Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Обоснование необходимости в разработке технологических параметров, исключающих контаминацию пищевых продуктов BACILLUS CEREUS

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Обоснование необходимости в разработке технологических параметров, исключающих контаминацию пищевых продуктов BACILLUS CEREUS"

$эт>

На правах pvконник

МЕРЧИНА СВЕТЛАНА ВАСИЛЬЕВНА

ОБОСНОВАНИЕ НЕОБХОДИМОСТИ В РАЗРАБОТКЕ

ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ, ИСКЛЮЧАЮЩИХ КОНТАМИНАЦИЮ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ BACILLUS CEREVS

03,00.07 микробиология 03.00.23 биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Саратов-ЛООЗ

Работа выполнена в Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии.

Научные руководители; доктор биологических наук

профессор Васильев Дмитрий Аркадьевич доктор ветеринарных наук ведущий научный сотрудник ВНИИЗЖ Русалеев Владимир Сергеевич

Официальные оппоненты; доктор биологических наук

профессор Щербаков Анатолии Анисимович доктор биологических наук профессор Обухов Игорь Леонидович

Ведущая организация: Московский государственный университет прикладной биотехнологии

Защита диссертации состоится

Ж.

» 200 ^г. в часов на

заседании диссертационного совета Д 220.06К04 в Федеральном государственном обрата вате льном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова» по адресу 410005, г. Саратов, ул, С околевая, 335.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Саратовск государственный аграрный университет им. Н.И.Вавилова» по адре 410005, г. Саратов, ул. Со кодовая, 335.

Автореферат разослан «у •) ЮЗ г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук ¡п ъ - Л-В.Карпунина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Значительная доля публикации в отечественной научной печати посвящена только Bacillus anthracis. Роль бацилл других видов в заболеваниях людей до конца не выяснена. Зарубежные публикации позволяют расширить наше представление в данной области. S.Gaillard, I.Lequerine!, Р. Mafart (1998), определяя содержание спорсюбра-зующнх бактерий в пробах молока, установил, что после термической обработки молока чаще обнаруживались Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Bacillus coagulans. H. Berkel nR, Hodlok (1976) выделяли спорообразу ющне бактерии Bacillus cereus из вареных колбас, По данным S.Noriyasu, K.Haruhiko, W. То-shikoet al. (1998), при изучение более 100 образцов пастеризованной ветчины в 21% проб обнаруживается бактерии рода Bacillus и наиболее распространенными являлись Bacillus cereus, Bacillus cubtiiis, Bacillus lichcnifonnis. P.Gany, l.Vendeuvre, M. Bellon-Fontaine (1998) приводит результаты анализа микрофлоры, содержащейся в тесте, и из 53 выделенных им штаммов 17 -Bacillus cereus. I. MoSska (1996) провела бактериологическое исследование из порченных пищевых продуктов и установила, что одной из причин порчи является сонтаминация их Bacillus cereus. В сообщении С .К lug, K.Fehlhaber. U.Muller, Р. Braun (1998) приводятся данные о наличии спорообразующлх аэробных бактерий в некоторых партиях колбас различных сортов, высказывается мнение, что причиной контаминации колбас являются добавляемые специи. Проведенное им специальное бактериологическое исследование более 100 проб различных специй (лавровый лист, перец, корица, сухой чеснок, сухая, горчица) показало, что спорообразующие, аэробные бактерии, более чем в половине случаев обнаруживаются в количестве до 8500 бактерий на I г пробы. Проведя бактериологическое исследование более 6300 проб продуктов, M.Mazar, I.Gonzalez, M.Lopesz, J.Gonzalez et ai. (1995) обнаружили достаточно частое но сравнению с другими выделение бацилл, и они связывают с ними определенный процент зарегистрированных пишевых токсикоинфек-ций. : miCMCXA

;. ......Л-tttiт>

С середины шестидесятых годов в литературе появились данные о пищевых отравлениях, вызываемых бактериями рола Bacillus и, в частности, Bacillus cereus. Наблюдали случаи вспышек пищевого отравления после употребления студня, содержащего бактерии того же вида. В 1979 году было описано заболевание 28 пациентов госпиталя, употребляющих в пищу мясо индейки, из которого микробиологи выделили Bacillus cereus. В обзоре Foot Technol за 1988 год Bacillus cerevs вошел в список 10 основных инфекционных агентов, вызывающих кишечные заболевания людей в Северной Америке. По мнению B.Amod'io-Cocchieri, T.Ciriili, F. Viliiani et al. (I99S), Bacillus cereus входит в группу 4-х наиболее опасных микроорганизмов - источников пищевого отравления людей. Считается, что патогенез заболеваний, вызываемых Bacillus cereus, полностью опосредован действием энтеротоксина. В материалах семинара, состоявшегося в 1990 году, опубликована работа Ю.В.Езепчука и А.Р.Битцэева "Структурное сходство токсинов Bacillus cereus и Bacillus anihracis". Авторы считают, что существует структурное и функциональное сходство между диареегенным - летальным токсином (DLT) Bacillus cereus и экзотоксином Bacillus anthracis. Заболевание чаще всего происходит при употреблении зараженных Bacillus cereus растительных продуктов и молока (40-55%), а также мясных (25%) и других продуктов.

Общеизвестно, что бациллы являются почвенными микроорганизмами. Возможное сходство механизмов патогенеза при заболеваниях, вызываемых Bacillus cereus и Bacillus anthracis, обусловлено наличием возможного обмена между ними генетического материала. Таким образом, возрастает опасность последствий контаминации пищевых продуктов бактериями этого вида.

Цель исследования. Целью настоящего исследования являлось изучение степени контаминации с пений микроорганизмами Bacillus cereus, возможной опасности, которую несет эта контаминация здоровью людей и путей ликвидации этой опасности.

Задачи исследования. В связи с этим при выполнении работы решались следующие задачи:

t, Изучить показатели распространённости и сохранности Bacillus cereus в специях используемых для пищевых целей.

2. Изучить возможное антигенное родство Bacillus anthracis и Bacillus cereus.

3. Определить возможность обмена генетического материала между бактериями Bacillus anthracis и Bacillus cereus.

4. Разработать технологию, позволяющую сократить контаминацию специй бактериями Bacillus cereus.

Научная новизна работы.

- Изучены показатели распространённости и сохранности Bacillus cereus в специях, используемых для пищевых целей.

- Определено антигенное родство Bacillus anthracis и Bacillus cervus методом РДП.

- Определена возможность обмена генетического материала межд_у Bacillus anthracis и Bacillus cereus,

- Разработана технология, позволяющая сократить показатели коши-минации специй бактериями Bacillus cereus.

Практическая значимость работы.

Разработаны:

«Методические рекомендации по выделению и идентификации бактерии Bacillus cereus из продуктов питания».

«Методические указания по стимуляции прорастания спор Bacillus cereus», «Методические указания по подавлению роста вегетативных форм Bacillus cereus с использованием соли нитрита натрия в концентрации 2,5%».

Они одобрены учёным советом и утверждены ректором академии 08.04.2003 г. Материалы диссертации используются в учебном процессе «о курсу ВСЭ и микробиология в Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии.

Основные положения диссертационной работы, выносимые hü защиту:

]. Анализ распространённости и сохранности Bacillus cereus а специях используемых для пншевых целей,

2. Подтверждение антигенного родства Bacillus amhracis i: Bacillus

cereus,

3. Доказанность обмена генетического материала между Bacillus anthracis и Bacillus cereus.

4. Разработка технологии, позволяющей сократить контаминацию специй бактериями Bacillus cereus.

Работа выполнена. Диссертация выполнена в соответствии с комплексным планом научной работы кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии и лаборатории микробиология Всероссийского научно-исследовательского института зашиты животных.

Лнроиацня работы. Результаты основных исследований подтверждены актом комиссионных испытаний ог 21,05.2002 г. Материалы диссертации доложены и обсуждены на научно-практических конференциях УГСХА (1996-2003). Краснодар (1996), Новосибирск (1996),

Публикации. По теме диссертации опубликованы 13работ.

Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 115 листах машинописного текста н включает: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение, вывода, практические предложения и список литературы (184 источника, в том числе 87 отечественных). Работа иллюстрирована 15 таблицами, 21 рисунками и дополнена приложением.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы н методы исследований

Штаммы: Bacillus anthracis вакцинные - СТИ-1,34F;, 55-ВНИ1 IBBnM. Bacillus cereus 8035, GP-7, Полевые штаммы Bacillus cereus, полученные u ходе исследовании в количестве 37 штаммов.

Растворы. 0,9 %-ный раствор хлористого натрия. pH 7.2 - 7.4; 10 % раствор лимоннокислого натрия; 30 %-ный раствор хлористого кальции; фосфатный буферный раствор с ионной силой 0,1. Остальные растворы указаны в собственных исследованиях.

Питательные среды. 2 % мясо-пептонный агар (МПА); агар Днфко; мясо-пептонный бульон (МПБ) pH 7,2-7,4;. Селективная среда для диагностики сибирской язвы Ставропольского научно-исследовательского и нет и гута вакцин и сывороток. Остальные среды указаны в собственных исследованиях.

Препараты. Антиген сибиреязвенный бактерийный стандартный, ТУ 10-09-26-89, серия № 59. Сыворотка сибиреязвенная преципитируюшая ТУ 30.19.77-89, серия № 33. Сыворотка иротивосибнреязвенная ТУ 10.19.80 - 89 серия № 20.

Приборы и оборудование. Микроскоп биологический световой по ГОСТ 8284-78 с фазова-контрастной насадкой, микроскоп электронный JEM-6A (Япония), фотографирование на пластинках "МР" при увеличении микроскопа бООО-бООООх, аппарат для РДП фирмы LKB, потенциометр типа pH - 340, центрнфуга ОПн-8УХЛ4.2 с частотой врашения до 5000g. фотоаппараты серии «Зенит», термостаты для микробиологических исследований, холодильники бытовые и минусовые, автоклав вертикальный по ГОСТ 958675, торзионные весы типа B-S01.

Культивирование. Культуры сибиреязвенных и цереусных штаммов выращивали по методике, описанной в собственных исследованиях, методы стимуляции прорастания спор по методике N.Roth, D.Loely, H.Hode <1954), A.Femelius (i960), И.В.Земсков и др. (1972). Изучение условий образования протопластов проводил по методике Чанга и Коэна (1979).

Реакции. Постановка реакции диффузной преципитации (РДП) по методу Оухтерлони (1965), в модификации Э.Беыа (1978). При исследовании по выделению бацилл использовали ГОСТ 10444,8-88.

Методы электронной микроскопии. Приготовлении пленок-

подложек, препаратов целых клеток, ультратопких срезов проводили по схемам и прописям, предложенным З.Н. Меньшиковой (1970),

Числовой материал обрабатывали по Стыоденту и на ПК с помощью программы Microsoft Excel (версия 7,0).

Результаты исследовании и их обсуждение Исследование специи на наличие Bacillus cereus •

Целью данных исследований являлось изучение количественных показателей контаминации специй, используемых в производстве колбасных изделий бактериями Bacillus cereus. Специи получены in различных предприятий Ульяновской области. Для исследования взяты специи в количестве 46 проб - 20 видов. Из исследуемых проб готовили образцы по следующей схеме: брали 1 г специй и заливали 9 мл МПБ (1:10). Затем из этой суспензии после 3-х минутного осаждения из супернатанта отбирали 1 мл и добавляли 19 мл МПБ (1:20). Приготовленную суспензию прогревали в водяной бане 30 минут (t 66-70СС), выдерживали в термостате (37СС) 6 час. Затем делали посев газоном на чашки Петри. Оценка результатов посева на чашки Петри через 12-16 часов инкубирования в термостате (37°С). Микроорганизмы Bacillus cereus были дифференцированы от других бацилл на селективной среде. Результаты исследований свидетельствуют, что 37 образцов специи -содержат-искомые микроорганизмы, которые форм!труют колонии матово-белого цвета с неровными краями в виде гривы льва. При добавлении 25% раствора нашатырного спирта цвет колоний становился розовым. Можно сделать вывод, что в 46 образцах проб (кроме экстракта душистого перца, экстракта чёрного перца, ЕМ ФРИШ, биафос) наблюдался рост Bacillus cereus в разведении 1:10 н 1:20, как сразу при посеве, так и после 6 часов подращивания в термостате при 137°С. Предлагаемая схема выделения Bacillus cereus, наиболее оптимальная (рис i).

Исследуемый материал

Осадок

1 гр + 9 мл МГ1Б (суспензия А)

осаждение 3 мин. Супернатант (суспензия Б)

I мл + 19 мл МПБ

Посев газоном суспензий А и Б на Водянал ба()Я 30 MHfJ

чашку Петри со средой Ставрополь- 6б-70°С

ского научно-исследовательского института вакцин и сывороток для выделения сибиреязвенного микроба. Тер-мостатирование 18 ч при 37°С и последующим типировапием бактерий.

Суспензии А и Б термостатировали 6 ч при 37°С и после этого сеяли газоном на чашки Петри. Термостатнровали 12 ч при 37СС и последующим тонированием бактерий

Рис. I. Схема выделения Bacillus cereus С целью определения длительности сохранения жизнеспособное!» спор Bacillus cereus, исследовали по вышеуказанной схеме чёрный перец, хранившийся 37 лет в стеклянной посуде, при температуре комнаты. Проведённые исследования дали положительные результаты.

Таким образом установлено, что: разработанная нами схема позволяв выделять микроорганизмы Bacillus cereus в течение 18-20 часов. Из 20 видов специй,, 16 видов контаминированных Bacillus cereus (80%), это составляет 37 из 46 исследуемых проб. После 17-летнего хранения со специями, споры Bacillus cereus сохранили свою жизнеспособность.

Разработка метода стимуляции прорастания спор Bacillus cereus Выше проведённые исследования показали, что практически 80% специй кон та минировано бактериями Bacillus cereus. Эти специи идут непосредственно в колбасный фарш, с последующей термической обработкой, режп-

мы которой они выдерживают достаточно успешно. Поэтому задачей следующих исследований была разработка методики перевода споровой формы Bacillus cereus в вегетативную с целью дальнейшего термического воздействия и последующей инактивации.

Разработали методику на образцах, полученных с Ульяновского мясокомбината - смесь № 5, № 3, № 7. Их помещали в водяную баню на 30 минут при температуре 66-70° С. Затем, после 30 минутной экспозиции в водяной бане, добавляли стерильный физраствор, содержащий аминокислоты L-аланин и L-тирозин, в концентрации 0,2%. Термостата ро вал и при 39°С, 2,5 часа с конечным соотношением специй и физраствора 1:20- После этого суспензию ставили в термостат при температуре 37°С на 12-16 часов для подращивания. По результатам проведенных исследований можно сделать вывод, что предлагаемая нами вышеуказанная методика, превосходит способ предложенный N. Roth, D. Lively, Н. Hodge (1954); A.Femtlius (1960) по количеству перешедших в вегетацию спор Bacillus cereus в четыре раза.

Изучение антигенной структуры Bacillus anthracis л Bacillus cereus

Для оценки общности сибиреязвенных антигенов и антигенов, выделенных из штаммов Bacillus cereus. использовали методику РДП по Оухтео л они, коммерческие сыворотки: преиипитируюшую и протн воси б и рея з венную и сибиреязвенный глобулин. Первоначально необходимо было определить способ наиболее эффективного выделения антигенного комплекса. В связи с этим были апробированы различные способы извлечения антигенов из вегетативных клеток Bacillus antihracis культивируемых в жидкой среде С.В. Thorne (i960). Для этого использовали две методики: - разрушением SDS; - прогреванием при 100"С в водяной бане в течение 20 минут, В результате проведенных исследований установлено, что наиболее активным оказался антигенный комплекс, выделенный из клеток Bacillus anthracis с помощью обработки детергентом SDS. С преципитирующен сывороткой этот комплекс образовывал 4 линии преципитации, с нротивосибириязвенной сывороткой - 3, с глобулином - 6. Метод прогревания показал худите результа-

ты и не был использован в дальнейшей работе, В наших исследованиях установлено, что SDS антиген Bacillus cereus образует две яннии л решши тал ли с противоснбиреязвенной сывороткой. Следовательно, в данной системе л па антигенных компонента, являющиеся специфичными для Bacillus anilmwis родственны Bacillus cereus,

Изучение доказательств обмена генетического материала между штаммами двух видов Bacillus cereus и Bacillus anf/tracts Протопласты бактерий являются более удобной, по сравнению с клеткой, моделью для генетических исследований по возможному проникновению генетического материала от бактериальных культур одного вида бацилл в другой вид, в виду отсутствия клеточной стенки.

В связи с этим первоначально, задача наших исследований заключались 6 разработке методов получения протопластов у штаммов Bacillus cereus. Bacillus anihacis. В работе использовали сибиреязвенный штамм 34F; устойчивый к стрептомицину (1000 мкт/мл) и шт. Bacillus cereus GP-7, устойчивым к тетракциклину (150 мкг/мл). В основе нашей работы лежит модифицированный метод Чанга и Коэна (Chang, Choen, 1979). С целью получения протопластов клетки бактерий выращивали в богатой питательной гипертонической среде (ДМ-3), содержащей гидролизат казеина, дрожжевой экстракт, глтош ¡у и антибиотики - стрептомицин и тетрациклин. Культуры выращивали при постоянном перемешивании. Затем трижды отмывали их средой для протогт-стирования ДМ-3. В своих опытах проводили изучение пригодности различных сред для образования протопластов: СММ; ГКЯ и среду Алфолди. 1 ¡сходные концентрации клеток определяли титрованием их в физиологическом растворе и высевом на мясо-пептон ньш агар (МПА) из соответствующих разведений. Протопласты получали путем обработки клеток бактерий лизоин.чом различных концентраций - 1, 2, 5 и 10 мг/мл. После добавления к клеткам лн-зоцима содержимое пробирок ресуспензироаали и ставили на щуттель-ап парит при t° - 37СС. Время инкубирования клеток с лизоцимом было равно 1 часу Через 1 час инкубации бактериальных клеток с лизоцимом суспензию огмы-

вали от лизоцима, титровали ее в среде для протопластообразования и из соответствующих разведений высевали на твердую регенсрационную среду.

Образование протопластов контролировали с помощью фаз о во-контрастной микроскопии. Чувствительность протопластов к осмотическому шоку определяли следующим образом: суспензию протопластов дважды центрифугировали по 15 минут при 4000 об/мин, с ресуспедированием после каждого раза в дистиллированной воде. Затем из соответствующих разведений делали высевы на МПА, Результаты учитывали через 24 часа инкубирования при 37°С. Учитывая исходную концентрацию клеток, число клеток, выросших на МПА после осмотического шока и количество клеток, образовавшихся на ре-генерационной среде, определяли процент образования протопластов и процент их реверсии в исходную форму. Выход протопластов был высоким при использовании в качестве сред для протопластирования среды СММ и составлял 99,5% и среды Алфолди, где он достигал 99,8% при концентрации лизоцима 1 мг/мл (рис.2 и рис.3). При использовании среды ГКЯ протопласты не образовывались совсем при концентрациях лизоцима 1 и 2 мг/мл. Процент образующихся протопластов составлял 70% при применении лизоиима в кон-, центраиии 5 мг/мл и 91% - 10 мг/мл. В связи с этим в своих последующих опытах среда ГКЯ нами не использовалась.

Рис.2. Протопласты ВасШш сегеж при увеличении хбОООО

*S>j->. (■■..i-: ■"" ........

^ттшт^

■ir'^'l

Рис.3. Протопласты штамма Bacillus anthracis 34 F: при у величении X40000

Следующая серия экспериментов была направлена на выяснение способности полученных протопластов реверсировать в нормальные бактериальные формы. Для этого суспензию разводили в гипертонической среде и из различных разведении делати высевы на плотную агаризованную среду (ДМ-3). Регенерацию протопластов проводили в условиях полужидкого (0,8%) агара, так как при этом наблюдается более интенсивная аэрация и более мягкое прорастание регенерированных протопластов. Подсчет образующихся бактериальных колоний производили через 24 часа инкубирования при t° 37°С, Уровень реверсии определяли исходя из разницы в числе колоний, образовавшихся на регенерационной среде и формирующихся на МПА после осмотического шока, отнесенной к первоначальному количеству бактерий п культуре. Было установлено, что наиболее высокий процент регенерации протопластов наблюдали при применении среды Алфолди, использовании лизоцима в концентрации ] мг/мл и он достигал 6,5%, Более высокие концентрации лизоцима (5 и 10 мг/мл) снижали уровень реверсии протопластов. В среде СММ, несмотря на высокий процент протонластообразовамия. уровень реверсии протопластов в исходную бациллярную форму был низким и составлял 0,06 - 0,08%, Метод получения протопластов включает следующие основные этапы их получения:

Г Вырашиванне клеток бактерий в жидкой питательной среде (ДМ-3 ) до середины логарифмической фазы роста с применением шуттель-аппарата;

2, Использование гипертонической среды Алфолди для образования протопластов;

3, Обработка бактериальной суспензии лизоцимом в концентрации 1-2 мг/мл и инкубация их в течение 1 часа при 37 С;

4, Контроль образования протопластов с помощью фазово-контрастной микроскопии;

Исходя из вышеизложенного, можно сделать вывод о том, что наиболее подходящими условиями для образования протопластов из бактериальных штаммов ВасШт сегеиз ОР-7 и ВасШиз аткгасЫ 34¥2 являются: среда Алфолди, концентрация лизоцима = 1 мг/мл; время инкубирования с лизоцимом ) час., при 1° = 37°С, В этих условиях образование протопластов достигает 99,5 - 99,9% и процент их реверсии составляет 6,5%.

Таблица 1

Образование протопластов в среде Алфолди и их реверсия в бактериальные формы

Концентрация лизоцима (мг/мл)

I 1 5 10 ■

Число кл/мл в исходной культуре МО7 МО7 МО7 П-107 ;

Число кл/мл после шока 4-104 3-1 о4 2-104 3-10' j

Число после реверсии 5-105 2,6-105 41 о4 ;

% сформировавшихся протопластов 99,8 99,5 99,87 99,7 ;

% реверсии 6,5 3,5 0,4 0,1

В дальнейших исследованиях необходимо было выяснить возможность феномена межвидового слияния протопластов штаммов Bacillus anthracis м Bacillus cereus. В качестве одного из родителей использовали вакцинный сибиреязвенный штамм 34F;. Другим родителем был штамм Bacillus cercti.s GP-7. Штамм 34Fj, обладает биологическими свойствами, характерными для

штамма возбудителя сибирской язвы: типичным ростом на М11А и в МПС. клетки его неподвижны, соединены в цепочки, чувствителен к сибиреязвенным бактериофагам "К-ВИЭВ" и у-МВА, не лизирует эритроциты барана, не обладает способностью к росту при 45°С. Штамм ВасШиз сегеш вР-7 способен расти при 45°С, клетки его подвижны и не соединены в цепочки, гемолн-тически активен и не чувствителен к сибиреязвенным бактериофагам. Метод слияния протопластов заключается в следующем: равные объемы суспензии протопластов, полученных по вышеуказанному методу, смешивали и обрабатывали 40% полиэтнленгликолем с молекулярным весом 6000, приготовленным на гипертонической среде СММ, содержащей двойные количества сахарозы и хлористого магния. Обработку ПЭГ проводили при комнатной температуре в течение короткого промежутка времени (1-2 минут), так как адгезия протопластов происходит почти мгновенно, а увеличение времен» инкубации свыше 20 минут негативно сказывается на последующем выходе рекомби-нантного потомства. После экспозиции суспензию с ПЭГом разбавляли гипертонической средой, СММ, содержащей сахарозу, малеиновуто кислоту, хлористый магний, Репаззау бульон и центрифугировали в щадящем режиме (10 минут при 2600 §). Следует отметить, что этап центрифугирования в данном случае благоприятно сказывался на конечных результатах слияния протопластов, Затем протопласты переводили в небольшой объем гипертонической среды (СММ) и инкубировали 1,5-2 часа при 37°С до завершения -лапа слияния. После этого высевали бациллярную взвесь на селективные среды с антибиотиками. Реверсию протопластов в исходные бактериальные формы н осуществляли инкубацией их в жидкой СММ и на твердых регенераннонных средах. Селекцию гибридных колоний проводили 2-мя способами; I - прямая селекция - смесь протопластов обоих родителей после обработки ПЭГом высева-пи на чашки Петри с реге нерацион ной средой, содержащей антибиотики - стрептомицин и тетрациклин, 2 - непрямая селекция - смесь протопласты высевали на ре генерационную среду без антибиотиков, инкубировали при 37°С в течение 16-18 часов и после реверсии пересевали на МП А с шпибио-

тиками для отбора рекомбинантных клонов. С помощью метода непрямой селекции были подучены рекомбинанты, которые после реверсии на твердой регенераиконной среде и пересева на МПА, содержащего смесь 2-х антибиотиков - стрептомицина и тетрациклина, образовывали колонии через 24 часа культивирования при 37 "С. Методом прямой селекции не удалось получить рекомбинантные клоны. Рекомбинантные клоны, полученные методом непрямой селекции, устойчивы к 2-м антибиотикам - стрептомицину (1000 мкг/мл) и тетрзциклину (150 мкг/мл). Культу рал ьные, морфологические, биохимические и антигенные свойства всех ре ком б и нан то в исследовали с использованием 11 тестов, принятых для идентификации и дифференциации штаммов Bacillus antiwacis or штамма Bacillus cereus. Рекомбинантные клоны по культу рал ьно-морфологическим и биохимическим свойствам можно разделить на 3 группы. К 1-ой группе были отнесены рекомбинанты, имеющие сходные культуральные, морфологические и некоторые биохимические свойства с исходным штаммом Bacillus cereus GP-7 (характер роста на МПА и в МПБ, мор фол опт клеток и их подвижность, способность росту при 45°С). Для рекомбинантов 2-ой группы характерно наличие как подвижных одиночных клеток, так и неподвижных, соединенных в длинные цепочки, способность к росту при 45SC. Рекомбинанты 3-ей группы характеризовались отсутствием подвижности, по морфологии клеток они обнаруживали сходство с исходными штаммом Bacillus anthracls, но обладали способностью к росту при 45°С, характерной для Bacillus cereus. Рекомбинанты всех 3-х групп имели более низкую гемолитическую активность по сравнению с исходным штаммом Bacillus cereus и были не чувствительны к сибиреязвенным фагам. Таким образом, путем слияния протопластов, штаммов Bacillus anthnteis 34F;. устойчивых к стрептомицину (1000 мкг/мл) и Bacillus cereus GP-7, устойчивых к тетрациклину (150 мкг/мл) получены рекомбинантые клоны, устойчивые к 2-м антибиотикам - стрептомицину (1000 мкг/мл) и тетрациклину (150 мкг/мл). Они имеют большое сходство по биологическим свойствам с родительским штаммом Bacillus cereus GP-7 (характер poena на

МПЛ, способность к росту при 45°С, отсутствие чувствительности к сибиреязвенным фагам, характерных для ВасШт амЬ-ат) и некоторое сходство с исходным штаммом ВасШш ашкгаах по морфологии клеток, отсутствию подвижности и гемолитической активности.

В результате проведенных исследовании доказана возможность появления межвидовых рекомбинантов путем слияния протопластов Вое:IIих аткгасич и ВаеШиз сегеих. Рекомбинантные клоны имели свойства обоих родителей.

Разработка технологии, позволяющей сократить показатели контаминации специй ВасШиз еегеиа

С целью разработки технологии, позволяющей сократить контаминацию специй ВасШт сегеи;г, мы изучали влияния различной концентрации нитрата натрия на рост вегетативных форм бактерий ВасИ1их сегегкк. Материалом для исследований служили пробы специй, которые ставили в водяную баню и прогревали 30 мин, при 170°С. Затем проводили разведение специй в физрастворе с 0,2% содержанием аминокислот помещали в термостат при I 39°С на 2,5 часа. Далее на 2,5, 16 и 24 часа добавляли раствор разной концентрации нитрата натрия по схеме и продержав в боксе 5-10 мнн. делали посев на чашки Петри с селективной средой. Чашки с агаром ставили в термостатна 12 час. при 1° 39°С. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2

Влияние различных концентраций нитрата натрия на рост вегетативных

форм шт. Bacillus cereus при экспозиции воздействия 24 часа

Название специи Концентрация соли нитрата натрия Характер роста Bacillus cereus на чашках Петри Контроль

Смесь специй № 3 2,5% роста нет сплошной рост

Смесь специй № 3 10% роста нет сплошной рост

Смесь специй № 3 15% роста пет сплошной рост

В результате экспериментов показано, что при использовании 2,5% раствора нитрата натрия и инкубации в течение 24 час. при 1~37гС полностью подавляется развитие вегетативной формы бактерий Bacillus cereus

Выводы

1. Из 20 видов специй, включающих 46 проб, 16 видов контаминнро-ванных Bacillus cereus (80%), это составляет 37 проб из общего количества исследуемых проб (71%),

2. Изучены биологические свойства штаммов Bacillus cereus, выделенные из специй, и установлено, что шт. Bacillus cereus: грамоположительные подвижные палочки, образуют споры, при культивировании на мясо-пептонном агаре (МПА) формируют шероховатые колонии беловатого цвета с извитыми нитями по краям. В мясо-пептон ном бульоне (МПБ) имеет место помутненне бульона и крошковатый, трудно разбивающийся осадок. Штамм Bacillus cereus вызывает гемолиз эритроцитов барана, протеолиз свернутой лошадиной сыворотки, обладает ярко выраженной фосфатазной и имеет ;ie-цитилазную активность.

3. Разработана схема выделения Bacillus cereus из спеиий и пищевых продуктов, включающая: прогревание в водяной бане исследуемого материала 30 мин при 66-70°С с последующим инкубированием при 37"С, высевом на селективную среду, термостатитрованием при 37°С 12-16 часов для подращивания, колонии Bacillus cereus при добавлении 25% раствора аммиака на крышку чашки Петри окрашивались в розовый цвет.

4. Установлено, что после 17-летнего хранения при комнатной температуре споры Bacillus cereus сохранили свою жизнеспособность и переходили в вегетативную форму с сохранением биологических свойств, характерных для данного вида.

5. Установлено, что из 4-х антигенных компонентов, выявленных в ходе исследования методом РДП. - 2 антигенных компонента Bacillus iwtlinwis родственны Bacillus cereus.

6. Показзна возможность появления межвидовых рекомбинантов путем

слияния протопластов штаммов Bacillus cereus и Bacillus anthracis, Полученные ре комби нентные клоны имеют большое сходство но биологическим свойствам с родительским штаммом Bacillus cereus GP-7 (характер роста на МГ1А, способность к росту при 45°С. отсутствие чувствительности к сибиреязвенным бактериофагам) и некоторое сходство с исходным штаммом Bacillus anthracis 34F^ (по морфологии клеток, отсутствию подвижности и гемолитической активности), были устойчивы к 2-м антибиотикам - стрептомицину (1000 мкг/мл) и тетрациклину (150 мкг/мл),

7. Существует теоретически опасность контаминации пншевых продуктов через специи бактериями вида Bacillus cereus со свойствами бактерий вида Bacillus anthracis. Разработана технология, позволяющая сократить показатели контаминации специй Bacillus cereus и тем самым обезопасить пищевые продукты, суть которой сводится к тому, что пробы специи, помещаем в водяную баню и прогреваем 30 мин. при t 70°С, С дальнейшим суспен-знрованием специй в физрастворе с 0,2% содержанием амнкокислш L-аланин и L-тирозин и термоетатированием при 139°С на 2,5 часа, добавлением нитрата натрня в конечной концентрации 2,5% с экнозициеи в 24 часа при комнатной температуре и в качестве контроля высевом на плотную селективную питательную среду.

Практические предложения

Разработаны:

"Методические рекомендации по выделению и идентификации бактерий Bacillus cereus из продуктов питания".

«Методические указания по стимуляции прорастания спор Bacillus cereus». «Методические указания по подавлению роста вегетативных форм Вас! I lus cereus с использованием соли нитрита натрия в концентрации 2,5%».

Они одобрены учёным советом и утверждёны ректором академик 08.04.2003 г.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Мерчина С. В. О контаминации пищевых продуктов бакчериями

cillus // Сб. научных работ «Вопросы ветеринарной микробиологии, эпизоотологии и ВСЭ». - Ульяновск, 1994. -С.84-88.

2. Мерчина C.B., Русалеев B.C., Васильев Д.А. Влияние степени контаминации продуктов бактериями рода Bacillus // Сб. работ «Состояние и перспективы развития научных исследований по профилактике и лечению болезней сельскохозяйственных животных и птиц». - Краснодар, 1996. -С.128-130.

3. Мерчина C.B., Русалеев B.C., Васильев Д.А. Разработка оптимального метода выделения бактерий рода Bacillus из пищевых продуктов // Тезисы международной конференции «Актуальные проблемы ветсанконтроля сельскохозяйственной продукции». - Краснодар, 1996. - С.44-45.

4. Мерчина C.B., Русалеев B.C., Васильев Д.А. Теоретические и практические аспекты биологической стандартизации бактериофагов // Сб. научных работ «Профилактика и меры борьбы с инфекционными болезнями крупного рогатого скота». — Новосибирск, 1996. - С,52-55.

5. Мерчина C.B., Русалеев B.C., Васильев Д.А. Изучение одиночного цикла размножения субтилисных бактериофагов // Сб. научных работ «Профилактика и меры борьбы с инфекционными болезнями крупного рогатого скота». - Новосибирск, 1996. - С.56-58.

6. Мерчина C.B., Русалеев B.C., Васильев Д.А. Применение споровых культур в качестве индикаторных при репродукции субтилисных бактериофагов // Сб. работ «Профилактика и меры борьбы с инфекционными болезнями крупного рогатого скота». - Новосибирск, 1996. - С.58-60.

7. Мерчина C.B., Русалеев B.C. Морфология и биологические свойства фагов бактерий рода Bacillus It Сб. научных работ «Вопросы микробиологии, эпизоотологии и ветсанэкспертизы». - Ульяновск, 1998. - С.82-87,

8. Мерчина C.B., Русалеев B.C. Теоретические и практические аспекты биологической стандартизации бактериофагов // Сб. работ «Вопросы микробиологии, эпизоотологии и ветсанэкспертнзы». - Ульяновск, 2000. - С.37-39.

9. Мерчина C.B., Русалеев B.C., Бадаев P.P., Васильев Д.А. Выбор оп-

тимальнош метола вегетации спор бактерии Bacillus ceretts И Сб, «Вестник УГСХА». - Ульяновск. - 2002. - № 8. » С.7-9.

М.Мерчина C.B., Русалеев B.C., Васильев Д.А. Изучение сроков жизнеспособности Bacillus cereus в пищевых добавках // Сб. «Вестник УГСХА». - Ульяновск, -2002. - № 8. - С. 10-12,

П-Мерчина C.B., Русалеев B.C., Васильев Д.А., Бадаев P.P. Изучение действия соли нитрита натрия на рост Bacillus cereus И Сб, «Вестник УГСХА». - Ульяновск. - 2002. - № 8. - С.12-15.

12.Мерчина C.B., Русалеев B.C., Васильев ДА. Классификация и таксономия двух видов Bacillus anthracis и Bacillus cereus И Сб, «Вестник УГСХА». - Ульяновск. - 2002. - Ла 8. - C.15-I8.

13.Мерчина С.В„ Русалеев B.C., Елантьева Т.А, Изучение антигенной структуры Bacillus anlhracis и Bacillus cereus Н Материалы Всероссийской научной конференции «Инновационные технологии в аграрном образовании, науке и АПК России». - Ульяновск - Ч. II. - 2003, - С.249-251.

Подписано к печати 24,12.03 Заказ 241 Тираж 1Р0 Бумага офсетная

Формат 60x84' 16 Усл.-иеч.д.! .0 Печать 1ШО

Отпечатано ООО «Когшринг», г. Ульяновск, ул. Карла Маркса 26, тел.(8422)41-22-57, (8422)32~-04-37

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Мерчина, Светлана Васильевна

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Систематика и идентификация микроорганизмов рода Bacillus

1.2. Таксономия двух видов бацилл - Bacillus anthracis и Bacillus cereus

1.3. Изучение антигенного состава бацилл

1.4. Микроорганизмы рода Bacillus, обнаруживаемые в пищевых продуктах.

1.5. Получение межвидовых рекомбинантных штаммов рода Bacillus

1.6. Микроорганизмы рода Bacillus в организме животных.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Материалы и методы

2.2. Полученные результаты.

2.2.1. Изучение тинкториальных и биологических свойств бацилл, используемых в экспериментах

2.2.2. Исследование специй, используемых для производства колбасных изделий на наличие Bacillus cereus

2.2.3. Разработка метода стимуляции прорастания спор Bacillus cereus

2.2.4. Изучение антигенной структуры Bacillus anthracis и Bacillus cereus

2.2.5. Изучение доказательств обмена генетического материала между штаммами двух видов Bacillus cereus и Bacillus anthracis.

2.2.6. Разработка технологии, позволяющей сократить показатели контаминации специй бактериями Bacillus cereus.

ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Обоснование необходимости в разработке технологических параметров, исключающих контаминацию пищевых продуктов BACILLUS CEREUS"

Актуальность проблемы. Значительная доля публикаций в отечественной научной печати посвящена только Bacillus anthracis. Роль бацилл других видов в заболеваниях людей до конца не выяснена. Зарубежные публикации позволяют расширить наше представление в данной области. S.Gaillard, I.Lequerinel, P. Mafart (1998), определяя содержание спорообра-зующих бактерий в пробах молока, установил, что после термической обработки молока чаще обнаруживались Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Bacillus coagulans. H. Berkel и R. Hodlok (1976) выделяли спорообразующие бактерии Bacillus cereus из вареных колбас. По данным S.Noriyasu, K.Haruhiko, W. То-shiko et al. (1998), при изучение более 100 образцов пастеризованной ветчины в 21% проб обнаруживается бактерии рода Bacillus и наиболее распространенными являлись Bacillus cereus, Bacillus cubtilis, Bacillus licheniformis. P.Garry, I.Vendeuvre, M. Bellon-Fontaine (1998) приводит результаты анализа микрофлоры, содержащейся в тесте, и из 53 выделенных им штаммов 17 - Bacillus cereus. I. Molska (1996) провела бактериологическое исследование из порченных пищевых продуктов и установила, что одной из причин порчи является сонтаминация их Bacillus cereus. В сообщении C.Klug, K.Fehlhaber, U.Muller, P. Braun (1998) приводятся данные о наличии спорообразующих аэробных бактерий в некоторых партиях колбас различных сортов, высказывается мнение, что причиной контаминации колбас являются добавляемые специи. Проведенное им специальное бактериологическое исследование более 100 проб различных специй (лавровый лист, перец, корица, сухой чеснок, сухая, горчица) показало, что спорообразующие, аэробные бактерии, более чем в половине случаев обнаруживаются в количестве до 8500 бактерий на 1 г пробы. Проведя бактериологическое исследование более 6300 проб продуктов, M.Mazar, I.Gonzalez, M.Lopesz, J.Gonzalez et al. (1995) обнаружили достаточно частое по сравнению с другими выделение бацилл, и они связывают с ними с ними определенный процент зарегистрированных пищевых токсикоинфек-ций.

С середины шестидесятых годов в литературе появились данные о пищевых отравлениях, вызываемых бактериями рода Bacillus и, в частности, Bacillus cereus. Наблюдали случаи вспышек пищевого отравления после употребления студня, содержащего бактерии того же вида. В 1979 году было описано заболевание 28 пациентов госпиталя, употребляющих в пищу мясо индейки, из которого микробиологи выделили Bacillus cereus. В обзоре Foot Technol за 1988 год Bacillus cereus вошел в список 10 основных инфекционных агентов, вызывающих кишечные заболевания людей в Северной Америке. По мнению B.Amodio-Cocchieri, T.Cirilli, F. Villiani et al. (1998), Bacillus cereus входит в группу 4-х наиболее опасных микроорганизмов - источников пищевого отравления людей. Считается, что патогенез заболеваний, вызываемых Bacillus cereus, полностью опосредован действием энтеротоксина. В материалах семинара, состоявшегося в 1990 году, опубликована работа Ю.В.Езепчука и А.Р.Битцаева "Структурное сходство токсинов Bacillus cereus и Bacillus anthracis". Авторы считают, что существует структурное и функциональное сходство между диареегенным - летальным токсином (DLT) Bacillus cereus и экзотоксином Bacillus anthracis. Заболевание чаще всего происходит при употреблении зараженных Bacillus cereus растительных продуктов и молока (40-55%), а также мясных (25%) и других продуктов.

Общеизвестно, что бациллы являются почвенными микроорганизмами. Возможное сходство механизмов патогенеза при заболеваниях, вызываемых Bacillus cereus и Bacillus anthracis, обусловлено наличием возможного обмена между ними генетического материала. Таким образом, возрастает опасность последствий контаминации пищевых продуктов бактериями этого вида.

Цель исследования. Целью настоящего исследования являлось изучение степени контаминации специй микроорганизмами Bacillus cereus, возможной опасности, которую несет эта контаминация здоровью людей и путей ликвидации этой опасности.

Задачи исследования. В связи с этим при выполнении работы решались следующие задачи:

1. Изучить показатели распространённости и сохранности Bacillus cereus в специях используемых для пищевых целей.

2. Изучить возможное антигенное родство Bacillus anthracis и Bacillus cereus.

3. Определить возможность обмена генетического материала между бактериями Bacillus anthracis и Bacillus cereus.

4. Разработать технологию, позволяющую сократить контаминацию специй бактериями Bacillus cereus.

Научная новизна работы.

- Изучены показатели распространённости и сохранности Bacillus cereus в специях, используемых для пищевых целей.

- Определено антигенное родство Bacillus anthracis и Bacillus cereus методом РДП.

- Определена возможность обмена генетического материала между Bacillus anthracis и Bacillus cereus.

- Разработана технология, позволяющая сократить показатели контаминации специй бактериями Bacillus cereus.

Практическая значимость работы.

Разработаны:

Методические рекомендации по выделению и идентификации бактерий Bacillus cereus из продуктов питания».

Методические указания по стимуляции прорастания спор Bacillus cereus». «Методические указания по подавлению роста вегетативных форм Bacillus cereus с использованием соли нитрита натрия в концентрации 2,5%».

Они одобрены учёным советом и утверждёны ректором академии 08.04.2003 г. Материалы диссертации используются в учебном процессе по курсу ВСЭ и микробиология в Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии.

Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

1. Анализ распространённости и сохранности Bacillus cereus в специях используемых для пищевых целей.

2. Подтверждение антигенного родства Bacillus anthracis и Bacillus cereus.

3. Доказанность обмена генетического материала между Bacillus anthracis и Bacillus cereus.

4. Разработка технологии, позволяющей сократить контаминацию специй бактериями Bacillus cereus.

Работа выполнена. Диссертация выполнена в соответствии с комплексным планом научной работы кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии и лаборатории микробиологии Всероссийского научно-исследовательского института защиты животных.

Апробация работы. Результаты основных исследований подтверждены актом комиссионных испытаний от 21.05.2002 г. Материалы диссертации доложены и обсуждены на научно-практических конференциях УГСХА (1996-2003), Краснодар (1996), Новосибирск (1996).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 13 работ.

Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 115 листах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение, вывода, практические предложения и список литературы (184 источника, в том числе 87 отечественных). Работа иллюстрирована 15 таблицами, 21 рисунками и дополнена приложением.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Мерчина, Светлана Васильевна

ВЫВОДЫ

1. Из 20 видов специй, включающих 46 проб, 16 видов контами-нированных Bacillus cereus (80%), это составляет 37 проб из общего количества исследуемых проб (71%).

2. Изучены биологические свойства штаммов Bacillus cereus, выделенные из специй, и установлено, что шт. Bacillus cereus: грамоположи-тельные подвижные палочки, образуют споры, при культивировании на мя-со-пептонном агаре (МПА) формируют шероховатые колонии беловатого цвета с извитыми нитями по краям. В мясо-пептонном бульоне (МПБ) имеет место помутнение бульона и крошковатый, трудно разбивающийся осадок. Штамм Bacillus cereus вызывает гемолиз эритроцитов барана, протеолиз свернутой лошадиной сыворотки, обладает ярко выраженной фосфатазной и имеет лецитилазную активность.

3. Разработана схема выделения Bacillus cereus из специй и пищевых продуктов, включающая: прогревание в водяной бане исследуемого материала 30 мин при 66-70°С с последующим инкубированием при 37°С, высевом на селективную среду, термостатитрованием при 37°С 12-16 часов для подращивания, колонии Bacillus cereus при добавлении 25% раствора аммиака на крышку чашки Петри окрашивались в розовый цвет.

4. Установлено, что после 17-летнего хранения при комнатной температуре споры Bacillus cereus сохранили свою жизнеспособность и переходили в вегетативную форму с сохранением биологических свойств, характерных для данного вида.

5. Установлено, что из 4-х антигенных компонентов, выявленных в ходе исследования методом РДП, - 2 антигенных компонента Bacillus ап-thracis родственны Bacillus cereus.

6. Показана возможность появления межвидовых рекомбинантов путем слияния протопластов штаммов Bacillus cereus и Bacillus anthracis. Полученные рекомбинентные клоны имеют большое сходство по биологическим свойствам с родительским штаммом Bacillus cereus GP-7 (характер роста на МПА, способность к росту при 45°С, отсутствие чувствительности к сибиреязвенным бактериофагам) и некоторое сходство с исходным штаммом Bacillus anthracis 34F2 (по морфологии клеток, отсутствию подвижности и гемолитической активности), были устойчивы к 2-м антибиотикам - стрептомицину (1000 мкг/мл) и тетрациклину (150 мкг/мл).

1. Существует теоретически опасность контаминации пищевых продуктов через специи бактериями вида Bacillus cereus со свойствами бактерий вида Bacillus anthracis. Разработана технология, позволяющая сократить показатели контаминации специй Bacillus cereus и тем самым обезопасить пищевые продукты, суть которой сводится к тому, что пробы специй, помещаем в водяную баню и прогреваем 30 мин. при t 70°С, с дальнейшим суспензированием специй в физрастворе с 0,2% содержанием аминокислот L-аланин и L-тирозин и термостатированием при t 39°С на 2,5 часа, добавлением нитрата натрия в конечной концентрации 2,5% с экпозицией в 24 часа при комнатной температуре и в качестве контроля высевом на плотную селективную питательную среду.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Разработаны:

Методические рекомендации по выделению и идентификации бактерий Bacillus cereus из продуктов питания".

Методические указания по стимуляции прорастания спор Bacillus cereus».

Методические указания по подавлению роста вегетативных форм Bacillus cereus с использованием соли нитррта натрия в концентрации 2,5%».

Они одобрены учёным советом и утверждёны ректором академии 08.04.2003 г. Материалы диссертации используются в учебном процессе по курсу ВСЭ и микробиология в Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мерчина, Светлана Васильевна, Ульяновск

1. Акимович В.В., Самойлова Л.В. Микроб // Сб. научн. тр. Саратов. -1960. - В.4. - С.265-271.

2. Акимович В.В., Земцова И.Н., Самойлова Л.В. и др. Особо опасные и природноочаговые инфекции // Сб. научн. тр. 1962. - С. 170-171.

3. Акимович В.В., Земцова И.Н., Гончарова Н.С. и др. Специфическая профилактика особо опасных инфекций // Сб. научн. тр. 1964. - С.226-236.

4. Асколонов С.П., Ильченко А.И. Пищевые заболевания, вызываемые спорообразующими бактериями Bacillus subtilis и Bacillus mesentericus. В кн.: Вопросы питания. Киев: Госмедиздат УССР. - 1962. - С.226-229.

5. Африкян Э.К. Энтомопатогенные бактерии и их значение. Ереван: Изд-во АН АрмССР. - 1973.-С.418.

6. Безносов М.В. Выделение и изучение специфических антигенов Bacillus anthracis с целью конструирования диагностических и профилактических препаратов: Дис.канд.биол.наук. Саратов. - 1997. - 171 с.

7. Безуглая В.А. Биология бактерий рода Proteus, выделенных из продуктов убоя свиней в УССР, и мероприятия по обеспечению выпуска свинины, благополучной по протею: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Киев. — 1975.-22 с.

8. Бойков Ю.И. // Труды ВНИИВС. 1964. - Т.24. - С. 107.

9. Бойков Ю.И. Выделение Bacillus anthracis из почвы. // Труды ВНИИВС. 1967,-Т.25,-С. 16-21.

10. Борисов Е.М. // Ветеринария. 1955. - № 9. - С.80-81.

11. Буравцева Н.П., Лопаткин О.Н., Пилипенко В.Г. и др. // Матер. X Пленарного заседания междуведомственной комиссии по борьбе с сибирской язвой.-М., 1978.-С.102-103.

12. Буравцева Н.П., Лопаткин О.Н. Достижения и перспективы борьбы с сибирской язвой в СССР // Матер. X Пленарного заседания междуведомственной комиссии по борьбе с сибирской язвой. -М., 1983. С.105-107.

13. Бургасов П.М., Рожков Г.И. Сибиреязвенная инфекция. М.: Медицина. - 1984. - С.206.

14. Временное наставление по применению сибиреязвенного бактериофага "К" ВИЭВ для определения возбудителя сибирской язвы. -М., 1986. -С.17-27.

15. Вуд У. Брожение углеводов и родственных соединений. В кн.: Метаболизм бактерий. М.: Изд-во иностр. лит. - 1963. - С.96.

16. Гаврилов В.А. Иммуногенетические аспекты разработки противосибиреязвенных вакцин // Ветеринария. 1987. - № 10. - С. 27-29.

17. Галиуллин А.К., Коксин В.П., Салмаков K.M. и др. // Ветеринария.- 1996.-№ 1. С. 17-19.

18. Галиуллин А.К., Салмаков K.M., Алимов А.М. и др. // Ветеринария.- 1996. -№ 11.-С. 17-20.

19. ГинсбургН.Н. Антрацис. Кишинев. - 1964.

20. Гинсбурга H.H. Сибирская язва. М. - 1975. - С.157.

21. Глебова И.Я. Инфекционные болезни сельскохозяйственных животных // Сб. науч. тр. Краснодарской науч.-исслед. вет. станции. Краснодар. - 1971.-Т.4. - С.49-51.

22. Григорьева Т.М., Азузбекян Р.Р. Конъюгационная передача плаз-миды pAMßl Вас. anthracis. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1980. - № 4. - С. 19-24.

23. Груз Е.В. Изучение и рационализация некоторых лабораторных методов индикации и идентификации В ас. anthracis. II Автореф. дис. канд. мед. наук. Одесса. - 1965 .-19с.

24. Динчева E.H. Микробиологическое изучение мясного фарша. //Науч. тр. Высш. ветеринарно-мед. ин-та. 1970. - Т.22. - С. 139-146.

25. Дунаев Г.В. // Ветеринария. Киев. - 1967. - В. 12. - С.32.

26. Езепчук Ю.В. Патогенность как функция биомолекул. М., 1985. -С.238.

27. Езепчук Ю.В., Битцаева А.Р. Структурное сходство токсинов Bacillus cereus и Bacillus anthracis. М., 1990. - С.26.

28. Елагин Г.Д., Пятков В.А., Дубровин М.Ю. и др. // Тез. докл. науч,-практ.конф., посвящ. 100-летию образ, противочумной службы в России. -Саратов, 1997. Т.2. - С.175-176.

29. Заварзин Г.А. Фенотипическая систематика бактерий: Пространство логических возможностей. М.: Наука, 1974. - С. 137.

30. Завирюха А.И., Степанюк О.П. Достижения и перспективы борьбы с сибирской язвой в СССР // Матер. X пленар. засед. межведомственной комиссии по борьбе с сибирской язвой. М., 1978. - С. 130-131.

31. Иванова Е.В. Получение протопластов и мембранных структур Bacillus anthracis. II Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1983. - № 10.-С.104.

32. Иванова СЛ. // Журн. микробиол. 1957. - № 1. - С.75-79.

33. Ильина З.М.//Журн. микробиол. 1957.-№ 1.-С.55-59.

34. Ильина Т.К., Негру-Водэ В.В., Миллер Ю.М. и др. Химизм энергетического процесса восстановления нитрата у различных представителей почвенной микрофлоры. // Микробиология. 1977. - В.46. - № 6. - С. 10341036.

35. Инструкция и методические указания по лабораторной, клинической диагностике, профилактике и лечению сибирской язвы у людей. М., 1982.-61 с.

36. Ипатенко Н.Г. Лабораторные методы исследований при сибирской язве. // Ветеринария. 1983. - № 7. - С.74-75.

37. Ипатенко Н.Г., Седов В.А., Зелепукин B.C. и др. Сибирская язва сельскохозяйственных животных. М., 1987. - 256 с.

38. Калашник М.М., Дунаев Г.В. Вопросы эффективности противоси-биреязвенных мероприятий // Матер. IX Пленар. засед. межведомственной комиссии по борьбе с сибирской язвой. М., 1974. - С.136-137.

39. Колесов С.Г., Михайлов H.A. // Тр. ГНКИ. М., 1962. - С.45-49.

40. Колесова С.Г. Сибирская язва. М., 1976. - 288 с.

41. Коляков Я.Е. // Ветеринарная микробиология. М., 1960. - В.4. -С.15-19.

42. Коляков Я.Е., Мелихов А.Д. // Ветеринария. 1960. - № 3. - С.8184.

43. Коротич A.C., Погребняк Л.И. Сибирская язва. Киев, 1976. -С.157.

44. Костенко Ю.Г., Степаненко П.П., Любашенко С.Я. и др. Изучение остаточной аэробной мезофильной микрофлоры в пастеризованных консервах "Шейка ветчинная". // Тр. ВНИИ мясо-молоч. пром-сти. 1978. - № 41. -С.28-29.

45. Костюкова Т.А., Дроздов И.Г., Еремин С.А., Ежов И.Н., Анисимов П.И. Получение протопластов сибиреязвенного микроба и использование их в слиянии. // Сб. генетика, микробиология и совер. методов лаб. д-ки особо опасн. инфекций. Саратов, 1991. - С.37-46.

46. Красильников H.A. Определитель бактерий и актиномицетов. М.-Л., Изд-во АН СССР. - 1949.

47. Кузнецова Л.И., Веренков М.С., Земцова И.Н. Проблемы особо опасных инфекций // Сб. науч. тр. Саратов, 1969. - № 5(9). - С. 199-201.

48. Левина E.H., Кац Л.Н. // Журн. микробиол. 1966. - № 4. - С.98103.

49. Левина E.H., Гольдин Р.Б., Носков Ф.С. и др. Люминесцирующие антитела (в изучении патогенных микроорганизмов). М., 1972. - 144 с.

50. Лесняк О.Т. Экспериментальные обоснования к стандартизации сибиреязвенной вакцины СТИ для иммунизации людей. Автореф. дис. канд. мед. наук. М., 1970. - 20 с.

51. Манина Е.Г., Полякова И.Н., Езепчук Е.В., Жарикова Г.Г. Антигенные особенности клеток четырех вариантов Bacillus brevis var. G.B. Микробиология. - 1975. - 44. - № 6. - С. 1086-1089.

52. Мелихов А.Д. // Сб. науч. тр. Московск. вет.акад. -М., 1957. Т. 19. -В.2. -4.1. - С.86-88.

53. Методические указания по лабораторной диагностике сибирской язвы. // Лаб. исследования в ветеринарии. М., 1986. - С.5-9.

54. Методические указания по проведению обязательного минимума исследований в ветеринарных лабораториях при диагностике болезней животных. // Ветеринарное законодательство. М., 1972. - Т.2. - С. 181-182.

55. Мирзоева В.А. Бактерия группы сенной и картофельной палочек. -М.: Изд-во АН СССР, 1959. 176 с.

56. Никольский В.В. Вирусный гастроэнтерит свиней. К.: Урожай, 1975.-С.69.

57. Орловский В.И., Бочков И.А. Развитие микрофлоры в желудочно-кишечном тракте морских свинок. // Журн. микробиол., эпидемиол. и имму-нол.- 1973.-№ 8.-С. 141-142.

58. Павлова И.П., Полянская К.Н., Сядук В.Ф. и др. Вопросы эффективности противосибиреязвенных мероприятий // Матер. IX пленар. засед. межведомственной комиссии по борьбе с сибирской язвой. М., 1974. -С.131-132.

59. Петрова Л.Н. Дифференциране на культури от род Bacillus изоли-рани от местних полуконсервов. // Ветеринарно-мед. науки. 1975. - № 8. -С.12.

60. Полховский В.А. Реакция агглютинации как метод серологической дифференциации Вас. cereus. Докл. АН БССР. - 1967- 11. - № 5. - С.436-438.

61. Полховский В. А.//Журн. микробиол. 1970. -№ 2. - С.82-86.

62. Полховский В.А. Нуклеотидный состав ДНК аэробных спорообразующих бактерий. В кн.: Вопросы инфекционной и неинфекционной патологии. Ташкент. - 1975.-С. 183-185.

63. Преснов И.Н. // Ветеринария. 1966. - № 7. - С.25-29.

64. Преснов И.Н. Проблемы ветеринарной санитарии // Сб. науч. тр. ВНИИВС. М., 1967. - Т.29. - С.72-78.

65. Раутенштейн Я.И., Талалаева Д.Г., Блохина Т.П. и др. О применении специфических фагов для дифференциации энтомопатогенных бактерий, относящихся к Bac.thuringiensis. II Микробиология. 1975. - 44. — № 6. -С.1081-1085.

66. Рево М.В., Дунаев Г.В., Новиков В.М. До питания про принцип содержания обациллярного закисного фактора против сибирки. // Ветеринария.- Киев. 1964. - В.2. - С.47-49.

67. Резник С.Р., Сорокулова И.Б., Качан А.Ф. Дополнительный подход к дифференциации споровых бактерий Вас. subtilis и Вас. cereus. II Микро-биол. журн. 1978. - 40. - № 4. - С.448-453.

68. Рябченко Н.Ф., Буканов Н.О., Саканян В.А., Алиханян С.И. Трансформация протопластов Вас. thuriengiensis плазмидной ДНК рВС-16. // ДАН СССР. 1980. - 253. - № 3. - С. 729-732.

69. Сибирская язва // Лабораторные исследования в ветеринарии. М., 1971.-С.5-12.

70. Тарасова Т.Д., Шелохович А.И., Липпницкий A.B. К вопросу о получении протопластов сибиреязвенного микроба. // Лаб. диагн. и генет. вирулентности возбудителей особо опас. инфекций. -Всес. н.-и. противочум. ин-т- Микроб. Саратов, 1990. - С. 138-141.

71. Терентьев Ф.А. Морфологическая изменчивость сибирской язвы. // Труды науч. конф. Киев, Изд. Акад. Наук УССР. - 1939.

72. Топчий М.П. Применение препаратов из живых культур сенной палочки при дисбактериозах у телят: Автореф. дисс. . канд. биол. наук. -Минск, 1979.-21 с.

73. Турова Т.П., Бакалдина Н.Б. Физиология и молекулярная биология болезнетворных микроорганизмов // Сб. науч. тр. Горький, 1988. - С.4-8.

74. Филиппович Ю.В., Загвоздкин Л.Н., Бушляков М.С. // Журн. мик-робиол. 1969. - № 9. - С. 151.

75. Франек Ю., Кубин В. // Журн. гиг., эпидемиол., микробиол. и им-мунол. Прага, 1967. -№ 11. - В.З. - С.285-289.

76. Хвацева С.С., Куницын О.В., Скляров В .Я. и др. Достижения и перспективы борьбы с сибирской язвой в СССР // Матер. X пленар. засед. межведомственной комиссии по борьбе с сибирской язвой. М., 1978. - С.114-115.

77. Хмель И.А. Протопласты и эволюция микроорганизмов. // Успехи современной биологии. 1985. - 99. - № 3. - С. 323.

78. Ценин А.Н., Рыбчик В.Н. Получение рекомбинантов при смешивании протопластов E.coli. В кн. XIV Международный генетич. конгресс. М., Наука. - 1983,-С.241.

79. Цыганкова О.И. Гемолитическая и протеолитическая активность сибиреязвенного микроба. Дис. канд. мед. наук. Саратов, 1993. - 179 с.

80. Черкасский Б.Л., Кноп А.Г., Керимова Д.Д. и др. Достижения и перспективы борьбы с сибирской язвой в СССР // Матер. X пленар. засед. межведомственной комиссии по борьбе с сибирской язвой. М., 1978. - С.95-97.

81. Черкасский Б.Л., Жанузаков Н.Ж. Сибирская язва. Алма-Ата, 1980.- 192 с.

82. Шастина О.К, Соркин Ю.И., Калиновский А.И. и др. Вопросы санитарной охраны территории и профилактики природно-очаговых инфекций // Тез. докл.науч. конф. Хабаровск, 1986. - С.77-78.

83. Шляхов Э.Н., Груз Е.В., Прискарь В.И. Сибирская язва (очерки эпидемиологии, лабораторной диагностики и профилактики). Кишинев, 1975.-С.162.

84. Шуляк Ф.С. //Тр. Моск. вет.акад. М., 1956. - Т. 12. - С. 116-122.

85. Юзвик JT.H., Найманов П.И., Мусатов Ю.С. // Журн. микробиол. -1983. -№ 11. — С.102-103.

86. Afiti S., Muller J. Fluorescence bacterioscopy, a direct method for bacteriological food analysis. // Nahrung, 1975. V. 19. - N 7. - P.557-567.

87. Amodio-Cocchieri В., Cirillo Т., Villani F., Moschetti G. // Int. J. Food Sci and Nutr. 1998. - V.49. - N 4. - P.303-308.

88. Angelety L.H., Wright G.G. // Appl. Microbiol. 1971. - V.21. - № 1. - P.157-159.

89. BabaTs. // Japan J.Bact.- 1963,- V.18.-№ 12. P.455-457.

90. Barjac H. de, Bonnefoi A. Mise au point sur la classification des Bacillus thuringiensis. Entomophaga, 1973. - V.18. - N 1.-P.5-17.

91. Barjac H., Cosmao-Dumanoir V. Interet de certains criteres biochemi-ques supplementaires pour la classification des souches de Bacillus. Ann. Microbiol., 1975.-V. 126. - N 1. - P.83-95.

92. Baptist J.N., Mandel M., Gherna R.L. Comparative zone electrophoresis of enxymes in the genus Bacillus. // Int. J. Syst. Bacterid., 1978. 28. - N 2. -P.229-244.

93. Battisti L., Green B.D., Thorne C.B. Mating system for transfer of plasmids among Bacillus anthracis, Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis. И J. Bacteriol. 1985. - V. 162. - № 2. - P.543-550.

94. Bergey's manual of determinative bacteriology. 8th ed. - Baltimore: Williams and Wilkins Co. 1974. - 1258 p.

95. Berkei H., Hadlok R. Lecithinase und Toxinbildung durch Stamme der Gattung Bacikkus. // Lebensm. itelhygiene, 1976. V.27. - N 2. - S.63-65.

96. Boeye A., Aerts M. Numerical taxonomy of Bacillus isolates from North Sea sediments. // Int. J. Syst. Bacteriol., 1976. 26. -N 4. -P.427-441.

97. Bonde G.J. The genus Bacillus. An experiment with cluster analysis. // Dan. Med. Bull., 1975. V.22. - N 2. - P.41-61.

98. Bonventre P.F., Eckert N.J. // Amer. J. Pathol. 1963. - V.43. - № 2. -P.210-212.

99. Brown E.R., Cherry W.B. Specific identification of Bacillus anthracis by mean of a variant bacteriophage. // J. infect. Dis. 1955. - V.96. - № 1. - P.34-39.

100. Brown E.R., Cherry W.B., Moody M.D., Gordon M.A. // J.Bact. -1955. V.69. - № 5. - P.590-602.

101. Brown E.R., Moody M.D., Treece E.L., Smith C.W. // J. Bact., 1958. -V.75. № 5. - P.499-509.

102. Burdon K.L. //J.Bact. 1956. - V.71. - №1. - P.25-42.

103. Burdon K.L., Wendel R.D. //J. Infect. Dis, 1960. V.107. - P. 1224.

104. Candel A., Mastrandrea V., Cenci G., Bartolomeo A. Sensitivity to lytic agents and DNA base composition of several aerobic spore-bearing bacilli. // Zbl. Bacteriol. Parasitenk., lnfektionskrankh. und Hyg., Abt. 2, 1978. V.133. -N 3. - S.250-260.

105. Chan Kwong-Yu, Ko Kwai-Ming. Inhibitory effect and differentiating capacities of selected dyes on bacteria. Geobios, 1978. - V.5. -N 6. - P.241-250.

106. Chang S., Choen S.N. Sligh frequency transformation of B. subtilis protoplasts by plasmid DNA // Mol. gen Genet, 1979. V.168. - P.l 11-115.

107. Chatterjee B.R. Formation of spheroplasts from B.anthracis // J. Bacteriol., 1965.-P. 894.

108. Chatterjee B.R., Williams R.P. Formation of spheroplasts from Bacillus anthracis. // J. Bacteriol. 1965. - V.89, № 4. - P. 1128-1133.

109. Clark I.E.//J.Bact., 1937. V.33-P.435.

110. Clark R. Speculations on the incidence of anthrax in bovines.// J.S. Afr. vet. med. Assoc. 1938. - V.9. - P.5-12.

111. Costlow R.D., Radziwon T.S. Studies on the lysis and formation of protoplasts. //Bact. proc. 1961. - P.83.

112. Dominici S., Sarris K., Morozzi A., Cadaras P. Identificazion rapida del B. cereus mediante immunofluoreszenza. // Atti. Soc. ital. sei. vet., 1972. V.25. -P.418-421.

113. Durand M., Pichinoty F., Job C., Mandel M. Nutrition carbonee et etude taxonomique de Bacillus subtilis et. B. licheniformis. // Can. J. Microbiol., 1979. V.24. - N 4. - P.491-498.

114. Ezzell J.W., Abshire T.G., Little S.F. e.a. // J. Clin. Microbiol. 1990. - V.28. - № 2. - P.223-231.

115. Fen-Ke Yin // Acta Vet. Budapest. 1962. - V. 12. - № 4. - P.373-381.

116. Fleyry C. // Arch.Sei. 1963(1964). - V.16. - № 3. - P.469-470.

117. Fodor K., Alfoldi L. Fusion of protoplast of B.megaterium // Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 1976. V.73. - P.2147-2150.

118. Foldes S., Meretey K. Protoplast production induced by penicillin from the cells of B.cereus and B.anthracis. // Acta microbiol., 1960. -V.l. -N 1. -P.43-49.

119. Gaiginschi A., Timosca S., Burcoveanu C., Alexandresco M., Radu E., Petreanu V., Saicinc C. Formes "L" du Bacillus anthracis obtenus sous e' action de la trichloriode-pyridine. Arch. Roum. Pathol. Experim. Microb. - 1964. - V.23, № 3. - P.545-554.

120. Gaillard S., Lequerinel I., Mafart P. // J. Food Sei. 1998. - V.63. - N 5. - P.887-889.

121. Garry P., Vendeuvre L., Bellon-Fontaine M. // J. Dispers. Sei. and Technol.- 1998.-V.19.-N 6-7.-P.1175-1197.

122. Gibson T., Gordon R.F. Genus Basilius "Bergeyis manual of determinative bacteriology". //Baltimore, 1974. P.529-550.

123. Gordon R. The genus Bacillus. // In: Handb. Microbiol. Cleveland (Ohio), 1973.-V.l.-P.71-88.

124. Graham K., Keller K., Ezzell J., Doyle R. // Eur. J. Clin. Microbiol. -1984. V.3. - № 3. - P.210-212.

125. Green B.D. Mobilization of the Bacillus anthracis plasmids pXOl and pX02 by the Bacillus thuringiensis fertility plasmid pX012. Diss. Abstr. Internat. -B.1988. - V.49, № 5.-P.1523-B.

126. Green B.D., Battisti L., Thorne C.B. Involvement of Tn 4430 in transfer of Bacillus anthracis plasmids mediated by Bacillus thuringiensis plasmid p X012.-J. Bacterid. 1989. - V.171, № 1. - P.104-113.

127. Hotchkiss R.D. Parameters governing bacterial regeneration and genetic recombination after fusion of B.subt. protoplasts. // J.Bacter., 1978. V.137. - P.1346.

128. Ivanovics G. Unter welchen Bedingungen werden bei der Nahr-boodenzuchtung der Milzbrandbazillen Kapseln gebildet? // Zbl. Bakteriol. 1. Orig. 1937. Bd. 138. - № 7/8. - S.449-455.

129. Ivanovics G., Fuldes J. // Acta microbial. Acad. Sei. Fing. 1958. -V.5. -№ 1. - P.89-109.

130. Ivanovics G., Varga J. Naturwiesenschaften, 1963. V.50. -N 21.1. P.674.

131. Jejnes M. The growth and develops of bacterial protoplasts. // Exp. Cell. Res., 1961. V.4. - P.255-264.

132. Jensen J. Eine einfache "morphologische", streptomycin bestimmugs-methode mit milzbrandsporen. // Klin. Wschr. 1951. Bd. 29. - S.519.

133. Jensen J., Kleemeyer H. // Zbl. Bacteriol. I. Orig. 1953. - B.159. -H.8. - S.494-600.

134. Jonescu C. Identification of Bacillus subtilis from milk. // Microbiología, Parasitología, Epidemiología, 1966. V.l 1. - N 5. - P.322-325.

135. Katsaras K. Untersuchungen über saurelosliche Antigene an verschiedenen Stammen der Gattung Bacillus. // Berlin und München, tierartzl. Wochenschr., 1979. V.92.-N 12. - S.243-247.

136. Klug C., Fehlhaber K., Muller U., Braun P. // Berlin und munch tier-arztl Wochenschr. 1998. - V. 111. - N. 1. - S.9-12.

137. Knisely R.F. // J. Bact. 1966. - V.92. - № 3. - P.784-786.

138. Kundrat W. Zur Differenzierung aerober sporenbildner (Genus Bacillus Cohn). -Zbl. Veterinarmed, 1963. B.10. - N 5. - S.418-426.

139. Lachowski £., Krizyzanowski S., Wawrzkiewiczowa K. // Med. Wet. -1963.-V.19. -№ 8. P.447-453.

140. Lantos J., Ivanovics G. // Acta microbial. Acad Scient. Hung. 1964 (1965). - V.ll.-№ 4.-P.351-355.

141. Leise J.M., Carter C.H., Friedlander H.M., Freed S.W. // J. Bact. -1959. V.77. - № 5. - P.655-660.

142. Lemille F., Barjac H., Bonnefoi A. Essai sur la classification biochimique de 97 Bacillus du groupe I. Ann. Inst. Past., 1969. - V.l 16. - N 6. - P.808-819.

143. Levi C., Sanchez-Rivas C. Genetic studies on the fusion of bacterial protoplasts.//Microbiol., 1977. V.2. - P.233-236.

144. Lott G. Taxonomie und Bedeutung psychrotropher Keime. // Arch. Le-bensmittehyg., 1972. 23.-N 12. - S.265-268.

145. Mastroeni P., Nacci A., Misefari A. Immunoelectrophoretic analysis of surface antigens in vegetative cells and spores of Bacillus cereus. // G. bacterid., virol. et immunol., 1974. V.67. -N 7-12. -P.180-184.

146. Mc Donald. // J. Bact., 1963. V.84. - P.1071.

147. McDonald J.C. The isolation of pulcherriminic acid from Bacillus cereus.//Canad. J. Mircobiol., 1967.-V.13.-N 1.-P.17.

148. Mc Quillen. Bacterial protoplasts. // The Bacteria, Acad. Press Inc. New York, 1960.- V.l.-P.283.

149. Michel G., Brouilland I., Poulet P. // Bull. Acad Vet. France. 1972. -V.45. - № 8. - P.391-399.

150. Michael C., Brouillaum J., Poulter P., e.a. Diagnostic differential entre Bacteridi um anthracis et Bacillus cereus par immunodiffusion. // Bull. Intern. Epi-zoot. 1973. V.79. - № 3/4. - P.289-296.

151. Michel C., Poussot A., Chabassol C. et.al. Diagnostic bactériologique rapide de Bacteridium anthracis par immunofluorescence. Bull. Acad. Vet. France, 1973. - V.46. - № 8. - P.333-342.

152. Molska I. // Przen. spoz. 1996. - V.50. -N 12. - P.13-15.

153. Morris E.J. // J. gen. Microbiol. 1955. - V. 13. - № 3. - P.456-460.

154. Mazas M., Gonzalez J., Sarmiento Roberto M. // Int. J. Food Sci and Technol. 1995. - V.30. - N 1. - P.71-78.

155. Nordberg B.K. Continued investigations of some important characteristics in anthrax-like microorganisms as viewed from a point of view of Differential diagnosis. Nord. Vet.Med. 1953.-Bd. 5. — № 11. S.915-924.

156. Noriyasu S., Haruhiko K., Toshniko W., Takeshi M., Tatsuji M. // Biol, and Pharm. Bull. 1998. - V.21. - N 4. - P.311-314.

157. Patra G., Sylvestre P., Ramisse V. e.a. // Proceedings of the International Workshop on Anthrax. Winchester. England. Ed. P.C.B. Turnbull. Salisbury Medical Bulletin. Special Supplement 1996. - № 87. -P.45-46.

158. Ramisse V., Patra G., Vande-Lanthier V. e.a. // Proceedings of the International Workshop on Anthrax. Winchester. England. Ed. P.C.B. Turnbull. Salisbury Medical Bulletin. Special Supplement 1996. - № 87. -P.51.

159. Reddy A., Battisti L., Thorne C.B. Identification of celltransmissible plasmids in four Bacillus thuringiensis subspecies. Abstr. Annu. Meet., Washington, D.C., 23-28 March, 1986. Washington, D.C., 1986. -P.149.

160. Reddy A., Battisti L., Thome C.B. Identification of celltransmissible plasmids in four Bacillus thuringiensis subspecies. // J. Bacteriol. 1987. - V.169, № 11.- P.5263-5270.

161. Ruhfel, R.E. interspecies Transduction of Plasmids among B.cereus, B.anthracis and Bacillus thuringiensis. V.157. - № 3. - P.708-711.

162. Ruhfol R.E., Kochler T.M., Green B.D. e.a. Plasmid-Related differences in capsule production by Bacillus anthracis. // Abstr. Anny. Meet. Amer. Soc. Microbiol., Washington. 1989. -P. 157.

163. Schaeffer P., Hotchkiss R.D. Fusion of bacterial protoplast.// Proc. Natl. Acad. Sci., 1978. USA. - 73. - P.2151-2155.

164. Seidel G., Strassmann R. //Arch. Exe. Vet. Med. 1956. - B. 10. - H.3. - S.325-327.

165. Seidel G. // Ztsxhr. F. d.g. Hyg u. ihre Grenzgebiete. 1963. - Bd.9. -H.9. - S.688-700.

166. Seki T., Chung C.-K., Milami H., Oshima Y. Deozyribonucleic acid and homology and taxonomy of the genus Bacillus. // Int.J.Syst. Bacteriol., 1978. -28. -N 2. P. 182-189.

167. Seki T., Oshima T., Oshima Y. Taxonomic study of Bacillus by deoxyribonucleic acid hybridization and inte specific transformation. // Int. J. Bacteriol., 1975. V.95. - N 3. - P.258-280.

168. Smith N.R., Gordon R.E., Clark F.E. Aerobic sporeforming bacteria. // Washington: U.S. Dept. Agric. 1952. -P.559.

169. Smith H., Keppie J. // Brit. J. Exptl. Pathol., 1953. V.34. - № 5.1. P.374.

170. Smitn H., Tempest D.W. // J. Gen. Micrbiol., 1957. P. 17.

171. Smith N.R., Amer. // J. Path., 1963. V.43. - P.201.

172. Somerville H.J., Jones M.L. DNA competition studies within the Bacillus cereus group of bacilli. // J. Gen. Microbiol., 1972. V.73. - N 2. - P.257-265.

173. Stamatin N. // Arch. Roumaln. Pathol. Exptl. et Microbiol., 1960. -V.19. -N 4. P.493.

174. Titball R.W., Turnbull P.C.B., Hutson R.A. // J. Appl. Bact. Symp. Suppl. 1991. - V.70. - P.9-18.

175. Torsell W., Nordberg B.K. // Acta Veterin. Scand. 1961. - V.2. - № 1. - P. 15-21.

176. Weibull C. The isolation of protoplasts from Bac.megaterium by controlled treatment with lysozyme. /.Bacterid., 1953. V.66. - P.688-695.

177. Williams R.P., Chattergee B.R. Preparation of protoplasts in Bacillus anthracis. //Bact. proc. 1961. -P.83.

178. Wolf J., Barker A.N. The genus Bacillus: aids to the identification of its species. The society for applied Bacteriology technical series N 2. In.: Identification methods for microbiologists. London; New York: Acad, press, 1968. - P.92-109.

179. Wood H.Y., Stjerholm R.L. Assimilation of carbon dioxide by heterotrophic organisms. The bacteria: a treatise on structure and function. New York-London. 1962. V.3. - P.41 -43.