Биологическая характеристика протективного антигена, синтезируемого аспорогенным рекомбинантным штаммом Bacillus anthracis

Попова, Полина Юрьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биологическая характеристика протективного антигена, синтезируемого аспорогенным рекомбинантным штаммом Bacillus anthracis
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Биологическая характеристика протективного антигена, синтезируемого аспорогенным рекомбинантным штаммом Bacillus anthracis"

На правах рукописи

005043257

Попова Полина Юрьевна

БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОТЕКТИВНОГО АНТИГЕНА, СИНТЕЗИРУЕМОГО АСПОРОГЕННЫМ РЕКОМБИНАНТНЫМ ШТАММОМ

В A CILL US ANTHRA CIS

03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 7 МАП 2Q12

Саратов-2012

005043257

Работа выполнена в ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Бойко Андрей Виталиевич, доктор медицинских наук, доцент, ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспо-требнадзора, зав. отделом образовательных программ и подготовки специалистов

Замараев Валерий Семенович, доктор медицинских наук, профессор, ФКУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотреб-надзора, главный научный сотрудник лаборатории функциональной геномики

Ведущая организация: ФКУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Защита состоится 30 мая 2012 г. в 1300 часов на заседании совета Д 208.078.01. по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук при ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб». Автореферат разослан £ 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук

Микшис Наталья Ивановна

доктор биологических наук, старший научный сотрудник

А.А. Слудский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Сибирская язва - особо опасное инфекционное заболевание, поражающее людей и восприимчивых животных. Потенциальная возможность заражения человека вирулентными штаммами Bacillus ап-thracis поддерживается периодически возникающими эпизоотиями болезни, а также существованием множественных почвенных очагов сибиреязвенной инфекции на территории многих стран, в том числе Российской Федерации - более 43 тысяч (Черкасский Б.Л., 2002). Кроме того, В. anthracis отнесен к категории А агентов биотерроризма (Онищенко Г.Г. с соавт., 2006).

Патогенность возбудителя сибирской язвы обусловлена синтезом капсулы и экзотоксина (Mock M., Fouet А., 2001). Токсин В. anthracis состоит из трех компонентов: отечного фактора (ОФ), летального фактора (ЛФ) и протективно-го антигена (ПА). Участвуя в реализации вирулентных свойств, ПА в то же время является основным иммуногеном сибиреязвенного микроба.

Эффективной превентивной мерой в отношении сибирской язвы является вакцинация населения групп риска и сельскохозяйственных животных. В России для профилактики сибирской язвы у людей лицензированы две вакцины -сибиреязвенная живая сухая для накожного и скарификационного применения и сибиреязвенная комбинированная - жидкая и сухая для подкожного применения. Комбинированная вакцина состоит из клеток вакцинного штамма В. anthracis СТИ-1 и полученного из него препарата ПА (Пименов Е.В. с соавт., 2002). В США и Великобритании для вакцинопрофилактики людей с начала 50-х годов XX века производятся химические вакцины, основой которых является адсорбированный на гидроокиси алюминия ПА, выделенный из культу-ральных фильтратов некапсулообразующих сибиреязвенных штаммов. Однако получение иммуногенного антигена из природных или аттенуированных штаммов В. anthracis проблематично ввиду трудностей хроматографического разделения компонентов токсина, имеющих близкие значения молекулярных масс. Наличие в химических сибиреязвенных вакцинах ненормированных примесей ОФ и ЛФ приводит к возникновению, примерно в 20 % случаев, побочных эффектов различной степени выраженности (Centers for disease control and prevention, 2000).

Для вакцинации людей предпочтительнее использовать ПА, получаемый из генно-инженерных штаммов с клонированным геном pag, кодирующим его синтез. За рубежом разработаны эффективные генно-инженерные продуценты ПА (Baillie L. et al., 1998; Cohen S. et al., 2000; Chauhan V. et al., 2001). На основе синтезируемого ими иммуногенного белка разрабатываются усовершенствованные химические вакцины, некоторые из них в настоящее время проходят

клинические испытания (Campbell J. et al., 2007; Brown В. et al., 2010; www. clinicaltrials. gov).

В лаборатории прикладной генетики РосНИПЧИ «Микроб» был сконструирован аспорогенный штамм В. anthracis 55ATTlA-l(Spo"), содержащий гибридную плазмиду с клонированной детерминантой синтеза ПА (Микшис Н.И., 2009). Использование его в качестве продуцента ПА позволяет создать технологию получения иммуногенного сибиреязвенного антигена без микробной контаминации лабораторных и производственных помещений и оборудования. Всестороннего исследования влияния синтезируемого штаммом ПА на макроорганизм не проводилось.

При разработке прототипов химических сибиреязвенных вакцин следует также учитывать иммуностимулирующее действие отдельных клеточных компонентов, например, белков S-слоя В. anthracis (Ariel N. et al., 2003; Baillie L. et al., 2003; Гончарова А.Ю., 2007).

Все вышеизложенное определяет актуальность диссертационной работы, целью которой является оценка перспективности использования протективного антигена, синтезируемого генно-инженерным штаммом В. anthracis 55ДТПА-l(Spo"), в качестве основного компонента химических сибиреязвенных вакцин.

Задачи исследования:

1. Изучить стабильность характерных свойств аспорогенного штамма В. anthracis 55ATTIA-l(Spo"). Оптимизировать условия культивирования реком-бинантного продуцента для увеличения выхода протективного антигена сибиреязвенного микроба.

2. В экспериментах на лабораторных животных (кролики, морские свинки, мыши линии BALB/c) определить динамику титров специфических антител и индексы иммунитета для рекомбинантного протективного антигена, полученного из культурального фильтрата штамма В. anthracis 55ATTlAl(Spo"). Сравнить иммунизирующую активность рекомбинантного протективного антигена и вакцинного штамма В. anthracis СТИ-1.

3. При экспериментальной сибиреязвенной инфекции выявить иммуностимулирующее действие белка S-слоя В. anthracis - ЕА1. Исследовать влияние сибиреязвенных антигенов - рекомбинантного протективного антигена и ЕА1, на экспрессию толл-подобных рецепторов.

4. Оценить реактогенность и токсичность препаратов, содержащих рекомбинантный протективный антиген, в экспериментах in vivo и in vitro.

5. Определить компонентный состав прототипов химических сибиреязвенных вакцин, подобрать оптимальные дозы и схемы введения лабораторным животным.

Научная новизна исследования. Впервые установлено, что оптимизация условий культивирования аспорогенного рекомбинантного штамма В. anthracis 55AUIA-l(Spo") - добавление в бульон Хоттингера триптона в концентрации 20 мг/мл и сокращение продолжительности выращивания с 24 часов до 16 часов, приводит к увеличению в 5 раз выхода протективного антигена. В экспериментально подобранных условиях штамм В. anthracis 55ATTIA-l(Spo") синтезирует в 20 раз больше протективного антигена, чем вакцинный штамм В. anthracis США.

Впервые осуществлено сравнение иммунизирующей активности вакцинного штамма возбудителя сибирской язвы В. anthracis СТИ-1 и препарата протективного антигена, полученного из аспорогенного генно-инженерного продуцента В. anthracis 55ДТПА-1(Бро"). Установлено, что продукция анти-ПА антител при двукратном введении биомоделям рекомбинантного протективного антигена характеризуется более высокими титрами, с превышением значений до 30 раз - для линейных мышей и морских свинок, и до 20 раз - для кроликов. На модели кроликов максимальные титры анти-ПА антител регистрировались через 1 месяц после последней инъекции препарата рекомбинантного протективного антигена, у морских свинок и линейных мышей - через 2,5 и 2 месяца, соответственно.

Двукратная иммунизация биомоделей препаратом очищенного протективного антигена в сочетании с адъювантом обеспечивает защиту от заражения тест-штаммом В. anthracis 71/12, сопоставимую с протективностью живой сибиреязвенной вакцины В. anthracis СТИ-1. На модели мышей линии BALB/c значения ЛД50 тест-заражающего штамма для интактных и иммунизированных рекомбинантным протективным антигеном животных различались на два порядка, в экспериментах на морских свинках - на четыре порядка. Индексы иммунитета препарата рекомбинантного протективного антигена и вакцинного штамма В. anthracis СТИ-1 сопоставимы.

Впервые установлено, что добавление к рекомбинантному протективному антигену очищенного протеина S-слоя сибиреязвенного микроба - ЕА1, приводит к повышению в 2,5 раза индекса иммунитета на модели линейных мышей.

Препараты рекомбинантного протективного антигена и ЕА1 не токсичны и не оказывают повреждающего действия на тимоциты и спленоциты лабораторных животных. Введение линейным мышам сибиреязвенных антигенов, рекомбинантного протективного антигена и ЕА1, достоверно увеличивает экспрессию толл-подобных рецепторов 2 и 6 типа.

Впервые получены данные, свидетельствующие о перспективности использования препарата рекомбинантного протективного антигена для бустер-

ной иммунизации с целью уменьшения на порядок вводимой дозы живой сибиреязвенной вакцины.

Практическая значимость. По материалам диссертации составлены методические рекомендации: «Технологии выделения и очистки рекомбинантного протективного антигена и белка Б-слоя (ЕА1) сибиреязвенного микроба», одобренные Ученым советом РосНИПЧИ «Микроб» и утвержденные директором РосНИПЧИ «Микроб» (протокол Ученого совета РосНИПЧИ "Микроб" № 7 от 22.12.2011 г.); «Определение экспрессии генов То11-подобных рецепторов 2 и 4 клетками врожденного и адаптивного иммунитета у людей и экспериментальных животных», одобренные Ученым советом РосНИПЧИ «Микроб» и утвержденные директором РосНИПЧИ «Микроб» (протокол Ученого совета РосНИПЧИ "Микроб" № 7 от 16.12.2010 г.).

Материалы диссертации используются при чтении лекций на курсах первичной специализации и повышения квалификации врачей и биологов по особо опасным инфекциям при РосНИПЧИ «Микроб» и биотехнологическом факультете Саратовского государственного аграрного университета имени Н.И. Вавилова.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Аспорогенный рекомбинантный штамм В. ап&гаыз 55ДТПА1(8ро") синтезирует 640 мкг/мл протективного антигена при выращивании в течение 16 часов в жидкой питательной среде (бульон Хоттингера), содержащей триптон в концентрации 20 мг/мл. В оптимизированных условиях культивирования продукция протективного антигена генно-инженерным штаммом В. апЛгасю 55ДТПА-1(8ро") и вакцинным штаммом В. аМкгаыз СТИ-1 различается в 20 раз. Более высокая продукция протективного антигена рекомбинантным штаммом является следствием отсутствия негативного регулятора синтеза протективного антигена pagR и увеличения числа копий кодирующего гена ра% за счет мультикопийности векторной плазмиды.

2. Протективный антиген, синтезируемый аспорогенным генно-инженерным штаммом В. атИгайз 55ДТПА-1(8ро"), эффективно защищает лабораторных животных при экспериментальном моделировании сибиреязвенного инфекционного процесса. Показатели ЛД50 тест-заражающего штамма для морских свинок, двукратно иммунизированных дозой 25 мкг рекомбинантного протективного антигена в сочетании с адъювантом, и интактных особей, различаются на четыре порядка. Индексы иммунитета рекомбинантного протективного антигена при двукратной иммунизации морских свинок (дозой 25 мкг) и мышей линии ВАЬВ/с (дозой 10 мкг) сопоставимы с индексами иммунитета живой вакцины В. апЛгаси СТИ-1 для тех же биомоделей.

3. Препарат протективного антигена, полученный из аспорогенного продуцента В. апЛгасн 55АТПА-1(8ро"), индуцирует выраженное образование анти-ПА антител при двукратном подкожном введении кроликам, морским свинкам и мышам линии ВАЬВ/с. На протяжении всего срока наблюдения (до 4,5 месяцев) у биомоделей отмечается более высокий уровень синтеза специфических антител, чем при однократном введении споровой культуры вакцинного штамма В. аШкгасн СТИ-1.

4. В комбинированной схеме специфической профилактики сибиреязвенной инфекции, включающей однократную инъекцию споровой культуры штамма В. апАгаЫз СТИ-1 и последующее однократное введение рекомбинант-ного протективного антигена в сочетании с адъювантом, доза вакцинного штамма снижается на порядок (с 5 • 107 спор до 5 • 10б спор для морских свинок).

5. Очищенный препарат протективного антигена, выделенный из культурального фильтрата аспорогенного рекомбинантного штамма-продуцента В. ап&гаск 55ДТПА-1(8ро"), не обладает реактогенностью и токсичностью для линейных мышей и морских свинок. В тестируемой дозе 10 мкг он не оказывает повреждающего действия на тимоциты и спленоциты мышей линии ВАЬВ/с и не изменяет их пролиферативную активность. Введение лабораторным животным препаратов, содержащих рекомбинантный протективный антиген и белок Б-слоя сибиреязвенного микроба (ЕА1), приводит к достоверному усилению экспрессии толл-подобных рецепторов врожденного иммунитета 2 и 6 типов на клетках селезенки и тимуса.

Апробация работы. Материалы диссертации представлялись на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2008); научно-практических школах-конференциях молодых ученых и специалистов «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 2010, 2011); Международной конференции «Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями» (Санкт-Петербург, 2010); X Межгосударственной научно-практической конференции государств - участников СНГ «Актуальные проблемы предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения государств -участников СНГ» (Ставрополь, 2010); X съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов «Итоги и перспективы обеспечения эпидемиологического благополучия населения Российской Федерации» (Москва, 2012), а также на ежегодных научных конференциях РосНИПЧИ "Микроб" (Саратов, 2009-2012).

Работа выполнена в рамках плановой НИР "Конструирование современных средств специфической профилактики и иммунодиагностики сибирской язвы" (2009 - 2013 гг.), шифр 41-3-09; Федеральной целевой программы "Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации", темы: "Совершенствование специфической профилактики чумы, сибирской язвы и туляремии".

Публикации. Основное содержание работы отражено в 10 научных публикациях, из них - 4 статьи в рекомендованных ВАК изданиях.

Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, списка принятых обозначений и сокращений, обзора литературы, пяти глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 31 отечественный и 171 зарубежный источник. Общий объем диссертации составляет 140 страниц машинописного текста. Текст иллюстрирован 5 таблицами и 22 рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы. При проведении собственных исследований были использованы рекомбинантные штаммы В. anthracis 55ATTIA-l(Spo") (КМ97) и В. anthracis СТИДТПА-1 (КМ96) (Государственная коллекция патогенных бактерий (ГКПБ) «Микроб», г. Саратов); вакцинный штамм В. anthracis СТИ-1 и тест-заражающий штамм В. anthracis 71/12 (2-я вакцина Ценковского) (Государственный институт стандартизации и контроля им. JI.A. Тарасевича, г. Москва). В качестве питательных сред использовали бульон и агар Хоттингера, L-бульон и L-arap (Маниатис Т. с соавт., 1984), в которые при необходимости добавляли канамицин (25 мкг/мл), триптон (20 мг/мл). Для выделения ПА штаммы В. anthracis выращивали в бульоне Хоттингера с добавлением трипто-на и канамицина или среде, предложенной J. Farchaus et al. (1998). Способность штаммов В. anthracis продуцировать ПА тестировали на казаминовой среде С. Thorne and F. Belton (1957) с добавлением кроличьих анти-ПА антител. Определение протеолитической активности проводили на полусинтетической среде с казеином (Микшис Н.И. с соавт., 2010). В качестве биомоделей использовали линейных мышей BALB/c массой от 18 до 20 г, морских свинок массой от 250 до 300 г, кроликов массой от 2,5 до 3 кг.

Микробиологические методы. Протеолитическую активность и способность к продукции ПА штамма В. anthracis 55ATITA-l(Spo") определяли путем переноса изолированных колоний на специальные среды, содержащие, соответственно, казеин или кроличьи антитела к ПА (Кудрявцева О.М., 2007). Для выяснения способности к образованию спор культуру штамма В. anthracis прогревали при температуре 65 °С в течение 30 минут с последующим высевом на

агар Хоттингера. Для получения споровых взвесей сибиреязвенные культуры выращивали на агаре Хоттингера до 7 суток, клеточную массу смывали стерильной дистиллированной водой, прогревали при температуре 65 °С в течение 30 минут и дважды отмывали стерильной дистиллированной водой. Концентрацию спор определяли путем высевов из последовательных десятикратных разведений исходной культуры, подсчет числа выросших колоний проводили после 24 часов инкубации при 37 °С. Для получения ПА выращивание аспоро-генного штамма В. anthracis 55ATIIA-l(Spo") проводили в жидкой питательной среде при температуре 37 °С с аэрацией в течение 16 часов. После периода инкубации добавляли ингибиторы протеаз. Клеточную массу осаждали центрифугированием в течение 30 минут при 7000 об/мин и температуре 4 °С. Суперна-тант, содержащий ПА, стерилизовали, пропуская через мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм (Millipore, США). Стабильность рекомбинантного штамма оценивали по стандартным методикам в модификациях J. Barnard, А. Friedlander (1999) и S. Cohen et al. (2000).

Биохимические методы. ПА выделяли из культурального фильтрата рекомбинантного штамма В. anthracis 55ATTIA-l(Spo"). Очистку ПА проводили на хроматографической системе BioLogic Duo Flou™ (BioRad, США) с использованием MacroPrep 50Q и Sephaciyl-HR300 (Bio-Rad, США) в качестве носителей. Белок ЕА1 экстрагировали из клеточных стенок штамма В. anthracis СТИ-1, очищали двухэтапной ионно-обменной хроматографией на колонке с гидроксиапатитом (Bio-Rad, США). Электрофоретическое разделение протеинов осуществляли в 10 % полиакриламидном геле (SDS-ПААГ) в вертикальной камере (Amersham, США) в соответствии с инструкцией производителя.

Иммунохимические методы. Титр антител к ПА и белку ЕА1 в сыворотках иммунизированных животных и количественную оценку уровня продукции ПА штаммами В. anthracis определяли с помощью твердофазного иммунофер-ментного анализа (ТИФА). Для анализа иммунореактивности ПА проводили иммуноблотинг с использованием нитроцеллюлозных мембран Hybond-C (Amersham, США).

Иммунологические методы. Определение ЛД50 проводили в соответствии с методическими рекомендациями «Основные требования к вакцинным штаммам сибиреязвенного микроба для иммунизации людей» (2002). Индексы иммунитета рассчитывали как отношение ЛД50 заражающей культуры иммунизированных особей к ЛДзо интактных биомоделей.

Распределение иммунокомпетентных клеток по фазам клеточного цикла устанавливали цитофлуориметрическим методом. Фиксированные в этиловом спирте тимоциты и спленоциты линейных мышей и лейкоциты крови человека окрашивали раствором, содержащим бромид этидия и митрамицин, в течение

20 минут. На проточном цитофлуориметре ICP-22 PHYWE (Германия) анализировали не менее 30000 клеток в каждой пробе (Кравцов А.Л., 1997; Kravtsov A.L. et al., 2001).

Молекулярно-генетические методы. Полимеразную цепную реакцию с праймерами на нуклеотидные последовательности гена pag проводили в модификации И.В. Тучкова с соавт. (2005). Праймеры на нуклеотидные последовательности гена pagR рассчитывали в программе Vector NTI. Праймеры к генам TLRs были синтезированы в лаборатории генодиагностических препаратов РосНИПЧИ «Микроб» на основе известных последовательностей. Выделение РНК из клеток селезенки и тимуса иммунизированных линейных мышей и реакцию обратной транскрипции осуществляли с помощью комплектов реагентов «РИБО-сорб» и «Реверта» (ИнтерЛабСервис, Россия) согласно инструкциям фирмы-производителя. Полимеразную цепную реакцию ставили на программируемом амплификаторе «Терцик» («ДНК-технология», Россия). Электрофоре-тический анализ ПЦР-продуктов проводили в горизонтальной камере (Bio-Rad, США) в 2 % агарозном геле. Визуализацию полос ДНК осуществляли в ультрафиолетовом свете и регистрировали с помощью системы гель-документирования «ViTran» (ДНК-технология, Россия).

Экспериментальные материалы обрабатывали посредством статистических методов, описанных И.П. Ашмариным, A.A. Воробьевым (1962). Определяли среднее значение (М), стандартную ошибку (m).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Используемые в практике здравоохранения и вновь разрабатываемые живые и химические сибиреязвенные вакцины основаны на действии ПА — одного из компонентов экзотоксина бинарного действия. Получение ПА из штаммов, содержащих клонированную детерминанту его синтеза (pag), обеспечивает отсутствие реактогенных примесей ОФ и ЛФ в иммунизирующем препарате. Депонированный в 2006 г. в ГКПБ РосНИПЧИ «Микроб» генно-инженерный штамм В. anthracis 55ATIIA-l(Spo") с включенным в состав гибридной плазмиды pUBllOPA-1 геном pag, не способен к образованию спор, вследствие чего имеет преимущество при организации технологического процесса получения из него иммуногенного сибиреязвенного антигена.

В начале нашего исследования оценивали стабильность основных свойств штамма В. anthracis 55ATIlA-l(Spo") после длительного хранения в лиофилизи-рованном состоянии. Проведя 20 последовательных пассажей штамма в жидкой питательной среде с добавлением селективного антибиотика, культуру рассевали до единичных колоний, а затем осуществляли их анализ по харак-

терным биологическим свойствам. На среде с белковым субстратом (казеином) не было отмечено зон лизиса вокруг всех 20 произвольно выбранных клонов. На среде, содержащей антитела к ПА, напротив, все исследуемые клоны образовывали широкие кольца преципитации. Результаты экспериментов свидетельствовали о сохранении низкой активности протеолитических ферментов и способности к продукции ПА штамма В. anthracis 55ДТПА-l(Spo"). Сравнение жизнеспособности культур до и после прогрева при 65 °С в течение 30 минут ни в одном из случаев не выявило реверсии к спорообразу-ющему фенотипу. При электрофоретическом исследовании ДНК произвольно выбранных клонов во всех случаях регистрировали наличие плазмиды соответствующего размера (6,5 т.п.н.). Проведенные эксперименты подтвердили стабильность биологических свойств рекомбинантного продуцента В. anthracis 55ДТПА-1(Бро") при многократном пассировании in vitro после хранения в лиофилизированном состоянии.

На следующем этапе исследовали возможность оптимизации параметров культивирования аспорогенного рекомбинантного продуцента для увеличения выхода иммуногенного белка. В проведенных ранее экспериментах концентрация ПА в культуральном фильтрате штамма В. anthracis 55ДТПА-1(8ро"), выращенного в течение 24 часов в жидкой питательной среде с высоким содержанием триптона и дрожжевого экстракта (Farchaus J. et al.,1998), составила 80 мкг/мл, что в 5 раз больше значений, установленных для вакцинного штамма В. anthracis СТИ-1 (Шулепов Д.В., 2009).

Количественную оценку уровней продукции ПА штаммами В. anthracis 55ATTIA-l(Spo") и В. anthracis СТИ-1 проводили в процессе их выращивания: а) в среде, описанной J. Farchaus et al.; б) в бульоне Хоттингера с добавлением 20 мг/мл триптона и в) в бульоне Хоттингера без дополнительных ингредиентов. Выращивание осуществляли до достижения поздней логарифмической (16 часов) или стационарной (24 часа) фаз роста. При культивировании рекомбинантного штамма в питательную среду вносили селективный антибиотик кана-мицин в концентрации 25 мкг/мл. Для вакцинного штамма обеспечивали повышенное содержание С02 в среде выращивания.

Добавление в питательную среду триптона приводило к значительному увеличению уровня продукции ПА рекомбинантным штаммом - приблизительно в 1,5-2 раза. Ответ вакцинного штамма на внесение дополнительного ингредиента оказался нейтральным.

По результатам ТИФА максимальные концентрации ПА в культуральных фильтратах обоих штаммов отмечались через 16 часов выращивания: 640 мкг/мл для В. anthracis 55ATTlA-l(Spo") и 30 мкг/мл для В. anthracis СТИ-1 (рис. 1). Через 18 часов инкубации концентрация ПА снизилась до 480 мкг/мл

для рекомбинантного продуцента и 15 мкг/мл для вакцинного штамма. Наименьшие значения отмечали через 24 часа культивирования - 150 мкг/мл для В. anthracis 55ATnA-l(Spo") и 10 мкг/мл для В. anthracis СТИ-1. Вероятно, после 16 часов инкубации количество протеолитических ферментов в среде достигает критического уровня, и, несмотря на то, что оба штамма характеризуются резко сниженной их активностью, происходит постепенная деградация белкового антигена. Нами установлено, что в равнозначных условиях рекомби-нантный штамм продуцирует в 20 раз больше ПА по сравнению с вакцинным штаммом.

а е-§(

Е- е

I *

I &

у / У ' N >

/ . / •___

. S // V*

У/ к--- *• i

Пр«долитлы1»стъ вырлпшводшя (тясы)

Рисунок 1 - Концентрация ПА в культуральных фильтратах рекомбинантного В. апЛгасгя 55ДТПА-1(8ро") (пунктирные линии) и вакцинного В. ап1кгас1з СТИ-1 (сплошные линии) штаммов, выращенных в различных питательных средах: 1 и 4 -среда, описанная I. РагсЬаш й а1.; 2 и 5 - бульон Хоттингера с добавлением триптона (20 мг/мл); 3 и 6 - бульон Хоттингера без триптона.

Как известно, в клетках природных штаммов В. апЛгаси или их аттенуи-рованных производных детерминанта синтеза ПА экспрессируется слабо из-за наличия сложной системы взаимодействия контролирующих генов. Позитивную регуляцию осуществляет главным образом плазмидная область А1хА, однако у рекомбинантного штамма с рЦВ110РА-1 область позитивной регуляции А1хА отсутствует. Высокий уровень продукции им ПА, возможно, обеспечен увеличением числа копий гена ра% за счет мультикопийности вектора рЦВПО и/или дефектом негативного регулятора pagR (Кудрявцева О.М., 2007).

Эффект дозы гена pag исследовали при помощи ПЦР с праймерами на основе его нуклеотидных последовательностей (Тучков И.В., 2005). В результате, при равном количестве исходной ДНК тестируемых штаммов - В. аыкгаш

55ДТПА-1(Бро') и В. anthracis СТИ-1, количество наработанных в ПЦР-реакции специфических ампликонов отличалось в несколько раз.

Для обнаружения в составе гибридной плазмиды регуляторного генаpagR (300 п.н.) нами в программе Vector NTI были рассчитаны праймеры, фланкирующие область с 36 по 234 п.н. от начала гена. Постановка ПЦР с использованием данных праймеров выявила наличие интактного гена pagR в геноме вакцинного штамма и продемонстрировала отсутствие негативного регулятора в геноме рекомбинантного продуцента.

Таким образом, высказанное ранее предположение подтверждено экспериментально.

На следующем этапе из аспорогенного генно-инженерного продуцента В. anthracis 55ATTIA-l(Spo") с использованием ранее разработанной методики (Шулепов Д.В., 2009) был выделен и очищен белок, имеющий по результатам SDS-ПААГ электрофореза молекулярную массу 83 кДа и специфично реагирующий с поликлональными анти-ПА антителами в иммунохимических реакциях

— иммуноблоте, дот-анализе и ТИФА.

Наиболее часто в качестве маркера иммуностимулирующего действия антигенных препаратов используют титры анти-ПА антител. Динамику антител у иммунизированных рекомбинантным ПА биомоделей изучали в сравнении с антителообразованием при использовании живой сибиреязвенной вакцины В. anthracis СТИ-1. Лабораторным животным опытных групп вводили двукратно препарат ПА в сочетании с полным адъювантом Фрейнда или культуру вакцинного штамма - линейным мышам и морским свинкам однократно в дозе 5 ■ 106 спор, а кроликам двукратно в дозе 1 • 107 спор.

Отмечены следующие особенности образования антител у мышей линии BALB/c. После двукратной иммунизации дозой 10 мкг ПА происходило постепенное нарастание титров специфических антител. К 21 дню иммуногенеза титр анти-ПА антител составил 1/2560, а через 2 месяца он достигал максимального значения - 1/40000. Вслед за пиком отмечали снижение титров до уровней 1/20000 - через 2,5 месяца, 1/5120 - через 3 - 3,5 месяца, и 1/640 - через 4,5 месяца. В сыворотках животных, вакцинированных однократно В. anthracis СТИ-1 (5 • 106 спор), максимум анти-ПА антител выявлялся на 28 сутки

— титр 1/5120. На протяжении всего срока наблюдения количество антител к ПА у мышей, иммунизированных антигенным препаратом, было выше. Различия показателей колебались в пределах от 2 до 30 раз (рис. 2).

« 45000

/ N

/ \

и / \

|| \

\ ,

5 ^ ' , , г

21 сутки 29 сутки 1.5месяца 2месяца 2.5 месяца Зиесяца 3.5месяца 4.5месяца Сроки поел* окончания иммунимцим

Рисунок 2 - Динамика титров анти-ПА антител при иммунизации линейных мышей ВАЬВ/с: пунктирная линия - препаратом ПА в дозе 10 мкг (двукратно); сплошная линия - споровой взвесью штамма В. апЖгаси СТИ-1 в дозе 5 • 106 спор (однократно). На графике приведены средние значения данных, полученных от 5 особей животных.

В случае однократной иммунизации споровой взвесью штамма В. апЛга-си СТИ-1 (5 • 106 спор) максимальный титр антител к ПА в сыворотках животных регистрировали через 1,5 месяца - 1/2560. В целом у морских свинок, иммунизированных антигенным препаратом, во все сроки отмечали более выраженный антителогенез с максимальным 30-кратным превышением титров в сравнении с биомоделями, вакцинированными В. апЖгаЫз СТИ-1.

В течение первых 35 суток поствакцинального периода у кроликов, двукратно иммунизированных В. апЖгасгя СТИ-1, отмечали более высокие титры анти-ПА антител. Пик антителообразования (титр антител 1/24000) у них регистрировали на 35 сутки. Впоследствии тенденция резко менялась, у биомоделей, иммунизированных антигенным препаратом, происходил «всплеск» выработки специфических антител. Их количество достигало максимума (титр антител 1/128000) через 1,5 месяца от начала иммунизации, затем происходило постепенное уменьшение значений титров до 1/33000 - через 2 месяца и 1/9000 -через 2,5 месяца. В отдаленные сроки (2 - 2,5 месяца) отмечали значительное (в отдельных случаях почти 20-кратное) превышение количества антител к ПА у кроликов, иммунизированных ПА.

Таким образом, ПА, полученный из аспорогенного рекомбинантного продуцента В. anth.ra.cis 55АТПА-1(8ро"), вызывает у лабораторных животных -линейных мышей, морских свинок, кроликов, выраженную продукцию специфических антител.

На следующем этапе определяли способность рекомбинантного ПА защищать мышей линии ВАЬВ/с и морских свинок от заражения тест-штаммами возбудителя сибирской язвы. Группам лабораторных животных (по 20 особей в каждой) вводили очищенный препарат рекомбинантного ПА двукратно в сочетании с полным адъювантом Фрейнда (в объемном соотношении 2:1) в дозах 10 мкг для линейных мышей и 25 мкг для морских свинок. Контролем служили интактные животные. В качестве препарата сравнения выбрали вакцинный штамм В. аШЬгаыз СТИ-1, которым иммунизировали подкожно однократно в дозе 1-2 • 10б спор для линейных мышей, 5 • 10б или 5 ■ 107 спор для морских свинок. В поствакцинальный период среди морских свинок, иммунизированных живой вакциной, регистрировали 20 - 25 % летальных случаев, среди линейных мышей аналогичной группы этот показатель достигал 10 %. Гибели животных, получивших инъекцию антигенного препарата, не наблюдали.

Через 21 день от последней инъекции осуществляли заражение животных споровой взвесью штамма В. ап^гаЫз 71/12. Линейным мышам вводили по 0,2 мл тест-штамма в четырех возрастающих дозах (по 5 животных каждой группы на дозу): от 1 • 103 до 1 • 10б спор - для иммунизированных, и от 1 ■ 102 до 1 • 105 спор — для интактных. Морским свинкам вводили по 0,5 мл споровой взвеси тест-штамма в четырех возрастающих дозах (по 5 животных каждой группы на дозу): от 1 ■ 104 до 1 ■ 107 спор - для иммунизированных, и от 1 • 104 до 1 ■ 101 спор - для интактных). Наблюдение за зараженными животными осуществляли в течение десяти дней, учитывали павших особей и подсчитывали ЛД50 В. ап-Лгаш 71/12, а также индексы иммунитета. Эксперимент по данной схеме повторяли трехкратно.

В результате обработки данных значение ЛД50 тест-штамма для интактных мышей в первом опыте составило 5,0 • 102 (100+2512) спор. Тот же показатель для животных, получивших антигенный препарат, оказался на два порядка выше - 7,9 • 104 (15849+501187) спор. Значение ЛД50 заражающего штамма для линейных мышей, иммунизированных вакцинным штаммом, было 3,1 • 104 (6310+158489) спор. Соответственно, в этом эксперименте индекс иммунитета рекомбинантного ПА - 158,5, аналогичный показатель штамма В. апЛга^ СТИ-1 - 63,1 (рис. 3, А). В следующих двух повторах опыта прослеживались те же тенденции. Индексы иммунитета или совпадали - 63,1 и 63,1, или отличались незначительно - 25,1 и 39,8. Колебания значений индексов иммунитета в

различных экспериментах, очевидно, могут быть связаны с условиями проведения экспериментов (сезон года) и индивидуальными особенностями животных (Колесов С.Г., 1976; Бывалов А.А., 2011).

В экспериментах на морских свинках определены следующие значения ЛД50 тест-заражающего штамма: для контрольных животных - 5 ■ 103 (1585+398107) спор; для морских свинок, получивших 25 мкг рекомбинантного ПА - 1,9 • 107 спор; для биомоделей, иммунизированных В. аМИгаая СТИ-1 (5 • 107 спор), - 1,9 • 107 спор. В результате индексы иммунитета рекомбинантного ПА и вакцинного штамма (3980,0) совпадали (рис. 3, Б). В следующих двух повторах опыта прослеживались те же закономерности.

190 I: 5 II 1 .. 1 я

шш

1 2

Рисунок 3 - Результаты экспериментов по сравнительному анализу индексов иммунитета рекомбинантного ПА (1) и вакцинного штамма В. аткгаЫя СТИ-1 (2) на модели линейных мышей (А) и морских свинок (Б).

Полученные результаты свидетельствуют о способности рекомбинантного ПА стимулировать формирование у лабораторных животных эффективного иммунного ответа. На основании сравнения индексов иммунитета можно сделать вывод о способности рекомбинантного протективного антигена обеспечивать защиту биомоделей, сопоставимую по уровню с протективностью вакцинного штамма В. anth.ra.cis СТИ-1.

Острую токсичность оценивали на иммунизированных препаратом ПА животных по данным мониторинга общего состояния и осмотра места инъекции. Мышам линии ВАЬВ/с (по 10 особей в группе) однократно подкожно вводили по 0,2 мл ПА без адъюванта в дозах 10 и 50 мкг, морским свинкам (по 5 особей в группе) по 0,5 мл препарата в дозах 25, 50 и 100 мкг. Контрольные животные получили по 0,2 и 0,5 мл физиологического раствора. При взвешивании животных всех групп не наблюдали снижения массы тела. Локальных морфологических изменений в области введения препаратов не фиксировали.

Для оценки повреждающего действия препарата in vitro осуществляли мониторинг состояния лейкоцитов крови человека после взаимодействия с ре-комбинантным ПА. По окончании инкубации антигенного препарата с цельной дефибринированной кровью людей проводили выделение и окраску лейкоцитов раствором, содержащим митрамицин и бромид этидия. Цитотоксическое действие ПА контролировали по количеству клеток в состоянии апоптоза методом проточной цитофлуориметрии. Установлено, что испытуемый препарат не оказывал повреждающего действия на лейкоциты крови.

Цитофлуориметрический мониторинг применяли также для оценки про-лиферативной активности лимфоцитов органов центрального (тимус) и периферического (селезенка) иммуногенеза линейных мышей BALB/c, иммунизированных однократно подкожно ПА без адъюванта. Апоптотическая и проли-феративная активности клеток тимуса существенно не отличались от аналогичных показателей в группе контрольных особей. В пробах селезенки регистрировали небольшое повышение пролиферативной активности клеток на 7 и 14 сутки, что может быть обусловлено пролиферацией В-клеток и антителопро-дукцией. Введение мышам ПА не влияло на апоптотическую активность спле-ноцитов. Индекс соотношения клеток селезенки и тимуса в стадии апоптоза и пролиферации не превышал единицы, что соответствует норме.

Несмотря на доминирующее значение ПА в процессе формирования иммунного ответа, в настоящее время не подвергается сомнению участие в иммуногенезе других антигенов возбудителя, в том числе белков S-слоя (Ariel N. et al., 2003; Baillie L. et al., 2003; Гончарова А.Ю., 2007). В связи с этим, представлялось обоснованным определить возможность использования одного из белков S-слоя - ЕА1 в качестве дополнительной составляющей химической сибиреязвенной вакцины.

Участие ЕА1 в формировании адаптивного иммунного ответа в первую очередь проверяли, оценивая титры анти-ПА и анти-EAl антител у кроликов, иммунизированных вакцинным штаммом В. anthracis СТИ-1. Кроликам (три особи в группе) вводили подкожно 1 ■ 107 спор бактериальной культуры. На 21 сутки осуществляли повторную иммунизацию той же дозой. Максимум антител как к ПА (среднее значение титров антител 1/24000), так и к белку S-слоя (среднее значение титров антител 1/6500) отмечали в сыворотках, взятых на 35 сутки после начала иммунизации. Спустя 2,5 месяца уровень антител к ПА и ЕА1 снижался до средних значений титров 1/4000 и 1/100, соответственно.

На следующей стадии проводили оценку эффективности иммунизации лабораторных животных препаратом, содержащим ПА в качестве основного иммуногенного вещества, а ЕА1 - в качестве иммуномодулирующего компо-

нента. Мышам двукратно вводили сочетание ПА в дозе 10 мкг с белком ЕА1 в дозе 5 мкг, морским свинкам - 25 мкг очищенного рекомбинантного ПА и 10 мкг белка ЕА1. Антигенные препараты использовали в сочетании с адъюван-том. Иммунобиологическую перестройку оценивали по показателям ЛД50 тест-штамма В. anihracis 71/12 и индексов иммунитета.

На модели линейных мышей были определены следующие значения ЛД50 заражающего штамма: 5 • 102 (100+2512) спор - для неиммунизированных особей, 3,1 • 104 (6310+158489) спор - при иммунизации В. anthracis СТИ-1, 1,9 • 105 (39811+1000000) спор - при введении комплексного препарата. Индексы иммунитета были следующими: 398,2 - для препарата ПА с ЕА1, 63,1 - для штамма В. anthracis СТИ-1. Ранее установленное значение индекса иммунитета для препарата рекомбинантного ПА в дозе 10 мкг составило 158,5. В сыворотках крови линейных мышей, иммунизированных комплексным препаратом, на 14 и 21 сутки иммуногенеза определялись специфические антитела к ЕА1.

Следовательно, добавление белка ЕА1 в иммунизирующий препарат на основе ПА повышает устойчивость линейных мышей к заражению тест-штаммом возбудителя сибирской язвы в 2,5 раза.

Эксперимент на морских свинках воспроизводили дважды на разных выборках животных. Для особей контрольной группы показатель ЛД50 заражающего штамма оказался равен 5 ■ 103 (1585+398107) или 3,1 • 102 (63+1585) спор. У морских свинок, получивших инъекцию препарата, содержащего ПА и ЕА1, в первом случае значение составило 1,9 • 10б (501187+19952623) спор, во втором случае - 3,1 • 107 спор. Для животных, иммунизированных вакцинным штаммом в дозе 5 • 10б спор, значение ЛД50 В. anthracis 71/12 было 3,1 • 106 (794328+50118723) спор. В повторном эксперименте иммунизирующая доза вакцинного штамма составляла 5 • 107 спор, значение ЛД50 тест-штамма -3,1 • 107 спор. Индексы иммунитета при иммунизации биомоделей комплексным препаратом ПА с ЕА1 - 398,0 и 100072,0, при введении В. anthracis СТИ-1 в концентрации 5 ■ 106 спор - 630,9, в концентрации 5 • 107 спор - 100072,0.

Отсутствие у протеина S-слоя цитотоксического действия по отношению к лейкоцитам крови человека подтверждали с использованием метода проточной цитометрии. Количество тимоцитов в состоянии апоптоза у лабораторных животных, иммунизированных белком S-слоя, не увеличивалось по сравнению с контролем. Число пролиферирующих клеток тимуса также соответствовало контрольным значениям. Коэффициент отношения апоптотических клеток к пролиферирующим был меньше единицы. Иммунизация белком ЕА1 приводила к увеличению числа апоптотических клеток селезенки на 7 сутки после имму-

низации, к концу срока наблюдения показатель возвращался к исходному значению. Показатель баланса был меньше единицы.

Из вышеизложенного следует, что создание прототипа химической вакцины целесообразно на основе сочетания рекомбинантного ПА и бежа Б-слоя ЕА1 сибиреязвенного микроба.

При оценке иммуногенного действия кандидатных химических вакцин необходимо уделить внимание взаимодействию антигенов со структурами врожденного иммунитета, в частности, толл-подобными рецепторами (ИЛв). Известно, что ПА является лигандом толл-подобных рецепторов 2 и 6 типов (Тпап1аА1оц М. й а1., 2007); данные о взаимодействии белков Б-слоя с ТЬЯэ отсутствуют.

Для исследования брали клетки тимуса и селезенки биомоделей в различные сроки после однократного введения изучаемых антигенных препаратов без адъюванта. С использованием коммерческих наборов была получена кДНК, послужившая матрицей для проведения ПЦР со специфическими праймерами к генам ТЬЯб. Положительным контролем служили ампликоны, образующиеся в ПЦР с праймерами к фрагменту гена «домашнего хозяйства», кодирующего синтез (3-актина. После электрофоретического разделения полученных амплико-нов проводили учет результатов эксперимента.

При исследовании в ПЦР проб, взятых через 4 часа, на 1, 3, 7 и 14 сутки после однократной иммунизации рекомбинантным ПА (10 мкг) или белком ЕА1 (10 мкг), во всех случаях образовывались специфичные ампликоны, что свидетельствует об экспрессии ТЬЯб 2 и 6 типов на клетках тимуса и селезенки линейных мышей. Интересно, что и у неиммунизированных животных отмечали экспрессию ТТЛв 2 и 6-го типа, хотя и слабо выраженную. Данный факт согласуется с представлениями о том, что клетки макроорганизма конститутивно экспрессируют рецепторы врожденного иммунитета (ТапвзепБ 8., ВеуаеЛ К, 2003). В связи с этим дополнительно осуществили сравнительный полуколичественный анализ экспрессии ТЪЯб на иммунокомпетентных клетках иммунизированных особей и интактных животных. Наработанные в ПЦР образцы титровали в двукратных разведениях и наносили в лунки агарозного геля. При элек-трофоретическом исследовании было установлено, что экспрессия ПЛв у линейных мышей, иммунизированных сибиреязвенными антигенами, в несколько раз больше, чем у животных, которым ПА и ЕА1 не вводили.

Проведенные эксперименты показывают, что при иммунизации линейных мышей ПА, выделенным из аспорогенного рекомбинантного продуцента, происходит активация врожденного звена иммунной системы, что выражается в достоверном значительном увеличении экспрессии ТТЛя 2 и 6 типа на клетках

селезенки и тимуса. Установлено, что белок ЕА1 также, как и ПА, способен взаимодействовать с рецепторами врожденного иммунитета.

При конструировании современных вакцин необходимо стремиться к соблюдению одного из основополагающих принципов вакцинологии - максимально возможному уменьшению дозы и кратности введения препарата. Ввиду этого обстоятельства, нами были проведены эксперименты по подбору доз и схем введения рекомбинантного ПА, обеспечивающих наилучшую защиту лабораторных животных.

Сравнение защитных свойств препаратов, различающихся по содержанию иммуногенного белка, проводили на модели мышей линии ВАЬВ/с. Животных отдельных групп, по 20 особей в каждой, иммунизировали рекомбинантным ПА в различных дозировках - 5, 10,20 и 30 мкг. ПА использовали в сочетании с адъювантом. Расчетное значение ЛД50 тест-штамма для мышей контрольной группы составило 5 • 102 спор. Показатели ЛД50 заражающего штамма для животных, получивших различные дозы рекомбинантного ПА, были выше: 5 • 104, 7,9 • 104, 3,1 • 104, 1,2 • 104спор при дозировке ПА 5 мкг, 10 мкг, 20 мкг, 30 мкг, соответственно. Индексы иммунитета варьировали следующим образом. Самое высокое значение оказалось у мышей, иммунизированных 10 мкг рекомбинантного ПА - 158,5. Как при увеличении, так и при уменьшении количества ПА отмечали снижение индекса иммунитета - до 100,0 для вводимой дозы ПА 5 мкг, и до 63,2 - для дозы 20 мкг ПА. Наименьшей протективной активностью обладал препарат, содержащий 30 мкг ПА, в этом случае индекс иммунитета был 25,6. По-видимому, увеличение антигенной нагрузки на макроорганизм ведет к супрессии иммунного ответа.

Обобщая эти экспериментальные данные и результаты, полученные на предыдущих этапах исследования, можно сделать вывод, что оптимальная иммунизирующая доза рекомбинантного ПА для мышей линии ВАЬВ/с составляет 10 мкг, для морских свинок - 25 мкг, для кроликов - 50 мкг.

На модели линейных мышей нами также установлено, что изменение схемы иммунизации за счет повышения кратности введения препарата не приводит к увеличению протективности. У линейных мышей, иммунизированных трехкратно (с одинаковым интервалом в 14 дней) 10 мкг ПА, показатель ЛД50 составил 1,9 • 104 спор, индекс иммунитета — 39,8. При двукратной схеме иммунизации той же дозой ПА индекс иммунитета был равен 158,5.

Принципиальным моментом оценки эффективности создаваемых вакцин является определение продолжительности создаваемого ими иммунитета. Нами показано, что иммунизация линейных мышей, морских свинок и кроликов препаратом ПА, полученного из генно-инженерного продуцента В. аЫЬгаси 55ДТПА-1(8ро"), стимулирует развитие иммунного ответа с относительно вы-

сокими титрами анти-ПА антител в период от 2 до 4,5 месяцев (срок наблюдения). Зарегистрированные значения существенно превышали титры специфических антител у животных, вакцинированных В. апИггасгь СТИ-1. Протективную активность в отдаленные сроки исследовали на модели линейных мышей. Лабораторных животных иммунизировали двукратно препаратом ПА в дозе 10 мкг в сочетании с адъювантом. Заражение тест-штаммом В. апИигас1$ 71/12 осуществляли через 21 день (первая группа), 2 месяца (вторая группа) и 4 месяца (третья группа) от последней инъекции антигенного препарата. Значение ЛД50 заражающего штамма для мышей первой группы составило 1,9 • 104 (3 981+100000) спор, второй группы - 1,2 • 104 (1585-4-63096) спор, третьей группы - 1,0 • 104 (1995+50119) спор. Индекс иммунитета в случае заражения биомоделей через 21 день был равен 39,8, через два месяца - 25,1, через четыре месяца -19,9.

На следующем этапе определяли оптимальные компонентные составы прототипов химических сибиреязвенных вакцин. Основываясь на совокупности результатов проведенных нами экспериментов, прототип химической сибиреязвенной вакцины обязательно должен содержать очищенный ПА, синтезированный генно-инженерным штаммом В. апЛгаая 55АТПА-1(8ро"). Кроме того, в его состав целесообразно включить белок Б-слоя ЕА1. Однако для снижения антигенной нагрузки на макроорганизм в комбинированном препарате дозу ЕА1 целесообразно уменьшать в 2 раза относительно содержания ПА.

Обычно вакцины на основе высокоочищенных гомогенных продуктов требуют включения в рецептуру веществ, неспецифически усиливающих иммунный ответ на антигены (Решег У. й а1., 2008; МЬо\у М. & а1., 2010). Мы также исходили из необходимости добавления адъюванта к препарату реком-бинантного ПА во всех экспериментах по изучению его протективности. При использовании комплексного препарата ПА с ЕА1 в иммунизирующую смесь также вносили полный адъювант Фрейнда, так как наличие у белков Б-слоя иммуномодулирующих свойств, как оказалось, не исключает потребности в адъюванте. Особенно четко эта особенность прослеживалась в экспериментах на морских свинках. Равному количеству животных (по 20 морских свинок в группе) вводили по 25 мкг ПА и 10 мкг ЕА1. В одном случае сочетание антигенов смешивали с равным объемом адъюванта, в другом адъювант не использовали. В первом варианте показатель ЛД50 составил 1,9 • 10б спор тест-штамма, индекс иммунитета - 398,1. Во втором значение ЛД50 было существенно ниже -1,2 • 10 спор, индекс иммунитета - 2,5. Использование адъювантов, разрешенных для использования у людей - альгидрогеля, монофосфорилированного ли-пида А, является одной из перспектив нашей работы.

На модели морских свинок тестировали комбинированную схему иммунизации. Лабораторным животным сначала вводили 5 • 106 спор штамма В. ап-Лгасй СТИ-1, а в конце поствакцинального периода (через 21 день) 25 мкг очищенного рекомбинантного ПА в сочетании с адъювантом. В этом случае значение ЛД50 регистрировали на уровне 1,7 • 107 спор, индекс иммунитета составил 3548,0. Значение ЛД50 тест-штамма для биомоделей, вакцинированных В. ап^гаск СТИ-1 в дозе 5 • 107 спор, оказалось 2 • 107 спор, а в дозе 5 • 106 спор - 3,1 • 10 спор. Следовательно, индексы иммунитета у животных, иммунизированных по комбинированной схеме, а также вакцинным штаммом в дозе 5 • 107 спор, были почти одинаковыми - 3548,0 и 3980,1. Полученные результаты свидетельствуют о возможности уменьшения вводимой дозы вакцинного штамма на порядок при дополнительной однократной иммунизации рекомби-нантным антигеном.

Таким образом, комплекс проведенных нами исследований подтверждает перспективность использования протективного антигена, полученного из аспо-рогенного штамма В. ап&гаси 55ДТПА-1(8ро~), в качестве основного компонента прототипа химической сибиреязвенной вакцины.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что для эффективной продукции протективного антигена культивирование аспорогенного штамма В. апИггаыз 55ДТПА-1(8ро") необходимо осуществлять в течение 16 часов в жидкой питательной среде (бульон Хоттингера), обогащенной триптоном. В оптимизированных условиях ре-комбинантный штамм синтезирует около 640 мкг/мл иммуногенного белка, что в 20 раз больше продукции протективного антигена вакцинным штаммом В. anth.ra.cis СТИ-1.

2. Высокий уровень продукции протективного антигена рекомбинант-ным штаммом В. аШкга^ 55ДТПА-1(8ро") является следствием отсутствия в его геноме негативного регулятора синтеза протективного антигена pagR и увеличения числа копий кодирующего гена рац за счет мультикопийности векторной плазмиды рЦВ110РА-1.

3. Показано, что у лабораторных животных, иммунизированных двукратно препаратом протективного антигена, происходит более интенсивное ан-тителообразование по сравнению с биомоделями, вакцинированными однократно В. аыЬга^ СТИ-1 (с превышением титров анти-ПА антител до 30 раз -для линейных мышей и морских свинок, и до 20 раз - для кроликов). Максимальные количества антител к протективному антигену регистрируются у кроликов через 1 месяц после начала иммунизации (титр 1/128000), у морских сви-

нок - через 2,5 месяца (титр 1/40000), у мышей линии BALB/c - через 2 месяца (титр 1/40000).

4. Показано, что двукратная иммунизация мышей линии BALB/c и морских свинок рекомбинантным протективным антигеном (в дозировке 10 и 25 мкг, соответственно, в сочетании с адъювантом) обеспечивает эффективную защиту от заражения тест-штаммом В. anthracis 71/12. Значения ЛД50 тест-заражающего штамма для иммунизированных и интактных морских свинок различаются на четыре порядка, для иммунизированных и интактных линейных мышей - на два порядка. Индексы иммунитета антигенного препарата и В. anthracis СТИ-1 для конкретного вида лабораторных животных сопоставимы.

5. Установлено, что на модели мышей линии BALB/c белок S-слоя сибиреязвенного микроба ЕА1 при совместном введении с рекомбинантным протективным антигеном стимулирует выработку анти-EAl антител и повышает индекс иммунитета в 2,5 раза.

6. Определены компонентные составы прототипов химических сибиреязвенных вакцин и иммунизирующие дозы для разных видов биомоделей. Препарат очищенного протективного антигена, синтезированного генно-инженерным штаммом В. anthracis 55ATIIA-l(Spo'), эффективен в сочетании с адъювантом или с адъювантом и белком S-слоя ЕА1. Оптимальная иммунизирующая доза рекомбинантного протективного антигена для мышей линии BALB/c составляет 10 мкг, для морских свинок - 25 мкг, для кроликов - 50 мкг.

7. Определена возможность уменьшения на порядок дозы живой сибиреязвенной вакцины В. anthracis СТИ-1 (до 5 • 106 спор для морских свинок) при дополнительной однократной иммунизации препаратом рекомбинантного протективного антигена (25 мкг для морских свинок) в сочетании с адъювантом.

8. При подкожном пути введения препарат рекомбинантного протективного антигена не токсичен в дозах 50 мкг - для линейных мышей, и 100 мкг -для морских свинок. Рекомбинантный протективный антиген и белок ЕА1 не оказывают влияния на пролиферативную активность клеток тимуса и селезенки лабораторных животных и не индуцируют гибель тимоцитов и спленоцитов по типу апоптоза. Введение препаратов, содержащих рекомбинантный протективный антиген и белок S-слоя ЕА1, приводит к достоверному увеличению экспрессии толл-подобных рецепторов 2 и 6 типов на тимоцитах и спленоцитах мышей линии BALB/c.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Щуковская Т.Н., Козлова Е.А., Саяпина Л.В., Осина H.A., Попова П.Ю., Кутырев В.В. Оптимизация экстренной и специфической профилактики

особо опасных инфекций: новые перспективы // Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней: Тезисы Всеросс. науч.-практ. конф. - Москва, 2008. - С. 129.

2. Попова П.Ю., Микшис Н.И. Определение защитных свойств про-тективного антигена, синтезируемого рекомбинантными штаммами В. anthracis II Современные технологии обеспечения биологической безопасности: Матер, науч.-практ. школы-конф. молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Роспотребнадзора. - Оболенск, 2010. - С. 296298.

3. Попова П.Ю., Микшис Н.И., Кудрявцева О.М., Гончарова А.Ю., Болотникова М.Ф., Новикова Л.В., Каштанова Т.Н., Попов Ю.А. Изучение способности протективного антигена, синтезируемого генно-инженерными штаммами В. anthracis, вызывать развитие адаптивного иммунитета у лабораторных животных // Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями: Матер, междунар. конф./ под ред. А.Б. Жебруна. - СПб.: ФГУН НИИЭМ имени Пастера Роспотребнадзора, 2010. - С. 128.

4. Попова П.Ю., Гончарова А.Ю., Микшис Н.И., Кудрявцева О.М., Попов Ю.А. Иммуногенная активность поверхностных антигенов возбудителя сибирской язвы // Актуальные проблемы предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения государств-участников СНГ: Матер. X Межгосуд. науч.-практ. конф. государств-участников СНГ. - Ставрополь, 2010. - С. 261262.

5. Попова П.Ю., Микшис Н.И., Гончарова А.Ю., Кудрявцева О.М., Попов Ю.А. Изучение иммуногенности сибиреязвенного рекомбинантного протективного антигена на модели морских свинок // Современные технологии обеспечения биологической безопасности: Матер. III науч.-практ. школы-конф. молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Роспотребнадзора. - Оболенск, 2011.- С. 332-335.

6. Микшис Н.И., Попова П.Ю., Гончарова А.Ю., Кудрявцева О.М., Новикова Л.В., Каштанова Т.Н., Живова Ю.Н., Попов Ю.А., Щуковская Т.Н., Кутырев В.В. Прототип сибиреязвенной химической вакцины на основе рекомбинантного протективного антигена // Материалы X съезда ВНПОЭМП «Итоги и перспективы обеспечения эпидемиологического благополучия населения Российской Федерации». - Москва, 2012. — Инфекция и иммунитет. - Т. 2. - № 1-2. -С. 105.

7. Микшис Н.И., Попова П.Ю., Кудрявцева О.М., Гончарова А.Ю., Попов Ю.А., Кутырев В.В. Иммуногенность протективного антиге-

на, выделенного из аспорогенного рекомбннаитного штамма В. anthracis И Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунопрофилактики. - 2011. -№1. - С. 44-48. (журнал из перечня ВАК).

8. Микшис Н.И., Кудрявцева О.М., Гончарова А.Ю., Попова П.Ю., Живова Ю.Н., Попов Ю.А., Кутырев В.В. Оценка эффективности продукции протективного антигена аспорогенным рекомбинантным штаммом Bacillus anthracis II Биотехнология. - 2011 - №5. - С. 38-43. (журнал из перечня ВАК).

9. Попова П.Ю., Микшис Н.И., Щуковская Т.Н., Попов Ю.А. Взаимодействие возбудителя сибирской язвы с паттерн-распознающими рецепторами врожденного и адаптивного иммунитета // Проблемы особо опасных инфекций. - 2011. - Вып. 4 (110). - С. 12-17. (журнал из перечня ВАК).

10. Попова П.Ю., Микшис Н.И., Кудрявцева О.М., Гончарова А.Ю., Новикова JI.B., Каштанова Т.Н., Попов Ю.А., Смолькова Е.А., Кравцов АЛ., Щуковская Т.Н. Влияние протективного антигена, синтезируемого аспорогенным рекомбинантным штаммом Bacillus anthracis, на иммунную систему экспериментальных животных // Проблемы особо опасных инфекций. - 2012. - Вып. 1 (111). - С. 84-87. (журнал из перечня ВАК).

Подписано к печати 27.04.2012 Формат 60x84 1/16 Печать лазерная Бумага офисная Объем 1,0 усл. п. л. Тираж 100 экз.

Отпечатано на полиграфическом оборудовании ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия

человека.

410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Попова, Полина Юрьевна

ВВЕДЕНИЕ

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Биологическая значимость протективного антигена и компонентов поверхностных структур сибиреязвенного микроба

1.2. Использование живых, химических и рекомбинантных вакцин для профилактики сибирской язвы

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Штаммы микроорганизмов, использованные в работе

2.2. Питательные среды, реактивы и лабораторные животные

2.3. Микробиологические методы исследования

2.3.1. Определение стабильности основных биологических свойств рекомбинантного штамма В. anthracis in vitro

2.3.2. Определение протеолитической активности штаммов

В. anthracis

2.3.3. Реакция радиальной диффузионной преципитации

2.3.4. Определение способности сибиреязвенных культур к спорообразованию

2.3.5. Приготовление споровой взвеси

2.3.6. Подготовка иммунизирующих и тест-заражающих штаммов В. anthracis

2.3.7. Культивирование аспорогенного рекомбинантного штамма-продуцента протективного антигена

2.4. Биохимические методы исследования

2.4.1. Выделение и очистка протективного антигена из куль-турального фильтрата аспорогенного рекомбинантного штамма

2.4.2. Выделение и очистка белка S-слоя ЕА

2.4.3. Белковый электрофорез

2.5. Иммунохимические методы исследования

2.5.1. Твердофазный иммуноферментный анализ

2.5.2. Реакция иммуноблота

2.5.3. Дот-иммуноанализ

2.6. Иммунологические методы исследования

2.6.1. Изучение иммуногенности препаратов сибиреязвенных антигенов для линейных мышей и морских свинок

2.6.2. Определение индексов иммунитета рекомбинантного протективного антигена и вакцинного штамма В. ап-thracis СТИ

2.6.3. Выделение лимфоцитов тимуса и селезенки

2.6.4. Определение токсичности антигенных препаратов in vitro

2.6.5. Определение пролиферативной активности иммуно-компетентных клеток цитофлуориметрическим методом

2.7. Молекулярно-генетические методы исследования

2.7.1. Выделение ДНК из клеток сибиреязвенных штаммов

2.7.2. Расчет праймеров и условия проведения полимеразной цепной реакции

2.7.3. Выделение РНК из лимфоцитов тимуса и селезенки

2.7.4. Проведение полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией

2.8. Статистические методы

ГЛАВА 3. ДОКАЗАТЕЛЬСТВА ПРЕИМУЩЕСТВА

ИСПОЛЬЗОВАНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ШТАММА В

КАЧЕСТВЕ ИСТОЧНИКА ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕКТИВНОГО

АНТИГЕНА СИБИРЕЯЗВЕННОГО МИКРОБА

3.1. Оценка стабильности характерных свойств штамма В. апФгаш 55АТПА-1(8ро")

3.2. Оптимизация условий культивирования рекомбинантного аспорогенного штамма с целью повышения выхода сибиреязвенного протективного антигена

3.3. Определение генетических причин высокой продукции протективного антигена генно-инженерным штаммом-продуцентом

ГЛАВА 4. ИЗУЧЕНИЕ СПОСОБНОСТИ ПРОТЕКТИВНОГО АНТИГЕНА, ПОЛУЧЕННОГО ИЗ АСПОРОГЕННОГО РЕКОМБИНАНТНОГО ПРОДУЦЕНТА, ВЫЗЫВАТЬ РАЗВИТИЕ ВЫРАЖЕННОГО ИММУННОГО ОТВЕТА У ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ. СРАВНЕНИЕ С ИММУНИЗИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ ВАКЦИННОГО ШТАММА В. АШНЯЛСШ СТИ

4.1. Исследование особенностей динамики титров специфических антител при иммунизации лабораторных животных рекомби-нантным протективным антигеном или вакцинным штаммом

В. anth.ra.cis СТИ

4.2. Определение защитных свойств рекомбинантного протективного антигена для различных биологических моделей в сравнении с индексами иммунитета вакцинного штамма

В. апИНгаш СТИ

ГЛАВА 5. ОЦЕНКА РЕАКТОГЕННОСТИ И ТОКСИЧНОСТИ ПРОТЕКТИВНОГО АНТИГЕНА, СИНТЕЗИРУЕМОГО

РЕКОМБИНАНТНЫМ ШТАММОМ В. ANTHRACIS 55ATnA-l(SPO-), В ЭКСПЕРИМЕНТАХ IN VIVO И IN VITRO

ГЛАВА 6. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОМПОНЕНТНОГО СОСТАВА ПРОТОТИПА ХИМИЧЕСКИХ СИБИРЕЯЗВЕННЫХ ВАКЦИН

6.1. Изучение перспективности использования белков S-слоя сибиреязвенного микроба в качестве дополнительного компонента химической вакцины

6.2. Определение взаимодействия рекомбинантного протективного антигена и белка S-слоя сибиреязвенного микроба ЕА1 с рецепторами врожденного иммунитета

6.3. Определение компонентного состава прототипов химических сибиреязвенных вакцин, подбор оптимальных доз и схем введения лабораторным животным

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биологическая характеристика протективного антигена, синтезируемого аспорогенным рекомбинантным штаммом Bacillus anthracis"

Актуальность исследования. Особо опасная зооантропонозная инфекция - сибирская язва, является серьезной проблемой здравоохранения и сельского хозяйства во всем мире. Потенциальная возможность заражения человека вирулентными штаммами Bacillus anthracis поддерживается периодически возникающими эпизоотиями болезни, а также существованием множественных почвенных очагов сибиреязвенной инфекции на территории многих стран, в том числе Российской Федерации - более 43 тысяч (Черкасский Б.Л., 2002). Кроме того, возбудитель сибирской язвы отнесен к категории А агентов биотерроризма, представляющих большую угрозу для мирного населения (Онищенко Г.Г. с соавт., 2006).

В. anthracis - грамположительный спорообразующий микроорганизм. Вирулентность В. anthracis обусловлена синтезом капсулы и экзотоксина (Mock M., Fouet А., 2001). Капсула представляет собой полимер D-глютаминовой кислоты. Основной функцией капсулы в инфицированном макроорганизме является защита микробных клеток от фагоцитоза (Thome С. et al., 1952; Fouet A. et al., 1999; Scorpio A. et al., 2010). Токсин возбудителя сибирской язвы состоит из трех компонентов: отечного фактора (ОФ), летального фактора (ЛФ) и протек-тивного антигена (ПА). ОФ является кальмодулин-зависимой аденилатцикла-зой, действие которой заключается в превращении аденозинтрифосфата в циклический аденозинмонофосфат (цАМФ). Накопление цАМФ приводит к изменению внутриклеточного водного баланса и клинически выражается в массивном отеке тканей (Leppla S., 1982; Yeager L. et al., 2009). ЛФ относится к цинк-зависимым металлопротеазам, расщепляющим митоген-активируемые протеиновые киназы (Duesbury N., Vande Woude G., 1999; Tonello F., Montecucco С., 2009). Белковая молекула ПА отвечает за транслокацию ОФ и ЛФ внутрь клетки. Расщепленный эукариотической протеазой фурином ПА в определенных условиях индуцирует процесс формирования пор в оболочке клетки-мишени. ОФ и ЛФ, взаимодействуя с ПА, формируют отечный и летальный токсины, которые после попадания в клетку реализуют свое повреждающее действие на макроорганизм (Mock M., Fouet А., 2001). Участвуя в реализации вирулентных свойств, ПА в то же время является основным иммуногеном сибиреязвенного микроба.

Эффективной превентивной мерой в отношении сибирской язвы является вакцинация населения групп риска и сельскохозяйственных животных. В России для профилактики сибирской язвы у людей лицензированы две вакцины -сибиреязвенная живая сухая для накожного и скарификационного применения и сибиреязвенная комбинированная - жидкая и сухая для подкожного применения. Комбинированная вакцина состоит из клеток вакцинного штамма В. ап-thracis СТИ-1 и полученного из него препарата ПА (Пименов Е.В. с соавт., 2002). В США и Великобритании для вакцинопрофилактики людей с начала 50-х годов XX века производятся химические вакцины, основой которых является адсорбированный на гидроокиси алюминия ПА, выделенный из культу-ральных фильтратов некапсулообразующих сибиреязвенных штаммов. Однако получение иммуногенного антигена из природных или аттенуированных штаммов В. anthracis проблематично ввиду трудностей хроматографического разделения компонентов токсина, имеющих близкие значения молекулярных масс. Наличие в химических сибиреязвенных вакцинах ненормированных примесей ОФ и ЛФ приводит к возникновению, примерно в 20 % случаев, побочных эффектов различной степени выраженности (Centers for disease control and prevention, 2000). Очевидно, что для вакцинации людей предпочтительнее использовать ПА, получаемый из генно-инженерных штаммов с клонированным геном pag, кодирующим его синтез. За рубежом разработаны эффективные генно-инженерные продуценты ПА (Baillie L. et al., 1998; Cohen S. et al., 2000; Chauhan V. et al., 2001). На основе синтезируемого ими иммуногенного белка разрабатываются усовершенствованные химические вакцины, некоторые из них в настоящее время проходят клинические испытания (Campbell J. et al., 2007; Brown В. et al., 2010; www. clinicaltrials. gov).

Ранее в лаборатории прикладной генетики РосНИПЧИ «Микроб» был сконструирован аспорогенный рекомбинантный штамм В. anthracis 55ДТПА-1 (Spo"), содержащий гибридную плазмиду с клонированной детерминантой синтеза ПА (Микшис Н.И., 2009). Использование его в качестве продуцента ПА дает возможность избежать микробной контаминации лабораторных и производственных помещений и оборудования. Из культурального фильтрата рекомби-нантного продуцента выделен биологически активный ПА, достигнута высокая степень его очистки. Всестороннего исследования влияния синтезируемого штаммом ПА на макроорганизм ранее не проводилось.

Перспективным направлением разработки новых профилактических сибиреязвенных препаратов является конструирование субъединичных вакцин, включающих помимо ПА другие компоненты В. anthracis и иммуномодулиру-ющие вещества. На наш взгляд применительно к сибиреязвенной инфекции перспективно использование естественных клеточных компонентов этого возбудителя - протеинов S-слоя, обладающих иммуномодулирующими свойствами и определенной иммуногенной активностью (Ariel N. et al., 2003; Baillie L. et al., 2003; Гончарова А.Ю., 2007).

Все вышеизложенное определяет актуальность диссертационной работы, целью которой является оценка перспективности использования протективного антигена, синтезируемого генно-инженерным штаммом В. anthracis 55ДТПА-1 (Spo"), в качестве основного компонента химических сибиреязвенных вакцин.

Задачи исследования:

1. Изучить стабильность характерных свойств аспорогенного штамма В. anthracis 55ATTIA-l(Spo")- Оптимизировать условия культивирования реком-бинантного продуцента для увеличения выхода протективного антигена сибиреязвенного микроба.

2. В экспериментах на лабораторных животных (кролики, морские свинки, мыши линии BALB/c) определить динамику титров специфических антител и индексы иммунитета для рекомбинантного протективного антигена, полученного из культурального фильтрата штамма В. anthracis 55ATIIA-l(Spo"). Сравнить иммунизирующую активность рекомбинантного протективного антигена и вакцинного штамма В. anthracis СТИ-1.

Научная новизна исследования:

Впервые установлено, что оптимизация условий культивирования аспоро-генного рекомбинантного штамма В. anthracis 55ATIIA-l(Spo") - добавление в бульон Хоттингера триптона в концентрации 20 мг/мл и сокращение продолжительности выращивания с 24 часов до 16 часов, приводит к увеличению в 5 раз выхода протективного антигена. В экспериментально подобранных условиях штамм В. anthracis 55ATTIA-l(Spo") синтезирует в 20 раз больше протективного антигена, чем вакцинный штамм В. anthracis СТИ-1.

Впервые осуществлено сравнение иммунизирующей активности вакцинного штамма возбудителя сибирской язвы В. anthracis СТИ-1 и препарата протективного антигена, полученного из аспорогенного генно-инженерного продуцента В. anthracis 55ATTIA-l(Spo"). Установлено, что продукция анти-ПА антител при двукратном введении биомоделям рекомбинантного протективного антигена характеризуется более высокими титрами, с превышением значений до 30 раз - для линейных мышей и морских свинок, и до 20 раз - для кроликов. На модели кроликов максимальные титры регистрировались через 1 месяц после последней инъекции препарата рекомбинантного протективного антигена, у морских свинок и линейных мышей - через 2,5 и 2 месяца, соответственно.

Впервые установлено, что добавление к рекомбинантному протективному антигену очищенного протеина Б-слоя сибиреязвенного микроба - ЕА1, приводит к повышению в 2,5 раза индекса иммунитета на модели линейных мышей.

Впервые получены данные, свидетельствующие о перспективности использования препарата рекомбинантного протективного антигена для бустерной иммунизации с целью уменьшения на порядок вводимой дозы живой сибиреязвенной вакцины.

Практическая ценность и формы внедрения:

По материалам диссертации составлены методические рекомендации: «Технологии выделения и очистки рекомбинантного протективного антигена и белка Б-слоя (ЕА1) сибиреязвенного микроба», одобренные Ученым советом РосНИПЧИ «Микроб» и утвержденные директором РосНИПЧИ «Микроб» (протокол Ученого совета РосНИПЧИ "Микроб" № 7 от 22.12.2011 г.); «Определение экспрессии генов То11-подобных рецепторов 2 и 4 клетками врожденного и адаптивного иммунитета у людей и экспериментальных животных», одобренные Ученым советом РосНИПЧИ «Микроб» и утвержденные директором РосНИПЧИ «Микроб» (протокол Ученого совета РосНИПЧИ "Микроб" № 7 от 16.12.2010 г.).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Аспорогенный рекомбинантный штамм В. амЬтаж 55ДТПА1(8ро") синтезирует 640 мкг/мл протективного антигена при выращивании в течение 16 часов в жидкой питательной среде (бульон Хоттингера), содержащей триптон в концентрации 20 мг/мл. В оптимизированных условиях культивирования продукция протективного антигена генно-инженерным штаммом В. аШкгаси 55ДТПА-1(8ро~) и вакцинным штаммом В. аШЪгаыя СТИ-1 различается в 20 раз. Более высокая продукция протективного антигена рекомбинантным штаммом является следствием отсутствия негативного регулятора синтеза протективного антигена pagR и увеличения числа копий кодирующего гена pag за счет мульти-копийности векторной плазмиды.

2. Протективный антиген, синтезируемый аспорогенным генно-инженерным штаммом В. аШкгаш 55ДТПА-1(8ро"), эффективно защищает лабораторных животных при экспериментальном моделировании сибиреязвенного инфекционного процесса. Показатели ЛД50 тест-заражающего штамма для морских свинок, двукратно иммунизированных дозой 25 мкг рекомбинантного протективного антигена в сочетании с адъювантом, и интактных особей, различаются на четыре порядка. Индексы иммунитета рекомбинантного протективного антигена при двукратной иммунизации морских свинок (дозой 25 мкг) и мышей линии ВАЬВ/с (дозой 10 мкг) сопоставимы с индексами иммунитета живой вакцины В. аМкгаыБ СТИ-1 для тех же биомоделей.

3. Препарат протективного антигена, полученный из аспорогенного продуцента В. аШкгаЫБ 55АТПА-1(8ро"), индуцирует выраженное образование анти-ПА антител при двукратном подкожном введении кроликам, морским свинкам и мышам линии ВАЬВ/с. На протяжении всего срока наблюдения (до 4,5 месяцев) у биомоделей отмечается более высокий уровень синтеза специфических антител, чем при однократном введении споровой культуры вакцинного штамма В. аМкгааБ СТИ-1.

4. В комбинированной схеме специфической профилактики сибиреязвенной инфекции, включающей однократную инъекцию споровой культуры штамма В. апШгаах СТИ-1 и последующее однократное введение рекомбинант-ного протективного антигена в сочетании с адъювантом, доза вакцинного штамма снижается на порядок (с 5 • 10 спор до 5 ■ 10 спор для морских свинок).

5. Очищенный препарат протективного антигена, выделенный из куль-турального фильтрата аспорогенного рекомбинантного штамма-продуцента В. апЖгаЫэ 55ДТПА-1(8ро"), не обладает реактогенностью и токсичностью для линейных мышей и морских свинок. В тестируемой дозе 10 мкг он не оказывает повреждающего действия на тимоциты и спленоциты мышей линии ВАЬВ/с и не изменяет их пролиферативную активность. Введение лабораторным животным препаратов, содержащих рекомбинантный протективный антиген и белок Б-слоя сибиреязвенного микроба (ЕА1), приводит к достоверному усилению экспрессии толл-подобных рецепторов врожденного иммунитета 2 и 6 типов на клетках селезенки и тимуса.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Попова, Полина Юрьевна

Выводы

1. Установлено, что для эффективной продукции протективного антигена культивирование аспорогенного штамма В. аШкгаЫБ 55АТПА-1(8ро") необходимо осуществлять в течение 16 часов в жидкой питательной среде (бульон Хоттингера), обогащенной триптоном. В оптимизированных условиях рекомби-нантный штамм синтезирует около 640 мкг/мл иммуногенного белка, что в 20 раз больше продукции протективного антигена вакцинным штаммом В. аШкга-с/я СТИ-1.

2. Высокий уровень продукции протективного антигена рекомбинант-ным штаммом В. апЖгасгя 55АТПА-1(8ро") является следствием отсутствия негативного регулятора синтеза протективного антигена pagR и увеличения числа копий кодирующего гена ра% за счет мультикопийности векторной плаз-миды рЦВ 110Р А-1.

3. Показано, что у лабораторных животных, иммунизированных двукратно препаратом протективного антигена, происходит более интенсивное ан-тителообразование по сравнению с биомоделями, вакцинированными однократно споровой взвесью В. аМкгасгз СТИ-1 (с превышением титров анти-ПА антител до 30 раз - для линейных мышей и морских свинок, и до 20 раз - для кроликов). Максимальные количества антител к протективному антигену регистрируются у кроликов через 1 месяц после начала иммунизации (титр 1/128000), у морских свинок - через 2,5 месяца (титр 1/40000), у мышей линии ВАЬВ/с - через 2 месяца (титр 1/40000).

4. Показано, что двукратная иммунизация мышей линии ВАЬВ/с и морских свинок рекомбинантным протективным антигеном (в дозировке 10 и 25 мкг, соответственно, в сочетании с адъювантом) обеспечивает их эффективную защиту от заражения тест-штаммом В. аШкгаыз 71/12. Значения ЛД50 тест-заражающего штамма для иммунизированных и интактных морских свинок различаются на четыре порядка, для иммунизированных и интактных линейных мышей - на два порядка. Индексы иммунитета антигенного препарата и В. ап-МгаЫя СТИ-1 для соответствующего вида лабораторных животных сопоставимы.

5. Установлено, что на модели мышей линии ВАЬВ/с белок Б-слоя сибиреязвенного микроба ЕА1 при совместном введении с рекомбинантным про-тективным антигеном стимулирует выработку анти-ЕА1 антител и повышает индекс иммунитета в 2,5 раза.

6. Определены компонентные составы прототипов химических сибиреязвенных вакцин и иммунизирующие дозы для разных видов биомоделей. Препарат очищенного протективного антигена, синтезированного генно-инженерным штаммом В. апОггаыз 55АТПА-1(8ро"), эффективен в сочетании с адъювантом или с адъювантом и белком Б-слоя ЕА1. Оптимальная иммунизирующая доза рекомбинантного протективного антигена для мышей линии ВАЬВ/с составляет 10 мкг, для морских свинок - 25 мкг, для кроликов - 50 мкг.

7. Определена возможность уменьшения на порядок дозы живой сибиреязвенной вакцины В. аМЬгаш СТИ-1 (до 5 ■ 106 спор для морских свинок) при дополнительной однократной иммунизации препаратом рекомбинантного протективного антигена (25 мкг для морских свинок) в сочетании с адъювантом.

8. При подкожном пути введения препарат рекомбинантного протективного антигена не токсичен в дозах 50 мкг - для линейных мышей, и 100 мкг -для морских свинок. Рекомбинантный протективный антиген и белок ЕА1 не оказывают влияния на пролиферативную активность клеток тимуса и селезенки лабораторных животных и не индуцируют гибель тимоцитов и спленоцитов по типу апоптоза. Введение препаратов, содержащих рекомбинантный протективный антиген и белок 8-слоя ЕА1, приводит к достоверному увеличению экспрессии толл-подобных рецепторов 2 и 6 типов на тимоцитах и спленоцитах мышей линии ВАЬВ/с.

I \

Заключение

Сибирская язва является одним из особо опасных заболеваний. Угроза возникновения и распространения данной инфекции на территории Российской Федерации сохраняется в настоящее время вследствие наличия большого количества стационарно неблагополучных очагов, а также неучтенных скотомогильников. Возбудитель сибирской язвы обладает высокой вирулентностью и способностью формировать резистентные к внешним воздействиям споры, что предопределяет возможность его использования в террористических целях.

Ежегодно регистрируемые случаи сибирской язвы сельскохозяйственных жи вотных и человека подтверждают необходимость поиска эффективных методов контроля инфекции. Вакцинация остается приоритетным способом профилактики инфекционных заболеваний, в том числе вызванных возбудителями особо опасных инфекций. Все использующиеся в практике здравоохранения и вновь разрабатываемые живые и химические сибиреязвенные вакцины включают в качестве основного ингредиента протективный антиген (ПА). Источником ПА служат аттенуированные штаммы В. аМкгаых. Однако в этом случае в вакцинном препарате содержатся примеси отечного и летального факторов, которые вызывают поствакцинальные осложнения. Исходя из изложенного, целесообразность использования для получения высокоочищенного протективного антигена генно-инженерных продуцентов, лишенных детерминант синтеза токсичных составляющих (отечного и летального факторов) представляется обоснованной.

Депонированный в 2006 г. в ГКПБ РосНИПЧИ «Микроб» аспорогенный генно-инженерный штамм В. аШкгасЪз 55АТПА-1(8ро") создан путем введения гибридной плазмиды рЦВПОРА-1, несущей клонированную детерминанту синтеза ПА, в бесплазмидное протеазодефицитное производное штамма В. аМкгаЫБ 55. Вследствие неспособности переходить в споровую форму данный дериват имеет преимущество при организации технологического процесса получения из него иммуногенного сибиреязвенного антигена. Кроме того, в отличие от природных штаммов, продукция ПА рекомбинантным штаммом не зависит от содержания углекислого газа, что обусловлено отсутствием в его геноме СОг-зависимого позитивного глобального регулятора AtxA. Однако использованию штамма в лабораторных и/или производственных условиях должны предшествовать эксперименты, подтверждающие стабильность основных свойств.

В начале нашего исследования оценивали стабильность основных свойств штамма В. anthracis 55AHIA-l(Spo") после долговременного хранения в лиофи-лизированном состоянии. Проводили 20 последовательных пассажей штамма в жидкой питательной среде с добавлением селективного антибиотика канами-цина (25 мкг/мл), а затем осуществляли рассев. Тестировали не менее 50 произвольно выбранных единичных колоний штамма по следующим признакам: способность к продукции ПА, протеазонегативность, аспорогенность. На средах, содержащих кроличьи поликлональные антитела к ПА, вокруг колоний регистрировали широкие зоны преципитации, что свидетельствует о способности рекомбинантного штамма продуцировать иммуногенный антиген. Анализ изучаемых клонов по признаку протеолитической активности проводили на казеиновой среде. На среде с белковым субстратом не было отмечено зон лизиса вокруг 20 произвольно выбранных клонов. Результаты поставленных экспериментов свидетельствовали о сохранении низкой активности протеолитиче-ских ферментов и способности к продукции протективного антигена штамма В. anthracis 55ATTIA-l(Spo').

Сравнение жизнеспособности культур до и после прогрева при 65 °С в течение 30 минут ни в одном из случаев не выявило реверсии к спорообразу-ющему фенотипу. При электрофоретическом исследовании ДНК у произвольно выбранных клонов во всех случаях регистрировали наличие плазмиды соответствующего размера (6,5 kb). Проведенные эксперименты подтвердили стабильность биологических свойств рекомбинантного продуцента при многократном пассировании in vitro после хранения в течение нескольких лет в лио-филизированном состоянии.

При культивировании штамма-продуцента важно определить условия выращивания, позволяющие получить максимальное количество целевого продукта. В первую очередь необходимо оптимизировать такие параметры, как состав питательной среды и продолжительность инкубации. В проведенных ранее экспериментах показано, что при выращивании штамма В. ашкгаш 55АТПА-1(8ро") в течение 24 часов в жидкой питательной среде с высоким содержанием триптона и дрожжевого экстракта концентрация ПА в культуральном фильтрате составляет 80 мкг/мл, что в 5 раз больше значений, установленных для вакцинного штамма В. anth.ra.cis СТИ-1 (Шулепов Д.В., 2009).

Культуры штаммов В. апМгасгз 55ДТПА-1(8ро") и В. аШкгаыз СТИ-1 (препарат сравнения) выращивали в среде, описанной I. РагсЬаш с соавторами (1998), в бульоне Хоттингера с добавлением триптона и в бульоне Хоттингера без дополнительных ингредиентов до достижения поздней логарифмической (16 часов) или стационарной (24 часа) фаз роста. Концентрации протективного антигена в культуральных фильтратах устанавливали с помощью твердофазного иммуноферментного анализа. Максимальные значения уровня синтеза ПА достигались после 16 часов культивирования (640 мкг/мл для рекомбинантного штамма и 30 мкг/мл для вакцинного штамма), в дальнейшем происходило снижение показателей. Вероятно, после 16 часов инкубации количество протеоли-тических ферментов в среде достигает величины, при которой начинается заметная деградация белкового антигена, несмотря на то, что оба штамма характеризуются резко сниженной активностью протеаз.

В ходе экспериментов отмечено, что добавление в питательную среду триптона приводит к значительному увеличению уровня продукции ПА реком-бинантным штаммом - приблизительно в 1,5-2 раза, в то время как продукция ПА вакцинным штаммом при внесении дополнительного ингредиента не менялась.

Таким образом, в равнозначных условиях рекомбинантный штамм продуцирует в 20 раз больше ПА по сравнению с вакцинным штаммом.

Высокий уровень продукции ПА рекомбинантным штаммом, по нашему предположению, может быть обусловлен либо мультикопийностью вектора pUBllO, либо рекомбииациоиными перестройками, затронувшими область синтеза негативного регулятора синтеза ПА - pagR.

Эффект дозы генаpag исследовали при помощи ПНР с праймерами на основе его нуклеотидных последовательностей. В итоге установлено, при равном количестве исходной ДНК тестируемых штаммов - В. anthracis 55ATIIA-l(Spo") и В. anthracis СТИ-1, количество наработанных в ПЦР-реакции специфических ампликонов на матрице ДНК рекомбинантного штамма в несколько раз превышало количество ампликонов, синтезированных на матрице ДНК штамма вакцинного штамма.

Для обнаружения регулятора pagR (300 п.н.) в программе Vector NTI нами были рассчитаны праймеры, фланкирующие область с 36 по 234 п.н. от начала гена. Постановка ПЦР с использованием данных праймеров выявила интактный ген pagR в геноме вакцинного штамма и продемонстрировала отсутствие негативного регулятора в геноме рекомбинантного продуцента.

Из аспорогенного генно-инженерного продуцента В. anthracis 55ДТПА-l(Spo") с использованием ранее разработанной методики (Шулепов Д.В., 2009) нами был выделен и очищен белок, имеющий по результатам SDS-ПААГ электрофореза молекулярную массу 83 кДа и специфично реагирующий с поликло-нальными анти-ПА антителами в иммунохимических реакциях.

Перспективность применения препарата ПА, выделенного из генно-инженерного продуцента, в качестве компонента химической вакцины должна быть оценена по показателям адаптивного и врожденного иммунного ответа с применением комплекса методов, включающих опыты на различных видах лабораторных животных и тесты in vitro.

Биологическую активность очищенного препарата ПА, его иммуноген-ность, протективность, реактогенность и токсичность исследовали на различных биомоделях - мышах линии BALB/c, морских свинках и кроликах. В качестве препарата сравнения был выбран вакцинный штамм В. anthracis СТИ-1 - единственное лицензированное для применения у людей профилактическое средство против сибирской язвы на территории Российской Федерации.

Наиболее часто в качестве маркера иммуностимулирующего действия антигенных препаратов используют титры анти-ПА антител, поэтому в наших экспериментах был применен аналогичный подход.

Выявлено, что после двукратной иммунизации мышей линии ВАЬВ/с дозой 10 мкг ПА происходило постепенное нарастание титров специфических антител с достижением максимального значения через 2 месяца - титр составлял 1/40000. В сыворотках животных, вакцинированных однократно В. апИггаш СТИ-1 (5 • 106 спор), максимум анти-ПА антител выявлялся на 28 сутки - титр равнялся 1/5120. На протяжении всего срока наблюдения количество антител к ПА у мышей, иммунизированных антигенным препаратом, было выше. Различия показателей колебались в пределах от 2 до 30 раз.

Аналогичная тенденция выявлена в экспериментах на морских свинках. После двукратной иммунизации биомоделей дозой 25 мкг рекомбинантного ПА отмечали повышение титров анти-ПА антител. Пик антителогенеза (титр антител 1/40000) регистрировали через 2,5 месяца. В случае однократной иммунизации споровой взвесью штамма В. аШкгас« СТИ-1 (5 • 106 спор) максимальный титр антител к ПА в сыворотках животных регистрировали через 1,5 месяца -титр составил 1/2560. В целом у морских свинок, иммунизированных антигенным препаратом, во все сроки отмечали более выраженное антителообразование с максимальным 30-кратным превышением титров антител к ПА по сравнению с биомоделями, иммунизированными вакцинным штаммом.

У кроликов, двукратно вакцинированных В. аткгаыз СТИ-1, в течение первых 35 суток поствакцинального периода отмечали более высокие титры анти-ПА антител. Пик антителообразования (титр равен 1/24000) у них регистрировали на 35 сутки. Впоследствии тенденция резко менялась, у биомоделей, иммунизированных антигенным препаратом, происходил «всплеск» выработки специфических антител. Их количество достигало максимума (титр увеличивался до 1/128000) через 1,5 месяца от начала иммунизации. В отдаленные сроки (2 - 2,5 месяца) отмечали значительное (в отдельных случаях почти 20-кратное) превышение количества антител к ПА у кроликов, иммунизированных ПА.

В дальнейшем определяли способность рекомбинантного ПА защищать мышей линии BALB/c и морских свинок от заражения тест-штаммом В. anthracis 71/12.

В результате проведенных экспериментов расчетное значение ЛД50 тест-штамма для интактных мышей составило 5,0 • 102 спор. Тот же показатель для животных, двукратно иммунизированных 10 мкг антигенного препарата, оказался на два порядка выше - 7,9 • 104 спор. Значение ЛД50 заражающего штамма для линейных мышей, вакцинированных В. anthracis СТИ-1 (1 • 106 спор), было равно 3,1 * 104 спор. Соответственно, индекс иммунитета рекомбинантного ПА составил - 158,5, аналогичный показатель штамма В. anthracis СТИ-1 - 63,1. В последующих двух повторах опытах прослеживалась та же закономерность.

В экспериментах на морских свинках определены следующие значения ЛД50 тест-заражающего штамма: для контрольных животных - 5 • 103 спор; для морских свинок, получивших 25 мкг рекомбинантного ПА - 1,9 • 107 спор; для биомоделей, иммунизированных В. anthracis СТИ-1 (5 • 107 спор) - 1,9 • 107 спор, В. anthracis СТИ-1 (5 • 106 спор) - 3,1 ■ 106спор. Индексы иммунитета рекомбинантного ПА и вакцинного штамма были сопоставимы.

Физиологическое состояние биомоделей, условия их содержания и кормления, а также генетические особенности системы иммунного ответа, могут служить причиной неодинаковой реакции на антигенное воздействие. Колебания значений индексов иммунитета в различных опытах связаны, по-видимому, с условиями проведения экспериментов (сезон года) и индивидуальными особенностями животных (Колесов С.Г., 1976; Бывалов A.A., 2011).

Необходимо отметить, что в поствакцинальный период среди морских свинок, иммунизированных живой вакциной, регистрировали 20-25 % летальных случаев, что является допустимым в соответствии с «Основными требованиями к вакцинным штаммам сибиреязвенного микроба для иммунизации людей». Среди линейных мышей аналогичной группы этот показатель достигал 10%. Гибели животных, получивших инъекцию антигенного препарата, не наблюдали.

Острую токсичность тестируемого рекомбинантного сибиреязвенного иммуногенного белка оценивали на иммунизированных препаратом ПА животных по данным мониторинга общего состояния и осмотра места инъекции. Мышам линии BALB/c вводили препарат в дозах 10 и 50 мкг, морским свинкам - в дозах 25, 50 и 100 мкг. Контрольные животные получили инъекции физиологического раствора. При взвешивании животных всех групп не наблюдалось снижения массы тела. Локальных морфологических изменений в области введения препаратов не фиксировали.

Для оценки повреждающего действия препарата in vitro осуществляли ци-тофлуориметрический мониторинг состояния лейкоцитов крови человека после инкубации с рекомбинантным ПА. В результате показано, что испытуемый препарат не оказывал повреждающего действия на лейкоциты крови.

Далее с помощью метода проточной цитометрии оценивали пролифера-тивную активность лимфоцитов тимуса и селезенки линейных мышей BALB/c, иммунизированных подкожно препаратом ПА. Апоптотическая и пролифера-тивная активность клеток тимуса существенно не отличалась от аналогичных показателей в группе контроля. В пробах селезенки регистрировали небольшое повышение пролиферативной активности клеток на 7 и 14 сутки, что может быть обусловлено пролиферацией В-клеток и антителопродукцией. Индекс соотношения клеток селезенки и тимуса в стадии апоптоза и пролиферации не превышал единицы, что соответствует норме.

Несмотря на доминирующее значение ПА в процессе формирования иммунного ответа, большинством исследователей в настоящее время не подвергается сомнению участие в иммуногенезе других антигенов возбудителя, в том числе протеинов S-слоя. Мы разделяем данную точку зрения и, в этой связи, проводили оценку эффективности иммунизации лабораторных животных препаратом, содержащим ПА в качестве основного иммуногенного вещества, а белка S-слоя ЕА1 - в качестве иммуномодулирующего компонента. Иммунобиологическую перестройку оценивали по показателям ЛД50 тест-штамма В. ап

Мгаш 71/12 и индексов иммунитета. Мышам двукратно вводили сочетание ПА в дозе 10 мкг с белком ЕА1 в дозе 5 мкг.

В серии опытов на модели линейных мышей были определены следующие индексы иммунитета: 398,2 - для препарата ПА с ЕА1, 63,1 - для штамма В. аШНгаЫя СТИ-1. Ранее установленное значение индекса иммунитета для препарата рекомбинантного ПА в дозе 10 мкг -158,5. Специфические антитела к ЕА1 в сыворотках крови линейных мышей, иммунизированных комплексным препаратом, определялись на 14 и 21 сутки иммуногенеза. Добавление ЕА1 в иммунизирующий препарат на основе ПА повышает устойчивость линейных мышей к заражению тест-штаммом возбудителя сибирской язвы в 2,5 раза.

В тестах на токсичность с использованием метода проточной цитометрии подтверждено отсутствие у протеина Б-слоя цитотоксического действия по отношению к лейкоцитам крови человека и клеткам тимуса и селезенки иммунизированных линейных мышей.

Из вышеизложенного следует, что создание прототипа эффективной и ареактогенной химической вакцины на основе комбинации рекомбинантного ПА и белка 8-слоя ЕА1 сибиреязвенного микроба целесобразно.

Дополнительным тестом оценки иммуностимулирующего действия прототипов химических вакцин явилось определение взаимодействия антигенов с толл-подобными рецепторами (ТЬЯб). Известно, что ПА является лигандом толл-подобных рецепторов 2 и 6 типов (Тпаг^аПои М. е1 а1., 2007), данные о взаимодействии белков Б-слоя с ТТЛя отсутствуют.

При исследовании в ПЦР проб селезенки и тимуса, взятых через 4 часа, на 1, 3, 7 и 14 сутки после иммунизации линейных мышей рекомбинантным ПА и белком ЕА1, во всех случаях нами показано образование специфичных ампли-конов, что свидетельствует о выраженной экспрессии ТЪЯб 2 и 6 типов. Интересно, что и у неиммунизированных животных отмечали экспрессию ТЬЯб 2 и 6 типа, хотя и слабо выраженную. Данный факт согласуется с представлениями о том, что клетки макроорганизма конститутивно экспрессируют рецепторы врожденного иммунитета (Таг^епБ Б., ВеуаеЛ Я., 2003). В связи с этим мы осуществили сравнительный полуколичественный анализ экспрессии ТЬЯэ на им-мунокомпетентных клетках иммунизированных особей и интактных животных. Наработанные в ПЦР образцы титровали в двукратных разведениях и наносили в лунки агарозного геля. При электрофоретическом исследовании было установлено, что экспрессия ТТЛя у линейных мышей, иммунизированных сибиреязвенными антигенами, в несколько раз больше, чем у животных, которым ПА и ЕА1 не вводили, что полностью согласуется с ранее опубликованными данными.

Далее нами были проведены эксперименты по подбору доз и схем введения рекомбинантного ПА, обеспечивающих наилучшую защиту лабораторных животных.

Сравнение защитных свойств препаратов, различающихся по содержанию иммуногенного белка, проводили на модели мышей линии ВАЬВ/с. Животных иммунизировали рекомбинантным ПА в различных дозировках - 5, 10, 20 и 30 мкг. В результате самое высокое значение индекса иммунитета оказалось у мышей, иммунизированных 10 мкг рекомбинантного ПА - 158,5. Как при увеличении, так и при уменьшении количества ПА отмечали снижение индекса иммунитета - до 100,0 для 5 мкг ПА, и до 63,2 - для 20 мкг ПА. Наименьшей протек-тивной активностью обладал препарат, содержащий 30 мкг ПА, в этом случае индекс иммунитета снижался до 25,6. Мы предполагаем, что, по-видимому, увеличение антигенной нагрузки на макроорганизм ведет к супрессии иммунитета.

Обобщая эти экспериментальные данные и результаты, полученные на предыдущих этапах исследования, можно сделать вывод, что оптимальная иммунизирующие доза рекомбинантного ПА для мышей линии ВАЬВ/с составляет 10 мкг, для морских свинок - 25 мкг, для кроликов - 50 мкг.

На модели линейных мышей нами установлено, что изменение схемы иммунизации за счет повышения кратности введения препарата не приводит к увеличению протективности. У линейных мышей, иммунизированных трехкратно (с одинаковым интервалом в 14 дней) 10 мкг ПА, показатель ЛД50 составил

1,9 • 104 спор, индекс иммунитета - 39,8. При двукратной схеме иммунизации той же дозой ПА индекс иммунитета был 158,5.

Принципиальным моментом оценки эффективности создаваемых вакцин является определение продолжительности создаваемого ими иммунитета. В серии экспериментов нами показано, что иммунизация линейных мышей, морских свинок и кроликов препаратом ПА, полученного из генно-инженерного продуцента В. anthracis 55ATnA-l(Spo'), стимулирует развитие иммунного ответа с относительно высокими титрами анти-ПА антител в период от 2 до 4,5 месяцев. Протективную активность в отдаленные сроки исследовали на модели линейных мышей. Лабораторных животных иммунизировали двукратно препаратом ПА в дозе 10 мкг в сочетании с адъювантом. Заражение тест-штаммом В. anthracis 71/12 осуществляли через 21 день (первая группа), 2 месяца (вторая группа) и 4 месяца (третья группа) от последней инъекции антигенного препарата. Индекс иммунитета в случае заражения биомоделей возбудителем сибирской язвы через 21 день был равен 39,8, при заражении через два месяца - 25,1, через 4 месяца -19,9.

Кроме того, на модели морских свинок тестировали комбинированную схему иммунизации. Лабораторным животным сначала вводили дозу 5 • 106 спор штамма Б. anthracis СТИ-1, а в конце поствакцинального периода (через 21 день) 25 мкг очищенного рекомбинантного ПА в сочетании с адъювантом. Индексы иммунитета у особей, иммунизированных по комбинированной схеме, а также вакцинным штаммом в дозе 5 • 10 спор, были почти одинаковыми -3548,0 и 3980,1. Полученные результаты свидетельствуют о возможности уменьшения вводимой дозы вакцинного штамма при дополнительной однократной иммунизации рекомбинантным антигеном.

Таким образом, протективный антиген, полученный из генно-инженерного аспорогенного протеазодефицитного штамма В. anthracis 55ATTIA-l(Spo"), обладает высокой иммуногенностью и протективностью и характеризуется отсутствием реактогенности, что определяет перспективность использования данного иммуногенного антигена в качестве основы высокоэффективной и ареактогенной химической сибиреязвенной вакцины. Добавление в рецептуру бесклеточного профилактического препарата белка S-слоя сибиреязвенного микроба ЕА1, усиливающего выраженность защиты лабораторных животных от заражения сибиреязвенными штаммами, позволяет еще более повысить его эффективность.

Таким образом, по результатам проведенных испытаний нами предложены прототипы химических сибиреязвенных вакцин, содержащие рекомбинант-ный протективный антиген, выделенный из штамма В. anthracis 55АТПА-1 (Spo"), или рекомбинантный протективный антиген в сочетании с белком S-слоя ЕА1.

Настоящее исследование проведено в русле одного из самых актуальных направлений разработки сибиреязвенных профилактических препаратов нового поколения - использование в качестве их основы иммуногенных продуктов, синтезируемых генно-инженерными штаммами. Успешные работы аналогичного плана широко проводятся в настоящее время в зарубежных лабораториях (Keitel W., 2006; Gorse G. et al., 2006; Vahedi F. et al., 2009; Chawla A. et al., 2009).

Совершенствование разработанных препаратов для профилактики сибирской язвы, по нашему мнению, целесообразно вести, в первую очередь, по пути подбора эффективных адъювантов, разрешенных для использования в практике здравоохранения. В то же время, нельзя исключать возможности дальнейших поисков дополнительных антигенных компонентов клеток В. anthracis, стимулирующих иммунный ответ макроорганизма. Среди потенциальных кандидатов на включение в состав сибиреязвенных профилактических рецептур можно рассматривать споровые антигены (Brossier F. et al., 2002; Gauthier Y. et al., 2009; Cybulski R. et al., 2008), a также биомолекулы, обнаруженные N. Ariel et al. (2002,2003) и О. Gat et al. (2006) в результате биоинформационного скрининга.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Попова, Полина Юрьевна, Саратов

1. Ашмарин И.П., Воробьев А А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. JL: Медгиз, 1962. 180 с.

2. Бургасов П.Н., Рожков Г.Н. Метод оценки противосибиреязвенного иммунитета по превентивным свойства сыворотки // Журн. микробиол., эпидем. и иммун. 1972. - № 6. - С. 124-134.

3. Бургасов П.Н., Черкасский Б.Л., Кноп А.Г., Утегенов К.Д. Эпидемиологическая эффективность сибиреязвенной вакцины СТИ // Журн. микробиол., эпидем. и иммун. 1976. - № 9. - С. 27-35.

4. Бывалов A.A. Методические подходы к идентификации протективных антигенов для разработки химических вакцин // Молекулярная медицина. -2011.-№6.-С. 19-24.

5. Гончарова А.Ю. Выделение, биохимическая и иммунобиологическая характеристика белков S-слоя сибиреязвенного микроба: Дис. канд. биол. наук. Саратов, 2007. - 137 с.

6. Кравцов А.Л. Микрофлуориметрическое исследование в потоке гетерогенных популяций бактерий У. pestis и клеток иммунной системы инфицированных чумой лабораторных животных: Дис. докт. биол. наук. Саратов, 1997.-239 с.

7. Кудрявцева О.М. Генетическое конструирование штаммов продуцентов протективного антигена Bacillus anthracis: Дис. канд. биол. наук. - Саратов, 2007. - 134 с.

8. Лившиц Ю.И. Требования к качеству лабораторных грызунов и условия их содержания // Руководство по вакцинному и сывороточному делу. М.: Медицина, 1978. - С. 24-36.

9. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Молекулярное клонирование. Пер. с англ. М.: Мир, 1984. - 479 с.

10. Ю.Маринин Л.И., Онищенко Г.Г., Кравченко Т.Б., Дятлов И.А., Тюрин Е.А., Степанов A.B., Никифоров В.В. Сибирская язва человека: эпидемиология, профилактика, диагностика, лечение. М.: ЗАО МП «Гигиена». - 2008. - 416 с.

11. Медицинские лабораторные технологии. Т.1. Справочник // Под ред.

12. A.И. Карпищева СПб.: Интермедика, 2002. - 408 с.

13. Микшис Н.И. Прототипы сибиреязвенных вакцин на основе генно-инженерных бациллярных штаммов и синтезируемых ими антигенов: Дис. докт. мед. наук. Саратов, 2009. - 297 с.

14. Микшис Н.И., Кудрявцева О.М., Шулепов Д.В., Гончарова А.Ю., Болотникова М.Ф., Новикова JI.B., Попов Ю.А., Кутырев В.В. Аспорогенный ре-комбинантный продуцент протективного антигена сибиреязвенного микроба // Биотехнология. 2010. - № 4. - С. 25-33.

15. Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности (МУ 1.3.2569-09): Методические указания. М. 2009.-38 с.

16. Основные требования к вакцинным штаммам сибиреязвенного микроба для иммунизации людей (МУ 3.3.1.1112-02): Методические указания. М., 2002.-47 с.

17. Пименов Е.В., Дармов И.В., Васильев Н.Т., Кожухов В.В., Бондарев

18. B.П., Кутырев В.В., Комоско Г.В., Сероглазов В.В., Шевцов А.Н., Строчков Ю.И. Состояние вопроса и перспективы разработки вакцин против сибирской язвы // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2002. - №5. - С. 42-46.

19. Половинкина B.C., Марков Е.Ю. Структура и иммуноадъювантные свойства CpG-ДНК // Медицинская иммунология. 2010. - Т. 12. - № 6. - С. 469-476.

20. Приказ МЗ СССР №755 от 12.08.77 г. «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных»

21. Ройт А., Бростофф Д., Мейл Д. Иммунология // Пер. с англ. М.: «Мир». - 2000. - 592 с.

22. Санитарные правила «Безопасность работы с микроорганизмами 1-И групп патогенности (опасности)» СП 1.3.1285-03 // Бюллетень нормативных и методических документов Госсанэпиднадзора. 2003. - Вып. 3 (13). - № 9. -104 с.

23. Санитарные правила «Безопасность работы с микроорганизмами Ш-IV групп патогенности (опасности)» СП 1.3.2322-08 // Бюллетень нормативных и методических документов Госсанэпиднадзора. 2008. - 49 с.

24. Семенов Б.Ф., Зверев В.В., Хаитов P.M. Прогноз развития вакцино-профилактики в первые десятилетия XXI века // Иммунология. — 2009. № 6. -С. 324 -335.

25. Сибирская язва. Под ред. С.Г. Колесова. М.: Колос, 1976. - 228с.

26. Симбирцев A.C. Толл-белки: специфические рецепторы неспецифического иммунитета // Иммунология. 2005. - № 6. - С. 368 - 377.

27. Супотницкий М.В. Бактериальные токсины. Их природа, механизмы действия, возможности конструирования гибридных и модифицированных токсинов // Биопрепараты. 2011. - №1. - С. 6-15.

28. Тучков И. В. Конструирование и внедрение в практику генодиагностической тест-системы для выявления ДНК возбудителя сибирской язвы // Автореф. дис. . канд. мед. наук. Саратов, 2005. - 19 с.

29. Черкасский Б.Л. Эпидемиология и профилактика сибирской язвы. М.: «Интерсэн», 2002. 384 с.

30. Шулепов Д.В. Аспорогенный рекомбинантный штамм Bacillus anthra-cis продуцент протективного антигена сибиреязвенного микроба: Дис. канд. биол. наук. - Саратов, 2009. - 124 с.

31. Auerbach S., Wright G. Studies on immunity in anthrax. VI. Immunizing activity of protective antigen against various strains of Bacillus anthracis // J. Immunol. 1955.-V. 75.-P. 129-133.

32. Bagheri V., Motamedi H., Reza M., Shapouri S. An efficient fusion protein system for expression of Bacillus anthracis protective antigen as immunogenic and diagnostic // Asian Pacific J. of Trop. Med. 2010. - P. 765-768.

33. Baillie L. Is new always better than old? The development of human vaccines for anthrax // Hum Vaccin. 2009. - V. 5. - P. 806-816.

34. Baillie L., Hebdon R., Flick-Smith H., Williamson D. Characterisation of the immune response to the UK human anthrax vaccine // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2003. - V. 36. - № 1-2. - P. 83 - 86.

35. Baillie L., Moir A., Manchee R. The expression of the protective antigen of Bacillus anthracis in Bacillus subtilis II J. Appl. Microbiol. 1998. - V. 84. - №5. - P. 741-746.

36. Barnard J., Friedlander A. Vaccination against anthrax with attenuated recombinant strains of Bacillus anthracis that produce protective antigen // Infect. Immun. 1999. - V. 67. - № 2. - P. 562-567.

37. Barth H., Aktories K., Popoff M., Stiles B. Binary bacterial toxins: biochemistry, biology, and applications of common Clostridium and Bacillus proteins // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2004. - V. 68. - № 3. - P. 373-402.

38. Basu S., Kang T., Chen W., Fenton M., Baillie L., Hibbs S., Cross A. Role of Bacillus anthracis spore structures in macrophage cytokine responses // Infect. Immun. 2007. - V. 75 - P. 2351-2358.

39. Belton F., Darlow H., Henderson D. The use of anthrax antigen to immunise man and monkey // Lancet. 1956. - V. 271. - P. 476-479.

40. Bienek D., Loomis L., Biagini R. The anthrax vaccine: no new tricks for an old dog // Hum. Vaccin. 2009. - V. 5. - P. 184-189.

41. Bourgogne A., Drisdale M., Hilsenbeck S., Peterson S., Koehler T. Global effect of virulence gene regulators in a Bacillus anthracis strain with both virulence plasmid // Infect. Immun. 2003. - V. 71. - №. 5. - P. 2736 - 2743.

42. Brachman P., Friedlander A., Grabenstein J. In: Vaccines by Plotkin S., Orenstein W., Offit P. 2008. - 1748 p.

43. Brachman P., Gold H., Plotkin S., Fekety F., Werrin M., Ingraham N. Field evaluation of human anthrax vaccine // Am. J. Public Health. 1962. - V. 52. P. 632645.

44. Bradley K., Mogridge J., Mourez M., Collier R., Young J. Identification of the cellular receptor for anthrax toxin // Nature. 2001. - V. 414. - P. 225 - 229.

45. Brossier F., Levy M., Mock M. Anthrax spores make an essential contribution to vaccine efficacy // Infect. Immun. 2002. - V. 70. - № 2. - P. 661- 664.

46. Buchanan T., Feeley J., Hayes P., Brachman P. Anthrax indirect microhe-magglutination test // J. Immunol. 1971. - V. 107. - P. 1631-1636.

47. Campbell J., Clement K., Wasserman S., Donegan S., Chrisley L., Kotloff K. Safety, reactogenicity and immunogenicity of a recombinant protective antigen anthrax vaccine given to healthy adults // Hum. Vaccine. 2007. - V.3. - P. 205-211.

48. Centers for Disease Control and Prevention. Use of Anthrax Vaccine in the United States: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices (ACIP) // Morb. Mortal. Wkly. Rep. 2000. - V. 19. - P. 5-7.

49. Centers for Disease Control and Prevention. Use of Anthrax Vaccine in the United States: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices (ACIP) // Morb. Mortal. Wkly. Rep. 2009. - V. 59.

50. Chabot D., Scorpio A., Tobery S., Little S., Norris S., Friedlander A. Anthrax capsule vaccine protects against experimental infection // Vaccine. 2004. -V. 23.-№ l.-P. 43-47.

51. Chauhan V., Singh A., Waheed S., Singh S., Bhatnagar R. Constitutive expression of protective antigen gene of Bacillus anthracis in Escherichia coli II Bio-chem. Biophys. Res. Commun. 2001. - V. 283. - № 2. - P. 308-315.

52. Chawla A., Midha S., Bhatnagar R. Efficacy of recombinant anthrax vaccine against Bacillus anthracis aerosol spore challenge: preclinical evaluation in rabbits and Rhesus monkeys // Biotechnol. J. 2009. - V. 4. - P. 391-399.

53. Chitlaru T., Altboum Z., Reuveny S., Shafferman A. Progress and novel strategies in vaccine development and treatment of anthrax // Immunol. Rev. — 2011. -V. 239. -№ l.-P. 221 -236.

54. Chitlaru T., Gat O., Grosfeld H., Inbar I., Gozlan Y., Shafferman A. Identification of in vzvo-expressed immunogenic proteins by serological proteome analysis of the Bacillus anthracis secretome // Infect. Immun. 2007. - V. 75. - № 6. - P. 2841-2852.

55. Coeshott C., Smithson S., Verderber E., Samaniego A., Blonder J., Rosenthal G., Westerink M. PluronicR F127-based systemic vaccine delivery systems // Vaccine. 2004. - V. 22. - P. 2396-2405.

56. Cybulski R., Sanz P., McDaniel D., Darnell S., Bull R., O' Brien A. Recombinant Bacillus anthracis spore proteins enhance protection of mice primed with suboptimal amounts of protective antigen // Vaccine 2008. - V. 26. - № 38. - P. 4927-4939.

57. Dai Z., Sirard J., Mock M., Kochler T. The atxA gene product activates transcription of the anthrax toxin genes and is essential for virulence // Mol. Microbiol.-1995.-V. 16.-P. 1171-1181.

58. Donegan S., Bellamy R., Gamble C. Vaccine for preventing anthrax // Cochrane Database Syst. Rev. 2009. - CD006403.

59. Duesbery N., Vande Woude G. Anthrax lethal factor causes proteolytic in-activation of mitogen-activated protein kinase kinase // J. Appl. Microbiol. 1999.-V. 87.-№2.-P.289-293.

60. Dumetz F., Jouvion G., Khun H., Glomski I., Corre J., Rougeaux C., Tang W., Mock m., Huerre M., Goossens P. Noninvasive imaging technologies reveal edema toxin as a key virulence factor in anthrax // Am. J. Pathol. 2011. - V. 178. - № 6.-P. 2523-2535.

61. Durand V., Wong S., Tough D., Le Bon A. Shaping of adaptive immune response to soluble proteins by TLR agonists: a role for IFN-alpha/beta // Immunol. Cell Biol. 2004. - V. 82. - № 6. - P. 596 - 602.

62. European Convention for the protection of Vertebrate Animals Used for Experimental and Other Scientific Purposes. 1985. - 3pp.

63. Ezzell J., Abshire T. Immunological analysis of cell-associated antigens of Bacillus anthracis II Infect. Immun. 1988. - V. 56. - № 2. - P. 349 - 356.

64. Farchaus J., Ribot W., Jendrek S., Little S. Fermentation, purification, and characterization of protective antigen from a recombinant, avirulent strain of Bacillus anthracis II Appl. Environ. Microbiol. 1998. - V. 64. - № 3. - P. 982-991.

65. Fellows P., Linscott M., Little S., Gibbs P., Ivins B. Anthrax vaccine efficacy in golden Syrian hamsters // Vaccine. 2002. - V. 20. - P. 1421-1424.

66. Flick-Smith H., Waters E., Walker N., Miller J., Stagg A., Green M., Williamson E. Mouse model characterization for anthrax vaccine development: comparison of one inbred and one outbred mouse strain // Microb. Pathog. 2005. -V. 38. -P. 33-40.

67. Fouet A., Mesnage S., Tosi-Couture E., Gounon P., Mock M. Bacillus anthracis surface: capsule and S-layer // J. Appl. Microbiol. 1999. - V. 87. - № 2. - P. 251-255.

68. Friedlander A., Little S. Advances in the development of next-generation anthrax vaccines // Vaccine. 2009. - D. 28-32

69. Friedlander A., Pittman P., Parker G. Anthrax vaccine: evidence for safety and efficacy against inhalational anthrax // JAMA. 1999. - V. 282. - P. 2104-2106.

70. Fritz D., Jaax N., Lawrence W., Davis K., Pitt M., Ezzell J., Friedlander A. Pathology of experimental inhalation anthrax in the rhesus monkey // Lab. Invest. -1995.- V. 73. P. 691-702.

71. Gat O., Grosfeld H., Ariel N. Search for Bacillus anthracis potential vaccine candidates by a functional genomic-serologic screen // Infect. Immun. 2006. -V. 74. - № 7. - P. 3987-4001.

72. Gauthier Y., Tournier J., Paucod J., Corre J., Mock M., Goossens P., Vidal D. Efficacy of a vaccine based on protective antigen and killed spores against experimental inhalation anthrax // Infect. Immun. 2009. - V. 77. - № 3. - P. 1197- 1207.

73. Glomski I., Corre J., Mock M., Goossens P. Cutting edge: IFN-gamma-producing CD4 T lymphocytes mediate spore-induced immunity to capsulated Bacillus anthracis II J. Immunol. 2007(a). - V. 178. - № 5. - P. 2646 - 2650.

74. Glomski I., Fritz J., Keppler S., Bailoy V., Chignard M., Mock M., Goossens P. Murine splenocytes produce inflammatory cytokines in a MyD88-dependent response to Bacillus anthracis spores // Cell Microbiol. 2007(6). - V. 9. - № 2. - P. 502-513.

75. Goodman J., Nitecki D. Immunochemical studies on the poly-gamma-D-glutamyl capsule of Bacillus anthracis. I. Characterization of polypeptide and of the specificity of its reaction with rabbit antisera // Biochemistry. 1966. - V. 5. - № 2. -P. 657-665.

76. Goossens P. Animal models of human anthrax: the quest for the Holy Grail // Mol. Aspects Med. 2009. - V. 30. - № 6. - P. 467 - 480.

77. Grunow R., Porsch-Ozcürümez M., Splettstoesser W., Buckendahl A., Hahn U., Beyer W., Böhm R., Huber M., vd Esche U., Bessler W., Frangoulidis D., Finke E. Monitoring of ELISA-reactive antibodies against anthrax protective antigen

78. PA), lethal factor (LF), and toxin-neutralizing antibodies in serum of individuals vaccinated against anthrax with the PA-based UK anthrax vaccine // Vaccine. 2007. -V. 25.-P. 3679-3683.

79. Gupta P., Waheed S., Bhatnagar R. Expression and purification of the recombinant protective antigen of Bacillus anthracis II Protein Expr. Purif. 1999. - V. 16. - № 3. - P. 369-376.

80. Gwinn W., Zhang M., Mon S., Sampey D., Zukauskas D., Kassebaum C., Zmuda J., Tsai A., Laird M. Scalable purification of Bacillus anthracis protective antigen from Escherichia coli II Protein Expr. Purif. 2006. - V. 45. - P. 30-36.

81. Hammerstrom T., Roh J., Nikonowicz E., Koehler T. Bacillus anthracis virulence regulator AtxA: oligometric state, function and CCVsignalling // Mol. Microbiol. 2011. - V. 82. - № 3. - P. 634 - 647.

82. Hanna P., Ireland J. Understanding Bacillus anthracis pathogenesis // Trends Microbiol. 1999. -V. 7. - P. 180-182.

83. Hanson J., Taft S., Weiss A. Neutralizing antibodies and persistence of immunity following anthrax vaccination // Clin. Vaccine Immunol. 2006. - V. 13. -P. 208-213.

84. Hering D., Thompson W., Hewetson J., Little S., Norris S., Pace-Templeton J. Validation of the anthrax lethal toxin neutralization assay // Biologicals. 2004.-V 32.-P. 17-27.

85. Hoebe K., Janssen E., Beutler B. The interface between innate and adaptive immunity // Nat. Immunol. 2004. - V. 5. - № io. - P. 971 - 974.

86. Ivins B. Welkos S. Recent advances in the development of an improved, human anthrax vaccine // Eur. J. Epidemiol. 1988. - V. 4. - P. 12-19.

87. Ivins B., Fellows P., Nelson G. Efficacy of a standard human anthrax vaccine against Bacillus anthracis spore challenge in guinea pigs // Vaccine 1994. -V. 12.-№10.-P. 872-874.

88. Ivins B., Welkos S., Little S., Crumrine M., Nelson G. Immunization against anthrax with Bacillus anthracis protective antigen combined with adjuvants // Infect. Immun. 1992. - V. 60. - № 2. - P. 662 - 668.

89. Ivins B., Ezzell J., Jemski J., Hedlund K., Ristroph J., Leppla S. Immunization studies with attenuated strains of Bacillus anthracis II Infect. Immun. 1986. -V. 52.-№2.-P. 454-458.

90. Janssens S., Beyaert R. Role of Toll-like receptors in pathogen recognition // Clin. Microbiol. Rev. 2003. - V. 16. - P. 637-646.

91. Johnson-Winegar A. Comparison of enzyme-linked immunosorbent and hemagglutination assays for determining anthrax antibodies // J. Clin. Microbiol. -1984. -V. 20.-P. 357-361.

92. Kang T., Fenton M., Weiner M., Hibbs S., Basu S., Baillie L., Cross A. Murine macrophages kill the vegetative form of Bacillus anthracis II Infect. Immun. -2005. V. 73 - P. 7495-7501.

93. Kawai T., Akira S. The roles of TLRs, RLRs and NLRs in pathogen recognition // Int. Immunol. 2009. - V. 21. - № 4. - P. 317 - 337.

94. Keitel W. Recombinant protective antigen 102 (rPA102): Profile of second-generation anthrax vaccine //Expert Rev Vaccines. 2006. - V. 5. - P. 417430.

95. Kim S., Park S., Kim H., Cho Y., Kim K., Kim Y., Chun J., Lee N. Enhancement of the immune response s of mice to Bacillus anthracis protective antigen by CIA07 combined with Alum II Arch. Pharm. Res. 2008. - V. 31. - P. 13851392.

96. Klinman D. CpG oligonucleotides accelerate and boost the immune response elicited by AVA, the licensed anthrax vaccine // Expert Rev. Vaccines. -2006(a).-V. 5.-P. 365-369.

97. Klinman D., Xie H., Ivins B. CpG oligonucleotides improve the protective immune response induced by the licensed anthrax vaccine //Ann. N.Y. Acad. Sei. 2006(6).-V. 1082.-P. 137-140.

98. Klinman D., Xie H., Little S., Currie D., Ivins B. CpG oligonucleotides improve the protective immune response induced by the anthrax vaccination of rhesus macaques // Vaccine. 2004. - V. 22. - P. 2881-2886.

99. Koehler T. Bacillus anthracis physiology and genetics // Mol. Aspects Med. 2009. - V. 30. - P. 386-396.

100. Koehler T., Dai Z., Kaufman-Yarbray M. Regulation of the Bacillus anthracis protective antigen gene: CO2 and a trans-acting element activate transcription from one of two promoters. // J. Bacteriol. 1994. - V. 176. - P. 586 - 595.

101. Kubler-Kielb J., Liu T., Mocca C., Majadly F., Robbins J., Schneerson R. Additional conjugation methods and immunogenicity of Bacillus anthracis poly-gamma-D-glutamic acid-protein conjugates // Infect. Immun. 2006. - V. 74. - № 8. P. 4744 - 4749.

102. Kumar P., Ahuja N., Bhatnagar R. Anthrax edema toxin requires influx of calcium for inducing cyclic AMP toxicity in target cells // Infect. Immun. 2002. -V. 70. - № 9. - P. 4997 - 5007.

103. Leppla S. Anthrax toxin edema factor: a bacterial adenylate cyclase that increases cyclic AMP concentrations in eukaryotic cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982. - V. 79. - P. 3162-3166.

104. Li H., Soroka S., Taylor T., Stamey K., Stinson K., Freeman A., Abram-son D., Desai R., Cronin L., Oxford J., Caba J., Pleatman C., Pathak S., Schmidt D.,

105. Semenova V., Martin S., Wilkins P., Quinn C. Standardized, mathematical modelbased and validated in vitro analysis of anthrax lethal toxin neutralization // J. Immunol. Methods. 2008. - V. 333. - P. 89-106.

106. Little S. Knudson G. Comparative efficacy of Bacillus anthracis Live spore vaccine and protective antigen vaccine against anthrax in the guinea pig // Infect. Immun. 1986. -V. 52. - P. 509-512.

107. Little S., Ivins B., Fellows P., Pitt M., Norris S., Andrews G. Defining a serological correlate of protection in rabbits for a recombinant anthrax vaccine // Vaccine. 2004. - V. 22. - P. 422-430.

108. Little S., Ivins B., Webster W., Norris S., Andrews G. Effect of aluminum hydroxide adjuvant and formaldehyde in the formulation of rPA anthrax vaccine // Vaccine. 2007. - V. 25. - № 15. - 2771-2777.

109. Lii J., He R., Dong M., Zhang L., Wang X. Immunological dynamics in response to two anthrax vaccines in mice // Sci. China C. Life Sci. 2008. - V. 51. -№10.-P. 872-878.

110. Lu J., Wei D., Wang Y., Wang G. High-level expression and single-step purification of recombinant Bacillus anthracis protective antigen from Escherichia coli // Biotechnol. Appl. Biochem. 2009. - V. 52. - P. 107-112.

111. Marcus H., Danieli R., Epstein E., Velan B., Shafferman A., Reuveny S. Contribution of immunological memory to protective immunity conferred by a Bacillus anthracis protective antigen-based vaccine //Infect. Immun. 2004. - V. 72. - P. 3471-3477.

112. Mbow M., De Gregorio E., Valiante N., Rappuoli R. New adjuvants for human vaccines // Curr. Opin. Immunol. 2010. - V. 22. - P. 411-416.

113. McBride B., Mogg A., Telfer J., Lever M., Miller J., Turnbull P., Baillie L. Protective efficacy of a recombinant protective antigen against Bacillus anthracis challenge and assessment of immunological markers // Vaccine. 1998. - V. 16. - P. 810-817.

114. Medzhitov R., Janeway C. Innate immunity: the virtues of nonclonal system of recognition // Cell. 1997. - V. 91. - № 3. - P. 295 - 298.

115. Mesnage S., Tosi-Couture E., Gounon P., Mock M., Fouet A. The capsule and S-layer: two independent and yet compatible macromolecular structures in Bacillus anthracis II J. Bacterid. 1998. - V. 180. -№ 1. - P. 52-58.

116. Mignot T., Mock M., Fouet A. A plasmid-encoded regulator couples the synthesis of toxins and surface structures in Bacillus anthracis II Mol. Microbiol. -2003. V. 47. - № 4. - P. 917-927.

117. Moayeri M., Leppla S. Cellular and systemic effects of anthrax lethal toxin and edema toxin // Mol. Aspects Med. 2009. - V. 30. - № 6. - P. 439 - 455.

118. Mock M., Fouet A. Anthrax // Microbiol. Rev. 2001. - V. 55. - P. 647671.

119. Nitecki D., Goodman J. Immunochemical studies on the poly-gamma-D-glutamyl capsule of Bacillus anthracis. II. The synthesis of eight dipeptides and four tripeptides of glutamic acid // Biochemistry. 1966. - V. 5. - № 2. - P. 665-673.

120. O'Brien J., Friedlander A., Dreier T., Ezzell J., Leppla S. Effects of anthrax toxin components on human neutrophils // Infect. Immun. 1985. - V. 47. - № l.-P. 306-310.

121. Park J., Ng V., Maeda S., Rest R., Karin M. Anthrolysin O and other gram-positive cytolysins are toll-like receptor 4 agonists // J. Exp. Med. 2004. - V. 200.-№ 12.-P. 1647- 1655.

122. Perrie Y., Mohammed A., Kirby D., McNeil S., Bramwell V. Vaccine adjuvant systems: enhancing the efficacy of sub-unit protein antigens // Int. J. Pharm.- 2008. V. 364. - P. 272-280.

123. Pezard C., Weber M., Sirard J., Berche P., Mock M. Protective immunity induced by Bacillus anthracis toxin-deficient strains // Infect. Immun. 1995. - V. 63. - P.1369-1372.

124. Phipps A., Premanandan C., Barnewall R., Lairmore M. Rabbit and nonhuman primate models of toxin-targeting human anthrax vaccines // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2004. - V. 68. - P. 617-629.

125. Pitt M., Little S., Ivins B., Fellows P., Barth J., Hewetson J., Gibbs P., Dertzbaugh M., Friedlander A. In vitro correlate of immunity in rabbit model of inha-lational anthrax // Vaccine. 2001. - V. 19. - P. 4768-73.

126. Pitt M., Ivins B., Estep J. Comparison of the efficacy of purified protective antigen and MDPH to protect non-human primates from inhalation anthrax // Salisbury Med. Bull. Suppl. 1996. - V. 87. -P.130.

127. Pittman P., Leitman S., Oro J., Norris S., Marano N., Ranadive M., Sink

128. B., McKee K. Protective antigen and toxin neutralization antibody patterns in anthrax vaccines undergoing serial plasmapheresis // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2005. -V. 12.-P. 713-721

129. Popov S., Villasmil R., Bernardi J., Grene E., Cardwell J., Popova T., Wu A., Alibek D., Bailey C., Alibek K. Effects of Bacillus anthracis lethal toxin on human peripheral blood mononuclear cells // FEBS Lett. 2002. - V. 527. - P. 211215.

130. Quinn C., Dull P., Semenova V., Li H., Crotty S., Taylor T., Steward-Clark E., Stamey K., Schmidt D., Stinson K., Freeman A., Elie C., Martin S., Greene

131. C., Aubert R., Glidewell J., Perkins B., Ahmed R., Stephens D. Immune responses to Bacillus anthracis protective antigen in patients with bioterrorism-related cutaneous or inhalation anthrax // J. Infect. Dis. 2004. - V. 190. - P. 1228-1236.

132. Reuveny S., White M., Adar Y., Kafri Y., Altboum Z., Gozes Y., Ko-biler D., Shafferman A., Velan B. Search for correlates of protective immunity conferred by anthrax vaccine // Infect. Immun. 2001. - V. 69 - P. 2888-2893.

133. Rhie G., Roehrl M., Mourez M., Collier R., Mekalanos J., Wang J. A dually active anthrax vaccine that confers protection against both bacilli and toxins // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. - V. 100. - № 19. - P. 10925-3995.

134. Ruthel G., Ribot W., Bavari S., Hoover T. Time-lapse confocal imaging of development of Bacillus anthracis in macrophages // J. Infect. Dis. 2004. - V. 189.- №7.-P. 1313-1316.

135. Sabet M., Cottam H. B., Guiney D.G. Modulation of cytokine production and enhancement of cell viability by TLR 7 and TLR 9 ligands during anthrax infection of macrophages // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2006. - V. 47. - P. 369-379.

136. Saile E., Koehler T. Control of anthrax toxin gene expression by the transition state regulator abrB II J. Bacteriol. 2002. - V. 184 - № 2. - P. 370 - 380.

137. Scobie H., Rainey G., Bradley K., Young J. Human capillary morphogenesis protein 2 functions as an anthrax toxin receptor // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003. - V. 100. - № 9. - P. 5170-5174.

138. Scorpio A., Blank T., Day W., Chabot D. Anthrax vaccines: Pasteur to present // Cell Mol. Life Sci. 2006. - V. 63. - P. 2237-2248.

139. Scorpio A., Chabot D., Day W., Hoover T., Friedlander A. Capsule de-polymerase overexpression reduces Bacillus anthracis virulence // Microbiology. -2010. V. 156. - P. 1459 - 1467.

140. Takeda K., Akira S. Toll-like receptors in innate immunity // Int. Immunol. 2005. - V. 17. - № 1. - P. 1 -14.

141. Thorne C., Belton F. An agar diffusion method for titrating Bacillus anthracis immunizing antigen and its application to a study of antigen production // J. Gen. Microbiol. 1957. - V. 17. - P. 505-516.

142. Thorne C., Gomez C., Housewright R. Synthesis of glutamic acid and glutamyl polypeptide by Bacillus anthracis. II. The effect of carbon dioxide on peptide production on solid media// J. Bacteriol. 1952. - V. 63. - P. 363 - 368.

143. Tonello F., Montecucco C. The anthrax lethal factor and its MAPK ki-nase-specific metalloprotease activity // Mol. Aspects Med. 2009. - V. 30. - № 6. -P. 431-438.

144. Triantafilou M., Uddin A., Maher S., Charalambous N., Hamm T.,

145. Alsumaiti A., Triantafilou K. Anthrax toxin evades Toll-like receptor recognition? Whereas its cell wall components trigger activation via TLR2/6 heterodimers // Cell Microbiol. 2007. - V. 9. - № 12. - P. 2880 - 2892.

146. Tross D., Klinman D. Effect of CpG oligonucleotides on vaccine-induced B cell memory // J. Immunol. 2008. - V. 181. - P. 5785-5790.

147. Turnbull P., Broster M., Carman J. Development of antibodies to protective antigen and lethal factor components of anthrax toxin in humans and guinea pigs and their relevance to protective immunity // Infect. Immun. 1986. - V. 52. - P. 356363.

148. Uchida I., Hornung J., Thorne C., Klimpel K., Leppla S. Cloning and characterization of a gene whose product is a trans-activator of anthrax toxin synthesis // J. Bacteriol. 1993(a). - V. 175. - P. 5329 -5338.

149. Vitale G., Bernardi L., Napolitani G., Mock M., Montecucco C. Susceptibility of mitogen-activated protein kinase kinase family members to proteolysis by anthrax lethal factor // J. Biochem. 2000. - V. 352. - P. 739-745.

150. Vodkin M., Leppla S. Cloning of the protective antigen gene of Bacillus anthracis II Cell. 1983. - V. 34. - P. 693-697.

151. Vuyisich M., Sanders C., Graves S. Binding and cell intoxication studies of anthrax lethal toxin // Mol. Biol. Rep. 2012. Epub ahead of print.

152. Weiss S., Levy H., Fisher M., Kobiler D., Altboum Z. Involvement of TLR2 in innate response to Bacillus anthracis infection // Innate Immun. 2009. -V. 15.-P. 43-51.

153. Welkos S., Friedlander A., Weeks S., Little S., Mendelson I. In-vitro characterization of the phagocytosis and fate of anthrax spores in macrophages and the effects of anti-PA antibody // J. Med. Microbiol. 2002. - V. 51. - №> 10. - P. 821831.

154. Welkos S., Keener T., Gibbs P. Differences in susceptibility of inbred mice to Bacillus anthracis II Infect. Immun. 1986. - Vol. 51. - P. 795-800.

155. Welkos S., Little S., Friedlander A., Fritz D., Fellows P. The role of antibodies to Bacillus anthracis and anthrax toxin components in inhibiting the early stages of infection by anthrax spores // Microbiology. 2001. - V. 147. - P. 16771685.

156. Wright G. Green T., Kanode R. Studies on immunity in anthrax. V. Immunizing activity of alum-precipitated protective antigen // J. Immunol. 1954. - V. 73.-P. 387-391.

157. Wu C., Hayashi T., Takabayashi K., Sabet M., Smee d., Guiney D., Cot-tam H., Carson D. Immunotherapeutic activity of a conjugate of a Toll-like receptor 7 ligand // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007. - V. 104. - № 10. - P. 3990-3995.

158. Wu C., Sabet M., Hayashi T. In vivo efficacy of a phosphodiester TLR9 aptamer and its beneficial effect in a pulmonary anthrax infection model // Cell. Immunol. 2008. - V. 251. - P. 78-85.

159. Zeng M., Xu Q., Pichichero M. Protection against anthrax by needle-free mucosal immunization with human anthrax vaccine // Vaccine. 2007. -V. 25. - P. 3588-3594.

160. Zhang Y., Qiu J., Zhou Y., Farhangfar F., Hester J., Lin A., Decker W. Plasmid-based vaccination with candidate anthrax vaccine antigens induces durable type 1 and type 2 T-helper immune responses // Vaccine 2008. - V. 26. - № 5. - P. 614-622.

Информация о работе

Попова, Полина Юрьевна
кандидата медицинских наук
Саратов, 2012
ВАК 03.02.03

Диссертация

Биологическая характеристика протективного антигена, синтезируемого аспорогенным рекомбинантным штаммом Bacillus anthracis - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Биологическая характеристика протективного антигена, синтезируемого аспорогенным рекомбинантным штаммом Bacillus anthracis - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы