of infectious bronchitis virus isolated from poultry flocks in Britain between 1981 and 1983II Avian Pathol. 1984. - V. 13. - P. 733 - 741.
62. Cook J.K Poultry vaccine containing infections bronchitis virusserotype// European patent application EP 0 639 640 A 1. 27.07.1994.
63. Cook J.К, Huggins M.B. Newly isolated serotypes of infectious bronchitis virus: Their role in disease // Avian Pathol. 1986. - V. 15. - P. 129-138.
64. Cook J.K., Smith H.W., Huggins M.B. Infectious bronchitis immunity: Its study in chickens, experimentally infected with mixtures of infectious bronchitis virus and E. coli // J. Gen. Virol. 1986. - V. 67. - P. 1427 -1434.
65. Cook R.W., Glass Sam.E. Laryngotracheitis eradication program II Poultry adviser. 1998. -V. XXI, N. VIII. - P. 49 - 52.
66. Cover M.S. The early history of infectious laryngotracheitis II Avian Dis. 1996. - V. 40. - P. 494 - 500.
67. Cowen B.S., Hitchner S.B. Serotyping of avian infectious bronchitis viruses by the virus-neutralization test II Avian DIs. 1975. - V. 19. - P. 583 - 595.
68. Derbyshire J.H., Assessment of cross-immunity in chicken to strains of infectious bronchitis virus using tracheal organ cultures II Avian Pathol. 1979. - V. 9.-P. 179-183.
69. Darbyshire J.H.,Rowell J.G., Cook J.K. et al. Taxonomic studies on strains of avian infectious bronchitis virus using neutralization test in tracheal organ cultures // Arch. Virol. 1979. - V. 61. - P. 227 - 238.
70. Dawson P.S., Gough R.E. Antigenic variation in strains of avian infectious bronchitis virus II Arch. Fur die Gesampte Virusforsch-1971 -V. 34. P. 32 - 39.
71. Fuchs В.; Boddecker G.; Bulow V.v. Vergleichende serologische Untersuchungen uber Methoden zum Nachweis von Antikorpern bei der infektiosen Laryngotracheitis (ILT) der Huhner // Berl. u. munch, tierarztl. Wschr. 1985.- T. 98., N.8. - P. 261-266.
72. Fuchs W, Mettenleiter T.C.J. DNA sequence of the UL6 to UL20 genes of infectious laryngotracheitis virus and characterization of the UL10 gene product as a nonglycosylated and nonessential virion protein //Gen. Virol. 1999.-V.80, N.8.- P. 2173-2182.
73. Fuchs W., Ziemann K., Teifke J.P. et al. The non-essential UL50 gene avian infectious laryngotracheitis virus encoded a functional dUTPase which is not a virulence factor // J. of Gen. Virol. 2000. - V. 81.- P. 627 638.
74. Garcia M, Riblet S.M. Characterization of infectious laryngotracheitis virus isolates: demonstration of viral subpopulations within vaccine preparations// Avian Dis. 2001. - V.45, N.3. - P.558-566.
75. Gelb J., Keller C.L., Nix W.A. et al. Antigenic and S1 genomic characterization of the Delaware variant serotype of infectious bronchitis virus II Avian Dis. 1997. - V. 41. - p. 661 - 669.
76. Gelb J., Ladman B.S., Tamayo M. et al. Novel infectious bronchitis virus S1 genotypes in Mexico 1998 1999 // Avian. Dis. - 2001. - V. 45, N.4.-P. 1060-1063.
77. Gelb J., Wolff J.B., Moran C.A. Variant serotypes of infectious bronchitis virus isolated from commercial layer and broiler chickens II Avian Dis. 1991. - V. 35. - P. 82 - 87.
78. Goodwin M.A., Smeltzer M.A., Brown J. et al. Comparison of histopathology to the direct immunofluorescent antibody test for the diagnosis of infectious laryngotracheitis In chickens II Avian Dis. 1991. -V.35. - P. 389 - 391.
79. Gough R.E., Randall C.J., Dagless M. et al. A "new" strain of infectious bronchitis virus infecting domestic fowl in Great Britain II Vet. Rec. 1992. - V. 130. - P. 493 - 494.
80. Granzow H., Klupp B.G., Fuchs W. et al. Egress of alphaherpesviruses: comparative ultrastructural study II J. of Virol. 2001.- Apr. P. 3675 - 3684.
81. Guy J.S., Barnes H.J., Morgan L.M. Virulence of infectious laryngotracheitis viruses: comparison of modified-live vaccine viruses and North Carolina field isolates II Avian Dis. -1990. V. 34. - P. 106 -113.
82. Han M.G., Kim S.J. Analysis of Korean strains of infectious laryngotracheitis virus by nucleotide sequences and restriction fragment length polymorphism II Vet. Microbiol. 2001. - V. 83. - P. 321 - 331.
83. Han M.G, Kim S.J. Efficacy of live virus vaccines against infectious laryngotracheitis assessed by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism // Avian Dis.- 2003. -V. 47, N. 2. P. 26171.
84. Han M.G., Kweon C.H., Mo I.P., Kim S.J. Pathogenicity and vaccine efficacy of a thymidine kinase gene deleted infectious laryngotracheitis virus expressing the green fluorescent protein gen elf Arch. Virol. 2002-V.147, N.5. - P.1017-1031.
85. Hilbink F.W., van Roozelaar D.J. A microtitration and neutralization test for infectious laringitracheitis virus. Their reproducibility and the effect of various test conditions // Tijdschr Diergeneeskd. 1988. - V. 113, N. 2. -P. 61 -61.
86. Hofstad M.S., Antigenic differences among isolates of avian infectious bronchitis virus // Am. J. Vet. Res. 1958. - V. 19. - P. 740 -743.
87. Hughes C. S., Jones R.C. Comparison of cultural methods for primary isolation of infectious laryngotracheitis virus from field materials // Avian Pathol. 1988. - V. 17. - P. 295 - 303.
88. Humberd J., Garcia M., Riblet S.M., Detection of infectious laryngotracheitis virus in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues by nested polymerase chain reaction // Avian Dis. 2002. - V. 46. - P. 64 -74.
89. Ignatovic J.f Ashton D.F., Reece R. et al. Pathogenicity of Australian strains of avian infectious bronchitis virus // J. Сотр. Pathol. 2002. - V. 126, N. 2-3. -P. 115-123.
90. Ignjatovic J., Sapats S. Avian infectious bronchitis virus // Rev. Sci. Tech. 2000. - V.19, №2. - P.493-508.
91. Jackwood M.W., Yousef N.M., Hilt D.A. Furher development and use of a molecular serotype identification test for infectious bronchitis virus // Avian Dis. 1997. -V. 41. - P. 105- 110.
92. Jang H.K., Ono M., Kim T. J. et al. The genetic organization and transcriptional analysis of the short unique region in the genome of nononcogenic Marek's disease virus serotype 2 II Virus Res.-1998. V. 58, N. 1-2.-P. 137-147.
93. Johnson M.A., Tyack S.G. Molecular evolution of infectious laryngotracheitis virus (ILTV;gallid herpesvirus 1):An ancient example of the Alphaherpesviridae? II Vet. Microbiol. -1995. -V. 46. -P. 221 231.
94. Johnson M.A., Tyack S.G., Prideaux C. et al. Nucleotide sequence of infectious laryngotracheitis virus (gallid herpesvirus 1) ICP4 gene // Virus Research. -1995. V.35. - P. 193 - 204.
95. Johnson M.A., Prideaux C., Kongsuwan S.G. et al. ICP27 immediate early gene, glycoprotein К (gK) and DNA helicase homologues of infectious laryngotracheitis virus (gallid herpesvirus 1) SA-2 strain II Arch. Virol. 1995. - V.140. - P. 623 - 634.
96. Johnson R.B., Marquardt W.W. The neutralizing characteristics of strains of infectious bronchitis virus as measured by the constant virus variable serum method in chicken tracheal cultures // vian Dis. 1975. - V. 19.-P. 82-90.
97. Johnson R.B., Marquardt W.W., Newman J.A. A new serotype of infectious bronchitis virus responsible for respiratory disease in Arkansas broiler flocks // Avian Dis. 1973. - V. 17. - P. 518 - 523.
98. Jordan F.T.W. Diagnosis of infectious laryngotracheitis by chick embryo inoculation II J. Сотр. Path. 1964. - V. 74. - P. 119 - 128.
99. Jordan F.T.W., Chubb R.C. The agar gel diffusion technique in the diagnosis of infectious laryngo-tracheitis (I.L.T.) and its differentiation from fowl pox II Res. Vet. Sci. 1962. - V. 3. - P. 245 - 255.
100. Kaleta E.F., Redmann Т., Redmann U. H., Frese K. Zum nachiveis der latenz des attenuierten virus des infektiosen laryngotracheitis deshuknes im trigeminus-ganglion II Dtsch. Tierarztl. Wichr. 1986. - V. 93. -P. 40-42.
101. Keller C.L., Reed K.L., Nix W.A. et al. Serotype identification of avian infectious bronchitis virus by RT-PCR of the peplomer (S1) gene II Avian Dis. 1998. - V. 42. - P. 275 - 284.
102. Keller C.L., Klngsley O.H., Adams Burton C.R. Identification of the Thymidine Kinase Gene of infectious laryngotracheitis virus II Avian Dis. -1991.-V. 35.-P. 920-929.
103. King D.J., Hopkins S.R. Rapid serotyping of infectious bronchitis virus isolates with the hemagglutinatlon-inhibition test II Avian Dis. 1984. -V. 28.-P. 727-733.
104. Kingsley D.H., Hazel J.W., Keeler C.L. identification and characterization of the laryngotracheitis virus glycoprotein С gene // Virilogy. 1994. - V. 203. - P. 336 - 343.
105. Koch G., Hartog A., Kant A. et al. Antigenic domains of the peplomer protein of avian infectious bronchitis virus: correlation with biological functions II J. Gen. Virol. 1990. - V. 71. - P. 1929 - 1935.
106. Kongsuwan K., Johnson MA., Prideaux C.T., Sheppard M. Identification of an infectious laryngotracheitis virus gene encoding an immunogenic protein with a predicted Mr of 32 kilodaitons II Virus Res. -1993.-V.29.-P.125-140.
107. Kotiw M., Sheppard M., May J.T., Wilks C.R. Differentiation between virulent and avirulent strains of infectious laryngotracheitis virus by DNA:DNA hybridization using a cloned DNA marker II Vet. Microbiol. -1986.-V. 11.-P. 319-330.
108. Kotiw M., Wilks C.R., May J.T. The effect of serial in vivo passage on the expression of virulence and DNA stability of an infectiouslaryngotracheitis virus strain of low virulence // Vet. Microbiol. 1995. -V.45. - P.71 - 80.
109. Kusters J.G., Niesters H.G., Lenstra J.A. et al. Phylogeny of antigenic variants of avian coronavirus IBV // Virology/ 1989. - V. 169. -P. 217-221.
110. Lee CW, Brown C, Hilt DA, Jackwood MW. Nephropathogenesis of chickens experimentally infected with various strains of infectious bronchitis virus // J.Vet.Med.Sci.- 2004. -V. 66, N. 7. P. 835-840.
111. Lee C.W., Jackwood M.W. Origin and evolution of Georgia 98 (GA98), a new serotype of avian infectious bronchitis virus // Virus Res. -2001. V. 28, N. 80 (1-2). - P. 33 - 39.
112. Lee CW, Hilt DA, Jackwood MW. Typing of field isolates of infectious bronchitis virus based on the sequence of the hypervariable region in the S1 gene // J. Vet. Diagn. Invest.- 2003. V.15, N.4. - P.344-348.
113. Lee S.K., Sung H.W., Kwon H.M. S1 glycoprotein gene analysis of infectious bronchitis viruses isolated in Korea // Arch. Virol.- 2004. V.149, N.3. -P:481-494.
114. Leib D.A.; Bradbury J.M.; Gaskell R.M. Restriction endonuclease patterns of some European and American isolates of avian infectious laryngotracheitis virus // Avian Dis. -1986. T. 30., N.4.-P.835-837.
115. Leib D.A.; Bradbury J.M.; Hart C.A.; McCarthy K. Genome isomerism in two alphaherpesviruses: Herpesvirus saimiri-1 (Herpesvirus tamarinus) and avian infectious laryngotracheitis virus И Arch. Virol. -1987. T. 93., N. 3-4. - P. 287-294.
116. Linares J.A., Bickford A.A., Cooper G.L. et al. An outbreak of infectious laryngotracheitis in California Broilers // Avian Dis.-1994- V. 38. -P. 188-192.
117. Liu S., Kong X. A new genotype of nephropathogenic infectious bronchitis virus circulating in vaccinated and non-vaccinated flocks in China // Avian Path. 2004. - V.33, N.3. - P. 321 - 327.
118. MacNaughton M.R., Davies H.A., Nermut M.V. Ribonucleoprotein-like structures from coronavirus particles II J. Gen. Virol.-1978.-V. 39. P. 545 - 549.
119. MacNaughton M.R., Madge M.N. The polypeptide composition of avian infectious bronchitis virus particles // Arch. Virol. 1977. - V. 55. -P. 47 - 54.
120. Mase M, Tsukamoto K, Imai K, Yamaguchi S. Phylogenetic analysis of avian infectious bronchitis virus strains isolated in Japan// Arch. Virol.-2004. July15 Epub ahead of print/.
121. Meulemans G., Halen P. A comparison of three methods of diagnosis of infectious laryngotracheitis // Avian Path. 1978. - V.7. - P. 433-436.
122. Modrow S., Falke D. Moleqular virology // Heidelberg Berlin -Oxford. - 1997.-533 P.
123. Mondal S.P., Lucio-Martinez В., Nagi S.A. Isolation and characterization of a novel antigenic subtype of infectious bronchitis virus serotype DE 072 // Avian Dis. 2001. - V. 45, N. 4.- P. 1054 - 1059.
124. Moore K.M., Jackwood M.W., Hilt D.A. Identification of amino acids involved in a serotype and neutralization specific epitope within the S1subunit of avian infectious bronchitis virus // Arch. Virol. 1997. - V. 142. -P. 2249 - 2256.
125. Nagy E. Detection of infectious laryngotracheitis virus infected cells with cloned DNA probes II Can J. Vet. Res. -1992. V. 56. - P. 34 - 40.
126. Nagy E., Lomniczi B. Polypeptide patterns of infectious bronchitis serotypes fall in two categiries II Arch. Virol. 1979. - V. 61. - P. 341 -345.
127. Nakamura K., Imai KM Tanimura N. Comparison of the effects of infectious bronchitis and infectious laryngotracheitis on the chicken respiratory tract // J. Сотр. Pathol. -1996.-V. 114, N.1.-P.11 -21.
128. Nielsen O. L., Handberg K. J., Jorgensen P.H. In situ hybridization for the detection of infectious laryngotracheitis virus in sections of trachea from experimentally infected chickens II Acta Vet. Scand. 1998. - V. 39, N.4.-P. 415- 421.
129. Parsons D., Ellis M.M., Cavanagh D., Cook J.K. Characterization of an infectious bronchitis virus isolated from vaccinated broiler breeder flocks // Vet.Rec. 1992. - V. 131. - P. 408 - 411.
130. Picault J.P., Bennejean G., Drouin P. A new pathogenic avian infectious bronchitis virus isolated in France // In: Curent topics in vet. Med. And animal science. -1986. P. 122 - 127.
131. Poulsen D.J., Adams Burton C.R., Brian J.J. et al. Identification of the infectious laryngotracheitis virus glycoprotein gB gene by the polymerase chain reaction II Virus genes. 1991. - V. 5., N.4. - P. 335 -347.
132. Poulsent D. J., Keeler C. L. Characterization of the assembly and processing of infectious laryngotracheitis virus glycoprotein В // J.of Gen. Virol. 1997. - V.78. - P. 2945 - 2951.
133. Raggi L.G., Gomes L. Two new isolants of infectious bronchitis virus with polyvalent immunogenicity II Avian Dis. 1975. - V. 19. - P. 323 -328.
134. Sander J.E., Thayer S.G. Evaluation of ELISA titers to infectious laryngotracheitis // Avian Dis. 1997. - V. 41, N. 2. - P.429 - 432.
135. Sapats S.I., Ashton F., Wright P.J. et al. Sequence analysis of the S1 glycoprotein of infectious bronchitis viruses: identification of a novel genotypic group in Australia // J. Gen.Virol. -1996. V. 77. - P. 413 - 418.
136. Sayed A.M. Infectious laryngotracheitis disease in broiler in Assiut governorate II Assiut veter.med.J.-2000.-V.42.,N.84.-P.264-271.
137. Schikora BM, Shih LM, Hietala SK. Genetic diversity of avian infectious bronchitis virus California variants isolated between 1988 and 2001 based on the S1 subunit of the spike glycoprotein II Arch. Virol.2003.-V.148, N.1- P. 115-136.
138. Schnitzlein W.M., Radzevicius G., Iripathy D.N. Proprgation of infectious laryngotracheitis virus in an avian liver cell line. // Avian Dis. -1994. V. 38. - P. 211-217.
139. Schnitzlein W.M., Wimans R.f Ellsworth S., Tripathy D.N. Generation of thymidine-kinase-deficient mutants of infectious laryngotracheitis virus // Virology. 1995. - V.209, N.2. - P. 304 - 314.
140. Sellers HS, Garcia M, Glisson JR, Brown TP, Sander JS, Guy JS. Mild infectious laryngotracheitis in broilers in the southeast // Avian Dis.2004. -V. 48, N.2. P.:430-436.
141. Siddell S.G., Wege H., ter Meulen V. The biology of coronavirus // J. Gen. virol. 1983. - V. 64. - P. 761 - 776.
142. Smati R., Silim A., Guertin C. et al. Molecular characterization of three new avian infectious bronchitis virus (IBV) strains isolated in Quebec II Virus genes. 2002. - V.25, N. 1. - P. 85 - 93.
143. Smith H.W., Cook J.K., Parsell Z. E. The experimental infection of chickens with mixtures of infectious bronchitis virus and E. coli II J. Gen. Virol. 1985. -V. 66. - P. 777 - 786.
144. Shapouri M.R., Mayahi M, Assasi K, Charkhkar S. A survey of the prevalence of infectious bronchitis virus type 4/91 in Iran// Acta. Vet. Hung.- 2004. -V. 52, N. 2. P. 163-166.
145. Shieh H.K, Shien J.H, Chou H.Y.et al. Complete nucleotide sequences of S1 and N genes of infectious bronchitis virus isolated in Japan and Taiwan// J. Vet. Med. Sci.- 2004. V.66, N.5. - P. 555-558.
146. Spackman D., Cameron I.R. Isolation of infectious bronchitis from pheasants II Vet. Rec. 1983. - V. 113. - P. 354 - 355.
147. Stern D.E., Kennedy S.I. Coronavirus multiplication strategy. I. Identification and characterization of virus specified RNA // J. Virol. 1980. - V. 34. - P. 665 - 574.
148. Stern D.E., Kennedy S.I. Coronavirus multiplication strategy.ll. Mapping the avian infectious bronchitis virus intracellular RNA species to the genome II J. Virol. -1980. V. 36. - P. 440 - 449.
149. Stern D.E., Sefton B.M. Coronavirus multiplication: the location of the genes coding for the virion proteins on the avian infectious bronchitis virus genome II J. Virol. -1984. V. 44. - P. 804 - 812.
150. Stern D.E., Sefton B.M. Coronavirus proteins: Biogenesis of avian infectious bronchitis virus virion proteins // J. Virol.-1982.- V. 44. P. 794 -803.
151. Stern D.E., Sefton B.M. Coronavirus proteins: Structure and functions of the oligosaccharides of the avian infectious bronchitis virus glycoproteins // J. Virol. -1982. V. 44. - P. 804 - 812.
152. Sturman L.S., Holmes K.V. Characterization of a coronavirus. II. Glycoproteins of the viral envelope: Tryptic peptide analysis II Virology. -1977.-V. 77.-P. 650-660.
153. Sturman L.S., Holmes K.V. The molecular biology of coronaviruses // Adv. Virus Res. 1983.-V. 28. P. 35-112.
154. Suzutani Т. The relationship between gene function and virulence in alphaherpesviruses II Nippon Rinsho. 2000. - V. 58, N. 4. - P.801 - 806.
155. Tantawi H.H., El Batrawi A.M., Bastami M.A. et al. Avian infectious laryngo-tracheitis In Egipet. I. Epidemiology, virus isolation and identification II Vet. Res. Commun. 1983. - V.6, N.4. - P. 281 - 287.
156. Thompson R.L., Cook M.L., Devi-Rao G.B. et al. Functional and molecular analyses of the avirulent wild-type herpes simplex virus type 1 strain KOSII J. Virol. -1986. V.51. - P. 203 - 211.
157. Thomson B.J., Martin M.E.D., Nicholas J. The molecular and cellular biology of human herpesvirus-6 II Rev. Med.Virol. 1991. - V.1. - P. 89 -99.
158. Timurkaan N., Yilmaz F., Bulut H. et al. Pathological and immunohistochemical findings in broilers inoculated with a low virulent strain of infectious laryngotracheitis virus II J. Vet. Sci. 2003. - V.4., N.2. -P. 175-180.
159. Trist H.M., Tyack S.G., Johnson M.A. et al. Comparision of the genomic short regions of a vaccine strain (SA-2) and a virulent strain (CSW-1) of infectious laryngotracheitis virus (Gallic! herpesvirus 1) // Avian Dis.-1996.-V. 40, N. 1.-P. 130-139.
160. Vander Кор M. Infectious laryngotracheitis in commercial broiler chickens II Can. Vet. J. 1993. -V. 35. - P. 185.181. van Kammen A., Spradbrow. Rapid diagnosis of some Avian Virus Disease II Avian Dis. -1976. V. 20., N. 4. - P. 748 - 751.
161. Veits J, Kollner B, Teifke J.P. et al. Isolation and characterization of monoclonal antibodies against structural proteins of infectious laryngotracheitis virus II Avian Dis.- 2003. -V. 47, N. 2. P.330-342.
162. Veits J., Mettenleiter T.C., Fuchs W. Five unique open reading frames of infectious laryngotracheitis virus are expressed during infection but are dispensable for virus replication in cell culture // J. of Gen. Virol. -2003. V. 83. - P. 1415 - 1425.
163. VogtlinA., Bruckner L., Ottiger H. P. Use of polymerase chain reaction (PCR) for the detection of vaccine contamination by infectious laryngitracheitis virus // Vaccine. - 1999. - V. 17. - P. 2501 - 2506.
164. Wadey C.N., Faragher J.T. Australian infectious bronchitis viruses:1.entification of nine subtypes by a neutralization test // Res. Vet. Sci. -1981.-V. 30.-P. 70-74.
165. Wang С. H., Huang Y.C. Relationship between serotypes and genotypes based on the hypervariable region of the S1 gene of infectious bronchitis virus // Arch. Virol. 2000. - V. 145. - P. 291 - 300.
166. Wang H.N., Wu Q.Z., Huang Y. et al. Isolation and identification of infectious bronchitis virus from chicken in Sichuan, China // Avian Dis.щ 1997. V. 41. - P. 279 - 282.
167. Wieliczko A, Mazurkiewicz M, Piasecki T, Kuszczynski T. The clinical course of the Infectious Laryngotracheitis (ILT) field case in hens and estimation of immunoprophylaxis efficiency // Pol. J. Vet. Sci.- 2004. V.7, N.2. - P.143-147.
168. Wild M.A., Cook S., Cochran M. A genomic map of infectious laringotracheitis virus and the sequence and organization of genes present in the unique short and flanking regions II Virus Genes.-1996.-V.12.,N.2-P. 107-116.
169. Wilks С. R.t Kogan V.G. An immunofluorescence diagnostic test for avian infectious laryngotracheitis // Australian Vet. J. 1979. - V. 55. - P. 385 - 388.
170. Yilmaz F, Timurkaan N, Bulut H. Detection of infectious laryngotracheitis virus in trigeminal ganglia by avidin-biotin complex method in chickens: short communication // Acta Vet. Hung.- 2004. V.52, N.2. - P.167-71.
171. Yu L., Jiang Y., Low S. et al. Characterization of three infectious bronchitis virus isolates from China associated with proventriculus in vaccinated chickens II Avian. Dis. 2001. - V. 45, N. 2. - P. 416 - 424.
172. York J.J., Fahey K.J. Diagnosis of infectious laryngotracheitis using a monoclonal antibody ELISAII Avian Path. -1988. P. 173 - 182.
173. Zanaty K.E.; Ahmed Y.F. Natural outbreak of infectious laryngotracheitis in broiler chickens in Saudia Arabia // Assiut veter.med.J. 1995. - V.33., N. 66. - P. 191-198.
174. Zanella A, Lavazza A, Marchi R.et al. Avian infectious bronchitis: characterization of new isolates from Italy II Avian Dis. 2003. - V. 47, N.1. - P.180-185.
175. Zellen G.K., Weber L.J., Martin S.W. Infectious laryngotracheitis in the Niagara Peninsula II Can. Vet. J. -1984. -V. 25. P. 75 - 77.
176. Ziegler A.F., Ladman B.S., Dunn P.A.et al. Nephropathogenic infectious bronchitis in Pennsylvania chickens 1997-2000 II Avian Dis.-2002. V.46, N.4. -P. 847-858.
177. Ziemann К., Mettenleiter С. Т., Fuchs W. Gene arrangement within the unique long genome region of infectious laryngotracheitis virus is distinct from that of other alphaherpesviruses // J. of Virology. Jan. -1998.- P.847 - 852.
178. Zhou J.Y., Zhang D.Y., Ye J.X., Cheng L.Q. Characterization of an avian infectious bronchitis virus isolated in China from chickens with nephritis // J. Vet. Med. B. Infect. Dis. Vet. Public. Health.- 2004. V. 51, N. 4. - P.147-152.
-
Батченко, Галина Владимировна
-
кандидата биологических наук
-
Владимир, 2004
-
ВАК 03.00.06
- Биологические свойства вирулентных штаммов вируса болезни Марека
- Метод штаммовой дифференциации вируса инфекционного бронхита кур и анализ изолятов вируса, выделенных на территории России
- Использование эксплантатов трахеи куриных эмбрионов и цыплят для изучения возбудителей инфекционных респираторных болезней птиц
- Применение вакцины Пулвак IB Праймер для профилактики инфекционного бронхита кур в промышленном птицеводстве
- Первичная структура генов фибера и гексона аденовирусов птиц и разработка новых методов диагностики аденовирусной инфекции
