Аспорогенный рекомбинантный штамм Bacillus anthracis – продуцент протективного антигена сибиреязвенного микроба

Шулепов, Дмитрий Викторович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Аспорогенный рекомбинантный штамм Bacillus anthracis – продуцент протективного антигена сибиреязвенного микроба
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Аспорогенный рекомбинантный штамм Bacillus anthracis – продуцент протективного антигена сибиреязвенного микроба"

На правах рукописи

Шулепов Дмитрий Викторович 00346S330

АСПОРОГЕННЫИ РЕКОМБИНАНТНЫИ ШТАММ BACILLUS ANTHRACIS -ПРОДУЦЕНТ ПРОТЕКТИВНОГО АНТИГЕНА СИБИРЕЯЗВЕННОГО МИКРОБА

03.00.07 - микробиология 03.00.04 -биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

о 2 апр 2::з

Саратов-2008

003466330

Работа выполнена в ФГУЗ "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научные руководители:

Доктор биологических наук, профессор

Кандидат медицинских наук

Попов Юрий Алексеевич Микшис Наталья Ивановна

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, доцент Доктор медицинских наук, профессор

Бойко Андрей Витальевич Еременко Евгений Иванович

Ведущая организация: ФГУЗ " Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт"

Защита состоится " CK * 2009 г. в Д

о о

_часов на заседании

диссертационного совета Д 208. 078. 01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора (кандидата) наук при ФГУЗ "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГУЗ "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб".

Автореферат разослан — 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук,

старший научный сотрудник / / Слудский A.A.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Сибирская язва - особо опасное зооантропонозное заболевание. Возбудителем инфекции является грамположительный спорообразующий микроорганизм -Bacillus anthracis, принадлежащий к роду Bacillus. Вследствие чрезвычайной резистентности к воздействию повреждающих факторов, споровые формы бактерий способны длительно сохраняться в объектах внешней среды. При попадании в организм человека или восприимчивого животного споры В. anthracis прорастают и инициируют развитие инфекционного процесса.

Ежегодно практически во всех регионах мира регистрируются многочисленные случаи сибиреязвенной инфекции. Эпидемическая обстановка по сибирской язве находится в прямой зависимости от эпизоотической ситуации (Бургасов П.Н., 1984). К увеличению эпидемических проявлений может привести расширение но-зоареала патогенного микроорганизма, ухудшение ветеринарного контроля за скотомогильниками и сельскохозяйственным сырьем, снижение масштабов иммунизации сельскохозяйственных животных и населения групп риска (Черкасский Б.Л. с соавт., 2002). Кроме того, необходимо помнить о трагичном опыте и возможности использования сибиреязвенного микроба в качестве биологического агента для совершения террористических актов и создания оружия массового поражения (Spencer R., Wilcox M., 1993; Jernigan J. et al., 2001; Bush L. et al., 2001; Spencer R., Lightfoot N.. 2001; Brachman P., 2002).

В реализации патогенного действия сибиреязвенного микроба ключевая роль отводится полиглютаминовой капсуле и бифункциональнуму экзотоксину. Капсула защищает бактериальные клетки от фагоцитоза, способствуя их размножению и накоплению в организме хозяина. Экзотоксин, состоящий из протективного антигена (ПА), отечного (ОФ) и летального (ЛФ) факторов, запускает основные звенья патогенеза сибиреязвенной инфекции. При взаимодействии протеолитически активированного ПА с ОФ и ЛФ образуются токсичные комплексы, оказывающие повреждающее действие на клетки макроорганизма (Leppla S., 1991; Singh Y. et al., 1989).

За синтез и регуляцию компонентов экзотоксина отвечают гены, входящие в состав плазмиды pXOl (182 т.п.н.). Образование капсулы кодируют детерминанты,

расположенные на внехромосомном репликоне рХ02 (93,5 т.п.н.) (Mikesell P. et al., 1983; Uchida I. et al., 1985; Okinaka R. et al., 1999). Вакцинные штаммы, лицензированные для использования в медицине (В. anthracis СТИ-1) или ветеринарии (Я anthracis Sterne34F2, В. anthracis 55), в процессе атгенуации утратили плазмиду рХ02. Результатом элиминации рХ02 стало резкое снижение их вирулентности. Чувствительные к фагоцитозу микробные клетки неспособны реализовать свое патогенное действие. Иммуногенность вакцинных штаммов обеспечивается, главным образом, протективным антигеном (ПА) - одним из компонентов экзотоксина. На основе ПА в середине прошлого столетия ученые разработали химическую вакцину для иммунопрофилактики людей (Wright G. et al., 1954).

В производстве лицензированных бесклеточных препаратов продуцентами ПА служат аттенуированные штаммы В. anthracis. В специальных условиях выращивания они экскретируют сибиреязвенный токсин. Опыт выделения ПА из куль-туральных фильтратов аттенуированных штаммов В. anthracis показал, что полного разделения компонентов сибиреязвенного токсина, имеющих лишь небольшие отличия в значениях молекулярных масс (ПА - 83 кДа, ОФ - 89 кДа, ЛФ - 85 кДа), достигнуть практически невозможно. Данное обстоятельство неблагоприятно сказывается на свойствах выпускаемых в настоящее время химических вакцин. По данным медицинских наблюдений в США у 30 % людей, вакцинированных против сибирской язвы, наблюдаются локальные реакции в виде аллергических проявлений или даже некроза тканей (Swanson-Biearman В., Krenzelok Е., 2001). Еще одной проблемой промышленного получения ПА является его выраженная деградация на этапах выделения и очистки, что связано с высокой активностью протеолитических ферментов большинства культур В. anthracis.

С развитием генно-инженерных технологий стало возможным получение ре-комбинантных штаммов, продуцирующих только один компонент токсина - ПА. Известно много прецедентов клонирования детерминанты синтеза ПА (pag) в штаммах различных видов бактерий, а также в геномах вирусов и трансгенных растений (Тедиков В.М., Добрица А.П., 1993; Алимов А.П., Павлов В.М., 1995; Дар-мов И.В. с соавт., 1999; Vodkin М., Leppla S., 1983; Ivins В., Welkos S., 1986; lacono-Connors L. et al., 1991; Coulson N. et al, 1994; Baillie L. et al., 1998; Zegers N. et al., 1999; Barnard J., Friedlander A., 1999; Gupta P. et al., 1999; Cohen S. et al., 2000;

Chauhan V. et al., 2001; Garmory H. et al., 2003; Azhar A. et al., 2002; Hull A. et al., 2005; Chichester J. et al., 2007; Stokes M. et al., 2007). Однако далеко не во всех случаях авторам удалось добиться стабильного функционирования гибридных плаз-мид в гетерологичных системах. Проблематичным оказалось и достижение достаточно высокого уровня продукции ПА.

Ранее в лаборатории прикладной генетики РосНИПЧИ "Микроб" были созданы генно-инженерные штаммы, продуцирующие ПА (Микшис Н.И. с соавт., 2007). Посредством встраивания участка pXOl, содержащего ген pag, детерминирующий синтез ПА сибиреязвенного микроба, в мультикопийный вектор pUBl 10 по сайтам рестрикции BamHl была сконструирована гибридная плазмида pUBl ЮРА и селектирован ее делеционный вариант pUBl 10РА-1. Плазмида pUBl 10РА-1 стабильно функционировала в геномах бациллярных штаммов В. anhtracis СТИДТ, В. anth-racis 55ДТ и В. subtilis WB600, обеспечивая продукцию ПА на уровне до 100 мкг/мл, что в несколько раз превышает секретируемый синтез данного белкового продукта, зарегистрированный для вакцинных штаммов В. anthracis.

С позиций биологической и экологической безопасности в промышленном производстве химических сибиреязвенных вакцин предпочтительнее использование штаммов-продуцентов, не образующих спор. Анализируя отечественный и зарубежный опыт создания бациллярных продуцентов ПА, выявили лишь единичные случаи получения их аспорогенных вариантов. Самой перспективной оказалась конструкция на основе рекомбинантного штамма В. anthracis ASteme-l(pPA102) (Worsham P., Sowers M., 1999). Хотя селектированный в его популяции спонтанный аспорогенный мутант отличался выраженной протеолитической активностью, добиться приемлемого выхода очищенного ПА (20 - 30 мкг/мл) удалось за счет коррекции условий его культивирования (Farchaus J. et al., 1998). В США зарегистрирован патент на метод приготовления химической вакцины на основе ПА, продуцируемого аспорогенным штаммом В. anthracis ASterne-1 (рРА 102)CR4 (Ivins В. et al., 2002). Отечественных аналогов продуцентов для безопасной и экологичной технологии выделения ПА не существует.

Все вышеизложенное определяет актуальность планируемой диссертационной работы, целью которой является: получение стабильного аспорогенного ре-

комбинантного штамма В. anthracis и оценка его в качестве продуцента протектив-ного антигена сибиреязвенного микроба.

Задачи исследования:

1. Получить рекомбинантный штамм с клонированным геном pag, являющийся продуцентом протекгивного антигена сибиреязвенного микроба и характеризующийся отсутствием способности к образованию спор.

2. Оценить стабильность биологических свойств аспорогенного реком-бинантного штамма-продуцента в условиях хранения и при культивировании на питательных средах.

3. Провести оценку уровня продукции протекгивного антигена сконструированного штамма, сравнить с уровнями продукции вакцинных культур.

4. Оптимизировать условия культивирования аспорогенного рекомби-нантного штамма, разработать экспериментальную схему выделения и хромато-графической очистки протекгивного антигена из его культурального фильтрата.

5. Получить высокоочищенный препарат рекомбинантного протективно-го антигена, осуществить его биохимическую и иммунохимическую характеристику.

6. В экспериментах ш vivo показать перспективность использования рекомбинантного протекгивного антигена в создании профилактических сибиреязвенных препаратов.

7. Получить поликлональные антитела к рекомбинантному IIA и оценить возможность их применения для постановки иммунохимических реакций.

Научная новизна исследования:

Впервые на основе бесплазмидного производного отечественного вакцинного штамма В. anthracis 55 получен аспорогенный рекомбинантный продуцент про-тективного антигена сибиреязвенного микроба. Штамм стабильно наследует гибридный репликон pUBl 10РА-1 и не реверсирует к спорообразующему фенотипу.

Сконструированный штамм не содержит гены, детерминирующие синтез факторов вирулентности В. anthracis, и характеризуется низкой активностью про-теолитических ферментов. Перспективы его использования в качестве продуцента протективного антигена связаны с отсутствием риска контаминации помещений и оборудования спорами В. anthracis.

Аспорогенный бациллярный штамм с клонированным геном pag - В. anthracis 55ATnA-lSpo\ продуцирует в 4 раза больше протективного антигена, чем вакцинный штамм В. anthracis 55.

Биологические характеристики протективного антигена, синтезируемого штаммом В. anthracis 55ATnA-I(Spo"), позволяют предложить его в качестве основного компонента современных химических и комбинированных сибиреязвенных вакцин. Установлено, что двукратная иммунизация кроликов дозой 50 мкг очищенного препарата протективного антигена, выделенного из аспорогеннного рекомбинантного штамма В. anthracis 55ATnA-lSpo", обеспечивает защиту 100% животных от заражения 50 ЛД50 высоковирулентного штамма В. anthracis 81/1.

Научная новизна и приоритетность выполненных исследований подтверждена патентом Российской Федерации на изобретение: № 2321629 - аспорогенный ре-комбинантный штамм В. anthracis 55ДТПА-1 Spo" (pUB110PA-l) - продуцент протективного антигена сибиреязвенного микроба.

Практическая ценность и формы внедрения:

В Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» депонирован рекомбинантный штамм - В. anthracis 55ATITA-lSpo'(КМ97) - стабильный аспорогенный продуцент протективного антигена возбудителя сибирской язвы.

Штамм и иммунные сыворотки к ПА использовались при выполнении генетических, молекулярно-генетических, молекулярно-биологических, биохимических и других исследований по плановым НИР: "Конструирование рекомбинантных штаммов Bacillus anthracis для создания нового поколения высокоэффективных сибиреязвенных вакцин" (№ Гос. регистрации 0.1.200.208130, 2002 - 2004 гг.), «Использование препаратов протективного антигена и белков S-слоя для создания средств диагностики и профилактики сибирской язвы» (№ Гос. регистрации 0120.0 603179, 2006-2008 гг.), а также в совместных исследованиях с отделом профилактических препаратов РосНИПЧИ "Микроб".

По материалам диссертации составлены методические рекомендации "Комплекс методических подходов к определению продукции протективного антигена сибиреязвенного микроба", одобренные Ученым советом РосНИПЧИ «Микроб» и утвержденные директором РосНИПЧИ «Микроб» (протокол Ученого совета РосНИПЧИ "Микроб" №2 от 17.04.06 г.)

Материалы диссертации используются в лекциях по генетике бактерий на курсах специализации и повышения квалификации врачей и биологов при Рос-НИПЧИ «Микроб» и биотехнологическом факультете Саратовского Государственного аграрного университета имени Н.И. Вавилова.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Получен аспорогенный рекомбинантный продуцент протективного антигена - В. anthracis 55ATíIA-l(Spo"). При пассировании in vitro штамм сохраняет свойство аспорогенности и способность к репликации гибридной плазмиды. Рекомбинантный штамм содержат структурный ген pag в составе гибридного репли-кона pUBllOPA-1 и не содержат детерминанты, кодирующие синтез основных факторов патогенности возбудителя сибирской язвы.

2. Уровень продукции протективного антигена аспорогенным генно-инженерным штаммом составляет около 80 мкг/мл, что в 4 - 5 раз больше значений, установленных для вакцинных штаммов В. anthracis СТИ-1 и В. anthracis 55.

3. Из сконструированного штамма В. anthracis 55ATnA-l(Spo") выделен белковый препарат, на основании биохимических, иммунохимических и иммунологических характеристик являющийся протективным антигеном сибиреязвенного микроба. Получены поликлональные антитела к рекомбинантному протективному антигену, перспективные для осуществления диагностических исследований.

4. Протективный антиген, синтезируемый аспорогенным рекомбинантным продуцентом, является биологически активным. Двукратная иммунизация дозой 50 мкг очищенного рекомбинантного продукта обеспечивает защиту 100 % кроликов от заражения 50 ЛД50 высоковирулентного штамма возбудителя сибирской язвы.

2006 г.); IX съезде всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007); Межгосударственной научно-практической конференции «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ» (Саратов, 2007), а также на научных конференциях РосНИП-ЧИ "Микроб" (Саратов, 2005-2008).

Публикации. Основное содержание работы отражено в 12 научных публикациях, из них - 1 статья в рекомендованных ВАК изданиях, 1 патент и 10 тезисов, в том числе 6 тезисов в сборниках международных и Российских конференций.

Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, списка принятых обозначений и сокращений, обзора литературы, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 39 отечественных и 95 зарубежных источников. Общий объем диссертации составляет 124 страниц машинописного текста. Текст иллюстрирован 5 таблицами и 18 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Материалы и методы. При проведении собственных исследований было использованы: вакцинные штаммы (рХ01+рХ02") - В. anthracis СТИ-1 (Государственный институт стандартизации и контроля (ГИСК) им. J1.A. Тарасевича, г. Москва) и В. anthracis 55 (НИИ микробиологии МО РФ, г. Киров); бесплазмидные производные (рХ0ГрХ02") - В. anthracis СТИДТ (КМ56-1), В. anthracis 55ДТ (КМ92(2)) и 55ATSpo" (КМ92(3)) (Государственная коллекция патогенных бактерий «Микроб» (ГКПБ «Микроб»)); рекомбинантные штаммы (рХ0ГрХ02' pUBl 10РА-1+) - В. anthracis СТИДТПА-1 (КМ96); В. anthracis 55ДТПА-1 (КМ95), В. subtilis WB600nA-l (KM 199) (ГКПБ «Микроб») и 55ДТПЛ-15ро" (КМ97) (получен в ходе настоящего исследования); высоковирулентный тест-заражающий штамм (рХ01+рХ02+) - В. anthracis 81/1 (ГКПБ «Микроб»),

В работе по определению специфичности поликлональных антител к ПА использовали следующие культуры: В. anthracis Pasteur, Sterne34F2, Ихтиман, Wright, 17JB, 2-ая вакцина Ценковского (71/12); В. cereus 569, др-7, 336, 8, 96, 104, 108, 1; В. subtilis 35, 36, 38, 168, 430, 350, 33, IE-20, IE-21, IE-26, IE-4, BD366, BD407, WB600; В. thuringiensis 482/3, 8а, 15а, 351,2090,19/31,482/7, 35 v. galeriae, 17/5, 48,

toumanoffi, 13M v. galeriae, 10M v. finitimus, 10B v. finitimus, tompsoni 11M; B. me-gaterium 5; B. mesentericus 5; B. mycoides 2, 10; B. stearotermophylus\ B. licheniformis.

В качестве питательных сред использовали бульон BHI («Difco», США), бульон и агар Хоттингера, L-бульон и L-arap (Маниатис Т. с соавт., 1984), в которые при необходимости канамицин (25 или 50 мкг/мл). Для выделения сибиреязвенного токсина штаммы В. anthracis выращивали на среде (S-бульоне), предложенной J. Farchaus et al. (1995). Реакцию радиальной диффузионной преципитации ставили на казаминовой среде С. Thorne, F. Belton (1957) с добавлением сибиреязвенного у-глобулина или кроличьих анти-ПА антител кроличьих антител к ПА - (2 мл/25 мл среды). Определение протеолитической активности проводили на оригинальной среде с казеином (Микшис Н. И. с соавт., 2003).

В опытах по определению иммуногенности использовали морских свинок весом 300 - 350 г, беспородных белых мышей или мышей линии BALB/c весом 18 -20 г. Для получения специфических антител к белковым препаратам использовали кроликов весом от 2,5 до 3 кг.

Микробиологические и иммунологические методы. Определение видовых признаков сибиреязвенных штаммов проводили согласно регламентирующему документу - «Инструкции и методические указания по лабораторной, клинической диагностике, профилактике и лечению сибирской язвы у людей» (М., 1980). Для определения протеолитической активности не более 16-ти изолированных колоний суточной агаровой культуры В. anthracis наносили на поверхность пластинки агара, инкубировали при температуре 37 °С в течение 24 часов и регистрировали ширину зоны лизиса вокруг колоний. Способность к споруляции определяли сравнением жизнеспособности прогретых (при температуре 65 °С в течение 30 минут) и непрогретых культур. Дополнительно способность к образованию спор проверяли при микроскопическом исследовании мазков, окрашенных фуксином Циля.

Подготовку споровой взвеси сибиреязвенных культур и определение ЛД5о штаммов В. anthracis проводили согласно регламенту производства №831-98 вакцины сибиреязвенной живой, а также в соответствии с методическими рекомендациями - «Основные требования к вакцинным штаммам сибиреязвенного микроба для иммунизации людей» (2002). Для определения протективных свойств получен-

ного препарата ПА кроликов, в количестве 10 штук на одну группу, иммунизировали препаратом очищенного рекомбинантного ПА в дозе 50 мкг двукратно с интервалом в 14 суток. Препарат вводили подкожно в объеме 1 мл в сочетании с полным адьювантом Фрейнда (в объемных соотношениях 1:1). Через 21 день животных заражали 50 ЛД50 высоковирулентного штамма В. anthracis 81/1 однократно, подкожно, в объеме 0,5 мл.

Анти-ПА антитела получали из сывороток кроликов, иммунизированных, очищенным препаратом ПА в дозе 50 мкг семикратно с интервалом в 1 неделю.

Генетические и молекулярно-генетические методы. Электростимулируемую трансформацию штаммов В. anthracis проводили по методике С.А. Еремина с со-авт. (1990). Выделение гибридных плазмид из штаммов В. anthracis осуществляли модифицированным способом С. Kado and S. Liu (1981). Результаты электрофоре-зов в агарозном геле сканировали с помощью гель-документирующей системы Vi-Tran (Биоком, Россия). Полимеразную цепную реакцию в модификации И.В. Тучкова с соавт. (1991) осуществляли на программируемом амплификаторе «Терцик» («ДНК-технология», Россия) с диагностическими праймерами на последовательности гена pag. Рестрикцию выделенной плазмидной ДНК проводили в соответствии с рекомендациями фирмы производителя ферментов Sigma (США) или MBI Fermentas (Литва). Стабильность гибридных плазмид оценивали согласно методикам, предложенным J. Barnard, A. Friedlander (1999) и S. Cohen et al. (2000).

Биохимические методы. Электрофоретическое разделение протеинов осуществляли в 10 % полиакриламидном геле в вертикальной камере (Amersham, США) при силе тока 50 мА в течение 5 часов. Концентрацию белка в препаратах определяли общепринятыми методами: по М. Брэдфорду (Практическая химия белка, 1989) и спектрофотометрически (Скоупс Р., 1985). Хроматографическую очистку ПА проводили согласно рекомендациям С. Quinn et al. (1988) с модификациями. Бульонную культуру штамма В. anthracis 55ATITA-l(Spo"), выращенную в течение 18 часов при температуре 37 °С в S-бульоне с канамицином (25 мкг/мл), фильтровали через мембранные фильтры (Millipore, США) с диаметром пор 0,22 мкм. Охлажденный фильтрат концентрировали в 10 раз на установке "Амикои" (США) с картриджем (Millipore, США), имеющим предел исключения белков с молекулярной массой 30 кДа, и диализовали 18 часов против 10 объемов буфера (25 мМ ди-этаноламина, 50 мМ хлорида натрия, 2 мМ ЭДТА, 30 мМ хлорида калия (pH 8,9)).

Иионобменную хроматографию проводили на колонке с Macro Prep 50Q (Bio-Rad, США). Полученный препарат вновь концентрировали в 10 раз на установке "Амикон", диализовали при тех же условиях и фильтровали через мембранные фильтры. Высокая степень очистки препарата ПА достигалась за счет последующих этапов гель фильтрации на сефакриле 300 HR в буфере, содержащем 0,1 М основного триса, 1 мМ ЭДТА, 50 мМ хлорида натрия (pH 8,0). Пробы, соответствующие пику поглощения белка ПА, собирали, концентрировали в 5 раз и фильтровали, как описано выше. Образцы хранили аликвотами при температуре - 70 °С.

Иммунохимические методы. Для анализа иммуноспецифичности препарата проводили иммуноблотинг по методу Н. Towbin et al. (1979). Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану Hybond-C (Amersham, США) проводили при силе тока 0,4 А и напряжении 100 V в течение 1,5 часов. Титр антител к протективному антигену в сыворотках иммунизированных животных и количественную оценку уровня продукции ПА рекомбинантными штаммами определяли с помощью дот-анализа и твердофазного ИФА (Фримель Г., 1987).

Экспериментальные материалы обрабатывали посредством статистических методов, описанных И.П. Ашмариным, A.A. Воробьевым (1962).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Клонирование гена, определяющего синтез ПА сибиреязвенного микроба, сопряжено с преодолением трудностей, связанных в первую очередь со стабильностью воспроизведения и функционирования детерминанты в гетерологичных системах. Помимо этого, конструирование рекомбинантных продуцентов ПА на основе бациллярных штаммов неизбежно сталкивается с проблемой выраженной активности протеолитических ферментов большинства представителей рода Bacillus, а также их способности к образованию спор в условиях культивирования in vitro.

В этой связи, в качестве первоочередной задачи настоящего исследования определено конструирование стабильного аспорогенного рекомбинантного штамма В. anthracis, сочетающего высокую продукцию протективного антигена с низкой активностью протеолитических ферментов.

Для успешного решения поставленной задачи имелись предпосылки: наличие аспорогенного реципиентного штамма В. anthracis и гибридной плазмиды pUBl 10РА-1 со встроенным геном pag.

Не образующий спор спонтанный мутант был селектирован ранее в популяции бесплазмидного производного вакцинного штамма В. anthracis 55, характеризующегося низкой активностью протеолитических ферментов. Аспорогенность штамма В. anthracis 55ATSpo" (КМ92(3)) сохранялась при культивировании in vitro и в процессе хранения (Микшис Н.И. с соавт., 2003).

Гибридная плазмида pUB110PA-l (6,5 т.п.н.), содержащая интактный ген pag, получена на основе мультикопийного вектора pUBHO. Функционирование данного репликона в бациллярных штаммах отличалось стабильностью и обеспечивало выраженную эспрессию гена, детерминирующего синтез ПА сибиреязвенного микроба (Микшис Н.И. с соавт., 2007).

ДНК плазмиды pUBl 10РА-1 выделяли из спорообразующего рекомбинант-ного штамма В. anthracis СТИДТПА-1. Полученный препарат плазмидной ДНК после определения электрофоретической подвижности, концентрации и осуществления рестрикционного анализа использовали в экспериментах по электростиму-лируемой трансформации.

Культуру реципиентного штамма В. anthracis 55ATSpo" выращивали в бульоне до середины логарифмической фазы роста при температуре 37 °С. В одном случае в соответствии с рекомендациями авторов методики перед электропорацией проводили обработку клеток пенициллином, в другом - этот дополнительный этап опускали. После стимуляции электрическим разрядом трансформационную смесь в течение 2-х часов инкубировали при температуре 37 °С, а затем высевали на твердую питательную среду с селективным антибиотиком. В результате были получены антибиотикорезистентные трансформанты. Эффективность трансформации не зависела от использования пенициллина и составила приблизительно 30 КОЕ/мкг ДНК.

Трансформанты переносили методом реплик на чашки со специальной средой, содержащей антитела к ПА. После инкубации в течение 16 часов в атмосфере С02 и в течение 24 часов при комнатной температуре вокруг посевов образовывались зоны радиальной преципитации шириной около 6-8 мм.

Факт переноса плазмиды подтверждали данными электрофоретического разделения ДНК в агарозном геле (рис. 1,А). Наличие клонированного гена pag -результатами ПЦР-анализа. ПЦР-анализ с "диагностическими" праймерами на по-

Рисунок 1. А - Результаты исследования плазмидных профилей клонов трансформантов, получивших в результате генетического переноса плазмиду pUB 11 OPA-1. 1 - 4 - клоны аспорогенных трансформантов; 5 - бесплазмидный реципиент; 6 - ДНК плазмиды pUB110PA-l; 7 - маркеры молекулярных масс - ДНК фага A/EcoRI + Hindlll. Б - Результаты ПЦР-анализа с "диагностическими" прай-мерами на последовательности гена pag. 1 - маркеры молекулярных масс - ДНК фага A/EcoRI; 2 - реципиентный штамм; 3 - 5 - клоны аспорогенных трансформантов.

следовательности гена pag подтвердил его присутствие в трансформантах В. anthracis 55ДТПА-1 Spo" (рис. 1 ,Б).

А 1234567 Б 1 2 3 4 5

pUBl 10РА-1

Важно, что после введения чужеродной наследственной информации клоны трансформантов сохраняли свойства, присущие реципиентному штамму - аспоро-генность и низкую активность протеолитических ферментов.

Определение стабильности репликации pUBllOPA-l в аспорогенном штамме проводили с применением схемы последовательных пассажей в жидкой питательной среде с канамицином. Через каждые 5 пересевов производили контрольный высев культуры на твердую питательную среду и осуществляли клональный анализ, для чего методом реплик на чашки с канамицином и без него переносили до 100 изолированных колоний. Для нескольких произвольно выбранных антибио-тикорезистентных колоний осуществляли плазмидный скрининг, контролируя присутствие в образцах ДНК репликона с электрофоретической подвижностью, свойственной pUB 11 OPA-1.

Установлено, что трансформанты В. anthracis 55ДТПА-18ро~при пассировании in vitro в присутствии селективного антибиотика стабильно наследуют плазмиду pUBllOPA-l. Частота элиминации гибридного репликона в популяциях иссле-

дованных клонов не превышала 5 %. Клональный анализ трех трансформантов (№ 5, 23 и 48) не выявил ни одного случая утраты р1Ш110РА-1 в продолжение 15 последовательных пассажей в условиях селективного давления.

Экспрессию клонированного гена pag в составе аспорогенного штамма В. апЛгаск 55ДТПА-1(8ро') исследовали с помощью комплекса биохимических и иммунохимических методов. В иммунохимических реакциях использовали поли-клональные антитела к ПА. Специфичные сыворотки получали при иммунизации кроликов белковым препаратом, выделенным из спорообразующего рекомбинант-ного продуцента В. аШкгаЫ СТИДТПА-1.

Продукцию ПА тестировали у стабильных трансформантов № 5, 23 и 48, отобранных на предыдущем этапе. Перечисленные клоны выращивали в стандартных условиях в питательной среде с добавлением бикарбоната натрия. Стерильные культуральные фильтраты концентрировали в 10 раз и вносили в одинаковом количестве в лунки акриламидного геля.

Белок с электрофоретической подвижностью, установленной для ПА сибиреязвенного микроба (83 кДа), секретировали все три клона В. апЛгаЫэ 55ДТПА-ЦЭро"). Продукция ПА аспорогенными рекомбинантами по данным белкового электрофореза превосходила продукцию контрольного вакцинного штамма В. апЛ-гаш 55. Среди тестированных рекомбинантных клонов наибольшее количество ПА секретировали трансформанты № 5 и 48.

Иммунореактивность синтезируемого белка подтверждали с помощью постановки реакции иммуноблота с поликлональными антителами к ПА. Электрофо-ретически разделенные белки концентрированных культуральных фильтратов ас-порогенных трансформантов переносили из полиакриламидного геля на нитроцел-люлозную мембрану НуЬопс1-С. После этого мембрану последовательно инкубировали со специфичными кроличьими антителами и диагностическими антителами против кроличьих иммуноглобулинов, мечеными пероксидазой. В результате окрашивания раствором диаминобензидина на нитроцеллюлозной мембране образовывались четкие полосы на уровне электрофоретической подвижности ПА.

Способность к синтезу ПА трансформантов, получивших в результате генетического переноса плазмиду риВ110РА-1, очень наглядно продемонстрирована результатами реакции преципитации на среде с анти-ПА антителами. Аспороген-

ные рекомбинантные клоны образовали одинаково большие зоны радиальной диффузии антигена. Ширина колец преципитации вокруг их посевов составила около 10 мм, в то время как вокруг посева В. апЛгаш 55 аналогичные показатель был не более 2 мм. Штамм В. амИгаая 55ДТ, не содержащий ген pag, радиальной зоны преципитации не образовывал.

т, * ""Г........ * В.шйЬгаш 55ДТПА-1 Бро

• " " клон 5, клон 23, клон 48 (слева-направо)

В.апЛгаЫя 55, В.аШкгаш 55ДТПА-1, < "]''," В.атИгаЫх 55ДТ (слева-направо)

Рисунок 2. Сравнение уровней продукции ПА на основании результатов реакции радиальной преципитации на среде с анти-ПА антителами.

Сходные результаты получили при постановке дот-анализа. Тестировали культуральные фильтраты трех трансформантов В. аШкгаая 55ДТПА-1(8ро') №5, 23, 48, исходного вакцинного штамма В. апЛгас1я 55 и спорообразующего реком-бинанта В. аиГ/ггош 55ДТПА-1 (рис. 3). Более интенсивное окрашивание образовавшихся иммунных комплексов отмечали в рядах, соответствующих образцам культуральных фильтратов рекомбинантных штаммов - трех клонов аспорогенных трансформантов и спорообразующего генно-инженерного продуцента. Из всех исследованных стабильных трансформантов наилучшей способностью к секреции иммуногенного антигена обладал клон № 5. На основании данных дот-анализа он продуцировал ПА приблизительно в 8 раз больше, чем исходный штамм В. апЛга-с« 55.

С использованием твердофазного ИФА осуществили количественную оценку уровней продукции ПА. На основании сопоставления данных нескольких анализов определили, что трансформант В. апЛгат 55ДТПА-1(8ро") №5 продуцирует 85 - 90 мкг/мл ПА, а клоны № 23 и 48 - чуть меньше - около 80 мкг/мл. Продукция ПА вакцинными штаммами В. ашИгаая СТИ-1 и В. опЛюая 55 составила 15 и 20 мкг/мл, соответственно.

■Г 1

и i

Ряды: 1 - В. аМНгааэ 55, 2 - В. атНгаЫв 55ЛТПА-15ро клон 5, 3 - В. апЛгас'ч 55АТПА-18ро" клон 23. 4 - В. аШкгас'^ 55АТПА-15ро" клон 48, 5-5. апгкгаш 55ДТПА-1.

Рисунок 3. Сравнение уровней продукции протективного антигена на основании результатов дот-анализа с анти-ПА антителами.

Таким образом, получен рекомбинантный штамм В. апМгааэ, являющийся стабильным аспорогенным протеазодефицитным продуцентом ПА сибиреязвенного микроба. Совокупность свойств рекомбинантного штамма определяет перспективы его практического использования. В частности, он может служить прототипом для создания безопасной и экологичной технологии производства химических сибиреязвенных вакцин. Сконструированный штамм продуцирует ПА в несколько раз больше, чем вакцинные штаммы В. ам1ггас{$ СТИ-1 и В. апЛгас^й 55. Он не содержит генов, детерминирующих синтез основных факторов патогенности возбудителя сибирской язвы, и не образует спор, способных длительно сохраняться и накапливаться в окружающей среде. Применение аспорогенного продуцента не будет связано с риском контаминации помещений и оборудования спорами, чрезвычайно устойчивыми к действию обеззараживающих агентов.

Немаловажно, что рекомбинантный штамм В. апЛгаш 55ДТПА-1 (вро") создан на основе лротеазодефицитного реципиента. Низкая активность собственных протеаз штамма-продуцента позволит избежать значительных потерь биологически значимого продукта в процессе его выделения и очистки.

этой связи, нам необходимо было получить убедительные свидетельства сохранения аспорогенности и способности к репликации гибридной плазмиды в процессе длительного пассирования штамма in vitro, а также при его хранении.

Для изучения стабильности использовали различные схемы последовательных пересевов культур с регулярным анализом свойств аспорогенности и анти-биотикорезистентности. Способность к спорообразованию тестировали у 10-ти произвольно выбранных клонов, резистентность к селективному антибиотику - не менее чем у 50-ти.

В течение более 30 суточных пассажей штамма В. anthracis 55ATHA-l(Spo") на питательных средах с добавлением селективного антибиотика случаев элиминации плазмиды pUB110PA-l отмечено не было. По окончании пассирования, а также на промежуточных этапах (через каждые 5-7 пересевов) реверсии к спорообра-зующему фенотипу также не наблюдали.

Данные электрофореза белковых препаратов, выделенных из культуральных фильтратов исследуемых клонов, свидетельствовали об их неизмененной способности к продукции ПА. Специфичность взаимодействия соответствующих белков с антителами к ПА подтверждали постановкой реакции иммуноблота.

Дополнительно тестировали протеолитическую активность штамма. При исследовании на среде с казеином у всех тестированных клонов отсутствовали зоны деградации белкового субстрата вокруг посевов.

В процессе исследования было также установлено, что элиминация плазмиды pUBl 10РА-1 не происходит в течение непродолжительного периода выращивания штамма В. anthracis 55ATnA-l(Spo') в жидкой питательной среде без селективного антибиотика. Однако продление времени культивирования рекомбинант-ного аспорогенного продуцента ПА в отсутствии канамицина, как и увеличение количества суточных пассажей, приводило к постепенному нарастанию темпов утраты репликона, несущего детерминанту синтеза ПА. Элиминация pUB110PA-l после третьих суток достигала уровня 40 %. К пятому пассажу количество чувствительных к канамицину клонов составляло почти 90 %. Вместе с тем, реверсии к спорообразующему и протеазоположительному фенотипу даже при многократном пассировании в жидкой питательной среде без селективного антибиотика не наблюдали.

После депонирования в ГКПБ "Микроб" лиофильно высушенного штамма В. аШ/ткк 55ДТПА-1(8ро") (КМ97) периодически тестировали стабильность его биологических свойств в условиях хранения. В течение более двух лет наблюдения штамм сохранял все присущие ему свойства.

На следующем этапе решали задачу оптимизации условий культивирования аспорогенного рекомбинантного продуцента на питательных средах. Обычно выращивание культуры В. апЛгааз 55ДТПА-1(5ро") осуществляли в богатой питательной среде, содержащей в больших количествах триптон и дрожжевой экстракт (Б-бульон), и при повышенном содержании С02. В качестве альтернативы нами были апробированы способы культивирования аспорогенного продуцента ПА с применением более доступных сред и в обычной атмосфере.

Параллельно тестировали 4 вида сред: 5-бульон, Ь-бульон, бульон Хоттин-гера и бульон Хоттингера с добавлением дрожжевого аутолизата. Одну порцию инкубировали в атмосфере С02, другую - в обычной атмосфере. Уровни продукции ПА сравнивали на основании данных электрофореза.

Электрофоретическое разделение протеинов культуральных фильтратов показало, что штамм В. апЛгаЫз 55ДТПА-1(5ро") продуцирует наибольшее количество ПА при его росте в 8-бульоне. Данная среда является оптимальной для развития микроорганизма и секреции иммуногенного белка. Использование бульона Хоттингера возможно только при условии добавления дополнительных ингредиентов, например, дрожжевого аутолизата.

Очень важным оказалось наблюдение, что продукция ПА аспорогенным ре-комбинантом не зависит от содержания в атмосфере С02. Как известно, экспрессия гена pag в составе рХ01, находится под строгим контролем С02- зависимого транскрипционного регулятора - ЛгхА. Область А(хА участвует в координированной регуляции синтеза ПА, ОФ, ЛФ, капсулы, белков Б-слоя и, возможно, других факторов (Нойтпаз1ег А., КоеЫег Т., 1997; Mignot Т. й а1., 2003). В рекомбинантном штамме с клонированным геном ра% область А1хА отсутствует, что объясняет С02 -независимый синтез ПА.

То обстоятельство, что продукция ПА рекомбинантным штаммом В. апЛга-55ДТПА-1(8ро") не зависит от содержания в атмосфере С02, выгодно отличает

полученный аспорогенный продуцент ПА с pUBllOPA-1 от аттенуированных штаммов, несущих в своем составе высокомолекулярную плазмиду pXOl.

С целью получения препаративных количеств ПА суточную агаровую культуру аспорогенного рекомбинантного штамма В. anthracis 55ATnA-l(Spo") засевали в 5 л S-бульона, содержащего 25 мкг/мл канамицина. Бикарбонат натрия в среду не добавляли. Культуру выращивали при температуре 37 °С в течение 18 часов с аэрацией. По окончании инкубации, полученный после осаждения клеточной массы супернатант фильтровали, концентрировали в 10 раз и диализовали против ди-этаноламинового буфера.

Выделение ПА проводили по схеме, предложенной С. Quinn et al. (1988), в нашей модификации. В качестве первой ступени очистки использовали ионообме-ную хроматографию. Сконцентрированный и диализованный препарат порционно наносили на колонку с Macro Prep 50Q. Выход протеинов регистрировали спектро-фотометрически. Образцы, соответствующие пикам поглощения, объединяли и исследовали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. Пробы, содержащие ПА, объединяли, вновь концентрировали в 10 раз, диализовали и фильтровали. На заключительном этапе осуществляли гель-фильтрацию с использованием Se-phacryl-HR300. Отобранные на основании спектрофотометрииеского анализа пробы концентрировали в 10 раз и диализовали.

Результаты электрофореза в полиакриламидном геле показали почти полное освобождение образцов, как от низкомолекулярных, так и высокомолекулярных сопутствующих белков (рис. 4). Элекгрофоретическая подвижность протеина, выделенного из аспорогенного рекомбинантного штамма Л. anthracis 55ATnAl(Spo"), соответствовала молекулярной массе 83 кДа. Всего из 5 литров исходной культуры штамма В. anthracis 55ATnA-l(Spo') было получено 80 мл высокоочищенного препарата ПА с концентрацией белка 0,8 мг/мл. В данном случае выход составил 12,8 мг очищенного ПА на 1 литр культуры аспорогенного рекомбинатного штамма.

Иммунореактивность и специфичность данного белка подтверждали результатами реакции иммуноблота, дот-анализа, твердофазного ИФА с антителами к ПА. Во всех случаях отмечали образование окрашенных иммунных комплексов.

1 2 3 4 5 6 7

Треки: 1 - культуральный фильтрат В. anthracis 55ДТПА-1Яро"; 2 - этап очистки на колонке с Macro Prep 50Q; 3 - маркеры молекулярных масс (116,0; 97,0; 66,0; 45,0; 29,0 кДа); 4 - 7 - этап хроматографии на колонке с Sephacryl-HR300 (пробы, соответствующие пику поглощения при 280 нм).

Рисунок 4. Результаты основных этапов хроматографической очистки ПА, выделенного из культурального фильтрата аспорогенного продуцента В. anthracis 55ATnA-lSpo'.

Полученные результаты очистки ПА и относительно высокий выход конечного продукта позволяют и в дальнейшем использовать данную оптимизированную схему для получения препаративных количеств иммуногенного антигена из реком-бинантного продуцента. Достигнутая степень очистки в совокупности с полным отсутствием в препарате ОФ и ЛФ обуславливают перспективность в плане конструирования на его основе современных профилактических и диагностических сибиреязвенных препаратов.

Иммуногенные свойства полученного белкового препарата ПА изучали в экспериментах на лабораторных животных. Одну группу кроликов (10 особей) иммунизировали очищенным препаратом ПА, выделенным из аспорогенного продуцента В. anthracis 55ATnA-l(Spo"). Белок вводили двукратно с интервалом в 14 дней в дозе 50 мкг в сочетании с полным адъювантом Фрейнда. Другую группу вакцинировали однократно штаммом В. anthracis СТИ-1 в дозе 5- Ю7КОЕ. Особей третьей группы оставляли интактными.

ликов. В случае иммунизации белковым препаратом титры анти-ПА составили 1:8192 - 1:16384, при иммунизации живой вакциной - 1:1024 - 1:2048.

Через 21 день после последней инъекции препаратов осуществляли заражение животных опытных и контрольной групп 50 ЛД50 высоковирулентного тест-штамма В. гш/Лгасм 81/1. Значение ЛД50 определяли предварительными экспериментами- 5 • Ю2КОЕ.

В результате выжило 100 % животных, иммунизированных В. аткгас 'и СТИ-1 и препаратом ПА. У всех неиммунизированных особей сибиреязвенная инфекция закончилась летально на третьи сутки. Специфичность инфекционного процесса подтверждали контрольным вскрытием павших животных.

Перспективы практического использования ПА, выделяемого из аспороген-ного продуцента, не ограничиваются только созданием химических вакцин. Данный препарат и специфически взаимодействующими с ним антитела могут оказаться востребованными для постановки иммунохимических реакций и в конструировании иммунодиагностических тест-систем.

В частности, наличие высокоочищенного препарата ПА и специфически взаимодействующих антител позволяет проводить количественную оценку продукции ПА природными, аттенуированными и рекомбинантными штаммами В. аШИгаш с помощью различных количественных и полуколичественных методов оценки продукции ПА - реакции радиальной иммунодиффузии, иммуноблота, дот-анализа и твердофазного ИФА.

Поли- или моноклональные антитела к очищенному ПА могут быть использованы для идентификации возбудителя сибирской язвы при осуществлении диагностических исследований. С целью доказательства такой возможности осуществили эксперименты по постановке различных вариантов ИФА (дот-анализа и твердофазного ИФА) на представительной выборке бациллярных штаммов, включающей 10 культур В. апЖгаЫз и 43 - близкородственных видов, таких как В. сегеш, В. виЫШя, В. В. тусо1с1ез, В. megaterium, В. теяеШепсия, В. ИсИет/ог-

ти и В. 51еаго1еппорИу1и.ч.

наличие умеренно выраженных перекрестных реакций - у 4-х штаммов из 43-х (В. сегеиз 1, 8, 96 и В. те$еп1епсия 5). Исследование стерильных культуральных фильтратов всех перечисленных бациллярных штаммов перекрестных реакций не выявило.

Полученные результаты свидетельствуют о высокой специфичности сывороток, полученных к рекомбинантному протективному антигену В. агикгаск и возможности их использования для конструирования сибиреязвенных диагностику-мов.

Кроме того, на основе синтезируемого В. апШгаЫз 55ДТПА-1(8ро") антигена возможно создание иммуноферментных тест-систем, позволяющих диагностировать заболевание сибирской язвой и проводить оценку состояния адаптивного иммунитета вакцинированных. В качестве иллюстрации такого подхода мы провели эксперимент по определению динамики титров антител у иммунизированных морских свинок. Лабораторным животным делали однократные инъекции 5 • 107 спор вакцинного штамма В. ап/НгаЫя СТИ-1 и определяли титры антител к ПА на 24-е, 28-е, 32-е, 36-е сутки и через 2 месяца после иммунизации. Отмечали нарастание титров антител до максимальных значений 1:2048 - 1:4096 к 32-м суткам исследования и снижение показателей до 1:512 - 1:1024 спустя 2 месяца.

Таким образом, полученный нами высокоочищенный ПА, являющийся продуктом рекомбинантного аспорогенного штаммма В. ашкгаая 55ДТПА-1(8ро'), может быть использован в конструировании профилактических и диагностических сибиреязвенных препаратов.

Выводы

1. Сконструирован аспорогенный рекомбинантный авирулентный продуцент протективного антигена - В. ашкгас'и 55ДТПА-1(8ро"). Ген, детерминирующий синтез протективного антигена, локализован в составе плазмиды р1ЛИ 10РА-1. Штамм В. апЛгаш 55ДТПА-1(8ро") стабильно наследует гибридный репликон в условиях селективного давления, не реверсирует к спорообразующему фенотипу и характеризуется низкой активностью протеолитических ферментов.

2. Аспорогенный рекомбинант В. амИгас'^ 55ДТПА-1(8ро") продуцирует в среду выращивания около 80 мкг/мл биологически активного протективного анти-

гена, что почти в 4 раза превышает его продукцию вакцинным штаммом В. anthracis 55.

3. Оптимизирована экспериментальная схема выделения и очистки протек-тивного антигена, синтезируемого генно-инженерным продуцентом. Установлено, что продукция ПА рекомбинантным штаммом В. anthracis 55ATIIA-l(Spo") не зависит от содержания в атмосфере С02. Использование в технологическом процессе сконструированного на основе вакцинного штамма В. anthracis аспорогенного продуцента позволит обеспечить безопасность и экологичность процедуры выделения протективного антигена.

4. Достигнута высокая степень очистки протеина, продуцируемого сконструированным штаммом В. anthracis 55ATnA-l(Spo'). По биохимическим, иммуно-химическим и биологическим свойствам полученный белковый препарат является протективным антигеном сибиреязвенного микроба.

5. При иммунизации лабораторных животных протективным антигеном, синтезируемым рекомбинантным штаммом В. anthracis 55ATIlA-l(Spo'), происходит развитие адаптивного иммунитета, характеризующегося высокими титрами ан-ти-ПА антител. Двукратная иммунизация дозой 50 мкг очищенного рекомбинант-ного протективного антигена обеспечивает защиту 100 % кроликов от заражения 50 ЛД50 высоковирулентного штамма В. anthracis 81/1.

6. Получены специфичные поликлональные (кроличьи) антитела к протек-тивному антигену сибиреязвенного микроба. Показана перспективность их использования в схеме идентификации возбудителя сибирской язвы и для определения уровней продукции иммуногенного антигена вакцинными штаммами.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Микшис Н.И., Кудрявцева О.М., Шулепов Д.В., Новикова Л.В., Болотникова М.Ф., Киреев М.Н. Генетическое конструирование продуцентов протективного антигена сибиреязвенного микроба // Медицинская микробиология - XXI век: Материалы Всероссийской научно-практической конференции. - Саратов, 2004. - С. 156 - 157.

2. Попов Ю.А., Микшис Н.И., Корсакова А. Ю., Кудрявцева О.М., Болотникова М.Ф., Новикова Л.В., Шулепов Д.В., Киреев М.Н., Коннов Н.П., Щуковская Т.Н., Фирстова В В., Брандзишевский Ю.В., Полунина Т.А. Конструирование рекомбинант-ных штаммов Bacillus anthracis для создания нового поколения высокоэффективных

сибиреязвенных вакцин // Методические документы и отчеты по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации. - Саратов, 2005. -С. 41.

3. Шулепов Д.В., Микшис Н.И., Кудрявцева О.М., Киреев М.Н., Попов Ю.А. Выделение и очистка протективного антигена из рекомбинантного штамма Bacillus anthracis II Окружающая среда и здоровье: Окружающая среда и здоровье: Материалы Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов. -Суздаль, 2005 г. - С. 212-213.

4. Микшис Н.И., Шулепов Д.В., Кудрявцева О.М., Болотникова М.Ф., Новикова JI.B., Попов Ю.А., Дроздов И.Г. Сравнение уровней продукции протективного антигена вакцинным и рекомбинантными штаммами Bacillus anthracis II Санитарная охрана территорий государств-участников СНГ: проблемы биологической безопасности и противодействия биологическому терроризму в современных условиях: Материалы VI Межгосударственной научно-практической конференции. - Волгоград, 2005. -С. 166-168.

5. Попов Ю.А., Микшис Н.И., Кудрявцева О.М., Корсакова А.Ю., Шулепов Д.В., Болотникова М.Ф., Новикова Л.В., Щуковская Т.Н., Киреев М.Н., Брандзишев-ский Ю.В., Коннов Н.П. Конструирование рекомбинантных штаммов Bacillus anthracis для создания нового поколения высокоэффективных сибиреязвенных вакцин // Методические документы и отчеты по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации. - Саратов, 2006. - С. 51.

6. Кудрявцева О.М., Микшис Н.И., Новикова Л.В, Болотникова М.Ф., Шулепов Д.В., Попов Ю.А. Селекция стабильных и эффективных рекомбинантных продуцентов протективного антигена Bacillus anthracis И Проблемы особо опасных инфекций. - 2006. - Вып. 1(91).- С. 38-41.

7. Микшис Н.И., Кудрявцева О.М., Шулепов Д.В., Болотникова М.Ф., Новикова Л.В., Попов Ю.А. Экспрессия гена синтеза протективного антигена сибиреязвенного микроба в рекомбинантных бациллярных штаммах // В сб. «Материалы IX съезда всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов». - Москва, 2007. - Т. 1. - С. 84.

8. Микшис Н.И., Шулепов Д.В., Кудрявцева О.М., Болотникова М.Ф., Новикова Л.В., Попов Ю.А. Конструирование рекомбинантного аспорогенного штамма-продуцента протективного антигена сибиреязвенного микроба // В сб. «Материалы IX

съезда всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов». - Москва, 2007. - Т. 1. - С. 83-84.

9. Шулепов Д.В., Микшис Н.И., Кудрявцева О.М., Попов Ю.А., Киреев М.Н. Получение высокоочшценного препарата протективного антигена из рекомбинантного аспорогенного штамма Bacillus anthracis // Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ: Материалы Межгосударственной научно-практической конференции. - Саратов, 2007. - С. 320-321.

10. Микшис Н.И., Кудрявцева О.М., Шулепов Д.В., Попов Ю.А. Комплекс методических подходов к определению протективного антигена сибиреязвенного микроба // Методические документы и отчеты по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации. - Саратов, 2007. - С. 16.

11. Микшис Н.И., Кудрявцева О.М., Болотникова М.Ф., Шулепов Д.В., Новикова Л.В., Попов Ю.А., Щуковская Т.Н., Дроздов И.Г., Кутырев В.В. Иммуногенность рекомбинантных бациллярных штаммов с клонированным геном синтеза протективного антигена Bacillus anthracis // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2007. - № 3. - С. 15-21.

12. Микшис Н.И., Попов Ю.А., Шулепов Д.В. Патент РФ на изобретение № 2321629 - аспорогенный рекомбинантный штамм В. anthracis 55ДТПА-1 Spo' (pUBl 10РА-1) - продуцент протективного антигена сибиреязвенного микроба // Бюллетень №10 от 10.04.2008 г.

Подписано к печати 13.03.2009 г. Формат 60x84/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Гарнитура «Тайме». Усл.-печ. л. 1. Тираж 100. Заказ № 27.

Отпечатано с оригинал-макета в ООО «Димонс» . 410039, г. Саратов, ул. Огородная, 120. Тел.: (845-2) 678-577

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Шулепов, Дмитрий Викторович

ВВЕДЕНИЕ 6 ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. В. anthracis - возбудитель сибирской язвы

1.2. Сибиреязвенный токсин - структура, механизм действия, функции и генетическая детерминация

1.3. Выделение протективного антигена из культуральных фильтратов аттенуированных и рекомбинантных штаммов и его практическое использование

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 3 В

2.1. Штаммы микроорганизмов, бактериофаги и плазмиды, использованные в работе

2.2. Питательные среды, реактивы и лабораторные животные

2.3. Методы исследования

2.3.1. Определение видовых признаков В. anthracis

2.3.2. Определение протеолитической активности штаммов В. anthracis

2.3.3. Определение способности сибиреязвенных культур к споруляции

2.3.4. Определение стабильности свойства аспорогенности

2.3.5. Приготовление споровой взвеси

2.3.6. Определение ЛД50 штаммов В. anthracis для лабораторных животных

2.3.7. Определение протективных свойств рекомбинантного протективного антигена

2.3.8. Трансформация штаммов В. anthracis

2.3.9. Выделение плазмидных ДНК штаммов В. anthracis

2.3.10. Определение стабильности гибридных плазмид in vitro

2.3.11. Метод полимеразной цепной реакции

2.3.12. Исследование белкового состава культуральных фильтратов

2.3.13. Выделение и очистка протективного антигена из культу-рального фильтрата рекомбинантного штамма В. anthracis

2.3.14. Определение концентрации белка в препаратах

2.3.15. Получение иммунных сывороток и специфических антител к протективному антигену

2.3.16. Реакция радиальной диффузной преципитации на среде с анти-ПА антителами

2.3.17. Постановка иммуноблот анализа с поликлональными антителами к протективному антигену

2.3.18. Постановка дот-иммуноанализа с поликлональными антителами к протективному антигену

2.3.19. Твердофазный иммуноферментный анализ

2.3.20. Количественная оценка продукции протективного антигена рекомбинантными и вакцинными штаммами В. anthracis

2.3.21. Статистические методы

ГЛАВА 3. ПОЛУЧЕНИЕ АСПОРОГЕННОГО РЕКОМБИНАНТНОГО ШТАММА-ПРОДУЦЕНТА ПРОТЕКТИВНОГО АНТИГЕНА СИБИРЕЯЗВЕННОГО МИКРОБА

3.1. Генетическое конструирование аспорогенного штамма-продуцента протективного антигена

3.2. Стабильность репликации гибридной плазмиды pUBl 10РА-1 в аспорогенных трансформантах

3.3. Определение уровней продукции протективного антигена аспорогенными и спорообразующими клонами с pUBllOPA

3.4. Изучение стабильности биологических свойств аспороген-ного штамма-продуцента протективного антигена при пассировании на питательных средах и хранении

ГЛАВА 4. ВЫДЕЛЕНИЕ ПРОТЕКТИВНОГО АНТИГЕНА ИЗ КУЛЬТУР АЛЬНОГО ФИЛЬТРАТА РЕКОМБИНАНТНОГО АСПОРОГЕН-НОГО ШТАММА В. ANTHRACIS И ХРОМАТОГРАФИЧЕСКАЯ ОЧИСТКА ПРЕПАРАТА

4.1. Оптимизация условий культивирования аспорогенного продуцента протективного антигена

4.2. Разработка экспериментальной схемы выделения и очистки протективного антигена из культурального фильтрата рекомбинантного штамма

ГЛАВА 5. ХАРАКТЕРИСТИКА И ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПРОТЕКТИВНОГО АНТИГЕНА, ПОЛУЧЕННОГО ИЗ СКОНСТРУИРОВАННОГО ПРОДУЦЕНТА В. ANTHRACIS 55АТПА-1 (SPO~)

5.1. Характеристика препарата протективного антигена, выделенного из культурального фильтрата аспорогенного рекомбинантного продуцента

5.2. Получение специфичных антител к рекомбинантному про-тективному антигену

5.3. Использование рекомбинантного протективного антигена и антител к нему в иммунохимических реакциях

Введение Диссертация по биологии, на тему "Аспорогенный рекомбинантный штамм Bacillus anthracis – продуцент протективного антигена сибиреязвенного микроба"

Актуальность исследования. Сибирская язва - особо опасное зооантро-понозное заболевание. Возбудителем инфекции является грамположительный спорообразующий микроорганизм - Bacillus anthracis, принадлежащий к роду Bacillus, семейству Bacillaceae, отряду Enterobacteriales. Вследствие чрезвычайной резистентности к воздействию повреждающих факторов, споровые формы бактерий способны длительно сохраняться в объектах внешней среды. При попадании в организм человека или восприимчивого животного споры В. anthracis прорастают и инициируют развитие инфекционного процесса.

В реализации патогенного действия сибиреязвенного микроба ключевая роль отводится полиглютаминовой капсуле и бифункциональнуму экзотоксину. Капсула защищает бактериальные клетки от фагоцитоза, способствуя их размножению и накоплению в организме хозяина. Экзотоксин, состоящий из про-тективного антигена (ПА), отечного (ОФ) и летального (ЛФ) факторов, запускает основные звенья патогенеза сибиреязвенной инфекции. При взаимодействии протеолитически активированного ПА с ОФ и ЛФ образуются токсичные комплексы, оказывающие повреждающее действие на клетки макроорганизма (Lep-pla S., 1991; Singh Y. et al., 1989).

Ежегодно практически во всех регионах мира регистрируются многочисленные случаи сибиреязвенной инфекции. Эпидемическая обстановка по сибирской язве находится в зависимости от эпизоотической ситуации (Бургасов П.Н., 1984). Заражение человека происходит обычно при контакте с заболевшими животными или инфицированными продуктами и сырьем животного происхождения. К увеличению эпидемических проявлений может привести расширение но-зоареала патогенного микроорганизма, ухудшение ветеринарного контроля за скотомогильниками и сельскохозяйственным сырьем, снижение масштабов иммунизации сельскохозяйственных животных и населения групп риска (Черкасский Б.Л. с соавт., 2002). Кроме того, необходимо помнить о трагичном опыте и возможности использования сибиреязвенного микроба в качестве биологического агента для совершения террористических актов и создания оружия массового поражения (Spencer R., Wilcox M., 1993; Jernigan J. et al., 2001; Bush L. et al., 2001; Spencer R., LightfootN., 2001; Brachman P., 2002).

В системе профилактических мероприятий, направленных на поддержание эпидемического благополучия по сибирской язве, особое место отводится вакцинации сельскохозяйственных животных и людей, относящихся к группам риска заражения. В настоящее время используют живые, химические и комбинированные сибиреязвенные вакцины. Основными достоинствами живых вакцин является напряженность и продолжительность создаваемого ими иммунитета. К существенным недостаткам можно отнести реактогенность, проявляющуюся в возникновении поствакцинальных осложнений.

За синтез и регуляцию компонентов экзотоксина отвечают гены, входящие в состав плазмиды pXOl (182 т.п.н.). Образование капсулы кодируют детерминанты, расположенные на внехромосомном репликоне рХ02 (93,5 т.п.н.) (Mikesell P. et al., 1983; Uchida I. et al., 1985; Okinaka R. et al., 1999). Вакцинные штаммы, лицензированные для использования в медицине (В. anthracis СТИ-1) или ветеринарии (В. anthracis Sterne34F2, В. anthracis 55), в процессе аттенуации утратили плазмиду рХ02. Результатом элиминации рХ02 стало резкое снижение их вирулентности. Чувствительные к фагоцитозу микробные клетки неспособны реализовать свое патогенное действие. Иммуногенность вакцинных штаммов обеспечивается, главным образом, протективным антигеном (ПА) -одним из компонентов экзотоксина. На основе ПА в середине прошлого столетия ученые разработали химическую вакцину для иммунопрофилактики людей (Wright G. et al., 1954).

В производстве лицензированных бесклеточных препаратов продуцентами ПА служат аттенуированные штаммы В. anthracis. В специальных условиях выращивания они экскретируют сибиреязвенный токсин. Для очистки его им-муногенной составляющей отечественными и зарубежными авторами предлагались методические приемы с использованием различных видов хроматографии: ионообменной (Александров Н.И. с соавт., 1963 (а,б); Дербин М.И. с соавт., 1976, 1977; Абалакин В.А. с соавт., 1992; Безносов М.В., 1997; Wright G. et al.,

1954; Leppla S., 1988); иммуносорбентной (Larson D. et al., 1988); комбинации ионообменной хроматографии и гель-фильтрации (Барков A.M. с соавт., 2000); того же сочетания, но с добавлением хроматографии гидрофобного взаимодействия (Quinn С. et al., 1988).

Опыт выделения ПА из культуральных фильтратов аттенуированных штаммов В. anthracis показал, что полного разделения компонентов сибиреязвенного токсина, имеющих лишь небольшие отличия в значениях молекулярных масс (ПА - 83 кДа, ОФ - 89 кДа, ЛФ - 85 кДа), достигнуть практически невозможно. Данное обстоятельство неблагоприятно сказывается на свойствах выпускаемых в настоящее время химических вакцин. По данным медицинских наблюдений в США у 30 % людей, вакцинированных против сибирской язвы, наблюдаются локальные реакции в виде аллергических проявлений или даже некроза тканей (Swanson-Biearman В., Krenzelok Е., 2001). Токсическое действие бесклеточных препаратов связывают, прежде всего, с содержанием в них примесей ОФ и ЛФ, а также некоторых других продуктов жизнедеятельности клеток. Еще одной проблемой промышленного получения ПА является его выраженная деградация на этапах выделения и очистки, что связано с высокой активностью протеолитических ферментов большинства культур В. anthracis.

С развитием генно-инженерных технологий стало возможным получение рекомбинантных штаммов, продуцирующих только один компонент токсина -ПА. Известно много прецедентов клонирования детерминанты синтеза ПА (pag) в штаммах различных видов бактерий, а также в геномах вирусов и трансгенных растений (Тедиков В.М., Добрица А.П., 1993; Алимов А.П., Павлов В.М., 1995; Дармов И.В. с соавт., 1999; Vodkin М., Leppla S., 1983; Ivins В., Welkos S., 1986; Iacono-Connors L. et al., 1991; Coulson N. et al., 1994; Baillie L. et al., 1998; Zegers N. et al., 1999; Barnard J., Friedlander A., 1999; Gupta P. et al., 1999; Cohen S. et al., 2000; Chauhan V. et al., 2001; Garmoiy H. et al., 2003; Azhar A. et al., 2002; Hull A. et al., 2005; Chichester J. et al., 2007; Stokes M. et al., 2007). Однако далеко не во всех случаях авторам удалось добиться стабильного функционирования гибридных плазмид в гетерологичных системах. Проблематичным оказалось и достижение достаточно высокого уровня продукции ПА.

Ранее в лаборатории прикладной генетики РосНИПЧИ "Микроб" были созданы генно-инженерные штаммы, продуцирующие ПА (Микшис Н.И. с со-авт., 2007). Посредством встраивания участка pXOl, содержащего ген pag, детерминирующий синтез ПА сибиреязвенного микроба, в мультикопийный вектор pUBllO по сайтам рестрикции BamHl была сконструирована гибридная плазмида pUB 11ОРА и селектирован ее делеционный вариант pUB 11 OP А-1. Плазмида pUB110PA-l стабильно функционировала в геномах бациллярных штаммов В. anhtracis СТИДТ, В. anthracis 55АТ и В. subtilis WB600, обеспечивая продукцию ПА на уровне до 100 мкг/мл, что в несколько раз превышает секретируемый синтез данного белкового продукта, зарегистрированный для вакцинных штаммов В. anthracis.

С позиций биологической и экологической безопасности в промышленном производстве химических сибиреязвенных вакцин предпочтительнее использование штаммов-продуцентов, не образующих спор. Анализируя отечественный и зарубежный опыт создания бациллярных продуцентов ПА, выявили лишь единичные случаи получения их аспорогенных вариантов. Самой перспективной оказалась конструкция на основе рекомбинантного штамма В. anthracis ASterne-l(pPA102) (Worsham P., Sowers M., 1999). Хотя селектированный в его популяции спонтанный аспорогенный мутант отличался выраженной про-теолитической активностью, добиться приемлемого выхода очищенного ПА (20 -30 мкг/мл) удалось за счет коррекции условий его культивирования (Farchaus J. et al., 1998). В США зарегистрирован патент на метод приготовления химической вакцины на основе ПА, продуцируемого аспорогенным штаммом В. anthracis ASteme-l(pPA102)CR4 (Ivins В. et al., 2002). Отечественных аналогов продуцентов для безопасной и экологичной технологии выделения ПА не существует.

Все вышеизложенное определяет актуальность планируемой диссертационной работы, целью которой является: получение стабильного аспорогенного рекомбинантного штамма В. anthracis и оценка его в качестве продуцента протективного антигена сибиреязвенного микроба.

Задачи исследования:

1. Получить рекомбинантный штамм с клонированным геном pag, являющийся продуцентом протективного антигена сибиреязвенного микроба и характеризующийся отсутствием способности к образованию спор.

2. Оценить стабильность биологических свойств аспорогенного рекомбинантного штамма-продуцента в условиях хранения и при культивировании на питательных средах.

3. Провести оценку уровня продукции протективного антигена сконструированного штамма, сравнить с уровнями продукции вакцинных культур.

4. Оптимизировать условия культивирования аспорогенного рекомбинантного штамма, разработать экспериментальную схему выделения и хромато-графической очистки протективного антигена из его культурального фильтрата.

5. Получить высокоочищенный препарат рекомбинантного протективного антигена, осуществить его биохимическую и иммунохимическую характеристику.

6. В экспериментах in vivo показать перспективность использования рекомбинантного протективного антигена в создании профилактических сибиреязвенных препаратов.

7. Получить поликлональные антитела к рекомбинантному ПА и оценить возможность их применения для постановки иммунохимических реакций.

Научная новизна исследования:

Впервые на основе бесплазмидного производного отечественного вакцинного штамма В. anthracis 55 получен аспорогенный рекомбинантный продуцент протективного антигена сибиреязвенного микроба. Штамм стабильно наследует гибридный репликон pUB110PA-l и не реверсирует к спорообразую-щему фенотипу.

Сконструированный штамм не содержит гены, детерминирующие синтез факторов вирулентности В. anthracis, и характеризуется низкой активностью протеолитических ферментов. Перспективы его использования в качестве продуцента протективного антигена связаны с отсутствием риска контаминации помещений и оборудования спорами В. anthracis.

Аспорогенный бациллярный штамм с клонированным геном pag - В. anthracis 55ATIIA-l(Spo~), продуцирует в 4 раза больше протективного антигена, чем вакцинный штамм В. anthracis 55.

Биологические характеристики протективного антигена, синтезируемого штаммом В. anthracis 55АТПА-1 (Spo"), позволяют предложить его в качестве основного компонента современных химических и комбинированных сибиреязвенных вакцин. Установлено, что двукратная иммунизация кроликов дозой 50 мкг очищенного препарата протективного антигена, выделенного из аспоро-геннного рекомбинантного штамма В. anthracis 55ATTIA-l(Spo~), обеспечивает защиту 100 % животных от заражения 50 ЛД50 высоковирулентного штамма В. anthracis 81/1.

Научная новизна и приоритетность выполненных исследований подтверждена патентом Российской Федерации на изобретение: № 2321629 - аспорогенный рекомбинантный штамм В. anthracis 55ATnA-l(Spo")(pUBl 10РА-1) -продуцент протективного антигена сибиреязвенного микроба.

Практическая ценность и формы внедрения:

В Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» депонирован рекомбинантный штамм - В. anthracis 55ATnA-l(Spo") (КМ97) - стабильный аспорогенный продуцент протективного антигена возбудителя сибирской язвы.

Штамм и иммунные сыворотки к ПА использовались при выполнении генетических, молекулярно-генетических, молекулярно-биологических, биохимических и других исследований по плановым НИР: "Конструирование рекомби-нантных штаммов Bacillus anthracis для создания нового поколения высокоэффективных сибиреязвенных вакцин" (№ Гос. регистрации 0.1.200.208130, 2002 -2004 гг.), «Использование препаратов протективного антигена и белков S-слоя для создания средств диагностики и профилактики сибирской язвы» (№ Гос. регистрации 0120.0 603179, 2006-2008 гг.), а также в совместных исследованиях с отделом профилактических препаратов РосНИПЧИ "Микроб".

Материалы диссертации используются в лекциях по генетике бактерий на курсах специализации и повышения квалификации врачей и биологов при РосНИПЧИ «Микроб» и биотехнологическом факультете Саратовского Государственного аграрного университета имени Н.И. Вавилова.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Получен аспорогенный рекомбинантный продуцент протективного антигена - В. anthracis 55ATIIA-l(Spo"). При пассировании in vitro штамм сохраняет свойство аспорогенности и способность к репликации гибридной плазми-ды. Рекомбинантный штамм содержат структурный ген pag в составе гибридного репликона pUB110PA-l и не содержат детерминанты, кодирующие синтез основных факторов патогенности возбудителя сибирской язвы.

3. Из сконструированного штамма В. anthracis 55ATnA-l(Spo") выделен белковый препарат, на основании биохимических, иммунохимических и иммунологических характеристик являющийся протективным антигеном сибиреязвенного микроба. Получены поликлональные антитела к рекомбинантному про-тективному антигену, перспективные для осуществления диагностических исследований.

4. Протективный антиген, синтезируемый аспорогенным рекомбинант-ным продуцентом, является биологически активным. Двукратная иммунизация дозой 50 мкг очищенного рекомбинантного продукта обеспечивает защиту 100 % кроликов от заражения 50 ЛД50 высоковирулентного штамма возбудителя сибирской язвы.

Апробация работы. Материалы диссертации представлялись на Всероссийской научно-практической конференции «Медицинская микробиология -XXI век» (Саратов, 2004); Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» (Суздаль, 2005); VI Межгосударственной научно-практической конференции «Санитарная охрана территорий государств-участников СНГ: проблемы биологической безо-пастности и противодействия биологическому терроризму в современных условиях» (Волгоград, 2005); Российском медицинском форуме "Фундаментальная наука и практика" (Москва, 2006 г.); IX съезде всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007); Межгосударственной научно-практической конференции «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ» (Саратов, 2007), а также на научных конференциях РосНИПЧИ "Микроб" (Саратов, 20052008).

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Шулепов, Дмитрий Викторович

Выводы

1. Сконструирован аспорогенный рекомбинантный авирулентный продуцент протективного антигена - В. anthracis 5 5 ДТП А -1 (Spo"). Ген, детерминирующий синтез протективного антигена, локализован в составе плазмиды pUBl 10РА-1. Штамм В. anthracis 55ATIIA-l(Spo") стабильно наследует гибридный репликон в условиях селективного давления, не реверсирует к спорообразующему фенотипу и характеризуется низкой активностью протеолитических ферментов.

2. Аспорогенный рекомбинант В. anthracis 55ATIIA-l(Spo") продуцирует в среду выращивания около 80 мкг/мл биологически активного протективного антигена, что почти в 4 раза превышает его продукцию вакцинным штаммом В. anthracis 55.

3. Оптимизирована экспериментальная схема выделения и очистки протективного антигена, синтезируемого генно-инженерным продуцентом. Установлено, что продукция ПА рекомбинантным штаммом В. anthracis 55АТПА-l(Spo") не зависит от содержания в атмосфере СО2. Использование в технологическом процессе сконструированного на основе вакцинного штамма В. anthracis аспорогенного продуцента позволит обеспечить безопасность и эко-логичность процедуры выделения протективного антигена.

4. Достигнута высокая степень очистки протеина, продуцируемого сконструированным штаммом В. anthracis 55ATIIA-l(Spo"). По биохимическим, иммунохимическим и биологическим свойствам полученный белковый препарат является протективным антигеном сибиреязвенного микроба.

5. При иммунизации лабораторных животных протективным антигеном, синтезируемым рекомбинантным штаммом В. anthracis 55ATIIA-l(Spo"), происходит развитие адаптивного иммунитета, характеризующегося высокими титрами анти-ПА антител. Двукратная иммунизация дозой 50 мкг очищенного рекомбинантного протективного антигена обеспечивает защиту 100 % кроликов от заражения 50 ЛД50 высоковирулентного штамма В. anthracis 81/1.

6. Получены специфичные поликлональные (кроличьи) антитела к про-тективному антигену сибиреязвенного микроба. Показана перспективность их использования в схеме идентификации возбудителя сибирской язвы и для определения уровней продукции иммуногенного антигена вакцинными штаммами.

Заключение

В настоящее время создание препаратов, предупреждающих развитие инфекционных заболеваний, немыслимо без использования современных технологий. Накопленные знания о молекулярной природе, генетической детерминации и механизмах действия факторов иммуногенности патогенных микроорганизмов предоставляют широкие возможности для целенаправленного конструирования безопасных и эффективных вакцин. Одно из наиболее перспективных и успешно развиваемых направлений современной вакцинологии - клонирование детерминант иммуногенности и получение рекомбинантных штаммов, синтезирующих протективные антигены.

Клонирование гена, определяющего синтез ПА сибиреязвенного микроба, сопряжено с преодолением трудностей, связанных, в первую очередь, со стабильностью воспроизведения и функционирования детерминанты в гетероло-гичных системах. Помимо этого, конструирование рекомбинантных продуцентов ПА на основе бациллярных штаммов неизбежно сталкивается с проблемой выраженной активности протеолитических ферментов большинства представителей рода Bacillus, а также их способности к образованию спор в условиях культивирования in vitro.

Вышеизложенное является обоснованием целесообразности конструирования стабильного аспорогенного рекомбинантного штамма В. anthracis, сочетающего интенсивную продукцию протективного антигена с низкой активностью протеолитических ферментов.

Предпосылками для успешного решения поставленной задачи явилось наличие аспорогенного реципиентного штамма В. anthracis и гибридной плазмиды pUBl 10РА-1 со встроенным геном pag.

Не образующий спор спонтанный мутант был селектирован ранее в популяции бесплазмидного производного вакцинного штамма В. anthracis 55, характеризующегося низкой активностью протеолитических ферментов. Аспороген-ность штамма Я anthracis 55AT(Spo") (КМ92(3)) сохранялась при культивировании in vitro и в процессе хранения (Микшис Н.И. с соавт., 2003).

Гибридная плазмидарЦШ 10РА-1 (6,5 т.п.н.), содержащая интактный ген pag, получена на основе мультикопийного вектора pUBllO. Функционирование данного репликона в бациллярных штаммах отличалось стабильностью и обеспечивало выраженную эспрессию гена, детерминирующего синтез ПА сибиреязвенного микроба (Микшис Н.И. с соавт., 2007).

ДНК плазмиды pUB110PA-l выделяли из спорообразующего рекомбинантного штамма В. anthracis СТИАТПА-1. Полученный препарат плазмидной ДНК после определения электрофоретической подвижности, концентрации и осуществления рестрикционного анализа использовали в экспериментах по электростимулируемой трансформации.

Культуру реципиентного штамма В. anthracis 55AT(Spo") выращивали в бульоне до середины логарифмической фазы роста. В одном случае проводили предварительную обработку клеток пенициллином, в другом - нет. После осуществления электропорации и инкубации в течение 2-х часов в обычных условиях трансформационную смесь высевали на твердую питательную среду с селективным антибиотиком. В результате были получены антибиотикорезистент-ные трансформанты. Эффективность трансформации не зависела от применения пенициллина и составила приблизительно 30 КОЕ/мкг ДНК.

Трансформанты переносили методом реплик на чашки со специальной средой, содержащей антитела к ПА. После соответствующей инкубации вокруг клонов образовавлись почти одинаковые радиальные зоны преципитаци-ии продуцируемого антигена со специфичными антителами.

Факт переноса плазмиды подтверждали данными электрофоретического разделения ДНК в агарозном геле. Наличие клонированного гена pag - результатами ПЦР-анализа. ПЦР-анализ с "диагностическими" праймерами на последовательности гена pag подтвердил его присутствие в трансформантах В. anthracis 55ATTIA-l(Spo").

Важно, что после введения чужеродной наследственной информации клоны трансформантов сохраняли аспорогенность и низкую активность протеоли-тических ферментов, присущие реципиентному штамму.

Определение стабильности репликации pUB110PA-l в аспорогенном штамме проводили с применением схемы последовательных пассажей в жидкой питаптельной среде с канамицином. Через каждые 5 пересевов производили контрольный высев культуры на твердую питательную среду и осуществляли клональный анализ, для чего методом реплик на чашки с канамицином и без него переносили до 100 изолированных колоний. Для нескольких произвольно выбранных антибиотикорезистентных колоний осуществляли плазмидный скрининг, контролируя присутствие в образцах ДНК репликона с электрофоре-тической подвижностью, свойственной pUBl 10РА-1.

Установлено, что трансформанты В. anthracis 55ATTIA-l(Spo") при пассировании in vitro в присутствии селективного антибиотика стабильно наследуют плазмиду pUB110PA-l. Частота элиминации гибридного репликона в популяциях исследованных клонов не превышала 5 %. Клональный анализ трех трансформантов (№ 5, 23 и 48) не выявил ни одного случая утраты pUBl 10РА-1 в продолжение 15 последовательных пассажей в условиях селективного давления.

Экспрессию клонированного гена pag в составе аспорогенного штамма В. anthracis 55ATnA-l(Spo") исследовали с помощью комплекса биохимических и иммунохимических методов. В иммунохимических реакциях использовали по-ликлональные антитела к ПА. Специфичные сыворотки получали при иммунизации кроликов белковым препаратом, выделенным из спорообразующего ре-комбинантного продуцента В. anthracis СТИДТПА-1.

Белок с электрофоретической подвижностью, установленной для ПА сибиреязвенного микроба (83 кДа), секретировали все три клона В. anthracis 55ATIIA-l(Spo"). Продукция ПА аспорогенными рекомбинантами по данным белкового электрофореза превосходила продукцию контрольного вакцинного штамма В. anthracis 55. Среди тестированных рекомбинантных клонов большее количество ПА секретировали трансформанты № 5 и 48.

Иммунореактивность синтезируемого белка подтверждали с помощью постановки реакции иммуноблота с поликлональными антителами к ПА. Элек-трофоретически разделенные белки концентрированных культуральных фильтратов аспорогенных трансформантов переносили из полиакриламидного геля на нитроцеллюлозную мембрану Hybond-C. После этого мембрану последовательно инкубировали со специфичными кроличьими антителами и диагностическими антителами против кроличьих иммуноглобулинов, мечеными пероксидазой. В результате окрашивания раствором диаминобензидина на нитроцеллюлозной мембране образовывались четкие полосы на уровне, электрофоретической подвижности ПА.

Способность к синтезу ПА трансформантов, получивших в результате генетического переноса плазмиду pUB110PA-l, очень наглядно продемонстрирована результатами реакции преципитации на среде с анти-ПА антителами. Ас-порогенные рекомбинантные клоны образовали одинаково большие зоны радиальной диффузии антигена. Ширина колец преципитации вокруг их посевов составила около 10 мм, в то время как вокруг посева В. anthracis 55 аналогичный показатель был не более 2 мм. Штамм В. anthracis 55АТ, не содержащий ген pag, радиальной зоны преципитации не образовывал.

Сходные результаты получили при постановке дот-анализа. Тестировали t культуральные фильтраты трех трансформантов В. anthracis 55ATTIA-l(Spo~) №5, 23, 48, исходного вакцинного штамма В. anthracis 55 и спорообразующего рекомбинанта В. anthracis 55АТПА-1. Более интенсивное окрашивание образовавшихся иммунных комплексов отмечали в рядах, соответствующих образцам культуральных фильтратов рекомбинантных штаммов - трех клонов аспорогенных трансформантов и спорообразующего генно-инженерного продуцента. Из всех исследованных стабильных трансформантов наилучшей способностью к секреции иммуногенного антигена обладал клон № 5. На основании данных дот-анализа он продуцировал ПА приблизительно в 8 раз больше, чем исходный штамм В. anthracis 55.

С использованием твердофазного ИФА осуществили количественную оценку уровней продукции ПА. На основании сопоставления данных нескольких анализов определили, что трансформант В. anthracis 55ATTIA-l(Spo") №5 продуцирует 80 - 90 мкг/мл ПА, а клоны № 23 и 48 - чуть меньше - около 80 мкг/мл. Продукция ПА вакцинными штаммами В. anthracis СТИ-1 и В. anthracis 55 составила 15 и 20 мкг/мл, соответственно.

Таким образом, получен рекомбинантный штамм В. anthracis, являющийся стабильным аспорогенным протеазодефицитным продуцентом ПА сибиреязвенного микроба. Совокупность полезных свойств рекомбинантного штамма определяет перспективы его практического использования. В частности, он может служить прототипом для создания безопасной и экологичной технологии производства химических сибиреязвенных вакцин. Сконструированный штамм продуцирует ПА в несколько раз больше, чем вакцинные штаммы В. anthracis СТИ-1 и В. anthracis 55. Он не содержит генов, детерминирующих синтез основных факторов патогенности возбудителя сибирской язвы, и не образует спор, способных длительно сохраняться и накапливаться в окружающей среде. Применение аспорогенного продуцента не будет связано с риском контаминации помещений и оборудования спорами, чрезвычайно устойчивыми к действию обеззараживающих агентов.

Немаловажно, что рекомбинантный штамм В. anthracis 55АТПА-1 (Spo") создан на основе протеазодефицитного реципиента. Низкая активность собственных протеаз штамма-продуцента позволит избежать значительных потерь биогогически значимого продукта в процессе его выделения и очистки.

Перспектива использования сконструированного нами аспорогеннного штамма для получения ПА сибиреязвенного микроба в лабораторных или даже промышленных условиях накладывает определенную долю ответственности за стабильность воспроизведения заключенной в нем наследственной информации. В этой связи, нам необходимо было получить убедительные свидетельства сохранения асиорогенноети и способности к репликации гибридной плазмиды в процессе длительного пассирования штамма in vitro, а также при его хранении.

Для изучения стабильности использовали различные схемы последовательных пересевов культур с регулярным анализом свойств аспорогенности и антибиотикорезистентности. Способность к спорообразованию тестировали у 10-ти произвольно выбранных клонов, резистентность к селективному антибиотику - не менее чем у 50-ти.

В течение более 30 суточных пассажей пересевов штамма В. anthracis 55ATTTA-l(Spo") на питательных средах с добавлением селективного антибиотика случаев элиминации плазмиды pUBl 10РА-1 отмечено не было. По окончании пассирования, а также на промежуточных этапах (через каждые 5-7 пересевов) реверсии к спорообразующему фенотипу также не наблюдали.

Данные электрофореза белковых препаратов, выделенных из культураль-ных фильтратов исследуемых клонов, свидетельствовали об их неизмененной способности к продукции ПА. Специфичность взаимодействия соответствующих белков с антителами к ПА подтверждали постановкой реакции иммунобло-та.

В процессе исследования было также установлено, что элиминация плазмиды pUB110PA-l не происходит в течение непродолжительного периода выращивания штамма В. anthracis 55ATllA-l(Spo") в жидкой питательной среде без селективного антибиотика. Однако продление времени культивирования рекомбинантного аспорогенного продуцента ПА в отсутствии канамицина, как и увеличение количества суточных пассажей, приводило к постепенному нарастанию темпов утраты репликона, несущего детерминанту синтеза ПА. Элиминация pUBl 10РА-1 после третьих суток достигала уровня 40 %. К пятому пассажу количество чувствительных к канамицину клонов составляло почти 90 %. Вместе с тем, реверсии к спорообразующему и протеазоположительному фенотипу даже при многократном пассировании в жидкой питательной среде без селективного антибиотика не наблюдали.

После депонирования в ГКПБ "Микроб" лиофильно высушенного штамма В. anthracis 55ATIIA-l(Spo") (КМ97) периодически тестировали стабильность его биологических свойств в условиях хранения. В течение более двух лет наблюдения штамм сохранял все присущие ему свойства.

На следующем этапе решали задачу оптимизации условий культивирования аспорогенного рекомбинантного продуцента на питательных средах. Выращивание культуры В. anthracis 55ATriA-l(Spo") осуществляли в богатой питательной среде, содержащей в больших количествах триптон и дрожжевой экстракт (S-бульон), и моделируя условия продукции ПА возбудителем сибирской язвы in vivo, то есть при повышенном содержании СОг

Параллельно тестировали 4 вида сред: S-бульон, L-бульон, бульон Хот-тингера и бульон Хоттингера с добавлением дрожжевого аутолизата. Одну порцию инкубировали в атмосфере СОг, другую - в обычной атмосфере. Уровни продукции ПА сравнивали на основании данных белкового электрофореза.

Электрофоретическое разделение протеинов культуральных фильтратов показало, что штамм В. anthracis 55ATIIA-l(Spo") продуцирует наибольшее количество ПА при его росте в S-бульоне. Данная среда является оптимальной для развития микроорганизма и секреции иммуногенного белка. Использование бульона Хоттингера возможно только при условии добавления дополнительных ингредиентов, например, дрожжевого аутолизата.

Очень важным оказалось наблюдение, что продукция ПА аспорогенным рекомбинантом не зависит от содержания в атмосфере СОг. Как известно, экспрессия гена pag в составе pXOl, находится под строгим контролем С02 - зависимого транскрипционного регулятора — AtxA. Область' AtxA участвует в координированной регуляции синтеза ПА, ОФ, ЛФ, капсулы, белков S-слоя и, возможно, других факторов (Hoffmaster А., КоеЫег Т., 1997; Mignot Т. et al., 2003). В рекомбинантном штамме с клонированным геном pag область AtxA отсутствует, что объясняет СОг - независимый синтез ПА.

То обстоятельство, что продукция ПА рекомбинантным штаммом В. anthracis 55ATQA-l(Spo") не зависит от содержания в атмосфере ССЬ, выгодно отличает полученный аспорогенный продуцент ПА с pUB110PA-l от аттенуиро-ванных штаммов, несущих в своем составе высокомолекулярную плазмиду pXOl.

С целью получения препаративных количеств ПА суточную агаровую культуру аспорогенного рекомбинантного штамма В. anthracis 55ATIIA-l(Spo~) засевали в 5 л S-бульона, содержащего канамицин. Бикарбонат натрия в среду не добавляли. Культуру выращивали при обычной температуре роста сибиреязвенного микроба в течение 18 часов с аэрацией. По окончании инкубации, полученный после осаждения клеточной массы супернатант фильтровали, концентрировали в 10 раз и диализовали.

Выделение ПА проводили по схеме, предложенной С. Quinn et al. (1988), в нашей модификации. В качестве первой ступени очистки использовали ионо-обменую хроматографию. Сконцентрированный и диализованный препарат порционно наносили на колонку с Macro Prep 50Q. Выход протеинов регистрировали спектрофотометрически. Образцы, соответствующие пикам поглощения, объединяли и исследовали с помощью электрофореза в акриламидном геле. Отобранные пробы объединяли, вновь концентрировали в 10 раз, диализовали и фильтровали. На заключительном этапе осуществляли гель-фильтрацию с использованием Sephacryl-HR300. Отобранные на основании спектрофотометри-ческого анализа пробы концентрировали в 10 раз и диализовали.

Результаты электрофореза в полиакриламидном геле показали почти полное освобождение образцов, как от низкомолекулярных, так и высокомолекулярных сопутствующих белков. Электрофоретическая подвижность протеина, выделенного из аспорогенного рекомбинантного штамма В. anthracis 55АТПА-1 (Spo"), соответствовала молекулярной массе 83 кДа. Всего из 5 литров исходной культуры штамма В. anthracis 55ATliA-l(Spo") было получено 80 мл высо-коочищенного препарата ПА с концентрацией белка 0,8 мг/мл. Выход составил

12,8 мг очищенного ПА на 1 литр культуры аспорогенного рекомбинатного штамма.

Удовлетворительные результаты очистки ПА и неплохой выход конечного продукта позволяют и в дальнейшем использовать данную оптимизированную схему для получения препаративных количеств иммуногенного антигена из рекомбинантного продуцента. Достигнутая степень очистки в совокупности с полным отсутствием в препарате ОФ и ЛФ обуславливают перспективность в плане конструирования на его основе современных профилактических и диагностических сибиреязвенных препаратов.

Иммуногенные свойства полученного белкового препарата ПА изучали в экспериментах на лабораторных животных. Одну группу кроликов иммунизировали очищенным препаратом ПА, выделенным из аспорогенного продуцента В. anthracis 55ATTIA-l(Spo"). Белок вводили двукратно с интервалом в 14 дней в дозе 50 мкг в сочетании с полным адъювантом Фрейнда. Другую группу вакцинировали однократно штаммом В. anthracis СТИ-1 в дозе 5 • 107 КОЕ. Особей третьей группы оставляли интактными.

В конце поствакцинального периода (на 19 сутки поле окончания иммунизации) у произвольно выбранных особей производили забор крови для определения титров антител к ПА. Адаптивный иммунитет формировался у всех опытных кроликов. В случае иммунизации белковым препаратом титры анти-ПА составили 1:8192 - 1:16384, при иммунизации живой вакциной - 1:1024 -1:2048.

Через 21 день после последней инъекции препаратов осуществляли заражение животных опытных и контрольной групп 50 ЛД50 высоковирулентного тест-штамма В. anthracis 81/1. Значение ЛД5о определяли предварительными л экспериментами -5-10 КОЕ.

В результате выжило 100 % животных, иммунизированных В. anthracis СТИ-1 и препаратом ПА. У всех неиммунизированных особей сибиреязвенная инфекция закончилась летально на третьи сутки. Специфичность инфекционного процесса подтверждали контрольным вскрытием павших животных.

Перспективы практического использования ПА, выделяемого из аспорогенного продуцента, не ограничиваются только созданием химических вакцин. Данный препарат и специфически взаимодействующими с ним антитела могут оказаться востребованными для постановки иммунохимических реакций и в конструировании иммунодиагностических тест-систем.

В частности, наличие высокоочищенного препарата ПА и специфически взаимодействующих антител позволяет проводить количественную оценку продукции ПА природными, аттенуированными и рекомбинантными штаммами В. anthracis. В нашей работе не раз были продемонстрированы достоинства и преимущества различных количественных и полуколичественных методов оценки продукции ПА - реакции радиальной иммунодиффузии, иммуноблота, дот-анализа и твердофазного ИФА.

Поли- или моноклональные антитела к очищенному ПА могут быть использованы для идентификации возбудителя сибирской язвы при осуществлении диагностических исследований. С целью доказательства такой возможности осуществили эксперименты по постановке различных вариантов ИФА (дот-анализа и твердофазного ИФА) на представительной выборке бациллярных штаммов, включающей 10 культур В. anthracis и 43 - близкородственных видов, таких как В. cereus, В. subtilis, В. thuringiensis, В. mycoides, В. megaterium, В. mesentericus, В. licheniformis и В. stearotermophylus.

Все исследованные сибиреязвенные штаммы положительно реагировали с антителами к ПА, выделенному из аспорогенного продуцента. Тестирование в дот-анализе микробных взвесей близкородственных бактерий в 9 % случаев показало наличие умеренно выраженных перекрестных реакций - у 4-х штаммов из 43-х {В. cereus 1, 8, 96 и В. mesentericus 5). Исследование стерильных культуральных фильтратов всех перечисленных бациллярных штаммов перекрестных реакций не выявило.

Полученные результаты свидетельствуют о высокой специфичности сывороток, полученных к рекомбинантному протективному антигену В. anthracis и возможности их использования для конструирования сибиреязвенных диагноста кумов.

Кроме того, на основе синтезируемого В. anthracis 55А Г11А-1 (Spo") антигена возможно создание иммуноферментных тест-систем, позволяющих диагностировать заболевание сибирской язвой и проводить оценку состояния адаптивного иммунитета вакцинированных. В качестве иллюстрации такого подхода мы провели эксперимент по определению динамики титров антител у иммунизированных морских свинок. Лабораторным животным делали однократные инъекции 5-10 спор вакцинного штамма В. anthracis СТИ-1 и определяли титры антител к ПА на 24-е, 28-е, 32-е, 36-е сутки и через 2 месяца после иммунизации. Отмечали нарастание титров антител до максимальных значений 1:2048 -1:4096 к 32-м суткам исследования и снижение показателей до 1:512 - 1:1024 спустя 2 месяца.

Таким образом, полученный нами высокоочищенный ПА, являющийся продуктом рекомбинантного аспорогенного штаммма В. anthracis 55АТПА-l(Spo"), может быть использован в конструировании профилактических и диагностических сибиреязвенных препаратов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Шулепов, Дмитрий Викторович, Саратов

1. Абалакин В.А., Сергеева Л.В., Черкасова Т.Д., Черкасский Б.Л. Очистка и характеристика факторов сибиреязвенного токсина // Микробиол. аспекты иммунобиотехнол.: Соврем, состояние и перспективы. / НИИВС АМН СССР. -М. 1992. - С. 82-93.

2. Абалакин В. А. Иммуносупрессивное действие летального токсина Bacillus anthracis на мышей. Журн. микробиол., эпидемиол. и имму-нобиол. - 1989. - № 6. - С. 94-99.

3. Александров Н.И., Гефен Н.Е., Будак А.П., Рунова В.Ф., Езепчук Ю.В., Бажинов А.Г. Изучение реактогенности химической депонированной сибиреязвенной вакцины на небольших группах людей // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1963(a). - №3.- С. 32-34.

4. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.: Медгиз, 1962. 180 с.

5. Барков A.M., Евтеева Е.В., Липницкий А.В. Выделение и антигенная характеристика компонентов культурального фильтрата Bacillus anthracis // Биотехнология. -2000. №6. - С. 27-33.

6. Бароян О.В. Очерки по мировому распределению важнейших заразных болезней человека. М.: Медицина, 1967. - 348 с.

7. Безносов М.В. Выделение и изучение специфических антигенов Bacillus anthracis с целью конструирования диагностических и профилактических препаратов // Автореф. дис. . канд. биол. наук. Саратов, 1997.-22 с.

8. Богомолов Ф.И. Морфологические и культуральные свойства штаммов сибирской язвы, выделенных из импортного кожевенного сырья. -Мпсробюлопчный журнал. 1967. - Т. 29. - С. 210-212.

9. Борисов И.В., Проскурина В.А., Неляпин Н.М. Патоморфоло-гические изменения у белых мышей при сибиреязвенной интоксикации // Тез. докл. итоговой науч. конф., Ставрополь. 1989. - Т.1. - С. 23-26.

10. Бургасов П.Н., Рожков Г.И. Сибиреязвенная инфекция. М., 1984. -212с.

11. Васильев К.Г., Сегал А.Е. История эпидемии в России. М.: Мед-гиз, 1960. - 398 с.

12. Гинсбург Н.Н. Культуральные и биохимические свойства возбудителя сибирской язвы. В кн.: Рук-во по микробиологии, клинике и эпидемиологии инфекционных болезней. М.: Медицина, 1966. - С. 297- 299.

13. Гинсбург Н.Н., Левина Е.Н., Федотова Ю.М. Современная характеристика возбудителя сибирской язвы. В кн.: Сибирская язва. 1975. -С. 6-39.

14. Глик Б., Пастернак Д. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение: Пер. с англ. М.: «Мир», 2002. - 589 с.

15. Гловер Д. Клонирование ДНК. Методы: Пер. с англ. М.: Мир, 1988. - 538 с.

16. Дербин М.И., Садовой Н.В., Тарумов B.C., Гарин Н.С. Сравнительное изучение гуморального противосибиреязвенного иммунитета у привитых живой и химической вакцинами. Иммунология. - 1982. - № 3. - С. 49-52.

17. Еремин С.А. Никифоров А.К., Костюкова Т.А., Микшис Н.И. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1999. - № 4. - С. 91 - 92.

18. Инструкции и методические указания по лабораторной, клинической диагностике, профилактике и лечению сибирской язвы у людей. М., 1980. - 65 с.

19. Ипатенко Н.Г. Сибирская язва. М.: Колос, 1996. 335 с.

20. Кудрявцева О.М. Генетическое конструирование штаммов продуцентов протективного антигена Bacillus anthracis: Дис. канд. биол. наук. -Саратов, 2007. - 134 с.

21. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. Пер. с англ. М.: Мир, 1984.- 479 с.

22. Маринин Л.И., Онищенко Г.Г., Степанов А.В. и др. Микробиологическая диагностика сибирской язвы. М.: ВУНМЦ МЗ РФ, 1999. - 222 с.

23. Микшис Н. И., Болотникова М. Ф., Новикова Л.В., Попов Ю.А., Еремин С. А., Дроздов И.Г., Кутырев В.В. Получение аспорогенных штаммов Bacillus anthracis П Биотехнология. 2003. - № 1.-С.3-11.

24. Онищенко Г.Г., Васильев Н.Т., Литусов Н.В., Харечко А. Т., Васильев П.Г., Садовой Н.В., Кожухов В.В. Сибирская язва: актуальные аспекты микробиологии, эпидемиологии, клиники, диагностики, лечения и профилактики -М.: ВУНМЦ МЗ РФ, 1999. 447 с.

25. Практическая химия белка. Пер. с англ. /Под ред. А. Дарбре. М.: Мир, 1989.-629 с.

26. Сибирская язва. Под ред. С.Г. Колесова. М.: Колос, 1976.287с.

27. Скоупс Р. Методы очистки белков. М.: Мир, 1985. -358 с.

28. Степанов А.С. Разработка основ генетического анализа возбудителя сибирской язвы: Дис. докт. мед. наук. Саратов, 1992. - 333 с.

29. Тедиков В.М., Добрица А.П. Клонирование и экспрессия детерминанты протективного антигена Bacillus anthracis в клетках Escherichia coli, Ваcillus subtilis и Bacillus anthracis II Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. -1993.-№2.-С. 13-16.

30. Тучков И. В., Куличенко А.Н., Норкина О.В., Дроздов И.Г. Детекция штаммов сибиреязвенного микроба с использованием полимеразной цепной реакции // Генет., микробиол., и совершенствование методов лаб. диагн. особо опасных инф. Саратов, 1991. - С. 89-91.

31. Фримель Г. Иммунологические методы: Пер. с англ. М.: Медицина, 1987.-472 с.

32. Черкасова Т.Д., Абалакин В.А. Чувствительность иммуноком-петентных клеток мышей к токсину Bacillus anthracis И Журн. микробиол., эпи-демиол. и иммунобиол. 1989. - №4.- С.104-105.

33. Черкасский Б.Л., Жанузаков Н.Ж. Сибирская язва. Алма-Ата: Кайнар, 1980. -269 с.

34. Черкасский Б.Л. Эпидемиология и профилактика сибирской язвы. М.: «Интерсэн», 2002. 384 с.

35. Щелкунов С. Н. Генетическая инженерия: Учеб. пособие: В 2 ч. -Новосибирск: изд-во Новосиб. Ун-та, 1994. 304 с.

36. Azhar A., Singh S., Anand К., Bhatnagar R. Expression of protective antigen in transgenic plants: a step towards edible vaccine against anthrax // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. - V. 299. - № 3 - P.345-351.

37. Baillie L.Vaccine production of the Bacillus anthracis protective antigen // United States Patent № US6267966 (C12N15/31; A61K39/07; C12R1/125) 2001.

38. Baillie L., Moir A., Manchee R. The expression of the protective antigen of Bacillus anthracis in Bacillus subtilis II J. Appl. Microbiol. 1998. - V. 84. - №5. -P. 741-746.

39. Barnard J., Friedlander A. Vaccination against anthrax with attenuated recombinant strains of Bacillus anthracis that produce protective antigen // Infect. Im-mun. 1999. - V. 67. - № 2. - P. 562-567.

40. Bartkus J., Leppla S. Transcriptional regulation of the protective antigen of Bacillus anthracis II Infect. Immun. 1989. - V. 57. - P. 2295-2300.

41. Beal F., Taylor M., Thome C. Rapid lethal effect in rats of a third component found upon fractionating the toxin of Bacillus anthracis II J. Bacteriol. 1962. -V. 83. - P. 1274-1280.

42. Bhatnagar R., Singh J., Leppla S., Friedlander A. Calcium is required for the expression of anthrax lethal toxin activity in the macrophagelike cell line J774A. 1 //Infec. Immun.- 1989. V.57. - №7. - P. 2107-2114.

43. Bourgogne A., Drisdale M., Hilsenbeck S., Peterson S., Koehler T. Global effect of virulence gene regulators in a Bacillus anthracis strain with both virulence plasmid //Infect. Immun. 2003. - V. 71. - №. 5. - P. 2736 - 2743.

44. Brachman P. Anthrax. In: Infectious Disease, Edited by Hoeprich P.D., New York, Harper and Row. 1977. - P. 807-812.

45. Brachman P. Bioterrorism: an update with a focus on anthrax // Am J. Epidemiol. 2002. - V. 155. - P. 981 -987.

46. Bragg Т., Robertson D. Nucleotide sequence and analysis of the lethal factor gene (lef) from Bacillus anthracis II Gene. 1989. - V. 81. - P. 45-54.

47. Bush L. Abrams В., Beall A. et al. Index case of fatal inhalational anthrax due to bioterrorism in the United States // N. Engl. J. Med. 2001. - V. 345. - P. 16071610.

48. Cataldi A., Labruiere E. Mock M. Construction and characterization of a protective antigen deficient Bacillus anthracis strain // Mol. Microbiol. - 1990. - V. 4. - № 7. - P. 1111-1117.

49. Chauhan V., Singh A., Waheed S., Singh S., Bhatnagar R. Constitutive expression of protective antigen gene of Bacillus anthracis in Escherichia coli II Bio-chem. Biophys. Res. Commun. 2001. - V. 283. - № 2. - P. 308-315.

50. Chichester J., Musiychuk K., de la Rosa P., Horsey A., Stevenson N.,

51. UgulavaN., Rabindran S., Palmer G., Mett V., Yusibov V. Immunogenicity of a sub-unit vaccine against Bacillus anthracis // Vaccine. 2007. - V. 25. - № 16. - P. 31113114.

52. Coulson N., Fulop M., Titball R. Effect of different plasmids on colonization of mouse tissues by the aromatic amino acid dependent Salmonella typhimurium SL 3261 // Microb. Pathog. 1994. - V. 16. - № 4. - P. 305-311.

53. Escuyer V., Duflot E., Sezer O., Danchin A., Mock M. 1988. Structural homology between virulence-associated bacterial adenylate cyclases. // Gene. 1988. - V. 71.-P. 293-298.

54. Farchaus J., Ribot W., Jendrek S., Little S. Fermentation, purification, and characterization of protective antigen from a recombinant, avirulent strain of Bacillus anthracis II Appl. Environ. Microbiol. 1998. - V. 64. - № 3. - P. 982-991.

55. Fish D., Mahlandt В., Dobbs J., Linkoln R. Purification and properties of in vitro produced anthrax toxin components // J. Bacteriol. 1968. - V. 95. - P. 907918.

56. Fowler K., McBride В., Turnbull P., Baillie L. Immune correlates of protection against anthrax // J. Appl. Microbiol. 1999. - V. 87. - № 2. - P. 305.

57. Friedlander A. Macrophages are sensitive to anthrax lethal toxin thorough an acid-dependent process // J. Biol. Chem. 1986. - V. 261. - P. 7123-7126.

58. Friedlander A. The anthrax toxins. In: Trafficking of Bacterial Toxins. Ed. Saelinder C.B.CRC Press, Boca Raton. 1990. - P. 121-128.

59. Gladstone G. Immunity of anthrax: protective antigen present in cell-free culture filtrates // Brit. J. Exp. Pathol. 1946. - V. 27. - P. 393-410.

60. Gordon V., Leppla S., Hewleff E. Inhibitors of receptor mediated endocy-tosis block the entry of Bacillus anthracis adenylate cyclase toxin but not that of Bordetellapertussis II Infect. Immun. 1988. - V. 56. - № 5. - P. 1066-1069.

61. Guidi-Rontani C., Weber-Levy M., Mock M., Cabiaux V. Translocation of Bacillus anthracis lethal and edema factors across endosome membranes // Cell. Microbiol. 2000. - V. 2. - P. 259-264.

62. Gupta P., Waheed S., Bhatnagar R. Expression and purification of the recombinant protective antigen of Bacillus anthracis II Protein Expr. Purif. 1999. - V. 16. - № 3. - P. 369-376.

63. Hahn J., Dubnau D. Analysis of plasmid deletional instability in Bacillus subtilis И J. Bacterid. 1985. - V. 162. - P. 1014-1023.

64. Heines В., Klein F., Lincoln R. Quantitative assay for crude anthrax toxin // J. Bacteriol. 1965. - Vol.89. - P. 74-83.

65. Hoffinaster A., Koehler T. The anthrax toxin activator gene atxA is associated with CC>2-enhanced non-toxin gene expression in Bacillus anthracis II Infect. Immun. 1997. - V. 65. - P. 3091-3099.

66. Hoffinaster A., Koehler T. Autogenous regulation of the Bacillus anthracis pag operon. // J. Bacteriol. 1999(a). - V. 181. - P. 4485-4492.

67. Hoffinaster A., Koehler T. Control of virulence gene expression in Bacillus anthracis II J. Appl. Microbiol. 1999(6). - V. 87. - P. 279-281.

68. Hull A., Criscuolo C., Mett V., Groen H., Steeman W., Westra H., Chapman G., Legutki В., Baillie L., Yusibov V. Human-derived, plant-produced monoclonal antibody for the treatment of anthrax // Vaccine. 2005. - V. 23. - P. 20822086.

69. Iacono-Connors L., Welkos S., Ivins В., Dalrymple J. Protection against anthrax with recombinant virus-expressed protective antigen in experimental animals //Infect. Immun.- 1991.-V. 59.-№6.-P. 1961-1965.

70. Ivins В., Welkos S. Cloning and expression of Bacillus anthracis protective antigen in Bacillus subtilis II Infect. Immun. 1986. - V. 54. - P. 537-542.

71. Ivins В., Worsham P., Friedlander A., Farchaus J., Welkos S. Method of making a vaccine // United States Patent № US2002034512 (C12N15/75; C12N15/74).-21.03.2002.

72. Kado C., Liu S. Rapid procedure for detection and isolation of large and small plasmids //J. Bacteriol. 1981. - V.145. - № 3. - P. 1365-1373.

73. Klimpel K., Arora N., Leppla S. Anthrax toxin lethal factor contains a zinc metalloprotease consensus sequence which is required for lethal toxin activity // Mol. Microbiol. 1994. - V. 13. - P. 1093-1100.

74. Koehler Т., Dai Z., Kaufman-Yarbray M. Regulation of the Bacillus anthracis protective antigen gene: C02 and a trans-acting element activate transcription from one of two promoters. // J. Bacteriol. 1994. - V. 176. - P. 586 - 595.

75. Koprowski H. Old and new prescriptions for infectious diseases and the newest recipes for biomedical products in plants // Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz). 2002. - V. 50. - №. 6. - P. 365-369.

76. Koya V., Moayeri M., Leppla S., Daniell H. Plant-based vaccine: mice immunized with chloroplast-derived anthrax protective antigen survive anthrax lethal toxin challenge // Infect. Immun. 2005. - V. 73. - № 12. - P. 8266-8274.

77. Larson D., Calton G., Burnett J., Little S., Leppla S. Purification of Bacillus anthracis protective antigen by immunosorbent chromatography. Enzyme Mi-crob. Technol. - 1988. - V. 10. - №1. - P. 14-18.

78. Larson D., Calton G., Little S., Leppla S., Burnett J. Separation of three exotoxic factors of Bacillus anthracis by segnential immunosorbent chromatography. -Toxicon. 1988. - V.26. - № 10. - P.913-921.

79. Leppla S. Anthrax toxin edema factor: a bacterial adenylate cyclase that increases cyclic AMP concentrations in eukaryotic cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982.-V. 79.-P. 3162-3166.

80. Leppla S. Anthrax toxins. In Bacterial Toxins and Virulence Factors in Disease, ed. J. Moss, B. Iglewski, M. Vaughan, A. Tu. New York/Hong Kong: Basel, 1995.-V. 8.-P. 543-572.

81. Leppla S. Production and purification of anthrax toxin // Methods Enzy-mol. 1988. - V. 165. - P. 103-116.

82. Leppla S. The anthrax toxin complex. In: Alouf J. and Freer J., Sourcebook of bacterial protein toxins, London: Academic Press., 1991. P. 277-302.

83. Linkoln R., Fish D. Anthrax toxin. In: T. Montie, S. Kadis, S. Ajl, Microbial Toxins III, New York, 1970. P. 361-414.

84. Little S., Leppla S., Cora E. Production and characterization of monoclonal antibodies to the protective antigen component of Bacillus anthracis toxin // Infect. Immun. 1988. - V.56. - №7.- P. 1807-1813.

85. Masure H., Shattuck R., Storm D. Mechanisms of bacterial pathogenicity that involve production of calmodulinsensitive adenylate cyclases // Microbiol. Rev. -1987.-V.51.- №1.- P. 60-65.

86. Mignot Т., Mock M., Fouet A. A plasmid-encoded regulator couples the synthesis of toxins and surface structures in Bacillus anthracis II Mol. Microbiol. -2003. V. 47. - № 4. - P. 917-927.

87. Mikesell P., Ivins В., Ristroph J., Dreier T. Evidence for plasmid-mediated toxin production in Bacillus anthracis II Infect. Immun. 1983. - V. 39. - P.371.376.

88. Miller J., McBride В., Manchee R., Moore P., Baillie L. Production and purification of recombinant protective antigen and protective efficacy against Bacillus anthracis // Lett.Appl. Microbiol. 1998. - V. 26. - № 1. - P. 56-60.

89. Milne J., Blanke S., Hanna P., Collier R. Protective antigen-binding domain of anthrax lethal factor mediates translocation of a heterologous protein fused to its amino- or carboxy-terminus // Mol. Microbiol. 1995. - V. 15. - P. 661-666.

90. Mock M., Labruy'ere E., Glaser P., Danchin A., Ullmann A. Cloning and expression of the calmodulin-sensitive Bacillus anthracis adenylate cyclase in Escherichia coli II Gene. 1988. - V. 64. - P. 277-284.

91. National Communicable Disease Center Investigational new drug application for anthrax protective antigen, aluminum hydroxide absorbed. FDA № DBS-IND 180,1970.

92. O'Brien J., Friedlander A., Dreier Т., Ezzel J., Leppla S. Effects of anthrax toxin components on human neutrophies // Jnfect. Immun. 1985. - V. 47. - № l.-P. 306-310.

93. Petosa C., Collier R., Klimpel K., Leppla S., Liddington R. Crystal structure of the anthrax toxin protective antigen //Nature, 1997. — V. 385. - P. 833-838.

94. Puziss M., Howard M.B. Studies on immunity in anthrax. Control of cellular permeability by bicarbonate ion in relation to protective antigen elaboration // J. Bacteriol. 1963. - V.85. - №1. - P.237-243.

95. Quinn С., Shone С., Turnbull P., Melling J. Purification of anthrax-toxin components by high-performance anion-exchange, gel-filtration and hydrophobic-interaction chromatography // J. Biochem. 1988. - V. 252. - P. 753-758.

96. Quinn C., Singh Y., Klimpel K., Leppla S. Functional mapping of anthrax toxin lethal factor by in-frame insertion mutagenesis. // J. Biol. Chem. 1991. - V. 266. - P. 20124-20130.

97. Robertson D., Leppla S. Molecular cloning and expression in Escherichia coli of the lethal factor gene of Bacillus anthracis II Gene. 1986. - V. 44. - P. 71-78.

98. Robillard N., Koehler Т., Murray R., Thorne C. Plasmid pBAl-mediated toxin production in Bacillus anthracis cells // Abstr. Annu. Meet. Amer. Soc. Microbiol. 1983. - V. 54.-P. 115.

99. Sastiy K., Tuteja U., Santhosh P., Lalitha M., Batra H. Identification of Bacillus anthracis by a simple protective antigen-specific mAb dot-ELISA//J. Med. Microbiol. 2003. - V. 52. - P. 47-49.

100. Singh Y., Leppla S., Bhatnagar R., Friedlander A. Bases of cellular sensitivity and resistance to anthrax lethal toxin. In: P.C.B.Turnbull, Proc. Int. Workshop on Anthrax. Salisbury Med. Bull., Winchester, England, 1989. P. 51.

101. Singh Y., Ivins В., Leppla S. Study of immunization against anthrax with the purified recombinant protective antigen of Bacillus anthracis II Infect. Immun. -1998. V. 66. - № 7. - P. 3447-3448.

102. Singh Y., Klimpel K., Arora N., Sharma M., Leppla S. The chymotryp-sinsensitive site, FFD315, in anthrax toxin protective antigen is required for translocation of lethal factor // J. Biol. Chem. 1994. - V. 269. - P. 29039-29046.

103. Spencer R., Lightfoot N. Preparedness and response to bioterrorism // J. Infect. 2001. - V.43.-P.104-110.

104. Spencer R., Wilcox M. Agents of biological warfare // Rev. Med. Microbiol. 1993. - V. 4. - P. 138-143.

105. Stanley J., Smith H. Purification of factor I and recognition of third factor of the anthrax toxin//J. Gen.Microbiol. 1961. - V. 26. - P. 49-66.

106. Swanson-Biearman В., Krenzelok E. Delayed life-threatening reaction to anthrax vaccine // J. Clin. Toxicol. 2001. - V. 39. - № 1. - P. 81-84.

107. Thorne C.5 Belton F. An agar diffusion method for titrating Bacillus anthracis immunizing antigen and its application to a study of antigen production // J. Gen. Microbiol. 1957. - V. 17. - P. 505-516.

108. Tippets M.5 Robertson D. Molecular cloning and expression of Bacillus anthracis edema factor toxin gene: a calmodulin-dependent adenylate cyclase I I J. Bacteriol. 1988. - V. 170. - № 5. - P. 2263 - 2266.

109. Towbin H., Staehelin Т., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. - Vol. 76. - P. 4350-4354.

110. Turnbull P., Broster M., Carman J. Development of antibodies to protective antigen and lethal factor components of anthrax toxin in humans and guinea pigs and their relevance to protective immunity // Infect. Immun. 1986. - V. 52. - P. 356363.

111. Uchida I., Sekizake Т., Hashimoto K., Terakado N. Association of the incapsulation of Bacillus anthracis with 60 megadalton plasmid // J. Gen. Microbiol. 1985. - V. 131. - P. 363-367.

112. Uchida I., Hornung J., Thorne C., Klimpel K., Leppla S. Cloning and characterization of a gene whose product is a trans-activator of anthrax toxin synthesis // J. Bacteriol. 1993. - V. 175. - P. 5329 -5338.

113. Vodkin M., Leppla S. Cloning of the protective antigen gene of Bacillus anthracis I I Cell. 1983. - V. 34. - P. 693-697.

114. Welkos S., Lowe J., Eden-McCutchan F., Vodkin M., Leppla S., Schmidt J. Sequence and analysis of the DNA encoding protective antigen of Bacillus anthracis I I Gene. 1988. - V. 69. - P. 287-300.

115. Worsham P., Sowers M. Isolation of an asporogenic (spoOA) protective antigen-producing strain of Bacillus anthracis // Canad. J. Microbiol. 1999. - V. 45. -P. 1-8.

116. Wright G. Influence of spermine and related substances on susceptibility of Bacillus anthracis to lyzozyme // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1961. - V. 108. - P. 740-742.

117. Wright G., Green Т., Kanode R. Studies on immunity in anthrax. Immunizing activity of alumprecipitated protective antigen. J. Immunol. - 1954. -V. 73. - №6. - P. 387-391.

Информация о работе

Шулепов, Дмитрий Викторович
кандидата медицинских наук
Саратов, 2009
ВАК 03.00.07

Диссертация

Аспорогенный рекомбинантный штамм Bacillus anthracis – продуцент протективного антигена сибиреязвенного микроба - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы