Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Совершенствование методов диагностики инфекционного бронхита кур

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Совершенствование методов диагностики инфекционного бронхита кур"

На правах рукописи

Дпя служебного пользования №4 дсп от 30.03.2001 г. экз.№(л

УДК: 619:616.98:578.834.11:636.5:616-078.33.

ЛУГОВСКАЯ Наталия Николаевна

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННОГО БРОНХИТА КУР

03.00.06.

"Вирусология"

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Владимир - 2001

Работа выполнена в ФГУ Всероссийский научно-исследовательский институт защиты животных (ВНИИЗЖ) Министерства сельского хозяйства Российской Федерации.

Научный руководитель

Научный консультант

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор

А.И. Дудников (ФГУ ВНИИЗЖ, г. Владимир); доктор биологических наук, старший научный сотрудник В.И. Смоленский (ВГНКИ, г. Москва).

- кандидат биологических наук, старшин научный сотрудник В.В. Дрыгин.

доктор ветеринарных наук, старший научный сотрудник А.В. Борисов.

Ведущее учреждение: Всероссийский научно-исследовательский

ветеринарный институт птицеводства (ВНИВИП, г. Санкт-Петербург, Ломоносов)

Защита состоится А. 9 2001 года в {с часов на заседании

диссертационного совета Д 220.015.01 в ФГУ Всероссийский научно-исследовательский институт защиты животных Минсельхоза России по адресу: 600900, г.Владимир, п/о Юрьевец, ВНИИЗЖ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИЗЖ. Автореферат разослан Р/и.^О^ 2001 года.

Учёный секретарь диссертационного совета

- Семёнова Г.М.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Инфекционный бронхит, вызываемый РНК-содержащим вирусом семейства Coronaviridae, является высококонтагиозным заболеванием. Вирус ИБК поражает трахеи, легкие, почки и яичники кур, что часто ведет к смертности птицы, особенно молодняка, снижению яйценоскости кур-несушек и ухудшению качества яиц.

Впервые заболевание было описано в США в штате Северная Дакота в 1931 году Schalk и Hawn, как ранее неизвестное заболевание дыхательной системы цыплят, сопровождающееся высокой летальностью. В дальнейшем болезнь была установлена и у взрослых кур. Заболевание широко распространено практически во всех странах с развитым промышленным птицеводством и наносит значительный экономический ущерб. Экономические потери при ИБК складываются, в основном, из снижения яичной и мясной продуктивности, вынужденной выбраковки заболевшей птицы, высокой летальности молодняка до 30-дневного возраста и повышения чувствительности к другим заболеваниям. На территории бывшего Советского Союза ИБК впервые был обнаружен на Бройлерных птицефабриках БССР в 1982 году у цыплят, завезенных из Венгрии (А.Б. Терюханов и др., 1990).

Для профилактики ИБК используют иммунизацию живыми и инактивиро-ванными вакцинами. Поэтому представляется важным разработка методов, позволяющих количественно определять концентрацию антигена вируса ИБК в исследуемом препарате. Для обнаружения антигена вируса ИБК рядом авторов (Hesselink et al., 1903, Nagano et al., 1990, Naqi et al., 1993, Ignjatovic & Ashton, 1996) разработаны «сэндвич»-варианты ИФА, основанные на разных комбинациях улавливающих и детекторных антител. Однако в этих работах были использованы моноклонапьные антитела, получение которых представляет определенную проблему. Системы с применением поликлональных антител обладали низкой чувствительностью (Yagyu & Ohta, 19S7). До сих пор не разработана тест-система для быстрого обнаружения антигена вируса ИБК и его количественной оценки в вирус-содержащих материалах, которая могла бы применяться для исследований в диагностических ветлабораториях.

Большое значение имеет контроль иммунного статуса поголовья кур птицефабрик, в первую очередь, контроль поствакцинального иммунитета и его напряженности, контроль материнского иммунитета, а также раннее выявление заболевания на птицефабриках, не применяющих вакцины. Традиционные методы для определения уровня антител в сыворотках крови кур: реакция диффузионной

преципитации, реакция торможения гемагглютинации и реакция нейтрализации, неудобны для массовых исследований, либо из-за недостаточной чувствительности и специфичности, либо в силу трудоемкости и невозможности стандартизации условий постановки реакции. На основе непрямого варианта ИФА за рубежом рядом фирм, такими как КР1_ (США), ЮЕХХ (США), Буапоуа (Швеция), Нурга (Испания) и др., выпускаются диагностические наборы. Во ВНИВИП (Санкт-Петербург) разработан иммуноферментный набор для визуального учета. Однако набор основан на методе последовательных разведений и позволяет тестировать на одном планшете 10-20 проб, что делает проводимые исследования низкопроизводи--тельными-и-трудоемкиыилоэтому возникла необходимость разработки сравнительно недорогого отечественного диагностического набора нового поколения для определения уровня антител к вирусу ИБК на основе ИФА методом одного разведения сыворотки с последующей компьютерной обработкой результатов, что позволит одновременно тестировать на одном планшете 90 проб и значительно уменьшит стоимость одного анализа.

Многие исследователи при постановке различных вариантов ИФА с использованием очищенных и концентрированных препаратов антигена вируса ИБК сталкиваются с проблемой их получения и хранения. Поэтому представляется перспективным использование в ИФА синтетических пептидов, аналогов антигенных детерминант нативного белка вируса, которые лишены недостатков препаратов вирусных антигенов, так как характеризуются отсутствием примесей, стабильностью, неограниченным сроком хранения и известным химическим составом.

Таким образом, разработка и совершенствование методов ИФА для диагностики ИБК являются актуальными и перспективными.

Цели и задачи исследования. Целью наших исследований явилась разработка иммуноферментных тест-систем для определения уровня специфических антител в сыворотках крови кур и выявления антигена вируса ИБК в вируссодер-жащих материалах. В связи с чем выполнение диссертационной работы предполагало решение следующих задач:

1) разработать тест-систему для выявления и определения уровня антител к вирусу ИБК в сыворотках крови кур методом одного разведения с компьютерной обработкой результатов, для чего необходимо:

- получить высокоочищенные и концентрированные препараты антигена вируса ИБК и вирусспецифические сыворотки крови кур;

- стандартизовать условия проведения реакции;

- установить критерии качественной и количественной оценки результатов;

- сравнить чувствительность и специфичность разработанной тест-системы с коммерческим иммуноферментным диагностическим набором фирмы КР1. (США), сертифицированным на территории Российской Федерации;

- показать возможность применения набора на основе данной тест-системы как одного из способов контроля иммунного статуса поголовья птиц на птицефабриках и для проверки антигенной активности вакцин;

2) изучить возможность использования в иммуноферментных тест-системах синтетического пептида с аминокислотной последовательностью, соответствующей участку структурного белка 82 вируса ИБК:

- в качестве антигена при проведении непрямого варианта ИФА для выявления антител к вирусу ИБК;

- в качестве лиганда для иммобилизации на ВгСЫ-сефарозе при аффинном выделении фракции 1дв из вирусспецифических сывороток крови кур и пептидоспеци-фических сывороток крови морских свинок;

3) разработать тест-систему для обнаружения антигена вируса ИБК и его количественной оценки в вирусных суспензиях, для чего необходимо:

- испытать различные варианты ИФА, позволяющие обнаруживать антиген вируса ИБК, и выбрать наиболее оптимальный;

- получить высокоочищенные, концентрированные препараты антигена вируса ИБК и вирусспецифических иммуноглобулинов, выделенных из сывороток крови животных;

- стандартизовать условия проведения реакции;

- установить критерии качественной и количественной оценки результатов;

- оценить чувствительность и специфичность разработанной тест-системы;

- показать возможность применения данной иммуноферментной системы для обнаружения вируса ИБК в биологических материалах.

Научная новизна. Разработана тест-система на основе непрямого варианта ИФА для определения антител к вирусу ИБК в сыворотках крови кур при тестировании их в одном разведении. В ходе исследований определены пороговые значения титра антител с учетом неспецифического связывания, что позволяло производить качественную оценку тестируемых проб, и выведены коэффициенты уравнения линейной регрессии для определения уровня антител к вирусу ИБК в сыворотках крови кур. Параметры тест-системы введены в компьютерную программу «Иммуноферментный анализ», которая позволяет производить автомати-

ческую обработку, учет и хранение данных.

При использовании разработанной тест-системы для определения антител к вирусу ЦБК в сыворотках крови кур проведен серологический мониторинг поголовья кур на птицефабриках Российской Федерации и стран СНГ в течение 19982000 г. г.

Показана возможность альтернативного использования в качестве антигена при проведении ИФА синтетического пептида, являющегося аналогом фрагмента М-концевого участка аминокислотной последовательности пепломерного белка Э2 ~вируса"ИБК:-

Предложен метод выявления антигена вируса ИБК в биологических материалах, основанный на проведении непрямого блокирующего жидкофазного варианта ИФА с использованием в качестве блокирующих антител аффинно-очищенных 1дС сывороток крови животных.

Разработана тест-система для выявления антигена вируса ИБК и его количественной оценки в пробах аллантоисной жидкости куриных эмбрионов с использованием двух способов постановки реакции: метода последовательных разведений и метода одного разведения проб. Установлены пороговые значения процента блокирования, отражающего количественное содержание антигена вируса ИБК в исследуемых пробах, и определена чувствительность предложенного метода. Установлена возможность перевода значения ОП исследуемых проб в значение титра антигена по уравнению линейной регрессии.

Показана область применения разработанной тест-системы: оценка концентрации антигена вируса ИБК в вакцинном сырье и обнаружение антигена вируса ИБК в образцах патологического материала после их пассирования на куриных эмбрионах.

Установлена возможность использования в качестве блокирующих антител моноклональных антител, полученных на штамм М41 вируса ИБК.

Модифицирован метод аффинной хроматографии для выделения фракции 1дС, выработанных на определенный участок аминокислотной последовательности вируса ИБК, из сывороток крови морской свинки и курицы с использованием синтетического пептида, иммобилизованного на ВгСЫ-сефарозе.

Практическая значимость. Результаты научных исследований легли в основу следующих документов, утвержденных Департаментом ветеринарии Министерства сельского хозяйства Российской Федерации и/или дирестором ВНИ-ИЗЖ:

1) комплекта НТД для «Набора по определению антител к вирусу ИБК в сыворотках крови кур иммуноферментным методом»;

2) комплекта НТД для «Набора по определению антител к вирусу ИБК в сыворотках крови кур иммуноферментным методом при тестировании проб в одном разведении»;

3) методических указаний по определению антител к вирусу ИБК иммуноферментным методом;

4) методического руководства по определению титра антител к вирусу ИБК в сыворотках крови кур при исследовании их в одном разведении;

5) методических рекомендаций по выявлению антигена вируса ИБК в вируссодер-жащих материалах;

6) методических рекомендаций по аффинному выделению специфических 1дО из сывороток крови животных.

Разработанные иммуноферментныо тест-системы применяются в научно-исследовательской и ветеринарной практике при оценке качества сырья для изготовления диагностических наборов и вакцин, при ретроспективной диагностике ИБК и контроле поствакцинального иммунитета.

При использовании диагностических наборов для определения антител к вирусу ИБК на основе разработанной иммуноферментной тест-системы в течение 1998-2000 г.г. было исследовано около 33000 сывороток из 262 птицеводческих хозяйств России и ближнего зарубежья, а также реализовано более 2000 коммерческих наборов, выпускаемых во ВНИИЗЖ.

Апробация работы. Результаты исследований по теме диссертации доложены и обсуждены на заседаниях ученого совета ВНИИЗЖ в 2000 г., на научно-производственной международной конференции «Роль ветеринарной науки в развитии животноводства» (Казахстан, г. Алматы, 2000 г.), научной конференции «Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными экзотическими и зооантропонозными болезнями животных» (г. Покров, 2000 г.), конференции молодых ученых ВНИИЗЖ «Достижения молодых ученых - в ветеринарную практику» (г. Владимир, 2000 г.), Всероссийской научной конференции ВГНКИ «Совершенствование методов контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов» (г. Москоа, 2001 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ. Основные положения, а/./носимые на защиту: • тест-система на основе непрямого варианта иммуноферментного анализа для

определения антител к вирусу ИБК в сыворотках крови кур при тестировании проб в одном разведении;

- применение тест-системы как одного из методов контроля иммунного статуса поголовья птицефабрик и исследования антигенной активности вакцин;

- использование синтетического антигена при проведении непрямого ИФА для определения антител к вирусу ИБК;

- тест-система на основе непрямого жидкофазного блокирующего варианта ИФА для выявления и количественной оценки антигена вируса ИБК в биологических

-материалах,-

- применение тест-системы для определения концентрации антигена в сырье для производства вакцин и диагностических наборов, а также полевых изолятов вируса ИБК в пробах патологического материала.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 142 страницах, иллюстрирована 32 таблицами и 21 рисунком. Список использованной литературы включает 155 источников, из них 145 на иностранных языках.

Исследования по диссертационной работе выполнены в течение 1998-2000 г.г. во Всероссийском научно-исследовательском институте защиты животных (ВНИИЗЖ, г. Владимир).

2.СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Антиген. В качестве антигенного сырья использовали вирус ИБК штаммов Чапаевский, Н120 (серотип Массачусетс), Д274, Д1466, 793В (4/91), полученные после заражения 10-сугочных куриных СПФ-змбрионов. Вирусную суспензию осветляли в течение 20 мин. при 3000 об/мин на центрифуге «Beckman». Вирус очищали и концентрировали через 30%-й раствор сахарозы 70 минут на высокоскоростной центрифуге «Sorvall» при 25000 об/мин. Антиген адсорбировали на планшетах фирмы Nunc (Дания) в концентрации 0,5-1 мкг на лунку.

Пептид. Для синтеза пептида выбрали один из наиболее консервативных участков аминокислотной последовательности вируса ИБК, N-концевой участок пепломерного белка S2. Синтезировали пептид с аминокислотной последовательностью, состоящей из 18 аминокислотных остатков (пептид синтезирован к.б.н., с.н.с. А.А. Луговским). Пептид обозначили как P-S2. Пептид, разведенный в карбонатно-бикарбонатном буфере (рН 9,5), наносили на планшеты с концентрацией 0,5 мкг на лунку.

Иммуноглобулины. Монокпональные антитела (МАт) на вирус ИБК штамма М41 получены из Института зоопрофилактики (г.Брешиа, Италия). Иммуноглобулины крови кролика, морской свинки на штамм оируса ИБК Н120 и синтетический пептид P-S2, курицы на штаммы вируса ИБК получали после двух-трехкратной иммунизации и выделяли путем осаждения белков насыщенным раствором сульфата аммония или аффинной хроматографией.

Конъюгат. Коммерческие препараты антивидовых иммунолероксидазных конъюгатов против IgG курицы, мыши, кролика, морской свинки получали из института микробиологии и иммунологии им. Гамалеи (Москва) и фирмы KPL (США). Рабочее разведение конъюгата определяли при проведении непрямого ИФА, используя известный антиген и известные отрицательные и положительные сыворотки.

Коммерческие диагностические наборы. В работе использовали коммерческие наборы «Определение антител к вирусу инфекционного бронхита кур» (ВНИИЗЖ) и «Infectious Bronchitis Virus Antibody Test Kit» фирмы KPL (США), зарегистрированный на территории РФ. Непрямой вариант иммуноферментного анализа проводили согласно наставлениям по применению наборов.

Электрофорез в полиакриламидном геле. Белковые пробы разделяли в 10% или 12,5% полиакриламидном геле. Электрофорез проводили по Laemmli (1970) с некоторыми модификациями (подробно описано в п.3.1.2.4. диссертации).

С-ИФА. «Сэндвич»-вариант ИФА (С-ИФА) проводили следующим образом. На планшеты наносили улавливающие антитела, разведенные в карбонатно-бикарбонатном буфере, с концентрацией 1-5мкг/лунку. Планшеты сенсибилизировали ночь при 4°С или 2 часа при 37°С. После блокировки в течение 1 часа при комнатной температуре в лунки планшета вносили последовательно разведенные в рабочем буфере испытуемые и контрольные пробы вируссодержащей жидкости. После инкубации в течение 30 минут при 37°С и промывки в каждую лунку заливали раствор детекторных антител в рабочем разведении. Планшеты инкубировали 30 минут при 37°С. После промывки планшетов вносили антивидовой перок-сидазный конъюгат. Окрашивание производили субстратной смесью АБТС или ОФД после инкубации планшета в течение 30 минут при 37сС и последующей отмывки. Реакцию останавливали соотвотстоующим субстрату раствором, после чего измеряли оптическую плотность содержимого каждой лунки на спектрофотометре "Униплан" при длине волны 405 им (субстрат АБТС) или 492 нм (субстрат ОФД).

Б-ИФА. Блокирующий вариант ИФА (Б-ИФА) проводили в два этапа: 1) жидкая фаза, 2) твердая фаза. К разведениям вируссодержащих проб аллантоисной жидкости куриных эмбрионов или гомогенатам тканей органов кур добавляли равный объем блокирующих антител и неионный детергент ЫР40 до конечной концентрации 1%. Также готовили смесь нормальной, не содержащей вируса ИБК, аллантоисной жидкости. Смесь инкубировали ночь при комнатной температуре (с МАт) или 1 час при 37°С (с 1дСкуР1ЦЬ,, 1дСкро™<а) и наносили на планшеты с разными антигенами по 100 мкл в лунку. Далее проводили реакцию Н-ИФА. Планшеты вы-

бочем разведении, после инкубации 30 минут при 37СС планшеты снова отмывали и окрашивали субстратной смесью АБТС. Измеряли оптическую плотность и вычисляли процент блокирования Б% по формуле:

0Писсл.прс6ы ' 0/7 контроля фона

Б% = 100----у 100 (1)

ОПконтроля ' ОПкоитрсля фона

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.2.1. Разработка тест-системы для определения антител к вирусу инфекционного бронхита кур на основе непрямого варианта иммуноферментного анализа (Н-ИФА)

Разработка данной тест-системы включала в себя выбор оптимального разведения сыворотки, вывод коэффициентов уравнения линейной регрессии для количественного анализа полученных результатов, определение позитивно-негативного порога для качественной интерпретации данных и допустимых значений ОП контрольных сывороток.

Выбор оптимального разведвния сыворотки. Для определения оптимального разведения предварительно методом последовательных разведений исследовали сыворотки крови кур с различным уровнем антител к вирусу инфекционного бронхита (60 сывороток). На основе полученных результатов выбрали для проведения исследований разведение пробы 1:400.

Вычисление титра антител к вирусу ИБК. Для быстрой и предельно точной интерпретации результатов с помощью компьютерной программы «^айэйса» на основе данных, полученных в ходе исследований, была построена калибровочная кривая и выведены коэффициенты для уравнения линейной регрессии. Уравнение позволяло переводить значение оптической плотности исследуемой сыворотки в числовое значение титра (рис. 1).

1дТ = 3.838 * 1.473 »IgS/P

Корреляция: г = .97322

IgS/P

Рис. 1. Калибровочная крияая и уравнение для определения числового значения титра антител

Позитивно - негативный порог (ПНП). Позитивно-негативный порог определяли по методу S/P отношения, для чего 33 заведомо отрицательных сыворотки крови от СПФ-цыплят, протестированные с помощью коммерческого набора фирмы KPL, исследовали методом последовательных разведений. В качестве положительного и отрицательного контроля были взяты стандартные контрольные сыворотки. Среднее значение оптической плотности нормальных сывороток суммированное с утроенным значением стандартного отклонения и составило значение оптической плотности, соответствующее наибольшему отрицательному значению - 0,185. Определяли пороговое значение S/P и по формуле (рис. 1) находили пороговые значения титра. Титр антител в пределах 0 - 1:350 считали отрицательным, 1:351 - 1:700 - сомнительным, от 1:701 и выше - положительным.

Допустимые значения контрольных сывороток. Для получения достоверных результатов при подсчете титра антител в анализируемой сыворотке большое значение имеет выбор положительного и отрицательного контролен. На основе анализа значений оптической плотности контрольных сывороток из разных серий наборов, исследованных в разведении 1:400, было показано, что допустимыми значениями оптической плотности контрольных сывороток являются значения, лежащие в диапазоне: для положительного контроля - от 0,450 до 0,950, для отрицательного контроля - от 0,08 до 0,150.

Определенные таким образом параметры iccr сисгомы были пподоны п компьютерную программу «Иммуноферментный анализ (СИНКО-ИФА)», разрабо-

тайную Зинковским Ю.В. с соавторами (авторское свидетельство №2000611338).

Сравнение значений титров, полученных при использовании разных субстратов. Методом одного разведения при использовании разных субстратов (ОФД и АБТС) были исследованы 112 сывороток с различным уровнем антител к вирусу ИБК (протестированные с применением набора фирмы KPL). Для каждого субстрата вычисляли коэффициенты уравнения линейной регрессии. Таким образом, были получены следующие уравнения: -lg-T-=-3.838^J.4Zi-J(t^iP (при использовании субстрата АБТС),

1дТ = 3,844 + 1,463 • Ig S/P (при использовании субстрата ОФД).

Титры, вычисленные для сывороток, имели хорошее согласование между собой. Корреляция составила 98%. Результаты показали, что выбор субстрата не имеет существенного значения при определении числового значения титра антител к вирусу ИБК в сыворотках крови кур.

Определение относительной чувствительности и специфичности тест-системы ВНИИЗЖ по сравнению с набором фирмы KPL и реакцией вирусной нейтрализации. С использованием наборов ВНИИЗЖ и KPL было протестировано 518 полевых сывороток, из них 364 были положительными, а 154 - отрицательными на наборе KPL, и 337 и 181, соответственно, на наборе ВНИИЗЖ.

Ткр! * 536.91 * .19919 • Тениизж Корреляция: г = .91033

55000

45000

35000

5 25 ООО t—

15000 5000

-5000

о о 8Л „•.с Os »

» Q 9 ° О

ÖJ

р 0

-5000 5000 15000 25000 35000 45000 55000 Твнииэж

Регрессияс

95% довер.интервалом

Рис. 2. Сравнение результатов тестирования 518 сывороток, полученных с использованием наборов ВНИИЗЖ и KPL

Чувствительность и специфичность набора ВНИИЗЖ относительно набора KPL, подсчитанные по HayhowC. S. (1993), равнялась 91% и 96%, соответствен-

но. Корреляция между коммерческими наборами KPL и ВНИИЗЖ составила 91% (рис.2). Полученная формула позволяла интерпретировать результаты исследований, полученные с использованием двух наборов.

Корреляция результатов, полученных при исследовании 1D0 сывороток в Н-ИФА и реакции нейтрализации (РН), составила 87%. Система Н-ИФА не уступала по специфичности PW (сыворотки крови СПФ-кур, отрицательные в РН, были также отрицательны в Н-ИФА) и превосходила по чувствительности.

Применение набора для определении антител к вирусу ИБК Исследование трансовариального иммунитета. Наблюдали падение уровня материнских антител у цыплят на четырех птицефабриках, исследуя пробы сывороток крови, отобранные у них в возрасте 1, 7, 14, 18, 21 суток (рис. 3). Анализ результатов выявил общую закономерность в динамике снижения уровня антител к ИБК у цыплят, который к 21 дню был ниже минимального положительного значения (Т s 700).

позраст птицы (дни)

Рис. 3. Динамика снижения материнского иммунитета у цыплят четырех птицефабрик

Изучение гуморального иммунного ответа кур на вакцинацию. При исследовании четырех групп сывороток крови кур, иммунизированных разными вакцинами против ИБК, наибольший гуморальный иммунный ответ наблюдали у кур на введение инактивированных вакцин. Сыворотки кропи, полученные от цыплят,

иммунизированных полиштаммовой вакциной и ассоциированной вакциной ИБК+БН+ССЯ после двух прививок живой вакциной штамма Н120, на 21 день после последнего введения вакцинных препаратов имели средний титр антител, равный 1:12961 и 1:13605, соответственно.

вакцины

Рис. 4. Уровень антител у кур на 21 день после введения вакцины Примечание. 1 - ассоциированная живая (штаммы Н120 вируса ИБК и Ла-Сота вируса БН); 2 - моновалентная живая (штамм Н120); 3 - полииламмовая инактивированная (штаммы Н52, Д274, 4/91 вируса ИБК); 4 - ассоциированная инактивированная (штаммы Н52 вируса ИБК, Ла-Сота вируса БН, В 8/78 вируса ССЯ).

В сыворотках крови кур, однократно иммунизированных живой вакциной штамма Н120 и живой ассоциированной вакциной ИБК+БН, через 21 день обнаруживали наличие антител со средним титром 1:2304 и 1:2848, соответственно (рис. 4).

С использованием набора на основе данной тест-системы изучали общую динамику развития поствакцинального иммунитета у кур после применения живых и инактивированных вакцин, обнаруживали антитела к вирусу ИБК у невакциниро-ванных птиц, тестируя сыворотки крови, поступившие с птицефабрик России и ближнего зарубежья. За период с 1998 г. по 2000 г. было исследовано 33000 сывороток с 262 птицефабрик.

2.2.3. Использование синтетического пептида P-S2 в качестве антигена Рассматривали возможность альтернативного применения синтетических антигенов. Использовали пептид, синтезированный (к.б.н. A.A. Луговским) в соответствии с аминокислотной последовательностью N-концевого участка пепломер-ного белка S2 вируса ИБК, который обозначили как P-S2. Для проведения реакции Н-ИФА пептид P-S2 наносили на планшеты в концентрации 0,5 мкг на лунку. Синтетический антиген взаимодействовал с сыворотками кур, иммунизированных штаммами Н120, Д1466 и Д274, с сыворотками крови морских свинок, иммунизированных штаммами Н120 и 4/91.

Таблица 1.

Связывание вирусспецифических сывороток с пептидом и антигенами вируса ИБК

сыворотки антигены вируса ИБК P-S2

Н120 Д1466 Д274 4/91

5курицы на Н120 1:12800 1:3200 1:6400 н/и* 1:800

Sкурицы наД1466 1:800 1:800 1:800 н/и 1:100

Эюицы на Д274 1:1600 1:800 1:6400 н/и 1:400

Suop.ceuHKu на Н120 1:25600 н/и н/и 1:25600 1:800

Suop.ceuHKu на 4/91 1:6400 н/и н/и 1:12800 1:800

Примечание. Н/и* - не исследовали.

Пептид по своей специфичности не уступал вирусному антигену. В Н-ИФА с использованием двух антигенов параллельно исследовали 567 сывороток крови кур с разным уровнем антител к вирусу ИБК. Результаты исследования, которые оценивали по значениям S/P каждой пробы в соответствии с установленными для P-S2 и вирусного антигена ПНП, совпадали по качественным характеристикам на 88%.

2.2.4. Разработка «сзндвичя-варианта непрямого иммуноферментного анализа для обнаружения антигена вируса ИБК

Разработка метода С-ИФА включала в себя испытание разных комбинаций детекторных и улавливающих антител, исследование их на специфичность и чувствительность. Наиболее чувствительной из испытанных комбинаций оказалась система, в которой использовали в качестве улавливающих антител Stp0™«a, полученных на Н120, в качестве детекторных антител Бысвинки - на Н120. Она позволяла обнаруживать антиген вируса ИБК в разведении, соответствующем 10s'1 - 105,s ЗИД50/МЛ. Значения ОП лунок с пробами, содержащими гетерологичные антигены, не превышали значения ОП отрицательного контроля. Однако некоторые нормальные аллантоисные жидкости давали сильное неспецифическое связывание. Отсутствие в этих пробах генома вируса ИБК было подтверждено ПЦР. Этот факт

ставил под сомнение полученные в данном варианте С-ИФА результаты. В С-ИФА с комбинацией Бм.свижи- ^курицы неспецифическая реакция отсутствовала, однако предел обнаружения этого варианта С-ИФА соответствовал лишь приблизительно 10е ЭИДэд/мл. Таким образом, неслецифичность одних вариантов С-ИФА и низкая чувствительность других заставили нас искать альтернативные пути для разработки более специфичного и чувствительного метода, позволяющего обнаруживать и количественно оценивать антиген вируса ИБК.

2.2.5. Разработка непрямого кидкофазного блокирующего варианта иммуноферментного анализа

-Разработка-Б-ИФА-включала-в-себя-подборглолучение,-оценку-блокирую-—

щих антител, испытание систем с разными блокирующими антителами и выбор оптимального по своей чувствительности и специфичности варианта Б-ИФА.

Получение препаратов блокирующих антител Пептидоспецифичвские иммуноглобулины крови морской свинки и курицы. Мы поставили перед собой задачу получить препарат 1дС, близкий по своим свойствам МАт. С этой целью двух-трехкратно иммунизировали синтетическим пептидом Р-Б2 морских свинок и кроликов. Были получены специфические сыворотки крови морских свинок с уровнем антител в среднем 1:442486 после двух иммуни-заций по 200 мкг Р-Э2 и кроликов в среднем - 1:166050 после трех иммунизации по 400 мкг Р-Э2 на животное. В целом, пептид обладал хорошей иммуногенно-стью. Однако полученные сыворотки практически совсем не связывались с вирусными антигенами ИБК штаммов Н120, Д1466 и "Чапаевский".

На примере антипептидной сыворотки морской свинки была разработана методика по очистке и выделению фракции 1дв путем аффинной хроматографии, которую затем применяли для выделения иммуноглобулинов, полученных на фрагмент белка Б2 вируса ИБК из сыворотки кур, иммунизированных смесью инактивированных вирусов ИБК штаммов Д274, Д1466 и 4/91.

Таблица 2.

Титр антител в препаратах 1дС нормой СВИНКИ и 1дО курицы

препарат антиген вируса ИБК Р-Э2

5и„в „и«™ до выделения 1д652 1:102400

5,,ог.с.1и«и после выделения 1двВ2 - 1:12800

1д052*иорско0 спинпи - 1:204800

8,юииы до выделения 1дЭ52 1:12800 1:1600

цыПосле выделения 1дС52 1:12800 1:100

'яб52 „ИрШ,ы 1:3200 1:6400

Примечание. -* - 1д882М0рс,0« с,„„,и не связывались с антигеном вируса ИБК; 1дС52" - готовый препарат иммуноглобулинов после осаладения бета сульфатом аммония и диализ а.

Синтетический пептид иммобилизовали на ВгСЫ-сефарозе. Эффективность иммобилизации пептида на матрице составила 78,03%.Все этапы очистки и выделения 1дС морской свинки и курицы контролировали проведением Н-ИФА методом последовательных разведений (табл. 2).

Качество препарата 1д032МОр. свинки, оценивали после проведения электрофореза в 12,5%-м полиакриламидном геле (рис. 5).

12.....3.....4 5 ""б 7 8 9

Рис. 5. Электрофорез в 12,5% полиакриламидном геле

Примечание. 1 - маркер; 2 - сыворотка крови морской свинки, иммунизированной синтетическим пептидом Р-Э2 (1:10); 3 - сыворотка крови морской свинки, иммунизированной синтетическим пептидом Р-Э2 (1:40); 4 - 1дС52«,р аин«и после осаждения (МНД)250„ (1:10); 5 - !дС32„о0 после осалдения (ЫН^ЭО^ (1:40); 6, 8 - 1дС52„о,, «инки после аффинного выделения из сыворотки (1:10); 7, 9 - 1дС32моц еви»™ после аффинного выделения из сыворотки (1:40); Н - тяжелые цепи 1д(3; I. -легкие цепи 1дЗ.

Концентрация специфического белка в препаратах 1дС52М0рск0й свинки, и 1дЭ52 курицы, измеренная по методу Бредфорда, составила 1,2мг/мл и 0,81мг/мл, соответственно. Полученный препарат 1д052«уричы использовали в Б-ИФА в качестве блокирующих антител в разведении 1:500.

При выделении пептидоспецифических иммуноглобулинов большое значение имеет подбор куриной сыворотки. В работе использовали несколько препаратов 1дС52курицы- Они имели разное сродство к пептиду, титры антител в Н-ИФА были в пределах от 1:400 до 1:6400, в то время как с вирусным антигеном 1дС52еджцы давали стабильный результат (1:1600-1:3200). Поэтому при разработке данного варианта Б-ИФА использовали в качестве подложки антиген вируса ИБК.

Вирусспецифические иммуноглобулины крови кролика. Иммуноглобулины выделяли из сыворотки крови кролика, трижды иммунизированного антигеном ви-

руса ИБК штамма Н120, методом аффинной хроматографии на ВгСМ-сефароэо с белком А. Концентрация белка в препарате составила приблизительно 2мг/мл.

Б-ИФА с использованием МАт. Первоначально метод разрабатывали с использованием антигена вируса ИБК штамма "Чапаевский" и синтетического пептида Р-Б2 для адсорбирования на планшетах и МАт, выработанных на штамм М41 вируса ИБК и хорошо взаимодействующих в Н-ИФА с тем, и с другим антигеном, для блокирования. Участок связывания МАт с вирусными белками предварительно не был картирован, но высокая степень взаимодействия МАт с Р-Э2 позволила предположить, что исследуемые моноклональные антитела получены на эпитоп, лежащий именно в этом района белка 82. Моноклональные антитела взаимодействовали с антигеном вируса ИБК, содержащемся в пробах аллантоисной жидкости, что выражалось в блокировании связывания МАт с вирусным и синтетическим антигенами. Пробы исследовали в разведении 1:2 при использовании системы с вирусным антигеном и 1:4 - с синтетическим антигеном. Процент блокирования подсчитывали по отношению к отрицательному контролю. Исходная вируссо-держащая аллантоисная жидкость куриных эмбрионов демонстрировала с вирусным и синтетическим антигенами 48% и 51% блокирования, соответственно. Концентрированный в 100 раз препарат - 76% и 74%, соответственно.

Б-ИФА с использованием 1д052куРицы. Разработали тест-систему с использованием в качестве блокирующих антител препарат 1дС52г/Рицы,. Оптимизировали условия постановки реакции Б-ИФА. Было показано, что максимальное блокирование 1дС82«урИцы происходило в течение первого часа инкубирования исследуемой пробы с блокирующими антителами при 37°С. Добавление к пробе неионного детергента ИР40 до конечной концентрации 1% повышало специфичность и чувствительность реакции. Для постановки реакции Б-ИФА выбрали разведение исследуемого материала 1:2, так как при этом не наблюдалось неспецифического связывания, пробы отрицательные к вирусу ИБК и положительные, с разным содержанием антигена вируса ИБК, имели четкие отличия по проценту блокирования.

Количественный анализ осуществляли по формуле 1. Для качественной характеристики исследуемых проб установили ПНЛ: процент блокирования до 17% считали отрицательным, 22% и выше - положительным, промежуточные значения - сомнительными. Разработанная тест-система была строго специфична по отношению к антигену вируса ИБК. Уровень блокирования аллантоисных жидкостей, содержащих гетерологичныэ антигены, не превышал уровня блокирования нор-

мальных (1-15%), в то время как пробы, содержащие антиген вируса ИБК, демонстрировали высокий процент блокирования (49-94%). Воспроизводимость результатов, определенная при тестировании одних и тех же проб на 7 разных планшетах с антигеном вируса ИБК, была высокая, среднее стандартное отклонение составляло 5%.

Чувствительность Б-ИФА с использованием 1д052«урИЦы определяли по отношению к инфекционной активности исследуемых проб, определенной титрованием на куриных эмбрионах. Предельное разведение аллантоисной жидкости, в котором еще определяли присутствие антигена вируса ИБК штамма Н120, было 1:16 и соответствовало 105,8 ЭИД5с/мл (22%), антиген вируса ИБК штамма Н52 обнаруживали в разведении 1:64 с минимальным процентом блокирования - 23%, что соответствовало Ю49 ЭИДк/мл.

Рис. 6. Исследование сырья для изготовления вакцины и диагностических наборов и образцов готовой вакцины в Б-ИФА с использованием (дСБ^у^ь,

Данный вариант Б-ИФА использовали для количественной оценки исследуемого антигенного материала и для обнаружения вируса ИБК в пробах аллантоисной жидкости после пассирования образцов патматериала на куриных эмбрионах. Материалы, содержащие вирус ИБК разных штаммов (Н120, Н52, Д274, Д1466, 4/91, М41, «Чапаевский») как исходное сырье, так и готовые препараты вакцины, демонстрировали процент блокирования от 40 до 77, в среднем, в то

время как концентраты вируса - 92-96% блокирования. Значение процента блокирования зависело от исходной концентрации вируса в препарате (рис. 6). При исследовании в Б-ИФА 11 проб аллантоисной жидкости, положительных в ПЦР, после одного или нескольких слепых пассажей на куриных эмбрионах образцов пат-материала 9 из них также были положительны в Б-ИФА (табл. 3).

Таблица 3.

Исследование образцов патологического материала в Б-ИФА и ПЦР

№ п/п образцы патматериапа Б-ИФА ПЦР

Б'Л +/-

1. 5/00 (1 пассаж) 78±2% +

—2 -2/99{7-пассаж)- -73±2%- -+- -+-

3. 1/99 (4 пассаж) 44±3% + +

4. 1/98 (5 пассаж) 94±1% + +

5. 3/00 (1 пассаж) 78±6% + +

6. ■ 2/00 (2 пассаж) 77±1% + +

7. 1/00 (2 пассаж) 73±4% + +

а. 6/00 (2 пассаж) 61 ±3% + +

9. 4/00 (2 пассаж) 68±5% + +

10. 7/00 (1 пассаж) 11 ±2% +

11. 8/00 (1 пассаж) 14±3% - +

Б-ИФА с использованием lgGH120tpo„ua. Чтобы повысить чувствительность исследований антигена в Б-ИФА в качестве блокирующих антител исполь-' зовали IgG, выделенные из сыворотки крови кролика, иммунизированного вирусом ИБК штамма Н120 (1д6Н120,фолим), методом аффинной хроматографии на сефарозе о белком А, Позитивно-негативный порог для исследуемых проб определяли в диапазоне разведений с 1:100 до 1:6400. Пробы, имевшие процент блокирования менее 20%, считали отрицательными, 30% и более - положительными, промежуточные значения - сомнительными.

Пробы аллантоисной жидкости с разной концентрацией антигена вируса ИБК исследовали методом последовательных разведений и методом одного разведения проб. За титр антигена вируса при постановке реакции методом последовательных разведений принимали такое разведение пробы, в котором значение ОП соответствовало или было близко наименьшему положительному проценту блокирования (30%). Для постановки реакции методом одного разведения выбрали разведение 1:100, так как в более низких разведениях нормальной аллантоисной жидкости наблюдали неспецифическое блокирование (рис. 7).

Чувствительность Б-ИФА с использованием 1д6И120,ролика определяли, исследуя методом последовательных разведений образцы вируссодержащей аллантоисной жидкости куриных эмбрионов с известной инфекционной активностью.

Проба аллантоисной жидкости куриных эмбрионов, зараженных штаммом Н120, при титровании на куриных эмбрионах имела инфекционную активность 107'2ЭИД5о/мл, штаммом Н52 - 10б'7ЭИД5о/мл, штаммом Д274 - 107'7ЭИДоо/мл, штаммом 4/91 - 106'7ЭИД5о/мл.

10 100 1000 разведения аллантоисной жидкости

Рис. 7. Исследование проб аллантоисной жидкости куриных эмбрионов в Б-ИФА с использованием с IgG, Примечание. АЖ" - нормальная АЖ; АЖдгг* - АЖ куриных эмбрионов, зараженных вирусом ИБК штамма Д274; АЖга1 - АЖ куриных эмбрионов, зараженных вирусом ИБК штамма 4/91; АЖН52 -АЖ куриных эмбрионов, зараженных вирусом ИБК штамма Н52; АЖшго - АЖ куриных эмбрионов, зараженных вирусом ИБК штамма Н120.

В Б-ИФА эти пробы демонстрировали титр антигена 1:1600, 1:3200, 1:6400 и 1:6400, соответственно. Таким образом, предел чувствительности Б-ИФА составил для антигена штамма Н120 Ю^ЭИДю/мл, для антигена штамма Н52 -Ю3,2ЭИД5о/мл, для антигена штамма Д274 - 103'9ЭИДю/мл и для антигена штамма 4/91 - 102,9ЭИД5о/мл. В среднем антиген вируса ИБК обнаруживали в разведении, соответствующем 103-1 С'ЭИДбо/мл.

Специфичность системы проверяли, исследуя отрицательные в ПЦР пробы, которые представляли собой концентрированные препараты антигенов вирусов FAV4, МГ, ССЯ, ИББ, PEO и БН. Пробы тестировали в разведении 1:100. Все пробы были отрицательны в Б-ИФА с использованием lgGH120KpOnma.

С использованием двух методов постановки реакции параллельно исследовали 82 пробы аллантоисной жидкости куриных эмбрионов с разным содержа-

нием антигена вируса ИБК. отношения S/N (отношение

Для каждой исследуемой пробы определяли значение ОП исследуемой пробы к ОП контроля 1дС).

ig Т а 2.361 - 1.680 * Ig S/N

Корреляция: г « -.9431

Ig S/N

Рис. 8. Калибровочная кривая и уравнение для вычисления значения титра антигена вируса ИБК в Б-ИФА

Рис. 9. Исследование сырья для изготовления пакцины и диагностических наборов в Б-ИФА с использованием 1дв, Примечание. Значение Б% определяли при разведении проб 1:100.

На основе полученных данных с использованием компьютерной программы «Statistica» вычислили коэффициент корреляции и коэффициенты для уравнения линейной регрессии перевода значения S/N в логарифмированное значение титра (рис. 8). Корреляция между результатами, полученными при использовании двух методов, составила 94%. Формула позволяла осуществлять компьютерную обработку данных.

Разработанную тест-систему использовали для исследования проб вакцинного сырья (рис. 9) и образцов патматериала (табл. А). Как видно из рис. 9, пробы аллантоисной жидкости куриных эмбрионов, зараженных штаммами Д274, 4/91, Н52 и Н120, демонстрировали 59-88% блокирования в среднем. Инактивирование 0,1%-м диметилэтиленимином не влияло на активность антигена вируса в Б-ИФА.

Таблица 4.

Обнаружение вируса ЦБК в образцах патологического материала

№ п/п образцы патматериала Б-ИФА ПЦР

Б'Л титрАГ +/-

1. 19/00(10% гомогенат тканей) 10% 1:274 - -

2. 20/00 (10% гомогенат тканей) 8% 1:264 - -

3. 22/00 (50% гомогенат тканей) 21% 1:341 - -

4. 17/00 (10% гомогенат тканей) 6% 1:255 - +

5. 18/00 (10% гомогенат тканей) 5% 1:250 - +

б. 23/00 (50% гомогенат тканей) 12% 1:284 - +

7. 12/00(1 пассаж) 81% 1:3741

8. 13/00 (1 пассаж) 80% 1:3428 + +

9. 12/00 (2 пассаж) 83% 1:4508 + +

10. 14/00 (2 пассаж) 66% 1:1219 + +

11. 15/00(1 пассаж) 74% 1:2208 + +

12. 16/00(1 пассаж) 58% 1:986 + +

13. 17/00 (2 пассаж) 56% 1:912 + +

Как показывал анализ табл. 4, чувствительность разработанного метода была недостаточна для обнаружения антигена вируса ИБК в тканях внутренних органов кур. Пробы 1-6 имели отрицательный титр в Б-ИФА, в то время как три из них (изоляты 4-6) обнаруживали присутствие вируса ИБК в ПЦР. Пробы 7-13 после пассирования на куриных эмбрионах были положительны как в ПЦР, так и в Б-ИФА.

з.выводы

1. Разработана тест-система на основе непрямого варианта ИФА и создан диагностический набор для определения титра антител к вирусу ИБК при тестировании сывороток в одном разведении. Определены рабочее разведение, критерии качественной оценки, допустимые значения оптической плотности контрольных

сывороток, коэффициенты уравнения для вычисления значения 1д Т. Параметры тест-системы введены в компьютерную программу «СИНКО-ИФА», разработанную во ВНИИЗЖ.

2. Установлено, что корреляция между результатами, полученными с применением разработанной тест-системы, и результатами базовой реакции нейтрализации составляет 87%. а между результатами разработанной тест-системы и коммерческого набора фирмы КР1. (США) - 91 %. Показано, что относительные чувствительность и специфичность реакции при применении тест-системы по сравнению с результатами, полученными с использованием набора КРЬ, состав--ляют-91 %-и-96%,-соответственно.----

3. С помощью разработанной тест-системы на основе непрямого варианта ИФА исследовано 33000 проб сывороток крови кур из 262 птицефабрик РФ и стран СНГ. В результате изучены динамика снижения пассивного иммунитета у цыплят, особенности гуморального поствакцинального иммунитета у птицы после применения живых и инактивированных вакцин, а также обнаружена циркуляция вируса ИБК у невакцинированного поголовья.

А. Показана возможность использования синтетического пептида (Р-82), аналога Ы-концевого участка белка Б2 вируса ИБК, в качестве антигена в тест-системе ИФА. При сравнении пептида с антигеном вируса ИБК на основании результатов тестирования 567 сывороток крови кур с разным уровнем антител к вирусу ИБК результаты совпадали по качественным характеристикам на 88%.

5. Показано при сравнении между собой разработанных тест-систем для выявления и количественной оценки антигена вируса ИБК на основе непрямого «сэндвича» и блокирующего варианта ИФА преимущество блокирующего варианта с различными компонентами (МАт, 1дС52КурщЫ, 1дСН120фоп„,8).

6. Предложена модифицированная методика аффинной очистки и фракционирования сывороток крови кур, иммунизированных вирусом ИБК, на ВгСМ-сефарозе с пептидом Р-Б2. Определены критерии качественной и количественной оценки результатов анализа и рабочее разведение исследуемых проб для тест-системы с 1др52 курицы. Относительная чувствительность системы соответствует Ю^ЭИДэо/мл.

7. Определены критерии качественной и количественной оценки, рабочее разведение исследуемых проб, рассчитаны коэффициенты для уравнения линейной регрессии определения значения 1д Т антигена, позволяющего осуществлять компьютерную обработку данных, для тест-системы Б-ИФА с использованием в

качестве блокирующих антител аффинно-выделенных на ВгСЫ-сефарозе с белком А 1дв кролика, иммунизированного вирусом ИБК штамма Н120. Относительная чувствительность системы соответствует 103"4 ЭИДю/мл.

8. С использованием метода Б-ИФА определена концентрация антигена вируса ИБК в 18 сериях вакцинного сырья и в 5 сериях сухих живых вакцин, а также обнаружен вирус ИБК в 21 исследуемой пробе патологического материала (полевые изоляты) после их пассирования на куриных эмбрионах.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Результаты проведенных исследований легли в основу следующих документов:

1. Комплект НТД для «Набора по определению антител к вирусу ИБК в сыворотках крови кур иммуноферментным методом»:

1 Технические условия (ТУ 9388-014-00495527-99) на набор для определения антител к вирусу инфекционного бронхита кур иммуноферментным методом (утверждены Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ 25.11.99.);

2)наставление по применению набора для определения антител к вирусу инфекционного бронхита кур иммуноферментным методом № 13-7-2/1791 (утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ 25.11.99.);

3)инструкция (регламент) по изготовлению и контролю диагностикумов и наборов для определения антител против вируса инфекционного бронхита кур иммуноферментным методом (одобрен ученым советом и утвержден директором ВНИИЗЖ 02.10.00.).

2. Комплект НТД для «Набора по определению антител к вирусу ИБК в сыворотках крови кур иммуноферментным методом при тестировании проб в одном разведении»:

1 Технические условия (ТУ 9388-022-00495527-00) на набор для определения антител к вирусу инфекционного бронхита кур иммуноферментным методом при тестировании сывороток в одном разведении (утверждены Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ 24.03.00.);

2)временное наставление по применению набора для определения антител к вирусу инфекционного бронхита кур иммуноферментным методом при тестировании сывороток в одном разведении № 13-7-2/1942 (утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ 24.03.00.);

3)инструкция (регламент) по изготовлению и контролю диагностикумов и наборов для определения антител против вируса инфекционного бронхита кур

иммуноферментным методом (одобрен ученым советом и утвержден директором ВНИИЗЖ 02.10.00.).

3. Методические указания по определению антител к вирусу инфекционного бронхита кур в сыворотке крови кур иммуноферментным методом (утверждены Департаментом ветеринарии Министерства сельского хозяйства РФ и директором ВНИИЗЖ) // В сборнике «Методические указания по диагностике заболеваний сельскохозяйственных животных иммуноферментным методом». -1996. - С.38-42.

4. Методическое руководство по определению антител к вирусу инфекционного бронхита кур в сыворотках крови птиц методом одного разведения в непрямом варианте иммуноферментного анализа (одобрено ученым советом и утверждено директором ВНИИЗЖ 29.10.99.).

5. Методические рекомендации по выявлению антигена вируса инфекционного бронхита кур в непрямом жидкофазном блокирующем варианте иммуноферментного анализа (одобрены ученым советом и утверждены директором ВНИИЗЖ 02.10.00.).

6. Методические рекомендации по выделению фракции иммуноглобулинов на участок пеппомерного белка S2 вируса инфекционного бронхита кур из сывороток крови животных с использованием аффинной хроматографии (одобрены ученым советом и утверждены директором ВНИИЗЖ 02.10.00.).

Список научных работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Луговская H.H., Мудрак Н.С., Дрыгин В.В, Борисов A.B. Оптимизация условий проведения непрямой реакции ИФА для определения антител к вирусу инфекционного бронхита кур // Проблемы инфекционной патологии сельскохозяйственных животных: Тезисы докладов конференции. - Владимир. -1997. - С.34-35.

2. Луговская H.H., Мудрак Н.С., Дрыгин В.В., Борисов A.B. Расчёт титра сывороток по одному разведению при иммуноферментной диагностике ИБК II Проблемы инфекционной патологии сельскохозяйственных животных: Тезисы докладов конференции, посвящённой 100-летию открытия вируса ящура. - Владимир. -1997.-С.35-36.

3. Луговская H.H., Мудрак Н.С., Дрыгин В.В., Борисов A.B. Иммунофермент-ная тест-система для определения антител к вирусу инфекционного бронхита кур // Роль ветеринарной науки в развитии животноводства: Материалы международной научно-производственной конференции. - Алматы. - 2000. - С.141-142.

4. Луговская H.H., Мудрак Н.С., Дрыгин В.В., Фролов C.B., Борисов A.B. Изучение основных характеристик иммуноферментного набора для определения ан-

тител к вирусу инфекционного бронхита кур (Институт защи^ыживотных) // Роль ветеринарной науки в развитии животноводства: Материалы международной научно-производственной конференции. - Алматы. -2000. — С. 139-140.

5. Луговская H.H., Мудрак Н.С., Дрыгин В.В., Борисов A.B. Контроль иммунного статуса поголовья кур на птицефабриках с применением иммуноферментно-го набора для определения антител к вирусу инфекционного бронхита (Институт защиты животных) // Роль ветеринарной науки в развитии животноводства: Материалы международной научно-производственной конференции. - Алматы. - 2000. - С.137-138.

6. Луговская H.H., Мудрак Н.С., Дрыгин В.В., Захарова Л.И., Борисов A.B. Разработка иммуноферментной тест-системы для определения антител к вирусу инфекционного бронхита кур // Достижения молодых ученых в ветеринарную практику: Материалы конференции молодых ученых. - Владимир. - 2000. - С. 140144.

7. Луговская H.H., Мудрак Н.С., Дрыгин В.В., Фролов C.B., Борисов A.B. Набор для определения антител к вирусу инфекционного бронхита кур: специфичность, чувствительность, стабильность антигена // Достижения молодых ученых в ветеринарную практику: Материалы конференции молодых ученых. - Владимир. -2000.-С. 145-150.

8. Луговская H.H., Мудрак Н.С., Дрыгин В.В., Борисов A.B. Применение набора для определения антител к вирусу инфекционного бронхита кур иммуно-ферментным методом при тестировании сыворотки в одном разведении // Достижения молодых ученых в ветеринарную практику: Материалы конференции молодых ученых, - Владимир. - 2000. - С.150-155.

9. Луговская H.H., Луговской A.A., Дрыгин В.В., Мудрак Н.С. Использование синтетического пептида в иммуноферментной диагностике инфекционного бронхита кур // Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными, экзотическими и зооангропонозными болезнями животных: Сборник статей международной научно-практической конференции. - Покров. - 2000. - С. 172-174.

10. Луговская H.H., Луговской A.A., Дрыгин В.В., Мудрак Н.С. Непрямой блокирующий вариант иммуноферментного анализа для обнаружения вируса инфекционного бронхита кур // Совершенствование методов контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов: Материалы Всероссийской научной конференции ВГНКИ. - Москва. -2001. - С.146-147.

Отпечатано нл б;пс отдела координации научных исслсдоплний. информации и международных спячсп ВНИИЗЖ. Тираж 80 зет. 2001 г.