Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Плазмидные ДНК со вставкой гена ангиогенина как потенциальные инструменты для генотерапии

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Плазмидные ДНК со вставкой гена ангиогенина как потенциальные инструменты для генотерапии"

На правах рукописи

ДУДАРЕВ Алексей Николаевич

ПЛАЗМИДНЫЕ ДНК СО ВСТАВКОЙ ГЕНА АНГИОГЕНИНА КАК ПОТЕНЦИАЛЬНЫЕ ИНСТРУМЕНТЫ ДЛЯ ГЕНОТЕРАПИИ

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Кольцове 2003

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте молекулярной биологии и биофизики Сибирского отделения Российской академии медицинских наук.

Научный руководитель:

доктор биологических наук,

профессор Мертвецов Николай Павлович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Воевода Михаил Иванович

кандидат биологических наук Колокольцов Алексей Александрович

Ведущая организация:

НИИ медицинской генетики Томского научного центра СО РАМН, г.Томск

заседании диссертационного совета Д 208.020.01 при Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» Минздрава РФ по адресу: ГНЦ ВБ «Вектор», Кольцово Новосибирской области, 630559.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ ВБ «Вектор».

Защита состоится « 8

2003 г. в 9.00 часов на

Автореферат разослан « » _2003 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

Малыгин Э.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Генная терапия (временный перенос генов и антисенс олигонуклеотидов в ткани биологических объектов с целью биокоррекции), - актуальная проблема современной биотехнологии, генетики и медицины. Интерес к генотерапии высок. Причина такого интереса заключается в том, что генотерапия обещает революционизировать медицину, лечить не следствие, а причину болезни. Ранее результаты клинической эффективности генотерапии с использованием вирусных векторов, кодирующих часть собственных оболочечных белков и интегрирующихся в геном млекопитающих, были определены как не достаточно безопасные (Баранов и др.,

Современные генотерапевтические конструкции плазмид (рекДНК - не кодирующие собственных белков), несущие различные гены (в том числе ген ангиогенина) успешно экспрессируются в эукариотических организмах. Их действие направлено на генную коррекцию нозологий, связанных с необходимостью временного увеличения дозы гена в органах и отдельных тканях. Механизм экспрессии таких плазмид в организме, причины их непродолжительного существования там пока не установлены. Плазм иды не содержат в своем составе генов, кодирующих вирусные белки, и поэтому не опасны. По той же причине они не защищены от действия нуклеаз клеток и плазмы организма. Тем не менее, они функционируют в тканях млекопитающих (вводятся в ткани, кровь и лимфу в препаративном количестве). Плазмидные ДНК после введения в организм существуют там не долгое время и успевают экспрессировать нужный ген, управляемый, как правило, сильным промотором (время функционирования в организме 1-1,5 месяца) (Baumgartner et al., 1998). За последнее десятилетие лечение генотерапевти-ческими конструкциями несущими различные гены, прошло более 3 тысяч волонтёров (Montain, 2000). Такие рекДНК по мере необходимости могут заключаться в липидные оболочки с целью придания им большей устойчивости в организме, при этом они приобретают отрицательное свойство ли-пидных частиц вызывать отёки (иногда отмечаются слабые аллергические реакции).

Популярностью в последние годы в зарубежной медицинской науке и практике пользуется генная терапия ангиогенеза (Жданов и др., 2000; Montain, 2000; Мертвецов и др., 2002). «Терапевтический ангиогенез» - составная часть науки генотерапии. При терапевтическом ангиогенезе используются белки и клонированные гены факторов роста кровеносных сосудов (в том числе ангиогенин и фактор роста фибробластов). Разработка технологии рекомбинантных ДНК позволила начать сравнительные клинические исследования по лечению инфаркта миокарда, тромбозов и других сердечно-

сосудистых заболеваний, используя как р активаторы

2000).

ангиогенеза, так и их генетические эквиваленты - плазмидные рекДНК, экс-прессирующиеся в организме человека (Baumgartner et al., 1998).

Поскольку в генотерапии определился переход к невирусным плазмид-ным ДНК, как биотехнологическим препаратам будущего, встаёт вопрос о масштабировании процесса производства соответственных видов рекомби-нантной ДНК, создании быстрых и стерильных методов выделения рекДНК, её очистки, транспортировки и хранения (Жданов и др., 2000; Montain, 2000).

Масштабирование производства рекДНК, безусловно, потребует перехода к использованию таких технических средств, как современные биореакторы. В биореакторе должны быть обеспечены способы переноса тепла, кислорода и массы между фазами с целью создания оптимальных условий для роста клеток и биосинтеза целевого продукта, при соблюдении условий стерильности и экономичности процесса.

Таким образом, смещение основного спектра внимания исследователей к изучению и использованию плазмидных рекДНК делают актуальными, как в научной, так и в практической области, следующие направления работ:

1. Для экспериментов в этой области необходимо производство полупрепаративных количеств рекомбинантных ДНК, так как, попадая в организм, большая часть плазмидных рекДНК подвергается рестрикционной деградации ферментами системы защиты клеток.

2. Поиск периода восприимчивости организма к воздействию плазмид-ной рекДНК, - периода наибольшей вероятности проникновения плазмид в клетки организма для последующей экспрессии экзогенной плазмидной рекДНК.

Цель и задачи исследования. Целью исследования являлась разработка методов для препаративной наработки, очистки и тестирования генотера-певтических генноинженерных конструкций, содержащих клонированные гены ангиогенных ростовых факторов человека.

В задачи работы входило:

1. Отработка метода получения биомассы бактерий Е. coli JM 109, содержащих рекомбинантные ДНК с клонированными генами млекопитающих в газо-вихревых биореакторах "Биок".

2. Наработка и очистка экспериментальных полупрепаративных количеств рекомбинантных ДНК, предназначенных для экспериментов в области генотерапии.

3. Тестирование активности генноинженерных плазмидных конструкций, содержащих клонированные гены ангиогенина человека на модели хо-риоаллантоисной мембраны развивающихся куриных эмбрионов (ХАО РКЭ) и в раннем постнатальном онтогенезе линейных мышей.

4. Исследование возможности разработки оригинальной схемы для переноса клонированных генов в постнатальном онтогенезе линейных мышей.

Научная новизна и практическая ценность работы.

1. Создана система культивирования в газо-вихревых биореакторах "Биок" для наработки биомассы бактерий Е. coli, содержащих рекомбинант-ные ДНК, а также выделения из неё рекДНК с клонированными генами человека. Разработанные способы культивирования, выделения и очистки рекДНК, содержащих клонированные гены животных и человека, позволяют получать полупрепаративные количества рекомбинантной ДНК для использования в генотерапии.

2. Тестирование полученных таким путём плазмидных ДНК, содержащих ген ангиогенина человека, на хориоаллантоисной мембране развивающихся куриных эмбрионов (ХАО РКЭ), свидетельствует об их биологической активности.

3. Разработана оригинальная схема эксперимента по переносу генов, заключённых в рекомбинантных плазмидных конструкциях, в раннем пост-натапьном онтогенезе мышей для генотерапевтических воздействий. Разработанная схема переноса клонированных генов в раннем постнатальном онтогенезе мышей представляет практическую ценность для реализации генотерапевтических конструкций в тканях млекопитающих.

Генноинженерные конструкции, введённые мышам на второй день после рождения (плазмидная рекомбинантная ДНК, содержащая клонированный ген ангиогенина человека), влияют на постнатальный онтогенез мышей линии Tg-8, значительно тормозя их рост с 28 по 40 день послеутробного развития. Животные в период раннего постнатального онтогенеза (вторые сутки) оказались чувствительными к влиянию рекомбинантной ДНК ангиогенина человека. Таким образом, впервые отработана схема переноса генов плазмидных рекДНК в ткани млекопитающих в раннем постнатальном онтогенезе.

Апробация работы и публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 печатных работы в научных журналах, монография и доклад на Международном симпозиуме «Стресс и экстремальные состояния» (Кара-Даг, Феодосия, Украина, 2002). Материалы работы доложены на пятом генетическом конгрессе в Малайзии (Proceedings of the Fifth National Congress of Genetics, 2003).

Структура и объём работы. Диссертация изложена на 105 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, посвя-щённого биотехнологическим аспектам проблемы генной коррекции, в том числе и «терапевтического ангиогенеза», экспериментальной части, обсуждения, результатов, заключения, выводов и списка литературы (112 ссылок), содержит 25 рисунков и 6 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Методы исследования

Трансформацию клеточных штаммов Е. Coli, плазмидными генетическими конструкциями рекДНК проводили по (Sambrook et al., 1989).

Наработку биомассы Е. Coli, содержащей рекДНК в полупрепаративных количествах осуществляли по разработанной нами методике в новом вихревом биореакторе "Биок". Концентрировали охлажденную биомассу при 2500 оборотах на крупногабаритных центрифугах "ОС-6М" (Россия).

Выделение полупрепаративных количеств (10-20 мг) ДНК осуществляли модифицированным нами методом с доочисткой хлористым литием, описанной А. Мазиным и др., 1990, на низкоскоростной крупногабаритной центрифуге "ОС-6М", при 5000 об/мин.

Оценку качества препаратов ДНК и их соответствия размерам и стандартам проводили методом электрофореза в агарозном геле после гидролиза соответствующими эндонуклеазми рестрикции (Sambrook et al., 1989). Количество рекДНК определяли денситометрически.

Хранение полупрепаративных количеств ДНК осуществляли под 96% этиловым спиртом.

Тест на биологическую активность рекДНК впервые проводили по методике, использующейся для определения активности белков на ХАО РКЭ (хориоаллантоисной мембране развивающегося куриного эмбриона) (Кислых и др., 2000; Мертвецов и др.,2002).

Тест на мышах линии TG-8 в раннем постнатальном онтогенезе проводили по разработанной нами методике (Мертвецов и др., 2002).

2. Экспериментальная часть

Поскольку за период времени, в который выполнялась данная работа, мы осуществляли два типа экспериментов:

1) Отработка процесса полупрепаративногй наработки биомассы Е. coli и выделения из неб рекДНК ангиогенина человека в новых газо-вихревых биореакторах объёмом 5 и 10 литров с последующим тестированием на ХАО РКЭ.

2) Проведение эксперимента с отработкой методов введения и тестированием рекДНК при постнатальном развитии мышей линии TG-8, - то работа фактически состоит из двух частей.

2.1. Наработка рекДНК факторов роста сосудов в полупрепаративных количествах

Первая часть данной работы представляет собой исследование возможностей полупрепаративной наработки рекомбинантных плазмид pAng 1, pAng 2, pAng 3, содержащих клонированный ген белка ангиогенина. Плаз-миды сконструированы в Институте молекулярной генетики РАН для совместных работ (Мертвецов и др.,2002).

Ангиогенин (молекулярная масса 14,5 килодальтон) - основной белок (рН-9,5) с ядерной локализацией. Он конкурентно взаимодействует с ДНК, играет роль в регуляции транскрипции генов (Моеппег е1 а!., 1999). Нуклео-тидная последовательность гена ангиогенина расшифрована и не содержит интронов (КигасЫ е1 а1., 1985), что делает его удобным для генноинженер-ных работ. Комплементарная ДНК ангиогенина человека клонирована и секвенирована (Незнанов и др., 1990).

Аналогичным образом нами осуществлялась полупрепаративная наработка рекомбинантных плазмид ФРФ 101 и ФРФ 103, содержащих гены фактора роста фибробластов, и плазмиды РИЕР-РБ (содержит ген белкового фактора роста сосудов из оболочки вируса ВИЧ). Наработку рекДНК производили в газо-вихревых биореакторах типа "Биок" (Кислых и др., пат. США, № 4259449, 1981г.; пат. ФРГ, № 2940446, 1982г.) с рабочим обьёмом 5 и 10 литров.

Несмотря на то, что основные конструкции биореакторов в течение многих лет радикально не изменялись, требования к культуральному оборудованию с каждым годом всё повышаются, так как культивирование клеток для производства значительных количеств биологически активных продуктов требует интенсификации процессов культивирования при тонкой регулировке биомеханической системы.

Применяемый нами для производства рекДНК новый ферментёр «Биок» объединяет в себе ряд преимуществ (Кислых и др., 2000):

1. Возможность регуляции и изменения объёма заполнения ферментёра в процессе работы от 90 % до 10 % с сохранением заданных параметров.

2. Отсутствие травмирующих клетки микровихрей при интенсивном перемешивании (в связи с отсутствием механического активатора).

3. Трёхмерное перемешивание по всему объёму, обеспечивающее в 3-6 раз более интенсивный массообмен.

4. Частичное гашение пенообразования верхним воздушным потоком

5. Экономия электроэнергии, поскольку воздушная мешалка не встречает на своём пути серьёзного сопротивления воздуха.

Основным рабочим узлом ферментёра "Биок" является принципиально новая аэродинамическая мешалка с магнитным, экранированным от внешней среды, приводом. Конструкция мешалки гарантирует абсолютную стерильность (за счёт магнитных муфт устранена необходимость герметических сальников).

В основу работы воздушного активатора заложен принцип массоперено-са в жидкой фазе одновременно в трёх направлениях: круговом, вертикальном и прецизионном (под углом). Перемешивание жидкой фазы происходит под действием постепенного закручивания вращающимся потоком воздуха верхнего слоя водной фазы (Рис. 1).

вихревом биореакторе «Биок» (Кислых и др., 2000; Мертвецов и др., 2002).

Ферментёр «Биок» стерилизуется вместе с присоединёнными к нему воздушными фильтрами и патрубками текущим паром в течение часа. Простоту обращения с ними можно приравнять к обычной лабораторной методике. Посевной материал получали, трансформировав рекомбинантными плазми-дами с клонированным геном человека, бактериальные штаммы Е. coli JM 109. Культуры продуцентов после ночной инкубации, выращивали на питательной среде LB (V= 100 мл) в колбе на шейкере при температуре 37° С в течение 12 часов, что соответствовало оптической плотности инокулята 3,0 оптических единицы, при длине волны 590 нм. Культивирование продуцен-

%

£

™

а

та рекомбинантных плазмид осуществляли на питательной среде LB. После приготовления питательную среду стерилизовали текущим паром в течение 60 мин. В предварительно автоклавированный вихревой биореактор вводили: стерильную питательную среду (LB), антибиотик ампициллин и посевной материал (E.coli JM 109). Включали электронный блок управления процессом культивирования. Расход воздуха на аэрирование составлял 0,2 л/л среды в минуту (Кафаров и др., 1979; Виестур и др., 1980). При отработке режима культивирования биомассы продуцента варьировались: число оборотов механического активатора, генерирующего вихревое движение воздуха над поверхностью суспензии клеток (от 1600 до 2300 об/мин) и объём питательной среды в биореакторе от 3,5 до 5 литров. В процессе роста биомассы в выносных пробах измеряли рН культуральной среды от начального - 7,4 до конечного - 6,0.

оп590

Время культивирования,мин

Рис. 2. График роста штаммов Е.соН 1М109, несущих различные реком-бинантные плазмиды ДНК с клонированными генами ангиогенина человека: 1 - плазмида рАп§1 (вектор рС БЫАЗ); 2 - плазмида рАгщ2 (вектор рС1-пео); 3 - плазмида рАгщЗ (вектор рС1).

Результаты измерений приведены в табл. 1 и на рис. 2. В табл. 1 во второй строке каждого столбца указан объём питательной среды в биореакторе. В последней строке каждого столбца указан вес биомассы продуцента после центрифугирования. На Рис. 2 по оси абсцисс отложено время от начала культивирования, по оси ординат оптическая плотность среды для каждой культуры. Рост биомассы продуцентов гибридных плазмид начинался практически сразу после включения блока поддержания режима культивирования, т. е. с незначительным лаг-периодом. Из табл. 1 видно, что оптическая плотность для каждой культуры в конце ферментации заметно ниже (1,422,14 в таблице), чем в известных из публикаций данных. Это может быть связано с влиянием центробежной силы на агглютинацию бактерий.

Таблица 1

Наработка продуцентов плазмидной ДНК с клонированными генами ангиоге-нина человека в штаммах Е. coli JM 109

Плазмида pAngl Плазмида pAng2 Плазмида pAng3

Объем среды 5000 мл Объем среды 3500 мл Объем среды 3500 мл

Интервал ремени (мин.) Оптическая плотность (ед.) Интервал времени (мин.) Оптическая плотность (ед.) Интервал времени (мин.) Оптическая плотность (ед.)

0 0.22 0 0.18 0 0.26

30 0.36 65 0.64 60 0.36

60 0.5 125 1.0 120 0.5

120 0.82 185 1.56 180 0.72

180 1.08 275 1.4 240 1.01

240 1.26 305 1.52 270 1.14

300 1.44 335 1.65 300 1.22

330 1.54 365 1.83 330 1.32

360 1.66 395 2.00 360 1.38

390 1.78 425 2.14 375 1.42

Выход биомассы 18.9 г Выход биомассы 11.5 г Выход биомассы 8.7 г

Количество ДНК 20 мг Количество ДНК 18 мг Количество ДНК 19 мг

Кол-во ДНК с 1-го грамма биомассы 1,06 мг Кол-во ДНК с 1-го грамма биомассы 1,6 мг Кол-во ДНК с 1-го грамма биомассы 2,17 мг

После окончания процесса культивирования биомассу отделяли от питательной среды центрифугированием при 3000 об/мин в течение 20 минут и хранили при -20 0 С до момента лизиса и выделения плазмиды. Затем производили выделение и очистку рекДНК с применением ПС1 (Мазин и др., 1990; БашЬгоок й а!., 1989) по модифицированной нами методике. Мы увеличили время инкубации, уменьшив скорости осаждения с 12000 до 5000 об/мин, необходимые для выделения и очистки рекДНК щелочным методом с использованием 1ЛС1. Модификация дала возможность перейти на боль-шеобъёмные низкоскоростные центрифуги (до 5000 об/мин) и выделять за один этап рекДНК, нарабатываемую в 5-и литровом ферментёре. По окончании культивирования и выделения плазмидную рекДНК анализировали с помощью электрофореза в 0,7%-ном агарозном геле после рестрикции соответствующими рестриктазами. Результаты электрофоретического разделения продуктов рестрикции представлены на Рис. 3. Все препараты плазмид-ной ДНК содержали вставку размером около 800 н. п., соответствующую клонированному гену ангиогенина человека (кДНК). Оценку размера вставки проводили с использованием ДНК фага X, расщеплённой по РяН -сайтам, и ДНК плазмиды рВ1ивспрШ БК, расщеплённой по МярЬсайтам. Количественную оценку ДНК проводили денситометрически.

Рис. 3. Рестрикционный анализ рекомбинантных плазмидных ДНК - рАг^1, рАг^2 и рАг^З, наработанных в газо-вихревом биореакторе "БИОК": 1,9 - РвН-гидролизат ДНК фага X (маркёр I); 2 - ДНК плазмиды рА^1; 3 - ЕсоЯ1-гидролизат ДНК плазмиды рА1^1; 4 - ДНК плазмиды рАп§2; 5 - ЕсоЯ1-гидролизат ДНК плазмиды рА1^2; 6 - ДНК плазмиды рА^З; 7 - ЕсоШ-гидролизат ДНК плазмиды рА^З; 8 -МврЬгидролизат ДНК плазмиды рЕИиевспр! (маркёр II).

Сравнив результаты наработок в полупрепаративных объёмах (Табл.1) трёх различных рекомбинантных плазмид, содержащих ген ангиогенина человека (рА^1, рАп§2 и рАг^З) с использованием различных скоростных режимов (2300; 2000 и 1600 об/мин) (Рис. 2 ,Табл. 1) мы пришли к следующим заключениям:

А) Различия в скорости роста бактериальной культуры объясняются влиянием скорости работы активатора вращения культуральной среды.

Б) Различия в соотношении количества наработанной биомассы и выделенной рекДНК объясняются, по-видимому: 1) неблагоприятным влиянием центробежных сил на копийность плазмид в клетках; 2) различиями в структурах самих плазмид.

По этим причинам мы посчитали на данном этапе работы:

1. Принять наиболее оптимальным использование режима активации вращения и перемешивания среды 1600 об/мин.

При 2300 оборотах активатора в растущей культуре (наработка плазмиды рАп£2) происходит, по-видимому, гибель клеток вследствие влияния сжимающих сил центрального вихря на культуру, повышающую свою плотность в процессе ращения. После падения оптической плотности при 2300 об/мин до 1,36 при Х=590 нм, наблюдается возобновление роста культуры при снижении числа оборотов до 2000 об/мин. Соответственно меньше составляет выход рекДНК при высоком выходе биомассы. Возможно, часть рекДНК теряется вследствие влияния центробежных сил реактора и гибели части клеток. Анализ культуральной жидкости в микроскопе показал образование конгломератов и глобул в культуральной жидкости, состоящих из больших беспорядочных скоплений клеток Е. соИ, что свидетельствует, по-видимому, о начинающейся гибели клеток. Кроме того, рН культуры резко падает до 6,0.

При использовании режима в 2000 оборотов активатора в минуту (наработка плазмиды рАгщ1) также снижается количество выделяемой рекДНК.

2. Для получения оптимального количества плазмидной ДНК, по-видимому, достаточно наращивать бактериальную культуру до оптической плотности 2,0 при Х=590 нм (наработка плазмиды рАп§2).

3. В целях получения оптимальных соотношений количество биомассы/количество выделенной рекДНК в полупрепаративных наработках целесообразно использовать режим 1600 об/мин.

Конечной оптической плотностью культуры для получения препаративного количества биомассы, содержащей рекДНК, при скорости культивирования 1600 об/мин за период времени равный 390 минут (наработка плазмиды АгщЗ) явилась плотность 1,42 при Х.=590. На основании проведенных замеров (Табл. 1, Рис. 2) при культивировании рекДНК белковых факторов рАп§1, рА1ц>2, рА^З и др., обладающих ангиогенным эффектом, можно

предполагать высокий выход продукта при таком способе препаративной наработки трансформированных в Е. coli плазмидных рекДНК.

2.2. Тестирование специфической ангиогенной активности рекДНК

Ангиогенез - это неоваскуляризация или образование новых кровеносных сосудов из уже сформированной кровеносной системы. Он наблюдается при нормальном состоянии в онтогенезе и в растущей плаценте. В случаях патологии он активируется при онкологии, восстановлении изменений и повреждений сосудов или ран, а также коллатеризации, стимулированной ишемией (Мертвецов, Стефанович, 1997). Наиболее специфичный «терапевтический ангиогенез» наблюдается при использовании белка ангиогени-на. Для проявления ангиогенной активности ангиогенина необходимы два сайта на поверхности белка: сайт связывания с клеточной поверхностью и сайт рибонуклеазной активности.

Рекомбинантный белок ангиогенин, нарабатываемый клетками кишечной палочки (Е. coli), применяется в экспериментальной медицине наряду с другими сосудостимулирующими белковыми факторами.

Наиболее распространёнными тестами на активность ангиогенных факторов являются следующие тесты: на экспериментальной ишемической лапе, на роговице глаза кролика и на хориоаллантоисной мембране развивающихся куриных эмбрионов (ХАО РКЭ).

Нами для проверки активности наработанных препаратов рекДНК был использован стандартный тест на ХАО РКЭ (Табл. 2). Из таблицы видно двукратное превышение числа сосудов во всех трёх опытах (pAngl, pAng2, pAng3) над контролем (плазмида pGEM), что говорит об ангиогенной активности препаратов рекДНК. Число сосудов подсчитывалось на площади 2 см 2. В эксперимент брали по 5мкг и по 50 мкг рекДНК на эмбрион. Отличий в действии данных количеств наносимого препарата не наблюдалось. Результаты теста просчитывались с учётом критерия Стьюдента. Таким образом, нами была наработана опытная партия биологически активных целевых продуктов рекДНК pAngl, pAng2 и pAng3 в количестве 20 мг, 18 мг и 19 мг соответственно.

Впоследствии, по этой методике нами были наработаны (Табл. 3) и оценены на наличие вставки и активность три плазмидные конструкции, сконструированные в Институте молекулярной генетики РАН (Москва), и предназначенные для тех же целей. Конструкции содержали гены таких факторов роста сосудов, как ФРФ (FGF - фактор роста фибробластов) и Pnef (сосудостимулиррующий фактор из оболочки вируса ВИЧ). Хранение и транспортировку рекДНК осуществляли в 96 % этаноле во льду или при -20 °С.

На основании проведенных измерений (Табл. 1-3) при культивировании штаммов можно сказать о хорошем выходе продукта при таком способе препаративной наработки ДНК. Количество рекДНК в 1 л культуральной

жидкости составляет 4,71 мг. Количество рекДНК в одном гамме сырой биомассы соответствует описанному в литературе для культивирования в колбах при заданных оптических плотностях (Мазин и др., 1990; БатЬгоок й а1., 1989) и соответствует 1,06-2,17 мкг/г сырой биомассы.

Полученные результаты позволяют продолжить исследования газовихревого ферментёра «Биок» и планировать создание линии лабораторных ферментёров для минибиопроизводства или большеобъёмного вихревого биореактора такого типа для наработки генноинженерных препаратов рекДНК для генотерапии.

Согласно нашим расчётам (Табл. 2-3) в мини-биопроизводстве, при регулярном использовании пяти - и десятилитровых ферментёров «Биок» можно получать с одного культивирования по 20-40 мг рекДНК. Известно, что для проведения курса лечения одного пациента необходимо 2-4 мг плазмидной рекДНК (МоШат, 2000). Таким образом, очевидно, что наработанной в ферментёре «Биок» (объёмом 5 и 10 л) за один цикл 20-40 мг плазмидной рекДНК будет достаточно для проведения курса лечения примерно 10-20 пациентов. Это в будущем может способствовать получению препаратов на основе больших количеств рекДНК.

Таблица 2

Результаты тестирования биологической активности рекДНК, содержащих ген ангиогенина человека (модель - хориоаллантоисная оболочка 9-суточного куриного эмбриона «Шавер 2000»).

Препарат Количество сосудов при прямом подсчёте

Контроль: ДНК рвЕМ 13,5 ±2,5

ДНКрАг^1 24,8 ± 2,8

ДНК рАпё2 30,3 ± 2,7

ДНКрАпёЗ 35,3 ±2,9

Итак, в результате проведенного исследования отработана технология культивирования, выделения, очистки и хранения полупрепаративных количеств плазмидной ДНК с клонированными генами сосудостимулирующих факторов в газо-вихревом биореакторе "Биок".

2.3. Разработка схемы введения рекДНК в организм новорожденных мышей линии Tg-8

Вторая часть данной работы представлена отработкой схемы введения рекДНК в организм новорожденных мышей линии Т§-8 и тестированием их по обнаруженным нами отклонениям в процессе развития. Рекомби-

нантные плазмиды экспрессирующиеся в организме млекопитающих, нарабатывают копии исходного природного белка, что говорит в пользу безопасности генетических препаратов (Жданов Р. И., и др., 2000; Montain А, 2000).

В ходе работы нами было решено разработать эксперимент по трансформации плазмидной рекДНК млекопитающих в раннем постнатальном ангиогенезе. Прямых литературных данных о влиянии ангиогенных ростовых факторов и их генетических эквивалентов на изменение веса тела в постнатальном онтогенезе животных нет. Литературные данные, послужившие для нас поводом для использования раннего постнатального онтогенеза для привнесения избытка белка ангиогенина или его генетического эквивалента в целях изучения воздействия на развитие организма следующие:

Таблица 3

Наработка препаратов рекомбинантных ДНК

РекДНК Размер плазмид без вставки (Н.П.) Размер вставки (Н.П.) Наработка РекДНК (мг) Объем культуральной среды (л) Количество рек ДНК/литр культуральной жидкости (мг/л)

pANGl (вектор рС DNA3) 5400 800 20 5 4

pANG2 (вектор рС1-пео) 5470 800 18 3,5 5,14

pANG3 (вектор рС1) 4000 800 19 3,5 5,42

ФРФ101 (вектор РС1) 4000 700 17 3,5 4,86

ФРФ103 (вектор рС1) 4000 500 17 3,5 4,86

PNEF-FS (вектор PBS-12) 5600 850 10 2,5 4

Среднее количество рекДНК/литр культуральной жидкости (мг/л) 4,71

Известно, что ангиогенез отсутствует в тканях взрослого организма. Факт ядерной локализации белков, обладающих ангиогенным эффектом (Moenner et al., 1999), позволяет сделать предположение о регуляторной роли таких белков в ходе онтогенеза. Кроме того, ангиогенные белковые факторы взаимодействуют с ядерным хроматином (Ни G.-Fu et al., 2000). Действие ангиогенных белков на рост особей после рождения (постнаталь-ный период) не изучено. В настоящее время активно исследуется стимулирующее действие факторов роста белковой природы на ранний эмбриогенез (пренатальный период) млекопитающих, в частности мышей.

Целью этой части настоящей работы было найти период и способ введения генноинженерных конструкций, при которых они будут экспрессиро-ваться в организме мышей Tg-8. В нашу задачу входило также выявить, какие изменения в организме этих мышей в процессе их развития вызовет дополнительная доза гена белка ангиогенина.

2.3.1. Физиологические особенности линии мышей линии TG-8

Работу проводили на линейных мышах Tg-8 с нокаутом гена МАО А,

любезно предоставленных нам О. Cases из Института Кюри (Institut Curie, Orsay, France), и содержавшихся в виварии Института цитологии и генетики СО РАН (Новосибирск). Это трансгенная линия мышей Tg-8 с нокаутом гена МАО А (моноаминооксидазы А), основного фермента деградации биогенных аминов (в частности серотонина). Мыши характеризовались повышенным содержанием серотонина и катехоламинов в мозгу, и по этой причине их поведение отличалось повышенной агрессивностью. Созданная французскими исследователями (Cases et al., 1995) трансгенная линия мышей Tg-8 с генетическим нокаутом гена МАО А явилась уникальной моделью для попытки обнаружения влияния на развитие организма плазмид, содержащих гены ростовых гормонов. Положительное влияние предобработки серотонином на развитие ранних зародышей мышей после криоконсервации отмечено в работе Сахаровой Н. Ю. (Сахарова и др., 1997). Кроме того, показано положительное влияние ангиогенных факторов роста - фактор роста фибробластов (ФРФ), трансформирующий фактор роста (TGF), эпидер-мальный фактор роста (FEGF) на доимплантационное развитие зародышей (Пенков, Платонов, 1999; Сахарова и др., 2002).

2.3.2. Тестирование препаратов рекДНК гена ангиогенина человека на мышах линии TG-8

Каждая серия экспериментов была поставлена на пометах мышей от двух-трёх самок. Мы использовали наработанные нами в полупрепаративных количествах рекомбинантные плазмиды pAng2 со вставкой гена ангиогенина для доставки их в организм мышей Tg-8. Такие рекомбинантные плазмиды со встроенным геном ангиогенина способны обеспечить их экспрессию в развивающемся организме мышей Tg-8, поскольку они содержат промотор цитомегаповируса.

Мышам двухсуточного возраста весом 2,0±0,2 г внутрибрюшинно вводили в объёме 100 мкл физиологического раствора на грамм веса тела следующие препараты:

1) рекомбинантную ДНК рА^, содержащую клонированный ген ангио-генина (кДНК клонирована в плазмиде РС1-пео) в дозе 7,5 мкг/г массы тела (опыт); 2) плазмидную ДНК без гена ангиогенина (ДНК РС1-пео) в дозе 7,5 мкг/г массы тела; 3) очищенный рекомбинантный ангиогенин человека (Кислых и др., 2000) в дозе 0,75 мкг/г массы тела; 4) Контролем служили мыши, получавшие физиологический раствор по 100 мкл/г веса и интактные мыши, не получавшие препаратов.

Измерение массы тела мышей производили в возрасте 28 и 40 суток, когда животные вели самостоятельный образ жизни (у них уже были реализованы антигравитационная поза и локомоция) (Розанова и др., 1972). Статистическая обработка проводилась с применением ^критерия Стьюдента для оценки уровня значимости различий между изучаемыми параметрами.

2.3.3. Влияние рекомбинантной ДНК на постнатальный онтогенез в результате эффекта временного увеличения дозы гена ангиогенина

Данные (табл. 4) свидетельствуют о том, что происходящее с возрастом увеличение массы тела мышей Тд-8 находится в зависимости от введенных им в постнатальный период генноинженерных конструкций.

Таблица 4

Изменение массы тела (М±ш) при внутрибрюшинном введении мышам линии Tg-8 препаратов рекомбинантной ДНК и ангиогенина в раннем постнатальном онтогенезе

Варианты инъекций Возраст животных (сутки) Прирост массы тела мышей Тя-8 от 28- до 40-сут. %

28 40

Контроль (интактные) 8,70±0,13 (5) 13,63±0,73# (3) 57

Физиологический раствор 9,46±0,54 (13) 13,32±0,68#(13) 40

Рекомбинантная ДНК, содержащая клонированный ген ангиогенина (ДНК рАп£) 4,70±0,21* (6) 6,30±1,6*(4) (34) Нет достоверного прироста (р>0,05)

Плазмидная ДНК без гена ангиогенина (РС1-пео) 6,78±0,13*(8) 10,2±0,34*#(7) 50

Очищенный рекомбинантный ангиогенин человека (Авд) 6,46±0,20*(12) 8,03±0,26*#(12) 24

Примечание: В скобках указано число животных; *-р<0,001 по сравнению с контролем, #-р<0,001 по сравнению с 28-суточными мышами.

Введение двухсуточным мышам Т§-8 рекомбинантной ДНК (ДНК рАпё2), содержащей клонированный ген ангиогенина (кДНК), вызывает резкое торможение их роста, о чем свидетельствует отсутствие достоверного прироста массы тела с 28-х по 40-е сутки жизни (р > 0,05) в то время как в контроле прирост массы тела мышей Тё8 с 28-х по 40-е сутки жизни составил 57%.

Введение двухсуточным мышам Тё-8 плазмидной ДНК без гена ангиогенина (ДНК РС1-пео) не сопровождалось достоверным изменением прироста массы тела, поскольку с 28-х по 40-е сутки прирост массы тела у этих животных составил 50%, а у контрольных, как отмечено выше, 57%.

Введение двухсуточным мышам Тё-8 очищенного белкового препарата рекомбинантного ангиогенина человека вызывало существенное торможение прироста

массы тела по сравнению с контролем, поскольку у мышей Т§-8 с введением рекомбинантного ангиогенина человека прирост массы тела в указанный период жизни составил всего 24%, существенно отличаясь от прироста массы тела у контрольных мышей Tg-8 (р<0,001).

Введение физиологического раствора существенного воздействия на рост мышей Tg-8 не оказывало.

В ходе эксперимента стало ясно, что: 1) экспрессия рекДНК в раннем постнатальном ангиогенезе обнаруживается, 2) экспрессию гена ангиогенина можно обнаружить по измененной массе тела мышей линии Tg-8.

Полученные данные указывают на то, что повышенный уровень ангиогенина и его гена на ранних стадиях развития организма оказывает тормозящее действие на увеличение массы тела. Наблюдаемый эффект связан скорее всего с ингибирующим действием избытка белка ангиогенина и его гена на гормон роста соматотропин в период развития организма.

Хотя эффект уменьшения массы тела в результате эксперимента и не соответствует избытку серотонина (у этой линии мышей) и избытку привнесённого в ходе эксперимента ростового фактора (Сахарова и др., 1997), но эффекты сдвига гормонального баланса на более ранних (пренатальных) и более поздних (постнатальных) стадиях развития могут существенно различаться и зависят от дозирования рекДНК гормонального препарата.

Кроме того, как описано в статье (Моеппеге! а1., 1999), белки с ядерной локализацией конкурентно взаимодействуют с важным регулятором количества РНК в клетке РНК-азином. РНК-азин инактивирует РНК-азы клетки, способствуя тем самым накоплению РНК, а значит и усилению трансляции клеточных белков. Возможно, эффект угнетения роста усиливается или определённым образом сопряжён с тем фактом, что ангиогенин, привнесенный извне, (в виде белка или в виде клонированного гена) начинает инактивиро-вать РНК-азин, связываясь с ним, что ведет к увеличению активности РНК-аз и, как следствие, к разрушению ими собственных клеточных РНК. Это

явление, посредством угнетения синтеза белка ослабляет пролиферацию клеток, участвующих в онтогенезе, тормозит рост животных. К тому же ан-гиогенин сам является специфической РНК-азой, что лишь усиливает эффект.

По-видимому, избыток ангиогенина способствует усилению пролиферации клеток проводящих путей (клетки стенок кровеносных сосудов), клеток фильтрующих органов (печень) и раковых клеток. Как известно, именно такие клетки и являются основными производителями и потребителями ангиогенина (Мертвецов, Стефанович, 1977). В то же время могут угнетаться процессы деления клеток, причастных к онтогенезу животных, в том числе и посредством ингибирования гормона роста соматотропина.

Надо отметить, что с течением времени мыши, которым вводили рекДНК ангиогенина, достигли размеров взрослых животных и дали потомство. Действие плазмиды в наших опытах носило временный характер. Литературные данные также отмечают временность действия рекомбинантных плазмид (МоШат, 2000). Ингибирующее действие белка и гена ангиогенина на рост особей линии Tg-8, скорее всего, носит стадиеспецифичный и временный характер. Таким образом плазмидная ДНК, содержащая ген ангиогенина в раннем постнатальном онтогенезе мышей линии Т£-8 имеет явный эффект воздействия, что говорит об активности плазмид и их большей устойчивости в этот период, когда собственная иммунная система ещё не развита.

Результаты нашего эксперимента показывают не только активность препаратов рекДНК, но и необходимость дозирования генов ростовых белковых препаратов, имеющих ядерную локализацию при генотерапевтических корректировках врождённых дефектов в периоды развития организма.

Выводы

1. Разработан способ и отработаны параметры суспензионного культивирования бактерий Е. coli в газо-вихревом биореакторе «Биок» для получения полупрепаративных количеств рекомбинантных плазмид, содержащих клонированные к ДНК.

2. С целью перехода на полупрепаративные количества рекДНК модифицирована методика выделения, очистки и хранения полупрепаративных количеств рекомбинантных ДНК, содержащих клонированные гены факторов роста кровеносных сосудов.

3. В результате тестирования биологической активности наработанных рекомбинантных ДНК на ХАО РКЭ показано, что плазмидные ДНК с клонированными генами ангиогенина обладают выраженной биологической активностью.

4. Опробована схема доставки клонированных генов млекопитающих (кДНК) в раннем постнатальном онтогенезе мышей. Исследовано влияние рекомбинантных ДНК, содержащих клонированные гены ангиогенина, на рост мышей линии Tg-8 при введении их в раннем постнатальном периоде. Установлено двукратное торможение роста развивающихся мышей.

Автор выражает благодарность:

Доктору технических наук Кислых Василию Ивановичу за ценные советы и помощь в проведении экспериментов по наработке рекомбинантных ДНК в газо-вихревых биореакторах «Биок».

Доктору биологических наук Войтенко Нинель Николаевне за ценные советы и организацию физиологических экспериментов по изучению биологической активности рекомбинантных ДНК в раннем постнатальном онтогенезе.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

2.

3.

4.

5.

6.

Мертвецов Н. П., Тарантул В. 3., Дударев А. Н., Кислых В. И., Рамаза-нов Ю. А., Гуткина Н. И., Хайдарова Н. В., Галахарь Н. А., Уфимцева Е. Г., Гавриленко А. В., Константинов Б. А. Наработка препаративных количеств рекомбинантной ДНК, обладающей ангиогенным эффектом, в вихревом биореакторе "БИОК'У/ Биотехнология, 2001г., т.З, № 3, с. 8593.

Мертвецов Н. П., Войтенко H. Н., Дударев А. Н., Иванова Е. А., Хайдарова Н. В., Тарантул В. 3. Введение рекомбинантного ангиогенина человека на ранних стадиях постнатального онтогенеза тормозит рост мышей // Онтогенез, 2002, № 6, с. 461-464.

Мертвецов Н. П., Рамазанов Ю. А., Репков А. П., Дударев А. Н., Кислых В. И. Газо-вихревые биореакторы «Биок». Использование в современной биотехнологии // Новосибирск, Наука, 2002 г., 117 с. Мертвецов Н. П., Дударев А. Н., Часовских М. И., Ватолин Г. Ю. Плаз-мидные ДНК как потенциальные инструменты генотерапии // Международный симпозиум «Стресс и экстремальные состояния», Кара-Даг, Феодосия (Крым), Украина, 2002, с. 106-107.

Мертвецов Н. П., Рамазанов Ю. А., Кислых В. И., Дударев А. Н., Тарантул В. 3., Хайдарова Н. В., Свердлов Е. Д., Вихревой биореактор «Биок». I. Опыт культивирования штамма Е. coli BL 21 (DE3) pZZSA, продуцирующего рекомбинантный ангиогенин человека. II. Наработка препаративных количеств рекомбинантной ДНК, обладающей ангиогенным эффектом // Бюлл. Биол, Малайзии (англ). 2003, в печати. Mertvetsov N. P., Tarantul V. Z., Dudarev A. N., Kislykh V. I., Ramasanov Y. A., Gutkina N. J., Khaidarova N. V., Galahar N. L., Ufimzeva E. G., Gavrilenko A. V., Konstantinov B. A. Production of recombinant DNA with angiogenic effect in adequate quantity for préparations in vertical bioreactor «BIOC» // Biotechnology, 2003, in press.

Соискатель

АЛ. Дударев

Зак. 35. Тир. 100. Печ. л. 1,0. Формат 60x84/16. Бумага офсетная.

Типография СО РАМН, Новосибирск, ул. Акад. Тимакова, 2/12,2003 г.

I

»

1(25"^ №1125 6

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Дударев, Алексей Николаевич

Список принятых сокращений

Введение

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Новые подходы в генотерапии. Рекомбинантные ДНК как инструменты переноса генов и потенциальные лекарственные ф препараты

1.1.1. Преимущества и недостатки молекулярных структур, переносящих гены

1.1.2. "Терапевтический ангиогенез" как часть генотерапии

1.2. Ангиогенез

1.2.1. Ангиогенин и его роль в ангиогенезе: функциональная активность, генетическая и белковая структура

1.2.2. Гомеобоксные гены белковых ростовых факторов и регуляторная роль их белков в процессах морфогенеза и ангиогенеза

1.3. Ранний постнатальный онтогенез как чувствительная модель для генотерапевтических воздействий (переноса клонированных генов)

1.4. Биореакторы в современной микробиологии и биотехнологии (сравнительный аспект)

1.5. Теоретическое обоснование процесса вихревого принципа 43 ферментации

Введение Диссертация по биологии, на тему "Плазмидные ДНК со вставкой гена ангиогенина как потенциальные инструменты для генотерапии"

Новая область науки - генотерапия - возникла как интегральное развитие биотехнологии, генетики и медицины. За последнее десятилетие в развитых странах мира значительно возрос интерес к генотерапии. Причина такого интереса заключается в том, что генотерапия обещает революционизировать медицину, лечить не следствие, а причину болезни. Ранее результаты клинической эффективности генотерапии были определены, как слабо управляемые и недостаточно безопасные. Впоследствии удалось перейти от опасных вирусных векторов, интегрирующихся в геном млекопитающих и человека, к невирусным плазмидным ДНК (Баранов и др., 2000; Горбунова, Баранов, 1997).

Плазмидные «чистые» рекДНК после введения в организм существуют в нём недолгое время (1-1,5 месяца), успевают экспрессировать нужный ген, стоящий под запускающим экспрессию в организме млекопитающих промотором и разрушаются. Такое их непродолжительное существование в организме даёт временный адресный эффект. Надо сказать, что за последнее десятилетие генотерапевтическое лечение (раковые заболевания, инфекционные заболевания, ревматоидные артриты, наследственные нарушения нервной системы, заболевания сердечно-сосудистой системы, послеоперационное восстановление тканей, заживление трофических язв) в Европе и Америке прошло около 3 тысяч волонтёров (Моп1ат, 2000). Большинство клинических наблюдений у пациентов, прошедших курс генотерапевтического лечения, сделаны благодаря использованию генов белков факторов роста кровеносных сосудов (ангиогенина и подобных ростовых факторов), способных вызывать пролиферацию определённых клеток (в частности, ангиогенез).

Ангиогенез, - это неоваскуляризация или образование новых кровеносных сосудов из уже сформированной кровеносной системы. Он наблюдается при нормальном состоянии организма в постнатальном онтогенезе и в случаях восстановления патологических изменений и повреждений сосудов или ран, а также коллатеризации, стимулированной ишемией. Известно, что ангиогенез практически полностью отсутствует в тканях взрослого организма. Это многоступенчатый процесс формирования кровеносных сосудов, связанный с серией скоординированных биохимических реакций. Ангиогенез состоит из ряда отдельных взаимосвязанных этапов, реализуемых на клеточном и биохимическом уровнях (Мертвецов, Стефанович., 1997).

До недавнего времени клинические способы регуляции роста кровеносных сосудов ограничивались лишь подавлением ангиогенеза с целью предотвращения образования, роста и метастазирования раковых опухолей. Однако в последнее время локальную стимуляцию ангиогенеза стали применять для лечения ишемических заболеваний миокарда и конечностей человека, а также диабетических язв и при заживлении ран (Baumgartner et al., 1998; Giordano et al., 1996). В связи с этим в последнее время наиболее активно развивается такое направление генотерапии, как «терапевтический ангиогенез». «Терапевтический ангиогенез» и перенос генов факторов роста сосудов в клетки тканей млекопитающих (трансгенозис) - актуальная проблема современной биологии и медицины. Для исследовательских целей в области «терапевтического ангиогенеза» применяют тест-системы на биологических объектах.

В качестве тест-системы для оценки биологической активности белка ангиогенина, нередко используют хориоаллантоисную мембрану (ХАО) развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ) (Denefle et al., 1987).

В нашей работе было решено применить аналогичную схему, тестируя экспрессирующиеся в организме млекопитающих генетические конструкции, содержащие клонированные гены. Предполагалось, что в случае активности рекомбинантной ДНК (рекДНК) результаты могут оказаться близки по степени ангиогенеза белковым тестам, проводимым ранее в нашей лаборатории (Кислых и др., 2000), или иметь положительную направленность.

На сегодняшний день наработка полупрепаративных количеств рекомбинантной плазмидной ДНК в мире в основном ведётся по стандартной методике на шейкерах в колбах. Эффективность при этом низка. В то же время на проведение курса лечения одного пациента необходимо использовать 4-8 мг рекДНК, что снижает интерес к такому лечению из-за высокой стоимости препарата, произведенного по старой методике (Жданов и др., 2000; Montain, 2000). Для наработки рекомбинантной плазмидной ДНК в Е. col. мы решили использовать газо-вихревые биореакторы типа «Биок» (Кислых и др., 2000). К такому решению проблемы мы пришли потому, что эти ферментеры работают при любом заполнении, стерилизуются текущим паром и позволяют менять скорость вращения и объём культуры во время работы. Простоту работы с их использованием можно приравнять к обычной лабораторной методике.

Используя низкоскоростные многолитражные центрифуги, можно работать с большими объёмами культуральной жидкости, выделяя биомассу бактерий. В дальнейшем мы предполагали модифицировать щелочную методику выделения ДНК и литиевую доочистку ДНК (Мазин и др., 1990; Sambrook et al., 1989) и уменьшить скорость центрифугирования. Таким образом, мы предполагали получать очищенные препараты рекДНК в больших количествах на низкоскоростных, но крупногабаритных центрифугах. Поскольку в стандартных методиках при выделении рекДНК, не теряя своих свойств, проводится через отмывку 96 % этанолом, то видимо этот этап можно было бы использовать для её стерилизации, хранения и доставки к месту назначения. Таким образом, весь процесс от создания генетических конструкций до испытания их активности можно было бы вести в одном специализированном исследовательском центре, в котором будут соблюдаться необходимые стандарты и условия стерильности.

Во взрослом организме ангиогенез в норме практически отсутствует по причине реализации в тканях регулирующего онтогенез механизма (Мертвецов, Стефанович., 1997). Мы учитывали, что генотерапевтические конструкции плазмид, несущие клонированные гены (в том числе ген ангиогенина) успешно функционируют в эукариотических организмах и используются для лечения заболеваний, связанных с необходимостью временного увеличения дозы гена в органах и тканях. Механизм экспрессии таких плазмид в организме, причину их непродолжительного существования там, а также место локализации (клеточное ядро или цитоплазма) установить пока не удаётся. Плазмиды не содержат в своем составе генов, кодирующих вирусные белки, и поэтому более безопасны. По той же причине они не защищены от действия нуклеаз клеток и плазмы организма. Тем не менее, они функционируют в тканях млекопитающих (Баранов, Баранов 2000; Baumgartner et al., 1998). Ядерная локализация генов ангиогенина и других ангиогенных белковых факторов предполагает регуляторную роль таких белков в ходе онтогенеза (Moenner et al., 1999; Hu G.-Fu et al., 2000). Нами было решено разработать эксперимент на новорожденных мышах с целью испытать определённую генноинженерную конструкцию на предмет возможной трансформации и последующей экспрессии в развивающемся организме мышей.

Целью диссертационной работы являлась разработка методов для препаративной наработки, очистки и тестирования генотерапевтических генноинженерных конструкций, содержащих клонированные гены ангиогенных ростовых факторов человека. Основными задачами работы были следующие:

1. Отработка метода получения биомассы бактерий Е. coli JM 109, содержащих рекомбинантные ДНК, с клонированными генами млекопитающих в газо-вихревых биореакторах "Биок".

2. Наработка и очистка экспериментальных полупрепаративных количеств рекомбинантных ДНК, предназначенных для экспериментов в области генотерапии.

3. Тестирование активности генноинженерных плазмидных конструкций, содержащих клонированные гены ангиогенина человека на модели хориоаллантоисной мембраны развивающихся куриных эмбрионов (ХАО РКЭ) и в раннем постнатальном онтогенезе линейных мышей.

4. Исследование возможности разработки оригинальной схемы для переноса клонированных генов в постнатальном онтогенезе линейных мышей.

Ф Научная новизна работы:

1. Создана система культивирования в газо-вихревых биореакторах "Биок" для наработки биомассы бактерий Е. coli, содержащих рекомбинантныеДНК, а также выделения из неё рекДНК с клонированными генами человека.

2. Разработана оригинальная схема эксперимента по переносу генов, заключённых в рекомбинантных плазмидных конструкциях, в раннем постнатальном онтогенезе мышей для генотерапевтических воздействий.

Практическая ценность: 1. Разработанные способы культивирования, выделения и очистки рекДНК, содержащих клонированные гены животных и человека, позволяют получать полупрепаративные количества рекДНК для использования в генотерапии.

2. Разработанная схема переноса клонированных генов в раннем постнатальном онтогенезе мышей представляет практическую ценность для реализации генотерапевтических конструкций в тканях млекопитающих.

На защиту выносятся следующие основные положения:

1. Разработан способ суспензионного культивирования бактерий Е coli в газо-вихревом биореакторе "Биок" для получения полу препаративных количеств рекомбинантных ф плазмид, содержащих кДНК ангиогенина человека.

2. Модифицирована и апробирована методика выделения, очистки и хранения полупрепаративных количеств рекомбинантных плазмидных ДНК, нарабатываемых в газо-вихревом биореакторе "Биок".

3. Тестирование рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих ген ангиогенина человека на хориоаллантоисной мембране развивающихся куриных эмбрионов (ХАО РКЭ), свидетельствует об их биологической активности.

4. Генноинженерные конструкции, введённые мышам на второй день после рождения (голая рекомбинантная ДНК, содержащая клонированный ген ангиогенина человека), влияют на постнатальный онтогенез мышей линии Tg-8, значительно тормозя их рост с 28 по 40 день ф послеутробного развития. Период раннего постнатального онтогенеза (вторые сутки) показал себя чувствительным к влиянию рекомбинантной ДНК ангиогенина человека. Таким образом, впервые отработана схема переноса генов плазмидных рекДНК в ткани млекопитающих в раннем постнатальном онтогенезе.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Дударев, Алексей Николаевич

Выводы

1) Разработан способ и отработаны параметры суспензионного культивирования бактерий Е. coli в газо-вихревом биореакторе «Биок» для получения полупрепаративных количеств рекомбинантных плазмид, содержащих клонированные кДНК.

2) С целью перехода на полупрепаративные количества рекДНК модифицирована методика выделения, очистки и хранения полупрепаративных количеств рекомбинантных ДНК, содержащих клонированные гены факторов роста кровеносных сосудов.

3) В результате тестирования биологической активности наработанных рекомбинантных ДНК на ХАО РКЭ показано, что плазмидные ДНК с клонированными генами ангиогенина обладают выраженной биологической активностью.

4) Опробована схема доставки клонированных генов млекопитающих (кДНК) в раннем постнатальном онтогенезе мышей. Исследовано влияние рекомбинантных ДНК, содержащих клонированные гены ангиогенина, на рост мышей линии Tg-8 при введении их в раннем постнатальном периоде. Установлено двукратное торможение роста развивающихся мышей.

Автор выражает благодарность:

Доктору технических наук Кислых Василию Ивановичу за ценные советы и помощь в проведении экспериментов по наработке рекомбинантных ДНК в газо-вихревых биореакторах «Биок».

Доктору биологических наук Войтенко Нинель Николаевне за ценные советы и организацию физиологических экспериментов по изучению биологической активности рекомбинантных ДНК в раннем постнатальном онтогенезе.

Заключение

Становится ясным, что генотерапия сердечно-сосудистых заболеваний в скором будущем может прочно утвердится в мире как отдельная научно-практическая отрасль медицины. Можно предположить, что для этого потребуется развитие таких её направлений, как:

1) Совершенствование материально-технической базы с целью получения препаратов для клинических испытаний и внедрения их в медицину. Совершенствование приборов для наработки клеточных биомасс, содержащих рекДНК (в том числе и гены ростовых факторов). Это означает возможный переход к новым более удобным в использовании ферментёрам лабораторного типа с более мягким режимом ферментации, каким является газо-вихревой биореактор «Биок».

2) Совершенствование плазмидных конструкций для переноса генов за счёт специфических фрагментов генома, усиливающих экспрессию в организме и повышающих продолжительность экспрессии и время существования плазмид после введения в организм.

3) Разработка новых тест-схем (возможно, как в нашем случае, в раннем постнатальном онтогенезе) на лабораторных животных для проверки активности рекомбинантного генетического материала, его безопасности в период развития организма и интенсивности его экспрессии.

4) Постепенный переход к доклиническим испытаниям рекДНК для успешного внедрения в практику таких препаратов, произведенных на основе новых технологий.

Такое важное направление, как генотерапевтические технологии, безусловно, имеет немало неисследованных и спорных аспектов. Но потеря приоритетов в этой области сейчас в дальнейшем может поставить в зависимость от развития иностранных технологий. Работы нашей и других российских и зарубежных лабораторий - это лишь начало усиливающегося процесса, имеющего серьёзную перспективу.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дударев, Алексей Николаевич, Новосибирск

1. Баранов В. С., Баранов А. Н. Генная терапия моногенных наследственных болезней. Миодистрофия Дюшена // Вопросы медицинской химии, 2000, т. 46, № 3, с. 279-292.

2. Баранов В. С., Баранова Е. В., Иващенко Т. Э., Асеев М. В. Геном человека и гены «предрасположенности». (Введение в предиктивную медицину) // СПб, «Интермедика», 2000, 272 с.

3. Богданенко Е. В., Свиридов Ю. В., Московцев А. А., Жданов Р. И. Адресная доставка функциональных генов в генотерапии с помощью углерод содержащих векторов // Вопросы медицинской химии, 2000, т. 46, № 3, с. 226-245.

4. Бузников Г. А. Нейротрансмиттеры в эмбриогенезе // М.: Мир, 1987, 230 с.

5. Виестур У. Э., Кристансонс Н. Ж., Былинкина Е. С. Культивирование микроорганизмов // М.: Пищевая промышленность, 1980, 230 с.

6. Воробьёв И. Д., Кислых В. И., Харченко В. А., Массообмен в клеточном культиваторе "Биоколь" // Гидродинамика и процессы переноса в биореакторах. Сб. под ред. Р. С. Горелика / Ин-т теплофизики, Новосибирск, 1989, с. 35-40.

7. Гилберт С. Биология развития // 1993, т. 1, 288 с.

8. Гилберт С. Биология развития // 1995, т. 3, 352 с.

9. Горбунова В. Н., Баранов В. С. Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний // Спец. Литература, 1997, 287 с.

10. Жданов Р. И., Семенова Н. В., Арчаков А. И. Реальности и надежды генотерапии // Вопросы медицинской химии, 2000, т. 46, № 3, с. 197-206.

11. Кафаров В. В., Винаров А. Ю., Гордеев Л. С. Моделирование биохимических реакторов // М: Лесная промышленность, 1979, 344 с.

12. Кислых В. И., Репков А. П., Рамазанов Ю. А., Воробьёв И. Д. Аппарат для суспензионного культивирования клеток тканей и микроорганизмов // Пат. России, № 2099413, опубл. 20. 04.97.

13. Кривцов Г. Г., Жданов Р. И. Адресная доставка функциональных генов в генотерапии с помощью углерод содержащих векторов // Вопросы медицинской химии, 2000, т. 46, № 3, с. 246-255.

14. Маркина Л. С. Микробиологическая промышленность за рубежом. Экономика, рынок, конъюнктура. Обзор // Новосибирск, НПО "Вектор", 1989, 33 с.

15. Маслова Л. Н., Науменко Е. В. О роли глюкокортикоидов в модификации гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной функции у крыс, вызванной стрессорными воздействиями в раннем онтогенезе // Рос. физиол. журн. им. И. М. Сеченова, 1997, т. 83, № 8, с.80-86.

16. Мертвецов Н. П., Стефанович Л. Е. Ангиогенин и механизмы ангиогенеза // Новосибирск: Наука, 1997, 77 с.

17. Мертвецов Н. П., Рамазанов Ю. А., Репков А. П., Дударев А. Н., Кислых В. И. Газо-вихревые биореакторы «Биок». Использование в современной биотехнологии // Новосибирск, Наука, 2002, 117 с.

18. Незнанов Н. С., Макарова И. В., Крамерова И. А., Бендукидзе К. А., Божков В. М., Газарян К. Г. Ген ангиогенина представлен несколькими копиями в геномах млекопитающих // Молекулярная биология, 1990, т. 24, вып. 3, с. 709-713.

19. Парфенова Е. В., Ткачук В. А. Перспективы генной терапии сердечно-сосудистых заболеваний // Вопросы медицинской химии, 2000, т. 46, № 3, с. 293-310.

20. Пат. № 4259449, США: МКИ с. 12 5/02, опубл. 1981. (Кислых В. И., Репков А. П., Рамазанов Ю. А.)

21. Пат. № 2940446, ФРГ: МКИ с. 13 5/00, опубл. 1982. (Кислых В. И., Репков А. П., Рамазанов Ю. А.)

22. Пенков J1. И., Платонов Е. С. Влияние факторов роста фибробластов (FGF 2, FGF 4) на развитие партеногенетических эмбрионов мышей // Онтогенез, 1999, т. 30, № 6, с. 448-452.

23. Платонов Е. С., Пенков Л. И., Нью Д. А. Т. Действие ростовых факторов FGF2 и FGF2 на развитие партеногенетических эмбрионов мышей in utero и in vitro // Онтогенез, 2002, т. 33, № 1, с. 60-67.

24. Розанова В. Д. Нейрогуморальные механизмы регуляции гомеостазиса и интенсивности роста в различные возрастные периоды. Ведущие факторы онтогенеза // Под ред. В. Н. Никитина, Киев: Наукова Думка, 1972, с.232-250.

25. Рэфф Р., Коффман Т. Эмбрионы, гены, эволюция // M.: Мир, 1986, 400 с.

26. Сахарова Н. Ю., Маркова J1. Н., Лепихов К. А. Положительное влияние предобработки серотонином и гликозидами на развитие ранних зародышей мышей после криоконсервации // Онтогенез, 1997, т. 28, с. 125-131.

27. Тяготин Ю. В., Коробицын Л. П., Милютина И. В., Воробьёв А. А. Гибридомная технология: сущность, проблемы и перспективы, рынок (по зарубежным данным) // Обзорная информация: М., 1984,40 с.

28. Угрюмов М. В. Механизмы нейроэндокринной регуляции // М.: Наука, 1999, 299 с.

29. Шестенко О. П., Никонов С. Д., Мертвецов Н. П. Ангиогенин и его роль в ангиогенезе // Молекулярная биология, 2001, т. 35, № 3, с. 1-23.

30. Шмидт Р., Тевс Г. Физиология человека // М.: Мир, 1996, том 2, 393 с.

31. Шугурова И. М., Бобрищева И. В., Гривенников И. А., Тарантул В. 3. Эффекты действия генов nef и tat на клетки феррохромоцитомы крысы PC 12 // Генетика, 2000, №8, т. 36, с. 1140-1146.

32. Щукин В. К., Халатов А. А. Теплообмен, массообмен и гидродинамика закрученных потоков в осесимметричных каналах // М.: Машиностроение, 1982, 200 с.

33. Asa S. L., Kovacs K., Horvath E. Electron microscopic and ultrastructural immunocitochemical analysis //Neuroendocrinology, 1988, Vol. 48, pp. 423-431.

34. Bartke A., Cecim M., Tand K. Neuroendocrine and reproductive conseguences of overexpression of growth hormone in transgenic mice // Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1994, Vol. 206, pp. 345-359.

35. Birdwell C. R., Gospodarowicz D., Nicholson G. L. Factors from 3T3 cells stimulate proliferation of cultured vascular endothelial cells //Nature, 1977, Vol. 268, pp. 528-531.

36. Bischoff J. Cell adhesion and angiogenesis // J. Clin. Invest., 1997, Vol. 99, pp. 373-376.

37. Bond M. D., Strydom D. J. Amino- acid seguence of bovine angiogenin //Biochemisry, 1989, vol.28,pp. 6110-6113.

38. Bond M. D., Strydom D. J., Vallee B. L. Characterization and sequencing of rabbit, pig and mouse angiogenins: discerment of functionally important residues and regions // Biochemica et Biophysica acta., 1993, vol. 1162, pp. 177-186.

39. Brunger A. T., Brooks C. L., Karplus M. Active site dynamics of ribonuclease // Protocol National Academie Sciences of USA, 1985, vol. 82, pp. 8458-8462.

40. Chitra S., Jones P. F., Patan S., Bartunkova S., Maisonpierre P. C., Davis S., Sato T. N., Yancopulos G. D. Requisite role of angiopoetin-1 a ligand for the TIE- 2 receptor, during embryonic angiogenesis // Cell, 1996, Vol. 87, pp. 1171-1180.

41. Clair D. K. St., Rybac S. M., Riordan J. F. and Vallee B. L. Angiogenin abolishes cell-free protein syntesis by specific ribonucleolytic inactivation of ribosomes // Protocol National Academie Sciences of USA, 1987, Vol. 84, pp. 8330-8334.

42. Cohen S., Carpenter G., King L. Epidermal growth factor-receptor protein kinase interaction // Journal of Biological Chemistry, 1980, Vol. 255, pp. 4834-4842.

43. Denefle P., Kovarik S., Guitton J-D., Cartwright T. and Mayaux J-F. Chemicall synthesis of a gene coding for human angiogenin, its expression in E. coli, and conversion of the product into its active form // Gene, 1987, vol.56, pp. 66-70.

44. Desgranges C., Razaka G., Rabaud M., Picard P., Dupuch F., Bricaud H. The human blood platelet: a cellular model to study the degradation of thymidine and its inhibition // Biochem. Pharmacol., 1982, Vol. 31, pp. 2755-2759.

45. Folkman J., Klagsbrun M. Angiogenic factors // Science, 1987, Vol. 235, pp. 442-447.

46. Furcht L. T. Critical factors controlling angiogenesis: cell products, cell matrix and growth factors // Lab. Invest., 1986, Vol. 55, pp. 505-509.

47. Garcia-Aragon J., Lobie P. E., Muscat G. E. O. Prenatal expression of the growth hormone (GH) receptor/binding protein in the rat; a role for GH in embryonic and fetal development // Development, 1992, Vol. 114, pp. 869-876.

48. Gimbrone M. A. Jr., Cotran R. S, Leapman S. B., Folkman J. Tumor growth and neovascularization: an experimental model using the rabbit cornea // J. Natl. Cancer Inst., 1974. Vol. 52, pp. 413-427.

49. Givol D., Yayon A. Complexity of FGF receptors: genetic basis for structural diversity and functional specificity. // FASEB J., 1992, Vol. 6, pp. 3362-3369.

50. Gospodarowicz D. Fibroblast growth factor and its involvement in developmental processes // Curr. Top. Dev. Biol., 1990,24 pp. 57-93.• 66. Grant D. S., Kleinman H. K„ Goldberg I. D., Bhargava M. M., Nickoloff B. J., Kinsella J. L.,

51. Polverini P., Rosen E. M. Scatter factor induces blood vessel formation in vivo // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, Vol. 90, pp.1937-1941.

52. Haraguchi M., Miyadera K., Uemura K., Sumizawa T., Furukawa T., Yamada K., ^ Akiyama S., Yamada. Y. Angiogenic activity of enzymes // Nature, 1994, Vol. 368, pp. 198.

53. Heldir C. H., Westermark B. Growth factors: Mechanism of action and relation to oncogenes // Cell,1984, Vol. 37, pp. 9-20.

54. Hlodan R., Pain R. H. Tumor necrosis factor is in equilibrium with a trimeric molten globule at low pH // FEBS Lett., 1994, Vol. 343, pp. 256-260.

55. Hu G. Fu, Chang S., Riordan J. F. Human angiogenin is rapidly translocated to the nucleus of human umbilical vein endothelial cells and bind to DNA // Journal of Cellular Biochemistry, 2000, Vol. 76, pp. 452-462.

56. Hu G. Fu, Chang S. - I., Riordan J. F., Vallee B. L. An angiogenin-binding protein fromendothelial cells // Protocol National Academie Sciences of USA, 1991, vol., 88, pp. 22272231.

57. Hu G. Fu, Riordan J. F. Angiogenin enhances actin acceleration of plasminogen activation // Biochemical and Biophysical Research Communications, 1993, Vol. 197, № 2, pp. 682-687.

58. Hu G. Fu, Riordan J. F. and Vallee B. L. Angiogenin promotes invasiveness of cultured endothelial cells by stimulation of cell-associated proteolytic activates // Protocol National Academie Sciences of USA, 1994, vol. 92, pp. 12096-12100.

59. Hughes S. E., Hall P. A. The fibroblast growth factor and receptor multigene families // J. Pathol., 1993, Vol. 170, pp. 219-221.

60. Ishikawa K., Katakami H., Jansson J. O., Frohman L. A. Ontogenesis of growth hormone-releasing hormone neurons in the rat hypothalamus // Neuroendocrinology, 1986, Vol. 43, pp. 537- 542.

61. Kelly P. A. Growth hormone and prolactine // Hormones: from molecules to diseases, 1990, pp. 191-217.

62. Kimelman D., Kinschner M. Synergistic induction of mesoderm by FGF and TGF-B and the identification of an mRNA coding for FGF in the early Xenopus embryo // Cell, 1987, Vol. 51, pp. 869-877.

63. Klagsbrun M., Knighton D., Folkman J. Tumor angiogenesis activity in cells grown in tissue culture // Cancer Res., 1976, Vol. 36, pp. 110-114.

64. Koch A. E., Polverini P. J., Kunkel S. L., Harlow L. A., Di Pietro L. A., Elner V. M., Elner S. G., Strieter R. M. Interleukin-8 as a macrophage- derived mediator of angiogenesis // Science, 1992, Vol. 258, 1798-1801.

65. Kurachi K., Davie E. W., Strydom D. J., Riordan J. F. and Vallee B. L. Sequence of the cDNA and gene for angiogenin a human angiogenesis factor // Biochemistry, 1985, vol. 24, pp. 5494.5499.

66. Langer R., Folkman J. Polymers for the sustained release of proteins and other macromolecules // Nature, 1976, Vol. 263, pp. 797-800.

67. Lee F. S., Vallee B. L. Binding of placental ribonuclease inhibitor to the active site of angiogenin // Biochemistry, 1989, Vol. 28, pp. 3556-3561.

68. Lee F. S., Shapiro R., Vallee B. L. Fight- binding inhibition of angiogenin and ribonuclease A by placental ribonuclease inhibitor // Biochemistry, 1989, Vol. 28, pp. 225-230.

69. Lyman D. F., White B. A. Molecular cloning of hepatic mRNAs in Rana catesheiana response to thyroid hormone during induced and spontaneous metamorphosis // J. of Biological Chemistry, 1987, Vol. 262, pp. 5233-5237.

70. Luqmani Y. A, Graham M., Coombes R. C. Expression of basic fibroblast growth factor, FGFR1 and FGFR2 in normal and malignant human breast, and comparison with other normal tissues // Brit J. Cancer., 1992, Vol. 66, pp. 273-280.

71. Mayo K. E., Cerelli G. M., Leo R. V. Gene encoding human growth hormone- releasing factor precursor: structure, seguence and chromosomal assigment // Protocol National Academie Sciences of USA, 1985, Vol. 62, pp. 63-67.

72. Moenner M., Chauviere M., Chevaillier P., Badet J. Basic homoamino acids, histones and protamines are potent antagonists of angiogenin binding to ribonuclease inhibitor // FEB S Letters, 1999, Vol. 443, pp. 303-307.

73. Montain A. Gene therapy: the first decade // Trends in Biotechnology, 2000, Vol.18, pp. 113-127.

74. Moore F., Riordan J. F. Angiogenin activités phospholipase C and elicits a rapid incorporation of fatty acid into cholesterol esters in vascular smooth muscle cells // Biochemistry, 1990, Vol. 29, pp. 228-233.

75. Naumenko E. V., Maslova L. N. Stress in early ontogenesis and reactivity of hypothalamo-pituitary-adrenal system in adult rats // Endocrinol. Experim., 1985, Vol.19, pp.171-178.

76. Naumenko E. V. Modification in early ontogenesis of the stress response of adults // News Physiolog. Sci., 1991, Vol.6, pp. 219-223.

77. Olson K. A., Fett J. W., French T. C., Key M. E. and Vallee B. L. Angiogenin antagonists prevent tumor growth in vivo // Protocol National Academie Sciences of USA, 1995, vol. 92, pp. 442-446.

78. Olwin B. B., Hauschka S. D. Cell type and tissue distribution of the fibroblast growth factor receptor // J. Cell Biochem., 1989, Vol. 39, pp. 443-454.

79. Pohorecki R., Balduga J. New model of micromixing in chemical reactors // Ind. Eng. Chem. Fundam., 1983, Vol. 22, №4, pp.398-405.

80. Resine T. Somatostatin receptors // American Journals of Physiology, 1995, Vol. 269, № 6, pt. l,pp. G813-G820.

81. Ribatti D., Vacca A., Bertossi M., Roncali L. Anti-angiogenesis: a multipurpose therapeutic tool // Int. J. Clin. Lab. Res., 1993, Vol. 23, pp. 117-120.

82. Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T. Molecular Cioning: A Laboratory Manual // Cold Spring Harbor Laboratory Pres, NY, Vol. 1,2,3.

83. Schor A. M„ Schor S. L. Tumor angiogenesis // J. Pathol., 1983, Vol. 141, pp. 385-413.

84. Schultz G. A., Heyner S. Growth factors in preimplantation mammalian embryos // Oxf. Rev. Report. Biol., 1993, vol. 15, pp. 43-81

85. Schumacher B., Specher P., Specht B. U., Segmann T. Induction of neoangiogenesis in ischemic myocardium by human growth factors // Circulation, 1998, Vol. 97, pp. 645- 650.

86. Shapiro R., Riordan J. F., Vallee B. L. Characteristic ribonucleolytic activity of human angiogenin // Biochemistry, 1986, Vol. 25, pp. 3527-3532.

87. Soncin F. Angiogenin supports endothelial and fibroblasts cell adhesion // Protocol National Academie of USA., 1992, vol. 89, pp. 2232-2236.

88. Soncin F., Shapiro R. and Fett J. W. A cell- surface proteolgycan mediates human angiogenin // The Journal of Biological Chemistry., 1994, vol. 269, № 12, pp. 8999-9005.

89. Steinhelper M. E., Field L. J. Assignment of the angiogenin gene to mouse chromosome 14 using a rapid PCR-RELP mapping technique // Genomics, 1992, Vol. 12, pp. 177-179.

90. Tuder R. M., Floor B. E., Voelkel N. F. Increased gene expression for FGEF and the FGEF receptors KDK/Fik and Fit in lungs exposed to acute or to chronic hypoxia // Journal of Clinic Investigation, 1995, Vol. 95, pp. 1798-1807.

91. Ugrumov M. V., Mitskevich M. S. Development of neuroendocrine regulation during ontogenesis // Sov. Sci. Rev. Sec. F Physiol. Gen. Biol., 1992, Vol. 5, pp. 41-96.

92. Wein N. Non- vial vectors vor gene therapy // In Biotechnology, 1999, Vol. 5a, pp. 427- 442.

93. Weiner H. L., Weiner L. H., Swain J. L. Tissue distribution and development expression of the messenger RNA, encoding angiogenin // Science, 1987, Vol. 237, pp. 280-283.