Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Метод штаммовой дифференциации вируса инфекционного бронхита кур и анализ изолятов вируса, выделенных на территории России

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бочков, Юрий Александрович, Владимир

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ

РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ

ЗАЩИТЫ ЖИВОТНЫХ

На правах рукописи

БОЧКОВ Юрий Александрович

МЕТОД ШТАММОВОЙ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО БРОНХИТА КУР И АНАЛИЗ ИЗОЛЯТОВ ВИРУСА, ВЫДЕЛЕННЫХ НА ТЕРРИТОРИИ РОССИИ

03.00.06 "Вирусология"

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель-кандидат биологических наук, старший научный сотрудник ДРЫГИН Владимир Викторович

Научный консультант-кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник БОРИСОВ Александр Владимирович Владимир -1999

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

а.о. - аминокислотный остаток

ВИБК - вирус инфекционного бронхита кур

ГМ - гепатит мышей

ГТЦ - гуанидинтиоцианат

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ДСН - додецилсульфат натрия

ИБК - инфекционный бронхит кур

ИФА - иммуноферментный анализ

кДНК - ДНК-копия с РНК-матрицы

КЭ - куриный эмбрион

МАТ - моноклональные антитела

мРНК - матричная РНК

н.о. - нуклеотидное основание

ОРС - открытая рамка считывания

ПААГ - полиакриламидный гель

п.н. - пар нуклеотидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РДП - реакция диффузионной преципитации

РИФ - реакция иммунофлюоресценции

РН - реакция нейтрализации

РНК - рибонуклеиновая кислота

РТГА - реакция торможения гемагглютинации

РЗГА - реакция задержки гемагглютинации

Трис - Трис (гидроксиметил) аминометан

ТГС - трансмиссивный гастроэнтерит свиней

ШЭР - шероховатый эндоплазматический ретикулум

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ЭИД50 - доза вируса, вызывающая гибель 50% инфицированных эмбрионов HVR - hyper-variable region - гипервариабельная область dNTP - дезоксирибонуклеотидтрифосфат

SPF - specific pathogen free -свободный от специфических патогенов

ОГЛАВЛЕНИЕ

1.ВВЕДЕНИЕ.................................................................................................5

2.0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ.............................................................................10

2.1. Патогенез и эпизоотология инфекционного бронхита кур....... 10

2.2. Классификация возбудителя......................................................... 14

2.3. Репликация вируса инфекционного бронхита кур..................... 18

2.4. Антигенная вариабельность вируса инфекционного

бронхита кур..................................................................................28

2.5. Изучение иммуногенных свойств пепломерного белка Б............32

2.6. Диагностика инфекционного бронхита кур.................................38

З.СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.......................................................46

3.1. Материалы.....................................................................................46

3.2. Методы...........................................................................................50

3.3. Результаты собственных исследований и их обсуждение.............54

3.3.1. Разработка стратегии штаммовой дифференциации вируса ИБК с использованием молекулярно-биологических методов..................54

3.3.2. Индикация генома вируса ИБК методом ОТ-ПЦР..................56

3.3.2.1. Очистка и концентрирование вируса ИБК............................56

3.3.2.2. Разработка метода выделения РНК вируса ИБК и суммарной РНК из различных вируссодержащих материалов...................60

3.3.2.3. Индикация генома вируса ИБК с помощью амплификации фрагмента кДНК консервативной нетранслируемой области (З'-иТЯ) методом ПЦР.........................................................................................................62

3.3.3. Исследование профиля вариабельности гена вируса ИБК

и теоретический расчет праймеров для штаммовой дифференциации......68

3.3.4. Амплификация кДНК вариабельной области гена методом ПЦР..................................................................................................................72

3.3.5. Секвенирование вариабельной области гена .......................73

3.3.6. Анализ генетической вариабельности вируса ИБК................. 75

3.3.7. Определение и сравнительный анализ первичной структуры вариабельной области гена изолятов вируса ИБК, выделенных на птицефабриках России в 1997-1998 гг.................................................................. 80

3.3.7.1. Сравнительный анализ первичной структуры вариабельной области гена и белка Б1 изолятов, близких к Массачусеттской генетической

группе............................................................................................................82

3.3.7.2. Сравнительный анализ первичной структуры вариабельной области гена и белка "вариантных" изолятов, имеющих низкий уровень генетической гомологии со всеми зарубежными штаммами

вируса ИБК...................................................................................................88

4.3АКЛЮЧЕНИЕ........................................................................................97

5.ВЫВОД Ы.................................................................................................. 104

6.СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ........................................................................ 106

7.ПРИЛОЖЕНИ Я........................................................................................ 128

1.ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Инфекционный бронхит кур (ИБК) - острое высококонтагиозное заболевание, поражающее кур различного возраста, возбудителем которого является вирус, принадлежащий к роду Coronavirus, семейства Coronaviridae. В зависимости от штамма, вызвавшего инфекцию, могут поражаться респираторные органы, почки, а также герминативные органы и кишечник кур. Инфекционный бронхит регистрируется в птицеводческих хозяйствах мясного и яичного направления.

По данным серологических исследований наличие ИБК в настоящее время подтверждают практически во всех обследованных птицехозяйствах России, а также в странах СНГ, что указывает на широкое распространение инфекции.

В птицеводческих хозяйствах, неблагополучных по ИБК, отход молодняка составляет, в среднем, 18-20%, но при первичной циркуляции в хозяйстве вируса с нефрогенной тропностью смертность птицы может увеличиваться до 57-70% [8]. Вынужденная выбраковка цыплят в хозяйствах, где отмечают ассоциированное течение ИБК с вторичными инфекциями может достигать 40-60% среди цыплят 1-5 месячного возраста.

Проявление ИБК часто маскируется другими болезнями вирусной и бактериальной природы, а также физиологическими нарушениями. Даже при типичном течении постановка диагноза на ИБК по клиническим и па-тологоанатомическим признакам является затруднительной. Кроме того, в крупных птицехозяйствах ИБК может иметь стационарный характер и протекать как хроническая инфекция без ярко выраженных симптомов поражения респираторных органов.

Система лабораторной диагностики ИБК включает в себя выделение вируса на куриных эмбрионах, постановку биопробы на восприимчивых цыплятах, идентификацию выделенного вируса в РН, РИФ и РТГА, выявление антител в сыворотках крови в РН, РТГА и ИФА, а также обнаружение гистологических изменений в органах и тканях.

Вирус ИБК отличается очень высокой генетической изменчивостью, которая обуславливает его антигенную вариабельность. По имеющимся к настоящему времени данным в мире известно более 30 серотипов вируса ИБК, причем перекрестная защита между штаммами разных серотипов практически отсутствует. Эффективность профилактических мероприятий при ИБК во многом обусловлена правильным выбором вакцинного штамма. В нашей стране в 1970-1980 гг. выделяли изоляты вируса ИБК, антиген-но родственные серотипам Массачусеттс и Коннектикут [6, 9], а в последнее время дигностика этого заболевания сводилась, в основном, к исследованию сывороток крови от больной птицы в ИФА и РЗГА. Таким образом, спектр штаммов, циркулирующих сейчас в России, оставался неизвестным. Постоянное появление новых антигенных вариантов вируса ИБК в разных странах мира, в том числе штаммов, способных вызывать заболевание у вакцинированной птицы, определяет актуальность работы и необходимость совершенствования имеющихся и разработки новых, более эффективных средств индикации и идентификации вируса и профилактики ИБК.

Основными критериями при совершенствовании и разработке методов диагностики ИБК является их высокая чувствительность, специфичность, быстрота проведения анализа, а также возможность не только выявлять, но и идентифицировать вирус.

В последнее время метод ПЦР, основанный на энзиматической амплификации части вирусного генома с использованием термостабильной ДНК-полимеразы и специфичных праймеров, стал успешно использоваться в диагностике многих инфекционных заболеваний. ПЦР обладает высокой специфичностью и чувствительностью, что позволяет выявлять даже фрагменты вирусного генома. Определение и сравнительный анализ первичной структуры кДНК фрагментов генома, характеризующихся высокой вариабельностью, позволяет наиболее точно установить штаммовую принадлежность вируса.

Метод ОТ-ПЦР для диагностики ИБК был впервые применен Lin и соавт. в 1991 году [114] и в настоящее время используется многими лабораториями в разных странах. Основными недостатками предложенных ранее методов при индикации вирусного генома являются необходимость культи-

вирования полевых изолятов вируса в куриных эмбрионах, а при штаммо-вой дифференциации - анализ консервативных областей генома, что снижает информативность метода. Имеющиеся к настоящему времени данные о первичной структуре различных областей генома вируса ИБК позволяют разработать оптимальную тест-систему не только для индикации, но и для штаммовой дифференциации вируса. Цель и задачи исследования

Основная цель данных исследований заключалась в разработке метода индикации и штаммовой дифференциации вируса ИБК и изучении моле-кулярно-биологическими методами генетических взаимоотношений штаммов вируса ИБК.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- разработать метод индикации генома вируса ИБК в различных вируссо-держащих материалах на основе ОТ-ПЦР;

- разработать метод идентификации вируса ИБК на основе нуклеотидного секвенирования вариабельной области гена Б1, позволяющий определять штаммовую принадлежность вируса;

- провести анализ нуклеотидной последовательности вариабельной области гена 81 полевых изолятов вируса ИБК, выделенных в России и вакцинных штаммов вируса ИБК;

- сравнить первичные структуры вариабельной области гена полевых изолятов и зарубежных штаммов вируса ИБК.

Научная новизна исследования

Впервые определена нуклеотидная последовательность вариабельной области гена 21 изолята вируса ИБК, выделенного на территории России в течение 1997-1998 гг., а также 10 отечественных и зарубежных вакцинных и патогенных штаммов.

Выявлены и дифференцированы генетические группы штаммов вируса ИБК.

Создан банк данных нуклеотидных и соответствующих аминокислотных последовательностей вариабельной области гена Б1 вируса ИБК.

Практическая значимость исследования

Разработаны метод очистки и концентрирования вируса ИБК и метод выделения вирусной РНК, позволяющие получать из аллантоисной жидкости РКЭ, инфицированных вирусом ИБК штаммом НПО препараты с концентрацией вирусного белка 0,5-1,5 мг/мл и, соответственно, около 0,3 мг вирусной РНК.

Разработан метод индикации вируса ИБК на основе ОТ-ПЦР с прай-мерами на консервативную область З'-ИТЯ, позволяющий выявлять геном возбудителя в различных вируссодержащих материалах без выделения вируса в куриных эмбрионах в течение 4-6 часов.

Разработан метод прямого секвенирования амплифицированных в ПЦР фрагментов кДНК, позволяющий в течение 2-3 дней определять первичную структуру вариабельной области гена 81, и в результате сравнительного анализа с использованием созданного банка данных, проводить штаммовую дифференциацию новых изолятов вируса ИБК.

С помощью разработанного метода проведена идентификация 21 изолята ВИБК, выделенного на территории России в 1997-1998 гг., а также 10 отечественных и зарубежных вакцинных и патогенных штаммов.

Разработанные методы индикации генома и штаммовой дифференциации вируса ИБК одобрены ученым советом и утверждены директором ВНИИЗЖ, а также Департаментом ветеринарии МСХиП РФ и в настоящее время используются для индикации генома и штаммовой дифференциации изолятов вируса ИБК, выделяемых на территории России и стран СНГ. Публикация научных исследований

По теме научных исследований опубликовано 5 научных работ. Апробация работы

Основные материалы диссертации были доложены на научно-практической конференции "Проблемы инфекционной патологии сельскохозяйственных животных" ВНИИЗЖ, г. Владимир (1997 г.), научной конференции "Современные аспекты ветеринарной патологии животных" г. Владимир (1998 г.) и II Всероссийской конференции "ПЦР в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний" г. Москва (1998 г.).

Структура и объем работы

Диссертация изложена на 127 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы и приложение. Список литературы включает 188 источников. Работа иллюстрирована 20 рисунками и 5 таблицами.

Основные положения, выносимые на защиту

-метод очистки и концентрирования вируса ИБК и метод выделения вирусной РНК;

-метод индикации генома вируса ИБК, основанный на амплификации в ПЦР фрагмента консервативной области З'-ИТЯ;

-метод штаммовой дифференциации вируса ИБК, основанный на определении первичной структуры амплифицированных в ПЦР фрагментов кДНК вариабельной области гена и сравнительном анализе с опубликованными последовательностями других штаммов;

- первичная структура вариабельной области гена 81, изолятов вируса ИБК, выделенных на территории России в 1997-1998 гг., а также отечественных и зарубежных вакцинных и патогенных штаммов.

Исследования по диссертационной работе выполнены в 1995-1998 г.г. во Всероссийском научно-исследовательском институте защиты животных (ВНИИЗЖ, г. Владимир).

Автор выражает искреннюю благодарность к.б.н. П.К. Аяноту, В.А. Лобанову, к.в.н. В.В. Борисову, Т.Н. Быковой, к.б.н. О.Г. Грибанову, Ю.В. Зинковскому, к.б.н. С.Н. Колосову, к.х.н. А.И. Ломакину, к.б.н. Н.С. Мудрак, д.б.н. H.A. Перевозчиковой, к.б.н. Г.М. Фалиной, к.б.н. A.B. Щербакову, к.б.н. Л.О. Щербаковой - за практическую помощь в выполнении отдельных этапов работы, д.в.н. В.Л. Узюмову - за ценные замечания при обсуждении работы.

2-ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Патогенез и эпизоотология инфекционного бронхита кур

Инфекционный бронхит впервые был описан в США в Северной Дакоте в 1931 году Schalk и Hawn, как неизвестное ранее заболевание дыхательной системы цыплят, сопровождающееся высокой летальностью [148]. В дальнейшем болезнь была установлена и у взрослых кур. Заболевание широко распространено практически во всех странах с развитым промышленным птицеводством и наносит значительный экономический ущерб. Экономические потери при инфекционном бронхите кур складываются, в основном, из снижения яичной и мясной продуктивности, вынужденной выбраковки заболевшей птицы, высокой летальности молодняка до 30-дневного возраста и повышения чувствительности к другим заболеваниям.

В птичниках, неблагополучных по ИБК, отход молодняка составляет в среднем 18-20% [5], при первичной циркуляции в хозяйстве вируса с неф-рогенной тропностъю летальность птицы может достигать 57-70% [8]. По различным данным, снижение яйценоскости у кур-несушек колеблется от 2,4 до 85%. В случае осложнения инфекционного бронхита другими инфекционными заболеваниями болезнь протекает в более тяжелой форме и яйценоскость переболевших кур-несушек никогда не достигает первоначального уровня. В крупных птицехозяйствах ИБК часто имеет стационарный характер и протекает как хроническая инфекция без ярко выраженных симптомов поражения респираторных органов.

Инфекционный бронхит кур, ослабляя организм птицы, создает благоприятный фон для развития вторичных инфекций. В случае ассоциированного течения ИБК с колибактериозом или микоплазмозом воспалительные процессы в респираторных органах наблюдаются более длительный срок, что увеличивает экономический ущерб хозяйства [154]. При одновременном течении ИБК и пуллороза (возбудитель-Salmonella pullorum-gallinarum) клинические признаки обоих заболеваний более ярко выражены, падеж сравнительно выше, ИБК обостряет латентную форму пуллороза [7]. Вынужденная выбраковка цыплят в хозяйствах, где отмечают ассоцииро-

ванное течение ИБК с вторичными инфекциями может достигать 40-60% среди цыплят 1-5 месячного возраста [4]. Инфекционный бронхит может протекать в комплексе с другими вирусными инфекциями, такими как ла-ринготрахеит и аденовирусная инфекция. Сочетание воздействия холодом и заражения Mycoplasma synoviae через 5 дней после заражения вирусом ИБК вызывало аэросаккулит, который отличался по контагиозности и остроте протекания от заболевания, вызванного одним штаммом вируса ИБК [85]. Комбинированное интраназальное заражение различными штаммами вируса ИБК и Escherichia coli вызывало высокую смертность у молодых цыплят, причем инфицирование этими возбудителями отдельно не приводило к их гибели [58].

Инфекционный бронхит поражает кур и цыплят всех возрастов. Наиболее остро заболевание протекает у цыплят до 30-дневного возраста, вызывая высокую смертность. Чувствительность к этому заболеванию отличается у различных пород домашних кур [62, 140]. Вирус ИБК был выделен также от фазанов,