Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-биологические свойства изолятов вируса инфекционного бронхита кур, выявленных на территории России в период с 2005 по 2011 гг.
ВАК РФ 03.02.02, Вирусология
Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-биологические свойства изолятов вируса инфекционного бронхита кур, выявленных на территории России в период с 2005 по 2011 гг."
На правах рукописи
005056883
ОВЧИННИКОВА Евгения Валерьевна
МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ИЗОЛЯТОВ ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО БРОНХИТА КУР, ВЫЯВЛЕННЫХ НА ТЕРРИТОРИИ РОССИИ В ПЕРИОД С 2005 ПО 2011 ГГ.
03.02.02 «Вирусология»
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
1 3 ЛЕН 2012
Владимир - 2012
005056883
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), г. Владимир
Научный руководитель - Дрыгин Владимир Викторович
доктор биологических наук, профессор (ФГБУ «ВНИИЗЖ»)
Официальные оппоненты: Цыбанов Содном Жамьянович
доктор биологических наук, профессор
(ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии), г. Покров
Смоленский Владимир Иванович
доктор биологических наук, профессор (ФГБУ «ВГНКИ»), г. Москва
Ведущая организация — Государственное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» (ГНУ ВНИТИБП), г. Щелково.
Защита диссертации состоится « ) 3 » декабря 2012 г. в 40 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 220.015.01 при ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» по адресу: 600901, г. Владимир, мкр. Юрьевец
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» и на сайте 1Шр/\уч^.ата11.ги.
Автореферат разослан «16» ноября 2012 г.
Ученый секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций ФГБУ «ВНИИЗЖ» доктор биологических наук, профессор А.П. Пономарев
1. Общая характеристика работы
1.1. Актуальность темы. Инфекционный бронхит кур (ИБК) -высококонтагиозное заболевание, которое поражает птиц всех возрастов в хозяйствах мясного и яичного направлений и широко распространено во многих странах. Возбудителем заболевания является РНК-содержащий вирус семейства Coronaviridae, рода Coronavirus. При развитии заболевания поражаются респираторные органы, почки, а также репродуктивные органы кур. Экономические потери связаны со снижением прироста массы тела у цыплят-бройлеров, снижением яичной продуктивности, ухудшением качества яйцу несушек и родительского поголовья [1, 8].
Как и другие РНК-содержащие вирусы, вирус ИБК может быстро мутировать. Давление со стороны иммунной системы хозяина на гетерогенную популяцию вируса приводит к преимущественному отбору и закреплению тех или иных вариантов вируса. В результате, вирусный геном быстро эволюционирует, порождая широкий спектр серотипов [13, 8]. Изменения в геноме вируса ИБК происходят в результате накопления точечных мутаций, инсерций и делеций, а также рекомбинации.
Иммунитет, приобретенный к одному серотипу, часто не обеспечивает перекрестной защиты от заражения вирусом других серотипов [8]. Выявление, типирование и изучение биологических свойств изолятов вируса ИБК необходимо для разработки эффективных программ вакцинации.
1.2. Степень разработанности проблемы. Изучение ИБК в России начато в 1960-е гг. Первые работы посвящены вопросам ассоциированного течения ИБК и бактериальных инфекций, а также определению типовой принадлежности штаммов вируса ИБК, выделенных на птицефабриках России, с помощью перекрестной реакции нейтрализации на КЭ [3].
Вопросам молекулярной диагностики ИБК посвящен ряд работ зарубежных и отечественных авторов. В России в 1997-98 гг. были разработаны методы штаммовой дифференциации вируса ИБК на основе ПЦР и секвенирования вариабельной области гена SI [5, 14]. С использованием
данных методик выявлено разнообразие генотипов вируса ИБК на птицефабриках России в период с 1997 по 2004 гг. Описаны молекулярно-биологические свойства изолятов «Таганрогский» генотипа 793В, «Щелковский» генотипа Массачусетс и изолята «Калужский», отличающегося по нуклеотидному составу от известных вакцинных штаммов более чем на 20%
[2, 7].
В работах зарубежных авторов описано широкое распространение в мире изолятов вируса ИБК генотипа ОХ. Для дальнейшей оптимизации средств профилактики заболевания изучены биологические свойства ряда изолятов вируса ИБК данного генотипа [9, 11, 12]. Для России проблема появления и распространения изолятов вируса генотипа С>Х также актуальна, но недостаточно изучена. Высокая изменчивость вируса и скорость распространения вновь появившихся вариантов обусловливают необходимость разработки чувствительного и специфичного метода ОТ-ПЦР в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ) для выявления генома вируса ИБК, постоянного мониторинга циркулирующих изолятов вируса, а также изучения их биологических свойств.
1.3. Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось изучение молекулярно-биологических свойств изолятов вируса ИБК, выявленных на территории РФ в период с 2005 по 2011 гг.
Для достижения цели были поставлены задачи:
1. разработать метод выявления генома вируса ИБК в ОТ-ПЦР-РВ;
2. провести филогенетический анализ изолятов вируса ИБК, выявленных на территории РФ в период с 2005 по 2011 гг.;
3. выделить изоляты вируса ИБК;
4. изучить молекулярно-биологические свойства изолята вируса ИБК генотипа
5. изучить молекулярно-генетические свойства рекомбинантных вирусов ИБК.
1.4. Научная новизна исследования. Разработан метод для выявления генома вируса ИБК в ОТ-ПЦР-РВ. Определена нуклеотидная
последовательность фрагмента гена и создан банк данных 169 изолятов вируса ИБК, выявленных у кур из хозяйств России в 2005-2011 гг. Впервые в России выявлена и подтверждена клонированием и секвенированием естественная рекомбинация гена вируса ИБК.
1.5. Практическая значимость исследования. В результате исследования 1445 проб патологического материала методами ОТ-ПЦР-РВ, ОТ-ПЦР и секвенирования установлено преобладание на птицефабриках РФ и стран ближнего зарубежья изолятов вируса ИБК генотипов Массачусетс, 793В, (}Х и Э274.
Выделенные изоляты вируса ИБК генотипа ОХ могут быть использованы в ФГБУ «ВНИИЗЖ» для разработки диагностических наборов и в качестве компонента полиштаммных вакцин против ИБК.
1.6. Соответствие диссертации паспорту научной специальности. В соответствии с формулой специальность 03.02.02 «Вирусология» представляет собой область науки, занимающуюся исследованием вирусов, их происхождения, состава, строения, генетики, морфологии, механизмов размножения, аспектов взаимоотношений с клеточными организмами, проблемами противовирусного иммунитета, патогенности вирусов, разработкой мер и средств предупреждения, диагностики и лечения вызываемых вирусами заболеваний. В диссертации разработаны методические указания по выявлению генома вируса инфекционного бронхита кур с использованием ОТ-ПЦР-РВ, приведены результаты исследований по выявлению и штаммовой дифференциации изолятов вируса ИБК, выявленных на территории России и стран ближнего зарубежья в период с 2005 по 2011 гг., а также описаны биологические свойства изолята 1ВУ08-10 генотипа рХ. Результаты научного исследования соответствуют пунктам 4, 6, 8, 10 паспорта специальности.
1.7. Апробация результатов работы. Результаты диссертационной работы представлены и обсуждены на V и VII Международных ветеринарных конгрессах по птицеводству (г. Москва, 2009, 2011 гг.), на научно-практических семинарах специалистов птицехозяйств России (Владимир, 2011, 2012 гг.), на 6-
ой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием (г. Москва, 2007 г.), на семинаре для главных зоотехников и главных ветеринарных врачей птицеводческих хозяйств России и стран СНГ (г. Сергиев Посад, 2012 г.), на Международной научно-практической конференции молодых ученых «Достижения молодых ученых - в ветеринарную практику» (г. Владимир, 2012 г.), на заседаниях ученого совета ФГБУ «ВНИИЗЖ» в период с 2005 по 2011 гг.
1.8. Публикации научных исследований. По теме диссертационной работы опубликовано 10 научных статей, в том числе 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации.
1.9. Основные ноложения, выносимые на защиту:
- метод ОТ-ПЦР-РВ для выявления генома вируса ИБК в пробах патологического материала;
- сравнительный анализ первичной структуры гена 81 изолятов вируса ИБК, выявленных на территории России и стран ближнего зарубежья в период с 2005 по 2011 гг.;
- молекулярно-биологические свойства изолята 1ВУ08-10 вируса ИБК генотипа С?Х;
- молекулярно-генетические свойства рекомбинантных форм вируса ИБК.
1.10. Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 116 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы и приложение. Список литературы включает 25 отечественных и 168 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 17 таблицами и 20 рисунками.
Исследования по теме диссертационной работы выполнены в 2005-2011 гг. в референтной лаборатории вирусных болезней птиц ФГБУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир.
1.11. Личный вклад соискателя. Основной объем исследований проведен автором самостоятельно. Автор выражает искреннюю благодарность Щербаковой JI.O., Селиверстову А.В., Елаткину Н.П. и всему коллективу референтной лаборатории вирусных болезней птиц за консультативную и методическую помощь при выполнении отдельных этапов работы.
2. Собственные исследования 2.1. Материалы
2.1.1. Образцы патологического материала. В работе исследовали приготовленные в фосфатно-буферном растворе 10-20%-ные суспензии трахей, легких, почек, миндалин слепых отростков кишечника и яйцеводов кур из хозяйств России, стран ближнего зарубежья и от экспериментально инфицированных цыплят.
2.1.2. Штаммы микроорганизмов. Использовали вакцинные штаммы и изоляты вируса ИБК, выделенные от птиц из хозяйств России, а также вакцинный штамм HI20 вируса ИБК из коллекции ФГБУ «ВНИИЗЖ». Проверку специфичности метода проводили с использованием референтных штаммов вирусов инфекционного бронхита кур, ньюкаслской болезни, инфекционного ларинготрахеита, инфекционной бурсальной болезни, болезни Марека, реовируса кур, и изолята вируса лейкоза птиц подгруппы J, аденовируса птиц 4 серотипа, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae, Escherichia coli.
2.1.3. Биологические тест-системы. Для оценки цилиостатического и эмбриопатического действий, а также для культивирования изолятов вируса ИБК использовали трахеальную органную культуру и СПФ-эмбрионы кур (Lohman Tierhzuch, Германия), соответственно.
2.1.4. Животные. При экспериментальном заражении использовали Цыплят породы белый леггорн, выведенных из СПФ-эмбрионов кур и разновозрастных коммерческих бройлеров и несушек, свободных от антител к вирусу ИБК.
2.2. Методы
2.2.1. Выбор праймеров и TaqMan-зондов осуществляли с помощью программ Primer Express, версия 3.0 («Applied Biosystems», США) и «Oligo», версия 3.3. Синтез осуществляла фирма НПО «Синтол» (г. Москва).
2.2.2. Выделение нуклеиновых кислот проводили с помощью набора для выделения нуклеиновых кислот с сорбентом NucIeoS+ (ООО «Биоком», г. Москва).
2.2.3. ОТ-ПЦР-РВ проводили с использованием системы «Rotor-Gene 6000» («Corbett Research», Австралия). Состав реакционной смеси: 5 мкл 5-кратного буфера для ПЦР, 2,5 мкл 25 мМ MgCl2, 1 мкл водного раствора 10 мМ dNTP, по 10 пмоль каждого из двух праймеров, 5 пмоль ТаяМап-зонда, по 1 ед. ферментов ревертазы и Taq ДНК-полимеразы, 5 мкл РНК и вода до конечного объема 25 мкл. Температурный режим реакции: 50°С — 20 мин, 95°С - 5 мин и 40 циклов: 95°С - 10 с; 55°С - 35 с; 72°С - 15 с.
2.2.4. ОТ-ПЦР. Состав реакционной смеси для обратной транскрипции: по 10 пМ прямого и обратного праймеров, 2 мкл 10 мМ dNTP, 4 мкл 5-кратного ревертазного буфера и 1 ед. ревертазы, 12 мкл раствора суммарной РНК. Смесь инкубировали 40 мин при 42°С, затем прогревали 3 мин при 95°С. ПЦР проводили в амплификаторе «Терцик» («ДНК-технология», Россия). Состав реакционной смеси для ПЦР и «nestedw-ПЦР: 3 мкл кДНК, по 10 пМ прямого и обратного праймеров, 1 мкл 10 мМ dNTP, 5 мкл 5-кратного буфера для ПЦР, 2,5 мкл 25 мМ MgCl2, 1 ед. Taq ДНК-полимеразы и 11,5 мкл воды. Проводили 35 или 25 циклов амплификации, соответственно, при следующем температурном режиме: 94° С - 20 с; 53° С - 30 с; 72° С - 40 с. Учет результатов реакции проводили методом электрофореза в 1-2% агарозном геле с 0,001% бромистого этидия.
2.2.5. Очистку продуктов ПЦР проводили с использованием стекловолокнистых фильтров GF/F («Whatman», США) и 80% этанола с помощью вакуумного насоса («Millipore»),
2.2.6. Секвеннрование осуществляли на автоматическом секвенаторе
ABI Prism 3100 («Applied Biosystems», США).
2.2.7. Анализ нуклеотндных последовательностей проводили в программе BioEdit, версия 7.0.5.3. Построение дендрограмм проводили с помощью алгоритма Neighbor-Joining пакета программ MEGA, версия 4.0.
2.2.8. Выделение вируса ИБК. Выделение вируса проводили путем заражения в аллантоисную полость 9-суточных СПФ-эмбрионов кур суспензией из патологического материала в объеме 0,2 мл. Зараженные эмбрионы инкубировали при 37°С, ежедневно овоскопируя. Гибель эмбрионов в течение первых суток инкубации считали неспецифической. Через 3 суток для следующего пассажа отбирали аллантоисную жидкость. Оставшиеся эмбрионы вскрывали через 7-9 суток и исследовали на наличие макроскопических изменений, характерных для ИБК (отставание в росте, скручивание эмбриона в щар). Для выделения вируса ИБК птиц проводили 3 последовательных пассажа
[4].
2.2.9. Определение титра инфекционной активности вируса
проводили на СПФ-эмбрионах кур. Готовили последовательные 10-кратные разведения (от 1 до 6) исследуемого вируссодержащего материала и заражали каждым не менее 4 чувствительных объектов. Расчет титра инфекционной активности вируса производили по методу Кербера.
2.2.10. Оценка цилиарной активности. Для оценки цилиарной активности использовали трахеи экспериментальных цыплят. Трахею цыпленка извлекали и помещали в ФБР. С помощью пинцета и бритвенного лезвия очищали трахеи от соединительной и жировой ткани и нарезали на тонкие (0,51,0 мм) кольца. Полученные эксплантаты трахеи помещали в ФБР и оценивали цилиарную активность под световым микроскопом [5].
2.2.11. Получение рекомбинантных плазмид, несущих вставки гена S1 вируса инфекционного бронхита кур. Для клонирования использовали универсальный плазмидный прокариотический вектор pGEM-T Easy ("Promega", США). Клонирование проводили в компетентные клетки E.coli штамма XL-1 по 5'Т концам вектора и З'А концам ПЦР фрагмента.
Трансфекцию осуществляли методом электропорации с использованием мультипоратора Eppendorf. Клетки после трансфекции высевали на чашки с LB агаром и через сутки проводили отбор клонов для скрининга методом ПЦР со специфическими праймерами на встройку гена.
Клоны, оказавшиеся положительными в ПЦР, подращивали для наработки плазмиды. Очистку плазмиды проводили набором GeneJET™ Plasmid Miniprep Kit («Fermentas», Литва). Полученные плазмиды секвенировали, с использованием праймеров на последовательность промотора плазмиды (Т7 - прямой, SP6 - обратный).
2.2.12. Статистическая обработка результатов. Для статистической обработки результатов определяли среднее арифметическое при количестве опытов (п) и среднее квадратическое (стандартное) отклонение (а) среднего арифметического.
3. Результаты собственных исследований
3.1. Разработка ОТ-ПЦР-РВ. При разработке метода ОТ-ПЦР-РВ для выявления генома вируса ИБК использовали систему праймеров и флуоресцентно-меченого олигонуклеотидного зонда для амплификации фрагмента консервативной нетранслируемой области генома вируса [10]. Специфичность разработанной ОТ-ПЦР-РВ была продемонстрирована с использованием шести штаммов и изолятов вируса ИБК разных генетических групп, а также проб, содержащих другие вирусные агенты. Аналитическая чувствительность ОТ-ПЦР-РВ составила 1,0 lg ЭИД50/мл вируса (13 геномных эквивалентов вируса ИБК на реакцию).
3.2. Анализ изолятов вируса ИБК, выявленных за период с 2005 по 2011 гг. В период с 2005 по 2011 гг. с помощью методов ОТ-ПЦР-РВ, ОТ-ПЦР и секвенирования на наличие генома вируса ИБК исследовано 1445 проб патологического материала, полученных из 300 хозяйств России и некоторых стран ближнего зарубежья. Геном вируса ИБК выявили более чем в 35% проб как от вакцинированной, так и от невакцинированной птицы.
Таблица 1
Результаты ОТ-ПЦР и секвенирования
Страна Кол-во проб исследованных/ положительных на ИБК Кол-во вакцинных штаммов Кол-во изолятов*
Россия 1328/486 250 158/236
Украина 73/26 12 6/14
респ. Казахстан 22/5 0 3/5
респ. Беларусь 18/0 0 0
респ. Узбекистан 4/0 0 0
Примечание: * в числителе указано число случаев выявления изолятов вируса, в знаменателе - число проб, в которых был выявлен геном изолята вируса ИБК, включая идентичные, например, выявленные в патологическом материале от птиц разных птичников одной птицефабрики
Нуклеотидные последовательности вариабельной области гена S1 изолятов вируса ИБК, выявленных в 2005-2011 гг., сравнивали с последовательностями изолятов и вакцинных штаммов вируса ИБК, опубликованных в международной базе данных GenBank.
В результате филогенетического анализа выявленные изоляты вируса ИБК были отнесены к генетическим группам Массачусетс, 793В, QX, D274, Italy-02, В1648, Arkansas. Кроме того, были выявлены вариантные изоляты, эндемичные для России и не относящиеся ни к одной генетической группе, а также рекомбинантные формы вируса ИБК. Уровень нуклеотидных отличий между разными генетическими группами составлял от 20% и выше. Основная часть изолятов представлена 4 генетическими группами (Массачусетс, 793В, QX, D274) и выделена на дендрограмме цветом (рис. 1).
Установлена длительная циркуляция изолятов вируса ИБК в хозяйствах. Так, на одной из птицефабрик Саратовской области идентичные по нуклеотидному составу изоляты выявляли в течение 5 лет. Кроме того, установлена совместная циркуляции в хозяйстве разных изолятов, принадлежащих к одной или нескольким генетическим группам вируса ИБК.
Большинство выявленных за рассматриваемый период изолятов вируса ИБК (29,5% от общего числа выявленных изолятов) относились к генотипу
Массачусетс. Всего с 2005 по 2011 гг. на птицефабриках Центрального, Приволжского, Южного, Северо-Западного, Сибирского, Уральского Федеральных округов РФ было выявлено 50 изолятов данного генотипа. Максимальный уровень нуклеотидных отличий по исследуемому фрагменту гена Б1 от вакцинных штаммов (Н-120, Н-52, Ма5) и внутри группы составил 4,8%.
• 793В
Рис. 1. Генетическая принадлежность изолятов вируса ИБК, выявленных в 2005-2011 гг. Анализ проводили в программе MEGA 4.02
Примечание: черными точками обозначены референтные штаммы вируса ИБК
Изоляты вируса ИБК генотипа 793В в период с 2005 по 2011 гг. выявляли ежегодно, причем число случаев выявления возросло с 6% (от общего числа выявленных изолятов) в 2005 г. до 38,7% - в 2011 г.
На территории РФ изоляты вируса ИБК генотипа 793В чаще выявляли в Приволжском и Центральном, реже - в Южном и Северо-Западном округах.
Всего было выявлено 36 нзолятов вируса данного генотипа (20,7 % от общего числа выявленных изолятов). Вариабельность фрагмента гена 81 внутри генетической группы не превышала 10%.
За исследуемый период на территории РФ было выявлено 20 изолятов вируса ИБК генотипа Э 274 (12,4% от общего числа выявленных изолятов). Уровень нуклеотидных отличий фрагмента гена Б1 внутри группы не превышал 5,8%. Десять изолятов из двадцати были выявлены на птицефабриках Уральского Федерального округа РФ.
Из 6 изолятов генотипа В1648 пять были выявлены на территории географически близких регионов (Нижегородская и Владимирская области), и один — на птицефабрике Ростовской области. Вариабельность по нуклеотидному составу гена внутри группы генотипа В1648 не превышала 8,7%. На одной из фабрик Нижегородской области изолят генотипа В1648 выявляли трижды: дважды в 2006 г. у кур в возрасте 5-6 месяцев (1ВУ05-06) и 11-12 месяцев (1ВУ12-06), а также в 2007 г. у кур в возрасте 9 месяцев (1ВУ06-07). Причем изолят 1ВУ06-07 отличался на 5% по нуклеотидному составу исследуемого фрагмента гена от изолятов, выявленных в 2006 году.
Изоляты вируса ИБК генотипа Иа1у-02 выявляли в 2007 г. в патологическом материале от 35-40-суточных цыплят, направленном для исследования из птицефабрики Украины, а также в 2010 и 2011 гг. в патологическом материале, присланном из Северо-Кавказского ФО. Процент отличий по нуклеотидному составу внутри группы составил 0,5-3,9% .
Генотип Арканзас распространен в Америке, тогда как на других континентах встречается редко. На территории России и ближнего зарубежья за период с 1998 по 2011 год было два случая выявления вируса данного генотипа. В мае 2005 года в патологическом материале от кур в возрасте 153 суток, присланном из птицефабрики Краснодарского края, был выявлен изолят 1ВУ09-05. Процент аминокислотных отличий фрагмента гена 81 от штамма Агк-99 (номер в СепВапк М99482) составил 8,1%. Это единственный случай выявления вируса ИБК генотипа Арканзас в России. Еще один изолят ИБК
этого генотипа (IBV14-07) выявили на птицефабрике респ. Казахстан в 2007 г.
Девятнадцать изолятов, выявленных в пробах патологического материала от кур в возрасте от 8 суток до 100 недель, имели уникальную первичную структуру гена S1, и были отнесены к вариантным изолятам вируса ИБК. Уровень нуклеотидных отличий вариантных изолятов от штаммов и изолятов, представленных в GenBank, составил более 20%.
По сравнению с данными за 1998-2004 гг. [5, 14], когда наряду с генотипом Массачусетс наблюдалось преобладание вариантных изолятов вируса ИБК, в период с 2005 по 2011 гг. количество случаев выявления подобных изолятов снизилось, а в 2009 и 2011 гг. не было выявлено ни одного вариантного изолята вируса.
За исследуемый период в патологическом материале, присланном из птицефабрик России, Украины и респ. Казахстан, от кур, как с клиническими признаками, так и без какого-либо проявления инфекции, были выявлены 28 изолятов вируса ИБК генотипа QX. Процент нуклеотидных отличий фрагмента гена S1 внутри группы составил 1,5-7,1%. Если еще в 2001-2005 гг. наблюдались единичные случаи выявления нового для нашей страны генотипа QX, то в 2008 и 2011 гг. их количество возросло до 31,5% и 25,8% от общего числа выявленных изолятов, соответственно.
Изоляты генетической группы QX выявляли в пробах патологического материала от птиц преимущественно раннего возраста (20-40 суток), однако в пробах от кур в возрасте 150, 300 суток также обнаруживали вирус данного генотипа. В большинстве случаев против ИБК на птицефабриках применялась вакцинация как инактивированными, так и живыми вакцинами. Изоляты генотипа QX обнаружены на птицефабриках Южного (Краснодарский край, Ростовская область), Центрального (Курская, Ивановская, Тверская, Воронежская, Белгородская области) и Приволжского (Самарская область) ФО России.
3.3. Выделение вируса ИБК проводили с использованием СПФ-эмбрионов кур [4]. Для выделения вируса проводили не менее трех
последовательных пассажей. Через 7-9 суток после инфицирования КЭ наблюдали эмбриопатические изменения, характерные для вируса ИБК, такие как отставание в росте и скручивание эмбрионов в шар.
Выделены 8 изолятов вируса генетической группы С>Х и два рекомбинантных вируса ИБК.
С помощью специфических праймеров определены полные или частичные последовательности гена 81 выделенных изолятов вируса ИБК и опубликованы в международной базе данных СепВапк (табл. 2).
Таблица 2
Выделенные нзоляты вируса ИБК
№ Название Регион РФ, страна Генотнпическая принадлежность изолята Номер в СепВапк
1 1ВУ02-08 Ростовская область ОХ .1X021292
2 1ВУ22-09 Краснодарский край ОХ НО840506
3 1ВУ08-10 Тверская область ОХ .10991523
5 1ВУ13-10 Нижегородская область ОХ .1X233489
6 1ВУ08-11 Оренбургская область ОХ .1X021293
7 1ВУ12-11 Курская область ОХ .1X233490
8 1ВУ28-11 Ростовская область ОХ 3X021291
9 1ВУ13-08 Ивановская область ОХ 3X021294
10 1ВУ27-11 Украина 'рекомбинант Масс - 4/91 3X233491
11 1ВУ02-09 Украина ^рекомбинант Н120 - ОХ НО840510
Примечание: рекомбииант изолята генотипа Массачусетс и вакцинного штамма 4/91; 2- рекомбинант вакцинного штамма Н-120 и изолята генотипа ОХ
3.4. Изучение биологических свойств изолята 1ВУ08-10 вируса ИБК генотипа ОХ. Изолят 1ВУ08-10 выделен в 2010 г. от 37-суточных цыплят-бройлеров одной из птицефабрик Тверской области РФ. Титр инфекционной активности вируса после 7 пассажа составил 6,45 ^ ЭИД50/мл. Контаминацию вирусами НБ, ИББ, ИЛТ, ГП типа А, ССЯ-76, реовирусом кур и микоплазмой исключили методом ПЦР.
Патогенность изолята 1ВУ08-10 определяли путем постановки биопробы на цыплятах разных возрастов (7, 21 и 52 суток), вакцинированных и невакцинированных против вируса ИБК. Цыплята в возрасте 7 и 21 суток вакцинированы не были, а в группе 52-суточных птиц были как иммунные, так
и неиммунные куры. Птиц каждой возрастной группы разделяли на экспериментальную и контрольную группы по 30 и 20 цыплят, соответственно. Экспериментальную и контрольную группы содержали в изолированных боксах. Заражение птиц экспериментальной группы проводили интраназально, перорально и на конъюнктиву в дозе 3,0 ^ ЭИД50. Длительность экспериментов составляла 28 суток. В течение опыта проводили диагностический убой по две птицы из опытной и по одной из контрольной группы через 1-11, 14, 21, 28 сутки после инфицирования. Для оценки цилиарной активности использовали трахеи экспериментальных птиц [5]. Ротоглоточные, клоакальные смывы и внутренние органы (трахея, легкие, почки, миндалины кишечника) исследовали на наличие генома вируса ИБК методом ОТ-ПЦР-РВ.
В результате проведенных экспериментов с использованием кур разных возрастов, иммунных и неиммунных к вирусу ИБК было показано, что изолят 1ВУ08-10 генотипа <ЗХ не вызывал у птиц клинических признаков и патологоанатомических изменений, за исключением непродолжительного цилиостаза у цыплят в возрасте 7 и 21 суток (табл. 3) и легких респираторных расстройств (чихание, хрипы) у 7-суточных цыплят.
Таблица 3
Цилиарная активность при экспериментальном заражении (в баллах)
№ опыта Возраст птиц (сутки) 1* 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
1 7 1 0 0 0 0 0 1 2 3 3 4
2 21 4 3 2 0 0 0 2 3 4 4 4
3 52 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4
Примечание: 1-11* сутки после инфицирования
В группе 52-суточных кур снижение цилиарной активности не наблюдали как у вакцинированных, так и у невакцинированных птиц. При этом геном вируса ИБК в пробах внутренних органов, ротоглоточных и клоакальных смывах от экспериментальных птиц выявляли в ОТ-ПЦР-РВ на протяжении всего опыта.
3.5. Рекомбинантные формы вируса ИБК. В случае, когда иммунизация живой вакциной проводится на уже инфицированном поголовье, или же заражение птицы произошло после вакцинации, возможно создание благоприятных условий для естественной рекомбинации вируса. При этом родительскими формами рекомбинантного вируса могут быть вакцинный штамм и изолят вируса ИБК. Начиная с 2009 года, были выявлены четыре рекомбинантных вируса ИБК (табл. 4).
Таблица 4
Рекомбинантные формы вируса ИБК, выявленные в 2009-2011 гг.
Название изолята Родительские вирусы, штаммы и изоляты Номер в СспВапк Вирусовыделение
1ВУ02-09 вакцинный штамм Н-120, изолят генотипа ()Х Н(3840510 Выделен на СПФ-эмбрионах кур
1ВУ01-10 вакцинный штамм Н-120, вакцинный штамм О 274 Н(3840511 Не выделен
1ВУ03-10 вакцинный штамм 1Ж4/91, изолят генотипа ОХ Н(3840512 Не выделен
1ВУ27-11 вакцинный штамм 1Ж4/91, изолят генотипа Массачусетс Ж233491 Выделен на СПФ-эмбрионах кур
Изолят 1ВУ02-09, выявленный на птицефабрике Украины, предположительно, появился в результате рекомбинации вакцинного штамма Н-120 и полевого изолята генотипа С?Х. Вирус 1ВУ01-10, выявленный в Центральном федеральном округе РФ являлся рекомбинантом вакцинных штаммов Н-120 и О 274. В Северо-Западном ФО РФ был выявлен рекомбинант 1ВУ03-10, родительскими вирусами которого стали вакцинный штамм 1Ж4/91 и изолят генотипа ОХ. Вирус 1ВУ27-11, выявленный на одной из птицефабрик Украины, являлся рекомбинантом двух изолятов, принадлежащих к генотипам Массачусетс и 793В. Причем родительский вирус генетической группы Массачусетс отличался по аминокислотному составу (4 аминокислотные замены) от применяемых на данной фабрике вакцинных штаммов Ма-5 и Н-120. Второй родительский вирус имел 1 аминокислотную замену от широко
применяемого вакцинного штамма ик 4-91.
Для изолята 1ВУ02-09 была определена первичная структура полного гена 81 (номер в вепВапк Н<3840510). Хотя данная нуклеотидная последовательность была получена с использованием прямого и обратного праймеров, для подтверждения рекомбинации и исключения гетерогенности вирусной популяции были получены десять клонов, несущих плазмиды со вставкой фрагмента гена 81, включающего рекомбинантный участок. В результате секвенирования наличие рекомбинации выявлено во всех десяти клонах.
Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей рекомбинантов вируса ИБК показал, что во всех четырех случаях рекомбинация происходила на участке 300-470 н.п. гена 81. Данный участок гена по локализации соответствует гипервариабельной области гена 81 вируса ИБК, определенной \Vang и соавт. [15].
Изоляты 1ВУ02-09 и 1ВУ27-11 были адаптированы к развивающимся СПФ-эмбрионам кур, при заражении вызывали эмбриопатические изменения, характерные для вируса ИБК. Титр инфекционной активности для изолятов 1ВУ02-09 и 1ВУ27-11 составил 6,0 и 6,1 ^ ЭИД50/мл, соответственно. При заражении трахеальной органной культуры оба изолята вызывали полную атрофию реснитчатого эпителия через 72 часа после инфицирования.
З.б. Динамика выявления изолятов вируса ИБК разных генотипов за период с 1998 по 2011 гг. По данным за период с 1998 по 2004 гг. основная часть выявленных изолятов ИБК на территории РФ относилась к генотипу Массачусетс и вариантным изолятам, отличающимся по нуклеотидному составу от известных штаммов более чем на 20% [6, 14]. За период с 2005-2011 гг. ситуация изменилась (табл. 5, рис.6).
Во-первых, уменьшилось количество изолятов генотипа Массачусетс на 13%, хотя данный генотип по-прежнему доминировал на территории России. Преобладанию генетической группы Массачусетс, вероятно, способствует широкое использование вакцин на основе штаммов данного генотипа.
Кроме того, на 21% сократилось количество вариантных изолятов вируса ИБК. Снижение количества случаев выявления вариантных изолятов вируса, возможно, связано с интенсивной профилактикой ИБК в последние годы. Еще одним объяснением может быть изменение генома вируса, вследствие накопления точечных мутаций в подпраймерной области, которые могут быть причиной ложноотрицательных результатов в ОТ-ПЦР.
2005
2007
2008
т.
0
2006
2009
2010
2011
ЧФ
□ ltaly-02
П Mass
□ QX
□ Variant □ Arkansas
□ D274 ■ 793В
□ В1648 □ Recombinant
Рис. 6. Динамика выявления изолятов вируса ИБК разных генотипов за период с 1998 по 2011 гг.
Во-вторых, увеличилось на 10% количество изолятов генотипа 793В и на 14% - изолятов генотипа ОХ. Среди возможных причин: занос вируса из-за границы и, в случае с генотипом 793В, активное применение вакцин на основе штамма 4/91.
Таблица 5
Количество изолятов вируса ИБК разных генотипов, выявленных в 1998-2011 гг. (%)
Генотип 1998-2004 гг. 2005-2011 гг.
Массачусетс 42 29
вариантные изоляты 32 11
793 В И 21
ОХ 2 16
И274 10 12
другие генотипы *3 ** 11
Примечание: * генотипы В1648, Иа1у-02; ** генотипы В1648, Иа1у-02, Арканзас и рекомбинантные формы вируса ИБК
В-третьих, на территории РФ появились единичные случаи выявления изолятов генотипа Арканзас и рекомбинантных вариантов вируса ИБК.
4. Выводы
1. Разработан специфичный метод ОТ-ПЦР-РВ для выявления фрагмента генома вируса ИБК, аналитическая чувствительность которого составила 1,0 ^ ЭИД50/мл вируса (13 геномных эквивалентов вируса ИБК на реакцию).
2. В результате исследования 1445 проб патологического материала из 300 хозяйств России и стран ближнего зарубежья выявлено 169 изолятов вируса ИБК генотипов Массачусетс (29%), 793В (21%), ОХ (16%), Э274 (12%), В1648 (3%), Иа1у-02 (2%), Арканзас (1%), а также вариантные изоляты с уникальной первичной структурой гена (11%).
3. Вариабельность фрагмента гена внутри генетических групп Массачусетс, 793В, ОХ, Б274, В1648, Иа1у-02, Арканзас не превышала 4,8%, 10%, 7,1%, 5,8%, 8,7%, 3,9%, 8,1%, соответственно. Вариантные изоляты отличались от всех известных вакцинных штаммов более чем на 20% и не были отнесены ни к одной генетической группе.
4. Выделены 8 изолятов вируса ИБК генотипа ОХ. Изолят 1ВУ08-10 обладал цилиостатическим и эмбриопатическим действиями, однако при
экспериментальном заражении птицы разных возрастов, иммунных и неиммунных к вирусу ИБК клинических признаков и патологоанатомических изменений не вызывал.
5. Впервые в РФ выявлены, выделены и охарактеризованы рекомбинантные формы вируса ИБК. Для всех выявленных рекомбинантных форм определены точки рекомбинации на участке 300-470 н.п. гена Б1.
6. Установлено, что на территории РФ в 2005-2011_ гг. по сравнению с данными за период 1998-2004 гг. сократилось количество изолятов вируса ИБК генотипа Массачусетс на 13%, вариантных изолятов - на 21 %, и возросло количество изолятов вируса ИБК генотипа 793 В на 10%, ОХ - на 14%.
5. Практические предложения
В результате проведенных исследований разработан нормативный документ: «Методические указания по выявлению генома вируса инфекционного бронхита кур с использованием полимеразной цепной реакции в режиме реального времени» (утверждены 05.02.2010 г.);
Депонирован в Коллекции штаммов и микроорганизмов ОБТК ФГБУ «ВНИИЗЖ» штамм ИРОв-Ю (1ВУ08-10) вируса инфекционного бронхита кур (справка №6).
6. Список использованной литературы
1. Вирусные болезни животных / В.Н. Сюрин, А.Я. Самуйленко, Б.В. Соловьев, Н.В. Фомина. - М.: ВНИТИБП, 1998. - С. 183-198.
2. Изучение иммунобиологических свойств вариантных полевых штаммов вируса инфекционного бронхита кур, выделенных на территории Российской Федерации / С.В. Фролов, Ю.А. Бочков, Г.В. Батченко [и др.] // Сб. науч. тр. ВГНКИ. - М„ 2005. - Т. 65. - С. 108-119.
3. Изучение инфекционного бронхита кур в России: исторический аспект / Ю. А. Бочков, Г. В. Батченко, Н. Н. Луговская [и др.] // Актуальные проблемы инфекционной патологии животных: материалы Междунар.
науч. конф., посвящ. 45-летию ФГУ "ВНИИЗЖ" - Владимир, 2003.
4. Методические указания по выделению и идентификации полевых изолятов вируса инфекционного бронхита птиц / Г.В. Батченко, Ю.А. Бочков, Н.Н. Луговская [и др.] // ФГУ «ВНИИЗЖ». - Владимир, 2002. -21 с.
5. Методические указания по приготовлению и поддержанию трахеальной органной культуры куриных эмбрионов и цыплят / О.А. Чупина, С.В. Фролов, В.И. Диев, А.В. Борисов // ФГУ "ВНИИЗЖ". - Владимир, 2006. -4 с.
6. Филогенетический анализ изолятов вируса инфекционного бронхита кур, выявленных в России / Ю.А. Бочков, А.В. Борисов, И.О. Щербакова, В.В. Дрыгин // Аграрная Россия. — 2002. - №2. — С. 11-16.
7. Чупина О.А. Протективные особенности изолята «Щелковский» вируса инфекционного бронхита кур / Ветеринарная патология. - 2006. — №4, 19 - С.123-125
8. Cavanagh, D., Naqi S. Infectious bronchitis // Diseases of Poultry. — 11th ed. — Ames, Iowa, 2003.-P. 101-119.
9. Characterization of three infectious bronchitis virus isolates from China associated with proventriculus in vaccinated chickens / L. Yu, Y. Jiang, S. Low [et al.] // Avian Diseases. - 2001. Vol. 45. - P. 416-424.
10. Development and evaluation of a real-time Taqman RT-PCR assay for the detection of infectious bronchitis virus from infected chickens / S.A. Callison, D.A. Hilt, Т.О. Boynton [et a!.] // Archives Virology. - 2007. - Vol. 152, №1, -P. 41-58.
11. Evaluation of the protection conferred by commercial vaccines and attenuated heterologous isolates in China against the CK/CH/LDL/97I strain of infectious bronchitis coronavirus / S. Liu, X. Zhang, Y. Wang [et al.] // Veterinary J. -2009.-Vol. 179.-P. 130-136.
12. Genotyping and serotyping of Guangxi IBV isolates during 1985-2008 / P.L.M. Wei, Z.J. Wei, X.Y. Wang [et al.] // Proceedings of the Vl-th
International Symposium on Avian Corona- and Pneumoviruses and Complicating Pathogens. - Rauischholzhausen, Germany, 2009. - P. 59-66.
13. Jackwood M.W., Hilt D.A., Brown T.P. Attenuation, safety, and efficacy of an infectious bronchitis virus GA98 serotype vaccine // Avian Diseases. - 2003. -Vol. 47. - P. 627-632.
14. Molecular epizootiology of avian infectious bronchitis in Russia / Y.A. Bochkov, G.V. Batchenko, L.O. Shcherbakova [et al.] // Avian Pathology. -2006. - Vol. 35. - P. 379-393.
15. Wang L., Junker D., Hock L. Evolutionary implications of genetic variations in the SI gene of infectious bronchitis virus // Virus Research. — 1994. - Vol.34. - P.327-338.
7. Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. Овчинникова Е.В., Селиверстов А.В. Биологические свойства изолята IBV08-10 вируса инфекционного бронхита кур генотипа QX / Ветеринария и кормление. - 2012. - №5. -С.36-37.
2. Определение генотипа и степени патогенности изолята вируса инфекционного бронхита кур / О.А. Чупина, Е.В. Овчинникова, Л.О. Щербакова [и др.] // Вет. патология. - 2007. - № 4 (23). - С. 121 -126.
3. Диагностика инфекционного бронхита кур / Ю.А. Бочков, А.В. Борисов, С.В. Фролов, В.В. Дрыгин, В.Н. Ирза, Г.В. Батченко, Н.Н. Луговская, Е.В. Овчинникова // Ветеринария. - 2003. - № 4. - С. 21-24.
4. Molecular characterization of infectious bronchitis virus isolates from Russia and neighbouring countries: identification of intertypic recombination in the SI gene / E. Ovchinnikova, Y. Bochkov, L. Shcherbakova, Z. Nikonova [et al.] // Avian Pathology. - 2011. - Vol. 40, №5. - P. 507-514.
5. Генетическая характеристика полевых изолятов вируса инфекционного бронхита кур, выявленных в России в 2004-2005 гг. / Е.В. Овчинникова, Г.В. Батченко, О.А. Чупина [и др.] // Тр. Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2006. - Т. 4. - С. 362-369.
6. Генетическая характеристика полевых изолятов вируса инфекционного бронхита кур, выявленных в России / Е.В. Овчинникова, Ю.А. Бочков, Г.В. Батченко [и др.] // Тр. Федерального центра охраны здоровья животных. - 2007. - Т. 5. - С. 303-316.
7. Диагностика инфекционного бронхита кур. Ситуация в России (2007-2008 гг.) / Е.В. Овчинникова, Л.О. Щербакова, Н.С. Мудрак [и др.] // 5-й Междунар. вет. конгр. по птицеводству. - М., 2009. — С. 66-70
8. Изоляты вируса инфекционного бронхита кур, выявленные в России и ближнем зарубежье в период с 2007 по 2009 годы / Е.В. Овчинникова, Л.О. Щербакова, Н.Г. Зиняков [и др.] // Молекулярная диагностика - 2010: сб. тр. VII Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием. - 2010. - Т. 2. - С. 157-159.
9. Изучение биологических свойств изолята вируса инфекционного бронхита кур IBV663-07 / Е.В. Овчинникова, O.A. Чупина, Л.О. Щербакова [и др.] // Генодиагностика инфекционных болезней: сбор. тр. 6-ой Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием. - 2007. - Т. 2. - С. 40-42.
10. Выявление патогенных микоплазм и вирусов у кур с клиническими признаками респираторной инфекции и теносиновитом на птицефабриках России / A.B. Спрыгин, Е.В. Овчинникова, З.Б. Никонова [и др.] // БИО. -2011. -№3. — С. 19-20.
8. Список сокращений
ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота
ИББ — инфекционная бурсальная болезнь кур
ИБК — инфекционный бронхит кур
ИЛТ — инфекционный ларинготрахеит птиц
кДНК - ДНК-копия с РНК-матрицы
КЭ - эмбрионы кур
НБ — ньюкаслская болезнь птиц
ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией
ОТ-ПЦР-РВ - обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция в
режиме реального времени
ПЦР - полимеразная цепная реакция
РНК - рибонуклеиновая кислота
ЭИД50 - 50%-ная эмбриональная инфицирующая доза
с11ЧТР - дезоксинуклеотидтрифосфаты
БРГ — свободный от специфических патогенов
Подписано в печать 16 ноября 2012 Формат 60x90 1/16. Усл. печ. л. 1. Тираж 80 экз Отпечатано на полиграфической базе ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Овчинникова, Евгения Валерьевна
ВВЕДЕНИЕ.
1. Обзор литературы.
1.1. Характеристика вируса ИБК.
1.1.1. Распространение вируса ИБК в мире.
1.1.2. Структура и свойства вируса ИБК.
1.1.3 Устойчивость к физико-химическим факторам.
1.1.4. Изменчивость вируса ИБК.
1.2. Диагностика ипфекциониого бронхита кур.
1.2.1. Молекулярные методы диагностики.
1.2.2. Серологические методы диагностики.
1.2.3. Выделение вируса ИБК.
1.2.4. Постановка биопробы.
1.3. Тинирование вируса ИБК.
1.4. Патогенез инфекционного бронхита кур.
1.5. Источники и пути передачи инфекции.
1.6. Профилактика ИБК.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-биологические свойства изолятов вируса инфекционного бронхита кур, выявленных на территории России в период с 2005 по 2011 гг."
Актуальность темы. Инфекционный бронхит кур (ИБК) -высококоитагиозное заболевание, которое поражает птиц всех возрастов в хозяйствах мясного и яичного направлений и широко распространено во многих странах. Возбудителем заболевания является РИК-содержащий вирус семейства Coronaviridae, рода Coronavirus. При развитии заболевания поражаются респираторные органы, почки, а также репродуктивные органы кур. Экономические потери связаны со снижением прироста массы тела у цыплят-бройлеров, снижением яичной продуктивности, ухудшением качества яиц у несушек и родительского поголовья 11, 4, 50].
Как и другие РИК-содержащие вирусы, вирус ИБК может быстро мутировать. Давление со стороны иммунной системы хозяина на гетерогенную популяцию вируса, приводит к преимущественному отбору и закреплению тех или иных вариантов вируса. В результате, вирусный геном быстро эволюционирует, порождая широкий спектр штаммов и подтипов [49, 119]. Изменения в геноме вируса ИБК происходят в результате накопления точечных мутаций, инсерций и делений, а также рекомбинации.
Профилактика ИБК значительно осложняется антигенной гетерогенностью его возбудителя. Известно большое количество серотинов, при этом иммунитет, приобретенный к одному серотипу, часто не обеспечивает перекрестной защиты от заражения вирусом других серотинов.
Степень разработанности проблемы. Изучение ИБК в России начато в 1960-е гг. Первые работы посвящены вопросам ассоциированного течения ИБК и бактериальных инфекций, а также определению типовой принадлежности штаммов вируса ИБК, выделенных на птицефабриках России, с помощью перекрестной реакции нейтрализации на КЭ |9|.
Вопросам диагностики ИБК, основанной на молекулярных методах, посвящен ряд работ зарубежных и отечественных авторов. В России в 199798 годах были разработаны методы штаммовой дифференциации вируса ИБК на основе ПЦР и секвепировапия вариабельной области гена SI 11 1 ]. С использованием данных методик показано разнообразие генетических групп вируса ИНК на птицефабриках России в период с 1997 по 2004 гг. Описаны биологические свойства изолята «Таганрогский» генотипа 793 В, «Щелковский» генотипа Массачусетс и изолята «Калужский», отличного по нуклеотидпому составу от известных вакцинных штаммов более чем на 20% |8,25|.
В работах зарубежных авторов описано широкое распространение в мире изолятов вируса ИНК генетической группы ОХ. Для дальнейшей оптимизации средств профилактики заболевания изучены биологические свойства ряда изолятов вируса ИНК данного генотипа [57, 87, 97]. Для России проблема появления и распространения изолятов вируса генотипа ОХ также актуальна, но недостаточно изучена. Высокая изменчивость вируса и скорость распространения вновь появившихся вариантов обусловливают необходимость разработки чувствительного и специфичного метода О'Г-ПЦР-РВ для выявления генома вируса ИНК, постоянного мониторинга циркулирующих изолятов вируса, а также изучения их биологических свойств.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось изучение молскулярно-биологических свойств изолятов вируса ИНК, выявленных на 'территории РФ в период с 2005 но 2011 гг.
Для достижения цели были поставлены задачи:
1. разработать метод выявления генома вируса ИНК в О'Г-ГИ 1.Р-РВ;
2. провести филогенетический анализ изолятов вируса ИНК, выявленных на территории РФ в период с 2005 по 201 1 гг.;
3. выделить изоляты вируса ИНК;
4. изучить молекулярно-биологические свойства изолята вируса ИНК генотипа С>Х;
5. изучить молекулярно-гепстическис свойства рскомбинантпых вирусов ИНК.
Научная новизна исследования. Разработан метод для выявления генома вируса ИБК в ОТ-1ЩР-РВ.
Определена нуклеотидпая последовательность фрагмента гена S1 и создан банк данных 169 изолятов вируса ИБК, выявленных у кур из хозяйств России в 2005-2011 гг.
Впервые в России выявлена и подтверждена клонированием и секвепированием естественная рекомбинация гена S1 вируса ИБК.
Практическая значимость исследования. В результате исследования 1445 проб патологического материала методами ОТ-ШДР-РВ и ОТ-ПЦР установлено преобладание на птицефабриках РФ изолятов вируса ИБК генотипов Массачусетс, 793В, QX и D274.
Выделенные изоляты вируса ИБК генотипа QX могут быть использованы в ФГБУ «ВНИИЗЖ» для разработки диагностических наборов и в качестве компонента полиштамных вакцин против ИБК.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности. В соответствии с формулой специальность 03.02.02 «Вирусология» представляет собой область науки, занимающуюся исследованием вирусов, их происхождения, состава, строения, генетики, морфологии, механизмов размножения, аспектов взаимоотношений с клеточными организмами, проблемами противовирусного иммунитета, патогенности вирусов, разработкой мер и средств предупреждения, диагностики и лечения вызываемых вирусами заболеваний. В диссертации разработаны методические указания по выявлению генома вируса инфекционного бронхита кур с использованием ОТ-ИЦР-РВ, приведены результаты исследований по выявлению и штаммовой дифференциации изолятов вируса ИБК, выявленных на территории России и стран ближнего зарубежья в период с 2005 по 2011 гг., а также описаны биологические свойства изолята IBV08-10 генотипа QX. Результаты научного исследования соответствуют пунктам 4, 6, 8, 10 паспорта специальности.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы представлены и обсуждены на V и VII Международных ветеринарных конгрессах по птицеводству (г. Москва, 2009 и 2011 г.г.), на научно-практических семинарах специалистов птицехозяйств России (Владимир, 2011 и 2012 гг.), на 6-ой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием (г. Москва, 2007 г.), на семинаре для главных зоотехников и главных ветеринарных врачей птицеводческих хозяйств России и стран СНГ (г. Сергиев Посад, 2012 г.), на Международной научно-практической конференции молодых ученых «Достижения молодых ученых - в ветеринарную практику» (г. Владимир, 2012 г.), на заседаниях ученого совета ФГБУ «ВПИИЗЖ» в период с 2005 по 2011 гг.
Публикации научных исследований. По теме диссертационной работы опубликовано 10 научных статей, в том числе 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации.
Основные положении, выносимые на защиту:
- метод ОТ-ПЦР-РВ для выявления генома вируса ИБК в пробах патологического материала;
- сравнительный анализ первичной структуры гена S1 изолятов вируса ИБК, выявленных на территории России и стран ближнего зарубежья в период с 2005 по 2011 гг.;
- молекулярпо-биологические свойства изолята IBV08-10 вируса ИБК генотипа QX;
- молекулярио- генетические свойства рекомбипаитпых форм вируса
ИБК.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 116 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы и приложение. Список литературы включает 25 отечественных и 168 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 17 таблицами и 20 рисунками.
Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Овчинникова, Евгения Валерьевна
5. ВЫВОДЫ
1. Разработан специфичный метод ОТ-ПЦР-РВ для выявления фрагмента генома вируса ИБК, аналитическая чувствительность которого составила 1,0 ^ ЭИД50/мл вируса (13 геномных эквивалентов вируса ИЫ< на реакцию).
2. В результате исследования 1445 проб патологического материала из 300 хозяйств России и стран ближнего зарубежья выявлено 169 изолятов вируса ИБК генотипов Массачусетс (29%), 793В (21%), рХ (16%,), 0274 (12%>), В1648 (3%), Иа1у-02 (2%), Арканзас (1%), а также вариантные изоляты вируса с уникальной первичной структурой гена 81(11%).
3. Вариабельность фрагмента гена 81 внутри генетических групп Массачусетс, 793В, (ЗХ, 0274, В1648, Иа1у-02, Арканзас не превышала 4,8%, 10%, 7,1%о, 5,8%, 8,7%о, 3,9%, 8,1%), соответственно. Вариантные изоляты отличались от всех известных вакцинных штаммов более чем на 20%> и не были отнесены ни к одной генетической группе.
4. Выделены 8 изолятов вируса ИБК генотипа С>Х. Изолят 1ВУ08-10 обладал цилиостатическим и эмбриопатическим действиями, однако при экспериментальном заражении птицы разных возрастов, иммунных и неиммупных к вирусу ИБК клинических признаков и патологоапатомических изменений не вызывал.
5. Впервые в РФ выявлены, выделены и охарактеризованы рекомбипантиые формы вируса ИБК. Для всех выявленных рекомбипаитных форм определены точки рекомбинации на участке 300-470 и.п. гена 81.
6. Установлено, что на территории РФ в 2005-2011 гг. по сравнению с данными за период 1998-2004 гг. сократилось количество изолятов вируса ИБК генотипа Массачусетс па 13%, вариантных изолятов - на 21 %, и возросло количество изолятов вируса ИБК генотипа 793В па 10%, - на 14%.
6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
В результате проведенных исследований разработаны следующие нормативные документы:
Методические указания по выявлению генома вируса инфекционного бронхита кур с использованием полимеразпой цепной реакции в режиме реального времени»;
Депонирован в Коллекции штаммов микроорганизмов ОБТК ФГБУ «ВНИИЗЖ» штамм Шт08-10 вируса инфекционного бронхита кур (ИБК).
4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В результате проведенных исследований был разработан метод ОТ-ПЦР-РВ для выявления генома вируса ИБК с использованием системы праймеров и флуоресцентно-меченого олигопуклеотидиого зонда, выбранных для амплификации фрагмента нетранслируемой области генома вируса (иТИ). Специфичность разработанного метода была продемонстрирована с использованием вакцинных штаммов и изолятов вируса ИБК генотипов Массачусетс, 793В, ОХ, Е) 274, а также вариантного изолята вируса (имеющего более 20% нуклеотидпых отличий от известных вакцинных штаммов) и проб, содержащих другие инфекционные агенты птиц.
В 2005-2011 гг. методами ОТ-ШДР и секвепировапия было исследовано 1445 проб патологического материала от птиц из 300 п тицефабрик России и некоторых стран ближнего зарубежья. Геном вируса ИБК выявили более чем в 35% проб как от вакцинированной, 'так и от нсвакцинировапной птицы разных пород и возрастов. Для гепотипироваиия выявленных изолятов вируса ИБК использовали сравнительный анализ фрагмента гена Б1 длиной 500 н.п. (позиция на геноме 112-653 п.и. относительно штамма Н120), кодирующего поверхностный гликопротеин.
При анализе нуклеотидпых последовательностей фрагментов гена 81 169 изолятов, выявленных в период с 2005 по 2011 гг., было установлено, что на птицефабриках РФ и ближнего зарубежья преобладали изоляты вируса ИБК генотипов Массачусетс (29% от общего числа выявленных изолятов вируса ИБК), 793В (21%), дХ (16%) и 13274 (12%). Кроме того, были выявлены изоляты генетических групп В1648, 11а1у-02, Арканзас, вариан тные изоляты, имеющие более 20% нуклеотидпых отличий от всех вакцинных штаммов и пе относящиеся ни к одной генетической группе, а также рекомбинантные формы вируса ИБК.
Преобладание изолятов генетической группы Массачусетс, возможно связано с применением па птицефабриках РФ преимущественно вакцин на основе штаммов данного генотипа (Ма5, И52, II120). Так же можно объяснить распространение изолятов генотипа 793В и С274, гак как в последние годы вакцины па основе штаммов 4/91 и 1)274 часто используются для профилактики ИБК в России и европейских странах. Кроме того, быстрому распространению изолятов европейских генотипов способствует импорт инкубационного яйца и племенной птицы из стран Европы. Изоляты вируса, генетически близкие штамму ОХ, который был выделен и охарактеризован в Китае в конце 1990-х годов, быстро распространились за последнее десятилетие па птицефабриках России, стран Азии и Европы. Возможно, этому способствовали не только экономические связи, но и способность вируса ИБК бессимптомно инфицировать диких перелетных птиц.
За исследуемый период на территории России выявлены 19 вариантных изолятов с уникальной первичной структурой гена Б1, имеющих более 20% пуклеотидиых отличий от известных вакцинных штаммов и не относящихся ни к одному генотипу. Большинство из них были выявлены в пробах патологического материала, отобранных от кур в возрасте от нескольких до 100 педель. Подобные изоляты преобладали на птицефабриках РФ с 19982004 гг. Возможно, это связано с интенсивным развитием птицеводства и укрупнением птицефабрик в то время. За исследуемый период времени (2005-2011 гг.) число выявлений подобных изолятов значительно снизилось.
За период с 2005 по 2011 гг. возросло количество случаев выявления изолятов вируса ИБК генотипа ОХ па птицефабриках России и стран ближнего зарубежья. Изоляты данной группы были обнаружены на птицефабриках Южного (Краснодарский край, Ростовская область), Центрального (Курская, Ивановская, Тверская, Воронежская, Белгородская области) и Приволжского (Самарская область) Федеральных округов России. Поэтому одной из задач данной работы были выделение и изучение биологических свойств вируса ИБК генотипа ОХ.
Для изучения биологических свойств с использованием С11Фэмбрионов кур выделены 8 изолятов вируса ИБК генетической груши,I ОХ. Были изучены биологические свойства изолята 1ВУ08-10 генотипа ОХ, выделенного от бройлеров птицефабрики Тверской области в 2010 году. Исследуемый изолят обладал цилиостатичсским действием, вызывая атрофию ресничек ТОК через 72 часа после инфицирования, и эмбриопатическим действием, характерным для вируса ИБК. Титр инфекционной акт ивности составил 6,4 ^ ЭИД50/мл. Патогеипость изолята 1ВУ08-10 определяли путем постановки биопробы на цыплятах разных возрастов (7, 21 и 52 сут.), иммунных и нсиммунных к вирусу ИБК. В результате проведенных экспериментов было показано, что изолят 1ВУ08-10 вируса ИБК генотипа ОХ не вызывал у птиц клинических признаков и патологоанатомических изменений, за исключением непродолжительного цилиостаза и легких респираторных расстройств, хотя геном вируса выявляли в пробах внутренних органов (трахея, легкие, почки, кишечник) и ротоголоточпых смывах методом ОТ-ПЦР-РВ на протяжении 28 суток (длительность каждого опыта) после заражения.
Впервые в России и на территории стран ближнего зарубежья, начиная с 2009 года, были выявлены четыре естественных рекомбинанта вируса ИБК (1ВУ02-09 в 2009 году, 1ВУ01-10, 1ВУ03-10 в начале 2010 года и 1ВУ27-11 в октябре 2011 года), родительскими формами которых предположительно были вакцинные штаммы и изоляты вируса ИБК четырех генотипов (Массачусетс, ОХ, 793В, 1)274) в различных сочетаниях.
Сравнительный анализ пуклеотидпой последовательности гена 81 всех четырех рекомбипаптов вируса ИБК показал, что рекомбинация происходила на участке гена 300-470 н.п.
С использованием СПФ-эмбриоиов кур были выделены два рекомбинанта: 1ВУ02-09, родительскими формами которого были вакцинный штамм Н120 и изолят генотипа ОХ, и 1ВУ27-11, появившийся в результате естественной рекомбинации двух изолятов, принадлежащих к генотипам
Массачусетс и 793 В. Оба рекомбипанта проявляли цилиостатичсское и эмбриопатическос действия, характерные для вируса ИБК. Титр инфекционной активности для изолятов 1ВУ02-09 и 1ВУ27-11 составил 6,0 и 6,1 ¡g ЭИД50/мл, соответственно.
В результате анализа иуклеотидиых последовательностей фрагмента гена 81 изолятов, выявленных с 2005 по 201 1 гг., была показана длительная циркуляция изолятов вируса ИНК в хозяйствах. Так, на одной из птицефабрик Саратовской области идентичные по иуклеотидпому составу изоляты выявляли в течение 5 лет. Кроме того, были описаны случаи совместной циркуляции в хозяйстве разных изолятов, принадлежащих к одной или нескольким генетическим фупнам вируса ИБК.
По данным за период с 1998 по 2004 гг. основная часть выявленных изолятов ИБК на территории РФ относилась к генотипу Массачусетс и к вариантным изолятам, эндемичным для России [23, 153). Полученные нами результаты позволяют сделать вывод о том, что в настоящее время ситуация изменилась. Хотя генотип Массачусетс в целом остается преобладающим, уменьшилось число выявлений вариантных изолятов вируса ИБК, увеличилось количество случаев выявления изолятов генотипов С^Х и 793В, появились единичные случаи выявления изолятов генотипа Арканзас и рекомбинантных форм вируса. Вышесказанное свидетельствует о постоянном изменении вируса ИБК и возможности его быстрого распространения.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Овчинникова, Евгения Валерьевна, Владимир
1. Бирман Б.Я. Инфекционный бронхит кур: монография. Минск: техпопринт, 2003. - 133 с.
2. Бобылева Г.А. Общие проблемы птицеводства // VI-й международный ветеринарный конгресс по птицеводству. М., 2010.
3. Бобылева Г.А. Птицеводство России на пороге экспорта // Ценовик. -2011,-№5.-С. 6-8.
4. Вирусные болезни животных / В.II. Сюрин, A.5I. Самуйленко, Б.В. Соловьев, Н.В. Фомина. М.:ВПИТИБП, 1998.-С. 183-198.
5. Гунснкова Н.К., Чистова 3.51., Сюрин В.II. Об антигенных вариантах вируса инфекционного бронхита птиц // Вирусные болезни с.-х животных: материалы 1-й Межвузов, вет. вирусолог. копф.-М., 1970. -Ч. 2.-С. 121-122.
6. Дьяконова Е.В., Шубин В.А. Смешанное течение вирусного бронхита и респираторного микоплазмоза у цыплят // Актуальные, вопр. ветеринар, вирусологии.: материалы III Всесоюз. ветеринар, вирусолог, копф. M., 1967. - Ч. 2. - С. 201-202.
7. Изучение иммунобиологических свойств вариантных полевых штаммов вируса инфекционного бронхита кур, выделенных на территории Российской Федерации / C.B. Фролов, Ю.А. Бочков, Г.В. Батчепко и др. // Сб. науч. тр. ВГНКИ. М, 2005. - Т. 65. - С. 108119.
8. Индикация генома вируса инфекционного бронхита кур с помощью полимеразпой цепной реакции / Бочков Ю.А., Дрыгип В.В., Борисов A.B. и др. // Совр. аспекты вет. патологии ж-ных: Докл. конф. -Владимир, 1998. С. 173-183.
9. Методические указания по выделению и идентификации полевых изолятов вируса инфекционного бронхита птиц / Г.В. Батчепко, Ю.А. Бочков, H.H. Луговская и др.| // ФГУ «ВНИИЗЖ». Владимир, 2002. -21 с.
10. Методические указания по приготовлению и поддержанию трахеальпой органной культуры куриных эмбрионов и цыплят / O.A. Чупина, C.B. Фролов, В.И. Диев, A.B. Борисов // ФГУ "ВНИИЗЖ". -Владимир, 2006. 4 с.
11. Мисиров З.Г. Одновременное течение инфекционного бронхита кур и пуллороза // Актуальные, вопр. ветеринар, вирусологии: тез. докл. 1У Всесоюз. вирусолог, копф. Владимир, 1976. - С. 200-201.
12. Основы общей ветеринарной вирусологии / Б.В. Горький |и др. 2-е изд.-М.: Колос, 1978.-192 с.
13. Сюрин В. II. Ветеринарная вирусология. 2-е изд., перераб. и доп. -М.: Агропромиздат, 1991.-431 с.
14. Сюрин В. П. Руководство по ветеринарной вирусологии. М.: Колос, 1966.-686 с.
15. Сюрин В.II., Белоусова Р.В., Фомина II.В. Инфекционный бронхит кур // Диагностика вирусных болезней живо тных. М., 1991. - С. 235-258.
16. Тсрюханов А.Б. Инфекционный бронхит кур. Л.: Колос, 1976. — 64 с.
17. Филогенетический анализ изолятов вируса инфекционного бронхита кур, выявленных в России / Ю.А. Бочков, A.B. Борисов, Л.О. Щербакова, В.В. Дрыгин // Аграрная Россия. 2002. - №2. - С. 11-16.
18. Четвергип А.Б. Новый взгляд па рекомбинацию РНК // Молекулярная биология. 1999. - N 6. - С. 985-996.
19. Чупина O.A. Протективпые особенности изолята «Щелковский» вируса инфекционного бронхита кур / Ветеринарная патология. 2006. - №4, 19 - С.123-125
20. A "new" strain of infectious bronchitis virus infecting domestic fowl in Great Britain / R.E. Gough, C.J. Randall, M. Dagless |et al. // The Veterinary Record. 1992. - Vol. 130. - P. 493-494.
21. A "novel" infectious bronchitis strain infecting broiler chickens in Italy / T. Capua, R.E. Gough, M. Mancini et al.| // Zentralblatt fur Veterinärmedizin Reihe. В 1994. - Bd, 41. - S. 83-89.
22. A new typing method for the avian infectious bronchitis virus using polymerase chain reaction and restriction enzyme fragment polymorphism /
23. Z. Lin, A. Kato, Y. Kudou |ct al.| // Archives. Virology. 1991. - Vol. 1 16. -P. 19-31.
24. A survey of the prevalence of infectious bronchitis virus type 4/91 in Iran / M.R. Seyii Abad Shapouri, M. Mayahi, K. Assasi, S. Charkhkar // Acta Veterinaria Ilungarica. 2004. - Vol. 52. - P. 163-166.
25. Ahmed Z., Naeem K., Ilameed A. Detection and seroprcvalcnce of infectious bronchitis virus strains in commercialpoultry in Pakistan // Poultry Science.-2007.-Vol. 86.-P. 1329-1335.
26. An emerging recombinant cluster of nephropathogenic strains of avian infectious bronchitis virus in Korea / Т.П. Lim, Il.J. Lee, D.II. Lee ct al.j // Infect. Genet. Evol. 2011. - Vol. 11, №3. - P. 678-685.
27. Analyses of hypervariable region in the 31 non-coding end of the infectious bronchitis virus genome / Л.К. Williams, L. Wang, L.W. Sneed jet al.| // Virus Research. 1993. - Vol. 28. - P. 19-27.
28. Antibodies to avian infectious bronchitis virus in Pakistani chickens / М.Л. Muneer, J.A. Newman, S.M. Goyal, M. Ajmal // Poultry Science. 1987. -Vol. 66.-P. 765-767.
29. Antigenic and molecular characterization of isolates of the Italy 02 infectious bronchitis virus genotype / R. Dolz, J. Pujols, G. Ordonez ct al.| // Avian Pathology. 2006. - Vol. 35. - P. 77-85.
30. Antigenic and S-l genomic characterization of the Delaware variant serotype of infectious bronchitis virus / J. Gelb, C.L Keeler, W.A Nix et al.| // Avian Diseases. 1997. - Vol. 41. - P. 661 -669.
31. Antigenic differentiation of avian bronchitis virus variant strains employing monoclonal antibodies / G.Koch, L. Ilartog, A. Kant et al.j // Israel J. of
32. Veterinary Medicine. 1986. - Vol. 42. - P. 89-97.
33. Antigenic domains on the peplomer protein of avian infectious bronchitis virus: correlation with biological functions / G. Koch, L. Hartog, A. Kant, D.J. van Roozelaar // J. of General Virology. 1990. - Vol. 71. - P. 19291935.
34. Avian infectious bronchitis virus: isolation of an apparently new variant in Italy / A. Zanella, R. Coaro, G. Fabris jet al.) // Veterinary Record. 2000. -Vol. 146. - P. 191-193.
35. Avian infectious bronchitis: characterization of new isolates from Italy / A. Zanella, A. Lavazza, R. Marchi |et al.J // Avian Diseases. 2003. - Vol. 47. -P. 180-185.
36. Bhattacharjee P.S., Jones R.C. Susceptibility of organ cultures from chicken tissues for strains of infectious bronchitis virus isolated from the intestine // Avian Pathology. 1997. - Vol. 26. - P. 553-563.
37. Bhattacharjee P.S., Naylor C.J., Jones R.C. A simple method for fluorescence staining of tracheal organ cultures for the rapid identification of infectious bronchitis virus // Avian Pathology. 1994. - Vol. 23. - P. 471480.
38. Braune M.O., Gentry R.F. Standardization of the fluorescent antibody technique for the detection of avian respiratory viruses // Avian Diseases. -1965.-Vol. 9.-P. 535-545.
39. Callison S.A., Jackwood M.W., Hilt D.A. Molecular characterization ofinfectious bronchitis virus isolates foreign to the United States and comparison with United States isolates // Avian Diseases. 2001. - Vol. 45. -P. 492-499.
40. Cavanagh D., Davis P.J., Mockett A.P. Amino acids within hypervariable region SI of avian coronavirus IBV (Massachusets serotype) spike glycoprotein are associated with neutralizing epitops // Virus Research.1988.-Vol. 1 l.-P. 141-150.
41. Cavanagh D., Ellis M.M., Cook J.K.A. Relationship between sequence variation in the SI spike protein of infectious bronchitis virus and the extent of cross-protection in vivo // Avian Pathology. 1997. - Vol. 26. - P. 63-74.
42. Cavanagh, D. Coronaviruses in poultry and other birds // Avian Pathology. -2005.-Vol. 34.-P. 439-448.
43. Cavanagh, D., Naqi S. Infectious bronchitis // Diseases of Poultry. 11th ed. -Ames, Iowa, 2003.-P. 101-119.
44. Characterisation of an infectious bronchitis virus isolated from vaccinated broiler breeder Hocks / D. Parsons, M.M. Ellis, D. Cavanagh, J.K.A. Cook // Veterinary Record. 1992. - Vol. 31. - P. 408-41 1.
45. Characterisation of strains of infectious bronchitis virus isolated in Chile / A. Cubillos, J. Ulloa, V. Cubillos |et al. // Avian Pathology. 1991. - Vol. 120.-P. 85-99.
46. Characterization of a new genotype and serotype of infectious bronchitis virus in Western Africa / M.E. Ducatez, A.M. Martin, A.A. Owoade et al. // J. of General Virology. 2009. - Vol. 90. - P. 2679-2685.
47. Characterization of infectious bronchitis virus using monoclonal antibodies / P.O. Wainright, P. Villegas, M. Brugh, P.D. Kukert // Avian Diseases.1989.-Vol. 33.-P. 482-490.
48. Characterization of infectious bronchitis viruses isolated from outbreaks of disease in commercial ilocks in Brazil / J. Di Fabio, L.I. Rossini, S.J. Orbell et al. . // Avian Diseases. 2000. - Vol. 44. - P. 582-589.
49. Characterization of new variants of avian infectious bronchitis virus in
50. Tunisia / II. Bourogaa, K. Milcd, L. Gribaa |ct al.| // Avian Diseases.2009.-Vol. 53.-P. 426-433.
51. Characterization of three infectious bronchitis virus isolates from China associated with proventriculus in vaccinated chickens / L. Yu, Y. Jiang, S. I;Ow et al. . // Avian Diseases. 2001. - Vol. 45. - P. 416-424.
52. Chen H.W., Huang Y.P., Wang C.H. Identification of intertypic recombinant infectious bronchitis viruses from slaughtered chickens // Poultry Science.2010.-Vol. 89, №3,-P. 439-446.
53. Chousalkar KL.K., Chectham B.F., Roberts J.R. Detection of infectious bronchitis virus strain N1/88 from the oviduct and feces of experimentally infected vaccinated and unvaccinated hens // Poultry Science. 2010. - Vol. 89, №8.-P. 1603-1608.
54. Chousalkara K.K., Checthamb B.F., Roberts J.R. LNA probe-based realtime RT-PCR for the detection of infectious bronchitis virus from the oviduct of unvaccinated and vaccinated laying hens // J. of Virological Methods. 2009. - Vol. 155. - P. 67-71.
55. Cloning and sequencing of the gene encoding the spike protein of the coronavirus IBV / M.M. Binns, M.K. Boursnell, D. Cavanagh et al. // J. General Virology 1985. - Vol. 66, №4. - P. 719-726.
56. Colwell W.M., Lukert P.D. Effects of avian infectious bronchitis virus (IBV) on tracheal organ cultures // Avian Diseases. 1969. - Vol. 13. - P. 888-894.
57. Comparison of the pathogenicity of QX-like, M41 and 793/B infectious bronchitis strains from different pathological conditions / Z. Benyeda, T. Mato, T. Suveges et al. // Avian Pathology. 2009. - Vol. 38. - P. 449456.
58. Comparison of the spike precursor sequences of coronavirus IBV strains M4I and 6/82 with that of IBV Beaudette / M.M. Binns, M.R Boursnell, P.M. Tomley, D.K. Brown // J. General Virology. 1986. - Vol. 67, №12. -P. 2825-2831.
59. Cook J.K.A. The classification of new serotypes of infectious bronchitis virus isolated from poultry flocks in Britain between 1981 and 1983 // Avian Pathology. 1984.-Vol. 13.-P. 733-741.
60. Cook J.K.A., Darbyshire J.II., Peters R.W. The use of chicken tracheal organ cultures for the isolation and assay of avian infectious bronchitis virus //Archives of Virology. 1976,-Vol. 50.-P. 109-118.
61. Cook J.K.A., Muggins M.B. Newly isolated serotypes of infectious bronchitis virus: their role in disease // Avian Pathology. 1986. - Vol. 15. -P. 129-138.
62. Cowen B.S., Hitchner S.B. Serotyping of avian infectious bronchitis viruses by the virus-neutralization test // Avian Disease. 1975. - Vol. 19, №3. - P. 583-595.
63. Darbyshire J.H., Cook J.K.A., Peters R.W. Comparative growth kinetic studies on avain infectious bronchitis virus in different systems // J. of Comparative Pathology. 1975. - Vol. 85. - P. 623-630.
64. Darbyshire J.H., Cook J.K.A., Peters R.W. Growth comparisons of avian infectious bronchitis virus strains in organ cultures of chicken tissues // Archives of Virology. 1978.-Vol. 56. - P. 317-325.
65. Darbyshire J.II., Cook J.K.A., Peters R.W. Organ culture studies on efficiency of infection with chicken tissues with avian infectious bronchitis virus // British J. of Experimental Pathology. 1976. - Vol. 57. - P. 443454.
66. Davelaar F.G., Kouwenhoven B., Burger A.G. Occurrence and significance of infectious bronchitis virus variant strains in egg and broiler production in the Netherlands // Veterinary Quarterly. 1984. - Vol. 6. - P. 114-120.
67. Detection of IBV antigen by enzyme immunoassay: application for diagnostic purposes / W.G. Hesselink, C. Schrier, E. Jagt, J. Hocks // Proceedings of the I International Symposium on Infectious Bronchitis. -Rauischholzhausen, Germany, 1988. P. 54.
68. Development and evaluation of a real-time Taqman RT-PCR assay for the detection of infectious bronchitis virus from infected chickens / S.A. Callison, D.A. Hilt, T.O. Boynton jet al. // Archives Virology. 2007. -Vol. 152, №1,-P. 41-58.
69. Dhinakar Raj G., Jones R.C. An in vitro comparison of the virulence of seven strains of infectious bronchitis virus using tracheal and oviduct cultures // Avian Pathology. 1996. - Vol. 25, - P. 649-662.
70. Efficace of infectious bronchitis virus vaccine against heterologous challenge / M.A. Muneer, J.A. Newman, D.A. Halvorson et al. // Recearch in Veterinary Science. 1988,- Vol. 45, №1,-P. 22-27.
71. Eid A.A.M. Infectious bronchitis virus infection in Egypt // Proceedings of the International Symposium on Infectious Bronchitis and Pneumovirus Infections in Poultry. Rauischholzhausen, Germany, 1998. - P. 145-156.
72. El-Houadfi M., Jones R.C. Isolation of avian infectious bronchitis viruses in Morocco including an enterotropic variant // Veterinary Record. 1985. -Vol. 116.-P. 445.
73. Emergence of a nephropathogenic avian infectious bronchitis virus with a novel genotype in India / J. Bayry, M.S. Goudar, P.K. Nighot |et al.| // J. of Clinical Microbiology.-2005.-Vol. 43.-P. 916-918.
74. Enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of infectious bronchitis virus (IBV) antigen with monoclonal antibody / II. Nagano, M. Tsuchimoto, T. Ilohdatsu ct al. // Japanese J. of Veterinary Science. -1990.-Vol. 52.-P. 657-659.
75. Epidemiological classification of infectious bronchitis virus isolated in Korea between 1986 and 1997 / C.S. Song, Y.J. Lee, J.11. Kim et al.| // Avian Pathology. 1998. - Vol. 27. - P. 409-416.
76. Evaluation of the protection conferred by commercial vaccines against the California 99 isolate of infectious bronchitis virus / I.R. Alvarado, P. Villcgas, J. El-Attrache, T.P. Brown // Avian Diseases. 2003. - Vol. 47. -P.1298-1304.
77. Evidence of circulation of a Chinese strain of infectious bronchitis virus (QXIBV) in Italy / M.S. Beato, C. De Battisti, C. Terregino et al. // Veterinary Record. 2005. - Vol. 156. - P. 720.
78. Evolution of infectious bronchitis virus in Taiwan: characterisation of RNA recombination in the nuclcocapsid gene / S.M. Kuo, C.I I. Wang, M.I I. 1 Iou |et al. | // Veterinary Microbiology. 2010. - Vol. 144. - P. 293-302.
79. Existence of avian infectious bronchitis virus with a European-prevalent 4/91 genotype in Japan / M. Mase, T. Inoue, S. Yamaguchi, T. Imada // J. of Veterinary Medical Science. 2008. - Vol. 70. - P. 1341 -1344.
80. Gelb J., Wolff J.B., Moran C.A. Variant serotypes of infectious bronchitis virus isolated from commercial layer and broiler chickens // Avian Diseases.- 1991.-Vol. 35.-P. 82-87.
81. Genetic diversity of avian infectious bronchitis virus isolates in ICorea between 2003 and 2006 / E.IC. Lee, W.J. Jcon, Y.J. Lee |et al.| // Avian Diseases. 2008. - Vol. 52. - P. 332-337.
82. Genetic grouping of avain infectious bronchitis virus isolated in Brazil based on RT-PCR/RFLP analysis of the SI gene / M.F.S. Montassier, L. Brentano, II.J. Montassier, L.J. Richtzenhain // Pesquisa Veterinaria Brasileira. 2008. -Vol. 28.-P. 190-194.
83. Genetic grouping of nephropathogenic avian infectious bronchitis virus isolated in Morocco / M. HI-Bouqdaoui, R.A. Mhand, H. Bouayoune, M.M. Lnnaji // International Journal of Poultry Science. 2005. - Vol. 4. - P. 721727.
84. Genetic recombination with poliovirus type 1. Studies of crosses between a normal horse serum-resistant mutant and several guanidinc-resistant mutants of the same strain / N. Ledinko et al. // Virology. 1963. -Vol. 20. - P. 107-119.
85. Gillette K.G. Plaque formation by infectious bronchitis virus in chicken embryo kidney cell cultures // Avian Diseases. 1973. - Vol. 17. - P. 369378.
86. Ilidalgo II., Gallardo R., Rosende S. Isolation of infectious bronchitis virus from broiler chickens in Chile // Avian Diseases. 1976. - Vol. 20. - P.601.603.
87. Hidalgo II., Gallardo R., Toro II. Antigenic and pathogenic properties of three isolates of infectious bronchitis virus obtained from vaccinated chickens//J. of Veterinary Medicine. 1986.-Vol. 33.-P. 26-35.
88. Hipo'lito O. Isolamento e identificaca o do virus da bronquite infecciosa das galinhas no Brasil // Arquivo Escuela Vcterinaria Universidade de Minas Gerais.- 1957.-Vol. 10.-P. 131-151.
89. I litchner S.B., White P.G. Growth curve studies of chick embryo-propagated infectious bronchitis virus // Poultry Science. 1955. - Vol. 34. - P. 590594.
90. Ilitchner S.B., Winterfield R.W., Applcton G.S. Infectious bronchitis virus types-incidence in the United States. // Avian Diseases. 1966. - Vol. 10. -P. 98-102.
91. Holmes K.V., Doller E.W., Bchnre J.N. Analysis of the function of coronavirus glycoproteins by differential inhibition of synthesis with tunicamycin//Adv. Exp. Med. Biol. 1981.-Vol. 142.-P. 133-142.
92. Holmes K.V., Doller E.W., Sturman L.S. Tunicamycin resistant glycosylation of a coronavirus glycoprotein: demonstration of a novel type of viral glycoprotein // Virology. -181,- Vol. 1 15. P. 334-344.
93. Hopkins S.R. Serological comparisons of strains of infectious bronchitis virus using plaque-purified isolants // Avian Diseases 1974. - Vol. 18. - P. 231-239.
94. Huang Y.P., Wang C.H. Development of attenuated vaccine from Taiwanese infectious bronchitis virus strains // Vaccine. 2006. - Vol. 24. - P. 785791.
95. Identification of a novel nephropathogenic infectious bronchitis virus in Israel / R. Meir, E. Rosenblut, S. Perl |ct al.| // Avian Diseases. 2004. -Vol. 48.-P. 635-641.
96. Ignjatovic J., Ashton I\ Detection and differentiation of avian infectious bronchitis viruses using a monoclonal antibodybased EL1SA // Avian
97. Ignjatovic J., Sapats S. Avian infectious bronchitis virus // Revue Sci. Tech. -2000.-Vol. 19.-P. 493-508.
98. Incidence, characterisation and prophylaxis of nephropathogenic avian infectious bronchitis viruses / G. Meulemans, M.C. Carlicr, M. Gonze |ct al.| // Veterinary Record. 1987. - Vol. 120. - P. 205-206.
99. Isolation and identification of glandular stomach type IBV (QX IBV) in chickens / W. Yu Dong, W. Yong Lin, Z. Zi Chun et al.| // Chinese J. of Animal Quarantine. 1998. - Vol. 15. - P. 1-3.
100. Isolation of "variant" strains of infectious bronchitis virus from vaccinated chickens in Great Britain / R.E. Gough, W.J. Cox, E. Gutierrez et al.| // Veterinary Record. 1996. - Vol. 139. - P. 552.
101. Isolation of 4/91 type of infectious bronchitis virus as a new variant in Japan and efficacy of vaccination against 4/91 type field isolate / Y. Shimazaki, T. I-Ioriuchi, M. l larada jet al.| // Avian Diseases. 2008. - Vol. 52. - P. 618622.
102. Isolation of avian infectious bronchitis coronavirus from domestic peafowl (Pavo cristatus) and Leal (Anas)./ S. Liu, J.Chen, J. Chen |el al) // J. of General Virology. 2005. - Vol. 86. - P. 719-725.
103. Isolation of new stains of IBV from broiler chickens in Poland / Z. Minta, P. Bugajek, E. Karpinska et al.j // International Symposium on Infectious Bronchitis and Pneumovirus Infections in Poultry. Rauischholzhausen, Germany, 1998.-P. 180-188.
104. Isolation, characterisation and preliminary cross-protection studies with a new pathogenic avian infectious bronchitis virus (strain PL-84084) / J.P. Picault, P. Drouin, M. Guittet |et al. // Avian Pathology. 1986. - Vol. 15. -P. 367-383.
105. Jackwood M.W., I lilt D.A., Brown T.P. Attenuation, safety, and efficacy of an infectious bronchitis virus GA98 serotype vaccine // Avian Diseases. -2003,- Vol.47. P. 627-632.
106. Johnson R.B., Marquardt W.W. Strains of infectious bronchitis virus on the Delmarva peninsula and in Arkansas // Avian Diseases. 1976. - Vol. 20. -P. 382-386.
107. Jones R.C. Use of a combined fluorescent antibody-trachea 1 organ culture method for the study of infectious bronchitis virus // Proceedings of the Vth World's Veterinary Poultry Association Conference. Munich, West Germany, 1973. - P. 66-69.
108. Khatchikian D., Orlich M., Rott R. Increased viral pathogenicity after insertion of a 28S ribosomal RNA sequence into the haemagglutinin gene of an influenza virus // Nature. 1989.-Vol. 13.-P. 156-157.
109. Kottier S.A., Cavanagh D., Britton P. Experimental evidence of recombination in coronavirus infectious bronchitis virus // Virology. 1995. -Vol. 10.-P. 569-580.
110. Ladman B.S., Loupos A.B., Gelb J. Infectious bronchitis virus SI gene sequence comparison is a better predictor of challenge of immunity in chickens than serotyping by virus neutralization // Avian Pathology. 2006. -Vol. 35.-P. 127-133.
111. Lee C.W., Jackwood M.W. Origin and evolution of Georgia 98 (GA98), a new serotype of avian infectious bronchitis virus // Virus Research. 2001. -Vol. 28, 80 №1-2. -P. 33-39.
112. Lee S.K., Sung H.W., Kwon H.M. SI glycoprotein gene analysis of infectious bronchitis viruses isolated in Korea // Archives of Virology. -2004.-Vol. 149.-P. 481-494.
113. Liao C.L, Lai M.M. RNA recombination in a coronavirus: recombination between viral genomic RNA and transfected RNA fragments // J Virology. -1992. Vol. 66, №10. - P. 6117-6124.
114. Location of the amino acid differences in the SI spike glycoprotein subunit of closely related serotypes of infectious bronchitis virus / D. Cavanagh, P.J. Davis, J.K.A. Cook ct al.| // Avian Pathology. 1992. - Vol. 21. - P. 3343.
115. Lohr J.E. Diagnosis of infectious bronchitis (IB) by examination of tracheal mucus for IB-precipitating antigens // Avian Diseases. 1981. - Vol. 25. -P. 1058-1064.
116. Lohr J.E. Serologic differences between strains of infectious bronchitis virus from New Zealand, Australia, and the United States // Avian Diseases. -1976.-Vol. 20.-P. 478-482.
117. Lohr J.E. Studies on avian infectious bronchitis virus in New Zealand. I. Serotypes // New Zealand Veterinary J. 1977. - Vol. 25. - P. 48-51.
118. Lohr, J.E. Infectious bronchitis in New Zealand, Asia, East Europe // Proceedings of the 1st International Symposium on Infectious Bronchitis. -Rauischholzhausen, Germany, 1988. P. 70-75.
119. Longitudinal studies of infectious bronchitis virus and avian pneumovirus in broilers using type-specific polymerase chain reactions / D. Cavanagh, K. Mawditt, P. Britton, C.J. Naylor // Avian Pathology. 1999. - Vol. 28. - P. 593-605.
120. Lucio B., Ilitchner S.B. Differentiation of avian infectious bronchitis virus serotypes by immunofluorescence // Avian Diseases. 1970. - Vol. 14. - P. 9-24.
121. Lukcrt P.D. Comparative sensitivities of embryonating chicken's eggs and primary chicken embryo kidney and liver cell cultures to infectious bronchitis virus // Avian Diseases. 1965. - Vol. 9. - P. 308-316.
122. Lulcert P.D. Differentiation and detection of infectious bronchitis virus subtypes by immunofluorescence // Avian Diseases. 1969. - Vol. 13. - P. 847-852.
123. Lukcrt, P.D. Immunofluorescence of avian infectious bronchitis virus in primary chicken embryo kidney, liver, lung and fibroblast cell cultures // Archives fur Virusforschung. 1966. - Vol. 19. - P. 265-272.
124. McFarlane R., Verma R. Sequence analysis of the gene coding for the SI glycoprotein of infectious bronchitis virus (IBV) strains from New Zealand // Virus Genes. 2008. - Vol. 37. - P. 351-357.
125. McKinlcy E.T., Hilt D.A., Jackwood M.W. Avian Coronavirus infectious bronchitis attenuated live vaccines undergo selection of subpopulations and mutations following vaccination // Vaccine. 2008. - Vol. 26, №10. - P. 1274-1284.
126. Mockett A.P.A., Cavanagh D., Brown T.D. Monoclonal antibodies to the SI spike and membrane proteins of avian infectious bronchitis Coronavirusstrain Massachusetts M41 // J. of General Virology. 1984. - Vol. 65. - P. 2281-2286.
127. Mohanty S.B., DeVolt II.M., Faber J.Ii A fluorescent antibody study of infectious bronchitis virus // Poultry Science. 1964. - Vol. 43. - P. 179182.
128. Molecular and serologic characterization, pathogenicity, and protection studies with infectious bronchitis virus field isolates from California / M.W. Jackwood, D.A. Hilt, S.M. Williams jet al. // Avian Diseases. 2007. -Vol. 51.-P. 527-533.
129. Molecular characterization of avian infectious bronchitis virus strains from outbreaks in Argentina (2001-2008) / A. Rimondi, M.I. Craig, A. Vagnozzi |et al.| //Avian Pathology. 2009. - Vol. 38. - P. 149-153.
130. Molecular characterization of infectious bronchitis virus strains isolated from the enteric contents of Brazilian laying hens and broilers / L.Y. Villarreal, P.L. Brandao, J.L. Chacon ct al.j // Avian Diseases. 2007. -Vol. 51.-P. 974-978.
131. Molecular epidemiology and evolution of avian infectious bronchitis virus in Spain over a fourteen-year period / R. Dolz, J. Pujols, G. Ordonez et al. // Virology. 2008. - Vol. 374. - P. 50-59.
132. Molecular epidemiology of avian infectious bronchitis in Brazil from 2007 to 2008 in breeders, broilers, and layers / L.Y. Villarreal, T.L. Sandri, S.P. Souza | et al. | // Avian Diseases. 2010. - Vol. 54. - P. 894-898.
133. Molecular epizootiology of avian infectious bronchitis in Russia / Y.A. Bochkov, G.V. Batchenko, L.O. Shcherbakova ct al.| // Avian Pathology. -2006.-Vol. 35.-P. 379-393.
134. Morlcy A.J., Thomson D.IC. Swollen-head syndrome in broiler chickens // Avian Diseases. 1984. - Vol. 28. - P. 238-243.
135. Naqi S.A., Karaca K., Bauman B. A monoclonal antibodybased antigen capture enzyme-linked immunosorbent assay for identification of infectious bronchitis virus serotypes // Avian Pathology. 1993. - Vol. 22. - P. 555564.
136. Naturally occurring recombination between distant strains of infectious bronchitis virus / K. Mardani, A.H. Noormohammadi, J. Ignjatovic, G.F. Browning//Archives Virology. 2010. - Vol. 155.-P. 1581-1586.
137. Orchitis in roosters with reduced fertility associated with avian infectious bronchitis virus and avian metapneumovirus infections / L.Y. Villarreal, P.H. Brandao, J.L. Chacon et al. // Avian Diseases. 2007. - Vol. 51. - P. 900904.
138. Pathogenicity of Australian strains of avian infectious bronchitis virus / J. Ignjatovic, D.F. Ashton, R. Reece |et al. // J. of Comparative Pathology. -2002.-Vol. 126.-P. 115-123.
139. Pensaert M., Lambrechts C. Vaccination of chickens against a Belgian nephropathogenic strain of infectious bronchitis virus B1648 using attenuated homologous and heterologous strains // Avian Pathology. 1994. -Vol. 23.-P. 631-641.
140. Peters R.W., Darbyshire J.II., Cook J.K.A. The susceptibility of chicken kidney and oviduct organ cultures to a vaccine strain of avian infectious bronchitis virus // Research in Veterinary Science. 1979. - Vol. 26. - P. 38-40.
141. Phylogenetic analysis of avian infectious bronchitis virus strains isolated in
142. Japan / M. Masc, IC. Tsukamoto, K. Imai, S. Yamaguchi //Archives of Virology.-2004.-Vol. 149.-P. 2069-2078.
143. Present status of infectious bronchitis in Egypt / A. Sheble, M.Z. Sabry, F.G. Davelaar et al.| // J. of the Egyptian Veterinary Medical Association. -1986.-Vol. 46.-P. 393-41 1.
144. Pringle C.R. Evidence of genetic recombination in foot-and-mouth disease virus // Virology. 1965. - Vol. 25. - P. 48-54.
145. Protection afforded infectious bronchitis virus-vaccinated sentinel chickens raised in a commercial environment / J. Gelb, J.K. Rosenberger, P.A. Erics |et al. 1 //Avian Diseases. 1989.-Vol. 33. - P. 764-769.
146. Protection of chickens after live and inactivated virus vaccination against challenge with nephropathogenic infectious bronchitis virus PA/Wolgcmuth/98 / B.S. Eadman, C.R. Pope, A.F. Ziegler et al.j // Avian Disease. 2002. - Vol. 46, №4. - P. 938-944.
147. Protection of chickens against renal damage caused by a nephropathogenic infectious bronchitis virus / J.K.A. Cook, J. Chesher, W. Baxcndale |ct al. j // Avian Pathology. 2001. - Vol. 30. - P. 423-426.
148. Purchase II.G., Cunningham C.I I., Burmester B.R. Genetic differences among chicken embryos in response to inoculation with an isolate of infectious bronchitis virus // Avian Diseases. 1966. - Vol. 10. - P. 162172.
149. Rapid heat-treatment attenuation of infectious bronchitis virus / M.W.
150. Jackwood, D.A. I lilt, U.S. Sellers et al. // Avian Pathology. 2010. - Vol. 39.-P. 227-233.
151. Recombination in Avian Gamma-Coronavirus Infectious Bronchitis Virus Sharmi / W. Thor, D. A. ililt, J. C. Kissinger (et al. // Viruses. 201 1. -Vol.3, №9.-P. 1777-1799.
152. Roussan D.A., Totanji W.S., Khawaldeh G.Y. Molecular subtype of infectious bronchitis virus in broiler flocks in Jordan // Poultry Science. -2008.-Vol. 87.-P. 661-664.
153. SI and N gene analysis of avian infectious bronchitis viruses in Taiwan / Y.P. Huang, I I.C. Lee, M.C. Cheng, C.I I. Wang // Avian Diseases. 2004. -Vol. 48.-P. 581-589.
154. SI gene characteristics and efficacy of vaccination against infectious bronchitis virus field isolates from the United States and Israel (1996 to 2000) / J. Gelb, Y. Weisman, B.S. Ladman, R. Meir // Avian Pathology.2005.-Vol. 34.-P. 194-203.
155. SI gene sequence analysis of a ncphropathogenic strain of avian infectious bronchitis virus in Egypt / A.S. Abdel-Moncim, M.F. Ll-Kady, B.S. Ladman, J.Gelb // Virology J. 2006. - Vol. 3. - P. 78.
156. Schalk A.F., Hawn M.C. An apparently new respiratory disease of baby chicks//J. Am. Vet. Med. Assoc. 1931.-Vol. 78.-P. 413-422.
157. Sequence evidence for RNA recombination in field isolates of avian coronavirus infectious bronchitis virus / J.G. Kusters, E.J. Jager, H.G.M. Nicsters, B.A.M. van der Zeijst // Vaccine. 1990. - Vol. 8. - P. 605-608.
158. Serotypes of avian infectious bronchitis virus isolates from field cases in Japan / M. Doi, T. Yamakami, H. Koimaru el al. . // Avian Diseases. 1982. - Vol. 26.-P. 946-956.
159. Stern D.F., Kennedy S.l. Coronavirus multiplication strategy. 1. Identification and characterization of virus specified RNA // J. Virology. -1980,-Vol. 34. P. 665-674.
160. Studies on avian bronchitis virus (IBV). Propagation of IBV in several cultured cells / K. Otsuki, K. Noro, II. Yamamoto, M. Tsubokura // Archives of Virology. 1979. -Vol. 60. - P. 115-122.
161. The isolation and characterisation of six avian infectious bronchitis viruses isolated in Morocco / M. El-Houadfi, R.C. Jones, J.K.A. Cook, A.G. Ambali //Avian Pathology. 1986.-Vol. 15.-P. 93-105.
162. Wang C.H., Huang Y.C. Relationship between serotypes and genotypes based on the hypervariable region of the SI gene of infectious bronchitis virus // Archives of Virology. 2000. - Vol. 145. - P. 291-300.
163. Wang C.IL, Tsai C.T. Genetic grouping for the isolates of avian infectious bronchitis virus in Taiwan // Archives of Virology. 1996. - Vol. 141. - P. 1677-1688.
164. Wang L., Junker D., Hock L. Evolutionary implications of genetic variations in the SI gene of infectious bronchitis virus // Virus Research. 1994. -Vol.34. -P.327-338.
165. Worthington K.J., Currie R.J., Jones R.C. A reverse transcriptase-polymerase chain reaction survey of infectious bronchitis virus genotypes in Western Europe from 2002 to 2006 // Avian Pathology. 2008. - Vol. 37. -P. 247-257.
166. Yagyu K., Ohla S. Dclcction of infectious bronchitis virus antigen from experimentally infected chickens by indirect immunofluorescent assay with monoclonal antibody // Avian Diseases. 1990. - Vol. 34. - P. 246-252.
167. Yagyu K., Ohta S. Enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of infectious bronchitis virus antigens // Japanese J. of Veterinary Science. -1987.-Vol. 49.-P. 757-763.
168. Zulperi Z.M., Omar A.R., Arshad S.S. Sequence and phylogenctic analysis of SI, S2, M, and N genes of infectious bronchitis virus isolates from Malaysia // Virus Genes. 2009. - Vol. 38. - P. 383-391.
169. Zwaagstra K.A., Van der Zciist B.A., Kusters J.G. Rapid detection and identification of avian infectious bronchitis virus // J. Clin. Microbiology. -1992.-Vol. 30, №1.-P. 79-84.
-
Овчинникова, Евгения Валерьевна
-
кандидата биологических наук
-
Владимир, 2012
-
ВАК 03.02.02
- Иммунобиологические свойства вируса инфекционного бронхита кур генотипа QX
- Метод штаммовой дифференциации вируса инфекционного бронхита кур и анализ изолятов вируса, выделенных на территории России
- Филогенетический анализ изолятов реовируса кур и изучение биологических свойств изолята ARV04/02rus, выделенного на территории РФ
- Изучение первичной структуры генома изолятов вируса высокопатогенного гриппа птиц A/H5N1, выделенных на территории Российской Федерации
- Биологические свойства вирулентных штаммов вируса болезни Марека
