Генетическое конструирование штаммов - продуцентов протективного антигена Bacillus anthracis

Кудрявцева, Ольга Михайловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Генетическое конструирование штаммов - продуцентов протективного антигена Bacillus anthracis
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Генетическое конструирование штаммов - продуцентов протективного антигена Bacillus anthracis"

На правах рукописи

КУДРЯВЦЕВА Ольга Михайловна

ГЕНЕТИЧЕСКОЕ КОНСТРУИРОВАНИЕ ШТАММОВ - ПРОДУЦЕНТОВ ПРОТЕКТИВНОГО АНТИГЕНА В A CILL US ANTHRA CIS

03.00.07 - микробиология 03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ООЗ1G2292

Саратов — 2007

003162292

Работа выполнена в ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научные руководители

доктор биологических наук, профессор Попов Юрий Алексеевич кандидат медицинских наук Микшис Наталья Ивановна Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, доцент Бойко Андрей Витальевич, доктор медицинских наук, профессор Еременко Евгений Иванович,

Ведущая организация: ФГУЗ «Волгоградский научно-

исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Защита состоится " £ " 2007 г в ^^ часов на

заседании диссертационного совета Д 208 078 01 по присуждению ученой степени доктора (кандидата) наук при ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (410005, г Саратов, ул Университетская, 46)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»

Автореферат разослан_ ' 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, ,

старший научный сотрудник /1

Слудский А А

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования.

Сибирская язва является серьезной проблемой здравоохранения и ветеринарии Ежегодно практически во всех регионах мира регистрируются случаи заражения людей и животных этим опасным инфекционным заболеванием (Ипатенко H , 1996, Онищенко Г с соавт , 1999) Тенденции к ухудшению эпидемиологической ситуации по сибирской язве (Черкасский Б, 2002, Ясинский А с соавт, 2005), угроза и реальные случаи применения Bacillus anthracis в биотеррористических целях (Bush L et al, 2001, Jeringan J et al, 2001, Spencer R , Lightioot N , 2001) требуют дальнейшего совершенствования средств защиты и диагностики Рекомендованные для иммунопрофилактики людей и сельскохозяйственных животных живые вакцины получены в середине прошлого столетия классическими способами аттенуации вирулентных штаммов возбудителя сибирской язвы Относительно высокий уровень их реакто-генности (Степанов А с соавт, 1996, Turnbull Р et al, 1986, 1991, Ivins В , 1990) обусловлен наличием в геноме плазмиды pXOl, детерминирующей синтез трехкомпонентного токсина, состоящего из протек-тивного антигена, отечного и летального факторов Развитие иммунного ответа макроорганизма обусловливает преимущественно протективный антиген (ПА) токсина Отечный (ОФ) и летальный (ЛФ) факторы, взаимодействуя с протеолитически активированным ПА, образуют токсичные комплексы, запускающие патогенетические процессы сибиреязвенной инфекции (Leppla S , 1991)

Для производства менее реактогенных химических сибиреязвенных вакцин разработаны методы выделения и очистки ПА из культуральных фильтратов вакцинных штаммов В anthracis (Безносое M , 1997, Leppla S , 1988, Quinn С et al, 1988) Однако предложенные методики хроматографического разделения компонентов токсина, имеющих очень близкие значения молекулярных масс (ПА - 83 кДа, ОФ - 89 кДа, ЛФ -85 кДа), не позволяют получить иммуногенный препарат свободный от сопутствующих белков В минимальных количествах ОФ и ЛФ присутствуют в образцах всех химических вакцин, получаемых из аттенуиро-ванных штаммов, причем их содержание не нормировано и сильно варьирует Именно с наличием реактогенных примесей ОФ и ЛФ в препаратах химических сибиреязвенных вакцин, производимых в США и Великобритании, связывают возникновение нередких (у 30 % вакцинированных) аллергических реакций или даже некроза тканей на месте введения (Swanson-Biearman S , 2001)

Современные достижения биологической науки открывают новые возможности для создания менее реактогенных, но эффективных вакцинных препаратов Среди развиваемых генетических и молекулярно-биологических направлений одним из перспективных является клонирование генов синтеза факторов иммуногенности в гомо- и гетерологич-ных системах с целью создания живых вакцин и продуцентов протек-тивных антигенов

Молекулярные механизмы сохранения иммуногенности и снижения вирулентности аттенуированных культур стали понятны после установления плазмидной детерминации синтеза основных факторов патогенно-сти и иммуногенности В anthracis (Mikesell Р et al, 1983, Green В et al, 1985, Uchida 1 et al, 1985) В геноме В anthracis содержатся два высокомолекулярных репликона - pXOl (182 т п н ) и рХ02 (93,5 т п н ) В процессе аттенуации происходит элиминация плазмиды рХ02, обусловливающей синтез капсулы, защищающей микробную клетку от фагоцитоза, что приводит к неспособности штамма вызывать развитие специфического инфекционного процесса в организме хозяина Репликон pXOl содержит детерминанты су a, lef и pag, кодирующие синтез ОФ, ЛФ и ПА, составляющие сибиреязвенный экзотоксин, и регуляторные области - atxA и pagR, отвечающие за регуляцию синтеза токсина, капсулы и белков S-слоя (Hoftmaster А , Koehler Т , 1999, Okinaka R et al,

1999, Mignot T et al, 2003) Нуклеотидная последовательность клонированного участка плазмиды pXOl, ответственного за синтез ПА, установлена S Welkos et al (1988)

Впервые ген pag, детерминирующий синтез ПА, клонирован М Vodkin и S Leppla (1983) в штамме Escherichia coll Однако уровни продукции ПА рекомбинантными штаммами Е coll (5—10 нг/мл) были на несколько порядков ниже значений, установленных для вакцинного штамма В anthracis Sterne34F2 (15 мкг/мл) Впоследствии неоднократно предпринимались попытки клонирования гена pag в штаммах различных бактериальных видов Е coll (Gupta Р et al, 1999, Chauhan V et al, 2001), Salmonella typhimiirium (Coulson N , et al, 1994), Lactobacillus casei (Zegers N et al, 1999), В subtilis (Ivins В и Welkos S , 1986, Baillie L et al, 1998) , В anthracis (Barnard J , Friedlander A, 1999, Cohen S et al,

2000, Alom-Grinstein R et al, 2005) В большинстве случаев гибридные плазмиды при функционировании в гетерологичных системах оказывались нестабильными или не могли обеспечить высокой продукции ПА

успешной оказалась работа S Cohen с соавторами (2000), клонировавших структурный ген pagA под сильным промотором а-амилазы в штамме ß anthracis Сообщается о высокой секреции ПА (100 мкг/мл) Попытки дальнейшего усовершенствования генетических конструкций за смет использования еще более мощных промоторов не увенчались успехом (Gat О et al, 2003) Гиперсекреция ПА, с одной стороны, сопровождалась нестабильностью гибридных плазмид, с другой - вела к «секретируемому стрессу», выражающемуся в значительном снижении выработки антител к ПА К повышению продукции ПА приводят деле-ции или мутации в области негативной регуляции гена pag (Baillie L et al, 1998, Barnard J , Friedlander A et al, 1999) Гибридные плазмиды с делециями в pagR области получены В Ivins и S Welkos(1986)

Отечественными авторами также предпринимались попытки клонирования гена pag в гетерологичных системах - в вакцинных штаммах Francisella tularensis (Павлов В , Тедиков В , 1995), Yersinia pestis (Кис-личкина О с соавт , 1991, Алимов А, Павлов В, 1995), Е coli, В subtilis, Staphylococcus aureus (Тедиков В с соавт , 1993) Однако, до последнего времени в распоряжении отечественных ученых отсутствовали как стабильные векторные плазмиды, содержащие ген синтеза Г1А, так и эффективные рекомбинантные продуценты ПА

Таким образом, все вышеизложенное определяет актуальность планируемой диссертационной работы,

Цель диссертационной работы генно-инженерное конструирование эффективных и стабильных штаммов-продуцентов протективного антигена сибиреязвенного микроба

Основные задачи исследования:

1 Микробиологический анализ реципиентных и донорных штаммов для создания продуцентов протективного антигена, оптимизация метода трансформационной передачи гибридной ДНК в клетки В anthracis и В subtilis, поиск возможных способов селекции трансформантов, продуцирующих протективный антиген

2 Конструирование гибридных плазмид, содержащих ген синтеза протективного антигена, клонирование гена pag в гомо- и гетерологичных бациллярных штаммах

3 Получение и отбор рекомбинантных штаммов с высокой продукцией протективного антигена сибиреязвенного микроба

4 Изучение стабильности генно-инженерных штаммов-продуцентов протективного антигена in vitro и in vivo

5 Сравнение уровней продукции протективного антигена рекомби-нантными и вакцинными штаммами сибиреязвенного микроба с использованием биохимических и иммунохимических методов исследования

6 Изучение иммуногенных свойств сконструированных штаммов с клонированным геном pag на модели лабораторных животных Научная новизна исследования.

Впервые на основе бесплазмидных производных отечественных вакцинных штаммов В anthracis СТИ-1 и В anthracis 55 получены реком-бинантные штаммы, являющиеся эффективными продуцентами протек-тивного антигена

Сконструирована гибридная плазмида pUBllOPA-1, содержащая ген pag, стабильно функционирующая в составе бациллярных штаммов и обеспечивающая высокий уровень продукции протективного антигена сибиреязвенного микроба

Рекомбинантные штаммы В anthracis СТИАТПА-1, В anthracts 55АТПА-1 и В subtilis \¥В600АТПА-1 стабильны при пассировании in vitro и in vivo, обладают низкой активностью протеолитических ферментов и пятикратно превосходят вакцинные штаммы В anthracis СТИ-1 и В anthracis 55 по уровню продукции протективного антигена

В экспериментах на морских свинках и линейных BALB/c мышах показано, что рекомбинантные штаммы В anthracis СТИАТПА-1 и В subtilis \¥В600ДТПА-1, содержащие гибридную плазмиду pUBllOPA-1, обладают протективным эффектом, обеспечивая защиту лабораторных животных на уровне вакцинного штамма В an-thtacis СТИ-1

В Роспатент подана заявка № 2006122787 на патентование рекомби-нантного штамма В anthracis СТИАТПА-1 (pUBllOPA-1) - продуцента протективного антигена сибиреязвенного микроба (дата приоритета 26 06 2006 г )

Практическая ценность.

В Государственной коллекции патогенных бактерий "Микроб" депонированы рекомбинантные штаммы В anthracis КМ95 (В anthracis 55АТПА-1), В anthracis КМ96 (В antracis СТИАТПА-1) и В subtilis КМ 199 (5 subtilis WB600nA-1) Штаммы содержат гибридный репликон pUBllOPA-l, несущий ген pag Штаммы В anthracis 55АТПА-1, В antracis СТИАТПА-1 и В subtilis \¥В600ПА-1 являются безопасными, стабильными и эффективными продуцентами протективного антигена сибиреязвенного микроба - основного компонента химических сибиреязвенных вакцин и диагностических препаратов

В Государственной коллекции патогенных бактерий "Микроб" депонированы изогенные штаммы В anthracis КМ92(2) (В anthracis 55ДТ) -бесплазмидный производный вакцинного штамма В anthracis 55, и В anthracis КМ92(3) - (В anthracis 55ATSpo") - аспорогенный мутант бес-плазмидного производного штамма В anthracis 55 Штаммы предназна-

чены для использования в качестве реципиентов при осуществлении клонирования детерминантов иммуногенности сибиреязвенного микроба

По материалам диссертации составлены методические рекомендации "Комплекс методических подходов к определению продукции протек-тивного антигена сибиреязвенного микроба", одобренные Ученым советом РосНИПЧИ "Микроб" (протокол Ученого совета РосНИПЧИ "Микроб" №2 от 17 04 2007 г) и утвержденные директором РосНИПЧИ "Микроб"

Материалы диссертации используются в лекциях по генетике бактерий на курсах специализации и повышения квалификации врачей и биологов по особо опасным инфекциям при РосНИПЧИ «Микроб»

Основные положения, выносимые на защиту.

1 На основе протеазодефицитных бесплазмидных производных В anltacis СТИАТ, В anthracis 55АТ и В subtilis WB600 сконструированы штаммы-продуценты протективного антигена сибиреязвенного микроба Рекомбинантные штаммы В antracis СТИДТПА-1, В anthtacis 55ДТПА-1 и В subtilis WB600nA-l содержат гибридный репликон pUBllOPA-l (6,5 т п н ) с включенным в его состав геном pag

2 Сконструированные штаммы В antracis СТИДТПА-1, В anthracis 55ДТПА-1 и В subtilis WB600nA-l по уровню продукции протективного антигена (80 - 90 мкг/мл) пятикратно превосходят вакцинные культуры В anthracis СТИ-1 и В anthracis 55

3 Рекомбинантные штаммы В antracis СТИДТПА-1, В anthracis 55ДТПА-1 и В subtilis \УВ600ПА-1 сохраняют биологические свойства при пассировании in vitro и in vivo Гибридная плазмида pUBllOPA-l стабильно функционирует в составе бациллярных штаммов в условиях селективного давления, а также при чередовании пассажей на селективных и обычных средах

4 Генно-инженерные штаммы В anthracis СТИАТПА-1 и В subtilis WB600nA-l в иммунизирующей дозе (3 - 5 х 107спор) не обладают остаточной вирулентностью для мышей линии BALB/c и морских свинок и обеспечивают их эффективную защиту от заражения тест-штаммом возбудителя сибирской язвы

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на Всероссийской научно-практической конференции "Медицинская микробиология-XXI век" (г Саратов, 2004), Международной конференции "Молекулярная медицина и биобезопасность" (г Москва, 2004), Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов "Окружающая среда и здоровье"

(г Суздаль, 2005), VI Межгосударственной научно-практической конференции "Санитарная охрана территорий государств-участников СНГ проблемы биологической безопасности и противодействия биологическому терроризму в современных условиях" (г Волгоград, 2005), Российском медицинском форуме "Фундаментальная наука и практика" (г Москва, 2006), IX съезде всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (г Москва, 2007), итоговых научно - практических конференциях РосНИПЧИ "Микроб" (2004, 2005 и 2006 гг)

Публикации. Основное содержание работы отражено в 11 научных публикациях, из них статей в рекомендованных ВАК изданиях - 2

Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, списка принятых обозначений и сокращений, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 58 отечественных и 158 зарубежных источников Общий объем диссертации составляет 133 страницы машинописного текста Текст иллюстрирован 5 таблицами и 18 рисунками

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Материалы и методы. В работе использовали вакцинные штаммы -В anthracis СТИ-1 (Государственный институт стандартизации и контроля им Тарасевича (ГИСК) им J1А Тарасевича, г Москва) и В anthracis 55 (НИИ микробиологии МО РФ, г Киров), штамм В anthracis 2-я вакцина Ценковского (ГИСК им Л А Тарасевича), В anthracis Sterne34F2, бесплазмидные штаммы В anthracis СТИДТ {Государственная коллекция патогенных бактерий «Микроб»), В anthracis 55АТ/КМ92(2) (получен в ходе данного исследования), штаммы В sub-tilis WB600, В subtihs 830 (Государственный научно-исследовательский институт «Генетика», г Москва), рекомбинантные штаммы с клонированным геном pag В anthracis СТИАТПА, В anthracis СТИАТПА-1/КМ96, В anthracis 55АТПА-1/КМ95 и В subtihs WB600I1A-1/KM199 (получены в ходе данного исследования)

В качестве питательных сред использовали бульон BHI ("Difco", США), L-бульон и агар, S-бульон (Farchaus J et al, 1995), казаминовую среду (Thome С, Belton F, 1957) с добавлением сибиреязвенного у-глобулина или кроличьих анти-ПА антител, среду для определения про-теолитической активности (Микшис H с соавт, 1999) с казеином или альбумином в качестве белкового субстрата Для получения антител к ПА использовали кроликов весом от 2,5 до 3 кг В опытах по определе-

нию иммуногенности использовали белых мышей линии BALB/c весом от 18 до 20 г и морских свинок весом от 300 до 350 г

Протеолитическую активность штаммов исследовали на полусинтетической среде с казеином, отмечая после периода инкубации зоны про-теолиза вокруг изолированных колоний

Электрофоретическое разделение белков препаратов концентрированных культуральных фильтратов проводили в 10 % полиакриламид-ном геле в вертикальной камере (Amersham, США) при силе тока 50 мА в течение 5 часов

Протективный антиген выделяли из рекомбинантного штамма В ап-thracis СТИДТПА-1 Многоступенчатую хроматографическую очистку осуществляли в соответствии с рекомендациями J Farchaus et al (1998) Ионообменную хроматографию препарата проводили на колонке с Macro Prep 50Q (Bio-Rad, США) Высокая степень очистки препарата ПА достигалась за счет последующих этапов гель фильтрации на сефак-риле 300 HR (Bio-Rad, США) Анти-ПА антитела получали из сывороток кроликов, иммунизированных очищенным препаратом ПА в дозе 50 мкг семикратно с интервалом в 2 недели

Реакцию радиальной диффузной преципитации ставили на казами-новой среде С Thorne and F Beiton (1957), регистрируя после периода инкубации зону преципитации вокруг посева уколом Постановку имму-ноблота осуществляли по модифицированному нами методу Н Towbin et al (1979) Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану Hybond-C (Amersham, США) проводили при силе тока 0,4 А и напряжении 100 V в течение 1,5 часов Кроличьи антитела к ПА, а также меченые перокси-дазой антитела диагностические против кроличьих иммуноглобулинов (Sigma, США) использовали в разведении I 2000 Титр антител к про-тективному антигену в сыворотках иммунизированных животных, а также количественную оценку уровня продукции ПА рекомбинантными штаммами определяли с помощью разновидностей иммуноферментного анализа - дот-анализа и твердофазного ИФА Для этого применяли разработанные ранее методические приемы (Фримель Г , 1987) Диагностические антитела против кроличьих иммуноглобулинов, меченые перокси-дазой (Sigma, США) использовали в разведении 1 2000 - для дот-анализа, и 1 20000 - для твердофазного ИФА

В экспериментах по температурной элиминации резидентных плаз-мид из клеток В anthracis за основу были взяты методики Р Mikesell et al (1983) и В Greenetal (1985) Выделение плазмиды pXOl из штамма В anthracis Sterne34F2 осуществляли по методу R Kaspar, D Robertson (1987), репликона pUBllO из штамма В subtilis 830 - с использованием метода S Falkow (Harwood С , Cutting С , 1990) Гибридные плазмиды

из рекомбииаитных бациллярных штаммов выделяли модифицированным способом С Kado and S Liu (1981) Культуру В anthracis выращивали в течение 18 часов с аэрацией при температуре 37 "С в 50 мл BHI-бульона с добавлением 0,1 % глицерина и 25 мкг/мл канамицина Лизис осуществляли в щелочных условиях при температуре 60 °С в течение 30 минут До обработки смесью фенол-хлороформа для освобождения от белковых примесей в образцы вносили этидиум бромид (65 мкг/мл) Электрофорез проводили в 0,8 % агарозном геле при напряжении 15 V/см в течение 2,5 часов, результаты сканировали с помощью гель-документирующей системы ViTran (Биоком, Россия)

Рестрикцию плазмидных ДНК проводили в соответствии с рекомендациями фирм производителей ферментов (Sigma, США, MBI Fermentas, Литва) Для pXOl - 40 мкг ДНК инкубировали с 10 мкл фермента в 100 мкл рестрикционной смеси в течение 9 часов при температуре 37 С После инкубации смесь прогревали при 65 °С в течение 15 минут Клонирование гена pag осуществляли по стандартным методикам (Маниа-тис Т с соавт , 1984) с модификациями Фрагменты ДНК плазмид pXOl и pUBUO, полученные в результате гидролиза ферментом рестрикции Bam HI, разделяли электрофорезом в 1 % агарозном геле Элюцию 6 тпн фрагмента плазмиды pXOl осуществляли по методу G Dretzen et al (1981) Полученный фрагмент лигировали с помощью Т4 ДНК-лигазы с Bam HI - расщепленной ДНК плазмиды pUBl 10 После 1 часа инкубации при температуре 22 °С и 19 часов инкубации при температуре 4 °С образцами ДНК трансформировали клетки реципиентных штаммов Электростимулируемую трансформацию штаммов В anthracis проводили по методике С Еремина с соавт (1990), штаммов В subtilis WB600 - по методу Р Brigidi et al (1990)

Полимеразную цепную реакцию в модификации И Тучкова с соавт (1991) осуществляли на программируемом амплификаторе «Терцик» («ДНК-технология», Россия) с диагностическими праймерами на последовательности гена pag

Стабильность гибридных плазмид оценивали согласно методикам, предложенным J Barnard, A Fnedlander (1999) и S Cohen et al (2000)

Споровую взвесь рекомбинантных и вакцинных штаммов готовили в соответствии с регламентом производства № 831-98 вакцины сибиреязвенной живой Для определения ЛД50 бациллярных штаммов исследуемым животным (5 групп по 5 штук) подкожно в объеме 0,2 мл вводили споровые взвеси каждой культуры в возрастающих концентрациях - от 104до 108 спор После заражения, в течение 10 дней наблюдения, отмечали павших животных в каждой группе и определяли ЛД50 по формуле Кербера Определение иммуногенности штаммов проводили со-

гласно п 12 7 8 регламента производства живой сибиреязвенной вакцины №831-98 Индексы иммунитета определяли как отношение ЛД<ш заражающей культуры иммунизированных и интактныч лабораторных животных

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

На первом этапе исследования был осуществлен подбор донорных и реципиентных штаммов На наш взгляд, бациллярные штаммы, ввиду их способности секретировать белки в среду культивирования, являются оптимальными реципиентами для клонирования гена синтеза ПА сибиреязвенного микроба В рамках настоящего исследования был получен бесплазмидный вариант вакцинного штамма В амИгася 55 - В аШЬгаыв 55АТ Кроме того, были отобраны и охарактеризованы штаммы В ьиЬнИз \VB600 и бесплазмидный производный вакцинного штамма В ашИгасм СТИ-1 - В аыНгааь СТИАТ Все реципиентные штаммы отличались низкой активностью протеолитических ферментов Данное обстоятельство существенно при конструировании продуцентов ПА, так как протеолитическая активность рекомбинантных штаммов является серьезной проблемой практического их использования

Для конструирования гибридной плазмиды, содержащий ген синтеза ПА, был выбран вектор р1Л3110 (4,5 т п н ), способный стабильно функционировать в составе бациллярных штаммов В микробных клетках бацилл может одновременно присутствовать до 50 копий этого реплико-на Для последующего использования в экспериментах по генно-инженерному конструированию продуцентов ПА из донорного штамма В зиЬн1и> 830 было получено 300 мкл (концентрация 1 мкг/мл) препарата плазмидной ДНК с электрофоретической подвижностью, соответствующей размеру риВ110

С целью успешного введения гибридной ДНК на основе риВ110 в геном реципиентных штаммов были оптимизированы предложенные ранее методики электростимулируемой трансформации При проведении модельных экспериментов по генетической передаче репликона риВ110 наибольший выход трансформантов В агиИгасгч СТИАТ (500 КОЕ/мкг ДНК) наблюдался при продлении времени обработки реципиентных клеток пенициллином с 15 до 25 минут Трансформация клеток В яиЫи^ \VB600 проходила наиболее эффективно (250 КОЕ/мкг ДНК) при отработке их разрядом мощностью 1,8 кВт В обоих случаях увеличение количества используемой ДНК с 1 до 10 мкг приводило к прямо пропорциональному увеличению выхода трансформантов

В экспериментах по генетическому конструированию продуцентов ПА очень важным моментом является осуществление селекции транс-

формантов, получивших в результате генетического переноса ген pag Прямой отбор рекомбинантных клонов, продуцирующих белковый антиген, проводят на средах, содержащих специфичные антитела До получения очищенного препарата ПА единственным возможным источником анти-ПА антител являлся коммерческий сибиреязвенный у-глобулин В связи с тем, что данный препарат был получен на комплекс антигенов сибиреязвенного микроба, была определена возможность его применения для селекции трансформантов, сконструированных на основе штаммов В cmthracis и продуцирующих только протективный компонент экзотоксина Установлено, что на среде с сибиреязвенным у-глобулином (Thorne С and Belton F , 1957) вокруг колоний бесплазмидных штаммов В cmthracis СТИДТ и В anthracis 55ÀT не образуются выраженные зоны преципитации, и, следовательно, в данном случае возможно ее использование с целью первичной селекции рекомбинантных клонов

Для конструирования гибридной плазмиды, с включенным в ее состав геном синтеза ПА, использовали Bam HI-фрагмент ДНК плазмиды pXOl В вектор pUBl 10 по сайтам рестрикции Ват H1 встроили 6 т п н участок плазмиды pXOl, содержащий ген pag (2,2 тп н) Полученный репликон посредством электростимулируемой трансформации передали в клетки бесплазмидного сибиреязвенного штамма - В anthracis СТИАТ Эффективность трансформации составила около 340 КОЕ на 1 мкг ДНК вектора Резистентные к канамицину трансформанты селектировали на среде с сибиреязвенным у-глобулином Клоны, продуцирующие ПА, пассировали на питательных средах с целью определения стабильности наследования гибридного репликона В процессе пересевов на селективных средах большинство изолированных трансформантов теряли способность к росту в присутствии канамицина Для стабильных рекомбинантных клонов осуществляли белковый электрофорез концентрированных культуральных фильтратов По его результатам отобранные трансформанты продуцировали в культуральную среду белок с электрофоретической подвижностью, установленной для ПА - 83 кДа

Выделенную из клона В anthracis СТИАТПА гибридную плазмиду обозначили pUBllOPA С помощью рестрикционного анализа определили ее размер-10,5 т п н, и показали наличие 2 сайтов гидролиза для ферментов Bam HI, Hind III и Eco RI, что соответствовало теоретически возможному варианту включения фрагмента pXOl в вектор pUBllO (рис 1) Результаты ПЦР-анализа с диагностическими праймерами на последовательности гена pag свидетельствовали о наличии клонированного гена синтеза ПА в составе гибридного репликона

1,8 1... _ 2,0 10,5 i.u.U.

,0 \\

/ ,

■W в \ E 4

6,5 т.п.Ii.

pUBi I OPA

pUBI ! OP A-1

Рисунок I. Рестрикцией ные карем плазмид pUHl '.Ol1 Л и pUBI 10l'A 1. Двойная Линия - фрагмент pXOI с локализованным в его составе геном peg; одинарная - Д11К векторной плазмиды pUBI 10. Стрелкой обозначено начало и направление транскрипции гена pug.

По результатам белкового электрофореза и реакции преципитация клон В. cinthracis СТИДТПА продуцировал ПА на уровне вакцинного штамма В. cmthracis СТИ1. На следующем этапе гибридную плазмиду pu В1 ЮРА выделили из рекомбинантиого клона н попытались переклонировать фрагмент, несущий ген pag. Векторную плазм иду, стратегию клонирования и репипиентный штамм использовали те же, что и при конструировании гибридного репл икона pH Li 1 LOPA, однако при селекции трансформантов на среде с сибиреязвенным '/-глобулином обнаружили клоны, образующие зоны диффузионной преципитации, почти в 10 раз превышающие ранее регистрируемые значения. Высокая продукция ПА была подтверждена результатами белкового электрофореза концентрированных культуральных фильтратов изолированных тра неформал-тов. Из клона с наибольшим уровнем продукции ПА выделили гибридную плазм Иду J обозначив ее pUBllOPA-1. Реетрикционпый анализ риВПОРА-1 определил ее размер - 6,5 т.п.п.. что на 4 т.п.н. меньше, чем у pUBlJOPA, и наличие по одному сайту для ферментов Bam HI, Hind Ш и два - Для Eco R1 (рис. !), По всей видимости, в процессе трансформации ДИК произошли рекомбинациониые изменения, приведшие к деде-тированию довольно большой части нуклеотидных последовательностей реп.шкона pUßllOPA. Транеформапты, полеченные после ре клонирования pl.BI ЮРА, обладали большей стабильностью. Только I %

клонов утрачивал способность к росту в присутствии селективного антибиотика при первичном кассировании на питательных средах.

Па следующем этапе плазмиду риВ11()РА-1 передали в другие про-теазодефицитные рециииентные штаммы; В. шмИгаст 55ДТ и В. ауЬ-ИШ \VB600. В обоих случаях были получены трансформанты, содержащие гибридный репликон (рис. 2). На основании реакции диффузной преципитации и белкового электрофореза концентрированных культу-ральных фильтратов уровни продукции ПА штаммами В. ап1Нгаах СТИАТПА-1. В. апвжасЬ 55АТПА-1 и В. яиЫШх \VB60011A-1 существенно не отличались друг от друга и были значительно выше уровней продукции иммуногенного антигена вакцинными штаммами В. ауШгаЫя СТИ-! и В. шик гас Ь 55 (рис. 3).

Перспективность использования сконструированных штаммов в качестве продуцентов ПА оценивали по уровню продукции ими основного иммуиогеиа сибиреязвенного микроба, определяя количественные показатели и сравнивая с продукцией известных вакцинных штаммов. На данном этапе исследования применяли иммупохимическне методы с использованием специфических антител к протективному антигену, выделенному из рек ом бнн ан тного штамма В. атЬгасЬ СТИАТПА-1. Результаты реакции диффузионной преципитации, иммуноблота, дот-анализа н твердофазного ИФА с полученными анти-ПА антителами свидетельствовали о преимуществе рекомбинантных штаммов над вакцинными в еекретируемом синтезе ПА.

1234 5678 э

риаиарл-1

р1_Ш 10

Рисунок 2, Плазмидные профили исходных, рецигшеитиых и рекомбинантных штаммов, I - В, амгаей СТИ-1; 2 - В. ап!гас!я СТИАТ; 3 - В.

antracis СТИЛТПЛ-I; 4 - ДНК плазмиды pUBl 10; 5 - В. subUlis WBfiOO; 6 - В. subtilh WB600nA-l; 7 - В. uniracis 55; 8 - В. antracis 55AT; 9 - B. antracis 55ДТПА-1

2 3 4 ? 6 1 g 9 10 11 13

|Г Ж Si иИИпИЖ» вШ ЯР* m :: ^allfL- ШЩЁ w Цк .Jlïl вр ■ИИ щр -щ ЭДШр ш IfciKi.ïIi

шЯтж . ^ШШк-; ■Лр Щ ; Щ Щ|| ;1ВМ

Рисунок 3. Белковые профили культурадьных фильтратов вакцинных, реш-шиентных. и рекомбинантиых бациллярных штаммов. 1 - В. amhracis СТИАТ; 2 В. anthracis СТИ-1: 3,4,5 клоны В. ап-thracis СТИАТПЛ-1; Ь - В. amhracis 55; 7 В. anthracis 55АТ; 8,9,10-клонШВ,mmhmcis 5SATUA-J ; И В, mbttlis WB600; 12,13 клоны В sublilis WB600riA-l.

Fi реакции диффузной преципитации па среде с антителами к НА уровни продукции ПА рекомбипактпъши штаммами перечисленными штаммами сравнивали с его продукцией клетками вакцинных штаммов В. anthracis СТИ-1 и В anthracis 55 (рис. 4, а). Па калами Новую среду, содержащую кроличьи антитела к ПА. переносили уколом изолированные колонии исследуемых штаммов. После периода инкубации в атмосфере COj вокруг поеезов образовывались зоны преципитации. Зоны радиальной диффузии протективного антигена у рскомбинаитных штаммов бацилл составили почти 10 мм, в то время как вокруг у вакцинных - не более 2 мм.

lia основании данных дот-апализа продукция ПА рекомбинантиыми штаммами В. anthracis СТИАТПА! и В. anihracis 55ДТПА-1 в 10 и 6 раз превышала продукцию ПА штаммами В. anthracis СТИ-1 и В anthracis 55, соответственно (рис. 4, б). С помощью ИФА определены количественные показатели продукции ПА рекомбиnaiпнь:мк штаммами - 80 -

90 мкт/мл. Для сравнения, вакцинные культуры продуцировали 15-20 м кг/мл.

Рисунок 4. Сравнение уровней продукции нротективного антигена исходными, реципиентными и рекомбинантп ы мн бациллярными штаммами на основании реакции диффузионной преципитации и дот-анализа с анти-ПА антителами.

а - И. - В. anthracis СТИ 1: 1.2. - В. anthracis СХЙДТ; 1.3. - В an-thracis ОТ И ДТП A-l: ПЛ. - В anthracis. 55; П.2. - В. anthracis 55ДТ; II.3, -В. cm thracis 55 ATOA-1; Ш.1. - В. subtUis WB600; Ш.З. - В. subülis WB6001IA-!.

6-1 - В. anthracis СТИ -1: 2 - В. anthracis СТИАТПА-1; 3 - В. ап-thracis 55; 4- В. anthracis 55АТПЛ-1; 5 - В- su hi ¡lis WBtiflO; 6 - В subliUs WB60011 A-l.

Высокая продукция ПА рекомбипантными штаммами с pUBHOPA-Ц вероятно, является следствием увеличения числа копий гена pag в муль-тикопийном векторе, а также делении нуклеотидных последовательностей гибридной плазм иды в результате рекомбинационных изменений. Как известно, ген pag под собственным промотором обеспечивает продукцию ПА на уровне 15 - 25 мкг/мл. Однако мутации и pagR области приводят к увеличению секретируемого синтеза ПА в несколько раз (Hoffmaster A.. Koehler Т., 1999). Можно предположить, что в нашем случае произошли рекомбинации, затронувшие область негативной регуляции гена pag, находящуюся в непосредственной близости от структурного гена pagA (в составе Вага HI-фрагмента плазм иды pXOI размером 6 т.п.и.).

Важной характеристикой рекомбинантного штамма является стабильность наследования гибридного репликона при пассировании in vitro и in vivo. Для определения стабильности плазмиды pUBl'IOPA-1 in

vitro использовали известные схемы последовательных пассажей в питательных средах В результате многочисленных пересевов в присутствии селективного антибиотика элиминации гибридного репликон pUBllOPA-1 из штаммов В anthracis СТИДГПА-1, В anthracis 55ДТПА-1 и В siibtilis \\'В600ПА-1 не происходило В процессе культивирования рекомбинантных штаммов в жидкой питательной среде без канами-цина во всех случаях отмечали постепенное нарастание темпов элиминации pUBl 10РА-1 после третьего суточного пассажа Наибольшей стабильностью обладал штамм В antracis СТИАТПА-1 Способность к росту и размножению в селективных условиях после цикла споруля-ции сохранялась примерно у 30 % исследованных клонов Повышение процента элиминации плазмиды в данном случае связано с использованием схемы приготовления спор, включающей длительную инкубацию культур (7 суток) в среде, не содержащей антибиотика При пассировании рекомбинантных культур через организм лабораторных животных (морские свинки) не происходило утраты гибридного репликона Тестирование штаммов in vivo показало 100 % стабильность рекомбинантных культур

Таким образом, в результате выполненных исследований нами были сконструированы штаммы В anthracis СТИДТПА-1, В anthracis 55ДТПА-1 и В siibtilis WB600nA-l, являющиеся эффективными и стабильными продуцентами ПА сибиреязвенного микроба Рекомбинант-ные штаммы в несколько раз превосходили известные вакцинные культуры В anthracis СТИ-1 и В anthracis 55 в секретируемом синтезе ПА Преимущество полученных методом генетического конструирования бациллярных штаммов заключается в отсутствии в геноме плазмид pXOl и рХ02, детерминирующих продукцию токсина и капсулы - основных факторов вирулентности возбудителя сибирской язвы Кроме того, в рекомбинантных штаммах клонирован ген синтеза только протективно-го компонента сибиреязвенного экзотоксина, и они не синтезируют отечный и летальный факторы Подобные штаммы перспективны в качестве продуцентов протективного компонента химических сибиреязвенных вакцин, а также прототипов живых вакцин

На заключительном этапе исследовали иммунологическую эффективность сконструированных штаммов с клонированным геном синтеза ПА Оценку протективной способности рекомбинантных штаммов проводили на мышах линии BALB/c и морских свинках Линейных мышей и морских свинок иммунизировали однократно, дозами, соответственно - 3 х 107 и 5 х 107 жизнеспособных спор рекомбинантных штаммов Через 21 день после иммунизации осуществляли заражение тест-культурой В anthracis 2-ая вакцина Ценковского, наблюдали 10 дней и подсчиты-

вали значения ЛДзд тест-заражающего штамма и индексов иммунитета Результаты экспериментов на лабораторных животных показали, что штаммы с клонированным геном pag, в отличие от аттенуированных культур, не обладают остаточной вирулентностью для морских свинок и мышей линии ВАЬВ/с В поствакцинальный период от иммунизирующей дозы штамма В аШИгасм 55 пало 50 % линейных мышей Вакцинный препарат В аЫкгаск СТИ-1 вызвал развитие летального инфекционного процесса у 35 % вакцинированных морских свинок Введение рекомбинантных штаммов в использованных дозах не приводило к гибели лабораторных животных

Результаты экспериментов продемонстрировали способность гене-тически-сконструированных штаммов, содержащих гибридную плазми-ду риВ110РА-1, обеспечивать защиту лабораторных животных от заражения возбудителем сибирской язвы На модели линейных мышей значения индексов иммунитета, представляющие собой соотношение показателей ЛДед тест-штамма для иммунизированных и интактных животных, распределились следующим образом для препарата В апШгааэ СТИ-1 - 126,5, для В амЬ-ааз СТИАТПА-1 - 100,0, для В зиЬШк \VB600nA-l - 67,6, для В аЫИгаси 55АТПА-1 - 47,0 Для интактных мышей значение Л Дед тест-штамма составило 6,8 х 101 спор, а для мышей, иммунизированных рекомбинантными культурами - почти на два порядка выше - 3,2 - 6,8 х 10"" спор (табл 1) Уровень защиты линейных мышей рекомбинантным штаммом В аШИгасм СТИАТПА-1 был адекватен уровню защиты вакцинным препаратом В аШ/ггасм СТИ-1 (ЛД^о тест-штамма - 8,6 х 10ч спор)

Таблица 1 Сравнение иммуногенности вакцинного штамма В ап-¡Игаая СТИ-1 и рекомбинантных штаммов, содержащих гибридную плазмиду рЦВ110РА-1 (на модели линейных мышей ВАЬВ/с)_

Название иммунизирующего штамма ЛДю тест-штамма Индексы иммунитета

В ашИгаах СТИ-1 8,6 х 10э (1,7 х 105- 4,2 х106) 126,5

В аМИгаси СТИАТПА-1 (рШ110РА-1) 6,8 х 105 (1,3 х 105- 3,4 хЮ6) 100,0

В амИгаси 55АТПА-1 (риВ110РА-1) 3,2 х Ю' (6,3 хЮ4 - 1,5 х 10б) 47,0

В яиЬаЬ \VB600nA-l (Р1ЛВ110РА-1) 4,6 х Ю5 (9,2 х 104 - 2,3 х 106) 67,6

физиологический раствор (контроль) 6,8 х 10' (1,3 х 103 - 4,2 х 104) -

На модели морских свинок рекомбинантные штаммы В амИгаа.ч СТИДТПА-1 и В ьиЫйн \¥В600ПА-1 имели идентичные индексы иммунитета - 24615,0, при требовании не менее 20000,0 для коммерческой сибиреязвенной вакцины (табл 2)

Таблица 2 Сравнение иммуногенности вакцинного препарата В ап-Шгаси СТИ-1 и рекомбинантных штаммов, содержащих гибридную плазмиду рЦВПОРА-1 (на модели морских свинок)_

Название иммунизирующего штамма ЛДчо тест-штамма Индексы иммунитета

В аШИгася СТИДТПА-1 (рШ110РА-1) 3,2 х 10' (1 х 106- 7,9 х 107) 24615

В биЬЫм \VB600nA-l (рШИОРА-1) 3,2 х 10' (7,9 х 106 - 5х 108) 24615

В аМкгааъ СТИ-1 2 х 10" 153846

физиологический раствор (контроль) 1,3 х 10' (2 х 102- 6,3 ч 101) -

Для интактных морских свинок значение ЛДздтест-штамма составило 1,3 х 10я спор Для морских свинок, иммунизированных штаммами В ашИгасм СТИДТПА-1 и В \VB600nA-l, этот показатель оказался

на 4 порядка выше - 3,2 х 107 спор Вакцинный препарат В амИгасм СТИ-1 защищал морских свинок несколько эффективнее (ЛД<щ тест-штамма - 2 х 108 спор, индекс иммунитета - 153846,0) Обнаруженная разница в уровнях защиты коммерческого препарата и сконструированных штаммов может быть связана с техническими особенностями подготовки спор в лабораторных условиях или с отсутствием в рекомбинантных штаммах генов синтеза отечного и летального факторов (Регагс! С й а1 1995)

Данные иммунохимического исследования сывороток иммунизированных штаммом В ашгася СТИДТПА-1 морских свинок свидетельствовали об иммунологической перестройке макроорганизма с выработкой антител к ПА в высоких титрах и о напряженности иммунитета, создаваемого рекомбинантным штаммом

Таким образом, в результате проведенных исследований на основе мультикопийного вектора р1Ш110 сконструирована гибридная плазмида риВПОРА, содержащая ген синтеза ПА сибиреязвенного микроба Получен ее дериват - риВ110РА-1, способный стабильно функционировать в клетках бациллярных штаммов и обеспечивать высокую продукцию иммуногенного антигена Созданы рекомбинантные штаммы, в

несколько раз превосходящие сибиреязвенные вакцинные культуры в секретируемом синтезе ПА Показано, что иммунизация лабораторных животных соответствующими дозами рекомбинантных штаммов вызывает развитие иммунного ответа, характеризующегося высокими значениями индексов иммунитета и титров антител к ПА

ВЫВОДЫ

1 Получены и охарактеризованы бесплазмидные реципиентные штаммы, обладающие низкой активностью протеолитических ферментов Для эффективной передачи гибридной ДНК в клетки бесплазмид-ных протеазодефицитных реципиентных штаммов В anthracis и В sub-tilis оптимизированы способы электростимулируемой трансформации и условия селекции трансформантов, продуцирующих протективный антиген

2 На основе мультикопийного вектора pUBllO сконструированы гибридные плазмиды pUBllOPA (10,5 тпн) и pUBllOPA-1 (6,5 т п н ), содержащие ген синтеза протективного антигена сибиреязвенного микроба Следствием делеции части нуклеотидных последовательностей клонированного фрагмента ДНК в репликоне pUBllOPA-1 стало повышение его стабильности и увеличение детерминируемого геном pag синтеза иммуногенного антигена

3 Продукция протективного антигена рекомбинантными штаммами В anthracis СТИДТПА-1, В anthracis 55АТПА-1 и В subtihs \¥Н600ПА-1, содержащими pUBllOPA-1, пятикратно превосходит продукцию протективного антигена вакцинными штаммами В anhtracis СТИ-1 и В anthracis 55, содержащими pXOl

4 Штаммы В anthracis СТИДТПА-1, В anthracis 55АТПА-1 и В sub-tilis WB600nA-l стабильно сохраняют биологические свойства при пассировании in vitro и in vivo

5. Однократная иммунизация морских свинок дозой 5 х 107 спор рекомбинантных штаммов В anthracis СТИДТПА-1 и В subtilis \УВ600ПА-1 вызывает развитие иммунного ответа, характеризующегося высокими значениями индексов иммунитета и титров антител к протек-тивному антигену Генно-инженерные штаммы не обладают остаточной вирулентностью для морских свинок и мышей линии BALB/c и обеспечивают защиту лабораторных животных на уровне вакцинного штамма В anthracis СТИ-1

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Микшис Н И , Кудрявцева О М , Новикова Л В , Попов Ю А Клонирование pag гена в протеазодефицитных бациллярных штаммах // Молекулярная медицина и биобезопасность Матер 1 Междунар конф -Москва, 2004 - С 131 -133

2 Микшис Н И , Кудрявцева О М , Шулепов Д В , Новикова Л В , Болотникова М Ф , Киреев М Н Генетическое конструирование продуцентов протективного антигена сибиреязвенного микроба // Медицинская микробиология - XXI век Матер Всероссийской науч -практ конф -Саратов, 2004 - С 156 - 157

3 Кудрявцева О М , Микшис Н И , Новикова Л В , Болотникова М Ф , Попов Ю А Генетическое конструирование продуцентов протективного антигена сибиреязвенного микроба // Окружающая среда и здоровье Матер Всероссийской науч - практ конф молодых ученых и специалистов - Суздаль, 2005 г - С 164-167

4 Шулепов Д В , Микшис Н И , Кудрявцева О М , Киреев М Н Попов Ю А Выделение и очистка протективного антигена из рекомби-нантного штамма Bacillus anthracis II Окружающая среда и здоровье Матер Всероссийской науч - практ конф молодых ученых и специалистов - Суздаль, 2005 г - С 212-213

5 Микшис Н И , Кудрявцева О М , Болотникова М Ф , Новикова Л В , Попов ЮА, Дроздов ИГ Оценка иммунологической эффективности рекомбинантных штаммов с клонированным геном pag // Санитарная охрана территорий государств-участников СНГ проблемы биологической безопасности и противодействия биологическому терроризму в современных условиях Матер VI Межгосударственной науч -практ конф - Волгоград, 2005 - С 164-166

6 Микшис Н И , Шулепов Д В , Кудрявцева О М , Болотникова М Ф , Новикова Л В , Попов Ю А , Дроздов И Г Сравнение уровней продукции протективного антигена вакцинным и рекомбинантными штаммами Bacillus anthracis II Санитарная охрана территорий государств-участников СНГ проблемы биологической безопасности и противодействия биологическому терроризму в современных условиях Матер VI Межгосударственной науч-практ конф - Волгоград, 2005 - С 166-168

7 Микшис Н И , Кудрявцева О М , Болотникова М Ф , Новикова Л В , Попов Ю А , Дроздов И Г , Щуковская Т Н , Фирстова В В , Клюева С Н Иммунологическая эффективность генетически сконструированных бациллярных штаммов, продуцирующих протективный антиген сибире-

язвенного микроба//Проблемы особо опасных инфекций -2005 - Вып 2(90) -С 58-59

8.Кудрявцева О М , Микшис Н И , Новикова Л В , Болотникова М Ф , Шулепов Д В , Попов Ю А Селекция стабильных и эффективных ре-комбинантных продуцентов протективного антигена Bacillus anthracis // Проблемы особо опасных инфекций -2005 - Вып 1(91) -С 38-41

9 Попов Ю А , Микшис Н И , Корсакова А Ю , Кудрявцева О М , Болотникова М Ф , Новикова Л В , Шулепов Д В , Киреев М Н , Кон-нов Н П , Щуковская Т Н , Фирстова В В , Брандзишевский Ю В , Полунина Т А Конструирование рекомбинантных штаммов Bacillus anthracis для создания нового поколения высокоэффективных сибиреязвенных вакцин // В сб "Методические документы по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации" - Саратов, 2005 -С 41

10 Микшис Н И , Кудрявцева О М , Шулепов Д В , Болотникова М Ф , Новикова Л В , Попов Ю А Экспрессия гена синтеза протективного антигена сибиреязвенного микроба в рекомбинантных бациллярных штаммах // В сб "Материалы IX съезда всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов" - Москва, 2007 - С 84

11 Микшис НИ, Шулепов ДВ, Кудрявцева ОМ, Болотникова М Ф , Новикова Л В , Попов Ю А Конструирование рекомбинантного аспорогенного штамма-продуцента протективного антигена сибиреязвенного микроба // В сб "Материалы IX съезда всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов" - Москва, 2007 - С 83-84

Подписано к печати 04 09.07 Формат 84x108 1/6 печать лазерная Бумага финская Гарнитура Тайме Объем 1,1 уел п л Тираж 100 экз

Отпечатано на полиграфическом оборудовании Российского НИПЧИ «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека 410005, г Саратов, ул , Университетская, 46

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кудрявцева, Ольга Михайловна

ВВЕДЕНИЕ

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Генетическая организация Bacillus anthracis

1.2. Создание рекомбинантных штаммов-продуцентов протектив-ного антигена сибиреязвенного микроба

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Штаммы микроорганизмов, использованные в работе

2.2. Питательные среды, реактивы и лабораторные животные

2.3. Методики

2.3.1. Элиминация плазмид

2.3.2. Определение протеолитической активности

2.3.3. Выделение плазмидных ДНК штаммов В. anthracis и Bacilus subtilis

2.3.4. Рестрикция ДНК плазмид

2.3.5. Конструирование гибридной плазмиды с клонированым геном pag сибиреязвенного микроба

2.3.6. Трансформация штаммов В. anthracis и В. subtilis

2.3.7. Метод полимеразной цепной реакции

2.3.8. Исследование белкового состава культуральных фильтратов

2.3.9. Выделение протективного антигена из рекомбинантного штамма В. anthracis

2.3.10. Получение иммунных сывороток и специфических антител к протективному антигену

2.3.11. Реакция радиальной диффузной преципитации на средах с сибиреязвенным у-глобулином или анти-ПА антителами

2.3.12. Реакция иммуноблота

2.3.13. Дот-иммуноанализ

2.3.14. Метод непрямого твердофазного иммуноферментного анализа

2.3.15. Определение титра антител к протективному антигену у иммунизированных животных

2.3.16. Определение стабильности плазмид in vitro и in vivo

2.3.17. Приготовление споровой взвеси и определение количества живых спор рекомбинантных и вакцинных штаммов

2.3.18. Определение ЛД50 бациллярных штаммов для линейных BALB/c мышей

2.3.19. Определение иммуногенности рекомбинантных штаммов

ГЛАВА 3. КОНСТРУИРОВАНИЕ ШТАММОВ, СОДЕРЖАЩИХ КЛОНИРОВАННЫЙ ГЕН СИНТЕЗА ПРОТЕКТИВНОГО АНТИГЕНА СИБИРЕЯЗВЕННОГО МИКРОБА

3.1. Подбор оптимальных донорных и реципиентных штаммов для генетического конструирования продуцентов протектив-ного антигена

3.2. Оптимизация трансформационной передачи плазмидной ДНК в клетки В. anthracis и В. subtilis

3.3. Определение возможности селекции рекомбинантных клонов, синтезирующих протективный антиген на среде с сибиреязвенным у-глобулином

3.4. Конструирование гибридных плазмид, содержащих ген синтеза протективного антигена

ГЛАВА 4. ПОЛУЧЕНИЕ И ОТБОР СТАБИЛЬНЫХ РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ-ПРОДУЦЕНТОВ ПРОТЕКТИВНОГО АНТИГЕНА

4.1. Передача гибридной плазмиды pUB110PA-l в бесплазм и д-ные бациллярные штаммы

4.2. Определение уровней продукции ПА рекомбинатными штаммами на основании иммунохимических методов исследования

4.3. Определение стабильности рекомбинантных штаммов in vitro и in vivo

ГЛАВА 5. ОЦЕНКА ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ

5.1. Подбор оптимальной иммунизирующей дозы для лабораторных животных

5.2. Сравнительное изучение индексов иммунитета сконструированных штаммов-продуцентов протективного антигена и вакцинных культур

Введение Диссертация по биологии, на тему "Генетическое конструирование штаммов - продуцентов протективного антигена Bacillus anthracis"

Актуальность исследования. Сибирская язва является серьезной проблемой здравоохранения и ветеринарии. Ежегодно практически во всех регионах мира регистрируются случаи заражения людей и животных этим опасным инфекционным заболеванием (Ипатенко Н., 1996; Онищенко Г. с соавт., 1999). Тенденции к ухудшению эпидемиологической ситуации по сибирской язве (Черкасский Б., 2002; Ясинский А. с соавт., 2005), угроза и реальные случаи применения Bacillus anthracis в биотеррористических целях (Bush L. et al., 2001; Jernigan J. et al., 2001; Spencer R., Lightfoot N., 2001) требуют дальнейшего совершенствования средств защиты и диагностики. Рекомендованные для иммунопрофилактики людей и сельскохозяйственных животных живые вакцины получены в середине прошлого столетия классическими способами аттенуации вирулентных штаммов возбудителя сибирской язвы. Относительно высокий уровень их реактогенности (Степанов А. с соавт., 1996; Turnbull P. et al., 1986, 1991; Ivins В., 1990) обусловлен наличием в геноме плазмиды pXOl, детерминирующей синтез трехкомпонентного токсина, состоящего из протективного антигена, отечного и летального факторов. Развитие иммунного ответа макроорганизма обусловливает преимущественно протективный антиген (ПА) токсина. Отечный (ОФ) и летальный (ЛФ) факторы, взаимодействуя с протеолитически активированным ПА, образуют токсичные комплексы, запускающие патогенетические процессы сибиреязвенной инфекции (Leppla S., 1991).

Для производства менее реактогенных химических сибиреязвенных вакцин разработаны методы выделения и очистки ПА из культуральных фильтратов вакцинных штаммов В. anthracis (Безносов М., 1997; Leppla S., 1988; Quinn С. et al., 1988). Однако предложенные методики хроматографического разделения компонентов токсина, имеющих очень близкие значения молекулярных масс (ПА - 83, ОФ - 89 и ЛФ - 85 кДа), не позволяют получить иммуногенный препарат свободный от сопутствующих белков. В минимальных количествах ОФ и ЛФ присутствуют в образцах всех химических вакцин, получаемых из аттенуи-рованных штаммов, причем их содержание не нормировано и сильно варьирует.

Именно с наличием реактогенных примесей ОФ и ЛФ в препаратах химических сибиреязвенных вакцин, производимых в США и Великобритании, связывают возникновение нередких (у 30 % вакцинированных) аллергических рекций или даже некроза тканей на месте введения (Swanson-Biearman S., 2001).

Современные достижения биологической науки открывают новые возможности для создания менее реактогенных, но эффективных вакцинных препаратов. Среди развиваемых генетических и молекулярно-биологических направлений одним из перспективных является клонирование генов синтеза факторов иммуногенности в гомо- и гетерологичных системах с целью создания живых вакцин и продуцентов протективных антигенов.

Молекулярные механизмы сохранения иммуногенности и снижения вирулентности аттенуированных культур стали понятны после установления плаз-мидной детерминации синтеза основных факторов патогенности и иммуногенности В. anthracis (Mikesell P. et al., 1983; Green B. et al., 1985; Uchida I. et al., 1985). В геноме В. anthracis содержатся два высокомолекулярных репликона -pXOl (182 т.п.н.) и рХ02 (93,5 т.п.н.). В процессе аттенуации происходит элиминация плазмиды рХ02, обусловливающей синтез капсулы, защищающей микробную клетку от фагоцитоза, что приводит к неспособности штамма вызывать развитие специфического инфекционного процесса в организме хозяина. В последовательность генов pXOl включены детерминанты суа, lef и pag, кодирующие синтез ОФ, ЛФ и ПА, составляющих сибиреязвенный экзотоксин; и регуля-торные области - atxA и pagR, отвечающие за позитивную и негативную регуляцию синтеза токсина, капсулы и белков S-слоя (Hoffmaster A., Koehler Т., 1999; Okinaka R. et al., 1999; Mignot Т. et al., 2003). Нуклеотидная последовательность клонированного участка плазмиды рХО 1, ответственного за синтез ПА, установлена S. Welkos et al (1988). Ими определена открытая рамка считывания протяженностью 2319 п.н., из которых 2205 п.н. кодируют 735 аминокислотных остатков белка ПА.

Впервые ген pag, детерминирующий синтез ПА, клонирован М. Vodkin и S. Leppla (1983) в штамме Escherichia coli. Однако уровни продукции ПА рекомбинантными штаммами Е. coli (5-10 нг/мл) были на несколько порядков ниже значений, установленных для вакцинного штамма В. anthracis Sterne34F2 (15 мкг/мл). Впоследствии неоднократно предпринимались попытки клонирования гена pag в штаммах различных бактериальных видов: Е. coli (Gupta Р. et al., 1999; Chauhan V. et al., 2001), Salmonella typhimurium (Coulson N., et al., 1994), Lactobacillus casei (Zegers N. et al., 1999), B. subtilis (Ivins В. и Welkos S., 1986; Baillie L. et al., 1998), B. anthracis (Barnard J., Friedlander A., 1999; Cohen S. et al., 2000; Aloni-Grinstein R. et al., 2005). В большинстве случаев гибридные плазми-ды при функционировании в гетерологичных системах оказывались нестабильными или не могли обеспечить достаточно высокого уровня продукции ПА.

Уровень синтеза ПА в генно-инженерных штаммах лимитируется слабостью собственного промотора гена pag сибиреязвенного микроба, наличием позитивного (atxA) и негативного (pagR) регуляторов и активностью протеолити-ческих ферментов реципиентных штаммов. Наиболее успешной оказалась работа S. Cohen с соавторами (2000), клонировавших структурный ген pagA под сильным промотором а-амилазы в штамме В. anthracis. Сообщается о высокой секреции ПА (100 мкг/мл). Попытки дальнейшего усовершенствования генетических конструкций за счет использования еще более мощных промоторов не увенчались успехом (Gat О. et al., 2003). Гиперсекреция ПА, с одной стороны, сопровождалась нестабильностью гибридных плазмид, с другой - вела к «секре-тируемому стрессу», выражающемуся в значительном снижении выработки антител к ПА. К повышению продукции ПА приводят делеции или мутации в области негативной регуляции гена pag (Baillie L. et al., 1998; Barnard J., Friedlander A. et al., 1999). Гибридные плазмиды с делениями в pagR области получены В. Ivins и S. Welkos (1986).

Отечественными авторами также предпринимались попытки клонирования гена pag в гетерологичных системах - в вакцинных штаммах Francisella tularensis (Павлов В., Тедиков В., 1995), Yersinia pestis (Кисличкина О. с соавт., 1991; Алимов А., Павлов В., 1995), Е. coli, В. subtilis, Staphylococcus aureus (Тедиков В. с соавт., 1993). Однако до последнего времени в распоряжении отечественных ученых отсутствовали как стабильные векторные плазмиды, содержащие ген синтеза ПА, так и эффективные рекомбинантные продуценты ПА.

Таким образом, все вышеизложенное определяет актуальность планируемой диссертационной работы.

Цель диссертационной работы: генно-инженерное конструирование эффективных и стабильных штаммов-продуцентов протективного антигена сибиреязвенного микроба.

Основные задачи исследования:

1.Микробиологический анализ реципиентных и донорных штаммов для создания продуцентов протективного антигена; оптимизация метода трансформационной передачи гибридной ДНК в клетки В. anthracis и В. subtilis; поиск возможных способов селекции трансформантов, продуцирующих протективный антиген.

2.Конструирование гибридных плазмид, содержащих ген синтеза протективного антигена; клонирование гена pag в гомо- и гетерологичных бациллярных штаммах.

3.Получение и отбор рекомбинантных штаммов с высокой продукцией протективного антигена сибиреязвенного микроба.

4.Изучение стабильности генно-инженерных штаммов-продуцентов протективного антигена in vitro и in vivo.

5.Сравнение уровней продукции протективного антигена рекомбинантны-ми и вакцинными штаммами сибиреязвенного микроба с использованием биохимических и иммунохимических методов исследования.

6.Изучение иммуногенных свойств сконструированных штаммов с клонированным геном pag на модели лабораторных животных.

Научная новизна исследования.

Впервые на основе бесплазмидных производных отечественных вакцинных штаммов В. anthracis СТИ-1 и В. anthracis 55 получены рекомбинантные штаммы, являющиеся эффективными продуцентами протективного антигена.

Сконструирована гибридная плазмида pUB110PA-l, содержащая ген pag, стабильно функционирующая в составе бациллярных штаммов и обеспечивающая высокий уровень продукции протективного антигена сибиреязвенного микроба.

Рекомбинантные штаммы В. anthracis СТИАТПА-1, В. anthracis 55АТПА-1 и В. subtilis \УВ600ДТПА-1 стабильны при пассировании in vitro и in vivo, обладают низкой активностью протеолитических ферментов и пятикратно превосходят вакцинные штаммы В. anthracis СТИ-1 и В. anthracis 55 по уровню продукции протективного антигена.

В экспериментах на морских свинках и линейных BALB/c мышах показано, что рекомбинантные штаммы В. anthracis СТИАТПА-1 и В. subtilis WB600A ТПА-1, содержащие гибридную плазмиду pUBl 10РА-1, обладают протективным эффектом, обеспечивая защиту лабораторных животных на уровне вакцинного штамма В. anthracis СТИ-1.

В Роспатент подана заявка № 2006122787 на патентование рекомбинант-ного штамма 5. anthracis СТИАТПА-1 (pUB110PA-l) - продуцента протективного антигена сибиреязвенного микроба (дата приоритета 26.06.2006 г.).

Практическая ценность.

В Государственной коллекции патогенных бактерий "Микроб" депонированы рекомбинантные штаммы: В. anthracis КМ95 (В. anthracis 55АТПА-1), В. anthracis КМ96 (В. antracis СТИАТПА-1) и В. subtilis КМ 199 (В. subtilis WB600I1A-1). Штаммы содержат гибридный репликон pUB110PA-l, несущий ген pag. Штаммы В. anthracis 55АТПА-1, В. antracis СТИАТПА-1 и В. subtilis WB600TLA-1 являются безопасными, стабильными и эффективными продуцентами протективного антигена сибиреязвенного микроба - основного компонента химических сибиреязвенных вакцин и диагностических препаратов.

В Государственной коллекции патогенных бактерий "Микроб" депонированы изогенные штаммы: В. anthracis КМ92(2) (В. anthracis 55АТ) - бесплазмид-ный производный вакцинного штамма В. anthracis 55, и В. anthracis КМ92(3) -(В. anthracis 55ATSpo") - аспорогенный мутант бесплазмидного производного штамма В. anthracis 55. Штаммы предназначены для использования в качестве реципиентов при осуществлении клонирования детерминантов иммуногенности сибиреязвенного микроба.

По материалам диссертации составлены методические рекомендации "Комплекс методических подходов к определению продукции протективного антигена сибиреязвенного микроба", одобренные Ученым советом РосНИПЧИ "Микроб" (протокол Ученого совета РосНИПЧИ "Микроб" №2 от 17.04.2007 г.) и утвержденные директором РосНИПЧИ "Микроб".

Основные положения, выносимые на защиту:

1. На основе протеазодефицитных бесплазмидных производных В. antracis СТИДТ, В. anthracis 55АТ и В. subtilis WB600 сконструированы штаммы-продуценты протективного антигена сибиреязвенного микроба. Рекомбинантные штаммы В. antracis СТИДТПА-1, В. anthracis 55ДТПА-1 и В. subtilis \УВ600ПА-1 содержат гибридный репликон pUB110PA-l (6,5 т.п.н.) с включенным в его состав геном pag.

2. Сконструированные штаммы В. antracis СТИДТПА-1, В. anthracis 55ДТПА-1 и В. subtilis WB600IIA-1 по уровню продукции протективного антигена (80 - 90 мкг/мл) пятикратно превосходят вакцинные культуры В. anthracis СТИ-I и В. anthracis 55.

3. Рекомбинантные штаммы В. antracis СТИДТПА-1, В. anthracis 55ДТПА-1 и В. subtilis WB600IIA-1 сохраняют биологические свойства при пассировании in vitro и in vivo. Гибридная плазмида pUB110PA-l стабильно функциониует в составе бациллярных штаммов в условиях селективного давления, а также при чередовании пассажей на селективных и обычных средах.

4. Генно-инженерные штаммы В. anthracis СТИДТПА-1 и В. subtilis WB600ELA-1 в иммунизирующей дозе (3 - 5 х 107 спор) не обладают остаточной вирулентностью для мышей линии BALB/c и морских свинок и обеспечивают их эффективную защиту от заражения тест-штаммом возбудителя сибирской язвы.

Апробация работы. Исследования проведены в рамках плановых НИР: "Конструирование рекомбинантных штаммов Bacillus anthracis для создания нового поколения высокоэффективных сибиреязвенных вакцин", № Гос. регистрации 0.1.200.208130 (2002 - 2004 гг.), «Использование препаратов протективного антигена и белков S-слоя для создания средств диагностики и профилактики сибирской язвы» № Гос. регистрации 0120.0 603179 (2006-2008 гг.), а также федеральной целевой научно-исследовательской программы "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники", раздела "Экспериментальная оценка эффективности использования различных методических подходов в конструировании живых сибиреязвенных вакцин", темы "Разработка и совершенствование средств и методов профилактики и лечения опасных и особо опасных заболеваний" (2002 - 2004 гг.).

Материалы диссертационной работы были представлены на Всероссийской научно-практической конференции "Медицинская микробиология-XXI век" (г. Саратов, 2004 г.); Международной конференции "Молекулярная медицина и биобезопасность" (г. Москва, 2004 г.); Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов "Окружающая среда и здоровье" (г. Суздаль, 2005 г.); VI Межгосударственной научно-практической конференции "Санитарная охрана территорий государств-участников СНГ: проблемы биологической безопасности и противодействия биологическому терроризму в современных условиях" (г. Волгоград, 2005 г.); Российском медицинском форуме "Фундаментальная наука и практика" (г. Москва, 2006 г.); Российском медицинском форуме "Фундаментальная наука и практика" (г. Москва, 2006 г.); IX съезде всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (г. Москва, 2007 г.); итоговых научно - практических конференциях РосНИПЧИ "Микроб" (2004, 2005 и 2006 гг).

Публикации. Основное содержание работы отражено в 11 научных публикациях, из них статей в рекомендованных ВАК изданиях - 2.

Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, списка принятых обозначений и сокращений, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 58 отечественных и 158 зарубежных источников. Общий объем диссертации составляет 133 страницы машинописного текста. Текст иллюстрирован 5 таблицами и 18 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Кудрявцева, Ольга Михайловна

выводы

1. Получены и охарактеризованы бесплазмидные реципиентные штаммы, обладающие низкой активностью протеолитических ферментов. Для эффективной передачи гибридной ДНК в клетки бесплазмидных протеазодефицит-ных реципиентных штаммов В. anthracis и В. subtilis оптимизированы способы электростимулируемой трансформации и условия селекции трансформантов, продуцирующих протективный антиген.

2. На основе мультикопийного вектора pUBllO сконструированы гибридные плазмиды pUBllOPA (10,5 т.п.н.) и pUB110PA-l (6,5 т.п.н.), содержащие ген синтеза протективного антигена сибиреязвенного микроба. Следствием де-леции части нуклеотидных последовательностей клонированного фрагмента ДНК в репликоне pUB110PA-l стало повышение его стабильности и увеличение детерминируемого геном pag синтеза иммуногенного антигена.

3. Продукция протективного антигена рекомбинантными штаммами В. anthracis СТИДТПА-1, В. anthracis 55ДТПА-1 и В. subtilis \УВ600ПА-1, содержащими pUB110PA-l, пятикратно превосходит продукцию протективного антигена вакцинными штаммами В. anhtracis СТИ-1 и В. anthracis 55, содержащими pXOl.

4. Штаммы В. anthracis СТИДТПА-1, В. anthracis 55ДТПА-1 и В. subtilis WB600nA-l стабильно сохраняют биологические свойства при пассировании in vitro и in vivo.

5. Однократная иммунизация морских свинок дозой 5 х 107 спор рекомбинантных штаммов В. anthracis СТИДТПА-1 и В. subtilis WB600FIA-1 вызывает развитие иммунного ответа, характеризующегося высокими значениями индексов иммунитета и титров антител к протективному антигену. Генно-инженерные штаммы не обладают остаточной вирулентностью для морских свинок и мышей линии BALB/c и обеспечивают защиту лабораторных животных на уровне вакцинного штамма В. anthracis СТИ-1.

Заключение

Сибирская язва является одним из наиболее опасных заболеваний человека и многих видов животных. Способность сибиреязвенного микроба длительное время сохраняться во внешней среде в виде спор приводит к образованию стойких природных резервуаров патогенного микроорганизма. В условиях недостаточности или отсутствия профилактических мероприятий на эндемичной территории возбудитель сибирской язвы может стать причиной массового заболевания людей и сельскохозяйственных животных (Онищенко Г.Г. с соавт., 1999; Ипатенко Н.Г. с соавт., 1999). Применяемые в настоящее время для иммунопрофилактики людей и сельскохозяйственных животных вакцины (живые, химические и комбинированные) разработаны на основе аттенуированных вирулентных штаммов возбудителя сибирской язвы и нуждаются в улучшении характеристик, связанных с иммуногенностью или реактогенностью. Одним из перспективных направлений совершенствования средств специфической профилактики является создание вакцинных препаратов на основе генно-инженерных технологий. С их помощью возможно конструирование вакцинных штаммов и продуцентов иммуногенных антигенов сибиреязвенного микроба с заданными свойствами.

Основное содержание нашей работы - генно-инженерное конструирование эффективных и стабильных продуцентов протективного антигена сибиреязвенного микроба, оценка уровней продукции протективного антигена полученными рекомбинантными штаммами, а также определение протективных свойств этих штаммов в сравнении с вакцинными культурами.

На первом этапе исследования был осуществлен подбор донорных и реци-пиентных штаммов. На наш взгляд, бациллярные штаммы, ввиду их способности секретировать белки в среду культивирования, являются оптимальными реципиентами для клонирования гена синтеза ПА сибиреязвенного микроба. В рамках настоящего исследования был получен бесплазмидный вариант вакцинного штамма В. anthracis 55 - В. anthracis 55ДТ. Кроме того, в качестве реципи-ентных штаммов для генетических экспериментов по клонированию гена pag были отобраны и охарактеризованы штаммы В. subtilis WB600 и бесплазмидный производный вакцинного штамма В. anthracis СТИ-1 - В. anthracis СТИАТ Все реципиентные штаммы отличались низкой активностью протеолитических ферментов. Данное обстоятельство существенно при конструировании продуцентов ПА, так как протеолитическая активность рекомбинантных штаммов является серьезной проблемой практического их использования.

Для конструирования гибридной плазмиды, содержащий ген синтеза ПА, был выбран вектор pUB 110 (4,5 т.п.н.), способный стабильно функционировать в составе бациллярных штаммов. В микробных клетках бацилл может одновременно присутствовать до 50 копий этого репликона. Для последующего использования в экспериментах по генно-инженерному конструированию продуцентов ПА из донорного штамма В. subtilis 830 было получено 300 мкл препарата плаз-мидной ДНК с электрофоретической подвижностью, соответствующей размеру молекулы pUBllO. Концентрация ДНК в препарате составляла 1 мкг/мл.

С целью успешного введения гибридной ДНК на основе pUB 110 в геном реципиентных штаммов оптимизированы предложенные ранее методики элек-тростимулируемой трансформации. При проведении модельных экспериментов по генетической передаче репликона pUB 110 максимальный выход трансформантов В. anthracis СТИАТ (500 КОЕ/мкг ДНК) наблюдался при продлении времени обработки реципиентных клеток пенициллином с 15 до 25 минут. Трансформация клеток В. subtilis WB600 проходила наиболее эффективно (250 КОЕ/мкг ДНК) при отработке их разрядом мощностью 1,8 кВт и емкостью 25 мкФ. В обоих случаях увеличение количества используемой ДНК с 1 до 10 мкг приводило к пропорциональному увеличению выхода трансформантов.

В экспериментах по генетическому конструированию продуцентов ПА очень важным моментом является осуществление селекции трансформантов, получивших в результате генетического переноса ген pag. Прямой отбор рекомбинантных клонов, продуцирующих белковый антиген, проводят на средах, содержащих специфичные антитела. До получения очищенного препарата ПА единственным возможным источником анти-ПА антител являлся коммерческий сибиреязвенный у-глобулин. В связи с тем, что данный препарат получен на комплекс антигенов сибиреязвенного микроба, была определена возможность его применения для селекции трансформантов, сконструированных на основе штаммов В. anthracis и продуцирующих только протективный компонент экзотоксина. Установлено, что на среде с сибиреязвенным у-глобулином вокруг колоний бесплазмидных штаммов В. anthracis СТИАТ и В. anthracis 55АТ не образуются выраженные зоны преципитации, и, следовательно, в данном случае возможно ее использование с целью первичной селекции рекомбинантных клонов.

Для конструирования гибридной плазмиды, с включенным в ее состав геном синтеза ПА, использовали Bam HI-фрагмент ДНК плазмиды pXOl. В вектор pUB 110 по сайтам рестрикции Bam HI встроили 6 т.п.н. участок плазмиды pXOl, содержащий ген pag (2,2 т.п.н.). Полученный репликон посредством элек-тростимулируемой трансформации передали в клетки бесплазмидного сибиреязвенного штамма - В. anthracis СТИАТ. Эффективность трансформации составила около 340 КОЕ на 1 мкг ДНК вектора. Резистентные к канамицину трансформанты, получившие в результате клонирования ген pag, селектировали на среде с сибиреязвенным у-глобулином. Клоны, продуцирующие ПА, пассировали на питательных средах с целью определения стабильности наследования гибридного репликона. В процессе пересевов на селективных средах большинство изолированных трансформантов теряли способность к росту в присутствии канамицина. Для стабильных рекомбинантных клонов осуществляли белковый электрофорез концентрированных культуральных фильтратов. По его результатам отобранные трансформанты продуцировали в культуральную среду белок с электрофоретической подвижностью, установленной для ПА - 83 кДа. Выделенную из клона В. anthracis СТИАТПА гибридную плазмиду обозначили pUBllOPA. С помощью рестрикционного анализа определили ее размер -10,5 т.п.н,. и показали наличие 2 сайтов гидролиза для ферментов Bam HI, Hind III и Eco RI. Результаты ПЦР-анализа с праймерами на последовательности гена pag подтвердили наличие клонированного гена синтеза ПА в составе гибридного репликона.

По результатам белкового электрофореза и реакции преципитации клон В. anthracis СТИДТПА продуцировал ПА на уровне вакцинного штамма В. anthracis СТИ-1. На следующем этапе гибридную плазмиду pUBllOPA выделили из рекомбинантного клона и попытались переклонировать фрагмент, несущий ген pag. Векторную плазмиду, реципиентный штамм и стратегию клонирования использовали те же, что и при конструировании гибридного репликона pUBllO-РА, однако при селекции трансформантов на среде с сибиреязвенным у-глобу-лином обнаружили клоны, образующие зоны диффузионной преципитации, почти в 10 раз превышающие ранее регистрируемые значения. Высокая продукция ПА была подтверждена результатами белкового электрофореза концентрированных культуральных фильтратов изолированных трансформантов. Из клона с максимальным уровнем продукции ПА выделили гибридную плазмиду, обозначив ее pUB110PA-l. Рестрикционный анализ ДНК плазмиды pUB110PA-l определил ее размер - 6,5 т.п.н., что на 4 т.п.н. меньше, чем у pUBllOPA, и наличие по одному сайту для ферментов Bam HI, Hind III и два - для Eco RI. По всей видимости, при трансформации ДНК произошли рекомбинационные изменения, приведшие к делетированию большой части нуклеотидных последовательностей репликона pUBllOPA. В процессе последовательных пассажей на питательных средах под селективным давлением канамицина было отмечено, что трансформанты, полученные после реклонирования pUBllOPA, обладали большей стабильностью. Только 1 % клонов утрачивал способность к росту в присутствии селективного антибиотика при первичном пассировании на питательных средах.

На следующем этапе плазмиду pUB110PA-l передали в другие протеазо-дефицитные реципиентные штаммы: В. anthracis 55АТ и В. subtilis WB600. В обоих случаях были получены трансформанты, содержащие гибридный репли-кон. На основании белкового электрофореза концентрированных культуральных фильтратов и реакции диффузной преципитации сконструированные штаммы В. anthracis СТИДТПА-1, В. anthracis 55ДТПА-1 и В. subtilis \УВ600ПА-1, содержащие pUB110PA-l, отличались высокой продукцией ПА. Уровни продукции

ПА рекомбинантными штаммами не зависели от использованных при их создании реципиентов.

Перспективность использования сконструированных штаммов в качестве продуцентов ПА оценивали по уровню продукции ими основного иммуногена сибиреязвенного микроба, определяя количественные показатели и сравнивая с продукцией известных вакцинных штаммов. На данном этапе исследования применяли иммунохимические методы с использованием специфических антител к протективному антигену, выделенному из рекомбинантного штамма В. anthracis СТИАТПА-1. Результаты реакции диффузионной преципитации, имму-ноблота, дот-анализа и твердофазного ИФА с полученными анти-ПА антителами свидетельствовали о преимуществе рекомбинантных штаммов над вакцинными в секретируемом синтезе ПА. На основании данных дот-анализа продукция ПА рекомбинантными штаммами В. anthracis СТИАТПА-1 и В. anthracis 55 АТПА-1 в 10 и 6 раз превышала продукцию ПА штаммами В. anthracis СТИ-1 и В. anthracis 55, соответственно.

С помощью ИФА определены количественные показатели продукции ПА рекомбинантными штаммами - 70 - 90 мкг/мл. Для сравнения, вакцинные культуры продуцировали 15-20 мкг/мл. Высокая продукция ПА рекомбинантными штаммами с pUB110PA-l, вероятно, является следствием увеличения числа копий гена pag в мультикопийном векторе, а также делеции нуклеотидных последовательностей гибридной плазмиды в результате рекомбинационных изменений. Как известно, ген pag под собственным промотором обеспечивает продукцию ПА на уровне 15-25 мкг/мл. Однако мутации в pagR области приводят к увеличению секретируемого синтеза ПА в несколько раз (Hoffmaster А., Koehler Т., 1999). Можно предположить, что в нашем случае произошли рекомбинации, затронувшие область негативной регуляции гена pag, находящуюся в непосредственной близости от структурного гена pagA (в составе Barn Н1-фраг-мента плазмиды pXOl размером 6 т.п.н.).

Важной характеристикой рекомбинантного штамма является стабильность наследования гибридного репликона при пасссировании in vitro и in vivo. В связи с этим, была изучена стабильность рекомбинантных штаммов В. anthracis СТИД ТПА-1, В. anthracis 55ДТПА-1 и В. subtilis WB600nA-l. Для определения стабильности плазмиды pUB110PA-l in vitro использовали известные схемы последовательных пассажей в питательных средах. В результате многочисленных пересевов в присутствии селективного антибиотика элиминации гибридного ре-пликон pUB110PA-l из штаммов В. anthracis СТИДТПА-1, В. anthracis 55ДТПА-1 и В. subtilis WB600nA-l не происходило. В процессе культивирования рекомбинантных штаммов в жидкой питательной среде без канамицина во всех случаях отмечали постепенное нарастание темпов элиминации pUB110PA-l после третьего суточного пассажа. Наибольшей стабильностью обладал штамм В. antracis СТИДТПА-1. Способность к росту и размножению в селективных условиях после цикла споруляции сохранялась примерно у 30 % исследованных клонов. Повышение процента элиминации плазмиды в данном случае связано с использованием схемы приготовления спор, включающей длительную инкубацию культур (7 суток) в среде, не содержащей антибиотика. При пассировании рекомбинатных культур через организм лабораторных животных (морские свинки) не происходило утраты гибридного репликона. Тестирование штаммов in vivo показало 100 % стабильность рекомбинантных культур.

Таким образом, в результате выполненных исследований нами были сконструированы штаммы В. anthracis СТИДТПА-1, В. anthracis 55ДТПА-1 и В. subtilis WB6001TA-1, являющиеся эффективными и стабильными продуцентами ПА сибиреязвенного микроба. Рекомбинантные штаммы в несколько раз превосходили известные вакцинные культуры В. anthracis СТИ-1 и В. anthracis 55 в секретируемом синтезе ПА. Преимущество полученных методом генетического конструирования бациллярных штаммов заключается в отсутствии в геноме плазмид pXOl и рХ02, детерминирующих продукцию токсина и капсулы -основных факторов вирулентности возбудителя сибирской язвы. Кроме того, в рекомбинантных штаммах клонирован ген синтеза только протективного компонента сибиреязвенного экзотоксина, и они не синтезируют отечный и летальный факторы.

Подобные штаммы перспективны в качестве продуцентов протективного компонента химических сибиреязвенных вакцин, а также прототипов живых вакцин. Профилактические препараты, созданные на основе рекомбинантных штаммов и синтезируемого ими ПА, будут обладать меньшей реактогенностью.

На заключительном этапе исследовали иммунологическую эффективность сконструированных штаммов с клонированным геном синтеза ПА. Оценку про-тективной способности рекомбинантных штаммов проводили на мышах линии BALB/c и морских свинках. Линейных мышей и морских свинок иммунизировали однократно, дозами 3 х 107 и 5 х 107 жизнеспособных спор рекомбинатного штамма, соответственно. Через 21 день после иммунизации осуществляли заражение тест-культурой В. anthracis 2-ая вакцина Ценковского, наблюдали животных 10 дней и подсчитывали значения ЛД50 тест-заражающего штамма и индексов иммунитета. Результаты экспериментов на лабораторных животных показали, что штаммы с клонированным геном pag, в отличие от аттенуированных вакцинных культур, не обладают остаточной вирулентностью для морских свинок и мышей линии BALB/c. В поствакцинальный период от иммунизирующей дозы штамма В. anthracis 55 пало 50 % линейных мышей. Вакцинный препарат В. anthracis СТИ-1 вызвал развитие летального инфекционного процесса у 35 % вакцинированных морских свинок. Введение рекомбинантных штаммов в использованных дозах не приводило к гибели лабораторных животных.

Результаты экспериментов продемонстрировали способность генетически-сконструированных штаммов, содержащих гибридную плазмиду pUB110PA-l, обеспечивать защиту лабораторных животных от заражения возбудителем сибирской язвы. На модели линейных мышей значения индексов иммунитета распределились следующим образом: для препарата В. anthracis СТИ-1 - 126,5; для В. anthracis СТИДТПА-1 - 100,0; для В. subtilis \¥В600ПА-1 - 67,6; для В. anthracis 55АТПА-1 - 47,0. Для интактных мышей значение ЛД50 тест-штамма составило 6,8 х 103 спор, а для мышей, иммунизированных рекомбинантными культурами - почти на два порядка выше - 3,2 - 6,8 х 105 спор. Уровень защиты линейных мышей рекомбинантным штаммом В. anthracis СТИДТПА-1 был адекватен уровню защиты вакцинным препаратом В. anthracis СТИ-1 (ЛД5о тест-штамма - 8,6 х 105 спор).

На модели морских свинок рекомбинантные штаммы В. anthracis СТИДТПА-1 и В. subtilis WB600IIA-1 имели идентичные индексы иммунитета, равные 24615,0, при требовании не менее 20000,0 для коммерческой сибиреязвенной вакцины. Для интактных морских свинок значение ЛД50 тест-штамма составило 1,3 х 103 спор. Для морских свинок, иммунизированных штаммами В. anthracis СТИДТПА-1 и В. subtilis WB600I1A-1, этот показатель оказался на 4 порядка выше - 3,2 х 107 спор. Вакцинный препарат В. anthracis СТИ-1 защищал морских свинок несколько эффективнее (ЛДю тест-штамма - 2 х 108 спор, индекс иммунитета - 153846,0). Обнаруженная разница в уровнях защиты коммерческого препарата и сконструированных штаммов может быть связана с техническими особенностями подготовки спор в лабораторных условиях или с отсутствием в рекомбинантных штаммах генов синтеза отечного и летального факторов (Pezard С. et al. 1995).

Данные иммунохимического исследования сывороток иммунизированных штаммом В. antracis СТИДТПА-1 морских свинок свидетельствовали об иммунологической перестройке макроорганизма с выработкой антител к ПА в высоких титрах и о напряженности иммунитета, создаваемого рекомбинантным штаммом.

Таким образом, в результате проведенных исследований на основе мульти-копийного вектора pUBllO сконструирована гибридная плазмида pUBllOPA, содержащая ген синтеза ПА сибиреязвенного микроба. Получен ее дериват -pUB110PA-l, способный стабильно функционировать в клетках бациллярных штаммов и обеспечивать высокую продукцию иммуногенного антигена. Созданы рекомбинантные штаммы, в несколько раз превосходящие сибиреязвенные вакцинные культуры в секретируемом синтезе ПА. Показано, что иммунизация лабораторных животных соответствующими дозами рекомбинатных штаммов вызывает развитие иммунного ответа, характеризующегося высокими значениями индексов иммунитета и титров антител к ПА.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кудрявцева, Ольга Михайловна, Саратов

1. Азизбекян P.P., Богданова Т.Л., Миненкова И.Б. и др. Характеристика выделенных из почвы фагов спорообразующих бактерий // Микробиология. -1977. №3. - С.554-559.

2. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л.: Медгиз, 1962. - 180 с.

3. Бакулов И. А. Гаврилов В.А. Оценка эффективности 10-летнего применения вакцины против сибирской язвы животных из штамма 55-ВНИИ ВиМ // Ветеринария. 1994. - №8. - С. 11 -15.

4. Безносов М. В., Петров Г. А., Соркин Ю. И. и др. Выделение поверхностного антигена вегетативных клеток Bacillus anthracis СТИ-1 и изучение его протективных свойств // Журн. микробиол. эпидемиол. иммунобиол. 1997.- № 1.-С.9- 13.

5. Богуш В.Г., Смирнов В.В., Ребентиш Б.А., Пермогоров В.М., Азизбекян P.P. Физико-химические свойства некоторых фагов Bacillus thuringiensis II Mo-лек. биол. 1977. - Т.П. - №4. - С.901-908.

6. Васильев Н.Т., Пименов Е.В., Кожухов В.В. и др. Перспективы создания сибиреязвенных вакцин нового поколения // Иммунология. 1999. - №3. - С.5-8.

7. Гаврилов С.В. Трансдукция у возбудителя сибирской язвы: Дисс.канд. мед. наук. Саратов, 1990. - 154с.

8. Гинсбург Н.Н. Живые вакцины. М.: Медицина, 1969. 336с.

9. Н.Гинсбург Н.Н. Копылов Н.Ф. Итоги применения сибиреязвенной вакцины

10. СТИ за время с августа 1941 г. по осень 1944 г. ( по анкетным материалам с мест на 1 апреля 1945 г.) Сб. работ НИИЭГ Красной армии. М., 1946. - С. 194-207.

11. Глик Б., Пастернак Д. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение: Пер. с англ. М.: «Мир», 2002. - 589 с.

12. Гловер Д. Клонирование ДНК. Методы: Пер. с англ. М.: «Мир», 1988. - 538 с.

13. Голубков В.И., Бойцов А.С., Гаупалова Т.В., Тотолян А.А. Гетерологичная трансформация плазмидами стрептококков и стафилококков // Молек. ген., микробиол. и вирусол. 1984. - №4. - С.7-10.

14. Еременко Е.И. Биологические и популяционные аспекты патогенности Bacillus anthracis: Дисс. д-ра. мед. наук. Ставрополь, 1997. - 275с.

15. Еременко Е.И. Выделение ауксотрофных мутантов вакцинного штамма СТИ-1 сибиреязвенного микроба//Особо опасные инфекции на Кавказе.-Сб. научн. трудов. Вып.1. Ставрополь, 1985. - С. 106-108.

16. Еремин С.А., Никифоров А.К., Костюкова Т.А., Микшис Н.И. Изучение способности штаммов возбудителя сибирской язвы к редукции метиленово-го синего // Журн. микробиол. 1999. - № 4. - С. 91-92.

17. Еремин С.А., Дроздов И.Г., Никитин А.Н. и др. Высокоэффективная элек-тростимулируемая трансформация Y. pestis EV и В. anthracis II Всес. н.-и. противочум. ин-т «Микроб». Саратов, 1990(a). -15 с.

18. Еремин С.А., Ежов И.Н., Костюкова Т.А. и др. Конструирование и изучение штаммов сибиреязвенного микроба, обладающих различным набором собственных плазмид // Молек. ген., микробиол. и вирусол. 1989. - №10. -С.35-38.

19. Ипатенко Н.Г. Сибирская язва. М.: Колос, 1996. - 335с.

20. Лефковитс И., Пернис Б. Иммунологические методы исследований: Пер. с англ. М.: Мир, 1983. - 349с.

21. Лопаткин О.Н., Буравцева Н.П., Солдатова Ю.В. Питательные потребности сибиреязвенного микроба // Микробиол., эпидемиол. и профилакт. особо опасных инф. Ставрополь, 1974. - С.32-35.

22. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование: Пер. с англ. М.: «Мир», 1984. - 480 с.

23. Микшис Н.И., Еремин С.А., Болотникова М.Ф. Корреляция вирулентности Bacillus anthracis с экпрессией признаков, кодируемых хромосомными генами //Молек. ген., микробиол. и вирусол. 1999(6). - №4. - С.25-28.

24. Микшис Н.И., Еремин С.А., Шевченко О.В. и др. Влияние спонтанных хромосомных мутаций на вирулентность возбудителя сибирской язвы: Матер, юбилейной науч. конф., посвящ. 70-летию НИИ микроб. МО РФ.- Киров, 1998. С.165-166.

25. Микшис Н.И., Корсакова А.Ю., Болотникова М.Ф. и др. Продукция белков S- слоя штаммами Bacillus anthracis II Биотехнология. 2004. - №5. - С.22-32.

26. Микшис Н.И., Степанов А.С., Шевченко О.В., Еремин С.А. Изучение феномена внутриштаммовой гетерогенности возбудителя сибирской язвы // Журнал микробиологии. 1999(a).- №3. - С.78-79.

27. Найманов П.И., Голубинский Е.П., Соркин Ю.И., Кондратов В.В. Потребление in vitro аминокислот клетками Bacillus anthracis // Журн.микро-биол., эпидемиол.и иммунобиол. 1986. - №4. - С.30-34.

28. Найманов П.И. Особенности питания и биологическая характеристика Bacillus anthracis: Дисс. канд. мед. наук. Иркутск, 1987. - 124 с.

29. Онищенко Г.Г., Васильев Н.Т., Литусов Н.В., и др. Сибирская язва: актуальные аспекты микробиологии, эпидемиологии, клиники, диагностики, лечения и профилактики. М., 1999. - 447с.

30. Основные требования к вакцинным штаммам сибиреязвенного микроба для иммунизации людей (МУ 3.3.1.1112-02): Методические указания. М., 2002. -47с.

31. Пименов Е.В., Дармов И.В., Васильев Н.Т. и др. Состояние вопроса и перспективы разработки вакцин против сибирской язвы // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2002. - №5. - С.42-46.

32. Прозоров А.А. Генетическая трансформация и трансфекция. М.: «Наука»,1980.-247с.

33. Пузанова О.Б. Криотрансформация возбудителя сибирской язвы плазмидной ДНК: Дисс. канд. мед. Наук. Саратов, 1990. - 147с.

34. Регламент производства № 831 -98 на вакцину сибиреязвенную живую.

35. Рудченко О.Н., Лихачева Н.А., Тимакова Н.В. Физиология компетентности у бактерий // Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. 1977. - №3. -С. 19-26.

36. Смирнова Т.А., Богданова Г. Л., Гальперин М.Ю. и др. Гомологичная и гете-рологичная трансцепция Сгу+ плазмид Bacillus thuringiensis // Молекул, генетика, микробиол., вирусол. 1987. - №10. - С.23-27.

37. Степанов А .С. Разработка основ генетического анализа возбудителя сибирской язвы: Дис. докт. мед. наук. Саратов, 1992. - 333 С.

38. Степанов А.С., Гаврилов С.В., Пузанова О.Б. и др. Трансдукция плазмид бактериофагом СР54 Bacillus anthracis // Молекул, генетика, микробиол. вирусол. 1989 (а). -№.1 - С. 14-19.

39. Степанов А.С., Пузанова О.Б., Гаврилов С.В. и др. Трансдукционная и ко-ньюгационная передача плазмиды рХ02 Bacullus anthracis // Молекул, генетика, микробиол., вирусол. 1989 (б).- №12. - С.39-43.

40. Тедиков В.М., Добрица А.П. Клонирование и экспрессия детерминанты протективного антигена Bacullus anthracis в клетках Escherichia coli, Bacullus subtilis и Bacullus anthracis // Молекул, генетика, микробиол., вирусол. -1993.- N2. С.13-16.

41. Терентьев Ф.А. Сибирская язва животных и борьба с ней. М.: «Сельхозгиз»,1946. 62 с.

42. Тучков И. В., Куличенко А.Н., Норкина О.В., Дроздов И.Г. Детекция штаммов сибиреязвенного микроба с использованием полимеразной цепной реакции // Генет., микробиол., и совершенствование методов лаб. диагн. особо опасных инф. Саратов, 1991. - С.89-91.

43. Фримель Г. Иммунологические методы: Пер. с англ. М.: «Медицина», 1987. - 472 с.

44. Хайкинсон М.Я., Рабинович П.М., Степанов А.И. Модели трансформации Bacullus subtilis плазмидной ДНК // Докл. АН СССР. М. - 1982(6). - Т. 265. -№5.-С. 1264-1267.

45. Хайкинсон М.Я., Рабинович П.М., Степанов А.И. Роль прямых и инвертируемых повторов в трансформации Bacullus subtilis плазмидной ДНК // Докл. АН СССР. 1982(a). Т. 265. № 4. С.975-978.

46. Цыганкова О.И., Буравцева Н.П. Некоторые данные по протеолитической активности штаммов возбудителя сибирской язвы // Особо опасные инф. на Кавказе: Тезисы, докл. 6-ой краевой науч. конф. Ставрополь, 1987. -С.249-250.

47. Цыганкова О.И. Гемолитическая и протеолитическая активность сибиреязвенного микроба: Дисс.канд. мед. наук. Ставрополь, 1993. - 179с.

48. Черкасский Б.Л. Эпидемиология и профилактика сибирской язвы. М.: «Ин-терсэн», 2002. 384с.

49. Шляхов Э.Н. Эпидемиология, диагностика и профилактика сибирской язвы. Кишинев: Картя Молдовеняскэ, 1960. 116с.

50. Щелкунов С. Н. Генетическая инженерия: Учеб. пособие: В 2 ч. Новосибирск: изд-во Новосиб. Ун-та, 1994. - 304с.

51. Ясинский А.А., Котова Е.А., Перевощикова А.А., и др. Эпидемиологическая ситуация в Российской Федерации в 2004 г // Эпидемиология, вакцинопро-филактика. 2005. - №2(21). - С.6-13.

52. Aloni-Grinstein R., Gat О., Altboum Z. et al. Oral spore vaccine based on live attenuated nontoxinogenic Bacillus anthracis expressing recombinant mutant protective antigen // Infect, and Immun. 2005 - V. 73. - № 7. - P.4043-4053.

53. Azhar A. M., Singh S., Anand K. P., Bhatnagar R. Expression of protective antigen in transgenic plants: a step towards edible vaccine against anthrax // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. - V. 299. - № 3 - P.345-351.

54. Baillie L., Moir A., Manchee R. The expression of the protective antigen of Bacillus anthracis in Bacillus subtilis // Journal of Applied Microbiology. 1998(b). -Vol. 84. №5. - P.741-746.

55. Baillie L.W., Moore P., McBride B.W. A heat-inducible Bacillus subtilis bacteriophage phi 105 expression system for the production of the protective antigen of Bacillus anthracis // FEMS Microbiol. Lett. 1998(a).- Vol. 163.- №1.- P.43-47.

56. Balassa G. Biochemical genetics of bacterial sporulation I. Unidirectional pleiotropic interactions among genes controlling sporulation in Bacillus subtilis // Mol. and Gen. Genet. 1969. - №104. - P. 73 - 103.

57. Barnard J.P., Friedlander A.M. Vaccination against anthrax with attenuated recombinant strains of Bacillus anthracis that produce protective antigen // Infect, and Immun. 1999. Vol. 67. - № 2. - P.562-567.

58. Bartkus J.A., Leppla S.H. Transcriptional regulation of the protective antigen of Bacillus anthracis I I Infect, and Immun. 1989. - V.57. - P.2295-2300.

59. Battisti L., Green B.D., Thorne C.B. Mating system for transfer of plasmids among Bacillus anthracis, Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis // J.Bacte-riol. 1985. - V.162. - №2. - P.543-550.

60. Beal F.A., Taylor M.J. Thorne C.B. Rapid lethal effect in rats of a third component found upon fractionating the toxin of Bacillus anthracis 11 J.Bacteriol. -1962. V.83. - P.1274-1280.

61. Birnboim H.C., Doly I. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA//Nucleic Acids Res. 1979. - V.7. - P.1513.

62. Bourgogne A., Drisdale M., Hilsenbeck S.G. et al. Global effect of virulence gene regulators in a Bacillus anthracis strain with both virulence plasmid // Infect, and Immun. 2003. - V.71. - №.5. - P.2736-2743.

63. Brigidi P., Rossi E., Bertarini M. Genetic transformation of intact cells of Bacillus subtilis by electroporation // FEMS Microbiol. Let. 1990. - V.67. - P.135-138.

64. Brassier F., Weber-Levy M., Mock M., Sirard J. Protective antigen-mediated antibody response against a heterologous protein produced in vivo by Bacillus anthracis // Infect.Immun. 2000. - Vol. 68. - P. 1781-1786.

65. Bush L.M, Abrams B.H, Beall A. et al. Index case of fatal inhalational anthrax due to bioterrorism in the United States // N. Engl. J. Med. 2001. - V. 345. -P.1607-1610.

66. Cataldi A., Labruiere E. Genetic study of toxin expression in Bacillus anthracis, p.60-61. In: P.C.B.Turnbull (ed.), Proc. Int. Workshop on Anthrax. Salisbury Med. Bull., Winchester, England. 1989.

67. Cataldi A., Labruiere E. Мок M. Construction and characterization of a protective antigen deficient Bacillus anthracis strain // Mol. Microbiol. - 1990. - V. 4. -№ 7. - P.l 111-1117.

68. Chattergee B.R., Williams R.P. Formation of spheroplasts from Bacillus anthracis 11 J. Bacteriol. -1965. V.89. - P.ll28-1133.

69. Chauhan V., Singh A., Waheed S.M. et al. Constitutive expression of protective antigen gene of Bacillus anthracis in Escherichia coli // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001. - Vol. 283. - № 2. - P.308-315.

70. Chauvaux S., Matuschek M., Begum P. Distinct affinity of binding sites tor S-lay-er homologous domains in Clostridium thermocellum and Bacillus anthracis cell envelopes // J. Bacteriol. 1999. - V.181. - P.2455 -2458.

71. Chu H. P. Variation of Bacillus anthracis with special reference to non-capsulated avirulent variant//J.Hygienc.- 1952. V.50. - P.433-444.

72. Clements M.O., Moir A. Role of the gerl operon of Bacillus cereus 569 in the response of spores to germinants // J. Bacteriol. 1998. - V.180. - P.6729-6735.

73. Cohen S., Mendelson I., Altboum Z. et al. Attenuated nontoxinogenic and nonen-capsulated recombinant Bacillus anthracis spore vaccines protect against anthrax // Infect, and Immun.- 2000.- Vol 68. №8. - P.4549-4558.

74. Connors M. J., Howard, S., Hoch, J. A., Setlow P. Determination of the chromosomal map location of four Bacillus subtilis genes which code for a family of small, acid-soluble spore proteins // J. Bacteriol. 1986. - V.166.- P.412-416.

75. Corfe B.M., Sammons R.L., Smith D.A., Mauel C. The gerB region of the Bacillus sublilis 168 chromosome encodes a homologue of the gerA spore germination operon. //Microbiology. 1994. - V.140. - P.471-478.

76. Coulson N.M., Fulop M., Titball R.W. Effect of different plasmids on colonization of mouse tissues by the aromatic amino acid dependent Salmonella typhimurium SL 3261 // Microb. Pathog. 1994. - Vol. 16. - № 4. - P.305-311.

77. Dai Z., Sirard J.-C., Mock M., Kochler T.M. The atxA gene product activates transcription of the anthrax toxin genes and is essential for virulence // Mol. Microbiol. -1995. V.16. - P.1171-1181.

78. Davies J. A major epidemic of anthrax in Zimbabwe. // Cent. Afr. J. Med. 1983. - Vol. 29. - P. 8-12.

79. Davies J. A major epidemic of anthrax in Zimbabwe. The spread of the epidemic in Matabeleland, Midlands and Mashonaland provinces during the period November, 1978 to October, 1980 // Central Afric. J. Med. 1982. - Vol. 28. -№12. -P.291-298.

80. Dretzen G., Bellard M., Sasson-Corsi P., Chambon P. A reliable method for the recovery of DNA Fragments from agarose and acrylamide gels // Anal. Biochem. -1980.-V.112.-P.295-299.

81. Escuer V., Duflot E., Sezer O. et al. Structure-homology between virulence-associated adenylate cyclases // Gene. 1988. - V.71. - P.293-298.

82. Etienne-Toumelin I., Sirard J.-C., Duflot E. et al. Characterization of the Bacillus anthracis S-layer: cloning and sequencing of the structural gene. // J. Bacteriol. -1995. V.177. - P.614-20.

83. Ezzell J.W. Anthrax. Army Med. Research Inst, of Infect. Diseases. Fort Dctrick, \ 984, 84p.

84. Ezzel J.W., Abshire T.G. Immunological analysis of cell-associated antigenes of Bacillus anthracis // Infcc. and Immun. 1988. - V.56. - P.349 - 356.

85. Farchaus J., Ribot W., Downs M. et al. Purification and Characterization of the Major Surfacc Array Protein from the Avirulent Bacillus anthracis Delta Sterne-1 // J. Bacteriol. 1995. - Vol. 177. - № 9. - P. 2481-2489.

86. Finlay B.B., Falkow S, Common themes in microbial pathogenicity // Microbiol. Rev. 1989. - V.53. - P.210-230.

87. Fish D.C., Mahlandt B.G., Dobbs J.P., Linkoln R.E. Purification and properties of in vitro produced anthrax toxin components // J.Bacteriol. 1968. - V.95. - P.907-918.

88. Fouet A., Mock M. Differential influence of the two Bacillus anthracis plasmids on regulation of virulence gene expression // Infect, and Immun. 1996. - V.64. -P.4928-4932.

89. Fouet A., Namy 0., Lambert G. Characterization of the operon encoding the alternative <3D factor from Bacillus anthracis and its role in virulence // J.Bacteriol.-2000. V.182. - P.5036 -5045.

90. Fouet A., Sirard J.C., Mock M. Bacillus anthracis pXOl virulence plasmid encodes a type IDNA topoisomerase I I Mol.Microbiol. 1994. - V.l 1. - P.471-479.

91. Fowler K., McBride B.W., Turnbull P.C., Baillie L.W. Immune correlates of protection against anthrax // Journal of Applied Microbiology. 1999. - Vol. 87. -№2. -P. 305-311.

92. Friedlander A.M. Macrophages are sensitive to anthrax lethal toxin thorough an acid-dependent process //J.Biol. Chem. 1986. - V.261. - P.7123-7126.

93. Gat О., Inbar I., AIoni-Grinstein R. et al. Use of a promoter trap system in Bacillus anthracis and Bacillus subtilis for the development of recombinant protective antigen-based vaccines // Infect, and Immun. 2003. - V.71. - № 2. - P.801-813.

94. Gladstone G.P. Immunity to anthrax: protective antigen present in cell-free culture filtrates // Brit. J. Exp.Pathol. 1939. - V.20. - P.189-200.

95. Gladstone G.P., Immunity of anthrax: protective antigen present in cell-free culture filtrates // Brit. J. Exp. Pathol. 1946. - V.27. - P.393-410.

96. Gonzalez J. M. Brown B.J., Carlton B.C. Transfer of Bacillus thuringiensis plasmid for a-endotoxin among strains of Bacillus thuringiensis and Bacillus cereus // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982. - V.79. - P.6951-6955.

97. Gonzalez J. M.? Carlton B.C. Plasmid transfer in Bacillus thuringiensis, p.85-95. In: Genetic exchange: a celebration and new generation. Marcel Decker. Inc., New York. 1981.

98. Goodman J.W., Nitecki D.E. Studies on the relation of a prior immune response to immunogenicity // Immunology. 1967. - V.13. - P.577-583.

99. Green B.D., Battisti L., Koehler T.M. et al. Demonstration of capsule plasmid in Bacillus anthracis II Infec. and Immun. 1985. - V.49. - №2. - P. 291-297.

100. Guidi-Rontani C., Pepeira Y., Ruffie S. et al. Identification and characterization of a germination operon on the virulence plasmid pXOl of Bacillus anthracis // Mol. Microbiol. 1999. - V.33. - P.407-414.

101. Guidi-Rontani C., Weber-Levy M., Labruyere E., Mock M. Germination of Bacillus anthracts spores within alveolar macrophages // Mol. Microbiol. 1999. -V.31.-P.9-17.

102. Guignot J., Mock M., Fouet A. AtxA activates the transcription of genes harbored by both Bacillus anlhracis virulence plasmids // FEMS Microbiol. Lett. -1997. V.147. - P.203-207.

103. Gupta P., Waheed S.M., Bhatnagar R. Expression and purification of the recombinant protective antigen of Bacillus anthracis // Protein Expr. Purif. 1999. -V.16. - №.3. - P.369-376.

104. Hahn J., Dubnau D. Analysis of plasmid deletional instability in Bacillus subtilis //J. Bacterid. 1985. - V. 162. - P. 1014-1023.

105. Hahn U.K., Aichler M., Boehm R., Beyer W. Comparison of the immunological memory after DNA vaccination and protein vaccination against anthrax in sheep // Vaccine. 2006. - V.24. - №.21. - P.4595 - 4597.

106. Hahn U.K., Alex M., Czerny C.P. et al. Protection of mice against challenge with Bacillus anthracis STI spores after DNA vaccination // J. Med. Microbiol. -2004. V.294. - №.1. - P.35-44.

107. Hoffmaster A.R., Koehler T.M. Control of virulence gene expression in Bacillus anlhracis //J.Appl. Microbiol. 1999(b). - V.87. - P.279-281.

108. Hoffmaster A.R., Koehler T.M. Autogenous regulation of the Bacillus anlhracis pag operon. //J.Bacteriol. 1999(a). - V.181. - P.4485-4492.

109. Iacono-Connors L.C., Welkos S.L., Ivins B.E., Dalrymple J.M. Protection against anthrax with recombinant virus-expressed protective antigen in experimental animals //Infect, and Immun. -1991,- Vol. 59. №.6. - P. 1961-1965.

110. Irie R., Fujita Y., Kobayashi M. Nucleolide sequence and gene organization of the gerK spore germination locus of Bacillus subtilis 168 // J. Gen. Appl. Microbiol. -1996. V.42. - P.141-153.

111. Ivins B.E. Cloned protective activity and progress in development of improved vaccines, p.65. In: P.C.B.Turnbull (ed.), Proc. Int. Workshop on Anthrax. Salisbury Med. Bull., Winchester, England. 1989.

112. Ivins B.E., Welkos S.L. Cloning and expression of Bacillus anthracis protective antigen in Bacillus subtilis // Infect, and Immun. 1986. - V.54. - P.537-542.

113. Ivins B.E., Welkos S.L., Knudson G.B., Leblanc D.J. Transposon Tn916 mutagenesis in Bacillus anthracis //Infec. and Immun. 1988. - V.56. - P.176-181.

114. Jernigan J.A., Stephens D.S., Ashford D.A. et al. Bioterrorism-related inhala-tional anthrax: the first 10 cases reported in the United States // Emerg. Infect. Dis. 2001. - №7. - P.933-944.

115. Kado C.I., Liu S.-T. Rapid procedure for detection and isolation of large and small plasmids // J.Bacteriol. 1981. - V. 145. - № 3. - P. 1365-1373.

116. Keim P., Kalif A., Schupp J. et al. Molecular evolution and diversity in Bacillus anthracis as delected by amplified fragment length polymorphism markers // J.Bacteriol. 1997. - V.179. - P.880-824.

117. Koehler T.M., Dai Z., Kaufman-Yarbray M. Regulation of the Bacillus anthracis protective antigen gene: CCh and a trans-acting element activate transcription from one of two promoters. // J. Bacteriol. 1994. -V.176. - P.586-595

118. Koehler T.M., Ruhfel R.E., Greem B.D., Thorne C.B. Plasmid-related differences in capsule production by Bacillus anthracis. In: Abstr. 86th Annu.Meet. -Washington D.C., 23-28 March 1986. P. 157.

119. Koehler T.M., Thorne C.B. Bacillus subtilis (natto) mediates interspecies plas-mid transfer //J.Bacteriol. 1987. - V.169. - №.11. - P.5271-5278.

120. Koya V., Moayeri M., Leppla S.H., Daniell H. Plant-based vaccine: mice immunized with chloroplast-derived anthrax protective antigen survive anthrax lethal toxin challenge. // Infect, and Immun. 2005. - Vol.73. - №.12. - P.8266-8274.

121. Lee J.S., Hadjipanayis A.G., Welkos S.L. Venezuelan equine encephalitis virus-vectored vaccines protect mice against anthrax spore challenge // Infect, and Immun. 2003. - V.71. - №.3. - P. 1491-1496.

122. Leppla S.H. Bacillus anthracis calmodulin-dependent adenylate cyclase: chemical and enzymatic properties and interaction with eucariotic cells // Adv.Cycl.Nu-cleotide Prot. Phosphoryl. Res. 1984. - V.17. - P.189-198.

123. Leppla S.H. Production and purification of anthrax toxin // Methods Enzymol. -1988.-V.165.-P.103-116.

124. Leppla S.H. The anthrax toxin complex, p. 277-302. In: Alouf J. and Freer J, Sourcebook of bacterial protein toxins., London: Academic Press. 1991.

125. Leppla S.H., Bhatnagar R., Friedlander A.M. Internalisation and processing of Bacillus anthracis lethal toxin by toxin-sensitive and resistant cells // J. Bi-ol.Chem. - 1989. - V.264. - P.ll099-11102.

126. Leppla S.H., Friedlander A.M., Singh Y. et al. A model for anthrax toxin action at the cellular level, p.41-43. In: P.C.B.TurnbuIl, Proc. Int. Workshop on Anthrax. Salisbury Med. Bull., Winchester, England. 1989.

127. Linkoln R.E., Fish D.C. Anthrax toxin, p.361-414. In: T.C. Montie, S. Kadis, S.J. Ajl, Microbial Toxins III, New York. 1970.

128. Losick R., Youngman P., Piggot P. J. Genetics of endospore formation in Bacillus subtilis //Ann. Rev. Genet. 1986. - V.20. - P.625-669.

129. Makino S., Sasakawa C., Uchida N. et al. Cloning and CO2 dependent expression of the genetic region for encapsulation from Bacillus anthracis // Mol. Mi-cobiol. -1988. - V.2. - №.7. - P.371-376.

130. Makino S.-I., Sasakawa C., Uchida N. et al. Transformation of a cloning vector pUB 110 into Bacillus anthracis I IFEMS Microbiol. Lett. 1987. - V.44. - № .1. -P.45-48.

131. Makino S.-I., Uchida N., Terakado I. et al. Molecular characterization and protein analyses of cap region which is essential for encapsulation in Bacillus anthracis //J. Bacteriol. 1989. - V.171. - P.722-730.

132. Matsuda M., Kameyama T. Gene expression at each stage of the life cycle of spore-forming bacteria: Different sensitivity of transcription to antibiotics which act on DNA gyrase //J. Basic Micobiol. 1985. - V.5.- №.7. - P.443-449.

133. McBride B.W., Mogg A., Telfer J.L. et al. Protective efficacy of a recombinant protective antigen against Bacillus anthracis challenge and assessment of immunological markers // Vaccine. 1998. - Vol. 16. - №.8. - P.810-817.

134. Mendelson I., Gat 0., AIoni-Grinstein R. et al. Efficacious, nontoxigenic Bacillus anthracis spore vaccines based on strains expressing mutant variants of lethal toxin components // Vaccine. 2005. - V.23. - P.5688-5697.

135. Mesnage S., Tosi-Couture E., Fouet A. Production and cell surface anchoring of functional fusions between the SLH motifs of the Bacillus anthracis S-layer proteins and the Bacillus subtilis levansucrase I I Mol. Microbiol. 1999(a). - V.31. -P.927-936.

136. Mesnage S., Weber-Levy M., Haustant M. et al. Cell surface exposed tetanus toxin fragment С produced by recombinant Bacillus anthracis protects against tetanus toxin // Infect, and Immun. 1999(b). - V. - 67. - P.4847-4850.

137. Meynell E., Meynell G.G. The roles of serum and carbon dioxide in capsule formation by Bacillus anthracis I I J. Gen. Microbiol. 1964. - V.34. - P.153-164.

138. Michel В., Niaudet В., Ehrlich S. Intramolecular recombination during plasmid transformation of Bacillus subtilis competent cells I I ENBO J. 1982. - Vol.1. -№12.-P. 1565-1571.

139. Mignot Т., Mock M., Fouet A. A plasmid encoded regulator couples the synthesis of toxins and surface structures in Bacillus anthracis // Mol. Microbiol. -2003. V.47. - P.917-927.

140. Mikesell P., Ivins B.E., Ristroph J.D., Dreier T.M. Evidence for plasmid-mediat-ed toxin production in Bacillus anthracis // Infec. and Immun. 1983. - V.39. -P.371-376.

141. Miller J., McBride B.W., Manchee R.J. et al. Production and purification of recombinant protective antigen and protective efficacy against Bacillus anthracis // Letters in Applied Microbiology. 1998. - Vol. 26. - №.1. - P. 56-60.

142. Mock M., Labruyere E., Glaser P. et al. Cloning and expression of the calmod-ulin-sensitive Bacillus anihracis adenylate cyclase in Escherichia coli // Gene. -1988. -V.64. P.277-284.

143. Narrero R., Welkos S.L. The transformation frequency of plasmids into Bacillus anthracis is affected by adenine methylation // Gene. 1995. - V.152. - P.75-78.

144. Okinaka R.T., Cloud К., Hampton О. et al. Sequence and organization of pXOl, the large Bacillus anthracis plasmid harboring the anthrax toxin genes // J. Bacte-riol. 1999. - V.181. - P.6509-6515.

145. Oultram G. D., Young M. Conjugal transfer of plasmid pAM(31 from Streptococcus lactis and Bacillus subtillis to Clostridium acetobutilicum I I FEMS Microbiol. Lett. -1985. V.27. - P.129-134.

146. Ozawa K., Swahana H. Involvement of transmissible plasmid in heat-stable exotoxin and delta-exotoxin production in Bacillus thuringiensis susp. Alarmstadien-sis // Curr. Microbiol. 1986. - V.13. - P.337-340.

147. Pavlov V., Tedikov V., Mokrievich A. Cloning of on pXOl and pag-gene of Bacillus anthracis in Francisella tularensis, p. 108-109 In: Proc. Int. Workshop on Anthrax. Salisbury Med. Bull., Winchester, England. 1995.

148. Perlak F. J., Mendelson C.L., Thorne C.B. Converting bacteriophage for spoliation and crystal formation in Bacillus thuringiensis // J.Bacteriol. 1979. -V.140. - P.699-706.

149. Piggot P.J., Coote J.G. Genetic aspects of bacterial endospore formation // Bacterid. Rews. 1976. - V. 40. - P. 908-962.

150. Preisz H. Experimentelle studien aber virulenz, empfanglichkeit und immunitat beim milzbrand //Zeitschr. Immunitat. 1909. - V.5. - P.341-452.

151. Price B.M., Liner A.L., Park S. et al. Protection against anthrax lethal toxin challenge by genetic immunization with a plasmid encoding the lethal factor protein // Infect, and Immun. 2001. - V.69. - №.7. - P.4509-4515.

152. Quinn C.P., Dancer B.N. Transformation of vegetative cells of Bacillus anthracis with plasmid DNA // J. Gen. Microbiol. 1990. - V.136. - №.7. - P.1211-1215.

153. Quinn C.P., Shone C.C., Turnbull P.C.B., Melling J. Purification of anthrax-toxin components by high-performance anion-exchange, gel-filtration and hydropho-bic-interaction chromatography // J. Biochem. 1988. - V.252. - P.753-758.

154. Ramirez D.M., Leppla S.H., Schneerson R., Shiloach J. Production, recovery and immunogenicity of the protective antigen from a recombinant strain of Bacillus anthracis // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2002. - V.28. - №.4. - P.232-238.

155. Riemenschneider J., Garrison A., Geisbert J. ct al. Comparison of individual and combination DNA vaccines for B. anthracis, Ebola virus, Marburg virus and Venezuelan equine encephalitis virus I I Vaccine. 2003. - V.21 (25-26). - P. 40714080.

156. Robertson D.L., Bragg T.S. Mapping and characterization of Bacillus anthracis plasmids pXOl and pX02, p.88-89. In: P.C.B.Turnbull (ed.), Proc. Int. Workshop on Anthrax. Salisbury Med. Bull., Winchester, England. 1989.

157. Robertson D.L., Leppla S.H., Molecular cloning and expression in Escherichia coli of the lethal factor gene of Bacillus anthracis // Gene. 1986. - V.44. - P.71-78.

158. Robertson D.L., Tippets M.T., Leppla S.H. Nucleotide sequence of the Bacillus anthracis edema factor gene (cya): a calmodulin-dependent adenylate cyclase//Gene. 1988.- V.73 - P.363-371.

159. Robillard N.J., Koehler T.M., Murray R., Thorne C.B. Plasmid pBAl-mediated toxin production in Bacillus anthracis cells //Abstr. Annu. Meet. Amer. Soc. Microbiol. -1983. V.54. - P. 115.

160. Roger L.K., Robertson D. L. Purification and physical analisis of Bacillus anthracis plasmids pXOl and pX021 I Biochim. Biophys. Res. Commun. 1987. -Vol. 149.-№. 2. - P.362-368.

161. Ruhfel R.E., Robillard N.I., Thorne C.B. Interspecies transduction of plasmids among B. anthracis, B.cereus and B.thuringiensis I I J.Bacteriol. 1984. -V.157. -№.3. -P.708-711.

162. Singh Y., Leppla S.H., Bhatnagar R., Friedlander A.M. Bases of cellular sensitivity and resistance to anthrax lethal toxin, p.51. In: P.C.B.Turnbull, Proc. Int. Workshop on Anthrax. Salisbury Med. Bull., Winchester, England. 1989.

163. Sirard J.-C., Mock M., Fouet A. The three Bacillus anthracis toxin genes are coordinately regulated by bicarbonate and temperature // J. Bacteriol. 1994. -V.176. - P.5188-5192.

164. Smith H., Keppie J., Stanley J.L. The chemical basis of the virulence of Bacillus anthracis. The specific toxin produced by Bacillus anthracis in vivo // Br. J. Exp. Pathol. 1955. - V.36. - P.460-472.

165. Spencer R.C., Lightfoot N.F. Preparedness and response to bioterrorism // J. Infect. 2001.- V.43.-P.104-110.

166. Stanley J.L., Smith H. Purification of factor I and recognition of third factor of the anthrax toxin //J.Gen.Microbiol. 1961. - V.26. - P. 49-66.

167. Stanley J.L., Smith H. The three factors of anthrax toxin: their immunogenicity and lack of demonstrable enzyme activity // J.Gen.Microbiol. 1963. - V.31. -P. 329-327.

168. Steichen C., Chen P., Kearney G.F., Turnbough C.L. Identification of the immunodominant protein and other proteins of the Bacillus anthracis exosporium // J.Bacteriol. 2003. - V. 185. - №.6. - P. 1903-1910.

169. Stepanov A., Marinin L., Pomerantsev A. et al. Development of novel vaccines against anthrax in man // J. Biotechnol. 1996. - Vol. 44. - P. 155-160.

170. Stepanov A.S., Gavrilov S.V., Puzanova O.B. et al. Transduction of plasmid in Bacillus anthracis by bacteriophage CP-54 // Mol. Gen., Microbiol and Virol. -1989 -V.l.-P.14-19.

171. Stepanov A.S., Puzanova O.B., Dityatkin S.Y. et al. Glycine-induced cryotrans-formation of plasmids into Bacillus anthracis I I J.Gen. Microbiol. 1990. -V.136. -P.1217-1221.

172. Swanson-Biearman В., Krenzelok E.P. Delayed life-threatening reaction to anthrax vaccine // J. Clin. Toxicol. 2001. - V. 39. - Iss. 1. - P. 81-84.

173. Thorne C., Belton F. An agar diffusion method for titrating Bacillus anthracis immunizing antigen and its application to a study of antigen production // J. Gen. Microbiol. 1957. - Vol. 17. - P. 505-516.

174. Thorne C.B. Biochemical properties and virulent and avirulent strains of Bacillus anthracis //Ann.N.-Y.Acad.Sci. 1960. - V.88. - P.1024 - 1033.

175. Thorne C.B. Genetic and physiological studies of Bacillus anthracis related to development of an improved vaccine. In: Annu. Progr. Rep. Univ. Mass. 1989. -P.l-58.

176. Thorne C.B. Transduction in Bacillus cereus and Bacillus anthracis 11 Bacteriol. Rev. 1968(a). - V.32. - P.358 - 361.

177. Thorne C.B. Transduction in Bacillus cereus and Bacillus anthracis 11 J.Virol. -1968(6). V.2. - №.7. - P.657-662.

178. Thorne C.B. Transduction in Bacillus thuringiensis 11 Appl. Environ. Microbiol. 1978. - V.35. - №.6. - P.1109-1115.

179. Thorne C.B. Genetics of Bacillus anthracis, p.56-62. In: Leive L. (ed.). Amer.-Soc. Microbiol., Washington D.C. 1985.

180. Thorne C.B., Gomez C.G., Housewright R.D. Synthesis of glutamic acid and glutamyl polypeptide by Bacillus anthracis. II. The effect of carbon dioxide on peptide production on solid media//J.Bacteriol. 1952. - V.63. - P.363-368.

181. Thorne C.B., Monlar D.M. D-aminoacid transamination in Bacillus anthracis 11 J.Bacteriol. 1955. - V.70. - P.420-426.

182. Tippets M.T., Robertson D.L. Molecular cloning and expression of Bacillus anthracis edema factor toxin gene: a calmodulin-dependent adenylate cyclase // J.Bacteriol. 1988. - V.170. - №.5. - P.2263 - 2266.

183. Todd S. J., Moir A.J., Johnson M.J., Moir A. Genes of Bacillus cereus and Bacillus anthracis encoding proteins of the exosporium // J.Bacteriol. 2003. -V.l 85. -№.11.- P.3373 - 3378.

184. Towbin H., Staehelin Т., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. - Vol.76. - P. 4350-4354.

185. Turnbull P. Anthrax vaccines: past, present and future // Vaccine. 1991. - Vol. 9. - P. 533-539.

186. Turnbull P.C.B., Hutson R.A., Ward M.J. et al. Bacillus anthracis but not always anthrax // J. Appl. Bact. 1992. - V.72. - P.21-28.

187. Uchida I., Sekizake Т., Hashimoto K., Terakado N. Association of the incapsu-lation of Bacillus anthracis with 60 megadalton plasmid//J. Gen. Microbiol. 1985. - Vol.l31.-P.363-367.

188. Uchida I., Hashimoto K., Makino S. et al. Restriction map of capsule plasmid of Bacillus anthracis //Plasmid. 1987. - V.18. - P.l78-181.

189. Uchida I., Hashimoto K., Terakado N. Virulence and immunogenic city in experimental animals of Bacillus anthracis strains harboring or lacking 110 mDa and 60mDa plasmids //J. Gen. Microbiol. 1986. - V.l32. - P.557-559.

190. Uchida I., Hornung J.M., Thome C.B. et al. Cloning and characterization of a gene whose product is a trans-activator of anthrax toxin synthesis // J.Bacteriol. -1993. V.175. - P.5329 -5338.

191. Uchida I., Makino S., Sasakawa C. et al. Identification of a novel gene, dep, associated with depolymerization of the capsular polymer in Bacillus anthracis // Mol. Microbiol. 1993. - V.9. - P.487-496.

192. Uchida I., Makino S.-I., Sekizaki Т., Terakado N. Cross-talk to the genes for capsule synthesis of Bacillus anthracis by atxA, the gene encoding /raws-activator anthrax toxin synthesis // Mol. Microbiol. 1997. - V.23. - P.1203-1213.

193. Vietri N.J., Marrero R., Hoover T.A., Welkos S.L. Identification and characterization of a trans-activator involved in the regulation of encapsulation by Bacillus anthracis // Gene. 1995. - V.l52. - P. 1-9.

194. Vodkin M., Leppla S.H. Cloning of the protective antigen gen of Bacillus anthracis // Cell. 1983. - V.34. - P.693-697.

195. Welkos S.L., Becker D., Friedlander A., Trotter R. Susceptibility of mice to anthrax and genetics of resistance to the Sterne vaccine strain, p. 54-55. In:

196. P.C.B.Turnbull, Proc. Int. Workshop on Anthrax. Salisbury Med. Bull., Winchester, England. 1989.

197. Welkos S.L., Plasmid-associated virulence factors of non-toxigenic (pXOl-) Bacillus anthracis I I Microb.Pathog. -1991. V.10. - P.183-198.

198. Welkos S.L, Lowe J.R., Eden-McCutchan F. et al. Sequence and analysis of the DNA encoding protective antigen of Bacillus anthracis // Gene. 1988. - V.69. -P.287-300.

199. Welkos S.L., Friedlander A.M. Pathogenesis and genetic control of resistance to the Sterne strain of Bacillus anthracis // Microb.Pathog. 1988. - V.4. - P. 53-59.

200. Welkos S.L., Vietri N.J., Gibbs P.H. Non-toxigenic derivatives of the Ames strain of Bacillus anthracis are fully virulent for mice: role of plasmid pX02 and chromosome in strain-dependent virulence // Microb. Pathog. 1993. - V.14. -P.381-88.

201. Williamson E.D., Bennett A.M., Perkins S.D. et al. Co-immunisation with a plasmid DNA cocktail primes mice against anthrax and plague // Vaccine. 2002. - V. 20(23-24). - P.2933-2941.

202. Worsham P.L, Sowers M. Isolation of an asporogenic (spoOA) protective antigen-producing strain of Bacillus anthracis // Canadian Journal of Microbiol. -1999.-V. 45.-P. 1-8.

203. Wright G.G. Influence of spermine and related substances on susceptibility of Bacillus anthracis to lyzozyme 11 Proc. Soc. Exp. Biol.Med. 1961. - V.108. -P.740-742.

204. Zegers N.D., Kluter E., van Der Stap H. et al. Expression of the protective antigen of Bacillus anthracis by Lactobacillus casei: towards the development of an oral vaccine against anthrax // J. of Applied Microbiol. 1999. - Vol.87. - №2. P.309-314

205. Zwartouw H.T, Smith H. Polyglutamic acid from Bacillus anthracis grown in vivo: structure and aggressin activity // Biochem. J. 1956. - V.63. - P.437-454.

Информация о работе

Кудрявцева, Ольга Михайловна
кандидата биологических наук
Саратов, 2007
ВАК 03.00.07

Диссертация

Генетическое конструирование штаммов - продуцентов протективного антигена Bacillus anthracis - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы