Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Химико-ферментативный синтез гена ангиогенина человека и его экспрессия в Е. COLI

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Химико-ферментативный синтез гена ангиогенина человека и его экспрессия в Е. COLI"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ

Новосибирский Институт биоорганической химии

На правах рукописи УДК 577.213.7+577.214.622

КОВАЛЕНКО Сергей Петрович

ХИМЖО-ФЕШЕНТАТИВНЫЙ СИНТЕЗ ГЕНА АНгаОШША ЧЕЛОВЕКА И ЕГО ЭКСПРЕССИЯ В Е.СОД1

Специальность 03.00.04. - Биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск - 1990

Работа выполнена в Новосибирском институте биоорганической химии СО АН СССР.

Научный руководитель - доктор биологических наук . Н.П.Мертвецов.

Официальные оппоненты: доктор химических наук

B.В.Власов,

кандидат биологических наук

C.Н.Щелкуяоз.■

Ведущая организация: Институт цитологии и генетики СО АН СССР.

часов

на заседании Специализированного сЬвета K003.52.0I в Новосибирском институте биоорганической химии СО АН СССР по адресу: 630090, Новосибирск-90, проспект ак. Лаврентьева, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского института биоорганической химии СО АН СССР.

Автореферат разослан "М> " 1990 г.

Ученый секретарь Специализированного совета

кандидат химических наук

О.С.Федорова

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Ангиогенин - основной белок, индуцирующий рост сосудов 1п у'^о . был вяёрвне выделен из клеток карциномы человека. Позднее ангиогенин был обнаружен в плазме крови здоровых людей. Экспрессию гена ангиогенина наблюдали как в нормальных, так и в опухолевых тканях человека и животных. Вопрос о роли ангиогенина в физиологических процессах в норме и патологии пока остается открытым, однако уже сегодня ангиогенин рассматривают как белок, потенциально значимый для лечения ран, ожогов, язв, обсувдается возможность его применения при некоторых' сердечно-сосудистых патологиях. Изучение регуляции экспрессии и механизмов действия ангиогенина, равно как и возможностей его медицинского применения сильно сдерживается незначительными количествами этого белка в природных источниках. Единственная возможность получения необходимых для медико-биологических испытаний количеств ангиогенина - создание его генно-инженерного продуцента.

Системы получения генно-инженерных белков постоянно совершенствуются, однако по настоящее 'время практически отсутствуют универсальные схемы, позволяющие быстро и надежно получать белковый продукт, синтез которого направляется сконструированной рекомбинантной ДНК. Универсальные системы особенно необходимы в практических лабораториях .где1, как правило, возникают задачи получения белка, а не исследования закономерностей его синтеза

в Е-00и.

Цель и задачи работы

Целью настоящей работы является получение генно-инженерного ангиогенина человека посредством химико-ферментативного синтеза полноразмерного гена с последующей экспрессией его в Е.со£г. При экспрессии синтетического гена предполагалось использовать системы о достаточным уровнем универсальности о тем, чтобы создать базу для дальнейшего получения генно-инженерных продуцентов биологически активных веществ белковой природы для

экспериментов по возможности их использования в практической медицине.

В соответствии с этим необходимо было решить следующие задачи:

1) разработка стратегии химико-ферментативного синтеза гена ангиогенина человека;

2) химико-ферментативный синтез гена ангиогенина человека и его клонирование в соответствии с разработанной стратегией;

3) анализ экспрессии синтетического гена ангиогенина в различных системах, характеризацш этих систем;

4) оценка биологической активности подученного генно-инженерного ангиогенина и его производных.

Научная новизна работы

В работе предложена новая схема сборки искусственных генов из блоков, впервые получены слитые белки ангиогенин-^-делтид ^ - гаггактозвдазы Е.со/7, р -галактозидаза-ангиогенин, домены белка А-ангиогенин. Обнаружена ангиогенная активность слитого белка р -галактозидаза-ангиогенин, продемонстрирована возможность специфического расщепления слитого белка кислотным гидролизом по связям Jsp'Pr■o. В процессе получения слитого белка домены белка А-ангиогензн обнаружена зависимость интенсивности внутриклеточного протеолзза белка от наличия сигнальной (лидераой) последовательности у этого белка.

Практическое значение. В результате проделанной работы получены бактериальные штаммы, продуцирующие ангиогенин в составе слитых белков. Разработаны схемы расщепления слитых белков. Создана база для начала экспериментов по оценке возможностей медицинского применения ангиогенина. Штаммы - продуценты слитых белков -галактозидаза-ангиогенин" и "домены белка А-ангиогенин" переданы для среднемасштабного культивирования в ШО "Фермент" Минмедбиопрома (г. Вильнюс).

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации были представлены на Всесоюзной конференции "Генная и клеточная ййженерия в решении фундаментальных проблем биотехнологии" (Тарту, 1988), на УШ двустороннем симпозиуме СССР - ФРГ "Регуляция генома" (Иркутск, 1989), на семинаре Отдела биотехнологии

Королевского института технологий (Стокгольм, 1988). В 19881989 гг. работа была представлена на ВДНХ СССР и удостоена золотой медали. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи, тезиоы двух докладов, получено положительное решение на изобретение.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 123 страницах, включая 27 рисунков и I таблицу. Библиография содержит 144 наименования. Работа состоит из введения, обзора литература, описания материалов и методов, результатов и обсуждения, выводов, списка цитированной литературы.

2. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

2.1. Химико-ферментативный синтез гена ангяогенина человека

Опубликованная аминокислотная последовательность ангиоге-нина человека была трансформирована в нукяеотодную последовательность с использованием ксдонов, наиболее часто используемых в активно экспрессирующихся генах Е.со^г. Из полученной нуклео-тидной последовательности были удалены потенциальные шпилечные структуры путем замены соответствующих ксяшов на синонимичные. Последовательность разбили на три блока для клонирования введением сайтов рестрикции. Каздый блок разбили на олигонуклеотидн для синтеза, разбивка на олигонуклеотиды была оптимизирована с помощью компьютерного анализа. Олигонуклеотида длиной 15-22 звеньев каждый были синтезированы в лаборатории химии нуклеиновых кислот Новосибирского института биоорганической химии. Олигонуклеотиды ф.осфорилировали с помощью подинуклеотидкиназы фага Т4 и сшивали в цени длиной 60-70 звеньев в соответствии с разработанной схемой (Рис. I). Полинугагеотидные цепи объединяли в блоки, блоки последовательно клонировали в полилинкере фага MI3 мр8, при этом в соответствии с принятой схемой клонирование первого блока приводило к термянации d -пептида } -галактозада-зы фага MI3, клонирование второго блока восстанавливало трансляционную рамку, а клонирование третьего блока вновь приводило к терминации трансляции до начала X -пептида (Рис. 2). Такая

MetGlnAspAsnSerArgTyrThrHisPheLeüThrGlnHisTyrAspAlaUysPro

C<-~— 1------><-- 3 ——X--5 ---->3E<-----7---

AATTCGATeCAGGACAACTCBAGATACACTCACTTTCTGACTCABCATTACBATBCTAAACCA GCTACGTCCTGTTGAGCTCTATGTGAGTGAAAGACTGAGTCGTAATGCTACSATTTGGT

C<----2------><---— 4---—X-—- 6----->U<-----

EcoRI Xhol

G1nGl^ArgAspAsjjArgTyrC^sfeluSerIIeMetAr^jAr gArgGlyLeuThrSerProCys

CAGGGCCGCGACGACCGTTATTGCGAATCTATTATGCGCCGCCGCGGTCTGACCTCTCCAT6C GTCCCSGCGCTGCTGGCAATAACGCTTAGATAATACGCGGCGGCGCCAGACTGGAGAGGTACB в-------x--—- 10-----X----12-->3C<—----14 —

LysAspIIeAsnThrPhel1eHibGIy**»

----15 —-----X------17------->3

AAAGACATCAACACTTTCATCCATGGTTAAGCGTCG TTTCTGTAGTTGTGAAASTAGGTACCAATTCGCAGCCTAG

---X-----16-----X-----IB----->3

Ncol BamHI

Hi sGlyAsnLysArgSer11eLysAlа11eCysGJuAsnLvsAsnGlvAsnProHi sArgGlu

[<----19------------21--------><—-----23------->3C<---

CATGGTAACAAACGT7CTATCAAAGCTATCTGCGAAAACAAAAACGGCAACCCGCACCGCGAA CATTGTTTGCAAGATAGTTTCGATAGACGCTTTTGTTTTTGCCGTTGGGCGTGGCGCTT C<---- 20 ------X------- 22 --------X------ 24-----'—>3

Ncol

AsnLeuArg11eSerLysSerSerPheGlnValThrThrCysL^sLeuHi sGl^G1y

AATCTGCGTATCTCTAAATCTTCTTTCCAGGTCACTACTTGCAAACTGCACGGTG TTAGACGCATAGAGATTTAGAAGAAAGGTCCAGTGATGAACGTTTGACGTGCCACCTAG

t<------ 26 —----X------- 28 --------X------ 30 ------>3

BamHI

Ser Pr oTrpPr-oPr oCysGl nTyrArgAl aThr Al aGl yPheAr g AsnVal Val Val Al aC

C<-------31-------X------33------X—------35 —------>3 C<

GATCCCCGTGGCCGCCATGTCAGTACCGTGCTACTGCTBGCTTCCGTAACGTTGTTGTTGCAT GGGCACCGGCGGTACAGTCATGGCACGATGACGACCGAAGGCATTGCAACAACAACGTA

C<------- 32 --------X-------- 34 --------><------36----

BamHI

y sGl uAsnGl yLeuProVal Hi sLeuAspGl nSer 11 ePheArgArgPr o***

-- 37 ---X- 39 -----X----41 --X---- 43 ——>3

GCGAAAACGGCCTGCCGGTTCACTTGGACCAGTCTATCTTCtSGTCGAQCATAATGACTGCA CGCTTTTGCCGGACGGCCAAGTGAACCTGGTCAGATAGAAGGCñGCTGGTATTACTG

— >3C<---38 -X--r 40----X----T-- 42-->3

Sal (31 PstI

Phc.J. Нуклеотидная последовательность блоков для сборки гена ангиогенина. Стрелками обозначены химически синтезированные олигонуклеотиды, квадратными скобками - сшиваемые фрагменты блоков. Над нуклеотидной последовательностью приведена аминокислотная последовательность, обозначены сайты узнавания для эндонуклеаз рестрикции и сайты клонирования блоков в вейторе. Блок I - олигонуклеотиды I-I8, блок 2 - олигонуклеотиды 19-30, блок 3 - олигонуклеотиды 31-43.

схема позволяла всякий раз отбирать рекомбинантные фаги по изменению фенотипа фаговых колоний при клонировании каждого последующего блока: Лас+ —¿ас-— Лас+—- ¿ас-..

Таким образом, был получен фрагмент ДНК длиной 389 нукле-отидных пар, кодирующий полную аминокислотную последовательность ангиогенина.

И!

ВотН1

1дсг' У////А.

-р ис

Нсо1

Р о

И N(3)1 ВатН!

I 1 \ исг' -I I | п | утят

Юс*

III

1ег

Д! Мсо! ВатН]

Р5»1

Г < < И 1-Асг' -| 1 | п | 1п тпт.

р о

1ас

Рис. 2, Принцип сборки гена из блоков в фаге М13 мр8 с изменением фенотипа фаговых колоний при присоединении каддогс^ последующего блока.

2.2. Анализ экспрессии слитого белка ангиогенин-и.- пептид -галакгозидазы Е.соб' в клетках, индуцированных фагом Ж-1

Согласно схеме сборки синтетического гена, он находится под контролем регуляторных элементов ¿ас -опердаа, поэтому моя-но было ожидать синтеза ангиогенина в клетках Е.со/г', индуцированных фагом М13 мр8 с проклэнираванным геном анпогенина. Однако анализ электрофореграмм суммарных клеточных белков Е.со/г' , индуцированных фагом М13 ант не выявил пслипептида, соответствующего ангиагенинину.

Для того, чтобы оценить уровень экспрессии ангиогенина

в клетках, индуцированных рекомбинантным фагом, наш был получен фаг MI-I, кодирующий слитый белок ангиогенин-^.- пептид р -галактозидазы Е.со^г. Фат MI-I получали с помощью олигонук-леотид- направленного мутагенеза таким образом, что на месте терминирующих кодонов гена ангиогенина формировались кодоны, кодирующие последовательность Asp-Pro (Рис. 3). Оценку количества слитого белка проводили по изменению л. -донорной активности экстрактов клеток Е.со^г, индуцированных фагом MI-I с различной множественностью и на разных стадиях роста клеточной культуры. Анализ изменений количества слитого белка продемонстрировал, что его содержание ь I ш клеточной суспензии возрастает с увеличением плотности культуры, а на ранних фазах роста E.co^t о увеличением множественности инфекции фагом. В пересчете на единичную клетку возрастания количества J- -донора на первых часах после индукции сменяется уменьшением J. -комп-лементирующего белка в стационарной фазе роста. Увеличением множественности заражения фагом можно добиться некоторого повышения количества ¿-донора на ранних этапах роста Е.со/г. Можно оценить и абсолютные количества белка о JL- донорной активностью в экстрактах Е.со^г, индуцированной фагом MI-I. Оценки абсолютного количества дают максимальное значение около 0,5 мкг слитого белка в I мл клеточной суспензии. Неомотря на то, что количества ангиогенина, получаемые в используемой системе незначительны, она вполне мсает быть использована как модель для выбора оптимальных регуляторных элементов в экспериментах по анализу экспрессии ангиогенина в Е.со^г.

2.3. Получение слитого белка Ji -галактозидаза - ангиоге-нин, его расщепление и некоторые биологические свойства

Синтетический ген ангиогенина клонировали в плазмиде 290 в единой трансляционной рамке с ji -галактозидазой так, что пояипептиды, соответствующие ангаогенину и уз -галактозидазе были соединены пептидной связью Asp-Pro (Рис. 4). При индукции lac - промотора в клетках Е.со&, несущих гибридную плазмиду, синтезировался слитый белок (Рис. 5). Слитый белок находился в клетках Е.со/г в составе телец включения, а потому мог быть

У///Л - ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ДНК, КОЛИРУЮЩАЯ АНГЙОГЕНИН I I " ГЕН ¿ас I' - - ВЕКТОРНАЯ ДНК

1ос"

1оС*

Агд Рго |ег teг Ыи 61п ... АТС ГТССбТСбАССАТДАТбАСГССАСССААбСТТСбСА... СбСАбСТбБТ Т ЕАСбТСбОТТС С АССС ^

Агд Рго Аер Рго 1.еи Ип . . . АТСТТССбТСбАССАбАТССбСТбСАбССААССТТСОСА ...

Рцс.3. СЛИЯНИЕ ГЕНА АНГЮГЕШ1А с гшюи /ас 2

-ОНК ФАГАМ 13 а нг • ОЛИГОНУКЛГОТИД

• ОНК «АГАМ 1-1

Не 1 Кв.1 У,'А!р'/дУп 15ег Агд Туг Тйг ..АТвОЙ ЬАС М ка № ТАС АСТ...

_1

р{р

ХИо1

1.у$ А5р»Рго Эег ТЬг Су$ Бег ..ААА Ш ССЙ ТСЙ АСС ТЕС АбС... -и_I

Ват Н1 ЗаШ р{?

М13Анг

риН290

Ьуз в!у АгрТРго 5ег Агд Туг ТЬг

..ААА Ш ССй ТСС АБА ТАС АСТ... |_I

ВатН1

риЯ2Э0-Анг

РиС.Д. фрагменты аминокислотных и соответствущих им нуклеотидных последовательностей плаэмид, использованных в работе. Заштрихованы аминокислоты ангиогенина, делегированные в слитом белке, место кис-лотолабильной пептидной связи обозначено стрелкой.

выделен с достаточной чистотой путем последовательной экстракции растворимых клеточных белков буферными растворами, содержащими неионные детергенты с последующей экстракцией оставшегося белка гуанидан гидрохлоридом. Выход слитого белка составлял 200-300 мг из I л клеточной культуры Е.со^г.

Показано, что слитый белок обладает ангиогенной активностью на хоришаллантоисной мембране куриных эмбрионов.

При расщеплении слитого белка мягким кислотным гидролизом в условиях преимущественного разрыва пептидной связи Asp - Pro образовались полипептиды, соответствующие ангиогенину и фрагментам ji -галактозидазы (Рис. 6). Смесь полипептидов после такого кислотного гидролиза обладала ангиогенной активностью, однако даже ограниченный протеолиз слитого белка с помощью суб-тилизина приводил к псиной потере ангиогенной активности образца.

Полипептид, соответствующий ангиогенину, выделяли из смеси. Было показано, что последовательность J -концевых аминокислот рекомбинатного ангиогенина полностью соответствовала запланированной.

Рис.5. Электрофорез в 7% ПААГ по Лэммли суммарных клеточных белков штамиов Е.соIi, несущих плазмиды рУД 290 Анг(1-3) или р№ 290(4-6). I, 6 - выращивание без индукции IPTQ, 2-5-5 ч выращивания после индукции IPTG.

Рис.6. Химическое расщепление слитого белка j, -галактози-даза-ангиогенин. Электрофорез в 15% ПААГ полипептидов, образующихся при гидролизе телец включения, выделенных из штаммов Е.соi?2 , несущих плазмиды р(/Н290 и p(JB290 - Ант. I - тельца включения E.co¿V с плазмидсй рУЙ290 (j¡ -галактозидаза) до гидролиза; 6-8 - то же после гидролиза; 2 - тельца включения Е.соб'с плазмидой р(/В290 - Анг до гидролиза; 9, 10, II - то se после гидролиза; 3-5 - маркеры молекулярных масс белков.

2.4. Получение слитых белков типа " Ig 6¡ - связывающие домены белка A £{cLhliijtococcu$ aureus - ангиогенин"

В основу альтернативной стратегии получения слитого белка, содержащего аминокислотную последовательность ангиогенина, была положена методология, предложенная проф. М.Уленом (Стокгольм, Швеция) для получения и очистки слитых белков. Эта методология предполагает получение белков, содержащих IqGi - связывающие домены белка А. Такие белки, как правило, обладают - связывающими свойствами, что позволяет легко выделять их из смесей биомолекул: с помощью аффинной хроматографии. Общая схема выделения слитого белка "Ig í - связывающие домены белка А - ангиогенин" о последующим получением из него ангиогенина приведена на Рис. 7.

Для получения слитого белка "доме® белка А - ангиогенин" была сконструирована плазмида f^íÁéнаправляющая синтез полипептида. типа "сигнальная последовательность белка А - Ij <? - связывающие домены-ангиогенин". Анализ белков Ig£¡ - связывающей фракции из среды культивирования клеток, периплазматического пространства Е.со^г и из суммарных экстрактов клеток Е.со/г несущих данную плазмиду показал, что слитый белок подвержен сильному протеолизу до - связывающих пептидных доменов с небольшими фрагментами полипептидной цепи ангиогенина. Было предположено, что добавление полипептидной цепи к С-концевой части слитого белка может защитить этот белок от протеолиза. Для получения такого слитого белка была сконструирована плазмида pD 10, кодирующая слитый белок - связывающие домены

Рис.7. Общая охема получения Pro - ангиогенина из (Стр./5) клеточных белков, содержащих слитый белок: домены белка А - ангиогенин..

белка А - ангиогенин - белок£" (Рис. 8). Белок 6 Slo-fyiococc^ bureus обладает аффинностью к альбумину (№), а значит слитый белок, кодируемый плазмидсй р £>10 должен обладать одновременно аффинностью к альбумину и к . Анализ белков связываюцихся и Ji& - связывающихся фракцией Е.со^г, несущих р ¿10 показал, что некоторое количество белка с соответствующей молекулярной массой и с аффинностью как к гак и к альбу-

мину, находится внутри клетки. Ни в периплазматическом пространстве Е.со^г , ни в среде культивирования обнаружить такой белок не удалось. На основании этих данных можно было полагать, что именно полипептид, соответствующий ангиогенину, препятствует проникновению слитого белка через клеточную мембрану, т.к. в ряде работ была показана эффективная секреция через плазматическую мембрану как доменов белка А, так и белка 5 . Вполне.вероятной представлялась возможность усиления протеолитического расщепления белка за счет неспособности его завершить уже начатую транслокацию сквозь плазматическую мембрану клетки. С целью проверки этой гипотезы была получена плазмида р^г 25, направляющая синтез аналогичного слитого белка, но не имеющего сигнальной последовательности. Оказалось, что слитый белок без сигнальной последовательности гораздо меньше подвержен протео-лизу в клетке. На рис. 9 приведены относительные количества белка с Ijij, альбумин - и /альбумин аффинностями в клетках Е. с о 6)несущих плазмида р 1)10 та р £>¿25. Видно, что удаление сигнальной последовательности значительно снижает интенсивность протеолиза слитого белка в клетке.

Для получения больших количеств слитого белка, из которого возможно было бы вшцеплять ангиогенин, мы сконструировали плазмиду рЩТА16. В этой плазмиде эффективная транскрипция обеспечивается промотором X Ре, эффективная трансляция - сайтом связывания с рибосомами гена его фага!, а возможность расщепления слитого белка - наличием непосредственно перед геном ангиогенина кодонов аминокислот Jsp-Pf-o (Рио. 10). Электрофоре-тический анализ показал, что IgG - овязываыцая фракция белков

IgG Angiogenin

—(

Бра

pH-7,5

I Binding

I

IgG

4

Angiogenin

Бра

II Elution

pH-3,2

[Asp-^Pro-

Ang

Ang

Ю

III Cleavage

r->4

If 0

1Y Conventional chroma tog га hy

Рас.7. Общая схема получения ?т~о ~ ангиогенина из клеточных белков, содержащих слитый белок: домены белка А - ангиогенин.

В

Рис.8. Схема плазмиды р DIO, кодирующей слитый белок

- связывающие домены - ангиогенин - альбумин связывающие домены. Z - - связывающие домены; ВВ - альбумин - связывающие домены, S - сигнальная последовательность белка А.

Рис.9. Влияние сигнальной последовательности на внутриклеточный протеолиз слитого белка: домены белка А -ангиогенин - белок 6 .

<Э - штамм Е.со^г, несущий плазмиду рЛЮ, кодирующую слитый белок с сигнальной последовательностью; ©- штамм Е.со^г .несущий плазмиду р Ь, 25, кодирующую слитый белок без сигнальной последовательности.

из клеток Е.оо/г, несущих плазмиды рЕГТ С-ц 857 и рЕГТА16, содержала белок с ояшцаемсй молекулярной массой. Этот белок расщеплялся мягким кислотным гидролизом в условиях предпочтительного разрыва связей Л&р-Рг-а с высвобождением полипептида, соответствующего по молекулярной массе ангиогенину (Рис. II).

Слитый белок "домены белка А-ангиогенин" индуцировал нео-ваокуляризацию в экспериментах на хориоиаллантоисной мембране куриных эмбрионов как сам по себе, так и после специфического

пиша» рк I т л 16

балка

нп1фятиг*лпиу*я синтез ОНЕТСГО домевд - анпюгвюв.

■ 4Рвпюя гева Лс

- вапювт гена, ъодвдюдаго белек А • - герюватор треаахря

хш

Рис. 10.

гидролиза по связям -Рго .

Таким образом, нами продемонстрирована возможность использования различных подходов для получения экспрессии синтетического гена ангиогенина в Е.со^г . Все использованные подходы достаточно универсальны и, по-видимому, могут применяться для экспрессии других генно-инженерных белков. Полученные слитые белки в ряде случаев обладают новыми свойствами. К таким свойствам, в частности, можно отнести ангиогенную активность суспензии слитого белка - галактозидаза-ангиогенин. Стабильность этого белка и простота получения делают его хорошим кандидатом на рель средства, индуцирущвго. неоваскуляризацию в

1 - 3 - 2 .

Рис.11. Химическое расщепление слитого белка домены белка А -

ангиогенин. Электрофорез в 15% ПААГ -SDS в системе

Lbínnmii .

I¿ Маркеры молекулярных масс белков.

2. I<¡6 - овязывавдаяся фракция белков штамма BITA 16.

3. То же, что (2) после 6 часов гидролиза 70$ муравьиной кислотой.

4. То же, что (2) после 18 чаоов гидролиза 70$ муравьиной кислотой.

иедико-биологических экспериментах.

В целом, полученные слитые белки ухе сейчас позволяют начать медико-биологические эксперименты по оценке возможности индукции ангиагене за и его эффективности для ускорения репара-тявных процессов самой разной этиологии. Выявление специфики биологического действия ангиогенина в таких экспериментах, по всей видимости, даст основу для создания медицинского препарата, который посредством усиления неаваскуляризации может интенсифицировать репаративные процессы при целом ряде патологий (травматические и ожоговые рана, язвы, переломы и т.п.).

выводы

1. Предложена оригинальная схема синтеза и сборки гена ангиогенина человека из олигонуклеотидных блоков. С использованием этой схемы осуществлен химико-ферментативный синтез и клонирование полноразмерного гена ангиогенина человека в составе фага MI3 мр8.

2. Показано, что синтетический ген ангиогенина человека экспрессируется в клетках Е.со/г' , обеспечивая синтез полипептида с аминокислотной последовательностью ангиогенина в составе слитых белков с <L -пептидом ^-галактозидазы, сс/-га-лактозидазой, о фрагментами белка А. Установлено, что слитый белок ji -галактозидаза - ангиогенин и слитый белок "домены белка А - ангиогенин" обладают ангиогенной активностью в экспериментах на хорионаллантоисной мембране куриных эмбрионов.

3. Показана возможность специфического химического расщепления слитых белков -галактозидаза-ангиогенин" и "домены белка А-ангиогенин" по пептидной связи Мр - Pro с шсвобоиде-нием ангиогенина. Продемонстрирована биологическая активность ангиогенина после выщепления.

4. Обнаружена связь интенсивности протеолитического расщепления рекомбинантного ангиогенина в Е.со<?г с наличием сигнальной последовательности у этого белка, выдвинута гипотеза о механизме такой связи.

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах: .

1. Коваленко С.П., ГорнВ.В., Каргинов В.А., Морозов И.В., Зарытова В.Ф., Мертвецов Н.П.// Химико-ферментативный и клонирование гена ангиогенина человека в составе фага MI3 мр8// -Биоорган, химия. - 1988. - T.I4, J6 7. - С. 910-915.

2. Коваленко С.П., Лисняк И.А., Мертвецов Н.П.// Экспрессия синтетического гена ангиогенина человека в Е.со/г в составе слитого белка J> -галактозидаза-ангиогенин // - Биоорг. химия. - 1989, - Т.15, S4. - С. 492-498.

3. Коваленко С.П., Мертвецов Н.П. // Экспрессия в Е.оо/? гена ангиогенина человека, трансляционно слитого с jf - концевым фрагментом J -галактозидазы // Биополимеры и клетка. - 1990.

- Т.6, » 3.

4. Коваленко С.П., Горн В.В., Каргинов В.А., Лисняк И.В., Зарытова В.Ф., Мертвецов H.H. // Химико-ферментативный синтез гена ангиогенина и его экспрессия в Е.со£г// Тез. докл. Все-союзн. конференции "Генная и клеточная инженерия в решении фундаментальных проблем биотехнологии" - Тарту, 1989. - С. 4146.

5. Мертвецов Н.П., Зарытова В.Ф., Коваленко С.П. // Химико-ферментативный синтез гена ангиогенина человека и его экспрессия в Е.со^г / Тез. докл. УШ двустороннего симпозиума СССР - ФРГ "Организация генома и регуляция активности генов" -Иркутск, 1989. - С. 18.