Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение и изучение специфических антигенов BACILLUS ANTHRACIS с целью конструирования диагностических и профилактических препаратов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Выделение и изучение специфических антигенов BACILLUS ANTHRACIS с целью конструирования диагностических и профилактических препаратов"

РГЗ од

2 4 НОР

На правах рукописи

БЕЗНОСОВ Михаил Владимирович

ВЫДЕЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИГЕНОВ BACILLUS ANTHRACIS С ЦЕЛЬЮ КОНСТРУИРОВАНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ И ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов, 1997

Работа выполнена в Иркутском ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском противочумном институте Сибири и Дальнего Востока Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник А.В.Родзиковский

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Ю.А.Попов

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Г.М.Сергеева

Ведущая организация:

Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт

Защита состоится «» декабря 1997 г. в 10.00 час. на заседании Диссертационного Совета Д 074. 32. 01 при Российском научно-исследовательском противочумном институте «Микроб» (410071, г. Саратов, ул. Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РНИПЧИ «Микроб»

Автореферат разослан «¡А » ноября 1997 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук, профессор Г.А.Корнеев

Общая характеристика работы

Актуальность темы. К настоящему времени антигенный состав сибиреязвенного микроба изучен недостаточно. Особенно мала информация о белковых антигенах клеточной поверхности.

Иммунохимическими и электрофоретическими исследованиями в экстрактах дезинтегрированных клеток Bacillus anthracis выявлено не менее 20 белковых антигенов с м.м. 10-200 кДа (Митин, 1981; Никитин, 1981; Лопаткин с соавт., 1985; Ezzell, Abshire, 1988; Quinn et al., 1989; Farhaus, 1995). Несомненно, что выявленные антигены оказывают непосредственное влияние на иммуногенез, патогенез заболевания и приобретают все большее значение при конструировании новых диагностических и профилактических препаратов. Эти антигены высокоиммуногенны и при иммунизации ими животных обеспечивают получение высокоактивных иммунных сывороток. К сожалению, последние нередко реагируют с антигенами не только сибиреязвенного микроба, но и близкородственных сапрофитов. В последние годы получены данные о наличии в клеточных структурах сибиреязвенного микроба высокоиммуноген-ных видоспецифических белковых антигенов, однако отсутствие надежных приемов выделения и очистки этих антигенов служит препятствием для их практического применения.

Общеизвестно, что живая споровая сибиреязвенная вакцина по защитной эффективности превосходит химические вакцины, которые в качестве основного иммунизирующего компонента содержат протективный антиген (ПА). Однако для создания относительно прочного иммунитета требуется многократное введение химической вакцины (Harrison, 1980), но и при этом не исключена возможность прорыва иммунной защиты (Little et al., ¡986; Ivins, 1994). По этой причине предполагается, что химическая вакцина против сибирской язвы должна содержать, кроме компонентов токсина, стимулирующих антитоксический иммунитет, другие антигены, которые участвуют в формировании антибактериального иммунитета (Борисов с соавт., 1985; Little et al., 1986; Turnbull et al., 1988; Perard et al., 1995).

Таким образом, представляется актуальным изучение антигенной структуры сибиреязвенного и близкородственных микробов, поиск, выделение и очистка видоспецифических, в том числе структурных белковых, антигенов и изыскание возможности их применения для усовершенствования методов диагностики и профилактики сибирской язвы.

Цель и задачи исследования. Основной целью данной работы являются сравнительное изучение антигенной структуры В. anthracis и близкородственных сапрофитов и оценка возможности использования выделенных очищенных антигенов сибиреязвенного микроба для конструирования диагностических и профилактических препаратов. В связи с этим в работе решались следующие задачи:

1. Разработать эффективные способы экстракции поверхностных белковых антигенов В. ашИгаЫя.

2. Провести сравнительное изучение антигенного состава экстрактов клеток возбудителя сибирской язвы и близкородственных сапрофитов с целью выявления видоспецифических антигенов.

3. Разработать высокоэффективные способы изоляции и очистки антигенов сибиреязвенного микроба.

4. Оценить пригодность очищенных сибиреязвенных антигенов для конструирования диагностических и профилактических препаратов.

Научная новизна работы.

1. Впервые в экстрактах вегетативных клеток В. аШИгаЫз обнаружены специфические соматические сибиреязвенные антигены белковой природы с м.м. 30 и 92 кДа (белки В и С соответственно), разработаны способы их очистки и охарактеризованы физико-химические, иммунохимические и биологические свойства. Разработан эффективный одноэтапный способ очистки протек-тивного антигена (ПА) и отечного фактора (ОФ) - компонентов сибиреязвенного токсина. Способы очистки антигенов защищены двумя авторскими свидетельствами на изобретение.

2. Впервые обнаружено, что соматический белковый антиген с м.м. 92 кДа (белок С) обладает протективной, сенсибилизирующей и аллергенной (типа ГЗТ) активностью.

3. Показан синергизм действия белка С, ПА и ОФ в процессе специфической иммунизации животных, найдены эффективные иммуностимуляторы растительного и бактериального происхождения.

Практическая значимость работы.

На основе белка С, ПА и ОФ сконструирована комплексная химическая вакцина, по протективной активности превосходящая живую споровую сибиреязвенную вакцину. Белок С рекомендован в качестве антраксина - более эффективного, чем коммерческий антраксин. На основе антител против белков В и С получены флуоресцирующие сыворотки, по чувствительности и специфичности превосходящие одноименные коммерческие диагностикумы. Разработан быстрый эффективный способ получения из коммерческого сибиреязвенного у-глобулина специфических антител, на основе которых сконструирована высокочувствительная специфическая иммунопероксидазная тест-система.

Разработаны, одобрены ученым советом и утверждены директором Иркутского противочумного института "Методические рекомендации по оценке биологической активности сибиреязвенного аллергена на белых мышах" (протокол № 7 от 26.06.1986), "Методические рекомендации по использованию реакции альтерации нейтрофилов и лизиса лейкоцитов для выявления сенсибилизации к сибиреязвенному аллергену" (протокол № 3 от 07.02.1986), "Методические рекомендации по получению и использованию высокоактивных иммунных сывороток к соматическим белковым антигенам сибиреязвенного микроба для индикации и идентификации возбудителя (протокол № 6 от

ного микроба для индикации и идентификации возбудителя (протокол № б от 30.06.1994), НТД на иммуноферментную систему для индикации и идентификации В. anthracis (протокол № 3 от 06.03.1990).

На защиту выносятся следующие основные положения:

1. Клеточная поверхность возбудителя сибирской язвы в вегетативной форме содержит по меньшей мере два видоспецифических белковых антигена с м.м. 30 и 92 кДа.

2. Использованные препаративные методы позволяют получить очищенные белковые антигены с м.м. 30 и 92 кДа в количествах, достаточных для практического применения.

3. Очищенный белковый сибиреязвенный антиген с м.м. 92 кДа:

• обладает протективной активностью, сопоставимой с активностью экстрацеллюлярного антигена - протективного компонента (ПА) сибиреязвенного токсина;

• принимает участие в формировании гуморального и антибактериального иммунитета;

• вызывает сенсибилизацию экспериментальных животных и стимулирует гиперчувствительность замедленного типа;

• может быть использован в качестве диагностического препарата (ант-раксина).

4. Флюоресцирующие иммунные сыворотки против очищенных соматических антигенов позволяют надежно дифференцировать В. anthracis от близкородственных сапрофитов.

Работа выполнена в лаборатории зоонозных инфекций Иркутского противочумного института в рамках тем: "Выделение и изучение специфических антигенов из экстрактов вегетативных клеток Bacillus anthracis СТИ-Г'( научный руководитель канд. мед. наук, ст. науч. сотрудник Соркин Ю.И., № ГР 01860020885), "Усовершенствование методов экспресс-диагностики сибиреязвенной инфекции и индикации возбудителя во внешней среде на основе специфических соматических сибиреязвенных антигенов"(научный руководитель канд. мед. наук, ст. науч. сотрудник Соркин Ю.И., № ГР 01910033749).

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на Всесоюзной конференции специалистов противочумных учреждений (Иркутск, Россия, 1984), XII Пленарном заседании междуведомственной комиссии по борьбе с сибирской язвой при Госагропроме и Минздраве СССР (Воронеж, Россия, 1986), 2-й Всесоюзной конференции "Бактериальные токсины" (Юрмала, Латвия, 1989), Всесоюзной конференции "Современные аспекты профилактики зоонозных инфекций" (Ставрополь, Россия, 1991), Российской научной конференции "Иммунология и специфическая профилактика особо опасных инфекций" (Саратов, Россия, 1993), Российской научно-практической конференции "Современные аспекты природной очаговости, эпидемиологии и профилактики особо опасных инфекционных болез-

(Омск, Россия, 1993), Российской научно-практической конференции "Актуальные проблемы профилактики особо опасных инфекционных болезней" (Иркутск, Россия, 1994), научных конференциях Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока (Иркутск, Россия, 1984-1996).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 24 работы.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованных литературных источников. Работа изложена на 171 странице машинописного текста, включает 15 таблиц и 27 рисунков. Список литературных источников содержит 217 наименований, в том числе 117 зарубежных.

Краткое содержание работы

Литературный обзор представлен в первой главе, где обсуждены проблемы антигенной структуры В. anthracis и родственных микроорганизмов, проанализированы способы выделения и очистки антигенов сибиреязвенного микроба, критически рассмотрены современные методы идентификации возбудителя, диагностики и профилактики сибирской язвы, обсуждены перспективы конструирования эффективных диагностических и профилактических препаратов.

Материалы и методы

В работе использованы 5 вакцинных и 10 вирулентных штаммов В. anthracis, 24 штамма В. cereus, 13 - В. thuringiensis, 3 - В. subtilis, 2 - В. anthracoides и 1 - В. megaíerium.

В качестве экспериментальных животных служили белые мыши, морские свинки, крысы линии Fischer, кролики "Венский голубой".

Вегетативные и споровые формы сибиреязвенного и родственных микроорганизмов получали общепринятыми микробиологическим методами (Ипатенко с соавт., 1989), бактериальную массу - из вегетативных клеток 18-часовых культур, выращенных при 37°С на агаре Хоттингера. Клетки разрушали в пресс-дезинтеграторе Х-25 (LKB, Швеция).

Антигены экстрагировали последовательно разными буферными растворами с возрастающей экстрактивной способностью при различных условиях (температура, наличие ДСН). При получении и очистке антигенов использовали ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе ДЕ-52, КМ-сефарозе 6В, адсорбционную хроматографию на гидроксилаппатите, гельфильтрацию на ультрогеле АСА- 54 и сефадексе G-25, диафильтрацию на ячейках "Amicon" (США) с фильтром РМ-10 или на приборе ДС-2 ("Amicon", США) с волокнистым фильтром HIPIO. Диализ препаратов проводили при 4° С в полиэтиленовых мешках или диализных трубках "Spectrapor membrane" (Serva, ФРГ). Для

ускорения процедуры освобождения белковых растворов от солей применяли электродиализ.

Антигенный и полипептидный состав фракций и чистоту выделенных антигенов проверяли в одномерном и перекрестном иммуноэлектрофорезе (Grabar, Williams, 1953; Веекс, 1977), диск-электрофорезе и ДСН-электрофорезе в ПААГ (Davies, 1964; Lammly, 1976), иммунофильтрационном иммуноэлектрофорезе (Марков с соавт., 1981), реакции иммунодиффузии (Ouchterlony, 1967).

Электрофорез проводили на приборе 2117 Multiphor (LKB, Швеция), используя стеклянные и полимерные "Gel Bond Film" пластины и шаблоны для постановки реакции производства фирмы LKB (Швеция).

Для определения молекулярной массы полипептидов применяли маркеры молекулярных масс фирм "BHD", Англия (14-71 кДа) и "Pharmacia", Швеция (19-94 к Да).

Аминокислотный состав белковых препаратов определяли по методу Moor, Stein (Дорбре, 1989) с помощью аминокислотного анализатора AAA 881 (Чехословакия). Количество каждой аминокислоты рассчитывали в молярных % по калибровочной кривой стандартной смеси аминокислот.

Аденилатциклазную активность исследуемых образцов антигенов определяли в системе, содержащей кальмодулин, АТФ, ЭДТА, ионы МгГ+, Са++ (Leppla, 1984), и оценивали по образованию цАМФ с помощью аналитического прибора фирмы "Amersham" (Англия). Результаты реакции учитывали на сцинтилляционном счетчике "Intertechnik S.L-30" (Франция).

Токсические свойства культурального фильтрата и компонентов сибиреязвенного токсина оценивали по эдематозной и летальной активности (Федорова, 1970; Heines, ¡965).

Аллергенную активность и специфичность реакции на введение соматических белков сибиреязвенного микроба изучали в опытах на морских свинках и белых мышах .

Протективную активность антигенов В. anthracis определяли в опытах на морских свинках или белых мышах. Результаты опытов оценивали по процентному соотношению числа выживших животных к числу погибших, а также по индексу иммунитета, ЛД50 рассчитывали по Риду, Менчу (Ашмарин, Воробьев, 1962).

Иммунные сыворотки против антигенов В. anthracis получали путем иммунизации кроликов по разработанной нами методике (Тюменцев, Безносов с соавт., 1993). Для стимулирования синтеза антител использовали феракрил и препарат БЭВО 91. Титр антител в сыворотках определяли в реакции иммунодиффузии (Ouchterlony, 1967). Превентивную активность иммунных сывороток оценивали по методу П.Н.Бургасова, Г.И.Рожкова (1984). Специфические антитела из коммерческого у-глобулина выделяли хроматографией на иммуно-сорбенте (активированным глутаральдегидом ультрогеле АСА 22 с химически связанными антигенами дезинтеграта В. cereus). IgG иммунных сывороток по-

лучали осаждением сульфатом аммония с последующей очисткой хроматогра-фированием на колонке с Affi Gel Blau (Bio-Rad, США).

Конъюгат антител с пероксидазой хрена получали по методу P.R.Nakane (1974), флюоресцирующие сыворотки - К.Л.Шаханиной (1968). Для проведения иммуноферментного анализа использовали прямой твердофазный сэнвич-вариант (Engval, 1971), иммунофлюоресцентный анализ проводили по рекомендациям О.И.Лежневой (1963).

Полученные результаты и их обсуждение

1. Сравнительный антигенный состав экстрактов клеток сибиреязвенного и близкородственных микробов

Для обнаружения и сравнительного анализа содержания антигенов использованы культуры вакцинных штаммов В. anthracis СТИ-1, СТИ-3, Ихти-ман, 34F2 и 71/12 Ценковского, а также микроорганизмов близкородственных видов - В. cereus 412, 504, 687; В. megaterium 512; В. subtilis 501. Штаммы выращивали на агаре Хоттингера pH 7.2 в течение 18 ч при 37°С в аэробных условиях. После дезинтегрирования бактериальных клеток и экстрагирования 0.05 M Na-фосфатным буферным раствором pH 7.4 растворы антигенов уравновешивали по содержанию белка до 2 мг/мл. Полученную фракцию составили легкорастворимые антигены сибиреязвенного и близкородственных сапрофи-тов.

По данным электрофореза в ПААГ, в экстрактах вегетативных клеток штаммов сибиреязвенного и родственных микробов выявлено около 20 полипептидов.

Электрофоретические спектры в экстрактах всех вакцинных штаммов В. anthracis практически полностью совпадают. Интенсивно окрашенные полосы соответствуют м.м. 110, 90, 72, 50, 28 и 14 кДа. Спектры полипептидов экстрактов близкородственных микроорганизмов и сибиреязвенного микроба почти идентичны, за исключением того, что у в первых отсутствует или слабо выражена полоса, соответствующая полипептиду с м.м. 30 кДа.

В одномерном электрофорезе при использовании в качестве проявляющей кроличьей иммунной сыворотки против антигенов экстракта вегетативных клеток В. anthracis СТИ-1 в экстрактах клеток сибиреязвенного микроба выявлено до 10, В. cereus - 8, В. megaterium - 5-6, В. subtilis - 2-3 антигена. Спектры их в экстрактах разных штаммов различаются незначительно, в основном интенсивностью окраски некоторых полос. При проведении перекрестного иммуноэлектрофореза иммунная сибиреязвенная сыворотка позволила выявить в экстрактах вегетативных клеток В. anthracis СТИ-1 20 антигенов, в экстрактах клеток В. cereus 687 - свыше 15, В. megaterium 512 - около 10 и В. subtilis 501 - от 3 до 5 антигенов.

Результаты исследования свидетельствуют о высокой гетерогенности и близком родстве растворимых антигенов представителей рода Bacillus. Вместе с тем у В. anthracis выявлены и видоспецифические антигены, характерным признаком которых является минимальная подвижность в электрическом поле агарозы. Так, в экстрактах из В. anthracis около 7 антигенов имели Rf в пределах 0.3, тогда как в экстрактах из В. cereus таких антигенов выявлено не более двух, а у В. megaterium и В. subtilis они отсутствовали. По данным иммуно-фильтрационного одномерного иммуноэлектрофореза, в экстракте клеток В. anthracis СТИ-1 обнаруживаются два специфических сибиреязвенных антигена с минимальной подвижностью в электрическом поле агарозы.

Таким образом, в экстрактах вегетативных клеток В. anthracis и близкородственных сапрофитов обнаружено значительное количество межвидовых антигенов, которые в организме животного вызывают синтез антител, перекрестно реагирующих при проведении серологических исследований. Межвидовые антигены В. anthracis и родственных микроорганизмов представляют собой, в основном, полипептиды, быстро мигрирующие в электрическом поле агарозы. Медленно мигрирующие антигены характерны для штаммов возбудителя сибирской язвы.

2. Выявление и выделение специфических антигенов сибиреязвенного

микроба

Для дальнейшего более детального изучения антигенного спектра и выявления перспективных с точки зрения конструирования диагностических и профилактических препаратов специфических антигенов сибиреязвенного микроба использовали клетки вакцинного штамма В. anthracis СТИ-1. Бактериальную массу получали на пластинчатом агаре Хоттингера из 18-часовой культуры. К этому времени культура находилась в фазе логарифмического роста и содержала минимальное количество продуктов лизиса клеток.

Первый этап работы состоял в изыскании оптимальных, максимально эффективных способов экстракции антигенов и фракционировании экстракта, второй - в получении и очистке специфических соматических антигенов.

2.1. Разработка способов экстракции соматических антигенов из вегетативных клеток В. anthracis СТИ-1.

Использованный методический подход заключался в последовательном экстрагировании вегетативных клеток В. anthracis СТИ-1 буферными растворами с возрастающей экстрактивной способностью при различных условиях экстракции.

С этой целью одну и ту же навеску бактериальной массы последовательно обрабатывали различными растворителями по следующей схеме:

100 г бактериальной массы интактных вегетативных клеток экстрагировали 0.05 М К-Ыа-фосфатным буферным раствором рН 7.4 (раствор 1) и надо-садочную жидкость после центрифугирования образца рассматривали как фракцию 1. Микробную массу, выпавшую в осадок, разрушали в пресс-дезинтеграторе, повторно экстрагировали раствором 1 и таким образом получали фракцию 2. По своим антигенным параметрам обе эти фракции соответствовали легкорастворимой фракции, охарактеризованной в разделе 1. Фракцию 3 получали экстрагированием нерастворимого осадка раствором 1, содержащим по 0.1% детергентов - дезоксихолата натрия, нонидета Р40 и тритона Х-305, фракцию 4 - экстрагированием остатка раствором 1 с 1% додецилсуль-фата натрия. Фракцию 5 составил оставшийся нерастворимый осадок. Первые три фракции получали экстрагированием на холоду (4° С), фракцию 4 - при 80° С в течение 10 мин.

Выделенные 5 фракций содержали полный набор антигенов, составляющих бактериальную клетку вегетативной формы В. амЬгаск СТИ-1.

Белковый и антигенный состав фракции анализировали электрофорезом в полиакриламидном геле и иммунохимическими методами.

Полипептиды каждой фракции по величине молекулярной массы распределены в пределах от 100 до 10 кДа. Во фракциях 1 и 2 обращает внимание присутствие наиболее окрашенных полос, соответствующих белкам с молекулярной массой 78, 56 и 30 кДа. Полипептиды с м.м. 30 кДа присутствуют также во фракциях 3 и 4, но в значительно меньших количествах. Однако наиболее характерным является наличие в этих двух фракциях полипептидов с м.м. 92 и 78 кДа, причем первый выявляется в наибольшем количестве во фракции 4.

При исследовании в перекрестном иммуноэлектрофорезе во фракции 1 выявлено до 12, во фракции 2 - 10 и фракции 3 - 9 антигенов. Большинство из них были быстромигрирующими (11£>0.3). Медленномигрирующих - специфичных для В. аыНгасгь - антигенов во фракции 1 выявлено 3, во фракции 3 - 4. Во фракции 4 медленномигрирующий антиген количественно преобладает над другими. Фракция 5 антигенной активностью не обладала.

Для дальнейшей работы по получению очищенных препаратов антигенов избраны фракции 1+2 и 4. Антигены первых двух фракций легко растворимы в условиях, приближенным к физиологическим и поэтому могут в первую очередь взаимодействовать с макроорганизмом, в частности в плане обеспечения выработки антител, в том числе видоспецифических для сибиреязвенного микроба. Антигены фракции 4, прежде всего с м.м. 92 кДА, судя по результатам изучения их биологических свойств, обладают протективной, аллергенной и сенсибилизирующей активностью.

3. Получение очищенных белковых антигенов В. anthracis 3.1. Выделение белка В

Исходным материалом для получения и очистки белкового соматического антигена с м.м. 30 кДА, которому мы присвоили наименование белка (антигена) В, служил экстракт дезинтегрированных вегетативных клеток В. anthracis СТИ-1 (фракции 2+1).

Концентрат экстракта подвергали ионообменной хроматографии на ДЭАЕ-целлюлозе ДЕ-52 (Pharmacia, Швеция). На колонку наносили 100 мл экстракта, элюцию проводили в градиенте концентрации NaCl (от 0 до 0.5 М), скорость элюции составляла 20 мл/ч, объем фракций - 5 мл.

В процессе хроматографирования белки экстракта распределялись на 2 главных и 5 минорных пиков. Иммунохимические исследования показали, что видоспецифические сибиреязвенные антигены с низкой электрофоретической подвижностью сосредоточены, в основном, в первом, выходящем в свободном объеме колонки, пике. В этой фракции обнаруживалось до б антигенов, причем некоторые из них давали перекрестные реакции с антисывороткой против экстрактивных белков В. cereus. Спектр антигенов второго главного пика состоял главным образом из быстромигрирующих (Rf>0.3) в электрическом поле ага-розы антигенов, реагирующих с антисывороткой против В. cereus.

Исходя из полученных результатов дальнейшую работу по выделению и очистке белка В проводили с белковыми фракциями, составляющими первый пик. Фракции этого пика объединяли, белки высаждали при 80% насыщения сульфатом аммония и диализовали против стартового 0.05 М Na-ацетатного буферного раствора. Полученный препарат подвергали дальнейшей очистке на КМ-сефарозе 6 В (Pharmacia, Швеция). С этой целью колонку (20x2 см) уравновешивали Na-ацетатным буферным раствором рН 5.0 и наносили 10 мл фракции. Элюцию проводили в градиенте рН от 5.0 до 8.0. Скорость элюции составляла 20 мл/час., объем фракций - 5 мл. Таким образом препарат удалось разделить на пять отдельных фракций. Иммунохимические испытания каждой фракций в одномерном иммуноэлектрофорезе показали, что специфический антиген В находится во фракции "49-53". Поскольку эта фракция содержала, хотя и в незначительном количестве, посторонние примеси, для устранения последних фракцию подвергали гельфильтрации на ультрогеле АСА-54 (LKB, Швеция). Белковый антиген В при этом рехроматографировался отдельным пиком с небольшим минорным пиком после него. Комплексные электрофоретические и иммунохимические исследования дают основания считать, что выделенный белковый антиген В - электрофоретически чистый препарат с молекулярной массой в пределах 30 кДа и Rf = 0.25 в ПААГ в системе B.S.Devies. При перекрестном иммуноэлектрофорезе против антител к исходному клеточному экстракту В. anthracis СТИ-1 выявляется один пик с небольшими (минорными) компонентами. С антисывороткой против экстракта клеток

В. сегеш белок В не реагирует. Выход препарата составил 3% от белков исходного экстракта.

3.2. Выделение белка С

В качестве исходного материала для получения белка с м.м. 92 кДа (белка С) служила фракция 4, полученная экстрагированием остатков клеточных стенок (после экстрагирования трех предыдущих фракций) В. апОггаая СТИ-1 0.05 М К-Ка-фосфатным буферным раствором с 1% додецилсульфата натрия. Как указывалось выше, эта фракция содержит белок с м.м. 92 кДа в качестве основного компонента. В биологических опытах отмечена прямая корреляция между количественным содержанием этого полипептида и усилением протективных свойств фракции.

Дальнейшие исследования показали, что антиген с м.м. 92 кДа является главным оболочечным белком возбудителя сибирской язвы в вегетативной форме и кодируется на хромосоме, поскольку обнаруживается в спектрах полипептидов штаммов Л. аыИгаж, содержащих рХО 1 или рХ02-плазмиды.

При скринировании методом ДСН-электрофореза в ПААГ интенсивно окрашенная полоса, соответствующая полипептиду с м.м. 92 кДа, выявляется только в экстрактах вегетативных клеток В. аЫкгат, и практически не обнаруживаются в экстрактах клеток близкородственных бацилл, за исключением некоторых штаммов В. сегеив (ОР7).

Полипептид легко экстрагируется из нативных вегетативных клеток 3% лаурилсаркозилатом натрия в 0.1 М трис-НС1 буфере на холоду. Предварительная обработка клеток буферным раствором без детергента позволяет удалить балластные вещества белковой, нуклеиновой и полисахаридной природы, что облегчает очистку антигена.

Очистку белка проводили по разработанной нами оригинальной методике, в которой совмещены два технологических процесса - концентрирование белкового раствора с удалением детергента и других балластных веществ и одновременно - сорбция белка на гидроксилаппатите при диафильтрации в резервуаре прибора ДС-2 Агшсоп (США) через волокнистый фильтр Н1Р30. Далее гелем гидроксил-аппатита с абсорбированными белками заполняли колонку 20x2 см и белки элюировали в нелинейном градиенте К-Иа-фосфатного буферного раствора с возрастающей концентрацией фосфата (от 0.005 до 0.3 М). Подобная процедура позволила разделить фракцию на 5 отдельных подфрак-ций (пиков). Белок С элюировался при концентрации фосфата 0.25 М (фракция 134-149).

Белок С с м.м. 92 кДа электрофоретически и иммунохимически гомогенен, электрофоретически слабо подвижен, хорошо растворим в буферных растворах при значениях рН>6.0.

3.3. Выделение антигенов сибиреязвенного токсина - ПА и ОФ

Для сопоставления свойств полученных белковых антигенов В и С с другими антигенными компонентами В. аЫкгааз нами разработан ускоренный метод выделения и очистки протективного антигена (ПА) и отечного фактора (ОФ) сибиреязвенного микроба. Предлагаемый метод в отличие от традиционных менее трудоемок и не требует специального оборудования и дефицитных реактивов. Суть метода заключается в получении ПА и ОФ в соответствии с процедурой, апробированной для очистки белка С. Источником получения антигенов служил культуральный фильтрат В. аЫкгаш СТИ-1. После концентрирования и сорбции на гидроксилаппатите белки элюировали в градиенте концентрации фосфата. ПА элюировался со свободным объемом колонки, элюирование ОФ происходило при концентрации фосфата 0.25 М. При этом 90% аденилатциклазной активности обнаружено во фракциях, содержащих ОФ, что свидетельствует о высокой степени очистки фермента. В целях сокращения времени получения лабильных белков перед лиофилизацией белковые растворы подвергали электродиализу.

Выделенные белки - ПА и ОФ - имеют молекулярную массу 85 и 89 кДа соответственно, электрофоретически и иммунохимически гомогенны не менее, чем на 85%.

В результате проведенной работы получены в очищенном виде 4 антигена сибиреязвенного микроба, два из которых (В и С) представляют собой антигены клеточной оболочки, два других (ПА и ОФ) - белковые компоненты экстрацеллюлярного сибиреязвенного токсина.

4. Получение антисывороток к антигенам В. апИггаск

Для получения высокоактивных иммунных сывороток нами разработана эффективная схема иммунизации кроликов специфическими белковыми антигенами сибиреязвенного микроба. В соответствии с этой схемой кроликов иммунизируют в 2 цикла. В течение I цикла антиген в сочетании с полным адъю-вантом Фрейнда (ПАФ) вводят последовательно через интервалы в 5-7 дней в подушечки задних и передних лап, в лимфатические узлы и внутримышечно. Через 1 мес после окончания I цикла животные трехкратно получают смесь антигена с иммунной аутосывороткой - внутривенно и феракрил - внутримышечно. На 7-й день после последней инъекции у животных забирают кровь и определяют титр антител в реакции иммунодиффузии по Оухтерлони. Рекомендуемая схема позволяет получать высокоспецифические сыворотки с титром антител, превышающем 1:64.

Поскольку по нашей схеме для получения сыворотки требуется более 2 мес. в экстренных случаях специфические антитела можно получить из вполне доступного коммерческого у-глобулина. Предлагаемая нами оригинальная методика состоит в использовании иммуносорбента на основе ультрогеля АСА-

22 (LKB, Швеция), активированного глутаральдегидом, и суспензии дезинте-грата вегетативных клеток В. cereus штаммов 412 и 687.

5. Физико-химические и биологические свойства очищенных

антигенов

Выделенные антигены являются белками, имеют выраженный максимум при спектрофотометрировании в области 280 нм, не содержат полисахаридов и нуклеиновых кислот, характеризуются низкой электрофоретической подвижностью, свидетельствующем о их заряде, близком к нейтральному. Молекулярные массы, по данным электрофоретических исследований в ПААГ, соматических белковых антигенов составляют 30 и 92 (белки В и С соответственно), протективного и отечного факторов - 85 и 89 кДА соответственно.

Иммунохимические исследования свидетельствуют о том, что выделенные белковые антигены не содержат общих антигенных детерминант, то есть представляют собой самостоятельные, не идентичные друг другу препараты.

В каждом белковом препарате идентифицировано по 16 аминокислот: аспарагиновая и глутаминовая кислоты, аланин, аргинин, валин, гистидин, глицин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, пролин, серин, тирозин, треонин и фенилаланин. Однако как содержание самих аминокислот, так и их распределение по отдельным препаратом неодинаково. Обращает внимание высокое содержание во всех препаратах глутаминовой кислоты (11.80-19.08 % мкм), в несколько меньших количествах присутствуют аспарагиновая кислота (4.219.50), глицин (6.83-12.22), валин (7.15-8.71), лизин (7.21-11.04), лейцин (5.5610.90), изолейцин (4.11-7.15). Для белка С характерно высокое содержание ме-тионина, для ПА - пролина. Соматические антигены В и С содержат почти в два раза больше, чем ПА и ОФ, аспарагиновой кислоты, но отличаются между собой по содержанию метионина (1.57 против 6.76 соответственно). ОФ по сравнению с ПА содержит в два раза больше лейцина, изолейцина, серина и гистидина и в два раза меньше - глицина.

Наиболее низкое суммарное соотношение основных аминокислот к кислым свойственно ПА (0.36) , наиболее высокое - белку В (0.90), примерно равное - ОФ (0.60) и белку С (0.59).

Удельная активность аденилатциклазы (ОФ), определяемая in vitro в модельной системе по методу S.H.Leppla (1984), составляла около 300 мкмоль цАМФ /мин/мг. Фермент лабилен и утрачивал активность даже при хранении на холоду в лиофильном состоянии в течение двух недель.

Белки В и С не обладают токсической активностью. ПА и ОФ при совместном введении в подкожную клетчатку морских свинок в дозах 25-30 мкг вызывают образование отека в месте введения, в случае раздельного введения антигенов отек не развивается. При введении в хвостовую вену крыс линии Fisher в дозе до 100 мкг эти препараты не оказывали токсического эффекта, что свидетельствует об отсутствии в них летального фактора.

Полученные белковые антигены обладают иммуногенными свойствами. Наибольший титр антител в РИД (1:128) получен при иммунизации кроликов белком С, наименьший (1:32-1:64) - белком В. Титр антител против ПА и ОФ составляет примерно 1:64.

Иммунная сыворотка против белка В не вызывала пассивного иммунитета у белых мышей. Сыворотки против остальных трех антигенов (С, ПА, ОФ) обеспечивали, хотя и в разной степени, развитие пассивного иммунитета у мышей. Наибольшую превентивную активность проявляла сыворотка против ПА - при разведении 1:25 она защищала 90% экспериментальных животных от заражающей дозы в 100 млн. спор В. аЫИгасгБ СТИ-1. Сыворотки против белка С и ОФ в том же разведении обеспечивали защиту 50% животных. При совместном введении белым мышам в соотношении 1:1 (конечное разведение 1:50) сыворотки против ПА и белка С индуцировали превентивную активность, сопоставимую с эффективностью коммерческого сибиреязвенного глобулина (70% выживших животных).

Результаты сравнительного изучения протективной активности очищенных антигенов (В, С, ПА, ОФ), культурального фильтрата и вегетативных клеток В. апЙ1гас18 СТИ-1 суммированы в таблице. Белых мышей весом 18-20 г двукратно иммунизировали путем подкожного введения с интервалом 14 дней 10 и 50 мкг соответствующего антигена в сочетании с ПАФ (соотношение 5:1) в 0.2 мл ЗФР. На 14-й день после последней инъекции антигена животных заражали внутрикожным введением спор В. аЫкгаш 71/12 в дозе 10 ЛД50. Гибель животных регистрировали в течение 10 дней.

Таблица. Протективная активность антигенов В. аЫкгас'я СТИ-1

Иммуноген Количество Выжило Погибло Процент

животных выживших

Концентрат культу- 10 8 2 80

рального фильтрата

ПА 10 8 2 80

ОФ 10 4 6 40

Белок В 10 1 9 10

Белок С 10 6 4 60

Белок С + ПА 10 9 1 90

В. аШИгаса СТИ-1,105 10 10 0 100

спор

Интактные животные 14 3 11 21.3

Полученные результаты показывают, что наибольшую протективную активность, приближающуюся к активности белков культурального фильтрата, проявляет ПА (80%). Белок С обеспечивает защиту несколько большую,

чем ОФ, но меньшую, чем ПА. Совершенно не вызывает, а даже несколько угнетает защиту белок В. Совместное введение двух белков - С и ПА - в соотношении 1:1 (мг/мг) усиливает защитную активность каждого из них. Количество выживших животных в этом случае достигало 90%, что сопоставимо с защитой, индуцируемой живой споровой сибиреязвенной вакциной В. аыНгас 'и СТИ-1.

Белок С в нативном состоянии при подкожном введении сенсибилизирует экспериментальных животных, а при повторном введении вызывает у них гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ). При прогревании в течение 15 мин при 90 е С белок С утрачивает способность взаимодействовать с антителами и сенсибилизировать животных, но сохраняет способность вызывать ГЗТ у сенсибилизированных животных. Сравнительное изучение аллергенной активности белка С и коммерческого сибиреязвенного антраксина показало значительные преимущества первого, который превосходит последний по специфичности и обеспечивает выявление в два раза большего количества положительно реагирующих среди специфически сенсибилизированных животных. Есть основания полагать, что белок С участвует в формировании не только гуморального, но и в стимуляции антиинфекционного иммунитета.

6. Конструирование диагностических и профилактических

препаратов

Исследования в данном направлении велись в плане оценки возможности использования как самих выделенных и очищенных антигенов В. аыНгасгв, так и полученных против них сывороток. Основными результатами проведенной работы являются конструирование, апробация и внедрение в практику ди-агностикумов для иммунофлюоресцентного и иммуноферментного анализа, аллергена (антраксина) и химической сибиреязвенной вакцины.

Диагностикум для иммунофлюоресцентного анализа создан на основе поликлональных кроличьих антител против белков В и С. Исходный титр антител анти-В-сыворотки в РИФ составлял 1:64, анти-С-сыворотки - 1:256. Полученные флюоресцирующие анти-В- и анти-С-сыворотки испытаны на 44 штаммах бацилл 5 видов (В. аЫкгас'^, В. сегет, В. В. зиЬНИя,

В. ашкгасоШез и В. тг%аШтт). Флюоресцирующая анти-В-сыворотка избирательно окрашивала клетки штаммов В. апМгаЫз и не давала перекрестных реакций ни с одним из испытанных штаммов бацилл близкородственных видов. Флюоресцирующая анти-С-сыворотка перекрестно реагировала только с четырьмя (из 24) штаммами В. сегеия. Иммунофлюоресцентный анализ с использованием наших диагностикумов оказался более специфичным, чем при применении коммерческого препарата, и примерно в 8 раз более чувствительным. При совместном применении анти-С-сыворотка устанавливала с высокой чувствительностью наличие возбудителя в исследуемом материале, а анти-В-сыворотка дифференцировала его от близкородственных сапрофитов.

Для постановки иммуноферментного анализа иммунопероксидазный: конъюгат приготовлен на основе специфических антител, полученных по нашему способу из коммерческого лошадиного у-глобулина. ИФА в нашей модификации позволяет обнаруживать антиген В. аЫкгасхз (независимо от штамма) при содержании его в испытуемом материале в концентрации 12.5 мкг/мл. Перекрестная реакция с антигеном части штаммов В. сегеш имела место только при повышении его концентрации до 100-200 мкг/мл. Антигены большей части штаммов В. сегеш, а также В. megaterium и В. зиЫШа с сибиреязвенным иммунопероксидазным диагностикумом не взаимодействовали.

В крови и органах (печень, селезенка, почки) экспериментально инфицированных спорами В. аШЬгаая СТИ-1 белых мышей антиген в ТИФА уже через двое суток обнаруживался в крови, печени, селезенке и почках, а затем регулярно - до 6-10 сут. В почве и шерсти антиген сибиреязвенного микроба в иммуноферментном (и имунофлюоресцентном) анализе выявлялся при концентрации 1000 и даже 100 м.к. на 1 г исследуемого материала.

Материалы опытов позволяют считать, что ТИФА с учетом его высокой чувствительности и специфичности может быть использован для диагностики заболевания сибирской язвой не только экспериментальных, но и сельскохозяйственных животных и человека.

Аллерген С (антраксин С) сконструирован на основе белка С и предложен в качестве альтернативы коммерческому антраксину. Сравнительное изучение аллергенной активности антраксина С и коммерческого сибиреязвенного антраксина показало значительные преимущества первого, который превосходит последний по специфичности, четкости результатов и обеспечивает выявление в два раза большего количества положительно реагирующих среди специфически сенсибилизированных животных. Кроме того, аллерген С из-за чистоты исходного антигена содержит в 2-3 раза меньше белка, чем коммерческий препарат.

С целью конструирования химической сибиреязвенной вакцины выделенные белковые антигены испытаны в различных комбинациях (рисунок). Экспериментальными животными служили морские свинки. Напряженность иммунитета контролировали высоковирулентным штаммом В. ашИгаая И-9 (ЛД50 для морских свинок 10-30 спор).

Установлено, что оптимальной является двукратная иммунизация животных химической вакциной в дозах 25 и 50 мкг (по белку) с интервалом 14 сут. Наибольшая протективная активность получена при совместном введении всех трех белковых антигенов (белок С, ПА, ОФ) в сочетании с ПАФ. По индексу иммунитета (1000.0) этот препарат почти в 2.5 раза превосходит живую ибиреязвенную вакцину (415.0). Вакцины, содержащие два компонента (белок С + ПА или белок С + ОФ) по протективной эффективности значительно уступали первому препарату (ИИ равны соответственно 121.4 и 125.0), а

1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0

Рисунок. Протективные свойства белковых компонентов В. аМИгас^я На оси ординат - показатели индекса иммунитета;

На оси абсцисс - вакцинные препараты: 1 - вакцина СТИ, 2 - белок С, 3 - ПАФ, 4 - белок С+ПАФ, 5 - белок С+ПА+ПАФ, 6 - белок С+ОФ+ПАФ, 7 - белок С+ПА+ОФ+ПАФ, 8 - белок С+гидроокись алюминия, 9 - ПА+гидроокись алюминия, 10 -ОФ+гидроокись алюминия, 11 - белок С+ПА+гидроокись алюминия, 12 - белок С+ОФ+гидроокись алюминия, 13 - белок С+ПА+ОФ+БЛПКТМ (белковолипополисахаридный комплекс туляремийного микроба), 14 - белок С+ПА+ОФ+гидроокись алюминия, 15 - белок С+ПА+ОФ+БЭВО 91, 16 - белок С+ПА+ОФ+НМХВ

препараты, не содержащие белка С, проявляли еще более низкую активность. Последнее обстоятельство свидетельствует о важной роли белка С в новых химических вакцинах.

При замене ПАФ другими биологически активными веществами наибольшую иммуностимулирующую активность проявили БЭВО 91 (ИИ = 250.0), гидроокись алюминия (114.5) и НМХВ (66.6). Однако проблема подбора эффективного и безопасного иммуностимулятора требует дальнейших исследований.

Выводы

1. Установлено наличие до 15 общих антигенных детерминант у В. ашИгааз, В. сегеиз, В. {¡аиг^гепт, В. яиЫШБ, В. аткгасо1с1ез и В. megaterium. Наиболее близким антигенным родством характеризуются В. аЫкгас1з и В. сегеш.

Д,иг. Дп

, Я.

Л

.14, г. 1 стшц. ■ Ч,,. .1ШЦ.Ш1 ,1г.,.,,,.» ■||».|.Ч.|Г. 11 'г г 1' """I'

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

2. Выявлены, изолированы, получены в очищенном состоянии и охарактеризованы поверхностные видоспецифические белковые антигены Bacillus anthracis - белок В и белок С.

3. Белок В имеет м.м. 30 кДа, вызывает образование в организме экспериментального животного антител, не реагирующих перекрестно с антигенами бацилл-сапрофитов и не создающих пассивного иммунитета, не обладает про-тективными свойствами. Белок С имеет м.м. 92 кДА, вызывает образование в организме животного антител, не взаимодействующих с антигенами бацилл-сапрофитов (за исключением антигенов некоторых штаммов В. cereus) и обладающих превентивными свойствами, обладает протективными, сенсибилизирующими и аллергенными свойствами.

4. Разработан оригинальный эффективный способ получения из культу-рального фильтрата компонентов сибиреязвенного токсина - ПА и ОФ.

5. Предложена оригинальная схема иммунизации кроликов-продуцентов для получения высокоактивных иммунных сывороток против соматических белков В и С.

6. Разработан эффективный способ получения специфических антител из коммерчески доступного сибиреязвенного у-глобулина.

7. Показана высокая протективная эффективность химической вакцины на основе белка С в сочетании с ПА и ОФ и иммуностимулятором (ПАФ, БЭ-ВО 91 или наружные мембраны холерного вибриона),

8. Обоснована возможность и доказана эффективность применения белка С в качестве аллергенного диагностикума как альтернативы коммерческому антраксину.

9. На основе антител против белков В и С и специфических антител коммерческого у-глобулина разработаны высокочувствительные иммуноф-люоресцентный и иммуноферментный методы детекции антигенов сибиреязвенного микроба.

Список публикаций по теме диссертации

1. Безносов М.В., Петров Г.А. Сравнительный анализ антигенного состава клеточных компонентов Bacillus anthracis и близкородственных видов рода Bacillus //Соврем, аспекты профил. зооноз. инфекций: Тез. докл. Всесоюз. конф. специалистов противочум. учреждений. - Ч. 3. - Иркутск, 1984. С. 8-9.

2. Безносов М.В., Рогов С.Н., Петров Г.А. Использование изотахофореза для препаративного разделения белков из экстракта клеток Bacillus anthracis СТИ-1 //Вопр. санохраны территории и профил. природно-очаговых инфекций: Тез. докл. науч. конф. - Хабаровск, 1986. С. 72-73.

3. Безносов М.В., Соркин Ю.И., Калиновский А.И., Петров Г.А. Способы получения специфических антител для идентификации Bacillus anthracis иммуноферментным методом //Актуальн. вопр. профил. сибирской язвы: Тез. докл. 12 пленарного заседания междуведомственной науч.-методич. комиссии

по борьбе с сибирской язвой. Воронеж, 20-21 октября 1986 . - М,1986. С. 115.116.

4. Петров Г.А., Безносов М.В. Клеточные реакции повышенной чувствительности замедленного типа у морских свинок, иммунизированных живой сибиреязвенной вакциной //Актуальн. вопр. профил. сибирской язвы: Тез. докл. 12 пленарного заседания междуведомственной науч.-методич. комиссии по борьбе с сибирской язвой. Воронеж, 20-21 октября 1986.-М, 1986. С. 112-113.

5. Петров Г.А., Безносов М.В. Оценка биологической активности сибиреязвенного аллергена на белых мышах //Актуальн. вопр. профил. сибирской язвы: Тез. докл. 12 пленарного заседания междуведомственной науч.-методич. комиссии по борьбе с сибирской язвой. Воронеж, 20-21 октября 1986 . - М, 1986. С. 114.

6. Безносов М.В., Петров Г.А. Получение и характеристика специфических соматических белковых антигенов сибиреязвенного микроба //Бактериальные токсины : Тез. докл. 2-й Всесоюз. конф. 27-30 ноября 1989. - Юрмала, 1989. С. 8.

7. Рогов С.Н., Безносов М.В., Чугай B.JI. Быстрый комбинированный метод получения протективного антигена и отечного фактора сибиреязвенного токсина //Бактериальные токсины : Тез. докл. 2-й Всесоюз. конф. 27-30 ноября

1989.-Юрмала, 1989. С. 110.

8. A.c. 1503102 СССР, МКИ N 22.4. Способ получения сибиреязвенного эндоантигена /Безносов М.В., Петров Г.А. (СССР). - 5 с.

9. A.c. 1640844 СССР, МКИ N 8.12. Способ получения сибиреязвенного аллергена /Безносов М.В., Петров Г.А. (СССР). 7 с.

10. Безносов М.В., Петров Г.А., Соркин Ю.И., Чугай B.JI. Сравнительное изучение защитных свойств экзо- и эндоантигенов сибиреязвенного микроба //Вопр. противоэпидемической защиты населения. - Ч. 3. - М., 1990. С. 231-239.

11. Голубинский Е.П., Марков Е.Ю., Урбанович Л.Я., Калиновский А.И., Соркин Ю.И., Безносов М.В. Принципы конструирования химических вакцин против особо опас. инфекций //2-я Объединенная науч. сессия НИИ и ВУЗов медико-биологического профиля. Иркутск, апрель 1990. - Иркутск,

1990. С. 151-157.

12. Безносов М.В., Петров Г.А., Соркин Ю.И., Чугай В.Л., Филиппова О.Л. Выделение и изучение иммуногенных свойств поверхностного антигена вегетативных клеток Bacillus anthracis СТИ-1 //Соврем, аспекты профил. зоо-ноз. инфекций: Тез. докл. науч. конф. Ставрополь, октябрь 1991. - Ставрополь,

1991. С. 105-106.

13. Петров Г.А., Безносов М.В., Соркин Ю.И. и др. Характеристика функциональной активности перитонеальных макрофагов белых мышей при иммунизации белковым комплексом сибиреязвенного микроба //Соврем, аспекты профил. зооноз. инфекций: Тез. докл. науч. конф. Ставрополь, октябрь 1991.-Ставрополь, 1991. С. 94-95.

14. Петров Г.А., Безносов М.В., Соркин Ю.И. и др. Поверхностный соматический антиген Bacillus anthracis СТИ-1 м.м. 92 кДа как составная часть химической сибиреязвенной вакцины //Иммунол. и специфич. профил. особо опас. инфекций: Тез. докл. Российской науч. конф. Саратов, 21-23 сентября 1993. Саратов, 1993. С. 193.

15. Тюменцев С.Н., Безносов М.В., Андреевская Н.М. и др. Получение высокоактивных иммунных сывороток против антигенов сибиреязвенного микроба //Соврем, аспекты профил. зооноз. инфекций: Тез. докл. науч. конф. Омск, октябрь 1993. - Ставрополь - 1993. С. 298-299.

16. Найманов П.И., Михайлова В.А., Безносов М.В., Соркин Ю.И., Тюменцев С.Н. Апробация сывороток к соматическим антигенам вакцинного штамма СТИ-1 для целей индикации и дифференциации возбудителя сибирской язвы непрямым флюоресцентным методом //Соврем, аспекты профил. зооноз. инфекций: Тез. докл. науч. конф. Омск, октябрь 1993. - Ставрополь -1993. С. 298-299.

17. Петров Г.А., Марков Е.Ю., Безносов М.В. и др. Экспериментальное изучение иммуностимулирующих свойств наружных мембран холерного вибриона и белковополисахаридного комплекса туляремийного микроба при иммунизации животных антигенами сибирской язвы //Соврем, аспекты профил. зооноз. инфекций: Тез. докл. науч. конф. Омск, октябрь 1991. - Ставрополь -

1993. С. 255-257.

18. Колесник P.C., Петров Г.А., Саппо С.Г., Соркин Ю.И., Безносов М.В., Старовойтова Т.П. К характеристике иммуногенности антигенных препаратов из Bacillus anthracis //Актуальные пробл. профил. особо опас. инфекционных болезней: Тез. докл. науч. конф. Иркутск, октябрь 1994. - Иркутск,

1994. С. 70-71

19. Найманов П.И., Михайлова В.А., Безносов М.В. и др. Испытание сывороток, полученных к клеточным белкам сибиреязвенного микроба, на вирулентных штаммах возбудителя //Актуальн. пробл. профил. особо опас. инфекционных болезней: Тез. докл. науч. конф. Иркутск, октябрь 1994. - Иркутск, 1994. С. 118.

20. Колесник P.C., Петров Г.А., Саппо С.Г., Безносов М.В. и др. Экспериментально-морфологические данные к оценке иммуногенности антигенных препаратов из Bacillus anthracis СТИ-1 //Иркутск, 1994. - 6 с. - Деп. в ВИНИТИ 12.06.94, № Ю87-В-94.

21. Выделение и изучение специфических антигенов из экстрактов вегетативных клеток Bacillus anthracis СТИ-1: Отчет о НИР (заключит.) /Иркутский науч.-иссл. противочум. ин-т Сибири и ДВ. - № ГР 01860020885; Инв. № 02910040087. - М., 1990. - 117 с.

22. Усовершенствование методов экспресс-диагностики сибиреязвенной инфекции и индикации возбудителя во внешней среде на основе специфических соматических сибиреязвенных антигенов: Отчет о НИР (заключит.)

/Иркутский науч.-иссл. противочум. ин-т Сибири и ДВ. - № ГР 01910033749; Инв. № 02960005345. - М., 1996. - 63 с.

23. Рогов С.Н., Безносов М.В., Чугай В.Л., Башкова В.А. Выделение и очистка протективного антигена и отечного фактора из культурального фильтрата Bacillus anthracis СТИ-1 //Ж. мед. паразитол. и паразит, болезни. - 1995. -№4. - С. 35-38.

24. Безносов М.В., Петров Г.А., Соркин Ю.И. и др. Выделение поверхностного антигена из вегетативных клеток Bacillus anthracis СТИ-1 //Журн. ммкробиол., эпидемиол., мммунобиол. - 1997. - № 1. - С. 9-13.