Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование невирусных способов доставки генных конструкций для генотерапии миодистрофии Дюшенна

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Исследование невирусных способов доставки генных конструкций для генотерапии миодистрофии Дюшенна"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

И А ПРАВАХ РУ КОПИа/ /

ргй/ол

18 шк гэсэ

V

Баранов Александр Николаевич

ИССЛЕДОВАНИЯ НЕВИРУСНЫХ СПОСОБОВ ДОСТАВКИ ГЕННЫХ КОНСТРУКЦИЙ ДЛЯ ГЕНОТЕРАПИИ МИОДИСТРОФИИ ДЮШЕННА

Специальность 03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2000

Работа выполнена в лаборатории пренатальной диагностики наследственных болезней Hay1 исследовательского института акушерства и гинекологии РАМН им.Д.О.Отта

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Баранов B.C.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор В.Н.Горбунова

доктор биологических наук, профессор А.П.Персвозчиков

Ведущее учреждение: Научно-исследовательский институт Цитологии,РАН, г.С.- Петербург

Защита состоится 2000 г. в /Я часов на заседании диссертаиионног

совета Д 063.57.21 по заидате диссертаций на соискание ученой степени доктора биологически наук в Санкт-Петербургском Университете по адресу: 199034 Санкт-Петербур1 Университетская наб. 7/9, СПбГУ. биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекнш аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке Санкт-Петербургскоп государственного университета

Автореферат разослан "

2000 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Кандидат биологических наук

Л.А. Мамон

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ актуальность темы. Мышечная дистрофия Дюшенна/Беккера (МДЦ/Б) - является 1аиболее распространенным наследственным нервно-мышечным заболеванием человека. 1астота встречаемости составляет 1 на 5000 новорожденных мальчиков для мышечной [истрофии Дюшенна (МДД) и 1 на 18500 для мышечной дистрофии Беккера (МДБ). Основным линическим проявлением МДЦ/Б является прогрессиругашая мышечная дистрофия. Симптомы шодистрофии Дюшенна (МДД) начинают в возрасте 3-5 лет. К 12-15 годам пациенты с МДД еряют способность передвигаться самостоятельно. Летальный исход, как правило, наступает [з-за сердечной недостаточности либо отказа дыхательной мускулатуры в возрасте около 20 лет Partridge, 1997). В случае более легкой формы миодистрофии - МДБ, симптомы заболевания гачинают проявляться значительно позже, и больные часто доживают до 35-50 лет.

Причиной заболевания являются мутации в гене дистрофина (Koenig et al., 1987; Hoffman et 1., 1987). Основным продуктом гена в мышечных тканях является присарколеммный белок [ышечный дистрофии, выполняющий функцию связующего звена между внутренним ¡итоскелетом миофибриллы и внеклеточным матриксом. Присутствие в мембране мышечного олокна аномального белка (МДБ) или же его полное отсутствие (МДД), индуцирует ;ервичные нарушения в структурной организации и функции сарколеммы, что приводит к апуску каскадного процесса дегенерации мышц (Hoffman et al. 1987).

Отсутствие эффективного медикаментозного лечения делает актуальной разработку новых -енотерапевтических подходов к лечению миодистрофии Дюшенна/Беккера. Суть метода, аключается во введении больному конструкций с нормальным геном дистрофина, беспечивакяцим синтез полноценного белка и восстанавливающим структуру и функцию 1ышц. В экспериментах in vivo на биологических моделях МДД мышах mdx. была показана озможность возобновление синтеза дистрофина в скелетных и сердечной мышцах после нутривенного введения аденовирусного вектора с кДНК гена дистрофина человека. ( Itratford-Perricaudet et al., 1992). Кроме возобновления синтеза белка, было отмечено, что иперэкспрессия человеческого дистрофина предотвращает патологические и механические вменения поврежденных мышечных волокон без побочных эффектов.

С сожалению, кардинальных успехов в генотерапии МДД/Б пока не достигнуто (Баранов, 999). Причиной этого являются, не только гигантские размеры гена и его мРНК, но и, лавным образом, отсутствие эффективных средств доставки гена в мышцы. Системы »ставки генных конструкций, или носители, должны обеспечивать: компактизацию ДНК, :роникновение в клетки мишени, предотвращать деградацию ДНК лизосомальными )ерментами и обеспечивать ядерную транслокацию. При этом, система доставки должна ¡ыть не токсичной или иммуногенной, а входящие в ее состав компоненты быть ¡иодеградируемыми (Wilson, 1998).

Считается, что достижение терапевтического эффекта возможно при успешной трансфекции re менее 20% , а, по последним данным, даже 30-40% мышечных волокон не только скелетной 1ускулатуры, но так же мышц сердца и диафрагмы (Phelps et al, 1995). При этом основными ритериями эффективности трансфекции и терапевтического эффекта являются: появление .истрофин-положительных мышечных волокон (ДПМВ), нормализация уровня биохимических (аркеров МДД/Б, изменения физиологических параметров мышц. Высокий уровень рансфекции пока достигнут только в нескольких опытах, где кДНК гена дистрофина вводили с юмощью аденовирусного или ретровирусного векторов (Ascadi et al.,1995; Fassati et al., 1995). 1спользование вирусных носителей, однако, наталкивается на существенные методические рудности. Наибольшим препятствием к использованию вирусных векторов является «ражённый иммунный ответ на вирусные антигены. Вышеперечисленных недостатков в начительной мере лишены невирусные носители (липосомы, олигопептиды, полимеры и др.). Однако эффективность трансфекции при их использовании in vivo оказывалась очень низкой

(Turner et al., 1997). Таким образом, проблема создания и испытаний новых средст; доставки генных конструкций в мышцы продолжает оставаться актуальной проблемо1 генотерапии миодистрофии Дюшенна.

Данная работа является продолжением цикла проводимых лабораторией пренатально! диагностики ИАГ РАМН исследований, по разработке экспериментальных основ генотерапт МДД/Б и посвящена анализу результатов доставки кДНК гена дистрофина человека в мышць мышей mdx при помощи различных типов невирусных носителей генов. Цели и задачи исследования. Целью работы является поиск оптимальных методо] невирусной доставки гена дистрофина человека в мышцы mdx мышей и оценка эффект; генетической трансфекции.

Для реализации намеченной цели были поставлены следующие задачи:

1. Проанализировать эффективность экспрессии гена дистрофина человека в зависимости от Типа генных конструкций и способов их доставки в пораженные мышцы мышей mdx

2. Иммуноцитохимическими и молекулярными методами изучить эффект генокоррекции; '3. Изучить возможность системной коррекции дефекта скелетных мышц, диафрагмы и сердцг мышей mdx в условиях внутримышечного введения генных конструкций;

Научная новизна и практическая значимость.

Впервые исследованы особенности трех новых невирусных способов доставки кДНК геш дистрофина в мышцы биологических моделей МДЦ мышей mdx. Впервые показанс существование феномена "дистантной трансфекции". Открытие феномена "дистантной трансфекции" органов и тканей модельных животных открывает перспективы для системно]! терапии миодистрофии Дюшенна путем внутримышечного и внутривенного введения генотерапевтических конструкций. Впервые показана возможность прохождения синтетических полимерных микросфер с "терапевтическими" генами .... через гематоэнцефалический барьер. Впервые доказана возможность высоко эффективной ядерной доставки генных конструкций с использованием невирусного носителя. Практическая значимость. Полученные результаты могут быть использованы в качестве экспериментальной основой для разработки доклинических и первой клинической фаз испытаний геннотерапевтических конструкций для лечения миодистрофии Дюшенна. Основные положения, выносимые на защиту:

Возможность эффективной доставки кДНК гена дистрофина с помощью невирусны: носителей. Обеспечение длительной экспрессии генных конструкций, доставленных в мышш с использованием невирусных способов доставки. Возможность трансфекции различны; групп мышц просле однократного внутримышечного введения (феномен "дистантно] трансфекции"). Прохождение невирусных носителей с геными конструкциями через гемато энцефаллический барьер. Возможность эффективной ядерной доставки с использование невирусных носителей.. .

Апробация работы. Представленные в диссертации результаты были доложены на VIII итого] конференции «Геном человека-98» (Черноголовка, 1998), 30-м совещании Европейского общее по генетике человека (Лиссабон, 1998), VI совещании Европейской рабочей группы по геш терапии человека (Иерусалим, 1998), V Российском Национальном Конгрессе «Человек лекарство» (Москва, 1998), II Американском совещании по генной терапии (Вашингтон, 1999), итоговой конференции «Геном человека-99» (Черноголовка, 1999), II съезде Всероссийск общества генетиков и селекционеров (С-Петербург, 2000), II Всероссийском съезде медицине! генетиков (Курск, 2000).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 работ.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 125 страницах машинописного текста. Иллюстративный материал представлен 8 таблицами и 10 рисунками. Диссертация состоит из

следующих разделов: Введение, Обзор литературы, Материал и методы исследования, Результаты и обсуждение, Выводы. Список цитируемой литературы содержит 135 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Эксперименты по невирусной доставке гена дистрофина проводились на биологических моделях миодистрофии Дюшенна мышах линии C57B16J mdx/mdx (mdx). Исследования внутриклеточной локализации комплексов ДНК/носитель in vitro проводилось на клеточных линиях С2С12, HeLa и CTL-L2. Для трансфекдии использовались - конструкции с полноразмерной кДНК гена дистрофина человека - pHSADy и pDMDl, с кДНК мини-гена человека -pSG5dys и pCMVDyB, а также с маркерным геном LacZ - pCMVLacZ. Для поставки генетических конструкций в мышцы использовались: " генное ружье аналоги :интетических олигопептидов KS и JTS1, липофектамин и, любезно предоставленые для испытаний компанией "Биосистема XXI" (Санкт-Петербург), синтетические полимерные шгкросферы. Введение комплексов ДНК/носитель in vivo проводили путем инъекции в ктырехглавую мышцу бедра m.quadriceps f. При баллистической трансфекции, генное ружье шряжали суспензией металлических частиц с преципитатом ДНК конструкции и 1роизводили выстрел в четырехглавую мышцу бедра. Мышей забивали через различные громежутки времени после введения (от 1 до 60 дней). Выявление дистрофина человека на топеречных криостатных срезах мышц мышей mdx проводили иммуногистохимическим методом с использованием кроличьих поликлональных антител к С-терминальному участку 5елка. Процент дистрофин-положительных мышечных волокон (ДПМВ) рассчитывали по ¡¡ормуле:

_100 х Кол-во ДПМВ на срезе_

Кол-во MB в поле зрения * Кол-во полей зрения на срезе Идентификацию экспрессии маркерного гена LacZ проводили по стандартной методике с )бесцвечиванием тотальных препаратов по методу Даусона. Для анализа межтканевого )аспределения введенных генетических конструкций с кДНК гена дистрофина использовался летод полимеразной цепной реакции с олигопраймерами 52F и 53R (Chamberlain et al.,1988 , \bbs et al.,1991). Анализ экспрессии методом ОТ-ПЦР проводили на образцах тотальной РНК гзолированной из образцов мышц. Первую цепь кДНК синтезировали с праймером DMD8d , :омплиментарным 3'-концу 58 экзона гена дистрофина (Roberts et al., 1992). Анализ {ежтканевого распределения и внутриклеточной локализации комплексов ДНК/носитель фоводили методом неизотопной гибридизации in situ. Анализ внутриклеточной локализации имплексов ДНК-МР2 in vitro проводили с использованием микросфер содержащих ¡иотинилированную плазмидную ДНК. ,

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ Исследованы возможности доставки конструкций с кДНК гена дистрофина в мышцы mdx 1ышей и проведена оценка эффекта генетической трансфекции с использованием следующих [евирусных способов доставки: "генного ружья", синтетических олигопептидов, интетических полимерных микросфер

'.Анализ результатов трансфекции мыши мышей mdx кДНК гена дистрофина еловека методом баллистической трансфекции.

Метод баллистической трансфекции (БТ) основан на механическом попадании в клетки шкрочастиц золота вольфрама и платины с адсорбированными на их поверхности енетпческими конструкциями. Нами изучена возможность направленной доставки различных онструкций кДНК гена дистрофина в мышцы с помощью "генного ружья" (Колесников и др., 995).

.1.Баллистическая трансфекцня полноразмерной кДНК гена дистрофина Эксперимент был проведен на 20 самцах мышей mdx. Для БТ использовались генетические онструкции pDMDl и pHSADy. В качестве контроля использоватись интактные мыши mdx,

мыши mdx после обстрела чистыми микрочастицами без ДНК, либо мыши mdx после обстре микрочастицами с конструкцией pCMV-LacZ.

Микрофотографии поперечных срезов мышечных волокон musculus quadriceps femoris опыта и контрольных мышей после иммуно-шггохимического выявления дистрофика приведены рисунке 1. У контрольных мышей дикого типа, во всех без исключения мышечных волоки дистрофии выявлялся по внутренней поверхности сарколеммы (рисЛа). В волокнах мышей m дистрофии практически не определялся (рис.lb.) Исключение составляли единичнь "ревертантные" мышечные волокна, в которых, по-видимому, вследствие редких ошиб сплайсинга первичного РНК продукта, либо точечных мутаций в гене нормализовался проце трансляции и происходил синтез полноразмерного белка. Число таких ревертантных волокон молодых мышей mdx, находится в пределах 0.2-0.6% (табл. 1). После проведения БТ кДНК ге: дистрофию, наряду с единичными ревертантными волокнами в мышце-мише! обнаруживались крупные группы из 10-20 или более дистрофин-положительных мышечнь волокон (ДПМВ) (рис. 1с). Единичные группы ДПМВ были зарегистрированы и после I плазмидами pCMV-lacZ. В серии экспериментов БТ с конструкцией pHSADy, наряду типичными ДПМВ с присарколемной локализацией дистрофина (в дальнейшем обозначен как ДПМВ1), нередко встречались ДПМВ с гомогенной цитоплазматической локализацш белка, имеющие на поперечных срезах вид крута ( обозначены как ДПМВ2) (рис. Id).

Результаты подсчета ДПМВ в опыте и контроле суммированы в таблице 1 . Полученнь данные свидетельствуют о том, что БТ с использованием кДНК гена дистрофина приводит увеличению числа ДПМВ в мышце-мишени. В случае баллистической трансфекщ конструкцией pDMDl, уже через 17 дней после введения число ДПМВ достигло 2% , и почт в 3 раза превышало число ДПМВ у контрольных мышей mdx того же возраста ( табл. 1). Бы; отмечено, что к 60-му дню после БТ конструкцией pDMDl число ДПМВ в мышце-мишеи продолжало увеличиваться. Более того, на этом сроке становится очевидным значительнс увеличение ДПМВ в не подвергавшейся баллистической траисфекции мьпш контралатеральной лапы (2.9%).

БТ конструкцией pHSADy оказалась более эффективной по сравнению с pDMD Максимальное увеличение в числе ДПМВ были отмечены на 20-й день после БТ с pHSADy. учетом всех вариантов специфической иммуноцитохимической окраски (рис. lc,d ) числ ДПМВ в этой серии достигало 17%. Таким образом, по сравнению с внутримышечно инъекцией pHSADy , в результате БТ аналогичной конструкцией число ДПМВ возрастал почти в 8 раз.. Однако, длительность экспрессии конструкции pHSADy оказалась меньше че pDMDl. К 60 дню после БТ с pHSADy, число ДПМВ снижалось до уровня интактны мышей mdx ( таб. 1). Следует отметить, что после введения конструкций методом БТ увеличение числа ДПМВ наблюдалось не только в мышце обстрела, но и в других мышцах. Так на 20 день после БТ конструкцией pHSADy в мышце контраяатерально лапы было зарегистрировано около 7% ДПМВ ( таб. 1).

Анализ межтканевого распределения генных конструкций после баллистаческо трансфекции проводился методом полимеразной цепной реакции с олигопраймерам* специфичными для 5'-конца экзона 52 и З'-конца экзона 53 гена дистрофина человек: Результаты ПЦР анализа показали, что после введения методом БТ введенные конструкции кДНК гена дистрофина присутствуют не только в мышце мишени подвергшейся обстрелу, н и в других группах мышц и органах удаленных от места введения.

Рисунок i. Иммуноцитохимическое выявление дистрофина на поперечных криостатных резах musculus quadriceps femori у мышей CBA/C57BL (контроль - а), интактных мышей mdx b.) и мышей mdx после баллистической трансфекшш плазмидой pDMDl (с) и pHSADy (d) а. -се мышечные волокна являются дистрофии положительными; Ь. отсутствие ДПМВ у ;нтактных мышей mdx; с. группа ДПМВ у мышей mdx после БТ ( ДПМВ1 нормальная :рисарколемная локализация дистрофина;) d. - отмечены стрелками ДПМВ с ;итоплазматической локализацией дистрофина ( ДПМВ2) Ув. х 480.

325 п о.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 'ис. 2. ПЦР анализ межтканевого распределения конструкции с кДНК гена дистрофина еловека pDMDl, у мышей mdx после баллистической трансфекции. Образцы ДНК из мыши; lusculus gluteus (1), muscuilis quadriceps femori (2. 4)- мышцы лапы подвергавшейся БТ. lusculus gluteus (3) muscuilis quadriceps femori (5) контралатеральной лапы, сердца (6). языка 7), кишечника (8). мозга (9). Контрольные образцы : геномная ДНК человека (10) , геномная 1НК мышей CBA/C57BL (11) и мышей mdx (12).

Таблица 1. Число дистрофин-положительных мышечных волокон (ДПМВ) в мышцах мыше тс!х после баллистической трансфекции плазмидами рВМБ! и рНЗАОу, содержащим

полноразмерную кДНК гена дистрофина человека.

Номер Конструкция Экспозиция (дни) Мышца Число ДПМВ Число ДПМВ1

Всего %

1 сБМВ1 17 Оп. 34 2.01 ±0.6 34

Кн. 8 0 5П±П.1 8

2 рБМЭ! 60 Оп. 27 2.97 ± 0.2 27

Кл 26 2.88±0.1 26

3 рШАБу 20 Оп. 175 17.5± 1.3 19(1.9%)

4 рШАБу 20 Оп. 138 17.2 ± 1.2 18 (2.25%)

СМУГасг Оп. 61 6.7 ± 1.1 . 51 (5%)

5 рНБАЦу 60 ■•■"■ Оп.- 8 0.7 ±0.2 8

Кл. 14 0.9 ±0.6 14

6 рШАБу 60 Оп. 12 1.0±0.2 12

Кл. 16 1.6 ±0.4 16

7 Контроль - 3 0.2 ±0.1 3

8 Контроль - - 14 0.6±0.1 14

9 СМУ1ас2 20 Оп. 33 2.5 ±0.4 6 (0.4%)

Кл. 39 2.8 ±0.6 26(1.8%)

10 рНБАЦу 20 Оп. 33 2.2 ± 0.8 33

(инъекция Кл. 12 1.0±0.3 12

в мышцу)

Оп. - Опытная мышца (мышца обстрела); Кл..- Койтралатеральная мышца

Проведенные эксперименты проказали, что введение полноразмерной кДНК гена дистрофина человека методом БТ приводит к существенному повышению числа ДПМВ в, мышцах мышей тс!х. Зарегистрированная в опытах по БТ эффективность., трансформации оказалась значительно выше, чем при внутримышечной инъекции конструкций с полноразмерной кДНК гена дистрофина (АэсасИ е1 а!., 1991), и вполне сопоставима с таковой при использовании липосом или ретровирусных конструкций с мини-геном дистрофина (ТпуесН е! а].; 1995, РаБэаН е1а!., 1995 , Yanagihara е1 а!., 1996).

Результаты БТ при использовании конструкций рШАОу и рОМЭ1 бвли различны. Особенностью БТ конструкцией рШАБу, явилось появление значительного числа ДПМВ с гомогенным цитоплазматическим распределением дистрофина ( ДПМВ2). Результаты анализа образцов мышц с ДПМВ2 , полученные в Институте Цитологии РАН (СЛетербурт), позволили рассматривать эту группу ДПМВ, как мышечные волокна в состоянии дегенерации (Михайлов и др. 1998).

Тип использованной конструкции существенно влиял на эффективность трансфекции ( до 17.5% при БТ рШАБу и лишь 2.9% при рОМШ), на долю ДПМВ1 и ДПМВ2 в общем числе ДПМВ, а так же на динамику экспрессии дистрофина после БТ. Так при использовании конструкции рБМВ1, экспрессия трансгена продолжала возрастать до 60 дня после обстрела. При БТ конструкцией рШАЛу число ДПМВ к этому времени снижалось до уровня контроля. Остается неясным, в какой мере выявленные различия обусловлены особенностями промоторных частей использованных генетических конструкций, а в какой они определяются особенностями метода БТ, в частности точностью попадания, пропорцией микрочастиц золота и вольфрама в заряде, силой взрывного удара и др. Нельзя также исключить и индивидуальные

особенности иммунного ответа на активный синтез дистрофина человека в мышцах мышей mdx после БТ pHSADy.

1.2. Баллистическая трансфеция кДНК мини-гена дистрофина

Эксперименты проводились с генетическими конструкциями, содержащими кДНК (6.5 тнп.) мини-гена дистрофина человека - pCMVDyB и pSG5dys, В качестве положительного контроля использована конструкция pDMDl полноразмерной кДНК гена дистрофина. На одном животном проведена котрансфекция мини геном дистрофина и конструкцией с маркерным геном р-галактозидазы - pCMVLacZ. Отрицательным контролем служили интактные мышцы мышей mdx. Учет результатов проводился через 2 недели после баллистической трансфекции.

Результаты подсчета ДПМВ на поперечных срезах мышц мышей mdx после баллистической трансфекции конструкциями с кДНК гена дистрофина приведены в таблице 2. Как следует из представленных данных, наибольшее количество ДПМВ (15%) с ярким свечением присарколемного дистрофина человека зарегистрировано в экспериментах с конструкцией pSG5dys в m.quadriceps опытной лапы. Следует отметить , что на отдельных образцах мышц (непосредственной зоны обстрела), число ДПМВ достигало 25%. Значительно меньше, число ДПМВ с ярким свечением присарколемного дистрофина наблюдалось в опытах по БТ конструкцией pCMVDyB (7%). В результате БТ с полноразмерной кДНК (pDMDl) в мышце обстрела регистрировалось до 3.5% ДПМВ.

Как и в предшествующих сериях опытов по БТ, экспрессия гена дистрофина регистрировалась не только в m.quadriceps опытной лапы , но и в мышцах удаленных от места попадания заряда. При трансфекции конструкцией pSG5dys в мышце m.quadriceps контралатеральной лапы регистрировалось около 3.8% ДПМВ, по сравнению с 0.6% ДПМВ в контроле(таб.2). При баллистической когрансфекции плазмидами с геном дистрофина и с бактериальным геном Lac-Z экспрессия Р-галактозидазы также идентифицировалась не только в мышечных волокнах опытной, но и контралатеральной лапы .

Таблица 2. Число дистрофии положительных волокон (ДПМВ ) в опытной и контрлатеральной мышцах - m, quadriceps (m.q), т. gluteus (m.g) мышей mdx через 2 недели после баллистической

N/N конструкция Дистрофии положительные мышечные волокна ( %)

m.q. (опыт) m.g (опыт) m.q. (кнтрл.)

1 pSG5dys 15.0+7.1 2.6+0.44 3.8±1.08

2 pCMVDy-B ' 7.0+0.81 2.4+0.31 2.3+1.30

3 pDMDl 3.5+0.12 1.6±0.35 2.9+0.76

4 контроль 0.6±0.2 0.6+0.1 0.7±0.2

Представляет интерес сравнить полученные данные с результатами предыдущих серий опытов та БТ с полноразмерной кДНК гена дистрофина. Прежде всего, следует отметить, что число ЦПМВ с ярким контуром присарколеммного белка, при трансфекции конструкцией pDMDl, в занной серии опытов вполне соответствовала таковому при баллистической трансфекции в тредыдущей серии опытов. Обращает на себя внимание отсутствие в экспериментах по БТ с <ДНК мини гена дистрофина ДПМВ с гомогенно окрашенной миоплазмой (ДПМВ2), столь многочисленных в предыдущих экспериментах. Другой важной особенностью, является аысокая эффективность трансфекции при использовании конструкций с мини-геном, где на зтдельных срезах число ДПМВ достигало 25%, то есть, было таким же, как и в жспериментах с использованием рекомбинантных аденовирусных векторов (gutted adenovirus

vector) ( Clemens et al., 1995). Следует однако отметить, что повторные введения вирусных векторов вследствии выраженного иммунного ответа оказываются невозможными.

Как и в опытах с полноразмерной кДНК, при БТ мини геном наблюдались различия, в эффективности трансфекщш в зависимости от типа гентической конструкции. В какой мере различия в экспрессии pSG5dys и pCMVDy-B были обусловлены различной ориентацией кДНК в плазмиде, остается неизвестным и требует специального изучения. Увеличение числа ДПМВ при БТ мини геном по сравнению с полноразмерной копией отчасти могло, быть обусловлено различиями в размерах клонированного фрагмента кДНК. При одной и той же дозе ДНК на каждый' выстрел (25 мкг.), число плазмид с мини геном на металлических носителях -микрочастицах, могло быть почти вдвое выше по сравнению с полноразмерной кДНК. Следует, однако, отметить, что при исследованном нами в экспериментах с. синтетическими олигопептидами увеличении дозы плазмиды до 50 мкг. или трехкратном в/м введения по 15 мкг. конструкции с полноразмерной кДНК, нам ни разу не удавалось получить столь высокого эффекта трансфекции ( Баранов и др., 1998). В отдельных опытах с полноразмерным геном число ДПМВ достигало 16- 18%, однако 13-15% таких волокон гомогенно окрашивалось на дистрофии, и только около 2-3% имели яркую присарколеммную окраску, типичную для нормальных мышечных волокон (Baranov et al., 1998; Зеленин и др., 1998). Оценивая полученные результаты, следует добавить, что, по мнению ряда авторов для достижения терапевтического эффекта сопоставимого с полноразмерной кДНК, экспрессия мини гена должна быть на 30% выше, то есть, число ДПМВ должно достигать уровня 50-70% (Fassati et al., 1997). При этом следует учитывать , что даже достаточно высокая экспрессия мини гена дистрофина не спасает от проявления некроза все группы мышц (Turner et al., 1997) .

Наиболее интересным результатом этих исследований явилась идентификация, не отмечавшегося ранее в работах других исследователей, феномена "дистантной трансфекции". Суть данного явления заключается в появлении ДПМВ, не только в мышце введения, но и других мышцах, органах или тканях. Широкое межтканевое распространение генетической конструкции после БТ, подтверждалось результатами ПЦР анализа образцов ДНК из различных образцов тканей экспериментальных животных. По нашему предположению, вводимая конструкция распространялась с кровью по организму, попадала в другие группы мышц и экспрессиировала дистрофика. Эффективность трансфекции других мышц была меньше, чем мышцы введения. Тем не менее, число ДПМВ зарегистрированное нами в некоторых из опытов по БТ мини-геном дистрофина в мышце контралатеральной лапы было в 5 раз больше, чем в интактном контроле. Убедительные доказательства дистантного эффекта при БТ было получено при проведении котрансфекции конструкциями с кДНК гена дистрофина и гена LacZ. При анализе результатов данного опыта, в мышце контралатеральной лапы наряду с группами дистрофии положительных волокон регистрировались клетки экспрессирующие ß - галоктазидазу.

2. Анализ экспрессии кДНК гена дистрофина человека в мышцах мышеи tndx после трансфекции с помощью липосом и синтетических олигопептидов

Синтетические олигопептидные комплексы (СОК), предложенные и изученные in vitro группой американских авторов (Gottschalk et al., 1996), были синтезированы в Институте Высокомолекулярных Соеднинений РАН (Санкт-Петербург). В настоящей работе для упаковки плазмиды pHSADy и ее доставки в миофибриллы использованы два олигопептида: К-8 (аналог спермидина, обладает положительным суммарным зарядом, взаимодействет с отрицательными зарядами фосфатных групп, вызывает конденсацию ДНК, обеспечивет ее упаковку) и JTS-1 (амфипатический олигопептид, аналог литических пептидов вируса гриппа, дестабилизирует мембраны эндосом, таким образом, предотвращает деградацию экзогенной ДНК и обеспечивает ее доставку в ядра.

Проведенные серии экспериментов с СОК и полученные результаты суммированы в таблице 3 и таблице 4.

На первом этапе нами были исследованы особенности трансфекции комплексами ДНК-СОК : различными суммарными зарядами (таб. 3). mdx мыши инъецировались комплексами с »отношениями ДНК/К8 1/2, 1/3, 1/4. Как следует из приведенных данных, наибольший процент ДПМВ был зарегистрирован при соотношением ДНК/К8 - 1:4. Количество ДПМВ в инъецированной мышце составило 16.1%, в контралатеральной 12.5%., по сравнению с 0.6% у интактных мышей mdx. При этом идентифицировались два типа ДПМВ: миофибриллы с присарколеммной локализацией дистрофина ( обозначены как ДПМВ1) и миофибриллы с локализацией дистрофина в миоплазме (ДПМВ2).

Таблица 3. Процент дистрофин-положительных волокон в инъецированной и контралатеральной ai. quadriceps после однократного внутримышечного введения генетической конструкции pHSADy, содержащей кДНК гена дистрофина, в составе комплекса с олигопептидами K8-JTS-1 : различным соотношением ДНК/К8.

Генетическая конструкция/ носитель Анализируемая мышца (m. quadriceps) Доза КдНК, мкг Дни после введения ДПМВ % ДПМВ-1 % ДПМВ-2 %

pHSADy: К8/1.-2 JTS1 Инъецированная 12 5 1.2±0.6 1.2 -

Контралатеральная 3.2 ±0.1 1.2 2.0

PHSADy: К8/1:3 JTS1 Инъецированная 12 5 3.1±0.3 1.7 1.4

Контралатеральная 4.9 ±0.5 1.9 3.0

PHSADy: К8/1:4 JTS1 Инъецированная 12 5 16.1 ±1.7 0.1 16.0

Контралатеральная 12.5 ±2.2 - 12.5

Контроль mdx - - 0.6 ±0.1 0.6 -

ЦПМВ-1 - присарколемная локализация дистрофина; ДПМВ-2 - гомогенное распределение иолекул дистрофина в саркоплазме.

Наибольшее количество ДПМВ-2 наблюдали при трансфекции СОК с соотношением ДНК/К8 - 1/4 (положительный заряд) (таб. 3). При данном соотношении ДНК-пептид К8, ДПМВ зыли представлены почти полностью волокнами с диффузно-окрашенной миоплазмой -ЦПМВ2. Отмечалась значительная инфильтрация групп волокон ДПМВ-2 макрофагами. Зптимальным соотношением ДНК - компактизующий олигопептид, являлось соотношение 1

3 ( заряд комплекса близкий к нейтральному), при котором в большей части ДПМВ мблюдалась корректная локализация дистрофина.

Дальнейшие эксперименты с использованием СОК по доставке конструкции pHSADy in vivo троводили при соотношении ДНК-.К8 - 1:3. Полученные результаты суммированы в таблице 4. Анализировалась динамика экспрессии и зависимость от дозы введенных генетических инструкций. Через 14 дней после введения в инъецированной мышце регистрировалось 3.8% ДПМВ, в образцах контралатеральной мышцы до 2.2% ДПМВ. Через 30 дней число ДПМВ ;нижалось до уровня контроля и составляло 0.9% в инъецированной и 1.8%. в сонтралатеральной мышце. Следует отметить, что во всех сериях наблюдалась корректная трисарколеммная локализация дистрофина. Таблица 4.

В эксперименте с трехкратным введением комплексов pHSADy/COK на сроке 20 дней после 1ервого введения, в инъецированной мышце идентифицировалось около 17% ДПМВ, из <оторых, однако 11.6% составляли волокна с гомогенно окрашенной миоплазмой (ДПМВ-2).

Доля ДПМВ в контралатералыюй мышце составляла 12.0±].9%, из которых доля ДПМВ-2 была 9.4%.

Таблица 4. Доля дистрофик-положительных мышечных волокон после введения кДНК гена дистрофина упакованного в СОК, в зависимости от дозы генетической конструкции и времени экспозиции.

Генетическая конструкция/ носитель Анализируемая мышца. (m. quadriceps) Доза кДНК, мкг Дни после введения ДПМВ % ДПМВ-1 % ДПМВ-2 %

PHSADy K8-JTS1 Инъецированная 20 14 3.8 ±0.2 3.8 -

Контралатеральная 2.2 ±0.03 2.2 -

PHSADy K8-JTS1 Инъецированная 20 30 0.9 ±0.01 0.9 -

Контралатеральная 1.8+0.11 1.8 -

PHSADy K8-JTS1 Инъецированная 15x3 20 17.2 ±2.3 5.6 11.6

Контралатеральная 12.0 ± 1.9 2.6 9.4

Контроль mdx - 0.6 ±0.1 0.6 -

ДПМВ-1 - яркая присарколемная локализация дистрофина; ДПМВ-2 - гомогенное распределение молекул дистрофина в саркоплазме.

325 п.о.

1 2 3 4 5 6 Рис. 3. Выявление транскриптов гена дистрофина методом ОТ-ПЦР на 30-й день после введения генетической конструкции pHSADy с помощью синтетических олигопептидов К8 и JTS-1. Образцы: 1. инъецированная ш. quadriceps, 2. контралатеральная т. quadriceps,3. диафрагма 4. Интактная мышца мыши mdx, 5. позитивный контроль , 6. молекулярный маркер.

Наряду с иммуноцитохимическим методом, экспрессия гена дистрофина и феномен дистантной трансфекции подтверждались результатами ОТ-ПЦР анализа. На рисунке 3 представлена электрофореграмма разделения продуктов амплификации фрагмента кДНК гена дистрофина (52-53 экзоны), синтезированной на матрице мРНК методом обратной транскрипции. Анализировали образцы РНК экстрагированные из мышц (инъецированная т. quadriceps, контралатеральная т. quadriceps, диафрагма) на сроках 14 и 30 дней после введения комплексов pHSADy/K8-JTS-l. Присутствие специфического продукта амплификации доказывало экспрессию введенной конструкции.

Терапевтический эффект введения генных конструкций обычно коррелирует с эффективностью доставки комплексов ген-носитель в клетку и клеточное ядро. Нами проводился FISH анализ с целью изучения внутриклеточной локализации введенных комплексов, их .межтканевого распределение, а также длительность персистенции в образцах. Показано , что на образцах криостатных срезов мышц введения и контралатеральной мышцы, комплексы кДНК гена дистрофина с СОК имеют преимущественно цитоллазматическуто локализацию (рис.4.). На 5, 14 и 30 день после трансфекции, СОК идентифицируются не только в мышце введения, но ив других органах и тканях экспериментальных животных.

нок 4. Анализ внутриклеточной локализации комплексов плазмиды pHSADy с синтетическими опептидами К8 и JTS1 на поперечных криостатных срезах мышц мышей mdx. FISH. СОК мы стрелками.

Результаты ПЦР анализа образцов ДНК из различных мышц и органов мышей mdx, )дтверждали широкое межтканевое распределение комплексов после однократного |)тримышечного введения.

1 2345 678 9 10 II

нок 5. Электрофореграмма продуктов амплификации фрагмента кДНК гена дистрофика (52-53 ш) в составе плазмиды рШАОу. Детекция введенной конструкции рШАОу методом ПЦР на 14 после введения. 1,2 - инъецирования мышца; 3,4 - коитралатерайьнай мышца; 5 - мышца передней ; 6 - сердце; 7 - диафрагма; 8 - легкие, 9 - интактная мышца мыши 1тк1х (отрицательный контроль); плазмида рНБАИу (положительный контроль); 11 - молекулярный маркер (продукты разделения гиплексной ПЦР экзонов гена дистрофина 307 п.о. -45 экзон, 357 п.о. -43 экзон).

"аким образом, применение СОК позволяет осуществить доставку кДНК гена дистрофина в >шщы мышей п^х. Эффективность трансфекшш возрастает с увеличением положительного ммарного заряда комплекса ДНК с СОК, при этом, однако, увеличивается и число генерирующих мышечных подокон ( ДПМВ2). Возникновение подобных волокон послс ллистической трансфекции было отмечено нами ранее (Зеленин и др., 1998), а также в работах утих авторов (Уа^Шага е1 а!.. 1996;С1етеп5 е! а!.. 1996).

Остановлено что через месяц после трансфекции доля ДПМВ в мышце введения (0.9%) актически не отличается от контрольного уровня у п^х мышей (0.6%) Однако, присутствие знскриптов гена дистрофина в скелетных мышцах удалось зарегистрировать и на 30-й день еле трансфекции, при анализе более чувствительным методом ОТ-ПЦР. При увеличении зы генной конструкции при трехкратном введение кДНК гена дистрофина упакованной в Ж, нами не выявлено увеличения количества ДПМВ в мышце-мишени.

Так же как и при БТ, при трансфекции с использованием СОК нами наблюдался эффект "дистантной трансфекции", выражавшийся в экспрессии гена в органах и тканях удаленных от места введения. Наличие дистантной трансфекции подтверждалось также результатами ОТ-ПЦР, ПЦР и FISH анализа.

Как следует из данных приведенных в таблице 5, введение кДНК гена дистрофина упакованного в поликатионные липосомы (pHSADy-ЛПФ), не привело к достоверному увеличению числа ДПМВ через 2 недели после воздействия. Число ДПМВ в инъецированной мышце находилось в пределах 0,7-0,8% и практически соответствовало таковому (0,6%) у интактных мышей mdx того же возраста. Эффективность трансфекции оказалась далее существенно ниже, чем при введении 10 мкг. чистой плазмиды в мышцу (2,2% ДПМВ) ( таб.5). Возможной причиной низкой эффективности доставки ДНК катионными липосомами в миофибриллы является наличие базальной пластинки, заряженные компоненты которой способны препятствовать проникновению комплексов электростатически (Turner et al,, 1997). Многие авторы отмечают отсутствие направленного транспорта ДНК в ядро при использовании обычных липосомных векторов. После слияния с клеточной мембраной генетическая конструкция освобождается от липидного вектора и попадает в цитоплазму, где существует высокая вероятность разрушения её нуклеазами. Таким образом, несмотря на то, что катионные липосомы обладают исключительно высокой способностью к трансфекции в условиях клеточных культур (Triverdi & Dickson, 1995), они малопригодны для трансфекции мышц in vivo. Вместе с тем существуют данные, что после включения в липосомный вектор агентов, обеспечивающих внутриядерный транспорт эффективность трансформации повышается (Pollard et al., 1998). Кроме того, показано, что при трансфекции in vivo с гемагглютинирующим японским вирусом HVJ экранированным от иммунной системы в поликатионных липосомах, экспрессия гена дистрофина может достигать 26% (Yanagihara et al., 1996).

Таблица 5. Процент дистрофин-положительных мышечных волокон после введения кДНК

Генетическая конструкция/ носитель Анализируемая мышца (m. quadriceps) Доза кДНК, мкг Дни после введения ДПМВ % ДПМВ-1 % ДПМВ-2 %

pHSADy липофектамин Инъецированная 10 14 3.8 ±0.2 3.8 -

Контр алатеральная 2.2 ±0.03 2.2 -

pHSADy липофектамин Инъецированная 10 14 0.9 ±0.01 0.9 -

Контралатеральная 1.8 ±0.11 1.8 -

pHSADy Инъецированная 10 14 2.2 0.4 2.2 -

Контралатеральная 1.0 0.2 1.0 -

Контроль mdx - 0.6 ±0.1 0.6 -

3. Изучение особенностей трансфекиии и экспрессии кДНК гена дистрофина человека маркерного гена Ьас2 , доставленных в мышиы мышей т<Ьс с помощью синтетичесм микросфер МР-2.

3. ¡.Экспрессия дистрофина в мышиах мышей тЛх после трансфекции полноразмерш кДНК гена дистрофина в составе микросфер МТ2.

Эксперименты проводились на самцах мышей 1Ых с использованием плазмиды рШАБ Трансфекцию проводили путем инъекции ДНК полимерных комплексов содержащих 25 мк

мазмиды в четырехглавую мышцу бедра. В качестве контроля использовались интактные мыши иск, мыши тс1х после введения неупакованной ( голой ) ДНК, мыши тс!х после введения 'пустых", не несущих ДНК конструкций, частиц МР-2. Динамику экспрессии кДНК гена дистрофина изучали на 1,7,21 и 60 дни после введения.

Результаты подсчета ДПМВ на криостатных поперечных срезах , мышц мышей тс}х через даличные интервалы времени после введения микросфер МР-2, нагруженных рГОлЬу, 1риведены на таблице 6. Как следует из представленных данных, число ДПМВ через 24 часа после ведения составляло только 1%, и практически не отличалось от эффективности трансфекции при ¡ведений "голой" плазмиды. Однако, уже через неделю отмечалось прогрессивное нарастание юли ДПМВ как в мышце , так и и в ягодичной мышце той же лапы ( таб. 6). Доля волокон репрессирующих дистрофии продолжала возрастать еще в течение 3-х недель после рансфекции ( таб. 6). Через 21 день после введения , в ягодичной мышце опытной лапы было арегистрировано максимальное число ДПМВ (8,4%). В эти же сроки возрастало число ДПМВ не олько в месте введения, но и в мышцах контралатеральной и передней лап. На 60-й день после ведения число ДПМВ снижалось. Особенно выраженным являлся данный процесс в мышцах, даленных от места введения. В то же время, в инъецированной мышце, доля ДПМВ и через два [есяца оставалась достаточно высокой - 4,7%, по сравнению с 0,6% в контроле. Таким образом одноразмерная кДНК гена дистрофина человека, доставленная с помощью микросфер МР-2, пособна к длительной экспрессии ( до 60 дней) в мышцах мышей т<1х.. Максимальный эффект рансфекции отмечался на 21 день после введения.

'аблица 6. Доля дистрофии положительных волокон в мышцах инъецированной (оп.) и онтралатеральной лап (ктрлат.) мышЩтйх, через различные промежутки времени после рансфекции комплексами рШАОу-МРЗ®

Дт после трансфекции

1 .7 21 60

1.1 ¿0,30 2.4±1.08 5.8±0.28 4.8^.13

1.0 ¿0.15 5.5Л3.81 8.4^0.29 1.0Й.11

1.030.14 2.Ц0.48 4.3^0.23 1.5П61

Число ДПМВ в проведенных экспериментах не превышало 10% , т.е. оказалось несколько ниже, ;м в наших опытах с баллистической трансфекцией (17%) или с помощью СОК (17,5%) (Зеленин др 1998 , Вагатуу е1 а1., 1998). Следует, однако, отметить, что в опытах с микросферами ПМВ были представлены почти исключительно кластерами ярко светящихся волокон с >рректной присарколемной локализацией дистрофина и без признаков дегенерации. В случае шлистической трансфекции и синтетических олигопептидов число таких волокон находилось в уделах 2-3%, тогда как основная часть ДПМВ (10-12%) характеризовалась присутствием лишь ¡больших фрагментов дистрофина либо последний гомогенно распределялся в миоплазме ПМВ2, т.е. не концентрировался под сарколеммой, что, по всей видимости, указывало на ишчие дегенеративных изменений (Зеленин и др 1998; Вагапоу е! а1., 1998; Михайлов и др. >98). Таким образом, складывается впечатление, что доставка рН8АБу с помощью микросфер Р-2 обеспечивает более эффективную трансформацию мышечных волокон и оказывает менее .¡раженный повреждающий эффект, чем БТ или СОК.

Сак и в предыдущих исследованиях, в опытах с микросферами четко определялся феномен, торый может быть назван "дистантной трансфекцией", т.е. наличием положительного шунноцитохимического сигнала на дистрофии в мышечных волокнах удаленных от места

мыаща

т^иасМсерз (оп.) т.акНаш (оп) т^иас1пс£р5 (ктрлат.)

введения , в частности, в m.quadticeps контралатеральной лапы и в мышцах передних лап. Во ж сериях число ДПМВ в таких мышцах было несколько ниже, чем в мышце введения , одна; достоверно превышало контрольный уровень даже спустя 2 месяца (таб.6).

3.2. Экспрессия дистрофина в мышцах мышей mdx после трансфекиии кДНК мини ге дистрофина в составе микросфер MF2.

Три мыши были инъецированы комплексами с 25 мкг. и три мыши с 50 мкг. кДНК мини те дистрофина (конструкция pSG5dys). Для сравнения, 3-м мышам внутримышечно вводили Д1 полимерные комплексы содержащие 25 мкг. полноразмерной кДНК (pHSADy). Анализ проводи; на 21-й день после трансфекции. Результаты подсчета ДПМВ приведены на рисунке 5. П введении полимерных комплексов с конструкцией pSG5dys, во всех исследованных образи наблюдалось существенное повышение эффективность трансфекции. Так, по сравнен! трансфекцией конструкцией pHSADy. (5.8%), в мышце введения (m.quadriceps) число ДГО возрастало более чем в 3 раза (около 18%). Повышение числа ДПМВ отмечалось также и мышцах m.gluteus лапы введения и m.quadriceps контралатеральной лапы.

Рисунок 5. Доля дистрофии положительных волокон в мышцах инъецированной (оп.) и контралатеральной лап мышей mdx, через 3 недели после однократного внутримышечного введения полноразмерной pHSADy и кДНК мини гена дистрофина pSG5dys упакованных в полимерные микросферы MF2

Число ДПМВ при введении конструкции pSGSdys в дозе 50 мкг. (около 13%), более чем в 2 раза превышало число ДПМВ при трансфекции pHSADy, однако, оказалось несколько ниже по сравнению с дозой в 25мкг. При этом значительное число ДПМВ было подвержено дегенеративным изменениям, имелась выраженная вариабельность в размере миофибрилл, наблюдались волокна с цитоплазматической локализацией дистрофина, инфильтрация макрофагами. Причиной этого могли быть повреждения мышц, вызванные инъекцией большего объема растворителя или массированным проникновением в мышечные волокна микросфер.

Экспрессия кДНК гена дистрофина доставленного в мышцы с помощью полимерных микросфер подтверждалась и результатами ОТ-ПЦР анализа. Были проанализированы образцы РНК экстрагированные из мышц (инъецированная m. quadriceps, контралатеральная т. quadriceps, диафрагма) на сроках 21 и 60 день после введения комплексов pSG5dys/MF2

ДПМВ %

m.quadriceps т. gluteus m.quadriceps (or.) (on) (ктрпат)

(рис.6). Было показано , что транскрипты гена дистрофина человека идентифицируются в образцах инъецированной и контралатеральной мышц, а так же диафрагмы на 21 и 60 день после введения.

1 2 3 4 5 6

Рисунок 6. Выявление транскриптов гена дистрофина методом ОТ-ПЦР после доставки генетической конструкции pSGSdys с помощью синтетических полимерных микросфер. Электрофореграмма продуктов амплификации фрагмента 52-53 экзонов гена дистрофина. Образцы: 1. инъецированная т. quadriceps, 2. коитралатеральная m. quadriceps,3. диафрагма 4. Интактная мышца мыши mdx, 5. позитивный контроль , б. молекулярный маркер.

3.3. Экспрессия маркерного гена Lac 2, доставленного с помощью синтетических микросфер MF-2.

Для подтверждения эффекта дистантной трансфекшш, нами проведены эксперименты по внутримышечному введению полимерных комплексов с маркерным геном LacZ ( конструкция pCMV-LacZ). Результы эксперимента регистрировали через 21 день после введения. Показано, что при доставке гена LacZ в микросферах MF2. экспрессия В-галактозидазы наблюдается не только в мышце введения, но и других проанализированных органах ( мышце контралатеральной лапы, сердце, диафрагме).

3.4.Аналш особенностей межтканевого распределения и внутриклеточной локализации ДНК полимерных комплексов MF2 в экспериментах in vivo и in vitro.

Анализ межтканевого распределения и внутрккпеточной локализации комплексов MF2 после внутримышечного введения mdx мышам проводился методом неизотопной in situ гибридизации (FISH). Благодаря включению большого числа (до 1000 копий ) плазмнды после проведения гибридизации комплексы MF-2/плазмидная ДНК выявлялись на гистологических срезах в виде достаточно крупных ( 2-2,5 микрон) сфер маркированных FITC (рис.6). При анализе гистологических срезов мышц, а также других органов и тканей после трансфекции показано, что уже через 24 часа микросферы распространяются по всему организму. По-видимому, уже в течение первых суток микросферы разносятся кровью (рис. 6 а), попадают в разные мышцы, в сердце, другие ткани и органы.

Важно отметить, что помимо выраженного межтканевого распределения , для микросфер была характерна высокая эффективность ядерной транслокации (рис. 6 Ь). Уже на 7-й день после введения более 70% ядер клеток-сателлитов и мышечных волокон мышцы введения содержали, по крайней мере, 1 микросферу (таб.7). Ядерная транслокация ДНК полимерных комплексов отмечалась и в образцах других исследованных органов и тканей (таб.7). Важным тля разработки генотерапии МДД являлась значительная концентрация микросфер MF-2 не только в ядрах клеток скелетных мышцах, но и сердца (таб. 7). К 21 дню после введения заблюд&тось некоторое уменьшение числа ядер содержавших крупные (1-2 мкм.) ликросферы. Одновременно в ядрах и цитоплазме наблюдалось увеличение числа их фрагментов. Результаты FISH анализа свидетельствовали о том, что и через 2 месяца после ¡ведения почти половина ядер миофибрилл сохраняют MF-2 частицы. Было показано , что

введения почти половина ядер миофибрилл сохраняют MF-2 частицы. Было показано , что через 60 дней после инъекции значительная часть микросфер деградирует, однако сохраняется в ядре в виде частиц меньшего размера. Подсчет таких FITC-положительных частиц, из за их малого размера становился невозможным. Важным итогом FISH анализа явились данные, доказывающие возможность преодоления микросферами гемато-энцефалического барьера. При этом отмечено, что значительное число микросфер не только попадает в ткани мозра , но и включается в ядра нервных клеток. Следует отметить , что создание систем доставки терапевтических генов через гемато-энцефалический барьер является крайне актуальным для генотерапии опухолей головного мозга. Насколько нам известно, проникновение частиц с экепрессирующими генными конструкциями через гемато-энцсфаличсский барьер другими авторами ранее не отмечалось.

Рисунок 6. Анализ межтканевого распределения и внутриклеточной локализации микросфер методом неизотопной гибридизации in situ. Препараты мазков крови ( а) и поперечные криостатные срезы мышц (Ь) мышей mdx через 24 часа (а) и 7 дней (Ь) после однократного внутримышечного введения комплексов pSG5dys-MF2. Микросферы отмечены стрелками.

Таблица 7. Содержание комплексов MF2/pHSA-Dy в ядрах клеток мышц, сердца и мозга через 7 и 21 день после однократного внутримышечного введения.

Экспозиция Образец Процент ядер содержащих MF2 Среднее число MF2 на ядро

7 дней m.quadriceps ( опыт) 74 0.4

m.gluteus (опыт) 64 0.9

т.quadriceps (контрлат.) 62 0.3

21 день m.quadriceps (опыт) 41 0.1

m.gluteus (опыт) 29 0.3

m.quadriceps (контрлат.) 45 0.3

передняя лапа 44 0.1

сердце 32 0.1

мозг 41 0.1

Данные о широком межтканевом распределении внутримышечно введенных комплексов МР2-плазмидная ДНК, были подтверждены и результатами ПЦР анализа. Наличие конструкции

с кДНК гена дистрофина показано в образцах тканей скелетных мышц, сердца, диафрагмы , мозга и легких на сроках 7, 21,60 дней после введения (рис 7.).

1 2 3 4 5 6 7 3 9

Рисунок 7. ПЦР анализ межтканевого распределения ДНК полимерных комплексов pSG5dys/MF2 на 21 день после однократного внутримышечного введения. Образцы ДНК -1 m.quadriceps лапы введения, 2 m.quadriceps контралатеральной лапы. 3 сердца, 4 диафрагмы .5 мозга . 6 легких 7 отрицательный контроль , S положительный контроль, 9 молекулярный маркер.

Отмечена высокая эффективность ядерной доставки генов полимерным носителем MF2 в экспериментах in vitro. Биотинилированными комплексами ДНК/МР2 трансфецировзли клетки HeLa . С2С12 или CTL-L2. Через 24 часа клеточную культуру фиксировали на предметных стеклах и идентифицировали микросферы с биотинилированной ДНК с помощью конъюгата Авидин-FITC.

Рисунок 8. Культура скелетных миобластов мыши С2С12. 24 часа после введения комплексов биотшшлированная плазмидная ДНК - MF2. Детекция комплексов Avidin-FITC. Микросферы указаны стрелками.

Большинство микросфер MF2 выявлялось в клетках в виде глобулоподобных структур размером порядка 1-2 мкм в области клеточного ядра и перинуклеарной цитоплазме (рис.8). Полученные результаты подтверждали высокую эффективность ядерной доставки экспрессирующих генных конструкций с помощью полимерных микросфер MF2. Окончательное доказательство ядерной локализации микросфер после трансфекции in vitro , 5ыло получено при электронно-микроскопических исследованиях, проведенных в Институте

Рисунок 9. Идентификация ДНК-полимерных комплексов МР2 ( помечены стрелками) в ядрах клеток линии СТИД через 24 часа после трансфекции. Электронная микроскопия.

Обеспечение ядерной доставки генных конструкций является важнейшей проблемой генной терапии. Эффективность ядерной транслокации зависит от многих факторов, в т.ч. от заряда комплексов ДНК/носитель (Labat-MoSeur et al., 1996), их способности проникать в цитоплазму и транслоцироваться в ядро, устойчивости к действию лизосомных ферментов и пр. (Coonrod et al., 1997). Какой из механизмов обеспечивает столь высокое сродство использованных нами микросфер MF-2 к ядрам клеток остается неизвестным и требует специального изучения.

Наши ориентировочные расчеты показывают, что одна частица MF-2 может включать до 100( плазмид pHSADy. Обнаруженное в проведенных экспериментах присутствие микросфер i большинстве ядер мышечных волокон, явно не соответствует наблюдаемому послс трансфекции уровню экспрессии дистрофина в мышцах мышей mdx. Особенно разительные является падение числа ДПМВ через 2 месяца после введения, когда почти половина мышечньн клеток все еще содержит микросферы с кДНК гена дистрофина. Можно предположить, чтс подобное несоответствие, обусловлено слишком плотной упаковкой.' конструкции е полимерный носитель , а также повреждениями ДНК в процессе сборки мякросфер. Плотим структура ДНК полимерного комплекса могла препятствовать выходу генной конструкции е нукдеоплазму, а следовательно и процессу транскрипции. Подобная ситуация наблюдала« японскими исследователями при трансфекции -с использование полимерного насителя ателоколлагена (Takahiro O.et al., 1999). Ателоколлаген обеспечивал транспорт комплекса через клеточную мембрану, доставку и сохранность ДНК в течение длительного времени, но из-зе чрезвычайно прочного связывания этого полимера с ДНК выход плазмиды из носителя был возможен только при наличии в составе комплекса глюкозы. Факт деградации значительной части ДНК конструкций в микросферах был подтвержден при разрушении микросфер d экспериментах in vitro. Более 50% молекул плазмидной ДНК извлеченной из микросфер имели различного рода разрывы. Таким образом, по нашему мнению для повышения эффективности трансфекции необходимо применить брлее щадящий режим сборки ДНК комплексов и возможно модифицировать структуру полимерного носителя.

ВЫВОДЫ

1. Эффект трансфекции (появление дистрофии положительных мышечных волокон - ДПМВ) показан при доставке гена дистрофина с помощью: аналогов вирусных олигопептидов, полимерных микросфер MF2 и генного ружья; трансфекция in vivo е использованием поликатионных липосом оказалась не эффективной .

2. Максиматьное число дистрофий положительных мышечных волокон (до 20%) и отсутствие выраженных дегенеративных изменений мышц, отмечены при доставке плазмидных конструкций в опытах in vivo с помощью микросфер MF2 и "генного ружья".

3. Высокий уровень ДПМВ (до 16%) при использовании в качестве носителя аналогов вирусных олигопептидов, сопровождался появлением волокон с аномальной, цитоплазматической локализацией дистрофина и дегенерацией миофибрилл, что делает эту систему мало пригодной для доставки кДНК гена дистрофина in vivo.'

4. Методами FISH и электронной микроскопии, доказана .высокая. эффективность внутриядерной доставки генов с использованием полимерного носителя MF2 in vitro и in vivo.

5. Показана возможность преодоления, гемато-энцефалического барьера экспрессируюшими генными конструкциями в составе синтетических полимерных микросфер MF2.

6. Внутримышечное и параэнтеральное введение генных конструкций при помощи аналогов вирусных олигопептидов, полимерных микросфер MF2 и "генного ружья" сопровождалось появлением ДПМВ в скелетных . мышцах, удаленных от места введения , .а таю ке в диафрагме и в сердце.

7. Высказано предположение, что данный эффект, названный нами "феноменом дистантной трансфекции ", открывает реальные перспективы для разработки генотерапевтических подходов к системному лечению, миодистрофии Дюшенна и других нервно-мышечных заболеваний.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Зеленин А., Тарасенко О., Колесников В., Михайлов В, Киселев А., Баранов А., и др., Экспрессия гена дистрофина в скелетных мышцах мышей mdx после баллистической трансфекции // Генетика, 1998,34,6, с. 730-736.

I. Baranov V.S., Zelenin A., Baranov A.N. et al., Human dystrophin gene expression in mdx muscles after in vivo ballistic transfection, application of synthetic olygopeptide complexes and cationic liposomes// NATO ASI Series, SubseriesM., 1997, vol. 105, p. 219-223. Баранов B.C., Тарасенко O.B., Баранов A.H., Киселев A.B., Иващенко Т.Э., Евграфов О.В., Михайлов В.M., Диксон Дж. Экспрессия гена дистрофина человека в миофибриллах. мышей mdx после трансфекции с помощью липосом и синтетических олигопептидов // Генетика,1998,34, 7, с. 876-882

L Баранов А.Н., Киселев A.B., Иващенко.. Т.Э., Кащеева Т.К., Баранов B.C. Особенности трансфекции и экспрессии кДНК гена дистрофина человека, доставленного в мышцы мышей mdx с помощью синтетических микросфер MF-2// Генетика, 1998, 34,12,с. 1-6.

i. A Baranov, Р Glazkov, A Kiselev, et al Local and distant transfection of MDX muscke fibers with dystrophin and LacZ genes delivered in vivo by synthetic microspheres // Gene Therapy,. 1999, v.6, p.1406-1414.

i. Синогеева H.A., Богданова M.A., Алейникова Т.Д., Шавловский М.М., Гайцхоки B.C., Остапенко О.В., Баранов А. Н. , Баранов B.C. Экспрессия маркерных генов в мышечных волокнах после трансфекции in vivo, опосредованной лактоферрином // Генетика ,2000, 36, 6, с.749-759

. Баранов B.C., Баранов А.Н. Генная тарапия .моногенных наследственных болезней. Миодистрофия Дюшенна. //Вопросы Мед. Хим., 200Q, 46,3, с. 279-293.

8. Baranov A., Kiselev A., Giazkov P., Sabetsky V„ Baranov V. Tissue distribution of humai dystrophin cDNA (HDcDNA) delivered into mdx muscles with synthetic olygopeptides (SO) о microspheres (MF-2) as vehicles II Abstr. 30th Annual Meeting of the European Society of Humai Genetics, 10-13 May 1998, Lisbon, Portugal, p. 175.

9. Baranov V.,Tarasenko O., Ivaschenko Т., Baranov A„ Sabetsky V.,.Ostapenko 0.,Kisele\ A.Synthetic olygopeptide complexes , cationic liposomes and microspheres as vechicles fo; delivery of human dystrophin gene cDNA into mdx mice muscles// Abstr. 30th Annual Meeting о the European Society of Human Genetics, 10-13 May 1998, Lisbon, Portugal, p.175.

10. Ivaschenko Т., Giazkov P., Baranov A. .Sabetsky V., Baranov V. Comparative analysis of gen( delivery to the lung cells of laboratory mice with different vehicles and by different administratior routs // Abstr. American Society of Gene Therapy. 1st Annual Meeting, May 28-31, 1998, Seattle Washington, p. 148a.

11. Baranov A., Kiselev A., Giazkov P., Sabetsky V., Baranov V. Synthetic olygopeptides (SO) anc artificial microspheres (MF-2) as efficient gene delivery vehicles in vivo // Abstr. American Societj of Gene Therapy. 1st Annual Meeting, May 28-31, 1998, Seattle, Washington, p. 163a.

12. Sabetsky V., Baranov V., Giazkov P., Kiselev A., Baranov A. New particulate gene delivery systerr for in vivo:applications // Abstr. American Society of Gene Therapy. 1st Annual Meeting, May 2831, 1998, Seattle, Washington, p. 162a.

13. Баранов В. С., Иващенко Т.Э., Кащеева Т.К., Глазков П.Б., Бакай М.А., Баранов А.Н, Пренатальная диагностика (ПД) и состояние исследований по генной терапии муковисцидозг (MB) в России // V Российский Национальный Конгресс «Человек и лекарство», Москва, 2125 апреля 1998г., с. 329.

14. Baranov A., Kiselev A., Sabetsky V., Baranov V. Synthetic microspheres as new gene delivery vechicles in vivo // 6th Meeting of Europ. Working Group on Human Gene Transfer and Therapy , Jerusalem 1998.

15. Baranov V., Baranov A., Kiselev A., Giazkov P., Ostapenko O., Mikhailov V., Ivaschenko Т., Sabetsky V. Efficient transfection of mdx muscle fibers with dystrophin and LacZ genes delivered by synthetic microspheres // 6th Meeting of Europ. Working Group on Human Gene Transfer and Therapy, Jerusalem 1998

16. Баранов B.C., Зеленин A.B., Остапенко О.В., Тарасенко О.А., Баранов А.Н., Колесников В.А., Иващенко Т.Э., Киселев А.В., Михайлов В.М., Кащеева Т.К., Зеленина И.А., Сабецкий В.А. Особенности трансфекции и экспрессии кДНК гена дистрофина человека, доставленного в мышцы мышей mdx с помощью различных невирусных носителей // 9-ая итоговая конф. «Геном человека», М.,1999, с.121.

17. Иващенко Т.Э., Глазков П.Б., Баранов А.Н., Сабецкий В.А., Киселев А.В., Баранов B.C. Трансфекция клеток легких мышей геном CFTR человека и геном LacZ при различных носителях и способах доставки // 9-ая итоговая конф. «Геном человека», М.,1999., с.122.

18. А. Баранов, П. Глазков, А. Киселев, О. Остапенко, Т. Иващенко, Т. Кащеева, М. Шавловский, Н. Синогеева, М. Мнушкина, А. Зеленин, В. Михайлов, В, Сабецкий, В.Баранов Невирусные способы доставки гена дистрофина в мышцы мышей mdx - биологической модели миодистрофии Дюшенна // Современные медицинские технологии, // Сб. научн. трудов/, Новосибирск, 1999 , с. 261-262.

19. А. Баранов, П. Глазков, А. Киселев, О. Остапенко, Т. Иващенко, Т. Кащеева, М. Шавловский, Н. Синогеева, А. Зеленин, В. Михайлов, В. Сабецкий, В..Баранов Исследование невирусных способов доставки гена дистрофина на биологической модели миодистрофии Дюшенна mdx мышах // 2-ой съезд ВОГИС, С. Петербург, 2000, с. 262-263.

20. Баранов А.Н., Остапенко О.В., Киселев А.В., Баранов B.C. Новое в генной терапии миодистрофии Дюшенна // II Всероссийский съезд медицинских генетиков, Курск, 2000, т. I, с. 25-26.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Баранов, Александр Николаевич

ОГЛАВЛЕНИЕ.

Список сокращений.

1. ВВЕДЕНИЕ.'.::.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.:.

2.1. Локализация и клонирование гена дистрофина.

2.2. Мутации в гене дистрофина.

2.3. Белковый продукт гена дистрофина.

2.3.1. Локализация, структура и функция мышечного дистрофина.

2.3.2. Изоформы дистрофина.

2.4. Аутосомный гомолог дистрофина-утрофин.

2.5. Молекулярные основы патогенеза МДД/Б.

2.5.1. «Мембранная теория» патогенеза МДД/Б.

2.5.2. Дистрофии опосредованный каскад процессов дегенерации мышц.

2.5.2.1. Нарушения в сборке 'д'истрбфин ассоциированного глюкопротеинового комплекса.

2.5.2.2. Аномалии- ионного баланса.г.

2.5.2.3. Нарушения мембранно ассоциированных сигнальных процессов.

2.5.2.4. Особенности патофизиологических процессов приМДД.

2.5.2.5. Двухфазная модель патогенеза МДД/Б.

2.6. Исследования по генотерапии мышечной дистрофии Дюшенна.

2.6.1. Генотерапия - новое направление медицины.

2.6.2. Способы доставки генных конструкций в клетки эукариот.

2.6.3. Основные направления исследований по генотерапии МДД/Б.

2.6.3.1. Вирусные способы доставки кДНК гена дистрофина.'.

2.6.3.2. Невирусные способы доставки кДНК гена дистрофина.

2.6.3.3. Заместительная генокоррекция МДД/Б.

2.6.3.4. Активизация экспрессии гена утрофина.

2.6.4. Клинические испытания по генотерапии МДД.

3. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ.

3.1. Материал.

3.1.1. Экспериментальные животные.

3.1.2. Клеточные линии. j. 1.3.

3.1.3.1.

3.1.3.2.

3.1.4.

3.1.4.1.

3.1.4.2.

3.1.4.3.

3.1.4.4.

3.1.5.

3.1.6.

3.1.7. 3.2.

3.2.1.

3.2.2.

3.2.2.1.

3.2.2.2.

3.2.2.3.

3.2.2.4. 3.2.2.

3.2.3.1.

3.2.3.2.

3.2.4.

3.2.5.

3.2.6.

3.2.7.

3.2.8.

3.2.9.

3.2.10.

3.2.10.

3.2.10.

Генетические конструкции.

Конструкции с маркерным геном LacZ.

Конструкции с кДНК гена дистрофина человека.

Носители и способы трансфекции.

Генное ружье.,.

Аналоги вирусных олигопептидов.

Липофектамин.

Синтетические полимерное микросферы MF2 .'.

Олигонуклеотидные праймеры.

Реактивы.-.—

Оборудование.

Методы.

Выделение плазмидной ДНК.

Сборка комплексов плазмидная ДНК носитель.

Баллистическая трансфекция.

Комплексы с аналогами вирусных олигопептидов. Катионные липосомы.

Синтетические полимерные микросферы MF

Проведение трансфекции in vivo.

Внутримышечные инъекции комплексов ДНК/нрситель.

Баллистическая трансфекция.

Забор материала для анализа результатов трансфекции.

Выявление экспрессии гена дистрофина иммуногистохимическим методом. Идентификация экспрессии маркерного гена LacZ на тотальных препаратах органов мышей.

Экстракция ДНК из тканей мышей mdx.:.

Проведение и анализ результатов ПЦР реакции.

Выделение тотальной РНК из тканей мышей и проведение обратнотранскрипционной полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР).

Анализ межтканевого распределения и внутриклетой локализации комплексов ДНК/носитель методом гибридизации in situ. Приготовление меченой ДНК пробы. Неизотопный вариант гибридизации in situ на гистологических препаратах.

Анализ препаратов.:.

Исследование внутриклеточной локализации комплексов МТ2/плазмидная

ДНК in vitro.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Анализ результатов трансфекции мышц мышей mdx кДНК гена дистрофина человека методом баллистической трансфекции.

Баллистическая трансфекция полноразмерной кДНК гена дистрофина.

Баллистическая трансфеция кДНК мини-гена дистрофина.

Анализ экспрессии кДНК гена дистрофина человека в мышцах мышей mdx после трансфекции с помощью липосом и синтетических олигопептидов.■.

Трансфекция комплексами ДНК-СОК с различными суммарными зарядами.

Анализ динамики и дозовой зависимости при .трансфекции с СОК.

Анализ межтканевого распределения комплексов плазмидная ДНК-СОК.

Трансфекция с использованием поликатионных липосом.

Изучение особенностей трансфекции и экспрессии кДНК гена дистрофина человека и маркерного гена LacZ , доставленных в мышцы мышей mdx с помощью синтетических микросфер MF-2.

Экспрессия дистрофина в мышцах мышей mdx после трансфекц] полноразмерной кДНК гена дистрофина в составе микросфер MF2.

Экспрессия дистрофина в мышцах мышей mdx после трансфекции кДНК мини гена дистрофина в составе микросфер MF2.;.

Экспрессия маркерного гена Lac Z, доставленного с помощью синтетических микросфер MF-2.

Анализ особенностей межтканевого распределения и внутриклеточной локализации ДНК полимерных комплексов MF2 в экспериментах in vivo и in vitro.

FISH анализ образцов органов мышей mdx после введения ДНК полимерных комплексов MF2.,.

Анализ внутриклеточной локализации полимерных микросфер MF2 в экспериментах in vitro.

ВЫВОДЫ.1.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование невирусных способов доставки генных конструкций для генотерапии миодистрофии Дюшенна"

Мышечная дистрофия Дюшенна/Беккера (МДД/Б) - является наиболее распространенным наследственным нервно-мышечным заболеванием человека. Частота встречаемости для мышечной дистрофии Дюшенна (МДД) составляет 1 на 3500 новорожденных мальчиков (Горбунова и др., 1998). Основным клиническим проявлением МДД/Б является прогрессирующая мышечная дистрофия. Симптомы миодистрофии Дюшенна (МДД) начинают в возрасте 3-5 лет. К 12-15 годам пациенты с МДД теряют способность передвигаться самостоятельно. Летальный исход, как правило, наступает из-за сердечной недостаточности либо отказа дыхательной мускулатуры в возрасте около 20 лет (Partridge, 1997). В случае более легкой формы миодистрофии - МДБ, симптомы заболевания начинают проявляться значительно позже, и больные часто доживают до 3 5-50 лет. f ■

Причиной заболевания являются мутации в гене дистрофина (Koenig et al., 1987; Hoffman et al., 1987). Основным продуктом гена в мышечных тканях является присарколеммный белок мышечный дистрофии, выполняющий функцию связующего звена между внутренним цитоскелетом миофибриллы и внеклеточным матриксом. Присутствие в мембране мышечного волокна аномального белка (МДБ) или же его полное отсутствие (МДД), индуцирует первичные нарушения в структурной организации и функции сарколеммы, что приводит к запуску каскадного процесса дегенерации мышц (Hoffman'et al. 1987).

Отсутствие эффективного медикаментозного лечения делает актуальной разработку новых - генотерапевтических подходов к лечению миодистрофии Дюшенна/Беккера. Суть метода, заключается во введении больному конструкций с нормальным геном дистрофина, обеспечивающим синтез полноценного белка и восстанавливающим структуру и функцию мышц. В экспериментах in vivo на биологических моделях МДД мышах mdx, была показана возмолшость возобновление синтеза дистрофина в скелетных и сердечной мышцах после внутривенного введения аденовирусного вектора с кДНК гена дистрофина человека. ( Stratford-Perricaudet et al., 1992). Кроме возобновления синтеза белка, было отмечено, что гиперэкспрессия человеческого дистрофина предотвращает 7 патологические и механические изменения поврежденных мышечных волокон без побочных эффектов.

К сожалению, кардинальных успехов в генотерапии МДД/Б пока не достигнуто (Баранов, 1999). Причиной этого являются, не только гигантские размеры гена и его мРНК, но и, главным образом, отсутствие . эффективных средств доставки гена в мышцы. Системы доставки генных конструкций, или носители, должны обеспечивать: компактизацию ДНК, проникновение в клетки мишени, предотвращать деградацию ДНК лизосомальными ферментами и обеспечивать ядерную транслокацию. При этом, система доставки должна быть не токсичной или иммуногенной, а входящие в ее состав компоненты быть биодеградируемыми (Wilson, 1998).

Считается, что достижение терапевтического эффекта возможно при успешной трансфекции не менее 20% , а, по последним данным, даже 30-40% мышечных волокон не только скелетной, мускулатуры, но так же мышц сердца и диафрагмы (Phelps et al., 1995). При этом Ьсновными критерйями эффективности трансфекции и терапевтического эффекта являются: появление дистрофии-положительных мышечных волокон (ДПМВ), нормализация уровня биохимических маркеров МДД/Б, изменения физиологических параметров мышц. Высокий уровень трансфекции пока достигнут только в нескольких опытах, где кДНК гена дистрофина вводили с помощью аденовирусного или ретровирусного векторов (Ascadi et al., 1995; Fassati et al., 1995). Использование вирусных носителей, однако, наталкивается на существенные методические трудности. Наибольшим препятствием к использованию вирусных векторов является выраженный иммунный ответ на вирусные антигены; Вышеперечисленных недостатков в 1 значительной мере лишены невирусные носители (липосомьг олигопептиды, полимеры и др.). Однако эффективность трансфекции при их использовании in vivo оказывалась очень низкой (Turner et al., 1997). Таким образом, проблема создания и испытаний новых средств доставки генных конструкций в мышцы продолжает оставаться актуальной проблемой генотерапии миодистрофии Дюшенна. 8

Данная работа является продолжением цикла проводимых лабораторией пренатальной диагностики ИАГ РАМН исследований, по разработке экспериментальных основ генотерапии МДД/Б и посвящена анализу результатов доставки кДНК гена дистрофина человека в мышцы мышей mdx при помощи различных типов невирусных носителей генов. .

Цели и задачи исследования. Целью работы является поиск оптимальных методов невирусной доставки гена дистрофина человека в мышцы mdx мышей и оценка I ■ эффекта генетической трансфекции.

Для реализации намеченной цели были поставлены следующие задачи:

1. Проанализировать эффективность экспрессии гена дистрофина человека в зависимости от типа генных конструкций и способов их доставки в пораженные мышцы мышей mdx

2. Иммуноцитохимическими и молекулярными методами изучить эффект генокоррекции;

3. Изучить возможность, системной коррекции дефекта скелетных мышц, диафрагмы и сердца мышей mdx в условиях внутримышечного введения генных конструкций;

Научная новизна и практическая значимость

• Исследованы особенности трех новых невирусных способов доставки кДНК гена дистрофина в мышцы биологических моделей МДД мышей mdx

• В экспериментах показано существование феномена "дистантной трансфекции" . Полученные данные об особенностях трансфекции органов и тканей модельных животных открывают перспективы для системной терапии миодистрофии Дюшенна путем местного введения генотерапевтических конструкций

• Показана возможность прохождения синтетических полимерных микросфер с "терапевтическими" генами через гематоэнцефалический барьер.

• Доказана высокая эффективность внутриядерной доставки генов с использованием полимерного носителя MF2

• Исследованы возможности системной терапии миодистрофии Дюшенна путем местного введения генотерапевтических конструкций;

Практическая значимость:

Полученные результаты могут быть использованы в качестве экспериментальной

• 1 • основой для разработки доклинических и первой клинической фаз испытаний геннотерапевтических конструкций для лечения миодистрофии Дюшенна.

Апробация работы

Представленные в диссертации результаты были доложены на VIII итоговой конференции «Геном человека-98» (Черноголовка, 1998), 30 ежегодном совещании Европейского общества по генетике человека (Лисабон, 1998), VI совещании Европейской рабочей Труппы по генной терапии человека (Иерусалим, 1998). V Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 1998), II Американском ежегодном совещании по генной терапии (Вашингтон, 1999). IX итоговой конференции «Геном человека-99» (Черноголовка, 1999), II съезде Всероссийского общества генетиков и селекционеров (С-Петербург, 2000), Ежегодном совещании по генетике человека (Канада, 2000), II Всероссийском съезде медицинских генетиков ( Курск, 2000).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 20 работ.

Структура и объем диссертации

Работа изложена на 111 страницах машинописного текста. Иллюстративный материал представлен 8 таблицами и 13 рисунками. Диссертация состоит из следующих разделов: Введение, Обзор литературы, Материалы и методы исследования, Результаты и обсуждение, Выводы. Список литературы насчитывает 165 наименований.

11

2.'Обзор литературы.

Миодистрофия Дюшенна/Беккера (МДД/Б) является наиболее частым среди сцепленных с полом наследственных заболеваний человека. Основным клиническим проявлением МДД/Б является прогрессирующая мышечная дистрофия. Миодистрофия Дюшенна встречается с частотой 1 на 3500 новорожденных мальчиков (Горбунова и др., 1998), характеризуется ранним, до 5 лет , проявлением симптомов и последующим тяжелым течением заболевания. Прогрессирующая мышечная дегенерация приводит к потере подвижности и летальному исходу из-за сердечной недостаточности либо отказа дыхательной мускулатуры в возрасте до '20 лет (Partridge, 1997). Миодистрофия Беккера 1

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Баранов, Александр Николаевич

ВЫВОДЫ

Эффект трансфекции (появление дистрофии положительных мышечных волокон - ДПМВ) показан при доставке гена дистрофина с помощью: аналогов вирусных олигопептидов, полимерных микросфер MF2 и генного ружья; трансфекция in vivo с использованием поликатионных липосом оказалась не эффективной .

Максимальное число дистрофии положительных мышечных волокон (до 20%) и отсутствие выраженных дегенеративных изменений мышц, отмечены при доставке плазмидных конструкций в , опытах in vivo с помощью микросфер MF2 и "генного ружья".

Высокий уровень ДПМВ (до 16%) при использовании в качестве носителя аналогов вирусных олигопептидов, сопровождался появлением волокон с аномальной, цитоплазматической локализацией дистрофина и дегенерацией миофибрилл, что делает эту систему мало пригодной для доставки кДНК гена дистрофина in vivo.

Методами FISH и электронной микроскопии, доказана высокая эффективность внутриядерной доставки генов с использованием полимерного носителя MF2 in vitro и in vivo.

Показана возможность преодоления гемато-энцефалического барьера экспрессирующими генными конструкциями в составе синтетических полимерных микросфер MF2.

• 1 ■

Внутримышечное и параэнтеральное введение генных конструкций при помощи аналогов вирусных олигопептидов , полимерных микросфер MF2 и "генного ружья" сопровождалось появлением ДПМВ в скелетных мышцах, удаленных от места введения, а так же в диафрагме и в сердце. Высказано предположение, что данный эффект, названный нами "феноменом дистантной трансфекции ", открывает реальные перспективы для разработки генотерапевтических подходов к системному лечению миодистрофии Дюшенна и других нервно-мышечных заболеваний.

96

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Баранов, Александр Николаевич, Санкт-Петербург

1. Баранов B.C. Генная терапия медицина XXI века // Соросовский образовательный журнал 1999 (а), 3, с.63-68

2. Баранов B.C. Отчет о IV рабочем совещании по генотерапии миодистрофии Дюшенна//Генетика 1999(6), 35, 12, с. 1724-1726

3. Баранов B.C., Баранов А'.Н. Генная тйрапия моногенных наследственных• I ■болезней. Миодистрофия Дюшенна. //Вопросы Мед. Хим., 2000, 46,3, с. 279293.

4. Горбунова В.Н., Баранов B.C. Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний // С.-Петербург, Специальная литература. 1997.

5. Зеленин А.В. , Кайгородоц В.А., Прасолов В.С. Генная терапия сегодня и завтра II Молекулярная биология 1998 ( а), 32,2,с.219-228

6. Зеленин А.В. Некоторые современные тенденции развития работ по генной терапии // генная терапия- медицине будущего , ред. Зеленин , М, ВИНИТИ, 2000, с. 127-12997i«

7. И.Кузнецова Т.В., В.С.Баранов, Н.Ю.Швед, А.Н.Баранов. "Пренатальная диагностика хромосомных болезней плода". Методические рекомендации. Санкт-Петербург, 1995, 21 стр.

8. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование.// Перевод с англ., «Мир», Москва: 480с, 1984.

9. Михайлов В.М. , Зеленин А.В., Штейн Г.И. и др. Дифференцировка мышечных волокон мышей mdx после баллистической трансфекции кДНК гена дистрофина человека//Цитология 1998, 40, 5, 401-406

10. Acsadi G, Massie B, Jani A, Adenovirus-mediated gene transfer into striated muscles // J. Mol. Med. 1995, 73,4, P. 165-80.

11. Ahn AH, Kunkel LM. Syntrophin binds to an alternatively spliced exon of dystrophin // J. Cell. Biol. 1995, 128, 3, P. 363-71.

12. Anderson JE, Kakulas BA, Jacobsen PF, Johnsen Ш}, Kornegay JN, Grounds MD .Comparison of basic fibroblast growth factor in X-linked dystrophin-deficient myopathies of human, dog and mouse.// Growth Factors. 1993, 9,2, P. 107-21.

13. Anderson W. F. Human gene therapy // Nature 1998, Vol 392, Supp, P. 25-30

14. J ^ musclce fibers with dystrophin and LacZ genes delivered in vivo by syntheticй .microspheres // Gene Therapy, 1999, 6, P. 1406-1414.6

15. Baranov Y.S., Zelenin A., Baranov A.N. et al., Human dystrophin gene expression in mdx muscles after in vivo ballistic transfection, application of synthetic/1.olygopeptide complexes and cationic liposomes // NATO ASI Series, Subseries

16. Bashkin P., Razin E., Eldor A. et al ., Degranulating mast cells secrete an endoglucosidase thet degrades heparin sulfate in subendothelial extracellular matrix//Blood 1990,75, P. 2204-2212

17. Bernasconi P, Torchiana E, Confalonieri P, Brugnoni R, Barresi R, Mora M,

18. Cornelio F, Morandi L. Mantegazza R. Expression of transforming growth factor2j

19. Bieber F.R., Hoffman E.P., Amos J. Dystrophin analysis in Duchenne muscular dystrophy: use in fetal diagnosis and in genetic counseling Am.J.FIum.Genet.f 1989, 45, P. 362-367щ

20. Brennman J.A., Chao D.S., Xia H. et al., (1995) Nitric oxide synthase complexed with dystrophin and absent from skeletal muscle sarcolemma in Duchenne muscular dystrophy// Cell, 82, P. 743-752

21. Brown SC, Lucy JA. Functions of dystrophin.// In "Dystrophin. Gene, protein and cell biology". Edited by Brown S.& Lucy J. Cambrige Univ. Press. 1997, P. 162 -200.

22. Bulfield G, Siller WG, Wight PA, Moore KJ. X chromosome-linked muscular dystrophy (mdx) in the mouse //Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1984,81, 4, P. 1189-92.

23. Burke JF, Mogg AE. Suppression of a nonsense mutation in mammalian cells in vivo by the aminoglycoside antibiotics G-418 and paromomycin. // Nucleic Acids Res. 1985, 11, 13(17) , P.6265-72.

24. Burmeister M, Lehrach H. Long-range restriction map around the Duchenne muscular dystrophy gene // Nature. 1986. Vol. 324. P. 582-5.

25. Burmeister M, Monaco AP, Gillard EF, van Ommen GJ, Affara NA, Ferguson-Smith MA, Kunkel LM, Lehrach H. A 10-megabase physical map of human Xp21, including the Duchenne muscular dystrophy gene,// Genomics 1988, 2, 3. P. 189202.

26. Burton EA, Tinsley JM, Holzfeind PJ, Rodrigues NR, Davies KE. A secondi ■promoter provides an alternative target for therapeutic up-regulaticin of utrophin in Duchenne muscular dystrophy.// Proc Natl Acad Sci U S A. 1999, 23,96(24), P. 14025-30.

27. Campbell KP. Three muscular dystrophies: loss of cytoskeleton-extracellular matrix linkage // Cell. 1995 , 80, 5. P. 675-9.

28. Canki N, Dutrillaux B. Two cases of familial paracentric inversion in man associated with sex chromosome anomaly. 47,XXY,inv(5)(q21q32) and 45,X,inv(7)(qll.3q22.3)//Hum. Genet. 1979, 47/3, P. 261-8.

29. Carlson B.M.& Faulkner J.A. The regeneration of sceletal muscle fibers following injury : a reviev // Medicine & Science in Sports & Exercise 1983, 15, P. 187-1981001. Л 4li 1г•■4-I:

30. Carpenter S, Karpati G, Robitaille Y, Melmed C. Cylindrical spirals in human skeletal muscle // Muscle Nerve. 1979. Vol., 2, N4. P. 282-7.

31. Chang WJ, Iannaccone ST, tlau KS, Masters BS, McCabe TJ, McMillan K, Padre RC, Spencer MJ, Tidball JG, Stull JT. Neuronal nitric oxide synthase and dystrophin-deficient muscular dystrophy // Proc.'Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996, 93, 17, P. 9142-7.

32. Chojkier J., Houglum K., Solis-Herruzo J., et al. Stimulation of collagen gene expression by ascorbic acid in cultured human fibroblasts. A role for lipid peroxodation ? //J.Biol. Chem. 1989 , 264, P. 16957-16962

33. Clemens P.R.,Kochanek S.,Sumada Y,S.Chan,H.H.Chen, K.P.Camp bell, C.T.Caskey. In vivo muscle gene transfer of full-length dystrophin withadenovirus vector that lacks all viral genes // Gene Therapy 1996,3,11, P. 965-972.i

34. Clemens PR, Kochanek S, Sunada Y, Chan S, Chen HH, Campbell KP, Caskey CT. In ■ vivo muscle gene transfer of full-length dystrophin with an adenoviral vector that lacks allviral genes // Gene Ttier. 1996,. 3, 11, P. 965-72.

35. Clemens PR, Krause TL, Chan S, Korb KE, Graham FL, Caskey CT. Recombinant truncated dystrophin minigenes: construction, expression, and adenoviral delivery. // Hum Gene Ther. 1995, 6(11), P. 1477-85.

36. Clerk A, Morris GE, Dubowitz V, Davies KE, Sewry CA. Dystrophin-related protein, utrophin, in normal and dystrophic human fetal skeletal muscle // Histochem. J. 1993, 25, 8, P. 554-61.

37. Coonrod A, Li FQ, Horwitz M. On the mechanism of DNA transfection: efficienti ■gene transfer without viruses.// Gene Ther. 1997, 4(12), P. 1313-21'.

38. Cooper BJ, Winand NJ, Stedman H, Valentine BA, Hoffman EP, Kunkel LM, Scott MO, Fischbeck KH, Kornegay JN, Avery RJ, et al. The homologue of the Duchenne locus is defective in X-linked muscular dystrophy of dogs // Nature 1988, 334, P. 154-6.

39. Cox GA, Cole NM, Matsumura K, Phelps SF, Hauschka SD, Campbell KP, Faulkner JA, Chamberlain JS. Overexpression of dystrophin in transgenic mdx mice eliminates dystrophic symptoms without toxicity //Nature. 1993, 364, P.725-9.•4