Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение, биохимическая и иммунобиологическая характеристика белков S-слоя сибиреязвенного микроба

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Выделение, биохимическая и иммунобиологическая характеристика белков S-слоя сибиреязвенного микроба"

На правах рукописи

ГОНЧАРОВА Анастасия Юрьевна

ВЫДЕЛЕНИЕ, БИОХИМИЧЕСКАЯ И ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БЕЛКОВ Б-СЛОЯ

СИБИРЕЯЗВЕННОГО МИКРОБА

03 00 07 - микробиология 03 00 04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

003173818

Работа выполнена в ФГУЗ "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научные руководители:

Доктор биологических наук, профессор Попов Юрий Алексеевич

Кандидат медицинских наук Микшис Наталья Ивановна

Официальные оппоненты:

Д.м н, профессор Липницкий Анатолий Васильевич

Д б н, профессор Тараненко Татьяна Михайловна

Ведущая организация: ФГУЗ "Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт"

Защита состоится " 2007 г. в /^^^часов на

заседании диссертационного совета Д 208 078. 01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора (кандидата) наук при ФГУЗ "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (410005, г. Саратов, ул Университетская, 46)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГУЗ "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб"

Автореферат разослан_^¿2 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук, .р

старший научный сотрудник ^{^^^^Слудский А.А

*

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Bacillus anthracis - этиологический агент особо опасного инфекционного заболевания - сибирской язвы В настоящее время существует тенденция к ухудшению эпидемиологической обстановки по сибирской язве, что выражается в неуклонном росте эндемичных территорий, регулярном возникновении вспышек заболевания людей и сельскохозяйственных животных, угрозе применения возбудителя сибирской язвы в качестве биологического оружия (Ипатенко НГ, 1996, Онищенко Г Г с соавт, 1999, Черкасский БЛ, 2002, Bush L et al, 2001) В связи с этим, большое внимание уделяется разработке и внедрению в практику иммунопрофилактических препаратов, основанных на использовании видоспецифических антигенов В anthracis

Развитие иммунного ответа макроорганизма обуславливает протек-тивный антиген сибиреязвенного токсина В качестве хромосомных факторов патогенности В anthracis в разное время рассматривались гемолизины, про-теазы, ферменты пигментсинтеза и спорообразования (Цыганкова О И, 1993; Еременко Е И, 1997, Koehler Т et al, 1992) В последнее время внимание отечественных и зарубежных исследователей привлекают упорядоченные поверхностные структуры - S-слои, ввиду их возможного участия в проявлении вирулентных и иммуногенных свойств микроорганизмов (Sleytr U, Messner Р, 1988, Bahl H et al, 1997, Bevendge T et al, 1997, Дебабов В Г, 2004)

S-слой (от англ surface — поверхность) представляет собой регулярное паракристаллическое окружение клетки и присутствует у большинства грам-положительных и грамотрицательных эубактерий и архебактерий Расположенный между капсулой и пептидогликаном S-слой возбудителя сибирской язвы представлен двумя белками - Sap (от англ surface array protem) и ЕА1 (от англ extractable antigen I) Белки S-слоя последовательно присутствуют на клеточной поверхности- на начальных стадиях роста in vitro синтезируется Sap, затем в течение стационарной фазы происходит замещение Sap на ЕА1 и выделение Sap в супернатант Синтез S-слоя детерминируется двумя генами sap и eag, расположенными в одинаковой ориентации, один за другим на хромосоме возбудителя сибирской язвы, и координируется AtxA-регулоном, вовлеченным в глобальную регуляцию генов токсина, капсулы и компонентов S-слоя

Среди отечественных работ по изучению поверхностных белков особого внимания заслуживают исследования M В Безносова с соавторами (1997) Из клеточной стенки штамма В anthracis СТИ-1 они экстрагировали белок С По молекулярной массе и биологическим свойствам данный антиген близок к ЕА1 Авторы показали перспективность применения белка С в конструировании диагностических и профилактических сибиреязвенных препаратов

Биоинформационные и протеомные анализы, осуществленные в различное время на модели возбудителя сибирской язвы, продемонстрировали наличие иммуногенных белков, кодируемых хромосомными генами (Ariel N et al, 2003, Chitlaru T et al, 2004, Gat O et al, 2006) Среди них оказались и белки S-слоя - Sap и ЕА1 В пользу иммунологической активности S-слоя т vivo косвенно свидетельствует тот факт, что в сыворотке больных сибирской язвой и иммунизированных людей и животных обнаруживаются антитела к Sap и ЕА1 Изучение вклада поверхностных белков в реализацию иммуногенных свойств В anthracis может быть полезным для конструирования более совершенных средств профилактики сибирской язвы

Все вышеизложенное определило актуальность данной диссертационной работы

Цель исследования выделение и идентификация белков S-слоя В anthracis, изучение их иммуногенного потенциала

Основные задачи исследования:

1 Селекция сибиреязвенных штаммов, продуцирующих белок

S-слоя.

2 Выделение и очистка белков Sap и ЕА1

3 Идентификация выделенных белков в качестве компонентов S-слоя с использованием биохимических, электронно-микроскопических и иммуноэлекгронно-микроскопических методов

4 Изучение иммуногенных свойств белков S-слоя

5 Получение штаммов В anthracis, дефектных по секреции белка Sap

6 Изучение вклада белка Sap в реализацию протективных свойств микроорганизма на модели сконструированной изогенной системы Sap+ и Sap" штаммов

Научная новизна исследования.

Впервые у штаммов возбудителя сибирской язвы обнаружены различия в продукции in vitro одного из белков S-слоя - Sap. Среди природных изо-лятов и аттенуированных производных В anthracis обнаружены культуры, не продуцирующие Sap в среду выращивания

С помощью биохимических, электронно-микроскопических и имму-ноэлектронно-микроскопических методов исследования получены доказательства принадлежности к структурам S-слоя сибиреязвенного микроба белков, выделенных из культурального фильтрата В anthracis SterneATPrt" и экстрактов клеточных стенок В anthracis СТИДТ.

Впервые показано, что условия температурной элиминации плазмид способствуют возникновению спонтанных Sap* мутаций Получены штаммы,

дефектные по экскреции белка Sap, за счет инсерции транспозона (Тп9/7) в последовательность хромосомных генов

Сконструирована изогенная система штаммов В anthracis продуцирующих и непродуцирующих белок S-слоя - Sap На ее основе получены доказательства участия белков S-слоя в обеспечении иммуногенности токсино-продуцирующих штаммов В anthracis Установлено, что штамм, дефектный по секретируемому синтезу белка Sap, обладает индексом иммунитета в три раза ниже по сравнению с Sap+ изогенным вариантом

Показано, что белки S-слоя являются дополнительными факторами иммуногенности при главенствующей роли протективного антигена сибиреязвенного микроба

Практическая ценность.

Депонированы в Государственной коллекции патогенных бактерий "Микроб" штаммы сибиреязвенного микроба КМ93 и КМ94, дефектные по секреции белка Sap Характерными особенностями штамма В anthracis КМ93 (В anthracis SterneATSap") являются нарушение выделения белка Sap в супер-натант, отсутствие плазмид токсинообразования и капсулопродукции Характерные особенности В anthracis КМ94 (В anthracis SterneATtp5Sap"Prt") - нарушение секреции белка Sap в супернатант, отсутствие плазмид токсинообразования и капсулопродукции, наличие маркеров антибиотикорезистентности (EmrLmr), низкая активностью протеолитических ферментов Штаммы предназначены для изучения влияния Sap" мутации на иммуногенность сибиреязвенного микроба

Среди бесплазмидных штаммов В anthracis селектированы эффективные доноры белка Sap - штаммы В anthracis SterneAT и В anthracis 2-ая вакцина Ценковского pf и получены их протеазодефицитные производные Продуценты со сниженной активностью протеолитических ферментов позволяют свести к минимуму возможные потери белка S-слоя в процессе его выделения и очистки

Предложен способ селекции штаммов сибиреязвенного микроба, продуцирующих белок S-слоя В его основу положены обнаруженные различия культурально-морфологических свойств Sap+ и Sap" изогенных вариантов. Использование признаков, для которых возможна прямая селекция, существенно ускоряет и удешевляет процедуру рутинного отбора, сводящегося только к скринингу белковых профилей культуральных фильтратов различных культур По материалам диссертации составлены методические рекомендации "Селекция штаммов сибиреязвенного микроба, продуцирующих белок Sap S-слоя", одобренные Ученым советом РосНИПЧИ "Микроб" (протокол Ученого совета РосНИПЧИ "Микроб" № б от 27 июня 2007 г ) и утвержденные директором РосНИПЧИ "Микроб"

Материалы диссертации используются в лекциях по генетике бакте-

рий на курсах специализации и повышения квалификации врачей и биологов по особо опасным инфекциям при РосНИПЧИ «Микроб»

Основные положения, выносимые на защиту:

1 Штаммы В anthracis различаются по способности к продукции одного из белков S-слоя - Sap

2 Эффективными донорами белка Sap являются бесплазмидные производные штаммов В anthracis Sterne 34F2 и В anthracis 2-ая вакцина Цен-ковского На их основе получены протеазонегативные продуценты

3. Бесплазмидный производный вакцинного штамма В anthracis СТИ-1 при культивировании in vitro характеризуется нарушением экскреции белка Sap

4 Белки, выделенные из культурального фильтрата штамма В anthracis SterneATPrt' и экстракта клеточных стенок В anthracis СТИДТ относятся к структурам S-слоя сибиреязвенного микроба - Sap и ЕА1, на основании их молекулярной массы, особенностей аминокислотного состава, паракри-сталлической ультраструктуры, иммунореактивности и локализации на поверхности клетки

5 Белки S-слоя возбудителя сибирской язвы обладают протек-тивным эффектом и являются дополнительными факторами иммуногенности при главенствующей роли протективного антигена Токсинопродуцирующий штамм, дефектный по секретируемому синтезу белка Sap, обладает индексом иммунитета в три раза меньшим по сравнению с Sap+ изогенным вариантом

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на 1 Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2004), IX Всероссийской научно-практическая конференции "Молодые ученые в медицине" (Казань, 2004), XX Российской конференции по электронной микроскопии (г. Черноголовка, 2004), а также на ежегодных научных конференциях РосНИПЧИ «Микроб» (Саратов, 2003,2004)

Публикации. Основное содержание работы отражено в 10 научных публикациях, из которых 4 статьи в рекомендованных ВАК изданиях

Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, списка принятых обозначений и сокращений, обзора литературы, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 33 отечественных и 174 зарубежных источников Общий объем диссертации составляет 137 страниц машинописного текста Текст иллюстрирован 5 таблицами и 17 рисунками

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Материалы и методы. В работе использовали вакцинные штаммы -В anthracis СТИ-1 (Государственный институт стандартизации и контроля им Тарасевича (ГИСК) им Л А Тарасевича, г Москва), 5 anthracis 55 (НИИ микробиологии МО РФ, г Киров), В anthracis Sterne34F2 (Государственная коллекция патогенных бактерий «Микроб»), тест-заражающий штамм В anthracis 2-я вакцина Ценковского (ГИСК им Л А Тарасевича), бесплазмидные производные штаммов В anthracis - В anthracis СТИЛТ, В anthracis 55ДТ/КМ92(2), В anthracis SterneAT, В anthracis 2-ая вакцина Ценковского pf (КМ58(1)), В anthracis 17JB pf (КМ57(1)), В anthracis 81/1 pf (КМЗЗ), В anthracis Pasteur pf (КМ59(1)) (ГКПБ «Микроб»), В anthracis Wright ДТ, В anthracis Ихтиман pf (получены в ходе настоящего исследования), штаммы-

продуценты белка Sap - В anthracis 2-ая вакцина Ценковского pf (71/12pfH2) + - + -

Sap Prt (KM88) и В anthracis Sterne ATHISap Prt (KM87), а также антибио-

тикорезистентные штаммы - SterneATSap Smrtkl0pXOlpAMBl, В anthracis

SterneATSap"Smrtk7pXO 1 pАМв 1, В anthracis CTHATpLTV3 TnP/7 (KM54(2)), В anthracis СТИ-lcRNl рАМв1 (KM70) (получены в ходе настоящего исследования)

В качестве питательных сред использовали бульон BHI ("Difco", США), L-бульон и агар ("Difco", США), бульон и агар Хоттингера, в которые при необходимости добавляли антибиотики эритромицин (0,1 мкг/мл и 1 мкг/мл), линкамицин (25 мкг/мл), тетрациклин (10 мкг/мл), стрептамицин (25 мкг/мл) Для выделения белков S слоя культуры выращивали на S-бульоне (FarchausJ et al, 1995) Определение протеолитической активности проводили на среде с казеином или альбумином (Микшис H с соавт, 1999) Для работы с бактериофагом CP51ts45 использовали питательный бульон (Nutrient broth, "Difco", США), среды для размножения, хранения и разведения фага (Thorne С et al, 1968) Реакцию иммунодиффузии ставили на диффузионном агаре (Фримель Г, 1987).

Антитела к белкам S-слоя выделяли из сывороток иммунизированных кроликов весом от 2,5 до 3 кг Эксперименты по определению иммуногенно-сти проводили на морских свинках весом от 300 до 350 г В работе использовались следующие методы Микробиологические, генетические и иммунологические методы Для микроскопического исследования клеток штаммов В anthracis суточную агаровую культуру засевали в BHI и инкубировали 3 часа с аэрацией при температуре 37 °С Определение протеолитической активности проводили после инкубации посевов при температуре 37 °С в течение 24 часов Регистрировали ширину зон просветления вокруг колоний

Для получения антител к белкам S-слоя применяли модифицированную схему J Farchaus et al (1995) Кроликов иммунизировали четырехкратно очищенными препаратами Sap или ЕА1 в дозе 100 мкг на инъекцию

Трансдукцию фагом CP51ts45 проводили в соответствии с методикой С Thorne et al (1968) Для получения инсерционных мутантов, опосредованных интеграцией Тп917 в хромосому В anthracis, использовали модифицированную методику Н И Микшис с соавт (2003) Конъюгационные скрещивания осуществляли на мембранных фильтрах по D Lereclusetal (1986) в модификации И В Брагина с соавт (1990) В экспериментах по элиминации резидентных плазмид из клеток В anthracis за основу были взяты методики Р Mikeselletal (1983) и В Greenetal (1985)

Подготовку споровой взвеси штаммов В anthracis и определение им-муногенности проводили в соответствии с регламентом производства № 83198 вакцины сибиреязвенной живой Морских свинок иммунизировали культурой штамма В anthracis или белковыми препаратами однократно, подкожно Через 21 день заражали тест-заражающим штаммом - 2ая вакцина Ценковско-го, в возрастающих дозах В течение 10 дней наблюдения отмечали павших животных и определяли ЛД50 по формуле Кербера. Индексы иммунитета определяли по формуле. ЛД50 заражающей культуры для иммунизированных / ЛД50 заражающей культуры для интактных лабораторных животных

Реакцию иммуноблота ставили в соответствии с модифицированным методом Towbin Н et al (1979) Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану Hybond-C (Amersham, США) проводили при силе тока 0,4 А и напряжении 100 V в течение 1,5 часов Кроличьи антитела к белкам S-слоя, а также меченые пероксидазой антитела диагностические против кроличьих иммуноглобулинов (Sigma, США) использовали в разведении 1:10000 Биохимические методы

Электрофоретическое разделение протеинов осуществляли в 10 % полиакриламидном геле в вертикальной камере (Amersham, США) при силе тока 50 мА в течение 5 часов Для определения молекулярной массы белков применяли коммерческие маркеры молекулярных масс (Sigma, США) ß-галактозидаза - 116,0 кДа, фосфорилаза b - 97,0 кДа, бычий сывороточный альбумин - 66,0 кДа; овальбумин - 45,0 кДа, карбоангидраза эритроцитов быка-29,0 кДа

Хроматографическую очистку Sap осуществляли в соответствии с рекомендациями J Farchaus et al (1995) с использованием различных носителей - сефарозы CL-4B, Macro Prep 50Q и гидроксиапатита Белок ЕА1 экстрагировали из клеточных стенок с помощью SDS-буфера. Для получения очищенного препарата ЕА1 использовали двухэтапную ионно-обменную хроматографию на гидроксиапатите

Аминокислотный состав определяли по методике S Moore, W Stein (Практическая химия белка, 1989) на базе института биохимии и физиологии

растений и микроорганизмов АН России (г Саратов)

Биофизические методы

Для электронной микроскопии препараты белков S-слоя предварительно дважды диализовали, препараты окрашивали 1,5 % раствором фосфор-но-вольфрамовой кислоты или 2 % раствором уранил-ацетата. Ультратонкие срезы контрастировали насыщенным спиртовым раствором уранилацетата при температуре 56 °С в течение 10 минут Подготовку препаратов для иммуно-электронной микроскопии проводили согласно процедуре, описанной J Farchaus et al (1995), с собственными модификациями Все препараты просматривали на электронном микроскопе JEM-7A (Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ Мечение антител коллоидным золотом для иммуноэлек-тронной микроскопии проводили по методике JI А Дыкмана (1996). Регулярность ультраструктуры полученных протеинов подтверждали сканирующей атомно-силовой микроскопией (Коннов H П с соавт, 2002)

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Большинство исследований S-слоя возбудителя сибирской язвы проводилось на штамме В anthracis Sterne 34F2 - зарубежной ветеринарной вакцине, или его производных Ввиду данного обстоятельства, первоочередной задачей настоящего исследования оказалось изучение способности к продукции Sap широкого круга сибиреязвенных штаммов Особый интерес представляли отечественные вакцинные штаммы, в частности В anthracis СТИ-1, не охарактеризованные по способностьи к синтезу протеинов S-слоя

На начальном этапе исследования нами было сделано предположение, что вакцинный штамм В anthracis СТИ-1 может быть дефектным по секрети-руемому синтезу белка Sap на основании присущих ему особенностей роста на питательных средах и формированию необычно длинных клеточных цепочек. Мы основывались на наблюдениях I Etienne-Toumelin et al (1995) и S Mesnage et al (1997) об отличии сконструированных ими мутантов, дефектных по синтезу белка Sap, от исходных культур Мутантные клетки Sap" штаммов образовывали более крупные колонии, при росте в бульоне оседали на дно в виде плохо разбивающихся конгломератов - "комочков ваты", а их клеточные цепочки превышали обычную длину в 20 и более раз

Для подтверждения данного предположения осуществили сравнение белковых профилей концентрированных культуральных фильтратов штаммов В anthracis СТИ-1 и В anthracis Sterne34F2 и их бесплазмидных производных В культуральных фильтратах В anthracis СТИ-1 и В anthracis СТИАТ, белок с электрофоретической подвижностью, соответствующей молекулярной массе 94 кДа, обнаружен не был Электронная микроскопия ультратонких срезов

микробных клеток тестируемых штаммов В anthracis Sterne 34F2, и В anthracis СТИ-1 частично подтвердила полученные данные Поверхностный слой у клеток штамма В anthracis Sterne 34F2 визуально выглядел более мощным, чем у В anthracis СТИ-1, однако объективные доказательства наличия или отсутствия антигена Sap могут быть получены только с помощью имму-номикроскопических методов, для которых необходимо наличие очищенного антигена и специифических антител

Исходя из предположения о существовании культур сибиреязвенного микроба, утративших в природных условиях или в процессе лабораторного культивирования способность к секретируемому синтезу одного из белков S-слоя, мы расширили круг исследования и провели электрофоретический анализ концентрированных культуральных фильтратов полученных в различное время бесплазмидных штаммов Существовало несколько причин для выбора в качестве модели бесплазмидных культур С одной стороны, лишенные плаз-мид производные не синтезируют целый спектр белков, детерминируемых генами плазмидной локализации С другой стороны, штаммы с элиминированным репликоном pXOl по данным Т Mignot et al (2003) продуцируют в 20 или 10 раз больше белка Sap, ввиду отсутствия у них регуляторных областей -atxA и pagR, продукты которых помимо всего прочего осуществляют и репрессию гена sap

Электрофоретический анализ концентрированных культуральных фильтратов бесплазмидных производных вакцинных штаммов В anthracis 2" вакцина Ценковского, Pasteur, Wright, 17JB, Ихтиман, 55, Sterne 34F2 и СТИ-1, а также природного штамма В anthracis 81/1, показал, что высокая продукция в среду культивирования белка S-слоя присуща далеко не всем бесплазмид-ным штаммам (рис 1)

Данный антиген активно продуцировали В anthracis SterneAT, 55АТ, 2Ш вакцина Ценковского pf и в меньшей степени В anthracis Wright AT Штаммы В anthracis Pasteur pf, 81/1 pf, 17JB pf, Ихтиман pf и СТИДТ такой способностью не обладали Вероятно, способность к секретируемому синтезу одного m белков S-слоя была утрачена ими в результате температурной элиминации плазмид или в процессе лабораторного культивирования

Исходя из экспериментальных данных, бесплазмидные штаммы В anthracis SterneAT, 55АТ и 2м вакцина Ценковского pf могли бы являться донорами белка Sap Однако, учитывая, что белок S-слоя - Sap быстро деградирует под воздействием протеолитических ферментов (Farchaus J et al, 1995), мы посчитали необходимым предпринять эксперименты по селекции протеа-зонегативных клонов

1234 5 678 9 10

I К 15Ш.. : - ■ ■ ■ JiB 4.: w

Рисунок 1. Элск'грофоpeграммы культуральных фильтратов б ее плаз-мидных штаммов В. anthracis. 1 - маркеры молекулярных масс (] 16,0; 97,0; 66,0; 45,0 кДа); концентрированные культу рал ьные фильтраты бесплазмидных штаммов: 2 - В, anthracis Ихтиман pf; 3 - В. anthracis Wright AT; 4 - В. anthracis СТИДТ; 5 -В. anthracis 2a:1 вакцина Денковского pf; 6 - В. anthracis Pasteur pf; 7 - В. anthracis 55ДТ; 8 - В. anthracis SterneAT; 9 - В. anthracis 17JB pf; 10 - B. anthracis 81/1 pf.

Исследование протеолитической активности проводили на полусинтетической казеиновой среде, затем культур ал ьные фильтраты изолированных клонов подвергали электрофоретическому анализу. На основании сравнения электрофоретических профилей концентрированных культуральных фильтратов штаммов с высокой и низкой протеолитической активностью, осуществленного после их хранения при температуре 4 °С в течение месяца, показано преимущество последних в качестве доноров белка S-слоя, выходящего в супер натант.

В результате клонального анализа были получены стабильные Prf производные В. anthracis SterneAT и 2м вакцина Ценковского pf, депонированные в Государственной коллекции патогенных бактерий "Микроб" под номерами КМ87 и КМ88, соответственно. Данные штаммы могут быть использованы как эффективные источники экскретируемого белка S-слоя - Sap, ввиду

их низкой протеолиткческой активности, приводящей к деградации белка на этапах выделения и очистки.

Итак, мы предположили, что протеин с молекулярной массой 94 кДа, обнаруживаемый в культуральных фильтратах штаммов В. anlhracis, является белком Sap. Тем не менее, для идентификации его в качестве структуры S-слоя предстояло получить протеин в очищенном виде, после чего установить его паракристаллическую структуру, выявить характерные особенности аминокислотного состава и подтвердить локализацию иа поверхности клетки.

Известно, что белки S-слоя возбудителя сибирской язвы, Sap и ЕА1, имеют одинаковую молекулярную массу, но их аминокислотные последовательности отличаются (Mesnage S. et al., 1997). То обстоятельство, что белок EA'l прочно связан с клеточной стенкой, a Sap при культивировании in Vitro на определенной стадии выделяется в супернатапт, определило различную стратегию выделения компонентов S-слоя сибиреязвенного микроба. В качестве доноров белка Sap использовали полученные и охарактеризованные ранее проте аз о негативные бесплазмидные производные: В, anthracis SterneATPrt" или В. anthracis 2-ая вакцина Цеиковского pfPrt", Выделение и очистку белка S-слоя, продуцируемого штаммами ß. anthracis в среду культивирования, осуществляли в соответствии с методикой, предложенной J. Farchaus et al. (1995). Данный способ включает три ступени хроматографической очистки с использованием различных носителей - сефарозы CL-4B, Macro Prep 50Q и гидроксиап атита.

1 2 34 56789

—I Яй* 4_Jbiwf '!__' ^J —Г

Рисунок 2. Результаты хроматографа ческой очистки белка с молекулярной массой 94 кДа, выделенного из культур ал ьного филмрата штамма В.

anthracis Sterne ATPrt" Треки 1 - культуральный фильтрат В anthracis Sterne ATPrt"; 2 - этап очистки на сефарозе CL-4B, 3, 4 - этап очистки на колонке с Macro Prep 50Q, 5 - 8 - этап хроматографии на колонке с гидроксиапатитом (линейный градиент фосфата калия), 9 - маркеры молекулярных масс (116,0, 97,0, 66,0,45,0,29,0 кДа)

Постепенное освобождение от белков с молекулярной массой, отличной от значения, характерного для Sap, контролировали электрофоретически По результатам электрофоретического анализа полученный после третьего этапа хроматографии препарат содержал исключительно белок с молекулярной массой 94 кДа Отмечено, что выход данного протеина на колонке с гидроксиапатитом происходил при низких значениях молярности фосфата калия (0,1 - 0,2 моль) В результате нескольких серий очистки культуральных фильтратов штаммов В anthracis SterneATPrt' и В anthracis 2-ая вакцина Ценковско-го pfPrt" было получено 60 мл белкового препарата с концентрацией 1,0 - 1,4 мг/мл

Для выделения белка ЕА1, являющегося постоянным компонентом клеток возбудителя сибирской язвы, использовали штамм В anthracis СТИАТ, полученный на основе самой распространенной в России живой вакцины К тому же, данный штамм характеризуется низкой активностью протеолитиче-ских ферментов (Микшис H И с соавт, 1999) Экстрагирование белков из клеточных стенок проводили с помощью SDS-буфера Для разделения белков использовали ионно-обменную хроматографию на колонке с гидроксилапати-титом Создавали ступенчатый градиент фосфата калия с шагом в 0,05 моль Фракции, соответствующие пикам поглощения, собирали и диализовали Образцы исследовали на электрофоретическую подвижность белков в полиакри-ламидном геле Выход белка с молекулярной массой 94 кДа отмечали при низких значениях молярности фосфата калия - от 0,05 до 0,1 моль Создание ступенчатого градиента фосфата калия позволило получить довольно большой объем данного образца - около 60 мл, с общей концентрацией по белку 1,2 мг/мл Тем не менее, судя по результатам электрофореза в полиакриламидном геле, с помощью одного этапа ионно-обменной хроматографии добиться максимальной чистоты интересующего нас протеина довольно трудно В связи с этим, возникла необходимость введения дополнительного этапа, направленного на улучшение качества белкового препарата

В качестве второй ступени очистки использовали хроматографию с применением различных носителей Macro Prep 50Q или гидроксиапатита Одну часть диализованного образца, соответствующего значению градиента фосфата калия - 0,1 моль, порционно наносили на колонку с Macro Prep 50Q Другая часть этого же препарата подвергалась вторичной очистке на гидро-ксиапатите В первом случае отмечали значительное снижение концентрации искомого белка, при появлении 80 кДа формы протеина и сохранении сопут-

ствующих примесей. При вторичной очистке на гидроксиапатите выход белка с электрофоретич ее кой подвижностью, характерной для белка Sap был достаточно эффективным и регистрировался во время прохождения через колонку 0,15 - 0,2 молярного раствора фосфата калия.

1 2 3 4 5 1344i

94 кДа

с» I

Рисунок 3. Электрофор с грамм а препаратов белков, полученнывх в результате хромато графической очистки SDS-экстракта клеток В. anthracis СТИДТ. 1 - SDS-экстракт клеток штамма В. anthracis СТИДТ; 2-Ю -препараты, полученные на этапах очистки SDS-экстракта на колонке с гидро-ксиаиатигитом (молярности фосфата калия от 0,05 до 0,4 моль): 2,3 - 0,05 моль; 4 - ОД моль; 11 - маркеры молекулярных масс; 12 — белковый препарат после первого этапа очистки на гидроксиапатите (элюция 0,1 молярным КФБ); 13 —после второго этапа очистки на Macro Prep 50Q; 14 - после второго этапа очистки на гидроксиапатите.

В результате предложенной схемы двухэтапной ионно-обменной хроматографии с использованием в качестве носителя гидроксиапатита было получено несколько серий в ы сок оо чище иного препарата с концентрацией белка 0,8 - 1,2 мг/мл общим объемом 100 мл.

Принадлежность выделенных протеинов к структурам S-слоя определяли с помощью биохимических, иммунохимических и физико-химических методов исследования. Одним из отличительных свойств S-слоев микроорганизмов является их упорядоченная паракристаллическая структура (Северина Л. О., 1995; SleytrU-, MessnerP., 1988; SleytrU., 1997).

Ультраструктуру белковых препаратов, полученных из культуралыю-

го фильтрата штамма В. агнИгааз ЭГетеЛТРп;" и клеточного 5В8-экстракта штамма В. атЬгаЫз СТИДТ исследовали на электронном микроскопе. Перед микроскопией осуществляли дополнительную подготовку очищенных белков с помощью двухэтапного диализа в калий-фосфатном и ацетатном буферах

В результате удалось выявить характерную для 5-елоя структуру (рис. 4). На представленных электронограммах отчетливо видна так называемая пар акр металлическая решетка с упорядоченным расположением цилиндрических пор. Диаметр пор составил 9 им, что соответствует установленным ранее значениям для белков Б-слоя возбудителя сибирской язвы (Е^еппе-ТоитеНп I, еХ а]., 1995; Mes]lage 3. е! а1., 1998). Кроме того, регулярность ультраструктуры полученных нами протеинов была подтверждены также данными сканирующей атом но-сило в ой электронной микроскопии, позволяющей получать трехмерные изображения поверхности неконтрастированных биологических объектов с нанометровым разрешением.

Рисунок 4. Электронно-микроскопическая картина ультраструктуры белкового препарата, полученного из культурального фильтрата штамма В. ашИгасгз 5(етеДТРг1Г (А - увеличение х 200 ООО) и препарата, полученного из ЗОЭ-экстракта клеточных стенок штамма В. аЫЬгаш СТИДТ (Б - увеличение х 150000).

Белкам Б-слоя возбудителя сибирской язвы, также как и других микроорганизмов, присущи характерные особенности аминокислотного состава значительное количество (40 - 60 %) неполярных, равные доли (приблизительно по 15 %) кислых и основных, отсутствие или наличие долей процента се-русодесодержащих аминокислот (метионина и цистеина) (РагсИаш 1, 1995, МеБпа§е Б й а1, 1997) Полученные нами оригинальные результаты не противоречили общеустановленным закономерностям Аминокислотный анализ белка, полученного из культурального фильтрата штамма В атНгаск 81егпеАТРгГ, выявил содержание неполярных аминокислот равное 53,5 %, кислых - 16,3 % и основных - 20 % Для белка, экстрагированного из клеточных стенок штамма В аыкгаск СТИДТ содержание неполярных аминокислот соответствовало 43,3 %, кислых - 17,3 % и основных - 18,8 % Метионин и цистеин в обоих препаратах обнаружены не были Можно только отметить небольшое превышение (на 1 - 2 %) содержания в протеинах аминокислот, относящихся к группам кислых и основных По остальным позициям оригинальные значения очень близки к цифрам, установленным ранее различными авторами для белков Б-слоя

Локализацию выделенных белков на поверхности клеток подтверждали иммуноэлектронной микроскопией со специфичными мечеными антителами Кроликов иммунизировали четырехкратно очищенными белковыми препаратами Бар и ЕА1 Из кроличьих сывороток получали специфические иммуноглобулины и конъюгировали их с частицами коллоидного золота. Для им-муномикроскопии использовали клеточные образцы штаммов В ашИгасм 81егпеДТ и В аткгаыь СТИДТ Предварительно блокировали неспецифические рецепторы бычьим сывороточным альбумином, а часть специфических рецепторов - разведенными антителами к белкам Б-слоя После чего осуществляли непосредственно иммуносорбцию, инкубируя с мечеными коллоидным золотом специфическими кроличьими антителами Препараты просматривали при помощи электронного микроскопа

Электронно-микроскопическое исследование штаммов сибиреязвенного микроба с мечеными антителами к выделенным белкам Б-слоя показало поверхностное расположение обоих антигенов После специфического взаимодействия с мечеными антителами к белку, выделенному из БОБ-экстрактов, клетки штаммов В апЛгаыБ СТИДТ и В аЫкгаш 81егпеДТ были почти сплошь покрыты непроницаемой для электронов меткой Отдельные частицы коллоидного золота располагались по периферии клеток и в межклеточном пространстве (рис 5А) Причем было отмечено, что взаимодействие анти-ЕА1 антител с поверхностным антигеном более выражено у штамма В апЛгаыв СТИДТ Это может быть связано с особенностями Б-слоя данного штамма, дефектного по синтезу Бар и образованного белком ЕА1 В случае использования меченых антител к белку, выделенному из культурального фильтрата,

электронно-микроскопические картины штаммов В. иткгааз СТИДТ и В. атЪгаЫь 51егпеДТ отличались (рис. 5Б). На поверхности клеток В. йпфгд&'х СТИДТ, в отличие от В, аШНгаск 5 Гете Д'Г, не было выраженной специфической сорбции анти-8ар антител.

Рисунок 5. Результаты иммуноэяекгрошкж микроскопии клеток штаммов В. аупЬгаслх 31егоеАТ (А - увеличение х 10 ООО) и В, аШИгаШ СТИДТ (Б - увеличение х 15 ООО), обработанных мечеными антителами к белку с молекулярной массой 94 кДа, выделенному из ЬВЙ-экстракта штамма В. ап-Шгаеа СТИДТ.

Для подтверждения иммунореактивности выделенных белковых препаратов была проведена реакция иммуноблота со специфическими кроличьими антителами. Положительную реакцию взаимодействия со специфичными антителами регистрировали у препаратов, содержащих концентрированный Культуральный фильтрат штамма В. аЫЬгаш 51еше34Р2 и белок, выделенный из культураяъного фильтрата штамма В. атНгас^я Й^тпеДТРл". С препаратом, полученным из супернатанта штамма В, апйггаслз СТИДТ, образования окрашенных иммунных комплексов не отмечалось, что также подтверждает предположение О дефектности данного вакцинного штамма по продукции одного из белков Б-елоя.

Таким образом, выделенные из культурального фильтрата штаммов В. ап(кгасЫ 51егпеДТРгТ и экстрактов клеточных стенок В. амкгаЫх СТИДТ вы-

сокоочшценные белковые препараты по молекулярной массе, формируемым ультраструктурам, аминокислотному составу и расположению на поверхности клеток являются компонентами S-слоя сибиреязвенного микроба, белками Sap и ЕА1, соответственно На основании изучения клеточной морфологии, элек-трофоретического анализа культуральных фильтратов, данных иммуноэлек-тронной микроскопии и иммуноблота установлено, что штамм В anthraas СТИДТ является дефектным по секретируемому синтезу белка Sap

Следующий раздел нашей работы посвящен характеристике иммуно-генных свойств белков S-слоя возбудителя сибирской язвы В настоящее время применение белков S-слоя в конструировании новых профилактических препаратов основано лишь на их иммуномодулирующем действии (Baillie L et al, 2003) или на использовании детерминирующих их генов в качестве "дисплейной" системы для продукции экзогенных токсинов (Mesnage S et al, 1999) Для определения перспектив использования белков S-слоя сибиреязвенного микроба в качестве возможного компонента химических вакцин, были осуществлены эксперименты по оценке их иммунологической эффективности Исследование иммуногенности белков S-слоя проводили на модели морских свинок Очищенные препараты Sap и ЕА1 вводили лабораторным животным двукратно в дозах 25 и 50 мкг Для сравнения 3-ю группу иммунизировали вакцинным штаммом В anthracis Sterne 34F2, содержащим в составе генома репликон pXOl, детерминирующий синтез протективного антигена Штамм В anthracis Sterne 34F2 вводили однократно в дозе 1 х 106 КОЕ, и еще одну (контрольную) группу морских свинок оставляли неиммунизированной.

Через 21 день иммунизированных и контрольных морских свинок заражали штаммом В anthracis 2м вакцина Ценковского в возрастающих дозах 1 102 - 1 107 КОЕ По окончании срока наблюдения определяли величину ЛД50 тест-штамма, а затем индексы иммунитета Иммуногенность белков S-слоя была почти на три порядка ниже иммуногенности вакцинного штамма Тем не менее, необходимо отметить, что даже в условиях отсутствия основного иммуногена сибиреязвенного микроба - протективного антигена, белки Sap и ЕА1 обеспечивали некоторую защиту лабораторных животных Соотношение индексов иммунитета Sap и ЕА1 в данном эксперименте свидетельствует о приоритете (на порядок выше) белка Sap (Табл 1)

Таблица 1 Иммуногенность белков S-слоя В anthracis

Иммунизирующий белок (штамм В anthracis) Величина ЛД50 заражающей культуры Индекс иммунитета

Sap 2,5 104 36,8

ЕА1 2,2 10J 3,2

В anthracis Sterne34F2 1,8 10" 2,6 10J

интактные животные 6,8 10^

Кроме изучения протективных свойств белков S-слоя, нас интересовал также их вклад в обеспечении иммуногенности токсинопродуцирующих штаммов Для того, чтобы ответить не вопрос - могут ли различия в продукции протеинов S-слоя влиять на иммуногенность штаммов, полноценно синтезирующих протективный антиген'' - необходимо наличие изогенной системы штаммов, секретирующих и несекретирующих белок S-слоя Это послужило основанием экспериментов по получению штаммов, дефектных по секрети-руемому синтезу Sap

Ранее было отмечено, что штаммы, не продуцирующие данный белок, отличаются по характеру роста на питательных средах и длине клеточных цепочек Эти особенности были положены в основу первоначального отбора спонтанных и инсерционных (Тп917) Sap" мутантов Использование признаков, для которых возможна прямая селекция, существенно ускорило процедуру отбора Кроме того, увеличения частоты возниковения Sap" мутантов удалось добиться за счет воспроизведения в эксперименте условий температурной элиминации плазмид. Дефектность по секреции Sap подтверждали данными белкового электрофореза, иммуноблота и иммуноэлектронной микроскопии с кроличьими знти-Sap антителами, мечеными коллоидным золотом Стабильность полученного признака была подтверждена многочисленными пересевами на питательных средах

В результате было получено несколько клонов спонтанных В

anthracis SterneATSap и транспозонных В anthracis StemeATtp5Sap Prt мутантов которые были депонированы в ГКПБ "Микроб" под номером КМ93 и КМ94 Данные штаммы предполагалось использовать в экспериментах по изучения влияния Sap' мутации на иммуногенность сибиреязвенного микроба Кроме того, на наш взгляд, полученные бесплазмидные штаммы, не продуцирующие Sap, могли бы послужить и в качестве основ для генетического конструирования бациллярных продуцентов биологически-значимых антигенов, например, протективного антигена

Сравнение протективных свойств бесплазмидных производных, продуцирующих и не продуцирующих в супернатант белок Sap, возможно только после введения в них детерминантов иммуногенности в составе плазмиды pXOl или в виде генно-инженерных конструкций. Для генетического переноса высокомолекулярного репликона pXOl мы использовали метод конъюгации После отработки параметров конъюгационной передачи генетического материала осуществили мобилизацию на перенос репликона pXOl из штамма В anthracis СТИ-1рАМ|31(рХ01+) в штаммы В anthracis SteraeATSmr(Sap+) и В anthracis SterneATSmr(Sap")

Определение иммуногенности сконструированных штаммов В anthracis StemeATSap"Smrtk7pX01pAMpi и В anthracis SterneATSap+Smrtkl()pX01pAMpi проводили на морских свинках Морских

свинок иммунизировали однократно споровыми взвесями трансконъюган-тов, продуцирующих или не продуцирующих белок Sap, в концентрации 1 х 10б КОЕ Через 21 день иммунизированных и контрольных животных заражали культурой В anthracis 2м вакцина Ценковского в возрастающих дозах. В результате индекс иммунитета Sap' мутанта оказался в 3 раза меньше индекса иммунитета исходного Sap+ варианта (Табл 2) Следовательно, Sap" мутация приводит к снижению протективных свойств моноплазмидных ток-синпродуцирующих штаммов сибиреязвенного микроба

Таблица 2 - Иммуногенность Sap+ и Sap" штаммов В anthracis

Иммунизирующий штамм В anthracis Величина ЛД50 заражающей культуры Индекс иммунитета

В anthracis SterneATSap" tkpXOl 5,6 х 105 8,2 х 102

В anthracis SterneATSap+ tk pXOl 1,8 х 10" 2,6 х 10"

интактные животные 6,8 х 10z

Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что штаммы В anthracis различаются по способности к продукции белка S-слоя - Sap Селектированы эффективные штаммы-продуценты белка Sap и получены их протеазонегативные варианты Из культурального фильтрата штамма В anthracis SterneATPrt" и экстракта клеточных стенок штамма В anthracis СТИДТ выделены белки Sap и ЕА1, осуществлена их хромотогра-фическая очистка Высокоочищенные белковые препараты идентифицированы в качестве сруктур S-слоя сибиреязвенного микроба по совокупности признаков молекулярной массе, ультраструктуре, аминокислотному составу и локализации на поверхности клетки С помощью сконструированной изогенной система Sap+ и Sap" штаммов получены экспериментальные доказательства участия белков S-слоя в обеспечении иммуногенности токсин-продуцирующих штаммов В anthracis На основании изучения протективных свойств показано, что белки Sap и ЕА1 являются дополнительными иммуногенными факторами В anthracis при определяющей роли протектив-ного антигена.

ВЫВОДЫ

1 На модели бесплазмидных производных аттенуированных штаммов и природных изолятов В anthracis показано различие сибиреязвенных культур по способности к продукции белка S-слоя - Sap Получены экспериментальные доказательства дефектности вакцинного штамма В anthracis СТИ-1 по секретируемому синтезу белка Sap

2 Среди штаммов сибиреязвенного микроба селектированы эффективные доноры белка Sap - В anthracis Sterne 34F2 и В anthracis 2-ая вакцина Ценковского На их основе получены продуценты, отличающиеся низкой активностью протеолитических ферментов - В anthracis SterneATPrt' и 2м вакцина Ценковского pf Prt\

3 Достигнута высокая степень очистки препаратов белков S-слоя, выделенных из культурального фильтрата и экстракта клеточных стенок штаммов В anthracis SterneATPrt' и В anthracis СТИАТ

4 Выделенные белки идентифицированы как компоненты S-слоя сибиреязвенного микроба по совокупности признаков молекулярной массе, ультраструктуре препаратов, аминокислотному составу и локализации на поверхности клетки

5. Получены стабильные спонтанные и транспозонные мутанты штамма В anthracis SterneAT, дефектные по синтезу белка S-слоя Sap Показано, что условия температурной элиминации плазмид способствуют возникновению спонтанных Sap" мутаций Предложен способ селекции Sap+ и Sap' клонов, основанный на выявленных особенностях их культурально-морфологических свойств характере роста на питательных средах и длине клеточных цепочек

6 Сконструирована изогенная система Sap+ и Sap' штаммов В anthracis С ее помощью получены экспериментальные доказательства участия белков S-слоя в обеспечении иммуногенности В anthracis Штамм, дефектный по экскреции белка Sap, обладает индексом иммунитета в три раза ниже по сравнению с Sap+ изогенным вариантом

7 Белки Sap и ЕА1 являются дополнительными иммуногенны-ми факторами сибиреязвенного микроба при определяющей роли протектив-ного антигена на основании сравнения протективных свойств очищенных препаратов белков S-слоя, Sap+ и Sap- изогенных вариантов и токсинопродуци-рующего штамма В anthracis Steme34F2

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Микшис H И , Корсакова А Ю, Болотникова M Ф , Попов Ю А , Кон-нов H П , Киреев M H , Дроздов И Г Продукция белков S-слоя штаммами Bacillus anthracis II Биотехнология - 2004 - № 5 - С. 22 - 32

2 Корсакова А Ю , Микшис H И , Попов Ю А, Коннов H П , Киреев

М Н, Подборонова Н В , Полунина Т А Выделение белков S-слоя сибиреязвенного микроба // Проблемы особо опасных инфекций - 2004 - Вып 1 (87) -С 48 - 50

3 Корсакова А Ю ,Микшис Н И , Попов Ю А, Коннов Н П Иммуно-электронная микроскопия для характеристики белков S-слоя Bacillus anthracis II Матер XX Российской конференции по электронной микроскопии - Черноголовка, 2004 - С 238

4 Корсакова А Ю ,Микшис Н И , Попов Ю А , Коннов Н П Электронно-микроскопическое исследование белков S-слоя сибиреязвенного микроба // Матер XX Российской конференции по электронной микроскопии - Черноголовка, 2004 -С 239

5 Корсакова А Ю ,Микшис Н И, Попов Ю А Характеристика белков S-слоя возбудителя сибирской язвы // Молодые ученые в медицине Матер IX Всероссийской научно-практической конференции - Казань, 2004 - С 130

6. Микшис Н И, Корсакова А Ю, Болотникова М Ф, Новикова Л В , Попов Ю А Иммуногенность белков S-слоя Bacillus anthracis II Молекулярная медицина и биобезопасность Матер 1 Междунар конф - Москва, 2004 -С 130-131.

7. Коннов Н П, Волков Ю П, Корсакова А Ю , Данилова Т В , Микшис Н И , Мантуров А О , Кузнецов О.С , Попов Ю А , Киреев М Н Трансмиссионная электронная и сканирующая силовая микроскопия белков S-слоя сибиреязвенного микроба // Проблемы особо опасных инфекций - 2004 - Вып 88 -С 34-36

8 Попов Ю А, Микшис Н И, Корсакова А Ю, Кудрявцева О М, Болотникова М Ф , Новикова Л В , Шулепов Д В , Киреев М Н, Коннов Н П, Щу-ковская Т Н, Фирстова В В , Брандзишевский Ю В , Полунина Т А Конструирование рекомбинантных штаммов Bacillus anthracis для создания нового поколения высокоэффективных сибиреязвенных вакцин // Методические документы по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации - Саратов, 2005 - С 41

9. Микшис Н И, Корсакова А Ю , Болотникова М Ф , Новикова Л В , Попов Ю А Роль компонентов S-слоя в иммуногенности возбудителя сибирской язвы И Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии -2006 - № 1 - С 29 -32

10 Попов Ю А , Микшис Н И, Кудрявцева О М , Корсакова А Ю , Шулепов Д В , Болотникова М Ф , Новикова Л В , Щуковская Т Н, Киреев М Н , Брандзишевский Ю.В, Коннов Н П Конструирование рекомбинантных штаммов Bacillus anthracis для создания нового поколения высокоэффективных сибиреязвенных вакцин // Методические документы и отчеты по санитар-но-эпидемио-логической охране территории Российской Федерации - Саратов, 2006 -С 51

Сдано в набор 14 09 07 г Подписано к печати 16 09 07 Формат 84x108 1/6. печать лазерная Бумага офсетная № 65 Гарнитура "Тайме" Объем 2,1 уел п л Тираж 100 экз