Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Иммунобиологические свойства вируса инфекционного бронхита кур генотипа QX

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Иммунобиологические свойства вируса инфекционного бронхита кур генотипа QX"

На правах рукописи

АБДУЛЛОЕВ ХУШБАХТ САТТОРОВИЧ

ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО БРОНХИТА КУР ГЕНОТИПА С}Х

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

15 АПР 2015

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Владимир - 2015

005567381

005567381

Работа выполнена в ФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов» и ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»),

Научный руководитель: Макаров Владимир Владимирович, доктор

биологических наук, профессор кафедры клинической ветеринарии ФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов»

Научный консультант: Фролов Сергей Владимирович, кандидат

ветеринарных наук, заведующий лабораторией профилактики болезней птиц ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»)

Официальные оппоненты: Виткова Ольга Николаевна, кандидат

ветеринарных наук, ФГБУ «Центральная научно-методическая ветеринарная лаборатория», заместитель директора.

Ярыгина Елена Игоревна, доктор биологических наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина», (ФГБОУ ВПО «МГАВМиБ»), заведующий кафедрой

Ведущая организация - Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности (ГНУ ВНИТИБП), г. Щелково

Защита состоится 2 июня 2015 года в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 220.015.01 при ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), г. Владимир, мкр. Юрьевец.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ВНИИЗЖ» (г. Владимир). Полный текст диссертации, автореферата и отзыв научного руководителя размещены на официальном сайте ФГБУ «ВНИИЗЖ» www.arriah.ru.

Автореферат разослан «01» апреля 2015 г.

Учёный секретарь совета по защите

докторских и кандидатских

диссертаций ФГБУ «ВНИИЗЖ», А)

кандидат биологических наук/^й^урггт/1-'/"Жбанова Татьяна Валентиновна

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1 Актуальность темы. Инфекционный бронхит кур - вирусная контагиозная болезнь кур, возбудителем которой является представитель семейства Coronaviridae, Avian infectious bronchitis virus. Болезнь имеет широкое распространение и поражает птиц всех возрастов и направлений продуктивности. Характеризуется многообразием клинических признаков, вызывая поражения респираторной, мочевыделительной, репродуктивной и пищеварительной систем. Развитие заболевания среди восприимчивого поголовья сопровождается значительными экономическими потерями, которые складываются из гибели молодняка птиц (до 20% поголовья), снижения привесов, снижения яичной продуктивности и др.

В разный период времени на конкретных территориях имеет распространение определённый антигенный спектр вируса ИБК. Так, на примере Европы можно проследить, что голландские варианты вируса ИБК (штаммы D1466, D274) были доминирующими в 1980-е гг., серотип UK793B (штамм 4/91) - в начале 1990-х гг., итальянские штаммы серотипа Italy 02 - в конце прошлого века и начале этого, а в последнее время широко распространился китайский вирус, относящийся к генотипу QX [6].

Вирусы, относящиеся к генотипу QX, вызывают различные клинические формы болезни и были выделены как от невакцинированной, так и от вакцинированной птицы [7]. Вирус ИБК генотипа QX был выявлен в РФ на Дальнем Востоке еще в 2001 г. [3], затем вирус был обнаружен и в европейской части РФ [3, 6]. В РФ за последние годы было выделено несколько изолятов, относящихся к генотипу QX из птицехозяйств Ивановской, Ростовской, Ульяновской областей и Краснодарского края. В связи с выделением в РФ относительно нового и малоизученного вируса ИБК генотипа QX существует научный и практический интерес к изучению его иммунобиологических свойств. Таким образом, изучение иммунобиологических свойств вируса ИБК генотипа QX штамма IBV RF 08-10 (далее по тексту штамм QX) является актуальной задачей ветеринарной науки и практики.

1.2 Степень разработанности проблемы. Впервые вирус ИБК генотипа QX был выделен и охарактеризован учеными из КНР, которые выделили вирус от бройлеров с поражением железистого желудка. Позже генетически идентичные вирусы выявляли в странах ЕС, в РФ от больных птиц с признаками нефрозо-нефрита и патологией репродуктивной системы. Генетически схожие изоляты вируса ИБК, выделенные в разных странах, стали называть «QX-подобными». Было доказано, что последовательная иммунизация цыплят против ИБК вакцинами из разных серотипов: Mass и 793/В -обеспечивает высокий уровень защиты против заражения вирулентным вирусом генотипа QX [7]. В плане вирусологических исследований вируса генотипа QX, помимо работ зарубежных учёных, некоторый опыт имеется и в ФГБУ «ВНИИЗЖ».

1.3 Цель и задачи исследования. Целью настоящей диссертационной работы являлось комплексное изучение иммунобиологических свойств вируса ИБК генотипа QX, выделенного на территории РФ в 2010 г.

В рамках основной цели были определены следующие задачи:

- провести анализ эпизоотической ситуации по ИБК в мире и в РФ, где этиологическим агентом выступает вирус генотипа QX;

- определить динамику накопления вируса ИБК штамма QX в куриных эмбрионах;

- установить возможность адаптации вируса ИБК к культурам клеток различного происхождения и определить влияние адаптации на антигенные свойства вируса;

- изучить антигенные свойства в реакции нейтрализации;

- определить патогенность штамма QX для птицы разного возраста;

- оценить протективные свойства коммерческой вакцины из серотипа Mass против заражения вирусом генотипа QX.

1.4 Научная новизна исследований. В процессе исследований были получены следующие результаты, представляющие научный интерес:

1. Проанализирована эпизоотическая ситуация по ИБК, где этиологическим агентом является вирус генотипа QX, оценена степень распространенности вируса данного генотипа в РФ и в мире.

2. Определена динамика накопления вируса ИБК штамм QX в КЭ. Установлены условия для адаптации вируса к культурам клеток различного происхождения и продемонстрировано отсутствие влияния культивирования в искусственных условиях на антигенную структуру вируса.

3. Выявлена степень антигенного родства вируса ИБК штамм QX, выделенного на территории РФ, относительно референс-штаммов вируса. Показано, что штамм QX имеет значительное антигенное отличие от референс-штаммов вируса ИБК.

4. Определена степень патогенности вируса в экспериментальных условиях для птиц разного возраста и установлено его негативное влияние на органы респираторной, мочевыделительной и репродуктивной систем.

1.5 Практическая и теоретическая значимость исследования. В процессе научно-исследовательской работы по теме диссертации были разработаны три методических рекомендации (одобрены ученым советом и утверждены заместителем директора ФГБУ «ВНИИЗЖ» в 2014 г.).

Результаты, полученные при выполнении работы, позволили оценить эпизоотическую ситуацию по ИБК генотипа QX в мире и в РФ. Установлены основные иммунобиологические свойства вируса ИБК штамма QX, такие, как культуральные свойства, патогенность для птицы разного возраста, интенсивность репродукции вируса на неиммунной и иммунной птице с использованием непрямых методов обнаружения вируса (оценка цилиарной активности трахеи и ПЦР-РВ), изучена протективная активность коммерческой вакцины из серотипа Mass в отношении вируса штамма QX.

1.6 Основные положения, выносимые на защиту:

1. Анализ эпизоотической ситуации по ИБК, где этиологическим агентом является вирус генотипа QX, и оценка степени распространенности вируса данного генотипа в России и в мире.

2. Динамика накопления вируса ИБК штамм QX в куриных эмбрионах. Условия для адаптации вируса ИБК к культурам клеток различного происхождения и их влияние на антигенные свойства вируса.

3. Степень антигенного родства штамма QX с референс-штаммами вируса ИБК.

4. Оценка протективных свойств коммерческой вакцины из серотипа Mass против заражения вирусом штамма QX.

5. Подход к изучению интенсивности патологического процесса, инициируемого вирусом ИБК в организме птицы на основе непрямых методов обнаружения вируса (оценка цилиарной активности трахеи и ПЦР-РВ).

1.7 Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена самостоятельно. В ходе выполнения работы практическую и консультативную помощь оказывали сотрудники ФГБУ «ВНИИЗЖ» В.Ю. Кулаков, Д.Л. Долгов, Б.Л. Манин, Е.В. Овчинникова и руководитель ООО «Тест-Пущино» М.В. Возняк, за что автор выражает им искреннюю признательность.

1.8 Степень достоверности и апробация результатов. Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на научно-практических конференциях: «Популяционное здоровье животных и эмерджентные инфекции в современных условиях». (Международная научно-практ. конф., Волгоград, 2013); «Современные проблемы гуманитарных и естественных наук» (XVI Международная науч.-практ. конф., Москва, 2013); «Инновационные процессы в АПК» (VI Международная науч.-практ. конф. преподавателей, молодых ученых, аспирантов и студентов, Москва, 2014).

Промежуточные результаты экспериментов вошли в материалы ежегодных отчетов лаборатории профилактики болезней птиц ФГБУ «ВНИИЗЖ» 2013-2014гг.

1.9 Публикация научных исследований. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работы, в том числе 3 работы в изданиях, рекомендованных ВАК РФ для кандидатских и докторских диссертаций.

1.10 Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 115 страницах компьютерного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение, выводы, практические предложения и список литературы, который состоит из 194 источников, в том числе 171-зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 14 таблицами, 11 рисунками и дополнена приложением аннотаций документов.

2 Собственные исследования 2.1Материалы и методы

Штаммы вируса ИБК. Н120 серотип Mass, D274 серотип D207, 4/91

серотип 793/В, IBV RF 08-10 генотип QX , LI 148 серотип D388.

Эмбрионы кур, культуры клеток. Эмбрионы кур 9-11- и 20-21-суточного срока инкубации, категории СПФ фирмы Lohman Tiehrzuch (Германия). В опытах использовали следующие культуры клеток: первично трипсинизированные культуры фибробластов (ФЭК) и почек эмбрионов кур (ПЭК), перевиваемую культуру клеток почки зеленой африканской мартышки (клетки Vero), почки КРС (MDBK), почки теленка (RBT), трахеальную органную культуру (ТОК) куриных эмбрионов.

Птицы. Цыплята, выведенные из оплодотворенных СПФ-яиц.

Оценка эпизоотической ситуации. Объектом исследования являлись результаты лабораторных исследований, оригинальных работ и первичных публикаций по нозогеографии, эпизоотологии ИБК. Поиск доказательной информации осуществлен в базах данных (PubMed, OIE Publications) и научных изданиях «Avian Disease», «Avian Pathology».

Культивирование вируса ИБК. Для вирусологических исследований использовали вирус ИБК в составе ЭЭЖ КЭ. Культивирование на КЭ проводили по общепринятой методике [4].

Оценка репродуктивной способности вируса ИБК штамма QX на культурах клеток. Репродуктивную способность вируса ИБК в культурах клеток изучали путем выполнения серийных «слепых» пассажей.

Титрование вируса. Применяли стандартный метод последовательных разведений. Расчет величины инфекционного титра вируса проводили по методу Кербера через 7 суток инкубации.

Реакция нейтрализации. Для постановки реакции нейтрализации использовали ТОК по методике О.А. Чупиной с модификациями [2]. За основу РН брали стандартный, классический метод, описанный в Руководстве по вирусологии [4].

Оценка защиты цыплят против контрольного заражения после вакцинации. Эффективность вакцинации исследовали согласно руководству МЭБ и методическим рекомендациям [5], где учитывали следующие параметры: клинико-патологоанатомическое проявление болезни, активность ресничек мерцательного эпителия трахеи, наличие вирусного генома в органах мишени с помощью ПЦР.

ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) и секвенирование фрагмента гена S1. ОТ-ПЦР проводили согласно методике Ю.А. Бочкова [3]. Определение нуклеотидной последовательности фрагмента гена S1 вируса ИБК осуществляли по методу Сэнгера с использованием флуоресцентно меченных терминирующих нуклеотидов на автоматическом секвинаторе ABI Prism 3130 (Applied Biosystems, США).

Обработка результатов экспериментов. Применяли стандартные методы обработки выборок варьирующих переменных, в том числе с использованием непараметрической статистики [1]. Вычислительные операции и графические построения выполняли с помощью приложения Microsoft Office Excel.

2.2 Результаты исследований 2.2.1 Вирус ИБК генотипа QX. Эпизоотическая ситуация в мире и степень распространения на территории РФ

Нозоареял вируса ИБК генотипа QX. На основании анализа научных публикаций, содержащих информацию об ИБК генотипа QX в период с 1996 по 2014 гг., была построена хронология начальных этапов распространения

возбудителя, проведено картографирование неблагополучных территорий и определен нозоареал. Вирус ИБК, демонстрирующий несвойственную данному вирусу клиническую картину болезни (провентрикулит - воспаление железистого желудка), был обнаружен в сентябре 1996 г. в провинциях Циндао и Шандонг в КНР. В сравнении с известными в то время генотипами вируса ИБК, структура генома выделенного вируса имела существенные отличия в гене S1. На этом основании выделенный изолят был определен как вирус ИБК отдельного генотипа QX.

В РФ распространение вируса ИБК генотипа QX было отмечено в 2001 г. на территории Дальнего Востока, и в 2002 г. - на европейской части.

В Европе первые сообщения о циркуляции этого генотипа, появились в Голландии в 2003 г. В период с 2003 по 2004 гг. болезнь была выявлена у бройлеров и характеризовалась поражением почек. Среди кур-несушек болезнь проявлялась повреждением репродуктивных органов.

В последние 10 лет изоляты вируса ИБК, генетически родственные китайскому вирусу (так называемые QX-подобные), выделяли во Франции, Бельгии, Италии, Венгрии, Швейцарии, Германии, Англии, Польше, Греции, Словении, Швеции, Дании, Финляндии.

Встречаемость вируса ИБК генотипа QX на территории России и стран СНГ в 2005-2014 гг. В основу данного анализа были положены результаты лабораторных исследований, проведённых в ФГБУ «ВНИИЗЖ», по выявлению генома вируса ИБК из патматериала птицеводческих хозяйств разных регионов РФ и стран СНГ. Исследования по выявлению генома вируса ИБК за 2005-2014 гг. были проведены сотрудником лаборатории вирусных болезней птиц ФГБУ «ВНИИЗЖ» к.б.н Овчинниковой Е.В.

Всего за указанный период в ПЦР было исследовано 2330 проб внутренних органов птиц более чем из 300 птицефабрик. Геном вируса ИБК был выявлен в 815 пробах, что составило 35% от общего количества изученных образцов. Большинство положительных образцов относились к генотипу Mass (30%). Генотип QX был выявлен в 14% случаев.

Динамика встречаемости генотипа в 2005-2014 гг. показала два выраженных максимума, которые были отмечены в 2008 г (=34%) и в 2011 г. (=27%). При этом в 2005 г. (=7%), в 2009 г. (=9%) и в 2013 г. (5%) присутствовали очевидные минимумы, и в 2014 г. <ЗХ-положительных образцов не было зарегистрировано.

Однако присутствие явной хронологической волнообразности процесса не дает оснований считать, что среди вариантов вируса ИБК представительство С^Х-генотипов монотонно снижается. При этом построенная регрессионная модель, имеющая коэффициент адекватности К2=0,7, прогнозирует в ближайшие два года очередные случаи выявления генотипа <ЗХ.

Проведенный эпизоотологический анализ показал, что распространение вируса ИБК генотипа ОХ с 1996 г. имело очевидную направленность, и в течение последних 19 лет возбудитель регистрируется во многих странах Европы, Азии и Африки, где присутствует развитое птицеводство. Хронология частоты встречаемости данного варианта вируса имеет волнообразный характер. Вероятно, случаи выявления вируса ИБК генотипа ОХ увеличатся на период 2015 -2017 гг.

2.2.2 Определение условий культивирования штамма ОХ вируса ИБК Культивирование на РКЭ. Проведение научно-исследовательских работ по изучению иммунобиологических свойств вирусов требует стандартизации вируссодержащего материала, используемого на всех этапах исследований. Поэтому получение необходимого объема высокоактивного вирусного материала для иммунологических исследований стало нашей первой задачей.

В качестве исходного вирусного материала использовали лиофилизированный вирусный материал вируса ИБК штамм С>Х с инфекционной активностью 4,1 ^ЦД50/см3, полученный из коллекции штаммов микроорганизмов ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Эмбрионы СПФ-кур 10-суточного срока инкубации использовали для заражения исходным вирусом. План эксперимента предполагал оценку титра вируса в ХАО и ЭЭЖ в динамике через заданный интервал времени.

Экспериментальный материал в виде установленных значений титра вируса представлен на рисунке 1.

Время культивирования,ч Рисунок 1. Динамика накопления вирусного генома и инфекционного вируса ИБК штамма ОХ в ЭЭЖ и в ХАО

Результаты, приведенные на рисунке 1, демонстрируют, что в обоих типах исследуемых образцов для вируса существовал явно выраженный период накопления, который заканчивался после 54 ч инкубации. В период с 36 по 54 ч культивирования вирус накапливался в максимальных титрах. Величина среднего значения титра в этот период в ЭЭЖ составила 3,2±0,2 1§ЦЦ5о/см3, тогда как в ткани ХАО средний титр был 2,3±0,19 1§ЦД50/см3. Указанные величины имели существенные различия (р<0,02). Далее, в период снижения титра, статистической разницы в оценках инфекционного тира вируса не было. Полученные данные указывали на то, что концентрация вируса в ЭЭЖ более чем на порядок превосходила аналогичный показатель в ХАО.

Таким образом, на основании проведенных опытов можно сделать заключение, что при инфицировании КЭ в полость аллантоиса накопление вируса в максимальных титрах происходит в ЭЭЖ в период 36-60 ч после инфицирования.

Адаптация вируса ИБК штамм ОХ к культурам клеток. Изучали возможность репродукции вируса ИБК штамма ОХ в клеточных культурах. Основной задачей данного этапа исследований было определение спектра

клеточных культур, чувствительных к вирусу. Предметом исследований были следующие культуры: первичная культура фибробластов эмбрионов кур (ФЭК), первичная культура почек эмбрионов кур (ПЭК), перевиваемая культура почки зеленой мартышки (Vero), перевиваемая культура гепатоцеллюлярной карциномы цыпленка (LMH), перевиваемая культура почки КРС (MDBK), перевиваемая культура почки теленка (RBT).

В экспериментах планировали исследовать возможность стимуляции репродукции и цитопатического действия вируса в результате добавления в состав питательной среды трипсина (1мг/100 мл).

Изменения в структуре монослоя, которые отличались от контроля, были отмечены на втором пассаже в культурах клеток ФЭК, ПЭК, RBT. Перечисленные культуры при стимуляции трипсином оказались чувствительными к данному штамму вируса ИБК. В период от третьего до пятого пассажа наблюдали устойчивое развитие цитопатических процессов. На дальнейших пассажах ЦПЭ стабилизировался.

Исследовали накопление инфекционного вируса в культурах клеток ФЭК, ПЭК, RBT. Установили, что на третьем пассаже титры инфекционного вируса (lgTUOso/cM3) для культур ФЭК, ПЭК и RBT (2,11±0,3; 2,58±0,17 и 1,85±0,1, соответственно) к пятому пассажу значительно возросли (2,5±0,2, 3,5±0,3 и 1,95±0,2, соответственно). После пятого пассажа накопление вируса стабилизировалось. Усредненные оценки титров 5-7 пассажа включительно для исследованных культур ФЭК, ПЭК, RBT составили: 2,83±0,17; 3,73±0,18; 2,49±0,53 (lgTim50/cM3), соответственно.

Исследовали антигенные свойства вируса, адаптированного к культуре клеток RBT. С этой целью провели реакцию нейтрализации. Использовали специфическую сыворотку к вирусу ИБК и отрицательную сыворотку СПФ-цыплят.

Было установлено, что средняя оценка нейтрализующего действия сыворотки составила величину 7,4±0,32 log2 НД50/0,1см3 против инфекционного вируса в дозе 100 ТЦЦ50. При этом нейтрализующего эффекта сыворотки от

СПФ-цыплят для исследованных разведений не наблюдали. Полученные результаты свидетельствовали, что вирус седьмого пассажа на культуре клеток КВТ активно реагировал в РН с сывороткой, имеющей антитела к вирусу ИБК, т.е сохранил соответствующие антигенные свойства.

2.23 Определение степени антигенного родства В серологических экспериментах по антигенной дифференциации штаммов использовали реакцию нейтрализации в варианте постоянной концентрации сыворотки и переменных доз вируса (а-вариант). При данном способе постановки реакции оценочным показателем был принят стандартный индекс нейтрализации как соотношение инфекционных титров вируса, установленных в гомо- и гетерологичных системах. В качестве чувствительной тест-системы использовали трахеальную органную культуру (в виде срезов толщиной 0,5-1 мм), которую инкубировали в лунках на пластиковых панелях в среде ПСС. Индикацию инфекционного действия вируса регистрировали по проявлению эффекта цилиостаза с помощью оптического микроскопа.

При выполнении серологических исследований, задачей которых являлось установление антигенной удаленности изучаемых штаммов на основе гомо- и гетерологичных индексов нейтрализации, был принят ряд условий, ограничивающих возможное влияние различных неспецифических факторов на результат эксперимента. Принято, что:

• исходным титром инфекционного вируса данного штамма считать оценку ЦД5о> установленную при титровании с 5% нормальной сывороткой кур;

• иммунные сыворотки в гомо - и гетерологичных реакциях использовать в концентрации 5%;

• определять гомологичный индекс нейтрализации как соотношение исходного и гомологичного титров данного штамма;

• гетерологичные индексы нейтрализации определять по сыворотке (при титровании тест-штамма с гетерологичными иммунными сыворотками) и по вирусу (при титровании тест-сыворотки с гетерологичными штаммами вируса);

• оценкой антигенной удаленности штаммов (по сыворотке или по вирусу) считать соотношение гомо - и гетерологичных индексов нейтрализации, установленное в виде доли инфекционного вируса, который не был нейтрализован в гетерологичной системе (оценка, обратная стандартной величине "г", характеризующей антигенную близость или "родственность").

Для штаммов ОХ, Н120, 4/91 и Б274 определили исходные титры инфекционного вируса, а также в перекрестной реакции нейтрализации установили индексы нейтрализации. Соответствующие результаты приведены в таблице 1.

Таблица 1 - Значение индексов нейтрализации в гомо- и гетерологичных _реакциях перекрестной нейтрализации_

Штаммы вируса Сыворотка к штаммам

Н 120 4/91 Б 274 <2Х

Н 120 5,б±0,15 .* - 0,6±0,П

4/91 - 5,0±0,10 - 1,4±0,10

О 274 - - 5,9±0,05 1,7±0,16

<ЗХ 0,3±0,18 1,1±0,10 0,9±0,10 3,8±0,07

не исследовали

Полученные значения позволили оценить соответствующие показатели односторонней антигенной удаленности (по сыворотке 1§(1/г5) и по вирусу ^(1/гу)), которые представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Одностороннее антигенное родство

Показатель Штамм Б*

Н120 4/91 Э274

1ё(1/Г;) 3,500 2,687 2,942 0,152

Ы'/Гу) 5,000 3,583 4,193 0,124

* статистический оператор Шеффе для дифференциации средних значений Приведенные в таблице 2 данные демонстрируют, что все показатели односторонней антигенной удаленности (1/г3 и 1/г„) штамма ОХ от исследуемых

вариантов вируса ИБК по тесту 1=Х/ш>1р<о 05 были значимы.

По результатам реакций с гетерологичными сыворотками наибольшая удаленность была установлена для штамма Н120, для которого соответствующий средний показатель составил величину 1§(1/г5.Н120)=3,500. Указанная оценка была достоверно (р<0,01) наибольшей по группе. Также соответствующее штамму Н120 значение 1 /г\,Н 120)=5,000 было статистически наибольшим (р<0,01) и в другой системе при дифференциации по вирусу. Варианты 4/91 и Э274 в обеих системах демонстрировали несколько меньшую удаленность от штамма ОХ. При этом средние оценки 1б(1/г$.4/91)=2,687 и ^(1/г5.Э274)=2,942, а также 1§(1/гу4/91)=3,583 и 1§(1/Гу0274)=4,193 были статистически тождественны. Это означало, что степень антигенной близости указанных вариантов вируса ИБК к штамму ОХ была приближенно одинаковой.

2.2.4 Патогенные свойства штамма ОХ

Известно, что вирус ИБК генотипа ОХ может вызывать разную клиническую картину болезни у кур всех возрастов и направлений продуктивности. При этом клинико-патологоанатомическое проявление болезни у молодняка связано с респираторным и нефрозо-нефритным синдромами, а среди кур-несушек - с репродуктивным синдромом. Учитывая эти данные, опыты по определению степени патогенности штамма ОХ выполняли на цыплятах категории СПФ.

Было сформировано 2 группы цыплят (20 голов в опытной, 10 голов в контрольной), которых выводили в лабораторных условиях из оплодотворенных СПФ-яиц. В суточном возрасте цыплят опытной группы интраназально инфицировали вирусом ИБК штамм ОХ в дозе 1000 ЦЦ50/0,1см3, тогда как цыплят контрольной группы не заражали. Затем проводили клиническое наблюдение за цыплятами и определяли показатели заболеваемости. Кроме клинических показателей оценивали патологоанатомические показатели болезни. Согласно протоколу опыта через 6 сут после инфицирования 10 цыплят из опытной и 5 цыплят из контрольной группы подвергали эвтаназии. Проводили патологоанатомическое вскрытие и

оценивали патологическую картину болезни, определяли активность реснитчатого эпителия трахеи.

Особое внимание заслуживает анализ результатов патологоанатомического вскрытия инфицированных птиц. Основные признаки болезни через 6 сут после инфицирования штаммом ОХ наблюдали со стороны респираторных органов и почек. При этом изменения были следующими: наличие серозно-слизистого экссудата в носовой полости и в трахее, отек легких, увеличение размеров и отёк почек; почки имели пестрый рисунок вследствие скопления в канальцах уратов, иногда до 0,5 см в диаметре. Проведенные исследования показали, что вирус ИБК штамм ОХ характеризуется умеренной вирулентностью для СПФ-цыплят и вызывает у них развитие респираторного и нефрозо-нефритного синдрома.

2.2.5 Использование теста на цилиостаз и ПЦР для оценки результативности вакцинации (протективного действия вакцины)

Развитие инфекционного процесса, обусловленного вирусом ИБК, не всегда может сопровождаться выраженной клинической картиной. Данная проблема становится особенно важной при выполнении экспериментов, целью которых является оценка напряженности поствакцинального иммунитета.

В этой связи считали целесообразным исследовать возможность использования методов, позволяющих определить наличие инфекционного процесса в организме птицы при отсутствии клинической картины болезни на макроуровне.

Из цыплят, в возрасте 1 сут, выведенных из СПФ-яиц, образовали четыре группы (№ 1, 2, 3, 4) по 25 голов. Группы содержались в изолированных боксах, исключающих горизонтальную передачу вируса. В первые сутки группы 1 и 3 были привиты коммерческой вакциной против ИБК из штамма Н120. Вакцина в виде суспензии была введена интраназально в дозе 4 ^ЭИД50 в объеме 0,1 см3. Группы 2 и 4 не прививали (контрольные группы).

Через 21 сут после прививки цыплятам в группах 1 и 2 ввели вирус ИБК штамм ОХ интраназально в дозе 3 1§ЭИД50/0,1 см3. Аналогичным образом

цыплятам в группах 3 и 4 ввели вирус ИБК штамм Н120. Через 6 сут после введения штамма QX и повторной прививки штаммом Н120 птиц, имеющих в группах одинаковые номера, подвергли эвтаназии и произвели препарирование трахеи и почек.

Для исследования трахеи был определен участок органа длиной 8 12 мм в проксимальном направлении от бифуркации. От каждой группы по 20 отпрепарированных образцов было исследовано в ОТ-ПЦР-РВ. Одновременно определяли активность ресничек мерцательного эпителия трахеи (CS показатель). Для исследования ткани почек от органа (в произвольном месте) отделяли участок, массой 0,5 0,7 г. Из каждой группы в ПЦР-РВ было исследовано по 20 отпрепарированных образцов.

Тест на цилиостаз. За основу измерения CS показателя была принята методика определения цилиларной активности эпителия трахеи птиц, изложенная в сообщении О.А. Чупиной [2].

Для оценки состояния эпителиальных ресничек в образце одной трахеи, в точках, равноудаленных от краев препарата, готовили не менее 4 кольцевых срезов толщиной около 1 мм. Индикацию инфекционного действия вируса регистрировали по проявлению эффекта цилиостаза. Оценкой масштаба цилиостаза (es) считали долю неподвижных (или десквамированных) ресничек, наблюдаемую в горизонтальной проекции на окружности (периметре) внутренней поверхности среза трахеи. Использовали следующие оценки: 0 -цилиостаз охватывает менее 1/4 периметра, 0,25 - охват не менее 1/4 периметра, 0,50 - охват не менее 1/2 периметра, 0,75 - охват не менее 3/4 периметра, 1,00 -охват более 3/4 периметра. Результирующим показателем цилиостаза в данном образце трахеи (CS) являлось среднее значение из n-числа единичных оценок (CS=Ecs/n).

Кроме этого, соответственно штаммам, использованным для вторичной прививки или заражения, между параллельно установленными значениями CS в контрольной и в опытных группах вычисляли оценки контраста (dQX и dHi;o),

которые характеризовали относительную "агрессивность" вируса для вакцинированных птиц. Полученные результаты приведены в таблице 3.

Из данных, представленных в таблице 3, следует, что оценки цилиостатических эффектов были значимы во всех исследованных группах птиц. Это указывало, что во всех случаях воздействие вируса отражалось на состоянии реснитчатого эпителия трахеи.

Таблица 3 - Показатели цилиостаза (CS) и результаты их сравнений в виде оценок контраста (des)* установленные соответственно использованным штаммам и порядку их применения

Группа цыплят (п-20) Контрольное введение, штамм

Н120 QX

Вакцинированные 0,10±0,03* 0,36±0,07

Невакцинированные 0,26±0,05 0,77±0,06

d 0,16±0,06 0,41±0,03

приведены среднее значение CS-показателей и их стандартные ошибки

Однако установленные средние значения ('х) были неодинаковы. Например, показатель 'С8=0,77±0,06, характеризующий результат инфекции штамма ОХ для невакцинированных (контрольных) птиц, существенно превосходил (р<0,001) аналогичный показатель 'С5=0,26±0,05, установленный для штамма Н120. На этом основании допустимо считать, что штамм ОХ в большей степени влиял на состояние мерцательного эпителия трахеи. Далее следует отметить существенное превышение цилиостатического эффекта (р<0,002), обусловленного штаммом ОХ при использовании его на привитых птицах ('С5=0,36 ±0,07) по отношению к штамму Н120 (С8=0,10±0,03). Это позволяет считать, что вирус штамма ОХ на иммунном фоне обладал относительно большей инвазивностью.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР-РВ). Оценочным показателем реакции приняли номер цикла, при котором достигался пороговый уровень флюоресценции продуктов амплификации (С^ - пороговый цикл). В соответствии с условиями выполнения теста установленное значение О

находилось в обратной зависимости от концентрации исходного генетического материала вируса. При проведении исследований реакцию считали отрицательной (геном вируса не определяется), если 0>41. Результаты, полученные в ОТ-ПЦР-РВ при исследовании образцов трахеи, представлены в таблице 4.

Таблица 4 - Количество циклов амплификации (СО и результаты их сравнений в виде оценок контраста (ЛО), установленные в образцах ткани трахеи соответственно использованных штаммов и порядка их применения

Группа цыплят (п-20) Контрольное введение, штамм

НПО ОХ

Вакцинированные 34,88±1,29* 29,86±1,41

Невакцинированные 24,90 ±1,38 23,2±1,13

ДО 10,0±1,52 6,62±1,88

приведены средние значения О и их стандартные ошибки

Достоверные различия в пользу штамма ОХ (р<0,02) были отмечены при сопоставлении показателей, характеризующих развитие возбудителя при введении его в организм привитых птиц 'С1=29,86±1,41 и 'С1=34,88±1,29. На этом основании возникает предположение, что у птиц, привитых штаммом Н120, штамм ОХ имел более эффективное воспроизводство, чем гомологичный вирус при повторном введении. На такую возможность также указывает и меньшая по величине и средняя оценка контраста 'ДрХ =6,62±1,88 в сравнении с аналогичным показателем 'ДН12о=Ю±1,52. Однако при данных условиях проведения эксперимента это положение статистически не подтвердилось.

Изучение накопления генома вируса ИБК штаммов ОХ и Н120 в образцах ткани почек проводили в соответствии с ранее изложенной методикой и порядке, аналогичном исследованию ткани трахеи. Полученные результаты приведены в таблице 5.

Результаты, представленные в таблице 5, демонстрируют, что количество генетического материала вируса ИБК штамма ОХ существенно превышало аналогичный показатель, установленный для штамма Н120 как у

невакцинированных [('а =25,14±1,77) > ('а=31,45±1,17)]р<о,оо5, так и у

привитых птиц [('а, =28,89±1,50) > 'а3=36,33±0,84)]р<о,оо,.

Таблица 5 - Количество циклов амплификации (С() и результаты их сравнений в виде оценок контраста (ЛСД, установленные в почках соответственно использованных штаммов н порядка их применения

Группа цыплят (п=20) Контрольное введение, штамм

Н120 <?х

Вакцинированные 36,33±0,84* 28,89±1,50

Невакцинированные 31,45±1,17 25,14±1,77

да 4,88±1,12 3,75±2,55

приведены средние значения О и их стандартные ошибки

Полученная для штамма ОХ оценка среднего контраста 'Л<5х= 3,75±2,55 при данных условиях эксперимента была статистически незначима. В биологическом смысле это означало, что влияние иммунизации для репродукции вируса было несущественным. При этом развитие вируса штамма Н120 значимо зависело от наличия иммунитета у подопытной птицы [('Лшго/т =4,88/1,12=>Ц<р)0ш=3,65].

3 Заключение 3.1 Выводы

1. Согласно данным эпизоотологического обследования и лабораторных исследований вирус инфекционного бронхита кур нового для РФ генотипа ОХ имеет широкое распространение во многих странах Евразии и в период 20052014 гг. регулярно регистрируется на территории страны.

2. Развивающиеся 9-11- суточные СПФ-куриные эмбрионы могут быть использованы в качестве системы для культивирования вируса ИБК. Максимальное накопление вируса регистрируется в ЭЭЖ куриных эмбрионов после 36-60 ч культивирования и достигает величины 41§ЦЦ50/0,1 см3.

3. Установлено, что вирус ИБК при стимулирующем действии трипсина может быть адаптирован к культурам клеток ФЭК, ПЭК и ЯВТ. Наибольшее

накопление вируса было отмечено после 6 пассажа на культуре ПЭК, где титр вируса достигал 4,6 ^ТЦД5о/см3.

4. Вирус ИБК штамм ОХ по результатам серологических исследований и статистической интерпретации имеет существенные антигенные отличия от референсных штаммов Н120, 4/91, Б274, выражающиеся в неполной перекрестной нейтрализации инфекционности с индексами от 2,7 ^ЦЦ50/см3 до 3,5 1 ^ЦД50/см3. Наиболее удаленным оказался штамм Н120, остаточная инфекционность которого в реакции с сывороткой к штамму ОХ составила 3,5 ^ЦДзо. Штамм 4/91 характеризовался большей антигенной родственностью, соответствующий показатель был приближенно 2,7 1§ЦД5о. Оценки индексов, полученные в гетерологичных реакциях как с сыворотками, так и со штаммами, были эквивалентны.

5. К вирусу ИБК штамм ОХ, выделенному на территории РФ, восприимчивы куры различного возраста. Патогенные свойства характеризуются преимущественным поражением почек у цыплят и репродуктивным синдромом у взрослой птицы.

6. По данным количественной ПЦР и теста на цилиостаз коммерческая вакцина против инфекционного бронхита кур на основе штамма Н120 обладает определенной протективной способностью в отношении вируса генотипа ОХ, предупреждая у вакцинированных цыплят респираторную инфекцию, но не вирусную репродукцию в тканях почек. Репродукция штамма ОХ в трахее цыплят, привитых штаммом Н120, в 32 раза превосходила накопление гомологичного вируса.

3.2 Практическое предложение

1. Для оценки антигенного родства штаммов вируса ИБК рекомендуется использовать разработанный алгоритм.

2. Для оценки степени защиты птиц против инфекционного бронхита кур после вакцинации рекомендуется комплексный подход, включающий выявление изменений в респираторных органах (тест на цилиостаз в трахее) и определение репродукции вирулентного вируса с помощью ПЦР.

3. Для научно-исследовательских и практических целей предлагаются комиссионно-испытанные, одобренные ученым советом и утвержденные заместителем директора ФГБУ «ВНИИЗЖ» следующие нормативно-методические документы:

■ Методические рекомендации по культивированию и титрованию вируса инфекционного бронхита кур в перевиваемой культуре клеток RBT;

■ Методические рекомендации по выявлению антител к вирусу инфекционного бронхита кур в реакции нейтрализации в культуре клеток RBT;

■ Методические рекомендации по получению гипериммунных сывороток птиц к вирусу инфекционного бронхита кур.

5 Список сокращений и условных обозночений ИБК - инфекционный бронхит кур ИН — индекс нейтрализации ИФА - иммуноферментный анализ КЭ - куриные эмбрионы

НД50 - 50% нейтрализующее действие сыворотки

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РКЭ - развивающиеся куриные эмбрионы

РН - реакция нейтрализации

РНК - рибонуклеиновая кислота

ТОК - трахеальная органная культура

ХАО - хориоаллантоисная оболочка

ЦЦ50 - 50% цилиостатическая доза

ЭЭЖ - экстраэмбриональная жидкость

6 Список литературы

1. Закс, JI. Статистическое оценивание / JI. Закс. - М.: Статистика, 1976. -598 с.

2. Изучение антигенного родства изолята «Калужский» к различным серотипам вируса инфекционного бронхита кур / O.A. Чупина, С.В.Фролов, Г.В Батченко [и др.] // Ученые зап. УО ВГАВМ. - 2005. - Т. 41, вып. 2, ч. 1.-С. 56-57.

3. Овчинникова, Е.В. Молекулярно-биологические свойства изолятов вируса инфекционного бронхита кур, выявленных на территории России в период с 2005 по 2011 гт: дис. ... канд. биол. наук / Овчинникова Евгения Валерьевна. - Владимир, 2012- 117с.

4. Троценко, Н.И. Практикум по ветеринарной вирусологии / Н.И. Троценко, Р.В. Белоусова, Э.А. Преображенская. - 2-е изд., перераб. и доп. -М.:Колос, 1999.-272с.

5. Avian infectious bronchitis [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health standards/tahm/2.03.02 А1В. pdf (дата обращения 22.10.14)

6. Comparison of the pathogenicity of QX-like, M41 and 793/B infectious bronchitis strains from different pathological conditions / Z. Benyeda, T. Mato, T. Suveges [et al.] // Avian Pathol. - 2009. - Vol.38. - Р.449-456/

7. Pathogenicity of a QX strain of infectious bronchitis virus in specific pathogen free and commercial broiler chickens, and evaluation of protection induced by a vaccination programme based on the Ma5 and 4/91 serotypes / C. Terregino, A. Toffan, M.S Beato [et al.] // Avian Pathol. - 2008. - Vol.37. - P.487-493.

6 Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Абдуллоев Х.С. Инфекционный процесс при инфекционном бронхите кур / Х.С. Абдуллоев, А.Ш. Дандал // Современные проблемы гуманитарных и естественных наук: материалы XVI международной науч.-практ. конф. - М., 2013.-С. 188-190.

2. Исследование развития вируса инфекционного бронхита кур в перевиваемых культурах клеток / X, С. Абдуллоев, Б.Л. Манин, С.В. Фролов, Н.В. Коропова // Ветеринарная практика. - 2013. - № 3 (62). - С. 2327.

3. Сравнение гомо- и гетерологичных реакций иммунных сывороток, полученных на штаммы «Н-120», «D-274» и «4/91» вируса инфекционного бронхита кур / X. С. Абдуллоев, С.В. Фролов, А.Ш. Дандал, B.IO. Кулаков // Актуальные вопросы ветеринарной биологии. - 2014. - № 1. - С. 27-31.

4. Вакцинация цыплят против инфекционного бронхита кур в суточном возрасте / X. С. Абдуллоев, А.Ш. Дандал, С.В. Фролов, В.Ю. Кулаков // Ветеринария. - 2014. -№ 10. - С. 29-31.

5. Абдуллоев, Х.С. Вирус инфекционного бронхита кур генотипа QX (обзор) / Х.С. Абдуллоев, В.В. Макаров // Птицеводство. - 2015. - №2. - С.52-56

Подписано в печать 31.03.2015 г. Формат 60x90 1/16. Усл. печ. л. 1. Тираж 80 экз Отпечатано на полиграфической базе ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»)