Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биологические и популяционные аспекты патогенности Bacillus Anthracis

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Биологические и популяционные аспекты патогенности Bacillus Anthracis"

prs од

2 k ноя <г»07

На правах рукописи

ЕРЁМЕНКО Евгений Иванович

БИОЛОГИЧЕСКИЕ И П О ПУЛ Я Ц И ОН Н Ы К АСПЕКТЫ ПАТОГЕННОСТИ BACILLUS ANTHRACIS

03.00 07 - микробиология

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени доктора медицинских наук

Ставрополь - 1997

Работа выполнена в Ставропольском научно-исследовательском противочумном институте

Защита состоится 17 декабря 1997 г. в 13 час. на заседании Специализированного Совета Д 074.32.01 по защите диссертаций на соискание ученой' степени доктора наук при Российском научно-исследовательском противочумном институте ''Микроб" (410005, г.Саратов, Университетская, 46)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института "Мигаэоб".

Научный консультант: засуженный деятель науки РФ,

доктор медицинских наук, профессор Бураецева Н.П. Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

. профессор Самойлова Л.В. доктор медицинских наук, профессор Анисимоеа Т.И. доктор медицинских наук, профессор Люшицкий A.B.

Ведущая организация: Государственный научно-

исследовательский институт прикладной микробиологии (г.Оболенск)

ноября 1997 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета, доктор биологических наук,

Г^А.Корнеев

!

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Сибиреязвенный микроб являет ся возбудителем острой зооантропонозной инфекции, эпидемические и эпизоотические проявления которой имеют большую социальную и экономическую значимость. При современном мировом уровне-заболеваемости людей от 20 до 100 тыс. в год (Бургасо'в ПЛ., Рожкоп Г.И., 1984) сибирская язва продолжает представлять собой серьезную проблему для здравоохранения и сельского хозяйства многих стран, включая Россию.

Потенциал инфекции поддерживается существованием множества почвенных очагов, которые проявляют себя ежегодными вспышками сибирской язвы сельскохозяйственных животных и сопутствующими им заболеваниями людей. На Северном Кавказе трудно наши населенный пункт или хозяйство, где за последние 40 лет не регистрировалась, хотя бы спорадически, сибирская язва. Чеченская Республика, например, относится к регионам, где эта инфекция отмечается ежегодно, только официально зарегистрировано 157 стационарно неблагополучных по этой инфекции крупных населенных пунктов, в которых учтено 276 почвенных очагов (Еременко Е.И. с соавт.,1996). С большим постоянством случаются спорадические вспышки этой инфекции в Ставропольском крае, где на учете имеется 723 почвенных очага, Карачаево-Черкесской Республике, Кабардино-Балкарской Республике, Республике Северная Осетия, Дагестане (Богданов И.К. н Пугачева О.И., 1991, Н.П.Буравцева с соавт, 1992, 1594).

В 1990 - 1996 г заболеваемость людей сибирской язпой в РФ колебалась от 0,016 до 0,032 па 100000 населения, ' при этом

тенденции к снижению не наблюдалось. В 1992 к 1993 году отмечались дне крупные вспышки инфекции п Карачаево-Черкесской и Кабардино-Балкарской республиках. В нынешних условиях перехода к рыночной экономике с нарушенными прежними и еще не сложившимися новыми экономическими механизмами, ослаблением государственного контроля за природопользованием, животноводством, производством и реализацией его продуктов, снижением качества лабораторной, противоэпидемической, 1гротнвоэ1ш:юотической и лечебной работы в России и странах СНГ следует ожидать подъема заболеваемости сибирской язвой.

Характерная особенность сибирской язвы - возможность внезапной активизации инфекции даже в экономически развитых странах, где животноводство исторически является одной из ведущих отраслей хозяйства. Примером может служить эпизоотия этой инфекции в Австралии в 1997 году, неожиданно возникшая на фоне многих десятилетий полного благополучия.

Типичные проявления сибирской яззы пос ледних лет. в развитых странах представлены отдельными случаями заболеваний людей в результате инфицирования при контакте с импортированным сырьем или продукцией животноводства. Число подобных случаев может увеличиться в связи с расширением импорта из неблагополучных стран.

В числе целого ряда неразрешенных вопросов, составляющих глобальную проблему сибирской язвы, по-прежнему актуальными для изучения остаются механизмы заражения животных в естественных условиях, переживания возбудителя сибирской язвы во внешней среде и сопутствующих этой фазе его жизненного цикла изменения основных свойств, поиск характерных особеностей разных штаммов, пригодных доя использования в качестве

эпидемиологических маркеров, защита организма чувствительных животных от так называемых "вакцинорезистентных" штаммов В. anthracis.

Свидетельством интереса ученых многих стран к перечисленным вопросам является существование и успешное выполнение программы по созданию новых вакцин против сибирской язвы.

Сибиреязвенный микроб служит объектом исследования уже более 100 лет, однако и сейчас многие свойства этого микроорганизма остаются неясными. В последнее десятилетие появилось много работ, которые позволяют по - новому взглянуть на известные свойства B.anthracis. Возобновление интереса к возбудителю сибирской язвы и к самой инфекции свидетельствует о неудовлетворенности ученых своими представлениями о них и недостаточной эффективности существующей системы противосибиреязвенных мероприятий.

В настоящее время патогенность сибиреязвенного мккроба ассоциируется с наличием у него двух основных факторов -экзотоксина и капсулы. Установлено, что продукция этих факторов детерминируется плазмидами pX01(Mikesell P. et al.,1983) и рХ02 (Green B.D. et al., 1985, Uchida I. et al., 1985). Считается, что сибиреязвенный микроб становится авирулентным, утратив любую из этих плазмид или обе. Очевидно, однако, что патогенность является полидетерминантным признаком и не исчерпывается этими двумя факторами.

Среди штаммов сибиреязвенного микроба имеется значительная доля атипичных по патогенности и ряду свойств, вероятно, с нею связанных. Часть атипичных штаммов с такими свойствами была выделена из почвы, являющейся альтернативной средой обитания

для сибиреязвенного микроба. Эпидемическая и эпизоотическая значимость эшх штаммов не выяснена, как и возможность реверсии к нормальному фенотипу. Поэтому при выделении таких штаммов всегда возникает вопрос, следует ли проводить все те же мероприятия, что и при выделении типичных вирулентных штаммов. Малая изученность подобных штаммов, на наш взгляд, связана не в последнюю очередь с тем, что не разработаны методы их выделения и идентификации.

Значительный прогресс в изучении биологических основ патогенности В.аШкгасЬ был достигнут благодаря разработке молекулярно-биолошческих методов исследования применительно к этому объекту. Однако следует иметь в виду, что основные данные были получены при изучении разработанных изогенных систем штаммов с разным набором плазмид, сконструированных на основе типичных вирулентных или аттенуированных вакцинных штаммов. Представляет большой интерес проведение подобных исследований на атипичных штаммах, для чего первоочередным делом является конструирование изогенной системы на основе атипичного по патогенности штамма сибиреязвенного микроба. Немаловажным представляется также, адаптация разработанных молекулярно-оиологических методов применительно к атипичным штаммам.

Установлено, что популяционный состав культур сибиреязвенного микроба по многим признакам варьирует, однако данных о связи количества клонов с разным фенотипом и генотипом в сосгаве популяции с патогенносгью и об ее изменениях => зависимости от состава практически нет.

Наконец, до сих пор нет единой признанной схемы внутривидовой дифференциации сибиреязвенного микроба, в которой было бы место для атипичных штаммов, из-за чего различия

в вирулентности определяются количественно и не отражают разнообразия вариантов возбудителя сибирской язвы.

Таким образом, актуальность работы связана с недостаточной изученностью особенностей атипичных штаммов сибиреязвеннЬго микроба, имеющих значение для их патогенности, изучение которых может способствовать усовершенствованию методов лабораторной диагностики, профилактики и тактики проведения противоэпидемических мероприятий.

Цель работы. Получение экспериментальных данных о биологических и популяционных свойствах штаммов B.anthracb с атипичной патогенностыо и применение полученных данных в лабораторной диагностике, профилактике и эпидемиологии сибирской язвы .

Для достижения этой цели были поставлены задачи:

1. Конструирование и усовершенсгвовшше специальных питательных сред для выделения и изучения атипичных по патогенности штаммов сибиреязвенного микроба.

2.Разработка метода выделешш атипичных штаммов Bacillus anthracis.

3.Создание метода исследования популяционного состава штаммов сибиреязвенного микроба по основным признакам, связанным с патогенностыо.

4. Модификация методов выделения нуклеиновых кислот возбудителя сибирской язвы .

5. Изучение основных фенотипов калсуло- и токсинообразования in vitro сибиреязвенного микроба .

6.Определение частоты встречаемости штаммов Bacillus anihracis с атипичной патогенностыо .

к

7.Исследование пбпуляционного состава штаммов возбудителя сибирской язвы, атипичных по патогенности, чувствительности к антибиотикам, по признакам капсуло-, токсинообразования, гемолитической и протеолитической активности, потребности в ароматических аминокислотах.

8.Сравнительное изучение вирулентности атипичных штаммов для разных лабораторных животных.

9. Разработка метода дифференциации штаммов Bacillus anlhracis по патогенности in vitro.

10.Разработка метода отбора иммуногенных вакцинных штаммов in vitro.

11.Создание прототипов перспективных полирезистентных вакцинных штаммов.

12.Определение критериев оценки эпидемической значимости атипичных штаммов и схемы внутривидовой дифференциации штаммов возбудителя сибирской язвы.

Научная новизна работы.

Впервые предложены методы выделения штаммов сибиреязвенного микроба с атипичным капсулообразованием и вирулентностью.

Впервые показано, что фенотипическое выражение капсулообразования и токсинообразования, протеолитической и гемолитической активности в отношении определенных субстратов in vitro, зависимость от аминокислот у сибиреязвенного микроба носят характер, свойственный группам штаммов с разной патогенносгью и могут сочетанно изменяться соответственно степени патогенности.

Впервые установлено, что популяхцш штаммов S.antkracls неоднородны по вышеперечисленным, признакам, морфологии

колоний на плотных питательных средах, плазмидному составу п представлены субпопуляциями, которые могут быть выделены в виде стабильных или диссоциирующих культур. Идентифицированы основные группы штаммов по признакам фенотипа, плазмидотипа и однородности популяции по этим признакам. Показано, что возрастание вирулентности в процессе пассирования штаммов с атипичной патогенпостыо через организм белых мышей сопровождается направленной перестройкой популяции штамма и прослежена ее динамика.

Впервые с учетом изменения ■ популяционных свойств предложены критерии эпидемической значимости и тест для атипичных штаммов на реверсию к патогенности.

Разработаны прототипы перспективных полирезисгентных вакцинных штаммов на основе штамма СТИ-ПР с устойчивостью к пенициллину, рифамшщину и тетрациклину, а также пенициллину, рифампицину я канамицину.

Подобрана коллекция из 6 различающихся по фенотипу капсуло-, токсинообразования и плазмидному составу изогенных вариантов, полученных на основе атипичного штамма сибиреязвенного микроба .

Предложены рецептуры новых сухих питательных сред для выделения - и " культивирования сибиреязвеннного микроба на непищевых основах.

Впервые предложена среда для сочетанного определения продукции капсулы и экзотоксина сибиреязвенного микроба.

Впервые разработаны новые методы оценки культур сибиреязвенного микроба по патогенности и иммуиогенности in vitro.

Впервые предложен метод восстановления вирулентности штаммов сибиреязвенного микроба.

Разработан метод получения нуклеиновых кислот сибиреязвенного микроба.

На среду ддя сочетаиного определения продукции экзотоксина и капсулы сибиреязвенного микроба, способ дифференциации культур сибиреязвенного микроба по вирулентности in vitro, способ отбора нммуногенпых субкультур сибиреязвенных вакцинных штаммов in vitro, способ повышения вирулентности сибиреязвенного микроба и способ получения нуклеиновых кислот у Bacillus unthraris получены положительные решения о выдаче патентов па изобретения.

Теорешческая значимость и практическая ценность.

Полученные данные о популяционных особенностях атипичных :'.глммоп и перестройке популяции, коррелирующей с изменениями патогепностч культур, могут иметь значение ßjui развития представлений о механизмах реализации патогспности и приспособления сибиреязвенного микроба к условиям обитания во внешней среде.

Ноиые специальные питательные среды и методы исследования сибиреязвенного микроба вошли в практику в виде выпускаемой среды сухой для выделения и культивирования сибиреязвенного микроба, а также следующих технологических, инструктивных и методических документов:

- Изменения к временной фармакопейной статье на питательную среду для выделения и культивирования сибиреязвенного микроба на основе аминопеппща ВФС42-41ВС-86, утвержденные начальником Управления по контролю качества лекарственных средств и медицинской техники в 1987 г.

Регламент производства на сухую среду л/ти выделения и культивирования сибиреязвенного микроба па основе аминопептида № 72-87, утвержденные начальником

Управления по контролю качества лекарственных средств I? медицинской тёхннки в 1987 г.

- Инструкция по применению среды для пы,деления и культивирования сибиреязвенного микроба сухой, утвержденные начальником Управления по контролю качества лекарственных средств и медицинской техники в 1987 г.

- Методические указания "Лабораторная диагностика сибирской язвы у животных и людей, обнаружение возбудителя в сырье животного происхождения и объектах внешней среды", Москва,1989 (Утверждены начальником ГУКИ МЗ СССР и начальником ГУВГ агропромышленного комитета СССР 1.09.1986.)

- Фармакопейная статья ФС 42-437ВС--94 на питательную среду для выделения и культивирования сибиреязвенного микроба, сухуто, утвержденная начальником Управления по котггролю качества лекарственных средств и медицинской техники 22.07.1994 г.

Регламент производства на питательную среду для выделения и культивирования сибиреязвенного микроба, сухую, утвержденный начальником Управления по контролю качества лекарственных средств и медицинской техники 22.07.1994 г.

- Инструкция по приготовлению и контролю питательной среды для выделения и культивирования сибиреязвенного микроба и инструкция по применению питательной среды для выделения и культивирования сибиреязвенного микроба, утвержденные начальником Управления по контролю качества лекарственных средств и медицинской техшнеи 22.07.1994 г.

Методические рекомендации по выделению штаммов сибиреязвенного микроба с атипичным капсулообразованием и вирулентностью, утвержденные заместителем начальника ГУ К И М 3 СССР 28.12.1987 г.

- Методические рекомендации по оценке патогенных и нммуногенных свойств сибиреязвенных культур in vitro, утвержденные первым заместителем министра здравоохранения РФ 31 января 1997 г.

- Методические рекомендации по дифференциации штаммов енбиреяэвеиого микроба по патогенности in vitro, утвержденные директором СНИПЧИ в 1993 г.

- Методические рекомендации по отбору иммуногешшх субкультур сибиреязвенных вакцинных нггаммов in. vitro, утвержденные директором СНИПЧИ в 1993 г.

- Методические рекомендации по определению потребностей штаммов сибиреязвенного микроба в факторах роста, утвержденные директором НИПЧИКиЗ в 1990 г.

Кроме того, вопросы лабораторной диагностики и профилактики сибирской язвы нашли отражение в двух целевых комплексных программах:

"Профилактика особо опасных инфекции и санитарная охрана ¿¿ppirropini Ставропольского края от завоза и ' распространения •'конвенционных инфекционных заболеваний" на 1993 - 1995 гг., утвержденной постановлением главы администрации края 14.10.1993 г.;

"Обеспечение эпидемического благополучия по особо опасным -•< прнродно-очагог.ым заболеваниям и улучшение медико-дологической обстановки на Юге России" на 1994 - 1996 гг.,

одобренной решением Совета ассоциации республик, краев и областей Северного Кавказа 15.05.1994 г.

Научные и практически значимые результаты работы используются в лекционном курсе по эпидемиологии, микробиологии и профилактике сибирской язвы для слушателей функциоштрующих при СНИПЧИ курсов специализации врачей общей медицинской сети и курсов первичной специализации работников противочумной службы страны.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Метод выделения штаммов сибиреязвенного микроба с использованием селективной среды для Bacillus anthracis позволяет выделять как типичные, так и штаммы с атипичным капсулообразованием и вирулентностью

2.. Предлагаемая питательная среда для сочетанного определения продукции экзотоксина и капсулы сибиреязвенного микроба дает возможность определять одновременно продукцию как экзотоксина, так и капсулы у всех изученных штаммов, при использований любого посевного материала и изучать популяционный состав штаммов по этим признакам

3. Фенотипическое выражение калсулообразоваиия и токеннообразования, протеолитической и гемолитической активности в отношении определенных субстратов in vitro зависимость от аминокислот у сибиреязвенного микроба х-плазмидный состав носят характер, свойственный группам штаммов с разной пагогенностъю и могут сочетанно изменяться при изменении патогенных свойств.

4. Розу пл аты оценки популяционкого состава атипичнчч штаммов üo оишеперечисленным признакам, отбора вариапк-п

ф с но п л аз м идот! I па и пассирования через организм белых мышей могут служить тесл ом на эпидемическую значимость таких штаммов.

5. Схема внутривидовой таксономии сибиреязвенного микроба при достаточно четком разделении всех штаммов на группы с определенным фено- и плазмидотипом дает возможность проследить закономерные взаимопереходы между ними, сопровождающиеся .вменениями однородности популяции и вирулентности обратимого > аракгера и расширять ее за счет вновь обнаруживаемых групп.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на ттутршшститутсюк научных конференциях, XII и XIII пленарных заседаниях Межведомственной научно-методической комиссии по --рьбе с сибирской язвой (Воронеж, 1986, Ташкент, 1990), всесоюзной конференции "Бактериальные

• лазмиды" (Нальчик, 1990), Российской научной конференции 'Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных ш1фекций"(Волгоград, 1992), Российской научной конференции "Иммунология и специфическая профилактика особо опасных ¿шфекций"( Саратов, 1993), на Межгосударственной конференции актуальные вопросы профилактики чумы и других инфекционных заболеваний" (Ставрополь, 1994), на научной конференции по облемам зоонозных и других инфекционных болезней ;авршюль,1994), на научной конференции" Актуальные вопросы ¿профилактики особо опасных и других инфекционных заболевашш" Ставрополь, 1995), на Международном научном семинаре "Особо .асные инфекционные заболевания: эпидемиология, экспресс-•чшоспша, профилактика" (Киров, 1997), на Межрегиональном -6очс:л совещании ВОЗ/ФАО по сибирской язве "уплаты,Казахстан, 1997).

Публикация. Основные результаты диссертации изложены u -Hl опубликованных работах и 6 заключительных отчетах.

Структура в объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 6 глав собственных ' исследований, заключения, выводов, списка цитируемой литературы из 132 отечественных и 149 зарубежных источников. Работа изложена на 275 страницах, иллюстрирована 15 рисунками и 29 таблицами.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

1.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом изучения были 547 штаммов сибиреязвенного

микроба. Из них 492 поступили для идентификации или имелись в

коллекции лаборатории, 55 получено в ходе работы. Подробно

штаммы охарактеризованы в соответствующих разделах. В отдельных

опытах использовали моноплазмидные производные штамма Bacillus

anthracis Ames [pXOl" (NHANH) и рХ02- (NHNNR-l)j, а также

i.

штаммы B.subtilis № 168 и RUB-830 , полученные из коллекционного центра РНИЧИ "Микроб"(Саратов)

В опытах использовали беспородных белых мышей массой 1820 г , морских свинок массой 320 - 350 г. а также кроликов породы "шиншилла" массой 2 - 2,5 кг.

Идентификацию сибиреязвенного микроба, изучение биологических свойств и определение вирулентности проводили в соответствии с "Методическими указаниями по лабораторной диагностике сибирской язвы животных и людей и обнаружешпо

возбудителя сибирской язвы в сырье животного происхождения и объектах внешней среды" (Москва, 1986).

В экспериментах по разработке состава питательных сред и их контролю руководствовались "Методическим руководством на проведение исследований по конструированию и контролю питательных сред для индикации возбудителей ООИ", "Методическими указаниями по применению физико-химических •тодов контроля питательных сред" (1977), "Методическими рекомендациями к контролю питательных сред по биологическим показателям" (1980).

Для определения потребностей Bacillus anihracis в ароматических аминокислотах использовали минимальную среду "9АТ", состоящую кз глюкозоминералыгой основы, тиамина. аминокислот аланина, шетидина, г.тутаминовой кислоты, глицина, лизина, метиошша, *фолина, серила и треонина.

Если исследуемые штаммы не росли на этой среде, то ее дополняли следующим пулом факторов роста:

Фенилаланин, тирозин, триптофан.

Если штамм рос на средах, содержащих дополнительно этот пул, его относили к нуждающимся в аминокислотах ароматической группы.

Выделение плазмидной ДНК проводили по методу B.D.Green et ¿.1.(1985) в одной из модификаций.

ПЦР ставили с использованием праймеров к фрагменту гена rap В плазмиды рХ02 размерами 256 . п.н., предложенными И.И.Тучковым с соавт.(1994) для детекции спор сибиреязвештого • ?аикроба в описанных ими условиях. Амплификацию проводит: на грмоциклере Amply-250 производства фирмы "Biocorn" (Москва). В

I7

качестве матрицы н i ЩР использовали препараты плазмидной ДИК штаммов сибиреязвенного микроба.

Реакции рестрикции с препаратами тигазмидной ДНК сибиреязвенного микроба ставили, пользуясь энцонуклеазамп рестрикции Barn Hl и Eco RI, в соответствии с условиями и в буферных растворах фирм-нзготов1ггелей в течение 3-5 часов при 37 ОС.

Электрофорез ДНК проводили в агарозном геле па аппаратах GNA-100 или CtNA-200 фирмы "Pharmacia". По окончании электрофореза гель окрашивали в растворе бромистого этидия (1мкг/мл) 45 минут с последующей отмывкой п дистиллированной поде. Гель фотографировали в ультрафиолетовых лучах, используя УФ-трансиллюминатор производства НПО при лаборатории радиационной генетики ЛИЯФ, г. Гатчина.

В процессе работы нами были существенно модифицированы и предложены питательные среды для выделения и культивирования, сочетанного 01гределения продукции экзотоксина и капсулы, методы выделения нуклеиновых кислот, дифференциации по вирулентности и отбора иммуногенных субкультур штаммов Bacillus anthracis in vitro.

?. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЯ

Патогенность сибиреязвенного микроба связана прежде всего с наличием капсулы и токсина, детерминируемых клазмидами, а также других факторов, роль которых в реализации патогенности не столь заметна.

Возбудитель сибирской язвы является патогенным микроорганизмом, имеющим . ряд особенностей, определяемых наличием в его сложном цикле развитая альтернативной

паразнтированшо фазы существования во внешней среде, тгго дает основание относить его к числу сапронозов или сапрозоонозов (Лигнин Ю.М., 1988). Различные аспекты пребывания Bacillus anihracis и почве широко изучались, накопилось достаточно данных в пользу возможное™ вегетирования в ней при наличии благоприятных условий, однако биологический смысл и исходы размножения его во внешней среде не вполне очевидны. Существует мнение о том, что ;1звнгие во внешней среде сопровождается утратой патогенных свойств, подтверждаемое выделением из внешней среды штаммов .пбиреязвепного микроба с ослабленной вирулентностью, но механизм и степень обратимости процесса "сапрофитизации" пока -1С установлены.

Полагая, что в разрешении этих, а также ряда других важных ¡опросов, касающихся пагогенности и экологии возбудителя сибирской язвы, существенным является изучение именно таких алшичных по патогенности штаммов, мы начали исследование с разработки методов их выделения и исследования. В литературе есть много примеров того, что атипичные по капсулообразованшо штаммы часто • выделяются из почвы, особенно старых скотомогильников. Для эффективного выделения штаммов Bacillus "nthracis из почвы предпочтительнее иметь селективные среды, позволяющие избирательно подаолять рост' сопутствующей -'ккрофлоры. Такие среды были ранее нами разработаны, задачей того исследования было испытать новые непищевые питательные и изменить технологическую схему произподсгва сред для гширения ассортимента питательных основ. Нами было показано, среды с основами из гидролизатов керапшеодержащего сырья и -г- ;ка отрубей (5 r/л) о сочетании с витаминным препаратом ЭКД (5 , обеспечивают рост всех изученных штаммов сибиреязвенного

микроба, по некоторым показателям (прозрачность и цпетность агаровой пластинки) превосходят существующие и пригодны в селективном варианте для выделения и культивирования возбудителя сибирской язвы. Использование измененной технологии приготовления' сухой основы позволило на одном и том же оборудовании изготавливать гпггательные среды из гндролизатов кормовых дрожжей, пептона "Д" и амипопептнда, что нашло отражение в Дополнешш к ВФС 42-41 ВС-86 и ФС 42 - 437 ВС-94 на питательную среду для 'выделения и культивирования сибиреязвенного микроба сухую, введенную взамен ВФС 42-41 ВС-86 в 1994 году.

Ввиду отсутствия в литературе сведении о специальных методах

выделения атипичных штаммов Bacillus anthracis, мы решили

восполшпъ этот пробел. Обычно выделение состояло в инокуляции

исследуемого материала бнопробным животным или его засеве на

плотные питательные среды с отбором колоний. Проблема состоял!

в том, что при достаточно редком выделении штаммов

сибиреязвенного микроба из почвы и необходимости исследования

большого количества проб, внимание исследователей сосредоточено

*.

на отборе титгшых колоний в R -форме и поэтому гладкие или слизистые колонии атитгпшх штаммов могли быть выделены лишь случайно. Из-за того, что атитгшые штаммы авирулентпы, использование биопробиых животных также не давало результатов. С другой стороны, отбор всех колоний в R-форме приводил к неоправданному исследованию близкородсгвенных сапрофитных бацилл, формирующих очень похожие колонии. E.JI.Черкасский с соавт.(1978), предложив для более эффективного бактериологического обследования почвы на -обсемепенпость возбудителем сибирской язвы схему, в которой критерием oiix/pa in

максимального числа изолированных колоний без специального изучения их морфологии, выросших на среде после засева прогретой вытяжки почвы, являлась фаголизабелыюсть сибиреязвенным бактериофагом "К"? отметили высокую частоту выделения античных оескапсульных культур. Однако, эта схема, на наш взгляд, также не лишена недостатков, поскольку исследование удлинялось и из пего сразу исключались фагорезисгентные штаммы.

В разработанном нами методе выделения штамм он сибиреязвенного микроба с атипичным капсулообразованием и вирулентностью отбор колоний Bacillus anthracis проводили непосредственно на селективной среде, угнетающей рост многих почвенных бацилл, по отрицательному тесту па щелочную '■•осфатазу, который в нашей модификации не давал положительных реакций со всеми исследованными штаммами, независимо от морфологии колоний и вирулентности. По литературным данным и нашим наблюдениям, даже при постановке классического теста на ¡«елочную фосфатазу, фосфатазоположительные культуры сибиреязвенного микроба встречались гораздо реже, чем устойчивые фагу "К". При этом значительно сокращалось время исследования - объем работы, а ложноположительные на первом этапе отбора гдзультаты а с редкими фосфатазонегативными сапрофитами в ^"льнейшем исключались при исследовании по тестам "жемчужного ожерелья" и фаголизиса. Выделенные культуры сразу предварительно дифференцировались по признаку капсулообразования in vitro и ■"т-гди них выделялись атипичные. Таким образом, эта схема фактически позволяла выделять все -штаммы, отбирать среди них "типичные по каисулообр;зованию, и, в силу доступности, могла Лить использована в учрехедениях. ведущих выделение и первичную деглификацию возбудители сибирской язви.

Используемые до сих пор схемы дифференциации штаммов Bacillus anthracis не учитывали второй основной фактор патогенное™ - токсинообразование, из-за чего культуры, отличающиеся по этому признаку, входили в одну группу, если имели идентичный фенотип калсулообразования. Задачу выявления токсинообразования in vitro мы решили, использовав иззесгный методический прием регистрации иммунопреципигации токсина, выделяемого растущими на среде токсинообразования культурами, с сывороткой, содержащей антитела к токсину (Mikesell,P., et al., 1983). В качестве таковой мы использовали коммерческий противосибиреязвенный глобулин, основной действующий компонент которого составляют антитоксические антитела. Нами были подобраны: 1. оптимальный состав синтетической среды токсинообразования, обеспечивающий рост всех штаммов, при использовании как спор, так и вегетативных клеток, включая и атипичные по потребностям в факторах рост; 2. концентрация глобулина, условия культивирования и иммунопреципигации, а также чувствительность реакции, позволяющие выявлять основной токсинный компонент выделяемых во внешнюю среду антигенов без искажения картины за счет минорных антигенов. При этом оказалось возможным выявлять одновременно и капсулообразование штаммов.

Среду для сочетанного определения продукции экзотоксина и капсулы (СОПЭК) готовили путем растворения в 400 - 425 мл дистиллированной воды ингредиентов в соотношении, п 1-алашш - 0,035 - 0,070

1-арпшин • HQ - 0,200 - 0,250

1-аспарагиновая кислота - 0,250 - 0,370 1-валин - 0,240 - 0,350

1-гисщдин • HQ - 0,074 - 0,110

глицин -0,090 - 0,130

1-глутамат натрия - 0,820 - 1,230

1-нзолейцин - 0,230 - 0,340

1-лейцин - 0,300 - 0,460

1-лизин - 0,300 - 0,460

1-метиошш - 0,100 -0,150

1-пролин - 0,060 - 0,240

1-серин - 0,310 - 0,470

1-треонин -0,160 - 0,240

1-ТИрОЗШ1 - 0,200 - 0,300

1-триптофан - 0,047 - 0,070

1-фепилалашш - 0,170 - 0,250

1-цистин - 0,034 - 0,050

аденин - 0,003 - 0,004

урацил - 0,002 - 0,003

тиамин * НС1 - 0,001 - 0,0015

СаС12 - 0,008 - 0,012

МЕ804-7Н20 - 0,026 - 0,032

Мп$04-Н20' - 0,002 - 0,003

Ре804 • 7Н20 - 0,002 - 0,003

к2нро4-зн2о - 3,920 - 4,000

N011003 - 8,0- 10,0

1! (+)глкжоза - 2,3 - 2,7

Контролировали рП среды и при необходимости доводили его

до 8,0. Полученный раствор питательной основы среды срили'ювали пугем фильтрования через мембранный фильтр с диметром пор 0,9.2 - 0,45 мкм.

Напсску агарозы 12,5+2,5 г суспендировали в 500 мл (иоиллироианпой воды, нагревали суспензию на подиной бане при

помешивании до полного расплавления агарозы и стерилизовали автоклавированием при 121 °С в течение 20 мин. Затем к охлажденному до 50 °С расплаву агарозы добавляли стерильно раствор питательной основы в объеме 400 - 425 мл и противосибиреязвенный глобулин жидкий в объеме 100 - 75 мл, перемешивали и разливали в чашки Петри по 10 - 12 мл.

Посевной материал засевали на чашки со средой, помещали их в анаэростат, из которого откачивали 25% воздуха1 и замещали его углекислым газом. Посевы инкубировали при 37 °С в течение 48 ч, а затем переносили в холодильник и выдерживали 48 ч при +6 °С. По окончании этого срока учитывали результаты. Для этого оценивали рост и определяли средние размеры колоний на чашках с каждой средой. Продукцию экзотоксина определяли по наличию белых концентрических колец иммунопреципитации * в среде вокруг колоний. Наличие и выраженность • токсинообразования устанавливали визуально, просматривая чашки на темном фоне, и микроскопически под малым увеличением микроскопа с объективом 8. Об экспрессии экзотоксина судили также по удалению колец от края колоний, принимая удаление прямо пропорциональным степени экспрессии экзотоксина. Продукцию капсулы определяли визуально по наличию на поверхности колоний слизистого блестящего слоя капсульнош вещества и микроскопически в мазках, сделанных с колоний и окрашенных по Ребигеру, пользуясь объективом 90 с иммерсией.

Достаточная чувствительность и специфичность выявления токсина были подтверждены нами с использованием моноплазмидных рХ01~ (ТШАТШ) и рХ02" (1ЧШШГЫ) штаммоп. Токсинообразование выявлялось как у бескапсульных (NHNNR-l, СТИ-1, 228/8, 34Р2), так и образующих капсулу (81/1, 30/86, 1(СО))

штаммов, можно было отдифференцировать бескапсульные (12/16-1) ■ и квпсульные (NHANH, 12/16, 228) штаммы, не продуцирующие токсин in vitro.

Важной особенностью этой питательной среды была способность выявлять капсул о- и токсинообразование при использовании стандартного спорового посевного материала, что давало возможность достаточно корректно изучать состав популяции штаммов по данным признакам и нашло свою реализацию в методе клализа популяции штаммов B.anthracis по признакам капсуло- и токсинообразования in vitro.

Для понимания особенностей атипичных по патогенносги штаммов необходимо было параллельно с фенологическими проявлениями исследовать и генетические детерминанты факторов патогенносги. Плазмидный состав атипичных штаммов Bacillus unthracis мало изучен, возможно, из-за сложностей лизиса клетки и илделения больших плазмид, хромосомные' же гены только начинают изучаться. В отличиь от многих возбудителей ООИ, например чумы, туляремии, бруцеллеза, особенности метаболизма нуклеиновых кислот и их предшественников у сибиреязвенного микроба не изучены.

В стремлении подготовить базу для такого рода исследований, «ш разработали метод получения нуклеиновых кислот в препаративных количествах. Решающими моментами в реализации схстракции нуклеиновых кислот было использование t-.лкроанаэрсфильных культур бескапсульного штамма, у которых устойчивость клеток к линоциму низка, в сочетании с циклом -амораживания-оттаивания. Данный способ обеспечивал хороший *>*дход достаточно выгокопо;дшсрных нуклеиновых кислот.

Методы илазмидного скрининга для сибиреязвенного микроба достаточно хорошо разработаны, однако при его выполнении по одной из модификаций метода B.D.Green et al.(1985), мы столкнулись с тем, что после депротеинизации и концентрирования этанолом фракция суперскрученной ДНК большой плазмиды pXOl часто не обнаруживается, хотя рестрикционный анализ подтверждает ее наличие. То же происходит и после ультраценгрифугировапия, когда плазмидная ДНК в результате разрывов Л1шеаризуется и мигрирует вместе с хромосомной ДНК. Мы использовали для концентрирования плазм иди о и ДНК диализ, для чего препарат из водной фазы после обработки фенолом/хлороформом вносили в диализную трубку Visking и помещали на ночь и концентрированный раствор ПЭГ 6000. Визуализация в электрофорезе давала четкие результаты, выявляя обе плазмиды » суперскрученпой форме, а при необходимости препараты можно было после переосаждения спиртом использопать для рестрикции.

Литературные данные о выделении атипичных штаммов давали большой разброс частот, определяемый прежде. всего целенаправленностью поисков. Мы проанализировали частоту их встречаемости. В нашей работе из 456 пгтаммов атипичными по .ому или иному свойству признано 33, гаи 1,7% всех штаммоп и больше всего их было выделено из почвы (21, или 63,6^ всех атипичных штаммов). 20 штаммов или 60,696 всех атипичных штаммов были бескалсульными. Чаще всего атипичные по патогенности штаммы встречались среди почвенных или длительно хранивших."; лабораторных штаммов, подвергавшихся неоднократным пересевам Характерным было частое сочетание нарушений ка 11 су л о о Gp а ю и а ш : >, [Сар" или Сар+о^калсулообразование при кучьтивнроватш ча воздухе на агаре Хотгингери)], токсижкюричовання (То\ \.

гемолитической (Hly-) и протеолитической(Рг1~) активностей в отношении определенных субстратов и зависимости от аминокислот ароматической группы (Aro-), выявляемые in vitro. При этом пггаммы с одинаковым фенотипом встречались среди почвенных, были ранее и в ходе этого исследования выделены в популяциях давно выделенных лабораторных штаммов. Эти результаты наводили на мысль об однонаправленных изменениях, происходящих со штаммами в почве и в результате неоднократных пересевов на искусственных питательных средах.

Проанализировав 86 штаммов сибиреязвенного микроба по всем этим признакам, а также по плазмидному составу, морфологии колоний и вирулетности для белых мышей, мы смогли выделить 5 rpyini по преобладающему фено/плазмидотипу и разной однородностью популяции среди штаммов каждой из групп. По вирулентности для белых мышей все штаммы можно было, исходя из существующих критериев, разделить трлько' на 2 группы -вирулентные и авирулентные. Такое несоответствие объясняется несущественностью токсинообразования для реализации патогенности Bacillus anthracis у этих животных, известное по литературным данным (Дроздов И.Г. с соавт., 1992; Welkos,S.L. и Ivins, B E., 1991).

Нами были тщательно изучены популяции 6 почвенных штаммов по всем вышеперечисленным признакам, . а также по морфологии колоний.

В составе их популяций мы смогли выделить 5 стабильных клонов:

1 .Ro3Sco2 Cap-Tox+Aro+Prt-Hly-/pX01 2.Sofio2 Cap-Tox+Aro+Prt-Hly-/pX01 3.Sco2Ro2 Cap-Tox+Aro-Prt-Hly-/pX01

A.SMco2 Roj Cap +co2 Tox-Aro-Prt"Hly-/pX01pX02

S.RoSco} Cap-Tox-Aro-Prt-Hly-/pX01

Три из шести "почленных" штаммов имели в составе популяции практически только один клон Ro, Sco2 Cap-Tox+Aro+Prt" Hly~/pX01. Еще два штамма, кроме этого клона, содержали в небольшом количестве кдон So7C0;Cap~Tox+Aro+ Prt-Hly-/pXO 1. Эта штаммы были подобны бескалсульным вакщпшым штаммам типа СГГИ-1. Пассирование данных штаммов на агаре Хоттингера не изменяло перечисленных свойств. Популяция штамма 140 П, болышшство которой составляла диссоциирующая субкультура SAIo2Cap+ o/Tox"Aro"Prt"Hly"/pXO 1рХ02, отщеплягошая на агаре Хотпшгера вышеописанный вариант RoScc2 Cap-Tox-Aro-Prt-Hly-/рХ01, шчела наиболее сложный состав, включающий все охарактеризованные субкультуры, варианты и клоны. Среди них большинство составляли клоны, образующие капсулу на воздухе на агаре Хоттингера, неспособные расти п атмосфере ССЬ. Их фенотип капсулообразовшпш соответствует 5-му классу рХ02 Тп 917 1шсерционных мутантов, описанных C.B.Thome (1993).

Весьма примечательным было то обстоятельство, что нам не удалось обнаружить ни одного штамма или варианта п составе его популяции; лишенного плазмиды pXOl, хотя два из пяти клонов не продуцировали токсин in vitro. В то же время все бескапсульиые штаммы и клоны не - имели капсульной плазмиды рХ02. Это позволяет говорить о большей сегрегационной стабильности и струк1урной гетерогенности плазмиды pXOl по сравнению с плазмэдсй рХ02 у природных штаммов снбиреязветгого микроба .

Изучение популяцнонного состава антибиотикорезистентных штаммов позволило выявить некоторые дополнительные различия в фенотипе хапнуло- и токспнообразовання. У некоторых штаммов

отмечались сниженная продукция токсина; у других - колонии были образованы секторами капсульного и бескапсульного роста; были штаммы со сниженной продукцией и гиперпродукцией капсулы. Значения LD50 были минимальными у штаммов 1(С0) >Y 1ч , 1 репг303 и 5/1 Strr 1, из которых перзые два являлись атоксигенными, но продуцировали капсулу, а третий пшерпродуцировал

капсулу(Сар+*).

Далее мы попытались отобрать . клоны . с разным фено/плазмидотипом и вирулентностью в популяциях атипичных по патогенности штаммов. Большинство клонов можно было отобрать но фенотипу капсуло- и токсинообразования на среде СОПЭК при культивировании в атмосфере ССЬ и на агаре Хогпшгера , однако клоны нормального вирулентного типа Ro^SMco/Zs^соДох+Аго+Prt+ Hly /рХО 1рХ02 в популяциях с преимущественными фено/плазмидотипами -SA/OjCap+o2Tox-Aro_Prt"Hly"/pXO 1рХ02,

RoSMcofiap+* со,Тох Aro'Prt" И1у"/рХО 1 рХ02, Roßco2 Cap-Tox+Aro+Prt" Шу-/рХ01 и Ro: Sco2 Cap-Tox-Aro-Pit-Hljr/pXOl нам не удалось выявить прямым анализом колоний, что мопю быть связано с его отсутствием или -низкой частотой встречаемости при отборе в неселективных условиях. Для обнаружения этого клона были использованы два методических приема. Один из них, позволивший ранее отобрать в популяции штамма 228 с феНо/плазмидотипом /?o>5A/cojCap+'coJTox"Aro"Prt"Hly7pX01pX02 варианты 228 Аго+ и 228ЭМСАго+ с типом RoSMco£ap согТох+Аго+Рп4 Н1у+/рХ01рХ02. заключался в селекции по признаку независимости от ароматических аминокислот. Проведенные опыты показали, что при этом далеко не всегда отбираются ревертанты по всем признакам, как это было в случае со штаммом 228. При селекции этим методом в популяциях двух штаммов типа SMo3Cap +o/Tox"Aro"PrfHly"/pXO 1рХ02

о-тпрались более вирулентные клопы R<::.S\1< с.С'ар i «.'1 ох Лю' l'rt Uly /рХ()1рХ02 такого же типа , как штамм 228, либо авиру аеншыс RoSco2Cap Тох'Лго4 PrfHIy /pXOl. Из попузяций других штаммов с таким же, как у 228 типом, отбирались клопы А'г'ЛМоСар г<>То\ Ar</Prt Н1у/рХ01рХ02 или Ä^.SVjCap Тох' Au.1 l'rt Uly / pXOl Получить этим методом искомый клон нам упаюсь лишь при селекции п популяции штамма 228. Эю могло свидетельствован. о том, что сам по себе признак Аго", очевидно. хромосомный не яь.1ястся обязательной принадлежностью итшру чет и ных для мгл«'.v'» пггаммои и его проявление не связано непосредственно с фупкпчег плазм ндпых генов капсулы и токсина. Тем не менее, псе атипичные но капсуло- и(или) токснноооразовапшо штаммы, включая и вакцинные, росли замедленно в отсутствие ампнокмс '(> ароматической группы или не росли совсем.

Второй методический прием для селектпг вирудептных кдопо' заключался в предварительном отборе из нопудяцин нссле.чуемыч атипичных штаммов без очистки субпоиутяции с типом Ко. S- с Сап Tox~Aro_Prt""TIly~/pXO t с последующим его пассированием 4c;v < организм белых мышей. Vi шести о (Meynell. 1963) что организм W чы\ мышей предоставляет оптимальные условия для селекции фепоппг. Сар. Однако, как было установлено нами, пассирование чср.-1 организм белых мышей может привести к реверсии атипичны^ пламмов с малой доли клонов типов Сар+«ь Точ : /рХ01р\02. SM'^ Сар1 ojl'ox'/ рХО 1 рХ02 /pXOl к обычному вирулентному ткп\ нпч условии преобладания в их популяции клонов типа Сар~'То.ч~ /p.XOi ч малого количества клонов Сар~Тох 1.

Конечный результат такого отбора являет собой •;• пормалмтго i.itpy ieiui:oro nnrn Rn/thfi-ojCap■roj'ox Аф (•••• ' [Ну /рХОТаким способом нам via loci, „ачлпил,1 /.¿ввгснн

штамма 12/16-1, который исходно имел тип Ro, Sco, Cap-Tox"/vro"Prt~ Н1у-/рХ01, а также штаммов 140П и 12/16 после отбора в их популяциях клонов с таким типом. (Рис.1) Факт отбора в этих условиях такого типа-штаммов мог говорить о том, что именно он наиболее приспособлен для выживания в организме животных и более других вирулентен. Наличие протеолитической активности в отношении альбумина и гемоглобина, гемолитической активности в отношении отмытых эритроцитов барана и независимость от ароматических аминокислот являются непременными атрибутами высоковирулентных штаммов и вносят свой вклад в патогенность Bacillus anthracis. Это 'утверждение основывалось на экспериментальных данных. Несмотря на отличия в патогенезе сибирской язвы для мышей и кроликов, при сравнительном изучении вирулентности исходных и пассированных таким образом штаммов, как и селекционированных по признаку Аго+ производных штамма 228, выявилась большая вирулентность пассированных и селекционированных вариантов для кроликов. Особенно заметными эти различия были для штаммов 140П (авирулептного для кроликов) и 12/16-1(авирулентного для белых мышей и кроликов), пассированные после селекции по фено/плазмидотипу Roj Sсо3 Сар-Tox-Aro"Prt-Hly~/pX01 • варианты которых оказались высоковирулентными для кроликов.

Результаты исследования популяции штамма 12/16-1 в течение 4-х последовательных пассажей через организм белых мышей дали возможность проследить за динамикой перестройки популяции по мере возрастания вирулентности и отметить резкий подъем вирулентности для кроликов после того, как доля КОЕ RoßMcojCa.^ соЛох+Aro1 Prt+ Н1у+/рХ01рХ02 превысила 86% (Рис.2).

Рис.1. Плазмидный профиль исходного штамма 140П , его бескапсульного

варианта 140П1102 и полученного после пассирования этого варианта через

организм белых мышей штамма 1401тб/м

1 2 3

А В

1 - 140П А - рХ01

2 - 14ОШ102 В " РХ02

3 - Ь-.ОГШб/м С-хромосомная ДНК

Следует отметить, что со времен Л.Пастера, впервые продемонстрировавшего, что последовательное пассирование аттенунрованного штамма полученной им вакцины, содержащей увеличенную долю клеток рХОГ, рХ02+ и уменьшенную долю вирулентных клеток рХ01+, рХ02+ в культуре, через организм однодневных морских свинок, восстанавливает вирулентность, очевидно,- вследствие отбора присутствующих о популяции вирулентных бацилл (Ьтш,В.О. е1 а1., 1986), пасспрование через организм лабораторных животных используется в качестве теста на реверсию. В частности, эта процедура является обязательной для проверки стабильности потери капсулы и Енессна в "Основные критерии отбора сибиреязвенных вакцинных штаммов, предназначенных для изготовления живых сибиреязвенных вакцин для иммунизации людей"( Салтыков Р.А.С соавт., 1982). Механизм селектш ::.с огт. вероятно, в'том, что в организме этих животных

Рис.2. Динамика изменений вирулентности и перестройки популяции сибиреязвенного микроба

17,1 —

15

0

1 II

О

<

>-

2,5

-10С

"86

-а-

5

< и

* л.

«I

а

|i?Oj5A/cojCap+'cOjTox"Aro"Prt"Hly7pX01pX02 SMo^Ce/)+o/rox-Aro-Prt-Hly-/pX01pX02 Ro3 SCoj Cap-Tox-Aro-Prt-HIy7pX01 SMco2Roj Cap+co2 Tox+ Aro+ Prt+ jjggjj| Ньидентифицированные феноплазмидотипы

1-12/16; 2 -12/16S; 3 - 12/16-1; 4 -12/16-11п; 5 -12/16-Шп;6-12/16-1Шп; 7- 12/16-1 Ivn (1-3 - изменения в процессе хранения и отбора культур с атипичным капсулообразованием; 3-7 - изменения в процессе 4-х последовательных пассажей через организм белых мышей

плазмидного и ПЦР с праймерами к генам cap профиля по отдельности hp всегда могут дать представление об

эпидемической значимости атипичных штаммов. Поэтому для ее оценки был предложен тест на реверсию, заключающийся в

предварительном установлении нренмушео пенного фенотипа, плазмидного и ГЩР профиля штамма. Штаммы с преимущественным типом Cap"'J'ox~/pX01 (1ЩР cap Hv) сразу можно расценил» как реверсирующие и поэтому эпидемически опасные, независимо От наличия электрофоретнческн обнаруживаемо!! плазмиды рХ02. Штаммы типа Сар-'Гох-/рХ01(НЦР cap ft) для выяснения их эпидемической значимости нуждаются в пассировании через организм белых мышей. Штаммы типа Сар_Тох+ /рХО! (ГЩР сарВ~) могут оьггь сразу исключены и:* дальнейшего рассмотрения, как пе имеющие эпидемической значимости. Второй этап теста включает 5-кратног пассирование через организм белых мышей штаммов типа Сар-'Го.\7рХО!(ГЩР cap В) и Сар"Тох+ /pXOl (ИЦР сарВ¥). Гибель животных на любом из пассажей и выделение культуры с обычным типом С.ар+со, Тех4 Д>Х01рХ02 позволяет отнести такой штамм к эпидемически значимым'.

Данные, полученные при изучении иопуляцнонного состава штаммов, позволили предложить несколько методов оценки свойств штаммов сибиреязвенного микроба in vitro.

' Метод дифференциации штаммов B.anthracis по вирулентности in vitro состоит в оценке способности кульчур к капсуло- и токсинообразолашно при культивировании па среде СОПЭК в атмосфере С'СЬ и капсулообразовапия па агаре Хоттпииера при куш.тивировании на воздухе. Он повышает то'пюсть дифференциации. В отличие от известных способов, он позволяет выделить вместо двух пять групп штаммов с отличающейся вирулентностью. Способ требует значительно меньших затрач времени и средств, не связан с использованием лабораторных животных >: позтому липгеп педос-ппкор. способа in vivo, определяемых ризличиями и чуиегкиселиюсти к инфекции у разных

пидов лабораторных Асивотных и физиологическом состоянии животных одного вида.

Метод отбора иммуногенных субкультур и вакцинных штаммов основан на том факте, что интервал процентного содержания колоний с иммунопреципитагщей, формирующихся на СОII ЭК, прямо коррелирует с индексом иммугаггета вакцинных нггаммов и может быть использован как критерий для отбора иммуногенных штаммов и их субкультур in vitro. Интервал 1 - 10% соответствует неиммуногенным штаммам, так как их индекс иммунитета составляет 1 - 2, что не превышает разброса в пределах одного порядка и может отражать разброс значений LD50 заражающего штамма при нескольких определениях. Промежуто'шый интервал 11 - 63% соответствует низкоиммуногенным штаммам, индекс иммунитета которых больше 10, но меньше индекса иммунитета референс-препарага. Эти штаммы обеспечивают защиту от заражения только части взятых в опыт животных. В интервал 64 - 100% колоний с иммунопреципитацией укладываются все те штаммы, индекс иммунитета которых равен или превышает индекс иммунитета референс-пггамма СГИ-1, которые относятся к иммуногегашм. Кроме того, если иммуногешюсть вакцинного штамма в процессе хранения снизилась, ее можно повысить, отобрав в его популяции и размножив иммуногенную субкультуру по специфическому фенотипу, что недостижимо другими способами.

В нашей работе путем глицинзависимой криотрансформации вакцинного штамма СГИ-ПР плазмидами pUBHO и рВС16 и отбора полирезистентных токсинообразующих in vitro клонов были получены прототипы перспективных вакцинных штаммов с устойчивостью к пенициллину, рифампицину, тетрациклину| а также

пенициллину, рифамгшцину и канамицину. Они могут найти спое место в системе профилактики сибирской язвы в ситуациях, когда необходимы одновременное проведение экстренной профилактики антибиотиками и иммунизации.

На основе чистых культур вариантов с разным феноплазмидотипом, происходящих из атипичного по капсулообразованшо, токсинообразованию и вирулентности штамма, получен набор из 6 изогенных штаммов для экспериментального ^ генетического изучения природа атипичной патогенности возбудителя сибирской язвы (таблица 1).

Предлагаемая нами схема внутривидовой таксономии сибиреязвенного микроба (таблица 2), основанная на определении фенотипа капсуло-, токсинообразования, гемолитической и гтротеолитической активностей in vitro, зависимости от ароматических аминокислот, плазмидного спектра, однородности популяции по этим признакам и вирулентности для лабораторных животных, при достаточно четком разделении всех штаммов на ipynnu с определенной характеристикой, дает возможность проследить закономерные взаимопереходы между ними, сопровождающиеся изменениями однородности популяции и вирулентности обратимого характера и расширять ее за счет вновь обнаруживаемых групп.

Таким образом, -полученные в ходе проведенного с 'использованием раэработашшх методой выделения и изучения пгга?,шоп с атипичной патогенностыо исследования, данные о .биологических и поггуляционных особенностях сибиреязвенного микроба no3BDjnuni расширить представления о вариабельпоста проявления и детерминации его факторов патогенности, <п::о-г>/чг--г.тс-'лггцноппогс состава, предло::ппъ критерии оценки

Таблица I

Характеристика набора нтогенных производных штамма' ВасШи.ч

ашкгааз 140 11

| Название штамма | Фспоган

[п/п ; 1

" • ' 140 П-к '

- н-

5 1 I_________НЙ П-к________V 1/^гСар^|-!Гох"Лг(ГРП'П1у'

|-з-

1 4

I

! 5

|"б"

140 11-1 140 Г! 2 Ы(Уг :г 140 П -4 140 П -5

Сар" Тих-Лго-Рл-Н1у-; уМО^лр^О Тох'АкГРп'Н 1у Сар- Тох- Лго- Рл-Шу-

Сар- Тох+Аго-Ра- _______

Сар1 СОТох+Лго11М+] 11у+

Плазм, ;дны й состав

рХО! рХ02

рХО! рХ02

рХ01

рХоГрХог"

Таблица 2

Распределение штаммов сибиреязвенного микроба по фугшам и соответствии с предлагаемыми критериями для внутривидовой таксономии

Труп- : Преимущественный I па феноплазмидопш

Однородность

|НОПУЛЯННИ

Нирученшоегь для:

I Саг

[!у7е>

3 ! Сар «)2Т\.\-Лго~РгГ ' ммеокая ______!|];-рХ()1рХС)2 :

Лго-1'П-Й1у-2 /рХ01рХ07.

Сар-Чох4" Лго-1" Рп Н1У7 РХО.1.....

.1

Сап"'Гол + А го"*" Рг1-Ч11.+/рХ()! .....

Сар" Тох Ато~ РгГ

Н1у7 рХО!_______

кродн-кон морсы« снинок белых мышей

высокая + + +

1 такая •Н ... + ±

ммеокая + + +

низкая •ь +

высокая - + .г

имсокая - - -

шикая - - -

пичкая - - -

высокая - - -

эпидемической значимости античных штаммов, схемы внутривидовой дифференциации и наметить перспективы дальнейших исследований.

ВЫВОДЫ

1. Разработанные сухие селективные питательные среды из пщролизатов дрожжей и аминопептида, технология изготовления которых отражена в фармакопейной статье, а также приготовленные на непищевых основах из кератинсодержащего сырья и белка отрубей, могут быдь использованы для выделения и культивирования сибиреязвенного микроба.

2.Для выделения и первичной дифференциации типичных, бескапсулышх и образующих капсулу на воздухе штаммов Bacillus anthracis предложена методика, основанная на отборе фосфатазонегативных колоний на селективной среде с последующим определением фенотипа капсулообразоватптя in vitro и идентификации по тестам с сибиреязвенным бактериофагом и " жемчужного ожерелья".

З.Одповремешюе определение факторов патогенности (наличие капсулы и токсина) in vitro у штаммов сибиреязвенного микроба , включая атипичные, и изучение состава их популяции возможно при использовании разработанной синтетической питательной среды, содержащей протиаосибиреязвениый глобулин.

'[.Воздействие на клетки микроанаэрофилыюй культуры Bacillus anthracis лизоцима в сочетании с циклом заморажипапия-оттаивания обеспечивает максимальный выход нуклеиновых кислот, пригодных для изучения физико-химических и биологических

5. По преимущественному фено/плазмидотипу природные и музейные культуры возбудителя сибирской язвы подразделяются на пять групп с разными фенотипами капсуло-, токсинообразования, протеолиза, гемолиза,« потребности в аминокислотах ароматической группы и плазмидным составом. Штаммы с одинаковыми по злектрофорептчесгаш данным плазмидами pXOl и рХ02 имеют разный характер капсуло- и токсинообразования: образующие капсулу в атмосфере СО2 и образующие капсулу на воздухе; продуцирующие и не продуцирующие токсин.

6. Культуры штаммов сибиреязвенного микроба в каждой из групп неоднородны по клеточному составу. Наиболее однородными по основным изученным признакам являются свежевыделенные вирулентные, вакцинные и сходные с ними почвенные бескапсульные штаммы Bacillus anthracis .

7. Пассирование штаммов с атипичной патогенностью через организм белых мышей изменяет клеточный" состав культур в направлении преобладания клеток, образующих капсулу и токсин в атмосфере ССЬ, с высокой протеолитической, гемолитической активностями, отсутствием потребностей в ароматических аминокислотах и наличием плазмид pXOl и рХ02.

S-Для оценки эпидемической значимости штаммов Bacillus anthracis с атипичной патогенностью необходимо установление у них преимущественного фенотипа, плазмидного и ПЦР-norQ профилей, а также пассирование через организм белых мышей. Штаммы с преимущественным типом СарТох'/рХОЦПЦР сарВf) следует расценивать как реверсирующие и эпидемически опасные, независимо от наличия элекгрофоретически выявляемой плазмиды рХ02. Штаммы типа СарТох"/рХ01(ПЦР сарВ~)для выяснения их эпидемической значимости нуждаются в пассировании через организм белых мышей.

9. По способности продуцировать токсин ir формировать капсулу in vitro в атмосфере СОт и на воздухе штаммы сибиреязвенного микроба подразделяются на 5 групп: высоковирулентные, умерештовирулептпые, слабовирулентные, авнрулентпыс и апатогеиные. Вакцинные бескапсульпые штаммы, формирующие на плотной питательной среде с сибиреязвенным глобулином колонии с ореолами преципитации в 64-100% являются иммуногеннымп, в 1163%- нпзкопммуногениыми и до 10% - неиммуногенными.

10. Предложенная схема внутривидовой дифференциации штаммов сибиреязвенного микроба, основанная на определении капсуло-, токсииообразования, гемолэтической и протеолигической активностей in vitro, зависимости от ароматических аминокислот, пллзмпдного состава и однородности популяции по этим признакам и вирулентности для различных лабораторных животных позволяет выделить среди них большое число групп и контролировать однородность популяции по этим признакам.

11.Путем глицинзависимой криотрансформации вакцинного штамма СТИ-ПР плазмидами pUBllO и рВС16 получены варианты вакцинного штамма, устойчивые к пенициллину, рифампицину и дополнительно к тетрациклипу или канамицину. &ги пггаммы могут использоваться • при создании новой вакцины, формирующей иммунитет на фоне экстренной профилактики антибиотиками.

12.Для экспериментального генетического изучения природы атипичной патогенности путем элиминации отдельных плазмид из атипичного штамма получен набор изогенных производных с разным плазмидным составом и фенотипической экспрессией признаков капсуло- и токсииообразования.

Перечень научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Лидирование клеток, сибиреязвенного микроба и восковндной £>ациллы//П сб. "Актуальные вопросы профилактики сибирской язвы "'-7 ел. докл. XII Пленарного засед. Межведомственной научно-практической комиссии по борьбе с сибирской язвой. 20-21 окт. 1986г.л Воронеж.-Москва,1986-С.38(Соавт.: Проскурина Б.Л., Зацепин В.И.)

*>. Синтетическая среда для сибиреязвенного микроба // В сб. "Актуальные вопросы профилактики сибирской язпьг'-Тез.докл. XII Пленарного засед. Межведомственной научно-практической комиссии но борьбе с сибирской язвой. 20-21 окт. 1986 г., г.Воронеж - Москва,1986- С. 48(Соавт.: Проскурина В.А.)

3. Методический подход к определению потребностей сибиреязвенного микроба в факторах роста// В сб."Особо опасные инфекции на Кавказе"-Тез.докл.Х1 краевой научной конф.-Ставрополь, 1987.-ЧЛ .-С. 123

4. Оптимизация среды для выделения возбудителя сибирской язвы из обьсктов внешней среды//В кн."Вопросы противоэпидемической защиты"- Ип-т им. Н.Ф.Гамалеи, Москва,-1988.-Вып.34.-С.323-328 (Соавт.: Буравцева II.П., Проскурина В.А., Соколенко М.Г., Пивоварова Н.И., Цыганкова О.И.)

5. Капсулообразование, вирулентность и иигательные потребности сибиреязвенного микроба // В сб. "Актуальные вопросы эпидемиологии, профилактики и диагностики ООН "-Тез. докл.итоговой науч.конф.(22 дек.1989 г.).- Ставрополь, 1.989 - 4.1.-С. 95 (Соавт.: Буравцева Н.П.,Сучков Ю.Г.)

6. Передача плазмид резистентности в Bacillus anthracis методом глицинзависимой криотрансформации // В сб. Актуальные вопросы эпидемиологии, профилактики и диагностики ООИ-Тез.док.итоговой науч.конф.(22 дск.1989 г.).- Ставрополь, 1989.-Ч.1.-С.83 (Соавт.: Држевецкая И.И., Логинова О.Г.)

7. Плазмидный состав вакцинных штаммов сибиреязвенного микроба // В сб. "Бактериальные плазмиды-Тез.докл. Под общ. Ред.чл.корр. АМН СССР проф. Домарадскош И.В.-Нальчик,1990.-С.52 (Соавт.: Буравцева Н.П., Држевецкая И.И., Проскурина В.А., Гавршюв А.П., Логинова О.Г.)

8. Капсулообразование и токсинообразованпе у разных штаммов ~ сибиреязвенного микроба // В сб. "Актуальные вопросы профилактики сибирской язвы "-Тез.докл. XIII Пленарного заседания Межведомственной науч.мстод.комиссшт по борьбе с сибирской язвой 23-24 октября 1990 г. г.Ташкент.-Москва, 1990.-С.75 (Соавт. ;Држевецкая И.И)

9. Диссоциация у различных штаммов сибиреязвенного микроба // В сб. "Актуальные вопросы профилактики сибирской язвы"-Тез.докл.ХШ Пленарного заседания Межведомственной науч.метод.комиссии по борьбе с сибирской язвой 23-24 окгября 1990 г. г.Ташкент.- Таипсент.-Москва, 1990.- С.73(Соавт.: Држевецкал И.И)

Ю.Разрабогка наиболее щадящего метода получения стерильного лизата сибиреязвенного микроба//В сб." Современные аспекты профилактики зоонозных инфекций"-Тез. докл.науч.конф,-Ставрополь, 1991.-С. 101. (Соавт. :Абгарян А.Г.,Майский В.Г.)

11.Рост сибиреязвенного микроба на различных питательных средах // В сб." Современные аспекты профилактики зоонозных инфекций"-Тез. докл.науч.конф.- Ставрополь, 1991.-С.102. (Соавт.:Абгарян А.Г., Майскзш В.Г.)

12.Атипичные штаммы возбудителя сибирской язвы // В сб. "Современные аспекты профилактики зоонозных инфекций"-Тез. докл.науч.конф,- Ставрополь, 1991.-С.114. (Соавт.: Цыганкова О.И., Ярощук В.А., Проскурина В.А., Буравцева Н.П.)

13.Выделение и очистка ДНК сибиреязвенного микроба// В сб. "Современные аспекты профилактики зоонозных инфекций"-Тез. докл.науч.конф,- Ставрополь, 1991.-С.115. (Соавт.: Голубев A.B., Ильяшенко Б.Н.)

14.Характеристика штаммов сибиреязвенного микроба Европейской части СССР // Б сб. "Современные аспекты профилактики зоонозных инфекций"-Тез. докл.науч.конф.- Ставрополь, 1991.-С.132. (Соавт.: Ярощук В.А., Цыганкова О.И., Проскуршш В А.)

15.Изменение фенотипа и плазмидного спектра штамма сибиреязвенного микроба с атипичным капсулообразованием// В сб. "Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекцшТ'-Тез.докл. Волгоград, 21-22 окт. 1992 г. Материалы Российской научной конференции.- ■ Волгоград,1992,-С.38 (Соавт.:Цыганкова О.И., Буравцева Н.П.)

16. Определение чувствительности ' сибиреязвенного микроба к антибиотикам ¿им дифференциации от а прообразующих сапрофнтов // Антибиогикн и химиогерагши.-1992.- т.37.- №2,-С.23 (Соавт.: Проскурина В.А.,Буравцсва Н.Г1.,Неляпин Н.М., Ярощук В.А..)

17. Использование гндролизатон керагш (содержащею сырья и белка отрубей в питательной основе сухих селективных сред для сибиреязвенного микроба //В сб.'"Разработка и производство препаратов медицинской биотехнологии-' :Тсз.конфсрснцни.-Махачкала, 1992 г. -С.7 (Соавт.: Цыганкова О.И.)

18. Оценка иммуногенных свойств сибиреязвенных вакцинных нггаммов ин витро// В сб. "Иммунология и специфическая профилактика особо опасных инфскций"-Матсрналы Российской научной конференции (21-23 ссн. 1993 г).- Саратов, 1993г.-С.196(Соавт.: Фунтикова Т.Н., Вуравцева 11.П., Солодовников

B.В., Банных В.А.)

19.Изученис некоторых свойств субкультуры сибиреязвенного вакцинного штамма СТИ-1 // В сб. "Иммунология и специфическая профилактика особо опасных инфекций"-Материалы Российской научной копференщш (21-23 сен. 1993 г).-Саратов, 1993 г. -С.192 (Соавт.: Цыганкова О.И., Фунтикова Т.Н., Буравцева Н.П.)

20. К вопросу о вирулентности штаммов сибиреязвенного микроба // В сб. "Современные аспекты природной очаговости, эпидемиологии и профилактики особо опасных инфекционных болезней"-Тез.докл;науч.конф., Омск, октябрь 1993г.).-СтавропольЛ993.-С.46(Соавт.:Цыганкова О.И.,Солодовников Б.В)

21.Изучение потаенных штаммов сибиреязвенного микроба // В сб. "Современные аспекты природной очаговости, эпидемиологии и профилактики особо опасных инфекционных болезней"-Тез.докл.науч.конф., Омск, октябрь 1993г.).- . Ставрополь, 1993,-

C.197 (Соавт.: Солодовников Б.В..Цыганкова О.И.)

22. Биологические свойства различных штаммов возбудителя сибирской язвы, выделенных в Карачаево-Черкесской Республике // В сб. "Современные аспекты природной очаговости, эпидемиолоши и профилактики особо опасных инфекционных болезней"-Тез. докл. науч.конф., Омск, октябрь 1993г.).-Ставрополь,1993.-С.316 (Соавт.: Ярощук В.А.,Цыганкова О.И.,Фунтикова Т.Н., Проскурина В.А.)

23.Современное состояние вопроса профилактики сибирской язвы в Ставропольском крае // В сб. "Эпидемиологические аспекты краевой патологии Ставрополья"-Материалы науч,-практич.конф., посвященной 70-летию сан-эггпд.службы.-Ставрополь, 1992.-С. 142-144 (Соавт.: Буравцева Н.П.,Яро щук В.А.)

24.Сибирская язва на Северном Кавказе // В сб. "Актуальные вопросы профилактики чумы и других инфекционных заболевашш"- Материалы межгосударственной научно-практической конф., 1госвящ. 100-летию открытия возб. чумы.-Спшроноль, 1994.-С'. 168 (Соаэт.: Буравцева Н.П.Яропгук В.А.,Банных В.А.,Гпиловская Ю.Г.)

25.Вспышка сибирской язвы в Кабардино-Балкарской Республике //Актуальные проблемы профилатикп особо опасных и нриродно-очаговых инфекций: Тез. докл.науч.конф.,посвящ.6()-летию Иркутского противочумного инспггута., октябрь 1994 г.-Иркугск, 1994.-С.17 (Соавт.:Буравцева Н.П., Ярощук В.А., Стсианянц Л.О., Гудым О.П., Казаков А.М.,Смоленцев Ф.И.)

26. Патогенносгь и экология возбудителя сибирской язвы // В кн. "Материалы научной конференции по проблемам зоонозных и друтх инфекционных болезней. Ставрополь, 26 мая 1994 г./Ставрои.н.-и.протшючум.ип-т.-Ставро1юль.1994. 101 о.-Доп. н ВИНИТИ г.Москва, 19.09.94 №2214-В94(Соавт. Цыганкова О.И.. Солодовников Б.I?., Ярощук В.А., Буравцева 11.Г1.)

27.Изучение нонуляционного состава штаммов сибиреязвенного микроба по признакам, связанным с патогепностыо//В сб. "Актуальные вопросы профилактики особо опасных и друшх инфекционных заболеваний" -Материалы научно-правсг.копф."60 лег противочумной службы Кавказа" (24-25 октября 1995 г.).-Ставроноль, 1995.- С.145-146 (Соавт. . Цыганкова О.И., Солодовников Б.В., Абгарян А.Г.)

28.К вопросу об адгезивных свойствах сибиреязвенных микробов и близкородственных снорообразующнх сапрофитов // В сб. "Актуальные вопросы профилактики особо опасных и других инфекционных заболеваний" -Материалы научно-пракг.конф."60 лет про-тнвочумной службы Кавказа" (24-25 октября 1995 г.).-Ставрополь,1995.-С.240-242 (Соавт. Фунтикова- Т.II.,Буравцева Н.П., Проскурина В.А., Жилченко Е.Б.)

29.Изучение свойств субкультур различных штаммов -сибиреязвенного микроба, резистентных к действию бактериофага // В сб. "Актуальные вопросы профилактики особо опасных и других инфекционных заболеваний" -Материалы научно-практ.конф."60 лет противочумной службы Кавказа" (24-25 октября 1995 г.).- Спшрополь, 1995.-С.242-243 (Соавт.: Цыганкова О.И.)

30.Применение синтетической Р-среды для изучения ферментативной активности сибиреязвенного микроба // В сб. "Акгуальные вопросы профилактики особо опасных и других инфекционных заболеваний" -Материалы научно-практ.конф."60 лет противочумной службы Кавказа" (24-25 октября 1995 г.).-Сгаврополь, 1995.- С.243-244 (Соавт.: Цыганкова О.И., Буравцева Н.П.)

31.Изменение клеточного состава популяции микробов в живых сибиреязвенных вакцинах в процессе длительного хранения // В сб. "Актуальные вопросы профилактики особо опасных и других инфекционных заболеваний" -Материалы научно-практ.конф."60 лет противочумной службы Кавказа" (24-25 октября 1995 г.).-Ставрополь, 1995.- С.322-323(Соавт.: Фунтикова Т.Н., Цыганкова О.И., Буравцева Н.П.)

32.Эпизоотологическая и эпидемиологическая характеристика сибирской язвы в Чеченской Республике // ЖМЭИ,- 199б.-№3 (приложение).-С. 106-108 (Соавт.: Ярощук В.А., Банных В.А., Неляпин Н.М., Буравцева Н.П., Брюханов А.Ф., Мезенцев В.М., Тихенко Н.И., Савельев В.Г., Грижебовский Г.М., Лащенко Е.В.)

33.Среда для сочетанногр определения продукции экзотоксина и капсулы Bacillus anthracis // Бюллетень изобретений, 1996.-№3(1), бюл.№16.

34.Способ дифференциации штаммов сибиреязвенного микроба по вирулентности in уйго//Заявка №95101339, положительное решение о выдаче патента на изобретение от 26.02.97 (Соавт.: Буравцева Н.П., Фунтикова Т.Н.)

35.Способ отбора иммуногенных штаммов и субкультур живых сибиреязвенных вакцин // Заявка №95101413, положигельное решение о выдаче патента на изобретение от 27.02.97(Соавт.: Буравцева Н.Й., Фунтикова Т.Н.)

36.Способ восстановления вирулентности штаммов сибиреязвенного микроба // Заявка №95101414/13(002738),

положительное решение о выдаче патента на изобретение от 13.03.97. (Соавт.: Цыганкова О.И.,Б.В.Солодовников)

37.Способ получения нуклеиновых кислот сибиреязвенного микроба //Заявка №95101495, положительное решение о вьц : патента на изобретение от 27.02.97. (Соавт.: Абгарян А.Г., Майск 'й В.Г.)

38.Молекулярная биология и генетика патогепности ВасШш anthracis // ЗОс.-Деп. в ВИНИТИ г.Москва 19.06.1997,№2035-В97

39.Разработка метода днфференциащш штаммов сибиреязвенного микроба но иагогенносги in vitro // 8 с.-Деп. в ВИНИТИ г.Москва 19.06.1997.№203б-В97 (Соавт.: Буравцева Н.П., Фунтикова Т.Н.)

40.Клональный анализ популяций штаммов Bacillus anthracis, выделенных из почвы // 21 с.-Деп. в ВИНИТИ г.Москва 19.06.1997,№2037-397 (Соавт.: Буравцева Н.П., Цыганкова О.И., Солодовников Б.В.)