Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Патогенетические свойства вируса инфекционного бронхита кур

ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Патогенетические свойства вируса инфекционного бронхита кур"

На правах рукописи

Дандал Али Шебли

ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО

БРОНХИТА КУР

06.02.02 «ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология»

АВТОРЕФЕРАТ АПР 2015

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Владимир-2015

005567380

005567380

Работа выполнена в ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ») Россельхознадзора и в ФГБАОУ ВПО «Российский университет дружбы народов»

Научный руководитель: Макаров Владимир Владимирович, доктор

биологических наук, профессор, кафедра клинической ветеринарии ФГБАОУ ВПО «Российский университет дружбы народов» Научный консультант: Фролов Сергей Владимирович, кандидат

ветеринарных наук, заведующий лабораторией профилактики болезней птиц ФГБУ «ВНИИЗЖ»

Официальные оппоненты: Кушнир Анатолий Тимофеевич, доктор

ветеринарных наук, профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории экспериментальной микробиологии ГНУ ВНИИВВиМ

Бурдейный Василий Владимирович,

доктор ветеринарных наук, профессор, кафедра эпизоотологии, паразитологии и микробиологии ФГБОУ ВПО "Костромская государственная сельскохозяйственная академия"

Ведущая организация - федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко» г. Москва.

Защита состоится 02 июня 2015 года в 10 часов на заседании диссертационного совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 220.015.01 при ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» по адресу: 600901, г. Владимир, мкр. Юрьевец, ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных».

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ВНИИЗЖ» (г. Владимир). Полный текст диссертации, автореферат и отзыв научного руководителя размещены на официальном сайте ФГБУ «ВНИИЗЖ» на сайте www.arriah.ru.

Автореферат диссертации разослан «01» апреля 2015

Ученый секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций ФГБУ «ВНИИЗЖ», у

кандидат биологических наук/<«^7-^:Г1\^'Жбанова Татьяна Валентиновна

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Основу современного птицеводства составляют промышленные птицеводческие хозяйства. Одной из особенностей этих хозяйств является то, что на ограниченной территории содержится большое количество птицы. Это создает определенную опасность для возникновения инфекционных болезней и быстрого распространения их.

Инфекционные болезни птиц, протекающие с признаками поражения респираторного тракта, являются актуальной проблемой для современного промышленного птицеводства. В настоящее время инфекционный бронхит кур - одна из наиболее значимых болезней промышленного птицеводства. Болезнь впервые была описана Schalk и Hawn [4] как респираторная болезнь цыплят, и считалось, что ей подвержен только молодняк кур. Однако дальнейшие исследования показали, что вирус ИБК вызывает болезнь и у взрослых кур [9].

В настоящее время болезнь распространена практически во всех странах мира, где развито промышленное птицеводство. В последние годы вспышки ИБК регистрируются в птицеводческих хозяйствах многих стран, в том числе и в РФ, и в странах СНГ, что указывает на широкое распространение болезни[1].

Биологические особенности вируса ИБК (высокая контагиозность, длительная персистенция, чувствительность популяции) способствуют стационарности и широкому распространению болезни [1].

При возникновении болезни происходит быстрое инфицирование всего поголовья. Тяжесть протекания болезни зависит от ряда факторов, основными из которых являются антигенная структура и тропизм вируса.

Общепринято, что ткани дыхательной системы - главная мишень вируса, но вирус также поражает почки и репродуктивные органы птицы [6, 9]. В последние годы всё больше сообщений касается выделения вируса ИБК из клоакальных мазков и тканей кишечника. При этом сообщается о возможности инфицирования цыплят вирусом ИБК клоакальным способом[8].

Тропность и место первичной репликации зависит от свойств вируса, например, некоторые штаммы могут вызывать тяжёлые поражения почек, а в респираторном тракте вызывать лишь слабое воспаление [7].

Таким образом, штаммы вируса ИБК имеют вариабельный тканевой тропизм, что приводит к разнообразным клиническим проявлениям болезни.

Основной мерой борьбы с данной болезнью является вакцинопрофилактика. Для научно-исследовательских и производственных целей количественное определение вируса ИБК в вирусном материале всегда остаётся актуальной задачей. Традиционно для титрования вируса ИБК используются развивающиеся эмбрионы кур (РКЭ), что имеет свои преимущества и недостатки. К основным недостаткам относятся: достаточно длительная процедура титрования, связанная с развитием инфекционного процесса (не менее 7 сут), достаточно высокая степень субъективизма при оценке результатов; кроме этого, сами тест-объекты и их обслуживание высокозатратны. В связи с этим поиск опосредованных методов оценки титра инфекционного вируса на основе ПЦР в реальном времени представляется актуальным. Обнаружение положительной корреляции результатов по выявлению генома вируса ИБК в ПЦР и титрованию вируса ИБК в РКЭ позволит разработать прогностическую модель для опосредованной оценки инфекционного титра вируса.

В вирусологической практике изучение патогенеза вновь выделенных изолятов вируса ИБК является необходимой и актуальной задачей, поскольку позволит понять природу болезни и разработать средства борьбы с ИБК. В этой связи изучению патогенеза ИБК необходимо уделять большое внимание [6].

Таким образом, в настоящее время существует потребность в разработке новых методических подходов к количественному определению вируса ИБК в биологических материалах, а также в изучении патогенеза различных штаммов вируса инфекционного бронхита кур в организме птиц.

Цели и задачи исследований. Цель настоящей работы состояла в изучении патогенетических свойств вируса инфекционного бронхита кур.

4

В рамках поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Оценить возможность использования ПЦР (в режиме реального времени) для опосредованной оценки инфекционного титра вируса ИБК. Построить модель связи между концентрацией вирусного генома (значением порогового цикла амплификации в ОТ-ПЦР-РВ) и величиной инфекционного титра вируса ИБК для КЭ и для органной культуры трахеи.

2. Определить развитие вируса инфекционного бронхита кур в различных частях куриного эмбриона.

3. Сравнить показатели инфекционного титра вируса ИБК для КЭ и ТОК и установить взаимосвязь между показателями.

4. Исследовать процесс распространения (диссеминации) в организме птицы различных штаммов вируса ИБК и оценить их преимущественный тропизм.

5. Сравнить патогенное действие штамма 1Ш)8-10 вируса ИБК генотипа (^Х для цыплят при различных способах заражения.

Научная новизна. В процессе выполнения исследований были получены следующие результаты, представляющие научный интерес:

1. Показана принципиальная возможность использования ОТ-ПЦР РВ для опосредованной оценки инфекционного титра вируса ИБК. Соответствующие регрессионные модели на основе значений пороговых циклов амплификации позволяли прогнозировать значение титра вируса, стандартное отклонение которого было сопоставимо с аналогичной эмпирической оценкой как для СПФ-эмбрионов кур, так и для трахеальной органной культуры.

2. Установлено, что максимальное накопления вируса ИБК в ткани хориоаллантоисной оболочки эмбриона кур может не сопровождаться возникновением макроскопических патологий данной ткани.

3. Показано, что характер патогенеза заболевания существенно зависит от тропизма конкретного штамма вируса ИБК. Определено, что по интенсивности воспроизводства в клетках конкретного вида ткани в организме птицы вирусные варианты могут различаться в 300 и более раз.

5

4. Установлено, что вирус ИБК генотипа <ЗХ имеет тропизм к тканям респираторного тракта, почек, яичников и лимфоидным тканям слепой и толстой кишок. При этом инфекционный процесс, вызванный вирусом штамма Н-120, в основном ограничен дыхательной системой птиц.

Практическая значимость. Результаты, полученные при проведении настоящих исследований, могут иметь очевидное практическое использование. Во-первых, была предложена модель опосредованной оценки величины инфекционного титра вируса ИБК на основе результатов, полученных в ПЦР. Данная модель позволяет с достаточной точностью определить ожидаемый титр вируса в течение 4 часов (при условии, что стандартный способ оценки титра продолжается 5-7 сут) и может быть использована для ускоренной оценки его инфекционной активности.

Во-вторых, установленные различия патогенетической сущности штаммов вируса ИБК в организме цыплят требуют корректировки оценочных показателей для средств специфической профилактики.

В-третьих, особенности инфекционного процесса при разных методах заражения птицы вирусом ИБК генотипа С?Х характеризуют основные патогенетические свойства этого вируса.

Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту.

1. Использование ПЦР (в режиме реального времени) позволяет осуществлять ускоренную опосредованную оценку величины инфекционного титра вируса ИБК.

2. Местом репликации вируса ИБК в курином эмбрионе является хориоаллантоисная оболочка, а максимальное накопление вируса происходит в экстраэмбрионапьной жидкости.

3. Показатели инфекционного титра вируса ИБК при размножении в КЭ, установленные с помощью ПЦР и в трахеальной органной культуре, не имеют существенных различий.

4. Патогенез инфекционного бронхита кур при заражении разными

б

штаммами вируса имеет характерные различия.

5. Обусловленные вирусом патологические процессы в трахее инфицированных птиц характеризуются временным разрушением реснитчатого эпителия.

6. Патогенное действие вируса ИБК генотипа ОХ проявляется при заражении СПФ-цыплят как окулярно-назальным, так и клоакальным способами.

Апробация результатов работы. Основные материалы диссертации представлены, доложены и обсуждены на научно-практических конференциях «Популяционное здоровье животных и эмерджентные инфекции в современных условиях» (Волгоград, 2013), VI Международной научно-практической конференции преподавателей, молодых ученых, аспирантов и студентов «Инновационные процессы в АПК» (Москва, 2014).

Промежуточные результаты экспериментов вошли в материалы ежегодных отчетов лаборатории профилактики болезней птиц ФГБУ «ВНИИЗЖ» в 2013-2014 гг.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 122 страницах компьютерного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение, выводы, практические предложения и список литературы, который состоит из 199 источников, в том числе 159 -зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 5 таблицами, 11 рисунками и дополнена приложением документов, подтверждающих внедрение результатов работы в ветеринарную практику.

Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 4 научных работы, в том числе 3 в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации.

Место выполнення работы. Экспериментальные исследования по теме диссертации проведены в течение 2012-2015 г.г. на базе лаборатории профилактики болезней птиц ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»),

Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена самостоятельно. В ходе работы практическую и консультативную помощь оказывали сотрудники ФГБУ «ВНИИЗЖ» к.в.н. C.B. Фролов, к.в.н. В.Ю. Кулаков, к.в.н. Д.Л. Долгов, к.б.н. Е. В. Овчинникова, за что выражаем им искреннюю признательность.

2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Материалы и методы

Вирус ИБК. В работе использовали следующие штаммы вируса ИБК: вакцинный штамм «Н-120» (серотип Массачусетс); вакцинный штамм «4/91» (серотип 793/В); штамм «Д274» (серотип Д207), штамм «М41» (серотип Массачусетс), штамм RF08-10 генотипа «QX» (штамм QX).

Эмбрионы кур. Для получения эмбрионов использовали яйца категории СПФ фирмы Valo Biomedic (Германия).

Эмбрионы инкубировали при температуре (37,0±0,5)°С и относительной влажности воздуха 60%.

Подопытная птица. В качестве подопытной птицы использовали клинически здоровых цыплят породы белый леггорн, выведенных из эмбрионов СПФ-кур, в количестве свыше 500 голов. Эксперименты с птицей проводили в виварии ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Птицу содержали по 10-20 голов в клетках, оборудованных кормушками и поилками. Рацион кормления, температурный режим и освещенность помещений соответствовали зоогигиеническим нормам содержания птиц.

2.2 Методы исследований

Культивирование вируса. Штаммы вируса ИБК культивировали в

эмбрионах СПФ-кур 9-11-суточного срока инкубации.

Зараженные эмбрионы кур помещали в термостат при температуре 37,0±0,5°С и относительной влажности воздуха 60%. Овоскопию зараженных эмбрионов проводили через 24 часа после заражения, затем с интервалом не более 6 часов. Гибель эмбрионов до 24 часов считали неспецифической. По

окончании инкубации, ограниченной 72-часовым сроком, эмбрионы помещали в холодильные камеры при температуре 2-6°С на 6-18 часов. Перед вскрытием эмбрионы выдерживали 2-3 часа при комнатной температуре до испарения конденсата на скорлупе.

После охлаждения эмбрионы вскрывали в стерильных вирусологических боксах, соблюдая правила асептики для сбора ЭЭЖ.

Образцы патологического материала. Заражённую вирусом ИБК птицу через 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15,17, 19, 21, 23, 25, и 27 сут после заражения по 3 гол в каждый срок подвергали диагностическому убою. В качестве патологического материала отбирали трахею, легкие, почки, репродуктивные органы, миндалины слепого отдела кишечника. Патологический материал помещали в пробирки эппендорфа и замораживали при температуре минус 70°С для проведения ПЦР исследований. Почки и трахею фиксировали в 10%-м растворе формалина для проведения гистологического исследования.

Полимеразно-цепная реакция. Нуклеиновую кислоту выделяли на роботизированной станции Tecan Freedom EVO-lOO из 100 мкл образца суспензии с помощью набора «Magna DNA Prep 100» (ООО БиоКом, г. Москва).

Для постановки ОТ-ПЦР-РВ использовали систему праймеров и флуоресцентно-меченого олигонуклеотидного зонда, выбранного для амплификации фрагмента нетранслируемой области генома вируса (UTR) согласно методическим указаниям [2]. Учет результатов реакции проводили при помощи прибора Corbett research Real-Time PCR System (Rotogene, Австралия), где регистрировали количество циклов амплификации.

Органная культура трахеи. Приготовление и поддержание ТОК проводили по стандартной методике [3]. Для её приготовления использовали эмбрионы СПФ-кур 19 - 21 суточного срока инкубации. Кольца трахеи препарировали при помощи скальпеля, ножниц, бритвенного лезвия.

Для подготовительных работ и культивирования ТОК использовали готовые поддерживающие питательные среды ПСС, ПСП. Трахеальные кольца

9

помещали в лунки пластиковых планшетов и культивировали в условиях СО2-инкубатора при температуре 37,6±0,3°С.

Гистологические исследования трахеи и почек. Цыплят опытных групп подвергали диагностическому убою и извлекали почки и трахеи. Кусочки тканей удаленных органов фиксировали 10%-м раствором формалина и заливали парафином. На микротоме готовили срезы парафинизированных тканей толщиной 5 мкм, которые помещали на предметные стекла. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином. После окрашивания и высушивания на срез наносили каплю канадского бальзама и покрывали покровным стеклом. Исследование образцов тканей проводили на световом микроскопе.

Для оценки патогистологических изменений структуры трахеи мы использовали 4 балльную шкалу, описанную А1уагас!о й а1. [5].

23 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.3.1 Применение полимеразной цепной реакции в режиме реального времени для опосредованной оценки инфекционного титра вируса ИБК

При проведении научных исследований, а также при выполнении работ на биологических предприятиях постоянно возникает необходимость определения титра (концентрации) вируса в том или ином материале.

Для титрования инфекционного вируса ИБК в качестве чувствительных тест-систем используют КЭ или ТОК. Каждая из указанных систем имеет свои преимущества и недостатки.

В связи с этим считали целесообразным провести поиск опосредованного метода оценки инфекционного титра вируса на основе ПЦР с учетом количества циклов амплификации, т.е. использовать ПЦР в реальном времени с применением обратной транскрипции (ОТ-ПЦР-РВ).

Методика экспериментов по выявлению связи между титром вируса в КЭ и результатами ОТ-ПЦР-РВ сводилась к следующему. В качестве вируссодержащего материала использовали экстраэмбриональную вируссодержащую жидкость. Готовили ряд последовательных десятикратных

разведений вирусного материала, из каждого полученного разведения отбирали две пробы: одну - для ОТ-ПЦР-РВ, другую - для заражения КЭ (п>5).

Полученные данные использовали для построения модели связи (регрессионной модели), где параметр С1 рассматривали как фиксированный, при этом параметр ^Т считали зависимым.

Установлено, что между концентрацией инфекционного вируса (1§Т) и пороговым циклом амплификации (О) присутствовала выраженная связь. Характеристикой связи указанных параметров явилось регрессионное уравнение вида:

1£"Т=0,0002(а)3-0,0178(а)2+0,1499(а)+6,3648, {1}

где ^"Т - прогнозируемая величина концентрации (титра) инфекционного вируса для заданного значения О.

Уравнение {1} было построено для всех экспериментальных точек и показывало высокую адекватность (К2=0,972) и позволяло проводить прогноз, в том числе и вне экспериментального диапазона. Однако очевидно, что практическое использование такой модели затруднено ввиду сложности вычислительных операций. В связи с этим был проведен поиск более простой модели. Для расчетов использовали значения ^Т), установленные только в диапазоне 10<СК35 (на отмеченном отрезке зависимость ^Т]' от С^ была близка к линейной). В результате была построена простая линейная модель вида: 1в"Т=-0,2654(а)+9,336 {2}

Единственным обязательным условием использования данной модели являлись границы отмеченного выше диапазона.

Целью следующего этапа работы было исследование связи между величиной инфекционного титра вируса, установленного по цилиостатическому эффекту в ТОК и (П - показателем, зарегистрированным для данного образца в ОТ-ПЦР-РВ.

Далее, по всему диапазону испытанных разведений, используя метод Кербера, рассчитывали величину титра 50% цилиостатических доз вируса (^Т, ЦДзо).

Последующая процедура проведения эксперимента полностью совпадала с ранее описанной методикой с использованием эмбрионов СПФ-кур, где для каждого тестированного разведения (]) вычисляли фактическую концентрацию инфекционного вируса и параллельно установленную оценку Си После

проведения ОТ-ПЦР-РВ получали выборки параллельно установленным показателям ^Т]' и С^'. Реакцию считали отрицательной (геном вируса не выявлен), если С^">35.

Показано, что величины ^Т и О имели выраженную связь. Развернутой характеристикой данной связи являлось полученное методом наименьших квадратов регрессионное уравнение вида:

"^Т=18,854-5,216(1пС0, {3}

Построенная модель {3} имела высокий уровень адекватности (112=0,957) и могла быть использована для соответствующих прогнозов. Однако, как и для модели {2}, операции прогнозирования не должны распространяться вне границ диапазона 10<0<35.

2.3.2 Репродукция вируса инфекционного бронхита кур в эмбрионах Задачей настоящего этапа работы являлось исследование динамики накопления вируса ИБК в различных частях инфицированного эмбриона. Кроме этого планировали провести сравнение опосредованных оценок титра инфекционного вируса на основе показателей О по уравнению {3} и фактически установленных значений инфекционного титра для ТОК.

С этой целью штаммом Н-120 вируса ИБК инфицировали группу из 50 эмбрионов СПФ-кур. В продолжение 96 часов, каждые 4 часа, от двух произвольно выбранных инфицированных эмбрионов отбирали образцы следующих биоматериалов: ткань тела эмбриона (ТЭ); ткань хориоаллантоисной оболочки (ХАО); амниотическую жидкости (АЖ); смеси амниотической и аллантоисной жидкостей (экстраэмбриональную жидкость -ЭЭЖ).

Полученные образцы биоматериалов использовали для исследования в

ОТ-ПЦР-РВ, и для титрования в ТОК, где оценивали величину ^Т (ЦЦ50).

12

Установленные величины О использовали для расчета прогнозируемых показателей "^Т по уравнению {3}.

Полученные результаты позволяют сделать ряд заключений. Во всех исследуемых образцах профили распределений фактических и прогнозируемых показателей (^Т и "^Т) по параметру времени (часы) демонстрировали очевидное подобие. Средняя разность указанных величин (ёТ= ^Т и "1цТ) по изученному диапазону для образцов ТЭ, ХАО, АЖ и ЭЭЖ составила статистически незначимые величины: 0,19±0,16, -0,06±0,17, -0,11±0,09 и -0,07±0,18, соответственно.

Динамика инфекционной активности всех биоматериалов имела в той или иной мере выраженные три фазы. Фазу роста, которая для образцов ХАО и ЭЭЖ заканчивалась к 20 часам, а для образцов ТЭ и АЖ - к 50 часам культивирования вируса, фазу стабилизации, продолжавшуюся для большинства образцов до 70^80 часов, и далее фазу угасания, где, за исключением образца ТЭ, происходило видимое снижение показателей инфекционности.

По абсолютным значениям титров (6,3-^6,5 ^ЦД50/0,1см3) на фазе стабилизации, после 20 часов культивирования, наибольшее накопление вируса было показано в образцах ХАО и ЭЭЖ. В образцах АЖ максимум накопления 6,48 1яЦД5о/0,1см3 наблюдали только после 60 часов. В образцах ТЭ накопление не превышало 5,5 ^ЦД50/0,1 см3.

Результаты исследования динамики накопления вируса в различных частях эмбриона свидетельствуют, что наиболее вероятным местом репродукции возбудителя является ткань хориоаллантоисной оболочки. Далее вирус диффундирует в аллантоисную полость.

2.3.4 Патогенез вируса инфекционного бронхита кур 2.3.4.1 Диссеминация вируса в организме цыплят по результатам

ПЦР

Изучение диссеминации вируса ИБК в организме птицы позволит выявить

особенности патогенеза различных штаммов и механизм возникновения

13

состояния латенции. Для реализации этой задачи с использованием ПЦР оценивали количество вируса в разных органах и тканях в различные периоды после заражения. В полученных образцах тканей различных органов, соответственно испытанным штаммам, в динамике, определяли показатели С^ и проводили расчет ожидаемых величин "^Т.

Полученные результаты в виде диаграмм приведены на рисунке 1. Представленные на диаграммах данные отражают, по сути, профили развития и динамики накопления вируса в исследуемых органах. Первые сутки после заражения выявлен рост количества возбудителя во всех исследуемых органах. Далее к восьмым суткам происходило значительное снижение титра вируса и стабилизация процесса накопления, что вероятно связано с включением в процесс гуморального иммунитета. Установлено также, что для всех исследуемых штаммов вируса ИБК ткани респираторной системы птиц в начальной фазе развития инфекционного процесса являются наиболее благоприятной (элективной) зоной. В данной области организма на 5 сут после инфицирования ожидаемые по накоплению генетического материала инфекционные титры возбудителя ("1§ЭИД50) составили от 3,95 у штамма до 5,00 у штамма Н-120. Последующий процесс вирусной диссеминации, очевидно, происходил как вторичное явление. Во всех остальных тканях максимальные оценки титров приходились на 7-е или 10-е сут.

По эффективности развития вне респираторной системы очевидным лидером следует считать штамм ОХ, который через 7-9 сут накапливался ("^ЭИД50) до 4,33, 4,15 и 3,85 в почках, в миндалинах слепой кишки и в тканях репродуктивных органов, соответственно. При этом распространение в организме птицы штамма Н-120 было значительно менее выражено. Промежуточное положение занял штамм 4/91.

Далее провели сравнительный анализ тропности исследуемых штаммов по отношению к изученным видам тканей. В качестве условного показателя, характеризующего относительную адаптированность штамма к определенному виду ткани, приняли величину логарифмической разности между ожидаемыми

14

титрами вируса штамма Н-120 (референтный штамм) и хронологически соответствующим аналогом другого штамма.

титра по данным ПЦР, Т) в пробах тканей различных органов птиц соответственных штаммов ("Н-120"- "4/91" -Ж и "<ЗХ" -■ ) и времени после заражения (сут)

Соответствующий расчет проводили по формуле {4}:

<Ц="18Т] - "18Т0, {4}

где 4) - коэффициент изучаемого штамма на данном интервале времени 0); "^ТЗ и - хронологически совпадающие оценки титров изучаемого штамма и штамма Н-120 (референта), соответственно.

Результирующей оценкой адаптированное™ штамма © по референту приняли медиану ('сН) хронологической выборки величин сЦь При этом положительное значение коэффициента ('<1>0) рассматривали как тенденцию к большей адаптированности штамма относительно референта, отрицательное значение ('с1<0) считали оценкой меньшей адаптированности.

Показано, что в респираторной системе птицы наибольшая

эффективность воспроизводства была у штамма Н-120. Полученные результаты

представлены в таблице 1. Результаты, приведенные в таблице 1, указывали на

то, что в респираторной системе птицы наибольшая эффективность

15

воспроизводства была у штамма Н-120. Установленные величины результирующих коэффициентов и их доверительных интервалов ^4/91= -1,09 ,05 и "ОХ- -0,71 {(-0,96)-^-0,21} р<о 05 находились в отрицательной области и свидетельствовали о меньшей адаптированное™ остальных исследуемых вариантов вируса ИБК.

При этом во всех остальных тканях репродукция референтного штамма была менее интенсивной. Оценки 'сЦ/91 и границы их доверительных интервалов (р<0,05) для ткани почек, миндалин слепой кишки и тканей репродуктивной системы составили 0,38{(-0,02)^0,61}, 1,81(1,53-2,22} и 0,76(0,26-1,52}, соответственно. Коэффициенты с1<зх, представленные в аналогичной форме и порядке имели вид 1,07(0,71-1,8}, 2,51(1,71-2,84} и 1,04(0.61-1.77}, соответственно.

Таблица 1- Коэффициенты относительной адаптированностн* штаммов вируса ИБК 4/91 и <}Х по референтному штамму Н-120, установленные для тканей различных органов птицы

Сут** Респираторная система Почки Миндалины слепой кишки Репродуктивная система

1?То ¿4/91 ¿ох 1йТп ¿4/91 «1ох № <14/91 <1ох № ¿4/91 ¿ОХ

1 1,20 -0,45 -0,19 1,04 -0,38 -0,76 -0,38 1,92 1,06 -0,97 0,90 1,23

2 4,52 -1,04 -1,54 1,52 0,83 -0,97 -0,01 2,59 2,66 0,30 0,47 0,63

3 5,00 -0,95 -1,05 2,34 0,30 -1,33 1,55 1,98 2,17 1,32 1,52 0,57

4 4,27 -0,86 -0,40 3,29 0,35 0,95 2,34 1,91 1,67 2,08 1,14 1,77

5 3,92 -1,65 -0,37 3,02 -0,49 1,30 2,52 1,53 1,63 1,74 1,33 2,14

6 3,57 -1,56 -0,27 1,95 0,63 1,92 2,44 0,93 1,71 0,85 1,94 2,40

7 3,12 -1,22 -0,34 1,40 0,41 2,06 1,67 1,59 2,13 0,55 2,01 1,06

8 3,07 -1,62 -1,71 0,96 0,56 1,80 1,48 1,84 2,42 0,33 1,16 1,22

9 1,94 -0,70 -0,94 1,09 -0,02 1,46 0,81 2,22 2,89 0,43 0,59 0,61

10 1,65 -1,20 -0,84 0,88 -0,12 0,96 0,73 2,45 2,67 -0,28 0,63 1,02

11 1,27 -1,13 -0,96 0,37 0,05 1,19 0,34 1,78 3,28 0,11 0,19 0,15

12 1,10 -0,90 -0,96 -0,17 0,47 1,21 0,26 1,50 2,84 -0,12 -0,40 0,39

13 0,71 -0,81 -0,57 -0,29 0,58 0,84 0,31 0,93 2,59 -0,88 0,26 1,14

14 0,37 -1,87 -0,23 -0,35 0,61 0,71 -0,59 1,68 2,69 -0,58 -0,24 0,61

Медиана -1,09 -0,71 - 0,38 1,07 1,81 2,51 0,76 1,04

Примечания:

* - ф' = "^Т) - "1вТо, где ф - коэффициент относительной адаптированностн изучаемого штамма 0) на данном интервале времени; "^Т] и - хронологически совпадающие оценки титров изучаемого штамма и штамма Н-120 (референта), соответственно;

** - сутки после инфицирования

В биологическом смысле это означало, ожидаемое накопление штамма 4/91 превосходило референтный вирус в зависимости от вида ткани в диапазоне от 2,4 до 65 раз. При этом развитие штамма С?Х при аналогичном

сопоставлении было интенсивнее референтного вируса в диапазоне от 11 до 324 раз.

Важно отметить, что значительное превышение титров штаммов 4/91 и ОХ по отношению к титру референтного штамма, установленное в миндалинах слепой кишки, может указывать на тропизм отмеченных возбудителей к лимфоидной ткани.

2.3.3.2 Патологоанатомические и гистологические изменения в почках и трахее птиц, вызванные различными штаммами вируса ИБК

При клиническом наблюдении за подопытными цыплятами (были инфицированы штаммами Н-120, 4/91 и штаммом генотипа ОХ вируса ИБК), отмечали следующие характерные симптомы: одышку, кашель, трахеальные хрипы и носовые выделения на 3 день после заражения во всех группах, затем эти симптомы исчезали в течение 7-8 дней.

Наряду с выполнением диагностического отбора проб для гистологического исследования у инфицированных цыплят проводили патологическую диагностику болезни. Основные патологоанатомические изменения обнаруживали в группах цыплят, инфицированных штаммами ОХ и 4/91.

У цыплят, инфицированных штаммами ОХ и 4/91, в почках отмечали анемию и развитие нефрито-нефрозного синдрома на 7 сут после заражения, а также отложение большого количества мочекислых солей в почках и в мочеточниках.

Гистологические изменения. Через сутки после заражения в трахее наблюдали слабое утолщение слизистой оболочки за счет отека, лимфоидной инфильтрации, потерю ресничек и десквамацию эпителиальных клеток. Через 3 сут после заражения почти все реснички исчезали с поверхности эпителия у цыплят, инфицированных штаммами Н-120, ОХ и 4/91. А также наблюдали гиперплазию эпителия трахеи (рисунок 2).

Рисунок 2 - Микроскопические изменения в трахее цыплят, инфицированных вирусом ИБК: А - без признаков патологии;

В - тяжелая гиперплазия эпителия и сильная субэпителиальная лимфоидная инфильтрация, умеренное утолщение слизистой оболочки. Все реснички исчезают с поверхности эпителия, и произошла десквамация эпителиальных и секретирующих клеток слизистой оболочки

Гистологические изменения в почках у цыплят, инфицированных

штаммами ОХ и 4/91, наблюдали через 3-е сут после заражения. Вирус вызывал

*

дистрофию, вакуолизацию и десквамацию в эпителии почечных канальцев. Изменения наблюдались в основном в собирательных протоках, прямых канальцах и в дистальных извитых канальцах мозгового вещества почки. А также наблюдали интерстициапьный отек с инфильтрацией из лимфоцитов и макрофагов (рисунок 3).

Контроль Опыт

Рисунок 3 - Микрофотографии образцов мозговой ткани почек, взятых в контрольной и опытной группах цыплят, инфицированных вирусом ИБК штамм 4/91 и ОХ

У инфицированных птиц присутствует интерстициапьный отек почечных канальцев с выраженной инфильтрацией лимфоцитами и макрофагами.

2.333 Репродукция вируса генотипа (}Х в организме цыплят при различных способах заражения

Как было установлено ранее, штамм ГОУ08-10 генотипа <ЗХ вируса ИБК способен обусловить в организме птицы инфекционный процесс, сопровождающийся главным образом поражением органов выделительной системы.

Для целей изучения диссеминации вируса в органах птиц при разных способах заражения применяли разработанную методику опосредованной оценки титра инфекционного вируса по результатам ПЦР в реальном времени.

Распределения показателей для обоих способов заражения продемонстрировали наличие начального периода развития инфекционного процесса, кратковременный максимум накопления инфекта и продолжительное монотонное снижение концентрации возбудителя.

Было установлено, что возбудитель имеет тропизм к тканям респираторного тракта, почек, яичников и лимфоидным тканям слепой и толстой кишок. Вирус эффективно развивается в организме как при окулярно-назальном, так и при клоачном способе инфицирования.

Было показано, что при клоачном способе заражения патогенное действие вируса выражалось в тяжелых поражениях почек и одновременно с умеренными поражения дыхательной системы через 3 сут после заражения. Тогда как заражение окулярно-назальным способом индуцировало респираторные признаки на следующий день после заражения и проявление умеренных почечных поражений через 4 или 5 сут после заражения.

При гистологических исследованиях в пораженных почках неизменно наблюдалась типичная картина нефроза/нефрита. Эти результаты говорят о том, что заражение цыплят вирусом ИБК в клоаку характеризуется тяжелыми поражениями почек. Эти результаты подтверждают, что вирус ИБК может проникать в организм через клоаку.

3 Заключение

1. Для ускоренной опосредованной оценки инфекционного титра вируса ИБК принципиально возможно использование ОТ-ПЦР-РВ. Построенные модели связи между пороговыми циклами амплификации (СО и оценками инфекционного титра (^Т) как для СПФ-эмбрионов кур, так и для трахеальной органной культуры, позволяют прогнозировать значение титра, стандартное отклонение которого (±0,3 сопоставимо с аналогичной эмпирической оценкой.

2. При культивировании вируса инфекционного бронхита кур в СПФ-эмбрионах кур местом репродукции возбудителя служат клетки хориоалланстоисной оболочки. Резервуаром накопления является экстраэмбриональная жидкость. Максимум накопления вируса приходится на период от 50-72 ч, при этом обусловленные вирусом макроскопические изменения тканей ХАО отсутствуют.

3. Характер патогенеза инфекционного бронхита кур существенно зависит от тропизма конкретного штамма вируса. Степень адаптированности как критерий оценки тканевого тропизма вирусных штаммов к конкретному виду ткани в организме птицы может различаться в 300 и более раз по титрам накопления.

4. Инфекционный бронхит кур при заражении вирусом генотипа ОХ сопровождается развитием нефрозо-нефритного синдрома с вакуолизацией и десквамацией эпителия почечных канальцев, образованием локализованных некротических очагов как в корковом, так и мозговом веществе почек.

5. Вирус инфекционного бронхита кур генотипа ОХ эффективно размножается в организме как при окулярно-назальном, так и клоачном способе инфицирования, имеет тропизм к тканям респираторного тракта, почек, яичников и лимфоидным тканям слепой и толстой кишок.

4 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Модели, характеризующие связь между величиной порогового цикла амплификации (СО в ОТ-ПЦР-РВ и прогнозируемым инфекционным титром вируса О'^Т) в единицах ЭИД50 вида "^Т=9,336-0,265(С0 или в единицах ЦЦ50 вида "^Т=18,854-5,216(1пС0, могут быть использованы:

а) для оптимизации процедуры культивирования вируса ИБК на развивающихся эмбрионах кур;

б) для проведения экспресс-оценки концентрации вегетативного вируса в полуфабрикате или конечном продукте при производстве живых вакцин против ИБК.

2. Величина накопления вируса в тканях трахеи, почек и лимфатической систем! кишечника птицы может служить косвенной оценкой вирулентности штамма ИБК и указывать на его эпизоотическую опасность.

3. Оценка относительной адаптированное™ (тропизма) штаммов вируса ИБК к конкретным видам тканей организма птицы может быть использована при конструировании препаратов специфической профилактики данного заболевания.

4. Для научно-исследовательских и практических целей предложены, комиссионно испытаны, одобрены ученым советом и утверждены зам. директора ФГБУ «ВНИИЗЖ» следующие методические рекомендации:

• Методические рекомендации по использованию полимеразой цепной реакции в режиме реального времени для опосредованной оценки величины титра вируса инфекционного бронхита кур

• Методические рекомендации по получению гипериммунных сывороток птиц к вирусу инфекционного бронхита кур

5 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ИБК - инфекционный бронхит кур

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РКЭ - развивающиеся куриные эмбрионы

РНК — рибонуклеиновая кислота

21

СПФ - свободный от патогенных факторов

ТОК - тканевая органная культура

ХАО - хориоаллантоисная оболочка

ТЭ — ткань тела эмбриона

ЦА — цилиарная активность

ЦД50 — доза, вызывающая цилиостаз в половине зараженных культур

ЭИД50 - 50% эмбриональная инфицирующая доза (доза вируса, вызывающая инфекционный процесс у 50% инфицированных эмбрионов)

ЭЭЖ - экстраэмбриональная жидкость

6 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Борисов, А.В. Инфекционный бронхит кур / А.В. Борисов, Т.В. Хлыбова, С.В. Фролов // Вет. мед. Украины. - 1998. - №5. - С.28-29.

2. Методические указания по выявлению генома вируса инфекционного бронхита кур методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени / Е. В. Овчинникова, JL О. Щербакова, А. В. Андриясов [и др.] / ФГБУ «ВНИИЗЖ» Владимир. - 2010. - Юс.

3. Методические указания по приготовлению и поддержанию трахеальной органной культуры куриных эмбрионов и цыплят / О.А. Чупина, С.В. Фролов, В.И. Диев [и др.] / ФГУ "ВНИИЗЖ". - Владимир, 2006. - 4 с.

4. Ambali, A.G. Effects of trypsin and sodium tauroglycocholate on an enterotropic variant infectious bronchitis virus / A.G. Ambali, R.C. Jones // Vet. Record. - 1991.-Vol.129.-P. 510-511.

5. Alvarado, I.R. Evaluation of the protection conferred by commercial vaccines against the California 99 isolate of infectious bronchitis vims / I.R. Alvarado, P. Villegas, J. El-Attrache // Avian Dis. - 2002. - Vol.47. - P.1298-1304.

6. Cavanagh, D. Coronavirus avian infectious bronchitis virus / D. Cavanagh // Vet. Res. - 2007. - Vol.38. - P.281-97.

7. Chen, B.Y. Histopathology and immunochemistry of renal lesions due to infectious bronchitis virus in chickens / B.Y. Chen, S. Hosi, T. Nunoya // Avian Pathol. - 1996. - Vol.25. - P.269-283.

8. Intracloacal infection with avian infectious bronchitis virus / T. Uenaka, Itsuko Kishimoto, S. Sato [et al.] // Avian Pathol. - 1998. - Vol.27. - P. 309-312.

9. Nakamura, K. Comparative study of respiratory lesions in two chicken lines of different susceptibility , infected with infectious bronchitis vims: histology, ultrastructure and immunochemistry / K. Nakamura, J.K.A. Cook, K. Otsuki // Avian Pathol. - 1991. - Vol.20. - P.245-261.

10. Parsons, D. Characterization of an infectious bronchitis virus isolated from vaccinated broiler breeder flocks / D. Parsons, M.M. Ellis, D.Cavanagh // Vet. Rec. - 1992. -Vol.131. - P.408-411.

7 Список научных работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Дандал, А.Ш. Применение полимеразной цепной реакции в режиме реального времени для опосредованной оценки инфекционного титра вируса инфекционного бронхита кур / А. Ш. Дандал, X. С. Абдуллоев // Ветеринарная практика . - 2013. - № 3. - С. 28-32.

2. Дандал, А. Ш. Использование трахеальной органной культуры -перспективный метод для изучения вируса инфекционного бронхита кур in vitro / А. Ш. Дандал, X. С. Абдуллоев // Популяционное здоровье животных и эмерджентные инфекции в современных условиях: материалы междунар. научно-практ. конф. - Волгоград, 2013. - Ч. 2. - С. 45-48.

3. Репродукция вируса инфекционного бронхита в эмбрионах кур / А.Ш. Дандал, Х.С. Абдуллоев, В.Ю. Кулаков [и др.] // Ветеринария. - 2015. -№ 1,- С. 31-35.

4. Дандал, А. Ш. Патогенез инфекционного бронхита кур. Сообщение 1. Репродукция вируса генотипа «QX» в организме цыплят при различных способах заражения / А. Ш. Дандал, О.И. Сухарев, В.В. Макаров // Актуальные вопросы ветеринарной биологии. - 2015. - № 1. - С. 24-27.

Подписано в печать 31 марта 2015г. Формат 60x90 1/16, Усл. печ. л. 1. Тираж 80 экз. Отпечатано на полиграфической базе ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»