Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ферментативный синтез искусственного гена пептида сна

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Власов, Виктор Петрович

ВВЕДЕНИЕ.

ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ СИНТЕЗ ИСКУССТВЕННЫХ ПЕНОВ (литературный обзор).

ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ СИНТЕЗ ИСКУССТВЕННОГО ГЕНА ПЕПТИДА СНА (обсуждение результатов).

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Ферментативный синтез искусственного гена пептида сна"

В последние годы наряду со структурным изучением нуклеиновых кислот интенсивно развиваются исследования по синтезу искусственных генетических структур. Существует два способа получения искусственных генов: синтез ДНК на матрице мЕНК с помощью обратной транскриптазы (обратная транскрипция) и сшивание химически синтезированных олигодезоксинуклеотидов с помощью ДНК-лигазы (химико-ферментативный способ). Методом обратной транскрипции возможно получение только структурных генов - фрагментов ДНК, кодирующих последовательность аминокислот в полипептидной цепи. Для получения полных искусственных генов, способных к прямой экспрессии, необходимо наличие регуляторных участков, обеспечивающих нормальный процесс транскрипции и трансляции; создание искусственных регуляторных участков возможно только с помощью методов химико-ферментативного синтеза ДНК, Кроме того, в тех случаях, когда выделение мЕНК, соответствующей желаемому белку, затруднено или вовсе невозможно, химико-ферментативный путь оказывается также единственным способом получения искусственных структурных генов.

Развитие методов химико-ферментативного синтеза нуклеиновых кислот является одной из важнейших задач биоорганической химии и молекулярной биологии, поскольку такой способ синтеза ДНК позволяет искусственно получать генетический материал любой заданной структуры, вводить природные и синтетические полинуклеотиды в плазмидные или фаговые векторы, проводить их молекулярное клонирование и амплификацию, осуществлять направленный мутагенез ДНК, исследовать на молекулярном уровне процессы белково-нуклеиновых взаимодействий. Особый интерес представляет введение в геном бактериальной или дрожжевой клетки искусственных генов высших организмов,кодирующих важные биологически активные олиго- и полипептиды, а также искусственных регуляторных участков, позволяющих не толысо исследовать тонкие механизмы процесса биосинтеза белка, но и регулировать его на уровне транскрипции и трансляции»За последнее десятилетие в различных лабораториях мира химико-ферментативным путём синтезировано около двух десятков искусственных структурных генов, большинство из которых были клонированы и экспрессировались под контролем природных регуляторных участков в виде гибридных белков, и в настоящее время исследования в области синтеза различных генетических структур, необходимых для научных и практических целей, продолжают развиваться.

Целью настоящей работы явился ферментативный синтез из синтетических олигонуклеотидов двух вариантов структурного гена пептида сна, операторного участка лактозного оперона Е.соИ (сайта связывания белка-репрессора), последовательности Шайна-Дальгарно (сайта связывания рибосомы) и их клонирование в плазмидных векторах. В задачу также входило создание некоторых новых плазмид, необходимых для клонирования синтезированных генов.

Синтез структурного гена пептида сна в двух вариантах был обусловлен его клонированием в принципиально отличающихся векторах с использованием двух различных подходов. Первый вариант гена был синтезирован нами для клонирования в плаз-мидном векторе, содержащем фрагмент 1ас -оперона; в этом случае ген пептида сна оказывается присоединенным к дистальной части гена 1асг и экспрессируется в составе гибридного белка ^ -галактозидаза-пептид сна. Второй вариант структурного гена пептида сна был создан для клонирования в векторе сполностью синтетическими регуляторными участками: промотор -оператор - последовательность Шайна-Дальгарно. в результате такого клонирования образуется полностью синтетический искусственный ген, способный к прямой экспрессии в бактериальной клетке.

В нашу задачу входило показать на примере этих двух моделей, что синтетический структурный ген может экспрессиро-ваться не только под контролем природных регуляторных участков с образованием гибридного белка, но также под контролем полностью синтетических регуляторных участков, обеспечивающих биосинтез ±п т!уо непосредственно целевого пептида.

Диссертационная работа была выполнена в период 1979-1981 годов и является частью комплексных исследований, проводимых в лаборатории химии генов Института биоорганической химии им. М.М.Шемякина АН СССР. Автор выражает глубокую благодарность академику М.Н.Колосову и старшему научному сотруднику лаборатории, кандидату химических наук В.Г.Коробко за научное руководство настоящей диссертацией, постоянное внимание и практическую помощь, а также кандидату химических наук В.Н.Добрынину и его сотрудникам за синтез олигонуклеотидов, использованных в этой работе.ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ СИНТЕЗ ИСКУССТВЕННЫХ ГЕНОВ (литературный обзор)Одной из важных задач современной молекулярной биологии является синтез искусственных генов биологически активных веществ. Наиболее простым и распространенным методом получения таких генов является обратная транскрипция мРНК из различных природных источников. Однако, если выделение мРНК, соответствующей желаемому белку, затруднено или вовсе невозможно, единственным способом получения искусственных генов становится сшивание химически синтезированных олигонуклеоти-дов с помощью ДНК-лигазы. Кроме того, сочетание этих двух подходов оказывается чрезвычайно эффективным в тех случаях, когда необходимо изменить или восполнить какую-либо часть протяженных генов, полученных обратной транскрипцией мРЯК [ I].

Помимо использования синтетических олигонуклеотидов в качестве строительных блоков для получения различных генов существует ряд других областей их применения [2-4]. Синтетические олигонуклеотиды позволяют выделять мРНК с помощью а финной хроматографии [5], используются в качестве линкеров [6-8], адаптеров [9, ТО], праймеров [II-I5], зондов [16-18]. Использование линкеров, расщепляемых рестриктазами, обеспечивает возможность соединения фрагментов ДНК любого происхождения с ДНК-векторами. Наличие синтетических фрагментов ДНК открывает возможность систематического изучения зависимости между структурой и функцией регуляторных участков ДНК. Развивается изучение белково-нуклеиновых взаимодействий синтетических фрагментов ДНК промоторного района [19-26], участков инициации и терминации трансляции [27-30], последовательностей, узнаваемых ферментами рестрикции [31-33], lac-оператора [34-39]. Использование синтетических фрагментов ДНК для изучения белково-нуклеиновых взаимодействий особенно важно потому, что направленное, планомерное изменение структуры изучаемой ДНК возможно лишь с использованием органохими-ческих методов.

Создание методов химического синтеза олигонуклеотидов и их ферментативного сшивания в фрагменты ДНК связано с именем Х.Г.Кораны, который начал исследования в этой области еще в середине 50-х годов [40], а к 1970 году осуществил первый полный синтез искусственного гена [41].

Первым среди искусственных генов был синтезирован ген аланиновой тРНК дрожжей [41-4б]. Эта работа, выполненная Х.Г.Кораной с группой сотрудников, велась более 5 лет. С 1965 г. по 1967 г. Кораной были синтезированы два икозанукле-отида, соответствующие участку 21-50 дрожжевой аланиновой тРНК. Эти 20-звенные полинуклеотцды имели десятинуклеотвдные взаимокомплементарные последовательности и поэтому образовывали дуплекс, перекрываясь своими половинами:С-Т-А-С-С-С-Т-С-Т-С-А-а-А-С-О-С-А-А-а-С 1111111111 С-С-Т-С-С-С-Т-Т-А-в-С-А-Т-О-С-а-А-С-А-ОВ ходе синтеза этих икозануклеотидов стало ясно, что получить достаточно протяженные фрагменты ДНК, такие, как ген тРНК, чисто химическими методами вряд ли удастся. В 1967 году три группы исследователей сообщили о существовании фермента ДНК-лигазы (полинуклеотидлигазы), осуществляющего восстановление межнуклеотидных связей в нативных ДНК [47-49]. Первой областью применения ДНК-лигазы стали исследования Кораны по выяснению минимальной длины комплементарных олиго-нуклеотидов, сшиваемых лигазой. Оказалось, что сшиваемые олигонуклеотиды могут быть достаточно короткими (8-10-звен-ными), кроме того, было отмечено участие в лигазной реакции 4-звенного олигонуклеотида• Таким образом, открытие ДНК-лигазы и первые опыты по ее применению показали, что этот фермент позволяет получать длинные цепи ДНК из коротких химически синтезированных олигонуклеотидов, объединенных в комплементарные комплексы.

В ходе синтеза структурного гена аланиновой тРНК дрожжей Кораной была сформулирована трехэтапная стратегия получения двуспиральной ДНК. Первый этап представляет собой химический синтез олигодезоксирибонуклеотидов, соответствующих обеим целевым нитям. Олигонуклеотиды должны содержать свободные концевые 3'- и б'-гвдроксильные группы и представлять в сумме двунитевой фрагмент ДНК. Фрагменты, принадлежащие противоположным нитям, должны перекрываться 4-6 нуклеотида-ми. Второй этап заключается в фосфоршшровании б'-гидроксиль-ных групп олигонуклеотидов с помощью [ У-^Р]АТР и полинуклеотидкиназы. В результате такого фосфорилирования олигонук/ я?леотиды превращаются в 5 - Р-меченные соединения, что значительно облегчает анализ продуктов сшивки. На третьем этапе проводят сшивание с помощью ДНК-лигазы двух или большего числа олигонуклеотидов.' Для этого короткие фрагменты ДНК с перекрывающимися комплементарными последовательностями смешиваются при определенной ионной силе и температуре и образуется двухцепочечный комплекс. Результатом ковалентного соединениярасположенных рядом фрагментов с помощью ДНК^лигазы является непрерывный дуплекс.

Перед синтезом структурного гена аланиновой тРНК весь 77-звенный дуплекс, соответствующий последовательности нук-леотидов в молекуле тШК, был разбит на 3 части: А, В и С (или С')»I 4А 5 ТССТаСАСОАОТССССААТС3' кссксстъстскъъос- нуклеотиды 1-209"11-1В 5' —вААСС йбАСАСТСТССС АТССТААСг- НуКЛвОТИДЫ3' -ТТАСЮТТОСССТСТОАОАОСОТАСОАТТСССТСО- 21-45IГ (I II5 7 810 12 14С 5' -ааАОС(Ю<ХЗТАССОАСТАСаСОССАСАО<ЗССС3' -С<КЮАТ(НК!ТвА1<К!<КГСОТСТССССа нуклеотиды 4Ь-?7ц иII 13 15В С'-части фрагменты 12 и 10 содержали соответственно по 12 и 8 нуклеотидов, а не по 10, как в С-части.

Дуплекс А был получен одновременным сшиванием фосфори-' лированных олигонуклеотидов 2, 3 и 4 с нефосфорадированным олигонуклеотидом I. Получение дуплекса В проводилось в два этапа: сначала были сшиты олигонуклеотидн 6, 7, 8, 9, а затем к ним пришит олигонуклеотид 5, При синтезе дуплекса С пришлось столкнуться с наибольшими трудностями. Были исследованы различные варианты сшивок и наиболее эффективным оказался следующий путь: сначала производился отжиг олигонуклеотидов 14 и 15, затем прибавлялись олигонуклеотиды II, 12, 13 и производилась сшивка; олигонуклеотвд 10 прибавлялся во все последующие реакции, в которых участвовал дуплекс В,На заключительном этапе производилась оборка полного гена дрожжевой тИЖА1а. Для этого сшивались дуплексы А и В, и затем к комплексу АВ пришивался дуплекс С. Аналогично, сначала получали комплекс ВС, который затем сшивался с дуплексом А.

Надежность разработанного Х.Г.Кораной химико-ферментативного пути синтеза двухцепочечных фрагментов ДНК особенно ярко была продемонстрирована синтезом 207-звенного гена тиро-зиновой супрессорной тШК [50-61]. Кроме структурного гена предшественника тРНК (126 пар оснований) синтезированный 207-звенный дуплекс включал промоторный участок (51 п.о.) и сигнал для процессинга первичного транскрипта гена в функциональную тРНК (25 п.о.). Поскольку клонирование полного гена тРНК предполагалось без применения каких-либо линкеров, 207-звенный дуплекс был снабжен "липкими" концами, представляющими собой сайты рестриктазы ЕсоШ. Сборка гена проводилась из предварительно полученных дуплексов Р^ю» 1У, Т.

Синтезированный химико-ферментативным путем ген тирози-новой супрессорной тРНК был встроен по EcoRi сайту в фаговый вектор, являющийся производным фага Л и имеющий две ам-бер-мутации Аат32 и Baml. После трансакции таким фагом E.coli наблюдали супрессию амбермутаций (образование жизнеспособных фаговых частиц) • Рекомбинантная ДНК с геном тРНК была получена также на базе шгазмиды coiEi, в этом случае наблюдали супрессию бактериальных амбер-мутаций [63].

Эти данные свидетельствуют о том, что синтезированный 207-звенный дуплекс обладает функциональной активностью, и процессинг предшественника тирозиновой супрессорной тРНК in vivo протекает полностью, с образованием зрелой супрессорной тРНК9^г.

В 1975 году Кёстером и сотрудниками был впервые осуществлен синтез полинуклеотидной последовательности, кодирующей последовательность аминокислот в полипептидной цепи. Этот так называемый "миниген" представлял собой структурный ген пептидного гормона ангиотензина П [65-67]. В отличие от Кораны, который синтезировал гены тРНК, зная первичную структуру самих молекул РНК, Кёстер осуществлял синтез гена, исходя из аминокислотной последовательности ангиотензина П. 33-звен-ный дуплекс был получен путем лига з но го сшивания семи олиго-нуклеотидов, синтезированных фосфодиэфирным методом. Кроме кодонов для 8 аминокислот дуплекс содержал инициирующий ко-дон ATG и два терминирующих кодона, один из которых был локализован перед структурным геном (что по замыслу авторов должно было обеспечивать эффективное начало трансляции).—реконструированный ген-г—Í4—11-5-. I-6-, г—7—iб' (+) ta|aatggatcgcgtttatattcatcccttttaa; з' 3' (-) atttacctagcgcaaatataagtagggaaaatt: 5'•—■—3-• «-2-11-1Step ¡ЗвЛкер Arg Val Туг Не His Pro Pbe StopРабота по клонированию такого дуплекса [68] не получила развития, видимо, из-за неудачного выбора вектора для встраивания в него синтетического гена (использовались октануклео-тидные линкеры, содержащие сайт рестриктазы ecori )• Однако, в дальнейшем, в 1979 году авторами была предпринята небольшая реконструкция гена, который был синтезирован в виде 31-звенного дуплекса (отсутствовали две А*Т-пары стоп-кодона перед инициирующим atg -кодоном). После клонирования такого гена по Peti -сайту плазмиды pBR322 с использованием линкеров, содержащих сайт этой эндонуклеазн можно ожидать экспрессии гена ангиотензина под контролем промотора гена J-лактамазы в составе химерного белка ^¿-лактамаза-ангиотензин [69-71].

Синтезированный в 1977 году ген гормона соматостатина [72] был вторым искусственным геном полипептида, полученным химико-ферментативным путем; однако создание этого гена и его клонирование в векторе, обеспечивающем экспрессию закодированной в гене информации по существу явились первой весьма убедительной и наглядной демонстрацией возможностей генетической инженерии. Выполненное исследование имело принципиальное значение прежде всего потому, что впервые удалось заставить бактериальную клетку вырабатывать пептид высших организмов, кроме того, осуществление экспрессии синтетического гена соматостатина подтвердило правильность планирования синтеза и всего исследования в целом. Эта работа определила дальнейший фронт работ в области синтеза генов полипептидов, обладающих физиологической активностью, и создания продуцентов пептидов и белков. Создание системы, обеспечивающей экспрессию гена соматостатина,и избрание ее в качестве модельной было обусловлено известной аминокислотной последовательностью и малыми размерами соматостатина, наличием чувствительных биологических и иммунохимических методов анализа, а также практическим интересом к этому гормону-тетраде-капептиду, который регулирует секрецию ряда гормонов, в томчисле инсулина, глюкагона, гормона роста.

Восемь олигонуклеотидов длиной от II до 16 звеньев, составляющие двухцепочечный структурный ген соматостатина, были синтезированы фосфотриэфирннм методом [73].Кодоны, соответствующие каждой из 14 аминокислот, были выбраны, исходя из первичной структуры пептидного гормона с учетом частоты встречаемости кодонов в геноме фага HS2. Двухцеп очечный по-линуклеотид имел на 5'-конце кодирующей цепи ко дон метионина (для обеспечения направленного расщепления полипептида в этой точке после трансляции) и был снабжен "липкими" концами, соответствующими сайтам рестриктаз EcoBi и ВатКГ.Start АЛаСЯу Cysly sAsnPhePheTrpLy sThrPheThrS erCy sSfccpStcpBanHI«-a->.-в-. -с-, -d5' aattcatggctggttgtaagaacticittiggaagaoiticacitcgtgttgatag3' vgtaccgaccaâca^ttg^^bxfil "-e-' 1-p-' '-g-' '-h-1Синтетический ген соматостатина был клонирован в двух специально сконструированных плазмидных векторах, имеющих необходимые для экспрессии генов элементы. На-первом этапе на основе плазмиды pBR322 была получена плазмида рвндо, имеющая ре гулят орную часть iac-оперона и кодоны 10 аминокислот J-галактозидазы; затем в плазмиде pBHIO был уничтожен EcoRl-сайт, наиболее удаленный от BamHi-сайга, и в полученную плаз-миду рВН20 был встроен синтетический структурный ген соматостатина. При конструировании плазмиды pSomlI-З, несущей 4,4 Мд фрагмент iac-оперона и искусственный ген соматостатина, Pstl-EcoRi фрагмент плазмиды pSoml был заменен на Psti-EcoRi фрагмент плазмиды pBR322 и в полученную плазмиду pSomii был интегрщюван 4,4 Мд lac-фрагмент.

ЕсоВ!ВятйН!НаеШ 203 д.о, НаеШ фрагмент ДНК я рХасЕсоН1, доотройка выступающих концов ДНК-полимеразой ЕсоВ! ЕсоВ!ДНК-лигазасинтетический ген соматостатинаЕсоВ! Бот ВшвН!ЕсоВ!защита сайта, лежащего в районе гена ■¿©ъ ШК-полимеразой, частичный Ее оН1—гидролиз, удаление выступающих концов нуклеазой сшивка встыкВатН!меньший фрагмент рш$22ЕсоВ!ЕсоВ!ЕсоВ! ДНК-лигазаЕсоВ! 1аср ЕсоВ!I—;---1ЕсоВ!4,4 Щ)Полученные таким образом две рекомбинантные плазмиды обусловливали в одном случае ( pSomll-з) экспрессию искусственного гена соматостатина в виде С-концевой 14-аминокислот-ной последовательности химерного белка, основная часть которого - 1006 аминокислотных остатков J, -галактозидазы; в другом случае ( pSomi ) - также в виде химерного полипептвда, но J> -галактозидазная часть в нем представлена всего десятью аминокислотными остатками. В обоих случаях экспрессия обеспечивается регуляторными участками lac -оперона.

Клеточные лизаты штаммов-продуцентов соматостатина подвергались обработке бромцианом и исследованию с помощью ра-диоиммуноанализа. Наличие соматостатина было показано только в случае клонов, содержащих плазмиду pSomii-з, где сомато-статин синтезируется в составе 1021-аминокислотного химерного белка; во всех случаях, когда фрагмент структурного гена -галактозидазы и ген соматостатина в сумме кодировали 24-звенный полипептид, радиоиммуноанализ показал отсутствие соматостатина, что авторы объясняют протеолитической деградацией короткого 24-звенного пептида бактериальными пептцдаза-ми сразу после его образования. Отсутствие соматостатина было также показано в штаммах, несущих плазмвду типа pSomii-з, но с противоположной ориентацией EcoRi-iac -фрагмента.

Биологическое тестирование показало, что экстракт штамма-продуцента соматостатина ингибирует секрецию гормона роста из клеток гипофиза крысы.

Дальнейшим развитием исследований Итакуры и сотр. по созданию искусственных генов белков стал химико-ферментативный синтез и клонирование структурных генов А- и В-цепей инсулина человека [74-75]. В отличие от природного гена инсулина, продуктом трансляции которого является единый полипептид, состоящий из А- и B-цепей, соединенных коротким С-пептидом, и сигнального S-пептида, в работе Итакуры гены А- и B-цепей инсулина были синтезированы и клонированы отдельно. Oöa гена вводились в область гена ^-галактозидазн и после их экспрессии в е.coli в составе химерных белков ^-галак-тозидаза-А-цепь и ^-галактозидаза-В-цепь бромциановым расщеплением были получены А- и B-цепи инсулина человека. После их дополнительной очистки цепи химическим путем объединялись в молекулу зрелого инсулина.

Олигонуклеотидные блоки (10-15 звеньев), составляющие гены обеих цепей инсулина, были синтезированы блочным фосфо-триэфирным методом. Ген А-цепи, состоящий из 12 олигонуклео-тидных блоков, представляет собой 77-звенный дуплекс. Его центральная часть кодирует триплеты 21 аминокислоты А-цепи инсулина, в левой части гена находится инициирующий кодон ATG и сайт рестриктазы EcoRi, справа последовательность аминокислотных кодонов ограничена двумя стоп-кодонами и сайтом BeusHI.

5' aattcatgggcatcgttgmcagt(folgcacttctatctgc-3' gtacccgtagcaacttgtcacaacgtgaagatagacgv VEcoRIВашНХ-tctctttaccagcttgagaacqäctgtaactaatag 3'-agagaaatggtcgaa^tcttgatgagattgattätggtag 5'Структурный ген А-цепи инсулина человекаГен B-цепи инсулина был получен поэтапным лигированием 18 олигонуклеотидов и содержал кроме аналогичных сайтов покраям сайт рестриктазы Hincan в середине дуплекса, что обеспечило возможность клонирования гена В-цепи по частям.

В принципе, для получения двухцепочечного полинуклеоти-да необязательно химически синтезировать обе цепи - достаточно одной цепи и праймера, после чего вторая цепь может быть достроена с помощыо ДНК-полимеразы. Наранг и сотр. предложили использовать такой подход для получения гена А-цепи инсулина [76-79]. Было синтезировано 8 олигонуклеотидов длиной от 10 до 17 звеньев; два из них служат "подложками", на которых с помощью лигазы сшиваются между собой более длинные олигонуклеотиды второй цепи:(А)5' gccaitgtggagcagtgctgcaccagcatctgctccctctacc ggagaactac 3' tcgtcacgácgt tagacgagggagatggttgacctcttgatgacgttc(В)Полученные таким образом частично комплементарные 43- и 35-звенные полинуклеотиды, перекрывающиеся на протяжении 15 нуклеотвдов, достраиваются ДНК-полимеразой до полного 63-членного дуплекса, кодирующего A-цепь инсулина.

Позже этими же авторами была синтезирована ДНК, кодирующая ВС-цепь инсулина человека. Дуплекс, полученный лигиро-ванием 32 синтетических олигонуклеотидов, сшивался с геном A-цепи с образованием 258-звенного двухцепочечного гена человеческого проинсулина [80]. При проектировании нуклеотид-ной последовательности синтетического гена были использованы данные о первичной структуре молекулы проинсулина [81]. Ген проинсулина, фланкированный сайтами ecori и BamHi и имеющий в своей структуре старт трансляции atg и стоп-сигнал tga, был клонирован в плазмидном векторе [82 ]. В последующей работе [83] была показана экспрессия синтетического гена про инсулина человека в дрожжевой клетке после его присоединения к промотору и кодирующей последовательности лидерного белка гена саы (дрожжевой галактокиназн).

Советскими исследователями химико-ферментативный синтез полинуклеотидннх последовательностей, кодирующих функционально значимые пептиды, впервые был осуществлен на примере структурных генов брадикинина [84-86] и лейцин-энкефалина [87, 88]. Четыре тридекануклеотвда, составляющие структурный ген одного из олигопептидов мозга, пентапептида-анальгетика Ьеи-энкефалина, были синтезированы диэфирным методом. Конечный 26-нуклеотидный дуплекс содержал кроме кодонов для 5 аминокислот пептида инициирующий кодон Атв и один терминирующий кодон, кроме того, дуплекс был снабжен "липкими" концами - сайтами рестриктаз Бсонг и ВашН1, необходимыми для его клонирования.I П ВашН1I л |5 ААТТСАТОТАТОбТОбСТТТСТбТАА 3 3' втасатассасс блаабасаттстаб 5'ЕсоЮС 1У ШПоследовательность оснований в структурном гене лейцин-энкефалина была составлена из кодонов, выбранных произвольно из числа преимущественно встречающихся в генах белков Е.сои и ее бактериофагов с учетом следующих моментов. Во-первых, последовательность подбирали таким образом, чтобы исключить нежелательное внутри- и межмолекулярное спаривание четырех составляющих ген тридекануклеотидных сегментов. Во-вторых, старались избежать наличия протяженных участков, богатых е.с -парами, за которыми следуют А*Т-богатые участки, так какэто может привести к терминации транскрипции [89].

В качестве клонирующего вектора использовалась рекомби-нантная плазмида, полученная интегрированием Есош -фрагмента ДНК харонового фага сь4А [90 ] с ДНК плазмиды ршзгг обработанной той же рестриктазой. Однако, получение конечной плазмиды, несущей ЕсоЫ -фрагмент фаговой ДНК и синтетический структурный ген лейцин-энкефалина, было осуществлено од-ноэтапной лигазной сшивкой, в которой участвовали ЕсоМ -гидролизат фаговой ДНК, Есога-вшага: -гидролизат плазмиды рВН322 и синтетический структурный ген лейцин-энкефалина.

Экстракты клеток, несущих плазмиду с правильной ориентацией 1аофрагмента относительно структурного гена лейцин-энкефалина подверглись радиоиммунологическому анализу (для высвобождения лейцин-энкефалина из состава химерного белка ^-галактозидаза-лейцин-энкефалин проводилось бромциановое расщепление) • Кроме наличия лейцин-энкефалина в бактериальных экстрактах было показано, что индукция 1ас-оперона изо-пропил-^, в -тиогалактозидом (ШИТ) увеличивает экспрессию гена лейцин-энкефалина •Синтетический структурный ген тканевого пептидного гормона брадикинина был получен лигированием 8 синтетических олигонуклеотидов. Олигонуклеотидные сегменты длиной от 9 до 12 звеньев синтезировались триэфирным методом.

Энзиматический синтез структурного гена брадикинина проводился в три стадии: сначала лигировали две пары олиго-нуклеотцдов (I + Ш) и (П + 17), составляющие левую часть гена, затем две пары (У + УП) и (УТ + УШ) правой части гена и, наконец, обе половины гена сшивали между собой. Вектором для синтетического гена служила гибридная плазмида рЫ, полученная путем рекомбинации in vitro плазмиды pBR322 с фагом Яр1ас5. При расщеплении ДНК этого фага рестриктазой EcoRI образуется 6 фрагментов, один из которых (величиной 4,4 ОДд) содержит промоторно-операторный участок лактозного оперона Е. coli и большую часть структурного гена lacz, кодирующего 1005 (из 1021) аминокислотных остатков J -галактозидазы [91, 92]. При правильной ориентации lac-фрагмента относительно клонируемого структурного гена брадикинина получалась плазмида, обеспечивающая экспрессию этого гена в виде 9-амино-кислотной С-концевой части гибридного белка J> -галактозида-за-брадикинин, которая освобождалась после обработки белка бромцианом.

В 1980 г. В.П.Кумаревым с сотр. был получен бактериальный штамм - продуцент гормона ангиотензина I. Двухцепочечный 48-звенный полинуклеотид, кодирующий последовательность аминокислот этого гормона, был синтезирован химико-ферментативным методом [93].lieft Asp Arg Val Туг Пе His Pro BbeHüsLeuStcp■—А-11-Б —-> i-В---—A-'5' tgaaticatggaccgtgtttacatccatccittccajtigtgaattga3' acttaagtacctggcäcää^^gtaggaääggtäaacacttaagt'-А-1 1-Г-"-Д-"-"Е-"—А-—1Олигонуклеотвдные блоки А-Е были синтезированы модифицированным триэфирным методом из соответствующих динуклеоти-дов [94]. Очищенные и фосфорилированные по 51-концу олиго-нуклеотцды Б-Е соединяли в двухцепочечный полинуклеотид с помощью ДНК-лигазы фага Т4, правильность их соединения была подтверждена анализом нуклеотидной последовательности по Максаму-Гилберту. К очищенному дуплексу Б-Е с помощью ДНК-лигазы присоединялся октануклеотид А и после обработки продукта этой реакции рестриктазой ecori двуспиральный полинуклеотид с выступающими концами встраивался в плазмццный и фаговый векторы.

Так как уровень экспрессии генов, клонируемых в составе фаговых векторов, выше, чем при клонировании этих генов в составе плазмидных векторов, ген ангиотензина I был встроен в фаговый вектор Л piac5-i [91].

Радиоиммунологически было показано, что в клетках е.coli, инфицированных рекомбинантным фагом, содержание ангиотензина I в 10 раз выше, чем в случае плазмидного вектоpa. Это связано с тем, что в клетках е.coli в середине логарифмической фазы содержится 20-30 копий плазмиды типа ColEi, в то же время клетки, инфицированные фагом, содержат до 100 копий его ДНК. Тестирование биологической активности ангиотензина бактериального происхождения на лабораторных крысах показало ярко выраженный вазопрессорный эффект [96].

Группой исследователей [99] были успешно синтезированы 22 олигонуклеотида, составляющие вместе структурный ген 43-аминокислотного гастринингибирующего пептида, который участвует в регуляции секреции желудочного сока. Для дальнейшего клонирования и обеспечения экспрессии этого гена крайние пары олигонуклеотидов содержат инициирующий кодон, два терминирующих кодона и сайты рестриктаз Ecohi и вшпю:. Все оли-гонуклеотиды были синтезированы твердофазным фосфотриэфирным методом, с применением целлюлозы в качестве носителя.I А Л Л5 aattcaigtacgcagaaggtacttttatcagtgattacagtatcgcaatg-3' gtacatgcgtcttcc^gaaaatagtcagtaatgtcaiagcgttac5' -gacaaaatccgtcagcaggactttgttActggctgctgggacagc3' -ctgttttagggagtcgtcctgaaacaattgaccgajjgaccgtgtcg5' -AGAAAGGTAAGAAAAGTGAGTGGAAAGATAACATCAGTGAGTAATAG 3' -TCTTTCCATTCTTTTCACTGACCTTTGTATTGTAGTGAGTCATTATCCTAGV V V VГруппой японских авторов [100] химико-ферментативным путем был получен структурный ген «/-неоэцдорфина.

МеЬ Туг (ЯуГЬеЬшАхзЬувТуг 1^ЬузЗ{С5зЭгрВап1Н1■—Р1-,,-Р2-,,-РЗ-,,Р4,5' ААТТСАТвТАТввССОТТТССТТСОТМвТАТССОААЛТААТАб3' gtacataccgccaaaggaagcattcataggcttcattatcctag ЕсоКЕ-F8-"-F7-1 '-F6-"-F5-1Ген неоэндорфина был клонирован в е.coli аналогично гену соматостатина [72 ] и экспрессировался в виде Ю-амино-кислотной С-концевой части гибридного белка ^-галактозидаза-Л -неоэндорфин. Продукт экспрессии синтетического гена обладал биологической активностью. В более поздней работе [iOl] ген неоэндорфина был клонирован вместе с геном щелочной фос-фатазы E.coli и экспрессировался в составе гибридного белка, представляющего собой 355-аминокислотный фрагмент фосфа-тазы, соединенный через остаток метионина с Ю-аминокислот-ной последовательностью эндорфина.

В работе [102] получен и клонирован синтетический ген 27-аминокислотного желудочно-кишечного гормона секретина. Ген, фланкированный инициирующим кодоном atg, двумя терминирующими кодонами tga и tag и сайтами Psti, был клонирован в плазмиде pBR322 и экспрессировался в составе гибридного белка JI -лактамаза-секретин под контролем промотора J3-лактамазы. Показана биологическая активность секретина бактериального происхождения.

В другой работе [ЮЗ] лигированием 23 синтетических олигонуклеотидов был получен структурный ген 53-аминокислот-ного ^tf-урогастрона. Этот ген был создан для клонирования и экспрессии в виде гибридного продукта с частью гена trpEE.coli в ранее сконструированном векторе для экспрессии [104]. Ген спроектирован таким образом, что перед первой аминокислотой ^-урогастрона находятся два остатка лизина, расщепляемые трипсином. Применение этого фермента для выделения урогастрона из гибридного белка обусловлено устойчивостью гормона к действию трипсина. Использование общепринятого подхода, основанного на расщеплении остатка метионина бромцианом, в этом случае невозможно, поскольку в молекуле урогастрона в 21 положении имеется остаток метионина. В работе показана экспрессия гена и биологическая активность ^-урогастрона.

Среди всех работ по созданию генов химико-ферментативным путем, выполненных до настоящего времени, рекордным результатом является синтез структурного гена человеческого лейкоцитарного интерферона оЦ [105]. Синтез 67 олигонуклео— тидов, составляющих этот ген, был осуществлен за то же время, которое понадобилось бы для выделения этого гена из природных источников. Высокая скорость получения олигонуклео-тидных блоков была обусловлена применением твердофазного фосфотриэфирного метода их синтеза [106, 107]. Последовательность кодонов для 166 аминокислотных остатков лейкоцитарного интерферона oiji tfs - <Lz ) была выведена из данных о первичной структуре клонированной кДНК человеческого лейкоцитарного интерферона [108]. Кроме 166 аминокислотных кодонов 514-звенный дуплекс имеет инициирующий кодон формилмети-онина atg, сигнал терминации трансляции ТАА и сайты рестри-ктаз ВалШ и Sali.I 2 3 4. 163 164 165 166 ÊamHI Met Oys Asp leu Pro. • • Arg Arg Lys Glü Stop Raij5' GATCC-ATG-TGT-GAT-CTG-CCG. AGG-CGG-AAG-GAA-TAA-G3' G-TAC-ACA-CTA-GAC-GGC ♦ • • TCC-GCC-TTC-CTT-ATT-CAGCTСинтетический ген ifn-oÍj клонировался в векторе, полученном из плазмиды pATI53 [l09] заменой ее меньшего EcoRi-ВапШ -фрагмента на 95-нуклеотвдный фрагмент промоторной области лактозного оперона е.coli, В результате встраивания в такую плазмиду гена интерферона в районе сайта BamHi обраS - D BaraHI MetCysзуется последовательность 5' -aggaaacaggatccatgtgt- 3', и структурный ген интерферона оказывается под контролем лактозного промотора в такой ориентации, что atg-кодон вместе с последовательностью Шайна-Дальгарно [IIO, III] образует сайт связывания рибосомы. Благодаря созданию такой системы появляется возможность для успешной транскрипции и трансляции гена интерферона.

Позже в работе [112] была показана экспрессия гена интерферона ©¿J В E.coli, а также в Methylophilus methylotro-pus.

Кроме того, синтетический ген интерферона клонировался в специально сконструированном промоторном векторе, полученном клонированием в плазмиде рАТ153 82-звенного синтетического дуплекса, включающего промотор, оператор и последовательность Шайна-Дальгарно триптофанового оперона е.coli [ИЗ]. В результате клонирования гена интерферона в таком векторе перед геном образуется эффективный старт трансляции S-D Met5 -aaagggtatcgacgatgtctcat- 3' [lI4]. В работе было показано, что экспрессия гена, клонированного в trp промоторномвекторе, значительно выше, чем гена, находящегося под контролем iacüV5 регуляторных участков.

В trp промоторном векторе был также клонирован с экспрессией синтетический ген человеческого интерферона ©¿g» полученный той же группой исследователей аналогично гену интерферона olj [115]. 511-звенный двухцепочечный ген, кодирующий 165 аминокислотных остатков интерферона, включает кодон формилметионина atg, стоп-кодон таа и сайты рестриктаз BamHI и Sali.

12 3. 165BamHI Met Qys Aap Lau. Glu&cp Sali 5' GATCCATGTGTGATCTG. GAATAAG 3'3' GTACACACTAGAC. • • CTTATTCAGCT 5'Синтетический ген интерферона Л 3 был клонирован также в векторе с lacUV5 промотором.

В 1983 г. группой японских исследователей был осуществлен химико-ферментативный синтез 454-звенного гена человеческого иммунного интерферона X. Ген был клонирован с экспрессией в плазмидном векторе о iacUV5 промотором. Было показано, что интерферон бактериального происхождения обладает противовирусной активностью [116].

В отличие от работы [75], в которой гены А- и В-цепей инсулина синтезировались и клонировались отдельно, советскими авторами был осуществлен химико-ферментативный синтез и клонирование гена проинсулина человека [117]. Химический синтез более сорока индивидуальных дезоксирибоолигонуклеоти-дов, использованных в этой работе, проводился с помощью разработанного авторами N -метилимидазолидного метода [П8]. Ген проинсулина был синтезирован в двух вариантах:

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Власов, Виктор Петрович

выводы

1. Синтезировано два варианта структурного гена пептида сна: с EcoRI-BamHI и Bamül-Sall "липкими" концами.

2. На основе плазмиды рВН322 и фрагмента lac-оперона получен универсальный вектор для клонирования с экспрессией (в виде гибридных белков) различных структурных генов с EcoRi, EcoRI-BamHI и EcoEi-Saii концами. Проведено клонирование структурного гена пептида сна в таком векторе и показана его экспрессия в виде С-концевой части гибридного белка jS-галактозидаза-пептид сна.

3. Осуществлен ферментативный синтез функционально активного lac-оператора и последовательности Шайна-Дальгарно. Проведено клонирование этих структур в плазмиде с неприродным синтетическим промотором и получен вектор с полностью синтетическими регулягорными участками.

4. Проведено клонирование в таком векторе структурного гена пептида сна с BamHi-Saii концами.

Впервые получен полностью синтетический искусственный ген, который наряду со структурной (кодирующей) частью содержит неприродный промотор, оператор, а также участок связывания рибосомы и способен к прямой экспрессии в бактериальной клетке, т.е. является функционально активным.

Показано, что в клетках е.coli, несущих плазмиду с полностью синтетическим геном, происходит биосинтез непосредственно пептида сна.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Власов, Виктор Петрович, Москва

1. Wu R., Bahl С.P., Narang S.A. Synthetic oligodeoxynucleo-tides for analyses of ША structure and function. -In: Progress Nucl. Acids Research and Molecular Biology, Acad. Press, New York, 1978, v.21, p.101-141.

2. Смирнов В.Д., Метелев В.Г*, Шабарова 3;Ai, Прокофьев M.Ai Синтетические олигонуклеотиды как инструмент исследования природных структур и процессов. Биоорган, химия, 1976, т.2, № 3, с.293-314.

3. Прокофьев М.А., Шабарова З.А. Производные нуклеотидов и олигонуклеотидов инструмент исследования в молекулярной биологии. - Мол. биол., 1978, т;12, вып.2, с.245-259;

4. Szostak J.W., Stiles J.I., Bahl С.Р», Wu R. Specific binding of a synthetic oligodeoxyribonucleotide to yeast cytochrome с mRHA. nature, T977, v.265, H 5589, p.61-63.

5. Joyce C.ST., Grindley N.D.F. Construction of a plasmid that overproduces the large proteolytic fragment (KLenow fragment) of ША polymerase I of Escherichia coli. Proc. ITatl. Acad. Sci. USA, 1983, v.80, H 7, p.1830-1834.

6. Bahl C.P., Wu R., Brosseau R., Sood A.R., Hsiung H.M., Narang S.A. Chemical synthesis of versatile adaptors for mo* lecular cloning. Biochem. and Biophys. Res. Commons, 1978, H 3, p.695-703.

7. Добрынин В.Н., Чернов Б.К., Колосов М.Н. Новый метод твердофазного синтеза олигодезоксинуклеотидов фосфотриэфирннм путем. Биоорган.химия,1980, т.6, № I, с.138-140.

8. Merritt S.C., Tschudi С., Königsberg W.H., Richarde P.P.

9. Reverse transcription of trypanosome variable antygen mRNAs initiated by a specific oligonucleotide primer. -Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1983, v.80, N 6, p.1536-1540.

10. Vieira J., Messing J. The pUC plasmids, an M13mp7 derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers. - Gene, 1982, v. 19, IT 3, p.259-268.

11. Goelet P., Lomonossoff G.P., Butler P.J.G., Akam M.E., Gait M.J., Earn J. Nucleotide sequence of tobacco mosaic virus RITA. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1982., v.79,1. N 19, p.5818-5822.

12. Dobrynin V.N., Korobko V. G., Severtsova I.V., Bystrov N.S., Chuvpilo S.A., Kolosov M.N. Synthesis of a model promoter for gene expression in Escherichia coli. Nucleic Acids Res., 1980, Symp. Series, N 7, p.365-376.

13. Коробко В.Г., Добрынин B.H., Чзпвпило С.А., Северцова И.В., Колосов М.Н. Промоторные векторы с синтетическим участком узнавания рибосомы. Биоорганич.химия, 1981, т.7, Л 12,с.1877-1880.

14. Коробко В.Г., Добрынин В.Н., Северцова И.В., Быстров Н.С.,

15. Колосов М.Н. Синтез промоторных линкеров для экспрессии генов в E.coli. Биоорган, химия, 1980, т.6, № II, с.1740-1742;

16. Miyada C.G., Soberon I., Itakura К., Wilcox G. The use of synthetic oligodeoxyribonucleotides to produce specific deletions in the araBAD promoter of Escherichia coli B/r.Gene, 1982, v.17, N 2, p.167-177.

17. Haseth F.L., Goldman R.A., Cech C.L., Caruthers M.H. Che» mical synthesis and biochemical reactivity of bacteriophage lambda PR promoter. Nucleic Acids Res., 1983, v.11,1. N 3, P. 773-787.

18. Rossi J.J., Soberon X., Marumoto Y., McMahon J., Itakura K. Biological expression of an Escherichia coli consensus sequence promoter and some mutant derivatives. -Proc. BTatl. Acad. Sei. USA, 1983, v.80, H 11, p.3203-3207.

19. Rommens J., MacKriight D., Pomeroy-Cloney L., Jay E. Gene expression: chemical synthesis and molecular cloning of a bacteriophage T5(T5P25) early promoter. Nucleic Acids Res., 1983, v.11, N 17, p.5921-5940.

20. Thomas D.Y., Dubuc G., Narang S. Escherichia coli plasmid vectors containing synthetic translational initiation sequences and ribosome binding sites fused with the lacZ gene. Gene, 1982, v.19, N 2, p.211-219.

21. Jay E., Seth А.К., Rommens J., Sood A., Jay G. Gene expressions cnemical synthesis of E.coli ribosome binding sites and their use in directing the expression of mammalian proteins in bacteria. Nucleic Acids Res., 1982, v.10,1. N 20, p6319-6329.

22. Drahos D., Galluppi G.R., Caruthers M., Szybalski W. Synthesis of the nutL ША segments and analysis of antitermi-nation and termination functions in coliphage lambda. -Gene, 1982, v.18, N 3, p.343-354.

23. Greene P. J., PoonianM.S., Nussbaum A.L., Tobias L., Gar-fin D.E., Boyer H.W., Goodman H.ffi. Restriction and modification of a self-complementary octanucleotide containing the EcoRI substrate. J. Mol. Biol., 1975, v.99, N 2,p.237-261.

24. Goeddel D.V., Jansura D.G., Caruthers M.H. Studies of gene control regions. I. Chemical synthesis of lactose dperator deoxyribonucleic acid segments. Biochemistry, 1977, v.16, N 9, p#1765-1772.

25. Gellert M. Formation of covalent circles of lambda DNA by E.coli extracts. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1967, v.57,1. N 1, p.148-155.

26. Olivera B.M., Lehman I.R. Linkage of polynucleotides through phosphodiester bonds by an enzyme from Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1967, v.57, N 5,p.1426-1433.

27. Gefter M.L., Becker A., Hurwitz J. The enzymatic repair of DNA. I. Formation of circular A DNA. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1967, v.58, N 1, p.240-247.

28. Sekiya T., Besmer P., Takeya T., Khorana H.G. 7. Enzymatic joining of the chemically synthesized segments to form a DNA duplex corresponding to the nucleotide sequence 1-26. -J. Biol. Chem., 1976, v.251, N 3, p.634-641.

29. Loewen P.C., Miller R.C., Panet A., Sekiya T., Khorana H.G. 8. Enzymatic joining of the chemically synthesized segments to form DNA duplexes corresponding to nucleotide sequences 23-60 and 23-66. J. Biol. Chem., 1976, v.251, N 3,p.642-650.

30. Panet A., Kleppe R., Kleppe K., Khorana H.G. 9. Enzymatic joining of chemically synthesized deoxyribopolynucleotide segments corresponding to nucleotide sequence 57-94. J. Biol. Chem., 1976, v.251, N 3, p.651-657.

31. Caruthers M.H., Kleppe R., Kleppe K., Khorana H.G. 10. Enzymatic joining of chemically synthesized segments to form the DNA duplex corresponding to the nucleotide sequence 86-126. J. Biol. Chem., 1976, v.251, N 3, p.658-666.

32. Sekiya T., Takeya T., Brown E.L., Belagaje R., Gontreras R., Fritz H.-J., Gait M.J., Lees R.G., Ryan M.J., Khorana H.G., Norris K.E. XVI. Enzymatic joining to form the total 207-base pair-long DNA. J. Biol. Chem., 1979, v.254, N 13,p. 5787-5801.

33. Khorana H.G. Total synthesis of a gene. Science, 1979, v.203, N 4381, p. 614-625.

34. Ryan M.J•, Brown E.L., Sekiya T., Küpper H«, Khorana H.G. Total synthesis of a tyrosine suppressor tRNA gene. XVTII. Biological activity and.transcription, in vitro, of the cloned gene. J. Biol. Chem., 1979, v.254, N 13, p. 5817-5826.

35. Harvey C.L., Olson K., de Czecala A., Nussbaum A.L. Construction of a double-stranded deozyribonucleotide sequence of 45 base pairs designed to code for S-peptide 2-14of bovin ribonuclease A. Nucleic Acids Res., 1975, v.2, N 11, p.2007-2020.

36. Köster H., Blöcker H., Prank R., Geussenhainer S., Kaiser W. Synthese eines Strukturgens für das Peptidhormon Angiotensin II, Teil 1. Zielsetzung und Synthesestrategie.-J. Liebigs Ann. Chem., 1978, N 6, s.839-853.

37. Marquardt 0., Köster H. Insertion of a chemically synthesized DNA into the plasmid pSF2124 and transformation of E.coli ^1776. Hoppe-Seyler*s Z. Physiol. Chem., 1978, bd. 359, heft 9, s.1116-1117.

38. Blöcker H., Kohli V., Köster H. Construction of a chemically synthesized structural gene, designed for insertion into pBR322. Hoppe-Seyler*s Z. Physiol. Chem., 1979, band 360, heft 8, s.1019-1020.

39. Ambler R.P., Scott G.K. Partial amino acid sequence of penicillinase coded by Escherichia coli plasmid R6K. -Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1978, v.75, N 8, p.3732-3736.

40. Sutcliffe J.G. Nucleotide sequence of the ampicillin resistance gene of Escherichia coli plasmid pSR322. -Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1978, v.75, N 8, p.3737-3741.

41. Itakura K., Hirose T., Crea R., Riggs A.D., Heyneker H.L., Bolivar F., Boyer H.W. Expression in Escherichia coli ofa chemically synthesized gene for the hormon somatostatin.-Science, 1977, v.198, N 4321, p.1056-1063.

42. Crea R., Krasziewski A., Hirose T., Itakura K. Chemicalsynthesis of genes for hunan insulin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1978, T.75, If 12, p.5765-5769.

43. Brosseau R., Scarpulla R., Sung W., Hsiung H.M., Narang S.A., Wu R. Synthesis of a human insulin gene J V* Enzymatic assembly, cloning and characterization of the human proinsulin DNA. Gene, 1982, v.17, N 3, p.279-289. .

44. Oyer P.E., Cho S., Peterson J.D., Steiner D.F. Studies on human proinsulin. J. Biol. Chem., 1971, .v.246, N 5,p. 1375-1386.

45. Scarpulla R.S., Narang S., Wu E. Use of a new retrieving adaptor in the cloning of a synthetic human insulin. A-chain gene. Anal. Bio chem., 1982, v.121, N2, p. 356-36 5.

46. Stepien P.P., Brousseau R., Wu R., Narang S., Thomas D.T. Synthesis of a human insulin gene. VI. Expression of the synthetic proinsulin gene in yeast. Gene, 1983, v.24, Nos 2/3, p.289-297.

47. Добрынин B.H., Коробко В.Г., Северцова И.В., Болдырева Е.Ф., Чернов Б.К., Колосов М.Н. Синтез структурного гена брадикинина. Биоорган, химия, 1979, т.5, № 5, с.776-778.

48. Городецкий С.И., Капелинская Т.В., Лисенков А.Ф;, Слюса-ренко А.Г., Дубинин Н.П. Клонирование и выражение химически синтезированного гена гормоновда брадикинина в бактериальной клетке. Докл. АН COOP, 1980, т.250, ft I,с.208-212.

49. Ефимов В.А., Чахмахчева О.Г. Синтез структурного гена лейцин-энкефалина. Биоорган, химия, 1979, т.5, № 2, с.305-307;

50. Свердлов Е.Д., Долганов Г.М., Монастырская Г.С., Ходко-ва E.M., Честухин А.В., Шемякин М.Ф. Клонирование и экспрессия синтетического гена лейцинэнкефалина в клетках E.coli, Биоорган, химия, 1979, т.5, ft 7, C.III2-III5.

51. Bertrand К., Кот L., Ьее F., FXatt Т., Squires С.Ь., Squires С., Yanofsky с. Hew features of the regulation of the tryptophan operon. Science, 1975, v. 189, N 4196', p.22-26.

52. Xtakura К., Katagirl N., Bahl С.P., Wigfrtaaan R.H., Nar-rang S.A. Improved triester approach for the synthesis of pentade cathymidyllc acid. Am. Chenu Бос., 1975« V.97, IT 25, p.7327-7332.

53. Polisky В., Bishop R.J., Gelfand D.H. A plamid cloning vehicle allowing regulated expression of eukaryotic UNA in bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1976, v.73, N 11, p.3900-3904.

54. Федоров ВЖ' К методике определения активности ренина в отдельных почечных клубочках и их фрагментах. Еюлл. экспер. биол. и мед., 1977, №11, с.633-635.

55. Doel M.T., Baton if., CookE.A., lewis H., Patel T., Carey N.H. The expression in E.coli of synthetic* repeating polymeric genes coding for poly (3>aspartyl-3>phenylala-nine) . Nucleic Acids Res., 1980, v.8, N 20, p.4575-4592.

56. Ohsuye E,, Nomura M., Tanaka 6., EUbota I., Nakazato H., Shinagawa H., Nakata A., Noguchi T. Expression of chemically synthesized ^-neo-endorphin gene fused! to E.coli alkaline phosphatase. Nucleic Acids "Res., 1983, v.11, N 5, p.1283-1294.

57. Mantei N., Schwarzstein K., Streuli IT., Panet Ss> Naga-ta S., Weisaaann C. The nucleotide sequence of & cloned human leukocyte interferon CERA. Gene, 1980, v.10,1. N 1, p.1-10.

58. Twigg A.J., Sherratt D. Trans-complementab 1 e copy-number mutants of plaanidi ColK. Nature, 1980, v.283, N15743, p. 216-218.

59. Shine J., Dalgarno L. Nucleotide sequence encoding the hybrid ribosome binding site. Proc. Natl. Acad. Sci.

60. USA, 1974, v.71, p.1342-1346.

61. Guarente L., Roberts T.M., Ptau&ne M. JL technique for expressing eukaryotic genes in bacteria. Science, 1980, v.209, N 232, p.1428-1430.

62. Tanaka S., Oshima T., Ohsuye K., Ono T., Mizono JL., Ue-no A., Nakazato E., Tsujimoto M.,; Higashi N., Noguchi T. Expression in Escherichia coli of chemically gene for the human immune interferon. Nucleic Acids Res., 1983, v.ll, N 6, p.l707-1723.

63. Овчинников Ю.А., Ефимов В.А., Чахмахчева О.Г. Химико-ферментативный синтез и клонирование гена проинсулина человека. Докл. АН СССР, 1983, т.270, № 3, с.743-747.

64. Sfiiiiov V.A., Reverdattto S.V., Cha&hmakhcheva O.Gr. New effective method for the synthesis of oligonucleotides via phosphotriester intermediates. Nucleic Acids Res., 1982, v.10, N 21, p.66*?5~6694.

65. Ullrich A., Shine J., Chirgwin J., Pictet R., Tischer В.* Rutter W.J., Goodman H.M. Hat insulin genes: construction of plaanids containing the coding sequences. Science, 1977, v.196, N 4296, p.1313-1319.

66. Villa-Komaroff L., Bfstratiadis A., Broome S., Lomedico P. Tizard R., Naber S.P., Chick W.L. and Gilbert W. A bacterial clone synthesizing pro insulin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1978, v.75, N 8, p.3727-3731.

67. Naber S., Villa-Komaroff b., Broome S.,. Rossini bar-uris V., Chick W. Biological activity of rat proinsulin synthesized by Escherichia coli. Gene, 1983, v.21, Nos 1 and. 2, p.95*404.

68. Shine J., Seeburg P.H., Martial J.A., Baxter J.B., Goodman H.M. Construction and analysis of recombinant ЛШ for human chorionic somatomammotropin. Nature, 1977, v.270, N 5637, p.494-499.

69. NodaM., Furutani Y., Takahashi H., Toyosato Ж., Hi rose Т.,- 13S 1.ayama S., Nakanidii S.,; Numa S. Cloning and sequence analysis of cDNA for bovine adrenal preproenkephalin. -Nature, 1982, v.295, N 5846i, p.202-206.

70. Seeburg P.B., Shine J., Martial J.A., Baxter J.D.,

71. Aviv H., Leder P. Purification of biologically active globin messenger KNA by chromatography on oligothymxdy-lic acid-cellulose. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1972, v.69, N 6,, p.l408-1412.

72. Bfstratiadis A., Kafatos P.C., Maxam A.M., Maniatis T. Enzymatic in vitro synthesis of globin genes. Cell, 1976, v.7, N 2, p.279-288.

73. Salser W.A. DNA sequencing techniques. Ann. Rev. Bio-chemi., 1974, v.43, p.945-955.

74. Proudfoot N.J. Sequence analysis of the 3' non-coding regions of rabbit and jS-globin. messenger RNAs. -J. Kol. Biol., 1976, v.107, N1 4, p.491-525.

75. Lomedico P.T., Saunders G.P. Preparation of pancreatic mRNA: cell-free translation of an insulin-immunoreaati-ve polypeptide. Nucleic Acids Res., 1976, v.3, N2:, p.381-391.

76. Chan S.J., Keim P., Steiner D.F. Cell-free synthesis of rat preproinsulinsi Characterization and partial aminoacid sequence de termination. proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1976, v.73, N6, p.1964-1968.

77. Broome S., Gilbert W. Immunological screening method todetect specific translation products. Proc. Natl.

78. Acad. Sei. USA, 1978, v.75, N 6, p.2746-2749.

79. Roozen K.J., FenwIckR.G., Curtiss R. III. Synthesis of ribonucleic acid and protein in plaanid-containi ng mi-nicells of Escherichia coli K-12. J. Bact., 1971, v.107, N 1, p.21-33.

80. M.A.W., Millican T.A., Patel T.P., Bose C.C., Carey N.K., Do el M.T. Molecular cloning and nucleotide sequence of CDNA coding for calf preprochymosin. Nucleic Acids Res., 1982, v.10, N 7, p.2177-2187.

81. Srtage J.S., Angal S., Do el M.T., Harris T.J.R., Jenkins B., Lilley G., Lowe P.A. Synthesis of calf prochy-mosin (prorenmin) in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. 8ci USA, 1983, v.80, N12, p.3671-3675.

82. Gubler U., Monahan J.J., Lomedico P.T., Bhatt R.S., Collier K.J., Hoffman B.J., Böhlen P., Esch F., Ling N.,

83. Zeytin F., Brazeau P., Poonian M.S., Gage b.P. Cloning; and sequence analysis of США for the precursor of human growth hormone-releasing factor, soma to crinim. -Pro©. Natl. Acad. Sci. USA, 1983, v.80, N 14, p.4311-4314.

84. Maniatis Т., Kee S.G., Efstratiadis A., Eafatos F.C. Amplification and characterization of a J> -globin gene synthesized in yitro. Cell, 1976, v.8, N 2, p.163-182.

85. Goeddel D.Y., Leung D.W., Bull T.J., Gross M., Lawn R.M., McCandliss R., Seeburg P.H., Ullrich A., Yelverton E., Gray P.W. The structure of eight distinct cloned human leukocyte interferon cBNAs. Nature, 1981, v.290,1. N 5801, p.20-26.

86. Weissenbach J., Chernajovsky Y., Zeevi M., Shulman L.,

87. Yang P., Brune J.L., Baldwin W.D., Barnett D.R., Bowman B.H. Identification and characterization of human haptoglobin cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983, v.80, N19, p.5875-5879.

88. Ohkubo H., Ktegeyama RM Ujihara It., Hirose T., Inayama S., Nakanishi S. Cloning and sequence analysis of cDNA for rat angiotensinogen. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983, v«80, N 8, p.2196-2200.

89. Kakidani H., Furutani Y., Takahashi H., Noda M., Mori-moto Y., Hirose T., Asai M.t Inayama S., Nakanishi S., Numa S. Cloning and sequence analysis of cBNA for porcine J> -neo-endorphin/dynorphin precursor. Nature, 1982, v.298, N 5871, p. 2^5-2^9.

90. Martial J. A., Hallewell R,A., Baxter J.D., Goodman H.M. Human growth hormone: complementary MA cloning and expression in bacteria, Science, 1979» v.205, N 4406, p.602-606.

91. Lupker J.H., fioskam W.G., Miloux B., Liauzum P., Ya-niv M., Jouannau J. Abundant excretion of human growth hormone by recombinant-plasmid-transformed monkey kidney cells. Gene, 1983» v.24, Nos 2/5, p.281-287.

92. Kurokawa I., Seno M., Sasada R., Ono Y., Onda H., Iga-rashi K., Kikuchi M., Sugino Y., Honjo T. Expression of human immunoglobulin E ^ chain cDNA in E.coli. — Nucleic Acids Res., 1985, v.II, N 10, p.3077-5085.

93. Reyes G.R., Gavis E.R., Buchan A., Raj N.B.K., Hay-ward G.S., Pit ha P.M. Expression of human -interferon cDNA under the control of a thymidine kinase promoter from herpes simplex virus. Nature, 1982, v.297,1. N 5867, p.598-601.

94. Dworkin-Rast 1 E., Swetly P., Dworkin M.B. Constructiont ■of expression plasmid producing high levels of human leukocyte-type interferon in Escherichia coli. Gene, 1985, v.2I, N 5, p.257-248.

95. Uaxam A.M., Gilbert If. Ixlx Methods in Enzymology, v.65, Nucleic Acids, Part I / Eds Grossman L., Moldave K.N.i. xv \

96. Hershfeld V., Boyer H.W., Xanofsky C., Lovett N.A., Helinski D.R. Plasmid ColEI as a molecular vehicle for cloning and amplification of DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1974, v.71, N 9» Р.5455-З459.

97. Гуревич А.И., Аваков А.Э;, Киселева O.A., Колосов М.Н." Ecofii-нуклеазная карта ДНК трансдуцирующего фага Дг1^47. Биоорган.химия, 1978, т.4, № 5, с.628-638.

98. Gilbert if., Muller-Hill В. Isolation of the lac repressor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1966, v«56, N 6,p.1891-1898«

99. Chen-Pei D., Wu E. Sequence analysis of short DNA fragments. In: Methods in Enzymology, v.65, Nucleic Acids, part I / Eds Grossman L., Moldave K.N.Y. New York: Acad. Press, 1980, p.620-638.

100. Jay E., Bambara E., Padmanabhan E., Vu B. DNA sequence analysis: a general, simple and rapid method for sequencing large oligodeoxyribonucleotide fragments by mapping. Nucleic Acids Res,, 1974, v.I, N 3, p.33I-353.

101. Maniatis Т., Fritsch E.F., Sambrook J. Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, p.504t

102. Bimboim H.C., Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic

103. Acids Res., 1979, v.7, N 6, p.I5I3-I523.

104. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике. М.: Мир, 1976, с.395.189* Caml В., Kourilßky P. Screening of cloned recombinant DNA in bacteria by in situ colony hybridization. -Nucleic Acids Bes., 1978, v.5, N 7, p.2381-2390.

105. Берлин Ю.А., Каган M.3., Колосов M.H., Коробко В.Г. Синтез о лито- и полинуклеотидов. ХУ. Синтез тридекадез-оксирибонуклеотида, комплементарного участку 23-35 ва-линовой тРНК дрожжей. Биоорган, химия, 1976, т.2, й 8, C.I063-I072.