Невирусные носители для доставки ДНК в клетки млекопитающих с целью генотерапии миодистрофии Дюшенна

Киселёв, Антон Вячеславович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Невирусные носители для доставки ДНК в клетки млекопитающих с целью генотерапии миодистрофии Дюшенна
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Невирусные носители для доставки ДНК в клетки млекопитающих с целью генотерапии миодистрофии Дюшенна"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

КИСЕЛЁВ Антон Вячеславович

НЕВИРУСНЫЕ НОСИТЕЛИ ДЛЯ ДОСТАВКИ ДНК В КЛЕТКИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ С ЦЕЛЬЮ ГЕНОТЕРАПИИ МИОДИСТРОФИИ ДЮШЕННА

Специальность: 03.00.04 - биохимия 03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2005

Работа выпо.шена в лаборатории пренатальной диагностики наследственных и врожденных заболеваний человека ГУ НИИ Ак\шерства и Г инеколот ии им Д О Опа РАМН

Научные руководители член-корреиюндент РАМН проф , Варанов Владислав Сергеевич кандидат биологических наук доцент Диже Г алина Петровна

Официальные оппоненты доктор биологических наук проф Перевозчиков Андрей Петрович

доктор биолот ических наук проф Горб\нова Виктория Николаевна

Ведушее учреждение Институт Гриппа РАМН

Защита состой гея Д-ПрСЛ^ч 2005 1 п {$ часов на заседании Диссертационного совета

Д 212 232 09 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Санкт-Петербургском ! ое>дарственном университете по адресу 199014 Санкт-Петербург, Университетская наб 7/9, СПбГ У

С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке Санкт-Петерб\ргского государственного университета

Автореферат разослан 'М ' Г^А-р-^ 2

2005 г

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук проф

3 И Крутецкая

¿go* ЧШМ

yffi/S bP ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Стремительный прогресс в расшифровке icnoMa человека идентификации ею генов. впечатляющие успехи биотехнологии летают все более актуальной разработку научных основ генной терапии наследственных заболеваний

Мышечная дистрофия Дюшенна (МДД) - является наиболее частым настедственным нервно-мышечным заболеванием человека Частота встречаемости МДД состав тяет 1 на 5000 новорожденных мальчиков (Emen', 1991). I ен МДД локализован на Х-хромосоме в локусе Хр21 1 и имеет размер ботее 2 4 млн п о явтяясь самым большим из и«есгных генов человека (Koemg et al, 1987. Hoffman et al . 1987) Основным продуктом гена в мышечных тканях является лрисарколеммный белок дистрофии, выполняющий функцию связующего «вена между внутренним цитоскелетом чиофибриллы и внеклеточным матриксом (Koemg et al .1988) Отсутствие дистрофина при МДД приводит к повышенной проницаемости сарколеммы и обраюванию в ней физических разрывов, что ветет к некрсчу мышц (Brown et al. 1997) Эффективная медикаментозная терапия МДД то настоящего времени отсутствует, поэтому так актуальна разработка ienoтерапевтических подходов к лечению этого забо тевания

Генная терапия заключается во введении в клетку нуклеиновых кислот с целью исправтения тенных тефектов или придания клеткам новых функций (Mountain. 2000) Восстановление нормального состояния мышечных вотокон при МДД является одной из основных задач генной терапии данного заболевания Считается, чго достижение терапевтического эффекта возможно при восстановлении синтеза дистрофина не менее, чем в 20% мышечных волокон (Браун. 2003) Необходимый уровень трансфекции в экспериментах на мышах mdx - биологических моделях МДД - был достигнут го гько с помощью вирусных векторов (Clemens et al 1996. W ang et al 2000) Однако использование вирусов наталкивается на существенные мето шческие трудности а также выраженный иммунный ответ организма на вирусные антигены Невирусные носители лишены этих недостатков, однако, }ффективносль трансфекции при их испо тьзовании. как правило невысока Основными функциями носителя являются компактизация ДНК. тканеснецифичный транспорт и эффективное проникновение в клетки, а также защита генетической консгру кции or тизосомальчои дегра шции (Pouton et а! . 2001) Кроме того, носитель должен бьггь нетоксичным и биодеградируемым.

Одним и! нанрав гений в области разработки синтетических средств госгавки ДНК является соиание носителей na 6aje ситттетичских пепти tob (Wyman et dl. 1997. bormnaya et al. 2000, Rrttner et al. 2002) К их преимуществам относятся биотеградируемость. легкость мо шфикации структуры и аминокис го г ного состава Однако, несмотря на масштабные исс тедоваггия петитных средств лоставки генных конструкции в шяние рагличных молификаиий на их трансфекционную активность изучено неюсгагочно

1аким образом, поиск и изучение новых пешишых носителей для гоставки ДНК в к гетки млекопитающих является актуальной проблемой генной терапии, в тоут чис ге генной терапии МДД

Цель работы заключается в поиске пептидных носи¡е гей перспективных для доставки генных конструкций в клетки млекопитающих и разработке новых подходов к генотерагтии мышечной дистрофии Дюшенна

Достижение этой цели преду сматривало решение следующих задач: Изучить особенности трансфекции мышечных волокон утышей mdx генетическими конструкциями с кДНК гена дистрофина с помощью аналогов вирусных олигопептидов и катионных типосом Оценить эффективность супрессии нонсенс-мутации в гене дистрофина у мышей mdx конструкгщяуш с геном супрессорной тРНК

Изучить условия образования и особенности структуры комплексов ДНК с пепгитньгми носителями Проанализировать в шяние состава и структуры иссгегуемых носителей на трансфекционную активность in v itro

Научная новизна и теоретическая значимость, впервые изучены особенности трансфекции мышечных волокон мышеи mdx генетическиуги конструкциями с кДНК гена дистрофина. поставляемых с помощью аналогов вирусных о шголепгидов и катионных типосом Впервые изучена вотможность коррекции нонсенс мутации в гене шелрофина у мышей mdx с помошью супрессорных тРНК Разработан оптимальный алгоритм тестирования синтетических о гигопептидов в качестве потенциальных векторов доставки экспрессирующихся генных конструкций в к гетки

млекопитающих Впервые изучены особенности тр 1нр^щг|)ДЦ||<)|М№НЗДФшсм '"¡иновыч

БИБЛИОТЕКА

о.

тендримеров и альфа-спиральных литтопепш юв Проанали¡ировано влияние состава и ыр\кгуры исследованных синтетических пептидных носителей па их грансфекционную активность in \itro

Положения, выносимые па шшиту: Использование нуклеопептидных коми тексов pHSADy/K8-.17S-1 существенно повышает эффективность трансфекции мышечных волокон m wvo Наличие жслрессии гена дисгрофина в скелетных мышцах, отдаленных от места введения, подтверждает гипотезу "дистантной трансфекции» Введение с>прессорных гРНК мышам mdx приводит к частичном) восстановлению синтеза дистрофина

Пептиды D1 и D2. ИМ и FP4 способны компактизовать ДНК, дос1авля1ь ее в клетки млекопитающих ш vitro и обеспечивать экспрессию маркерных генов, значительно превышающую таковую при введении чистой п щзмиды Модификация тизиновых денлримеров остатками пальмитиновой кислоты изменяет с i рук i ур> комп тексов ДНК-пепгид и способствует их проникновению в клетку Присоединение к линейным альфа-спиральным пешидам остатков каприновой кислоты увеличивает их мембраноактивные свойства и повышает эффективность трансфекции

Практическая тачимость работы. Полученные реч\ 1ыагы могут найти применение на доклинической фазе испытаний новых iенотерапевтических подходов в течении миодистрофии Дюшенна, а также других наследственных заболеваний

Апробация работы. Представленные в лиссертации результаты бьни до южены на f и V Ьжегодной конференции Американского Общества Генной Терапии (1998. 2002) на 9 10 11 и 12 Конгрессах Гвропеискою Общества Генной Терапии (2001. 2002. 2003 2004). на 10 и 14 Европейской Конференции по Генетике Человека (2001. 2004). на 27 Европейском Симпозиуме по Пептидам (2002); на 10 конференции "Синтез. исс тс ювание свойств модификация и переработка высокомолекулярных соединении" (Казань 2001), на Ш съезде ВОГ ИС (Москва. 2004)

Публикации По материалам диссертации опубликовано 20 работ, из них 7 статей Объем и структура диссертации Диссертационная работа состоит из ввеления. обзора литературы, экспериментальной части, включающей методы и результаты исс тетования, обсуждения полученных результатов. заключения, выводов и списка титерат\ры. состоящего из {( источников Работа изложена на страницах и содержит рисунков и J9 габ тип

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Эксперименты по невирусной доставке ДНК-копсгрукций щ м\о проводити на биолотических моделях МДД - мышах линии C57B16J mdv'mdx (mdx). несущих нонсенс мутацию Г A A (Gin) ~ - í АА (Ochre) в 24 жзоне тена дистрофина (пре юсгавлены проф 1 Партриджем (Be шкобритания)) Исследования in Mtro проводити на к теточных линиях Hela и HepG2 (Банк к теточных культур Институ г циголот ии РАН С1161 Д тя трансфекции in\т\о испо тьзовали плазмилы содержащие кДНК гена дистрофина человека pHSAD\ и рЮ11025 dys (пре юстав тены проф Дж Диксоном (Великобритания) и др-м С Ьрауном (Франция), плазмиду с 1еном супрессорной тРНК (охр) -pcDNA3 sup tRNA ochre (прелое гавлена акал J1JI Кисе тевым ИМБ РАН) В экспериментах m vitro использова-ти плазмиду pC'MV nls I acZ. содержащую маркерный тен lacZ с ядерной локализацией продукта экспрессии ф-талактозидазы) (предоставлена проф Б Шольте Нидерланды)

В работе быш испо тьзованы следующие невирусные носители липосомы (LipofcctAMINE (Gibco-BRL). Fscort™ (Sigma)). о тигопептиды (К8 (YKAK8WK). JTS-1 (ОПТ ALLbLLI SLWFJ 1 I A). FP0 (YKAK7UK) FP1 (СК[С 10]-Ahx-YKAK7WK) FP4 (С-Ahx-WKK[f 10]ККК[С 10]-КККК[С 10]KYKK[C 10]КК). DI (К8-К4-К2-К-А). D2 (К8-К4-К2-К-K[C18]K[C18|G - синтезированы в ИВС РАН (лаб физиототически активных полимеров, зав лаб проф 1 П Втасов)). полипептиты (лактоферрин любезно прелое гав тен проф ММ Шавловским (НИИЭМ РАМН))

В опытах in \i\p комп тексы ДНК/носитель вподити непосредственно р. чсгырсхпав>то мышцу бе тра (m quadriceps lemon) Мышей умерццзля ш на раз тичных сроках посте инъекции (от э то 30 cv I).

Для анализа межтканевою распределения ДНК-конструкции с кДНК тена тистрофина использова ти метод но шмеразной цепной реакции (ПЦР) с прайчерами 521 и 53R (Chamberlain ct al 1988 Abbs et al 1991) Анализ экспрессии методом oópaiно-транскрипционной ПЦР проволи ж на образцах тотатьнои РНК. выделенных из ске тстных мышц по стандартной мет шке с некоторыми модификациями (C'homcyynsci et ai. 1987) Синтез фрагментов кДНК прово ти ти с испотъзованием

набора фирмы «Pharmacia» (№ 27-9264-01) Для проведения реакции обратной транскрипции использовали праймер 8d. комтементарный Т-конц\ 58 экюна гена листрофина (Roberls et al 1992)

Для анализа локализации листрофина на криостатных срезах мышечных волокон использовали по лик тональные антитела Р6 специфичные к С-концу бечка (нобешо прелое 1авлены проф П Слронгоч (Великобритания)) Процент диирофин-положитечьных мышечных но юкон (ДПМВ) рассчитывали по формуле

100 ' Кол-во ДПМВ на срезе Ко ¡-во MB в поле зрения * Кол-во полей зрения на срезе

Изучение формирования комплексов ДНК'пептид проводили меюдом ре!ардаиии в агарозном геле методом «зашиты» от ДНКазьг I (Vaysse et al, 2000) и с помощью трансмиссионной электронной микроскопии Для трансфекции кзеток на 24-лу ночных планшетах испотыоваш 5 мкг комплексированной носителем плазмидной ДНК В качестве контрольного носителя испо!ыовали катионные типосомы Escort1*'1 Д im и учения эндосомотитичсской активности носителей трансфекцию проводит в прис>1С1вии антибиотика хлороквин (Wolfen et al.. 1998) Вьтяв юнис активноии ß-i атактозидазы проводили по стандартной методике с субстратом X-gal (Sanibrook et al 1989) Математическую обработку результатов проводили с испотьзованием статистически о пакета Prism 3

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОЬСУЖДЕНИЕ.

Принципиальная схема исследовании фансфеиируюших свойств носителей (I ipofettЛVIIN4 и K8.IIS-1) m \i\o представ lena на рис 1 В экспериментах изучали >ффек!ивность доставки и 1а)мидною векюра в органы и тьани а также экспрессию введенных конструкций на уровне РНК и белкового продукта - листрофина

Экспрессионная конструкция pHSADy (содержащая кДНК гена дистрофина)

Образование комплекса плазмидная ДНК/носитель

Введение конструкции модегьным животным (внутримышечная инъекция мышам C57BI6J mdx/mdx)

Забор образцов тканей для оценки эффективности трансфекции и межтканевого распределения конструкции

/ i \

Иммунодетекция Метод ОТ-ПЦР Метод ПЦР

дистрофина

Рис 1 Принципиальная схема эксперимента по тестированию новых носи1е (ей ДНК in \i\o

Трансфекция мыши мышей mix конструкцией pHSADy в комплексе с липосомным носителем

LipofectAMINE.

Введение комплексов pHSADy 'I ipofectAMIN'b мышам mdx осу mee ib ¡я ш путем инъекции в че!ырех!лавую мышцу бедра Мышей забинали чере! 14 лней посте воздействия Конгро (ем служили интактные животные той же линии

На первом >тапе проводили анализ меж!каневого распределения iенетической консфукции в па!личных тканях методом ПЦР с использованием праймерои на ;часюк кДНК. соотвечсшующий 52-5"! жюпам гена дистрофина человека Проведенный анатиз выяви! п шмиду pHSADy только в мышце введения (рис 2).

1 2 3 4 5

Рис 2 Выявление кДНК 1ена дистрофина человека меюдом ПЦР в мышцах мышеи пк1х через 14 дней после однократною в'м введения комплексов рНЬАОу/1лро1сиАМ1?чП.

1 ~ инъецированная мышца. 2 кош ралатеральная мышца. 3 -мышца интактнои мыши шс1х (отрица]ельный кон!роль). 4 - плаптида рНЬАОу (положительный контроль). 5 мо теку гярный маркер

Количественною оценку жспрессии 1ена дис!рофина пронодили по чис 1\ во юкон с характерной присарколеммной локализацией белка шетрофин-тюложительных мышечных волокон (ДГ1МВ) на поперечных криостатных срезах (Рис 3) У мышей линии С57В1 6,! md\/mdx (нонсенс-му тация в 23 экзоне) присутствуют отдельные, т н ревертаннше ДПМВ, число которых не превышает 1% от общего чис ш мышечных волокон Существование ревертантных во юкон объясняю! вошикьовением спонтанных делений с выпадением жзона 23. содержащего нонсенс-мутацию. вследствие чего ьосстанав тивае1ся рамка считывания и формируется бетковыи продукт '1 и е! а1 2000) Число ДПМВ после введения комплексов рН5АГ>>/1 1ро1еаАМ^Ь в иньецированнои и коптралатералыгой мышце составило около 0 9% и практически не отличалось от таковою у интактных мышей тй\ (0 6%) Интересно чго при вве 1снии самой генетической консгр\кции без шпосомното носите ш ( "юлой» пы!чиды pMSAD>) количество ДПМВ составило 2 2 "о в иньецированнои и II % в контр&штеральнои мышце

Рис 3 Иммуноцитохимическая летекция листрофина на поперечных криостатных срезах 11) m quadriceps мышей 057 ül (2) m quadriceps C'^7 B1 mdx. (3) m quadriceps C57 B1 mdx посте введения кДНК lena листрофина. дистрофин-положите шные волокна (ДПМВ). (4) диетрофин-потожителытые мышечные волокна с диффумо-окрашеннои миоплазмой (ДПМВ-2)

Возможной причиной низкой эффективности трансфекпии миофибри.п с использованием катонных типосом является наличие внеклеточной) матрикса. заряженные компонент которого препятствуют попаданию нуклеолипидных комплексов ь миоплазму (Turner et al. 1497) Нижая эффективность доставки генетических конструкции в мышечные волокна m \i\o с помощью липосомных векторов отмечалась и в pa6oiax друтих авторов По-видимому, нос ie с ¡ияния с клеючнои мембраной генетическая конструкция освобождается от липидното вектора и попадает в эндосочы. где она рафушается нук.теазами Следовательно несмотря на высокую эффективность трансфекпии миоб тастов тп vitro (Tmerdi & Dickson 1995). катонные шпосомы малоприюшы ля трапсфекции мышечных ко юкон m м\о О шако вкночение в липосомный век юр компонентов, обеспечивающих выхол неповрежденной конструкции из эндосом, а гак же сигналов ядерной ipanc шкаиии. способствующих направленной тоставки чужеродной ДНК в ядро с\щественно повышает эффективность трансфекпии (Miller. 2003) Таким обраюм для эффективной доставки юна шегрофинл in \i\o необходимы бо lee с южные векторные сис1емы способнтле не тмько к нереносл iенетическои конструкции через сарко темму но и обеспечивающие ей преодо тение всех нос те туюшич барьеров (мембраны лндосом. цитоплазмы и ядерной мембраны)

Трансфекиия мыши мышеи mdx конструкцией pllSADy в комплексе с шнетическими

0 гигопептидами KS и JTS-1.

( ин iei ичсс,<ии о 'и^плепги шыи ком1 ickl KS 'IS-1 "осит^!1 ньвируснои ириро 'Ы to анныи ' oxapai-гери5пва'мым ip''п'ои tv рикгн т их uf uipr.p ч ! 996 , о ¡\ Данная i/i геча йы та ис т пана < ' i d И 1 \ 1Т1LTH С р^ iHi-ihi |П MlTO Г I I' I I Iv'i I, |рц pdl'ujieHMI* К1 I пр.' "ИОО dCTOT ( ~Ч 1 2 И теп тцигор [инии ((■' tulnlk ; ti ¡')96> Ком' лс, и' .юч^ю' ibi о i;i и KK

1 P" 1 , T p T-' ' f ,< ' 11 ' dec«1 RDM I К1И' (V.'H1- 111 ПОИ к. ЧГОН^Ч Ч4-- ci !л Hd <_40ht 1<1М»|'\ 'О "О Л /рчом' " [С .ITV'HJ-VK / I lI4tLK.iy I С li,1.14) вИр.С I pui'l.d i' 1 1

пептида JTS-1 мктючается в шзисс эндосоч и обеспечении выхода комплексов в цитоплазм)

Мышам mdx кочтпексы pHSADv'KS-fTS-l вводи™ в четырех! ывую мышцу бедра и забивали черет 5 14 20 и 30 дней после инъекции Контролем с тужили ишакшые животные гой же тинии.

Проведены с тедукшше серии эксперимент»

• Иньекция нукъ-опептидпых комплексов рНЬА!)\ K8-J1S-1 (12 мкг ДНК) с различным соотношением ДНК'КЯ ~ 1/2. 1/3. 1/4.

• Инъекция нуктеопептидных комптексов pHSAI)>/ K8-JIS-1 (20 мкг ДНК) с соотношением ДНК'К8 1/3 на дтитетышй срок экспозиции (до 30 дней).

• Трехкратная инъекция нуклеопептидных комптексов pHSAD>' KS-IfS-l (15у3 мкг ДНК) с соотношением ДНК К8 - 1 3

Рл шчные весовые соотношения ДНК'К8 ттозвотяти менять суммарный заряд комптексов JIHKK8J1S1 1ак при соотношении ДПК'КВ i2 суммарный ;аряд комплексов отрицательный, при 1 3 нейтра тьныи.а при 1 4 - но южительный (Gottchalk et dl ¡996) При >гом котичсство Л S-

1 и коми тексах оставалось неизменным

Наличие гпазмиты pHSAD\ в инъецированных m quadriceps опрс те тя ш методом [|ЦР (Рис 4) Присутствие специфическою проекта амплификации ратчером -25 и о в образцах 1-6 юкашваег наличие введенной конструкции независимо от заряда комптексов

12 ) 4 5 6 7 8 9

Рис 4 Выяв тепие кДНК ! ена широфина человека через 5 дней после однократною нт^тримышечного введения комплексов рНЧЛО>/К8-П 8-1 при раз гачных соотношениях ДНК К8 (12- дорожки 1.2. 1.3 - дорожки 3.4- 1.4 - дорожки 5.6) Образен 7 - отрицательный контроль

1 2 3 4 5 6

Рис 5 ')лектрофорет рачча проектов амплификации кДНК тена тистрофина человека ситпс5ированной на матрице чРНК черс; 5 шеи нос те однократного вн\ тримышеччого вве ;ишя комптексов pi ISAD>'K8-ITS-! с раз шчныч соотношением ДНК К8 Обрашы 1. 2. 3 соотношении ДНК'К8 '2 13 1'4 соответсгвенно Oopafen 4 - отрицате тьныи кочгроть {гп

quadriceps ингактнои мыши mdx) Образец "> - по южителышй кон фоль (m quadriceps мыши С57 В1)

Для аналта экспрессии гена шстрофина человека в иньепированньтх m quadriceps мышей mdx метолом ОГ-ПЦР использовали праймеры на участок кДНК С001ве1С1вуюпшй 52-^3 экзонам гена листрофина четовека (Рис 5) Присутствие продукта амплификации в образцах 1 2 "5 свизетельствус-т о наличии экспрессии ввезенной консгр\кции в мышце введения

Оценку эффективности трансфекции на уровне белкового продукта прои^ио гата ч\ lev но 1счста ю ти дистрофии но тожитетьных мышечных возокон (ДПМВ) на поперечных срезах ске тетпых мышц С57 B1 mdx (Рис 6)

»дпмв

20 18 16 М 12 10 8 6 4 2 О

ин 1/2 к л 1/2 ин 1/3 к л 1/3 ин 1/4 к л 1/4 контр

0ДПМВ 1 0ДПМВ-2

Рис 6 Ко шчесгво дистрофин-по тожительных мышечных волокон (ДПМВ) у мышеи mdx через 5 шей после однократного внутримышечного введения комплексов pHSADy 'K8-ITS-1 с различным соотношением ДНК'К.8 ИП - инъецированная m quadriceps. К Л конфалатеральная m quadriceps При испо (ьзовании отрица1ельно заряженных комплексов (12). показана сравнительно шикая эффективность трансфекции (до 3 2%). что. по-видимому можно объяснить слабым таимо тействисм комплексов с отрицательно заряженной мембраной миофибризл Использование по южите 1ьно заряженных комитентов (1.4), приводило к значительному увешчению числа волокон жспрсссируюших дистрофии (ю 16%) Однако, в бо шшинстве таких во юкон чабтюлалось тмогенное распространение фтюоресцируюшсго сигнала на срезе волокна что свидеге 1ылвова.ю о неправильной юкализаиии листрофина. обуслов 1енной по-ви тимому. гиперэкспрессией конструкции pHSADy в мышечных вотокнах Значительная инфильтрация млкпофагами \к нывата на процессы апоптоз? начавшиеся в таких волокон ГТояв ic-ние по тобнпх f'moi о>, б| (м о мечено "икс iidvi' i'ic w. 6(ii ги< гичес> ои фансфекиии Не lunih л 1998 ■р '998} а ыкжо h ртг'итл .г их вгоров 'YcinaLihdia el a1 1996 ' V-mcin t! <i!

Мч> ы ни i 996,

В . !\ 4 <)' с m

н^Гпр' i чп > • p/Aiiin \ Komi скс(р <1 ii >гМи.ыи-ч'о,.1| "iiHí'je iv co^i ' -

г 1- И чом MMt illv' "WCH "ii i4| üiHL во Г I Oll с ) H"iTI I' 4 ]">>!' " чц

м " м'мп»' и im i'ik (luí u^nine" кмрел чошим ha ii<n ни ч< ч l> ч На ом основании соошошение ДНК К8 1 3 бы то признано оптимальным для дальнейших исс (сдований В экспериментах но лоставке генетической конструкции pHSADy в составе комп 1ек-сов K8/1TS-1. бьпи получены лоно шительные доказательства существования феномена "дистантной трччсФегмией оГч ю- лечного mim- в ирстьп" ших и^с хлопаниях <"3е тенич и m 1098 Ьт-'гпв

'/А В

'1!'| 1 ЧН41Х I ( и i и ч I П I > ri IP

Чм ¡ net - I1 м > ч

Ч ' I V 'i' 1 1И ,1 ill 1 u i ii' 1 ' '-"i i

1иафра1ме мже черс

н о

if IF

Он i<

"L I |Я

14 ?В '

л'><

ч 'КС IPIU.T чЬ'сср О"

i I ¡- ЛИ > I' Р ■

II , • г р( (> I ' _ И

шеи hoc ie ввезения

ins i" "itTiH i4' i- i чн'сср о"ip i-1 пеги м 1 пи

\)1 " ' 'i I I " I П I 14 .

11 1'1 'с >tl ■ о' 'И,' ,'ci 11 II ' IIIHV 'ри

! ер \f> HCl1 ' Hl 1

„ " Т' ' ' ~ ' I ■ i ' к V . ,

>ти реп тылы по 1тверж idL-i распроыранение

введенной конструкции с кровотоком попадание и экспрессию трансгена н разных тканях

При исследовании длите шности экспрессии введенной конструкции выявлено достоверное снижение количества ДГ1МВ на 14 и на 30 день посте внутримышечной инъекции нейтр&шных нуклеопепгидных коми ¡ексов (от 3,8% до 0 9% соответственно) При лом обращало на себя внимание 0|с\1с!вие волокон с гомогенно окрашенной миоплазмой па 14 и 30 лень Все обнаруженные ДИМВ характеризовались правильной присарколемной локализацией дисфофина (Рис 7)

%дпмв

20 18 16 14 12 10

8 - -Шрг

6 4 I , _ „ ____

2 н РТЯ № гп

0 Ю Ш1 гтн !Ш ____ 1 1

ин к/л ин к/л ин к/л контр

14 сут 14 сут 30 Cf 30 сут 20 сут 20 сут

□ ДПМВ-1

Зх коатное введение

ЗДПМВ-2

Рис 7 Ко шчесво тисфофин-по южигсч.пых волокон в инъецированном и конгра шсральнол m quadnceps в зависимости от лозы конструкции pUSADy и времени жинишши в opi ани¡ме ИП - инъецированная m quadriceps. К'Л - кон фала теральная m quadriceps

При увеличении дозы ДНК (трехкратное введение И мкг pUSADy в составе комплексов KX'JTS-1 с интервалами в 2 шя. ¡абор образцов через 20 дней посте первою введения) было обнаружено повышение числа ДПМВ (17 2% в инъецированной мышце и 12 0% в контралатеральнои) Олнако. значшоьную час!ь тистрофин-по.южите тьных миофибри 11 сое |дв 1я ч> «отокт с томогенро окраше'чти мнотра^мпи Возникновение боишото чис п ДПМВ пос ¡с уветичепия то!ы вводимой конструкции полтверж iaei предпо южение о гиперткспрессии иве ichhoh конструкции в таких волокнах Таким обратом ^»ве мчение до!ы вволимой ^онсфукции смпественно не в шяет на число трансфецированпых мышечных во юкон с ирави шной присарко 1смнои токади ¡апиеи дисгрофина

Использование охр тРНК для супрессии нонсенс-мутации в гене дистрофина

Исправление и ш направленное изменение нуктеотидных последоватетьностей с iочечными мутациями или короткими делениями - коррекционная генная ¡ерапия - яв1яегся альтернативой комплементационной генной терапии (введение в клетку кДНК нормальною iena) (Atkinson et а!. 1994) В 10-15% случаев МДД обусловлено нонсенс-мутациями в кодирующей части тена листрофина (Kaufman 1999) Известно, что стоп-кодоны мо[ут бьпь прочитаны с помошью супрессорных iPHK (Kisselev et al , 2000)

Нами изучена возможность коррекции при юане тяции мутангнои мРНК дистрофина у мышеи mdx с помошью супрессорных iPIIK Для получения супрессорных тРНК охр бы ia иепо тыована тенетическая конструкция pcDN'A3 sup tRNA ochre в составе коми ickcob с белком зактоферрином (С ино! еева и др . 2001)

Ьы ш проведены с 1едуюшие серии экспериментов

• Введение комплекса плазми (ы с геном супрессорной гРНК охр pcDNA3 >up tRNA ochre 'дактоферрин

• Введение комплекса плазчиды с потнора!мерной кДНК 1ена дисгрофина plG11025 d\s ' лактоферрин (по южигельный контроть)

Комп 1сксы pcDNA3 sup tRNA ochre ' 1актоферрин и рЮП025 dys'тактоферрин ввошш в четырех! тавую мыпшу бедра Мышей ¡абивали через 7 и 14 тней hoc ie воттействия Контро тем

сл\жили инлактные животные той же шнии Критерием 1ффемивночи 1\прес<ии нонсенс-ч\гации явтя юсь изменение юти мышечных во токон жспрсссиругоших шефофич 1абт 1 Изменение чиста дистрофин-по южительных вотокон в инъецированной т quadпceps мышей тс)х посте поставки генетических конструкций рсПМАЗ чир осЬте и рГГт 11025 ^ с

Конструкция Доза чкг 1 Срок { % ДПМВ

pcD\A3 sup tR\A oohri 1 1 i 24 I 1

pcDNAl sup tRNA ochre I 25 14 2 6-0 2

pl Ci d\- 25 7 ¡ _ 4— 14 3 8 12

p ГО dy ь 2^ i 7-0 й

k мтр 11 (иры* i ые г1 J\) U h 0 1

1 loe тс введения ч 11 ptDNA >нр IRN, ^ /осЬк

роли1 ли. ДПМВ визр 'а.ю (о 2 < сохрани ч-и п< >. Дншое !Н'"еиие петоверно выше о ч< р<ч)сртанпш\

I в составе Д1IK-ñi ткорч\ кочте'coi. чя"Ш'\11 течение 2-х ..'en ilaó !l Bf юкоч 'тр1»с\тствмоч1И\ в ммыпах

мншей mdx (менее 1%) но нсскотько ниже, чем при использовании пта!милы рТО 11025 dys. содержащей полноразмерную кДНК гена дистрофина человека (3 8%)

Таким образом из лвух возможных по тхо юв к ¡енотерапии МДД комп темешациошкло и коррекпионного ботее эффективным ока ¡алея комтеметпанионный - вве (ение нормальной копии lena тисфофина в cocíase плазмиды plG 11025 dys

С le iyei 01мегить что испольювание и других способов коррекции мутаций в мРИК (атписенс-нуь теоти ил. чимерап >асш) оказалось менее эффективным, чем введение в h ictk> нормальной ьДНК i сна дистрофина Волюжной причиной но'о явтяе!ся нсобчо шчость создания определенного пула низкомо юку тярной РНК в кте!ке для начала процесса коррекции (Rando. 2002), и наличие в кзетке механизма уничтожения мРНК несущих нонсенс-мутацию, вс ]едствис ко юрой в миофибриллах мышей mdx сохраняемся не более 10% гранскриптов гена дистрофина (Kisselev et al. 2000. Chamberlain et al . 1988)

Таким образом, но [ученные данные еви те!ельств\ют о принципиальной возможности применения супресеорных тРНК в [енотерапии МДД обусловленной точечными мутациями ити короткими делениями Актуальной проб ]емой. отнако. является обеспечение )ффек1ивной доставки конструкций с генами супрессорных iPHK в мышечные клетки

Липопептиды и iтиповые дендримеры как векторы доставки генетических конструкций

Исходя ш резу штатов опьпов ( ojihiопептидными комплексами К.8 HS бы m еннтещрованы новые пепти шые носи юли - липопепти <ы и лиишовые дендримеры и исслелованы их свойства m \itro как вотчожных носителей 1енных конструкций Дендримеры Ш и D2.

Поси[еш D1 и D2 относятся к классу асимметричных дендримеров и представ шот собой ра!веттенные чо теку ты. в точках вечвюния которых распо 1агается ачинокис кил ш-шн Пептид D2 модифицирован двумя остатками пальчиптновой кислоты

D1 02

1/0,4 1/0,8 1/1 1/1,2 1/1, 5 1/2 К

К 1/0,4 1/0,8 1/1 1/1,2 1/1,

1/2

Рис 8 Оценка эффективности свя!ывания птазмидной ДНК носителями D1 и D2 при раиичных ырядовых соотношениях

При изучении комгиыизуюших свойств тен тримсров D1 и D2 чеголоч г с ть-pciррдации показано что гашгые пептиды способны обеспечивать но гное связывание п тазугиды при заря говых соотношениях ДНК'носите ть 1'1 и 1/0 8 соответственно Полученные танные показывают что присутствие в составе D2 остатков па гьмитииовой кис юты уветичивает его ДНК/связывающие свойства по сравнению с D1 (рис 8)

Защищенность плазчидной ДНК, кочпактизованнои пептидами D1 и D2 от нуктеазнои игра нации анализировали с использованием метода защиты от ДНКазы (DNAse 1 protection assay)

А В

1/0,4 1/1 1/2 1/4 К+ К

К+ К- 1/0,4 1/1 1/2 1/4

Рис У Эффективность зашиты ДНК от ДНКазы I тендримерами Dl(a)nD2íh)

Зашита плазчинной ДНК наблю илась при зарятовом соотггошении 1 2 (Рис '■)} С ледова re тьно комплекс ДНК ленлричер способен обеспечить защиту ДНК от разрушения внутриклеточными нуклеазачи

Эффективность трансфекпии пгазмиды pCYlV nls !ас/ носите гячи D1 и 1)2 >'сс геновали на к тетках ку тыуры Hela Показано что носители 1)1 и D2 обеспечивают 'ровен» трансфекции лостоверно превышающий таковой при введении "голой« ДНК ( !аб т 2)

Таб т 2 Доля клеток (%). жспрессирутощих fi-галактози тазу пос ге трансфекции п тазми той рГМУ пК 1ас/ в комплексе с носите тями D1 и D2

Зарядовые соотношения

1/1

1/2 1/4~

1/8

- контроль (голая ДНК)

+ контроль (Escort)

Носитель

0,45±0,05

0,24±0,11

0,86±0,41

0,22±0,17

0,12±0,04 ~077±0,22 Ó,98±0,65

—I

Менее 0,01

10,0±2,0%

П не lov более высокую эффективность трансфекпии с помощью лендиругера 1)2 по ерл пению с D1 можно объяснить гидрофобносльто D2. влияюигей на структуру ею коуш гсксов с ДИК Не иск гючено что г и лрофобноегь комплекса способствует взаимодействию с мембраной эндосом Ч< . >"> чо 'I О ф то прс Н'О Í ч ч Ч ' О T'ocd 1 ' < ')2 об la тле i 1 ОМ" til 'кЛ, -'Il з т <Г' 1 < проверки пот о upe tno южечия бчл пропс теп ря т неперимешов i о трттсфет чии к ч к < тп ' 'Ч и ij4i,r >1 с ■ BT!t' )i юмс( чшщс .>атсп гхчроьв.тт (Pre И')

1)'

\ С I 1ЧОи " П"И ti

I Г!'

> чт

г о

I )1

грш ' , С Г;

M С ') 8 , НИИ 'opr IU ¡ ¡OI ,WI> Ч И" •

ф(1 ei 1 р 'i,1

1ИВНОСЧ

ффеч И ' «Г 1< ^.'К l)1 НС

IHf-

активностью

1 8

1 6

0 1 4

| ,2

* 1

1 08

¿г 06

02 0

С1 02 1//4 1//4//0 66 1//4//1 33 1//4//2

Зарядовые соотношения ДНЮ02иТБ-1

■ без хлороквина П с хлороквином

Рис. Ю Влияние х.юроквина на эффективность трансфекиии плазмидой рСМУ пк 1ас7 в комплексе с дендримерами и изменение эффективности трансфекиии при различных зарядовых соотношениях комплексов рСМУ-п15-Ьас2/Т)2'.ГГ?-1.

Одной из возможных причин низкои эффективности трансфекиии даже в присутслвии хлороквина могло являться го. чю лишь небольшая доля комплексов избетает шзосомальной леградации (Рис 10) Для подтверждения тайного предпотожения в состав комп иксов ДНКТ)2 быт введен амфипатический пептид Л"Я-1. обладающий высокой эндосомолитической активностью Ььпо усгановлено. что у комп тексов с зарядовыми соотношениями ДНК'П2/ЛГЧ-1 равными 1 4'2 эффективность грансфекнии необычно высокая и достигает 25% (Рис 10) Важно, что уровень экспрессии маркерною 1ена обеспечиваемый данными комгт тексами превышал таковой при использовании коммерческою носите тя (Чсоп с 1>жившего в этих экспериментах в качестве положительною контроля

А В

Рис 11 Резу льтаты электронной микроскопии (а) ДНКУ1)2. СЬ) ДНК'D2 JTS шкала составляет 100 нм. увеличение 5Ü000X

Для изучения причин столь высокой эффективности трансфекиии. с помотцыо метода просвечиваюшеи электронной микроскопии были изучены форма и размеры комплексов ДНК'02 JTS-1 (рис 11) Быто показано, что размеры комп тексов ДНК D2 составляют 60-120 нм (рис 11. а), что находится в пределах размеров комплексов ДНК с другими компакт и зу тощими соединениями (потилизин потиимины и др ) (Bloomfield. 1997) Добав тение пептида J1S-1 приводи то к уменьшению размеров комплексов (до 40-100 нм) и устраняло агрегацию между ними (рис 11 (Ь))

1аким образом резу тыаты экспериментов показали, что носитети D1 и D2 способны образовывать комп тексы с ДИК и обеспечивают высокий уровень экспрессии маркерною гена, юсюверно превышающий гаковой при введении '"тоюй" плазмилной ДНК Показано что присутствие двух остатков пальмитиновой кис тогы в составе дендримера D2 улучшило ею грансфекционные и эндосомолитические свойства по сравнению с пептидом D1 В сочетании с пептидом ÍTS-1 лентример D2 образует комплекс являющийся перспективным носилелем для переноса жспрсссируюшихся генетических конструкции в опытах тп \ttro ¡ребуются дальнейшие исследования т тя выяснения вопроса о перспективности даннот о носителя в опытах m \ т\о

0 1-Е

Липопептиды ГРО, 1Р1 и ГР4.

Пептиды группы ГР прстставтяют собой о тиготизины с варьирующей гитрофобностью за счет присоединения остатков каприновои кистоты Для изучения изменения их кочптексообраз\юшей способности и мембранной активности нами быта синтезирована серия петитов сосюяшая и! катионното пептида (ГРО), не содержащего гидрофобных радикалов пептида с одним остатком каприновои кистоты (ЬР1) и пептид со стр\кт\рой способствующей формированию амфипатической '/-спирали с четырьмя гидрофобными фрат ментами (ГР4)

В мотекуле пептида ГР4 гидрофобные остатки находятся в положениях тЛ-Ч(4) чю способствует появлению у структуры амфипатическото характера и является дополнитетьным фактором, способствующим спиралимции При ком образуется один гидрофобный сегмент, который не препятствует взаимодействию с ДНК (рис 12)

перпендикулярную оси а-спирали)

В per, 1ьтате исследования комплскеообратуюшей и ¡ащитюй способности пептидов бт.тто погано что но тное связываттие п та^миды пептидами I РО ГР' и ГР4 происхошг при sapsnoBbix cooiношениях равных Г1. 1 0 ^ и Hi 7 соответственно Носитсть FP0 обеспечивает ташиту ДНК гм тетрадации при мря ювыч соотношениях 1 1 t и бо тее тотда как носитети ГР1 и I Р4 начиная с соотношения 1 б 7 1аким обр^ом прис\ тствие остатков каприновои кис юты в составе шпопегиитов i PI и ГР4 у тучшп то их ДНК-кочнакшзуюшие свойства .ю сравнении! с пет том I РО 'Рис П)

1/0.1 1/0.3 1/0.5 1/0.7 1/1 К 1/0,2 1/0,4 1/0,5 1/0,7 1/1,4 1/2,8 К- К

Рис 11 Оценка эффективности связывания и зашиты плазчидной ДНК пептидами ГРО (a). FP1 (Ь), FP4 (с) при разтичных зарядовых соотношениях

(К) - ДНК без пептида, (К-) - ДНК после ферментативного расщепления

Дтя изучения трансфекционной активности пегий юв труппы FP бы ш проведены эксперименты по трансфекпии клеток HeLa генетической конструкцией pCMV nb lacZ компактизованной липопептиднычи носителями (Рис 14)

■ *ЛГр->В/На tj С ХЛ'зрОСВИмОМ /ПЭГ ЗКВ/НЯ /ГООССБ/ "'/

Рис 14 Iu'hvhmocri эффен ыинис.и трансфекпии к теть HeLa ~>\ заря юных (.оогно нении '(ПК 1»ХИЧ Ч i гпис\ Ч 'Пия X К рокг-ин !

Vстанов iL'ho чг< >ффеК1Ивноиь .рдпсфскпии юсччечивасмая носителем I Р0 состав тяе> «снес 0<)'" и госкв-рно не опи"1С1СЯ ог токовой при ввс кчи« мотои» ДНК Мэ'симаттная к[ф>л шыюло .раН(.фек[ши с ил,о гьзованис"" не* ти id 1 PI ,лк и'алас!, при ¡аря ювом u <sjт.отт^етти.т ДНК носите ib 1 28 и cocían тя та око то 0 14% к теток (рис 8i Наиботее эффективным зарядовым соотношением ДНК'! Р4 нии toll i 1.4 которое обеспечи то экспрессию транст ена в 1.61% меток (рис 14,

Для исследования эндосомолитических свойств пептидов FP1 и FP4 трансфекциго in vitro прово щ ти в присутствии хтороквина Показано что х юроквин \ве.тичивает эффективность грансфекции коми иксами ДНК 1 Р1 белее чем в 50 раз с 0.1 ю 5.1% (рис 14) Как следует из рез\льтагов поедсыв тепных на рис 14. эффективность трансфекпии к теток коми тексами /U1K/FP4 з чрислинии хтороквина состави та около 1.1% и юсговерно не от [ича_тась от эффективности грансфекции этими же коми >ексачи без допо чгитс тьных зндосомо дттичсских агентов '4 76">) Полученные резу тыэты сви тете 1ьив\ют о на шчии у носите тя J Р4 энлосомо штических свойств

Нептиг FP4 сотерлиг 4 остатка каприновои кис юты чю возможно и онреле тяет мембраноактивноетт ганното носи те тя Натичие у него мгдосомо гитическик свойств поиверж тается rt\i. что эффективность трансфекшти с испотьзовинисм FP4 тостовсрно не измени мсь г- присутствии морок-вина Подученные резмьтаты сот тасуются с ганнычи о мембране штических свойствах FP4 ( 1'очощьк) чею и ¡evo ima эритроцитов бьпо доказано. что мембраьоактивноегь тииопегтп'да ГР4 максимально проявляется при рН = 5 0. что позволяет носителю в ответ на закисление рН индуцировать тизис энлосом и высвобождать ДНК из них в цитоптазму (Гурьянов и тр 2005)

1аким образом типопептиды группы FP модифипировагнгые остатками каприновои киетоты явтяются теми синтетическими соединениями, на основе которых могут быть подучены новые невирусные носители перспективные т тя це тей тенной терапии

выводы.

1 Внешние генетическом конструкции, со гержашей кДНК тема листрофина в сосывс кагиоиныч гиггосом 1 ípofectAMINT мышам mdx не приводит к существенному повышению \ровня жспрсссии тена листрофина

2 I 1еи тральные ну к теопептидные коми тексы pH^ADy K8-J TS-1 в опытах m vivo по ¡во тяют добиться трансфскции ю 4% мышечных во токон

3 Экспрессия тена листрофина посте инъекции нуктеопептидных комплексов pHSAf)> 'K8-J fS-1 в ске1етных мышцах, отдаленных от места введения, подтверждает типотсзу «дистантной трансфекции»

4 Введение супрессорных гРНК мышам mdx приводит к увеличению до 2,5% чиста дисгрофин-потожигелытыч мышечных волокон

5 Пептиды D1 и D2 ГР1 и í Р4 способны достав шь чужеродную ДНК в клетки млекопитающих in vitro и обеспечивать экспрессию маркерных генов, значите щно превышающую таковую при введении чисгои плазмиды

6 Присоединение к тизиновым тенлримерам остатков пальмитиновом кислоты приводит к изменению структуры коми тсксов ДНК-петил и повышает эффективность их проникновения в клетку

7 Добав тение к тинейным а тпфа-спиралытым пептидам остатков каприновой кислоть увеличивает и* мембрлноактивш,те свойства и повышает эффективность грансфекции

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

' Baranov \ A/elenn О 1 arasenko V Kolesnikov V Mikhailov Т Ivaschenko A.Kiselev О Ancin.cvu О Lvgralov I 7elenma R Shafei, T Kascheeva G Dickson A Baranov Human dystrophin gene expression m mdx muscles after in vivo ballistic transfection application of synthetic oligopeptide complexes and cationc liposomes In NATO Advanced Study Institute on Gene Iherapy NA Ю АЫ Series title of the volume «'Gene iherapv> Springer-Verlag Berlin Heidelberg

1998 Vol H 105 pp 219-223

2 Baranov A Glazkov P. Kiselev A. Ostapenko () Mikhailov V Ivaschenko T Sabetsky V Baranov V Local and distam

transfection of mdx muscle fibers with dystrophin ard I ac7 genes delivered in vivo by synthetic microspheres Gene Therapy

1999 Aug 6(8) 1406-1414

1 Баранов В С . Тарасенко О В Баранов А Н , Киселёв А.В. Иваненко Г Э Евграфов О В , Михайлов В М Диксон Дж Экспрессия гена листрофина человека в миофибриллах мышей mdx посте трансфекции с помощью липосом и синтетических отигопептидов / Генетика, 1998, том 34, ,Vs7 с 876-882

4 Баранов А Н Киселев А. В. Иващенко Т '?, Кашсе&а I К Баранов В С Особенности трансфекции и экспрессии кДНК гена листрофина четовехл доставленного в мышцы мышей mdx с помощью синтетических микросфер MF-2 Генетика 1999 том 35 №1 с 22-27

5 Киселев А.В Остапенко О В . Рогожкина F В Хотоа Н С Сеит Неби \ С Баранов А Н Лесина F. А Иващенко Т Э. Сабецкий В А . Шавловский М М Речинский В О Киселев Л Л Баранов В С Использование гена су прессорной тРНК для иенравтения нонсенс мутации в гене листрофина Молеку тяриая биология 2002 Т 36(1) С 30-34

6 Киселев А.В Баранов АН Баранов ВС Генная терапия Состояние проблемы и перспскжвы Мотекулярно-биопогические технологии в четицинской практике - Новосибирск Атьфа-Виста 2003 Вып 3-С 49-75

7 Biacoei П Коротьков В И Панкова Г \ Баянова Н В , Тарасенко И И Баранов А Н Гтазков П Б Киселев А.В., Остапенко О В Песина F А Баранов В С Денлримеры на основе жзина и их <|ве-юобрашые/ полимерные производные изучение возможности использования для компактизации ДНК и доставки экспрессир^оиихся генетических конструкции in vitro Биоорганическая химия 2004 T30(I) 15-24

8 Baranov A Kiselev A. Ostapenko О Mikbailo* V Г tschenko 1 Sabet'k' У Baranov V Svntn.i с o!ygopept,des ISOi and microspheres СМГ-2) as efficient cere dcliverv vehicles in vivo 1st Annua' Meet.ng of American Soc,etv of Gene Ihtrapv Mav 28-31 1498 Seattle Washington P 163a

9 Kiseley A, Ostapenko О Baranov A Lesina Ь Kisse'ev L Baranov V tlfecls of nonsense suppiessor tRNA Renes transfection m vitro and in vivo i uiopean Journal of Human Genetics Vol 9 suppl 1 N * 10th Imernalional Congress of Human Genetics Vienna Austria 15-19 May,2001 P1642

10 Kiselev A. Ostapenko О lesina F Kholod \ Baranov A Ivaschenko T. Kisselev L, Baranov V Nonseibe codon suppression in mdx mice by ochre suppressor tRNA and gentamicin 9th Meeting of the FSG Г Antalva Turkey 2901 P 189

P Kiselev A. lesina L Gur'yanov I Baranov A KoroikovV Vlasov G Baranov V Development of a new non-viral peptide vehicle for DMA delivery 9th Meeting of the FSGf Antalya Turkey 2001 P 131

12 i урьянов И А Киселев А.В, Корольков ВИ Баранов ВС Власов I II ( ише; и нлчение ¡ибрилныч ДНК-связываюших олигопептилов 'Синтез исследование cbohcib модификация и переработка высокому 1екутярных соетинений 10 меж iy наролная конференция ст\ тентов и аспирантов 22 24 мая 2001г Казань Стр 8-°

13 Kiselev AV Baranov AN Bavanova NV Lesina ГА Gurvanov IA Ostapenko OV, Vlasov GP and Baranov VS Synthesis and Biological Application of a-Ammoacidj Derdrimers and Their С apacitv for Gere Delivery In Vitro 5th "\пч ia' Meeting of American Society ol Gene I herapv Boston June f 9 2002 P 922

14 Gurianov I Vlasova 1 Ko'olkov V Vlasov G Kiselev A. I esina 1 Baranov V С hirawhina F Vorob'ev V Svnthesis of Amphipatic Alpha-helical Peptides Modified with Lipophilic Fragments and their Interaction with DNA and Frythrocites 27th European Peptide Symposium Sorrento Uah August 3 i-Septembci 6 2002 Journal of Peptide Science V 8 Suppl SI 88

И Kiselev AV I esina FA Bavanova NV Baranov AN. Vlasov GP and Baranov VS Study ot transfettional activity of lysine based asymmetric dendrimers / 10th Meeting of the FSGI Antibes.! ranee P99

16 FA lesina AV Kiselev IA Gurvanov AN Baranov GP Vlasov and VS Baranov Synthesis of amphipatic alpha-helical peptides modified with lipophvlic fragments and their capacity for gene deliver^ in vitro 10th Meeting of the f SGI Antibes France 2002 P 100

17 Baranov A Kiselev A. 1 esina t Lgorova A„ Ostapenko О Baianova N Gurjanovl Vlasox G Baranov V Correlation between structure and transfect on properties of new linear and branched peptide vehicles ' lllh Meeting of the ESGT Fdinburg, L'K 14-17 Nov ember 2003 P60

18 Lesina f Barano\ A Kiselev A. 1 gorova A Bavanova N. Gur'ianov I . Il'ina P Dyachkov I Vlasov G Baranov V 1 ransfectson capacities of some novel peptide-based gene delivery systems F uropean Human Genetics Conference 2004 12-I'June P 1214

19 Киселев А.В. Лесина f А Баранов A II Fioposa А А Баянова H В Власов I П , Баранов В С Синтез и >пу 1ение трансфекнионной актинноои ратетвтенных пептидов ' Ш съеп ВОГИ( Геноика в XXI веке современное состояние и перспективы развития' Москва 6-12 июня 2004 Г 2 С М

20 Kiselev А V Lesma L A Baranov А N Gurvanov I A Lgorova A A ll'ina Р I Vlasov G Р Baranov V Ь Gene delivery capacities of asymmetric lysine dendrimers and lipopeptides m vitro 12th Annual Congress o' FSGF 4-7 November 2004 Tampere. Finland P 92

Отпечатано на ризографе ООО "ВИЧИ" 2 03 05 г Тираж 100 экз

Россия, 190000, Санкт-Петербург, ул Галерная, д. 22, офис 1 Тел./факс: (812)312-74-45

-43 58

1Б Русский фон д

2006-4 12569

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Киселёв, Антон Вячеславович

Список сокращений.

Введение.

X Обзор литературы.

1.1 Генетические и биохимические основы патологии мышечной дистрофии Дюшенна/Беккепа (МДД/Б).

1.1.1 Локализация и клонирование гена диет рофина.

1.1.2 Молекулярная природа мутаций в гене МДД.

1.1.3 Белковый продукт гена дистрофина.

1.1.4 Модельные животные.

1.2 Подходы к генной герапни мышечной дистрофии Дюшенна/Беккера.

1.2.1 Генотерапия наследственных болезней человека.

1.2.2 Способы доставки генов в клетки млекопитающих.

1.2.3 Использование вирусных векторов для доставки кДНК гена дистрофина в клетки млекопитающих in vivo.

1.2.4 Невирусные способы доставки кДНК гена дистрофина в клетки млекопитающих in vivo.

1.2.5 Коррекционная генная терапия МДД.

1.2.6 Активизация экспрессии гена утрофина - аутосомного гомолога гена дистрофина.

1.2.7 Клинические испытания по генотерапии МДД.

2 Материалы и методы.

2.1 Материалы.

2.2 Методы.

3 Результаты.

3.1 Анализ межтканевого распределения и экспрессии гена дистрофина после введения генетической конструкции pHSADy в комплексе с лнпосомиым носителем LipofectAMINE.

3.2 Анализ межткапевого распределения н экспрессии гена дистрофина после введения генетической конструкции pHSADy в составе олнгопептидпых комплексов IC8-JTS-1.

3.3 Трансфекция мышечных волокон мышей тих конструкцией с геном суирессориой тРНК охр в комплексе с лактоферрииом.

3.4 Пептидные носители, как векторы доставки генетических конструкции.

Депдримеры Р1 и Р2.

Липопептиды ГРО, ГР1 и ГР4.

4 Обсуждение.

4.1 Ка I ионные липосомы.

4.2 Синтетические олигопептидиые комплексы К8/.ГГ8-1.

4.3 Использование охр тРНК для супрессии нонсенс-мутации в гене дистрофина.

4.4 Липопептиды и лшииосыс деидримеры как векторы доставки генетических конструкций.

5 Выводы.

Список сокращений.

БСА - бычий сывороточный альбумин CMV - cytomegalovirus - цитомегаловирус ДЭПК - диэтилпирокарбонат DOGS - диоктадециламиноглицилспермин DOPE - диолеилфосфатидил-этаноламин

DOSPA - 2,3- диолеилокси-Ы-[2(сперминкарбоксамидо)этил]-К,Ы-диметил-1-пропанамин трифторацетат

DOTAP - 1,2-бис(олеоилокси)-3-(триметиламмоний пропан)

DOTMA - Ы-1(2,3-диолеилокси)пропил-Ы,Ы,М-триметиламмонийхлорид

ФИТЦ - флюоресцеинизотиоцианат

GRMD - golden retriever muscular dystrophy - золотистый Лабрадор с мышечной дистрофией kDa - kilodalthon -килодальтон

SCID - Syndrome of congenital immunodeficiency - синдром наследственного иммунодефицита

YAC - yeast artificial chromosome — искусственная хромосома дрожжей

AAB - аденоассоциированый вирус

БТ - баллистическая трансфекция

ДГК - Дистрофин-гликопротеиновый комплекс

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ДПМВ - дистрофин-положительные мышечные волокна кДНК - комплементарная ДНК

МДБ - мышечная дистрофия Беккера

МДД - мышечная дистрофия Дюшенна млн. п.о. — миллион пар оснований мРНК - матричная РНК

ОТ-ПЦР - обратно-транскрипционная полимеразная цепная реакция п.о. - пар оснований

ПААГ - полиакриламидный гель

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЭИ - полиэтиленимин

РНК - рибонуклеиновая кислота

СПИД - синдром приобретенного иммунодефицита

TBE - Tris-боратный буфер

ТЕМЕД - N, N'-тетраметилэтилендиамин тРНК - транспортная РНК тыс. п.о. — тысяча пар оснований

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат натрия

Введение Диссертация по биологии, на тему "Невирусные носители для доставки ДНК в клетки млекопитающих с целью генотерапии миодистрофии Дюшенна"

Стремительный прогресс в расшифровке генома человека и идентификации генов, а также успехи биотехнологии делают актуальной разработку научных основ генной терапии тяжелых наследственных заболеваний.

Мышечная дистрофия Дюшенна/Беккера (МДД/Б) - является наиболее частым нервно-мышечным наследственным заболеванием человека. Частота встречаемости составляет 1 на 5000 новорожденных мальчиков для мышечной дистрофии Дюшенна (МДД) и 1 на 18500 для мышечной дистрофии Беккера (МДБ) (Emery, 1991).

МДД характеризуется тяжёлым течением и ранним проявлением симптомов - до 5 лет. Прогрессирующая мышечная дегенерация приводит к потере подвижности в 13-16 лет. Летальный исход, как правило, наступает из-за сердечной недостаточности либо отказа дыхательной мускулатуры в возрасте около 20 лет. МДБ является менее тяжёлой аллельной формой заболевания, для которой характерно более позднее проявление первых симптомов, потеря подвижности после 16 лет и большая продолжительность жизни пациентов (Partridge, 1993).

Ген, мутации которого приводят к МДД/Б, был выделен с помощью методов позиционного клонирования в 1987 году (Koenig et al., 1987). Было показано, что он располагается на Х-хромосоме в локусе Хр21.1 и имеет размер более 2.4 млн. п.о., являясь самым большим из известных генов (Hoffman et al., 1987). Основным продуктом гена в мышечных тканях является присарколеммный белок дистрофии, выполняющий функцию связующего звена между внутренним цитоскелетом миофибриллы и внеклеточным матриксом. NH2-Koiieu дистрофина взаимодействует с эндоплазматическими нитями актина; С-конец связан с комплексом гликопротеидов сарколеммы (Koenig et al.,1988). Как полагают, данный комплекс белков защищает сарколемму от механического стресса в течение циклов сокращения-расслабления мышц, а также участвует в сигнальной трансдукции. Отсутствие дистрофина при МДД нарушает процесс сборки комплекса и приводит к повышенной проницаемости сарколеммы или образованию в ней физических разрывов (Brown et al., 1997).

Эффективная медикаментозная терапия МДЦ до настоящего времени отсутствует. Таким образом, актуальна разработка новых подходов к лечению этого смертельного заболевания, и в частности, методов генной терапии.

Генная терапия (ГТ) заключается во введении в клетку нуклеиновых кислот с целью исправления генных дефектов (коррекционная ГТ) или придания клеткам новых функций (комплементационная ГТ) (Mountain, 2000). Ориентированность на борьбу с причиной заболевания, а не с симптомами и последствиями отличает генную терапию от подходов традиционной медицины. Существенно, что при этом в роли фармацевтического препарата выступает клонированный ген или же специально подобранные синтетические молекулы ДНК или РНК.

Исправление генетического дефекта и восстановление нормального состояния мышечных волокон при МДЦ является одной из основных задач генной терапии данного заболевания. Показано, что введение в дистрофическую мышцу генетических конструкций, содержащих кДНК дистрофина, либо антисмысловых нуклеотидов, способствующих исключению экзона с мутацией из пре-мРНК, приводит к восстановлению синтеза белка и нормализации клеточного фенотипа (Сох et al., 1993; Wilton et al., 1999). Считается, что достижение терапевтического эффекта возможно при восстановлении синтеза дистрофина в не менее 20% всех мышечных волокон (Браун, 2003). Необходимый уровень трансфекции в экспериментах на мышах mdx -биологических моделях миодистрофии Дюшенна - пока был достигнут только в нескольких опытах, где кДНК гена дистрофина вводили с помощью вирусных векторов (Clemens et al., 1996; Wang et al., 2000). Однако, использование вирусных векторов наталкивается на существенные методические трудности (недостаточная пакующая способность, необходимость наличия клеток-хелперов), а также выраженный иммунный ответ организма на вирусные антигены. Пренебрежение к проблеме безопасности вирусных носителей привело к гибели пациента при проведении клинических испытаний генной терапии дефицита орнитинтранскарбамилазы, а также к появлению Т-клеточной лейкемии у двух пациентов после испытаний по лечению XI SCID -X сцепленной формой иммунодефицита (Smaglik, 1999; Cavazzana-Calvo et al., 2000). Этих недостатков в значительной мере лишены невирусные носители, при использовании которых, однако, эффективность трансфекции, как правило, невысока. В связи с этим, проводятся исследования по поиску природных или синтетических соединений, способных повысить эффективность доставки генетических конструкций в клетки млекопитающих. Функцией невирусного носителя является обеспечение компактизации ДНК, тканеспецифичного транспорта и эффективного проникновения в клетки, а также защита генетической конструкции от лизосомальной деградации (Pouton et al., 1998). Кроме того, носитель должен быть нетоксичным и биодеградируемым. Одним из направлений в области разработки синтетических средств доставки ДНК является создание носителей на базе пептидов (Wyman et al., 1997; Fominaya et al., 2000; Rittner et al., 2002). В данную группу входят линейные и разветвленные пептиды, а также липопептиды. К преимуществам данных носителей относятся биодеградируемость и легкость модификации структуры и аминокислотного состава. Однако, несмотря на масштабные исследования пептидных средств доставки, влияние разного рода модификаций на трансфекционную активность носителей данной группы изучено недостаточно.

Исходя из данных положений, поиск и изучение новых пептидных носителей для доставки ДНК в клетки млекопитающих является актуальной проблемой генной терапии МД Д, а также других заболеваний.

Целью данной работы являлся поиск пептидных носителей для доставки генных конструкций в клетки млекопитающих и разработка новых подходов к генотерапии мышечной дистрофии Дюшенна. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить особенности трансфекции мышечных волокон мышей mdx генетическими конструкциями с кДНК гена дистрофина с помощью аналогов вирусных олигопептидов и катионных липосом.

2. Оценить эффективность супрессии нонсенс-мутации в гене дистрофина у мышей mdx конструкциями с геном супрессорной тРНК.

3. Изучить условия образования и особенности структуры комплексов ДНК с пептидными носителями.

4. Проанализировать влияние состава и структуры исследуемых носителей на трансфекционную активность in vitro.

Новизна: впервые были изучены особенности трансфекции мышечных волокон мышей mdx генетическими конструкциями с кДНК гена дистрофина с помощью аналогов вирусных олигопептидов и катионных липосом. Впервые изучена эффективность супрессии нонсенс мутации в гене дистрофина у мышей mdx с помощью супрессорных тРНК. Разработан оптимальный алгоритм тестирования синтетических олигопептидов в качестве потенциальных векторов доставки экспрессирующих генных конструкций в клетки млекопитающих. Впервые изучены особенности трансфекции с использованием лизиновых дендримеров и альфа-спиральных липопептидов. Проанализировано влияние состава и структуры исследуемых носителей на их трансфекционную активность in vitro.

Положения, выносимые на защиту:

1. Использование нуклеопептидных комплексов pHSADy/K8-JTS-l позволяет добиться трансфекции мышечных волокон in vivo.

2. Наличие экспрессии гена дистрофина в скелетных мышцах, отдаленных от места введения, подтверждает гипотезу «дистантной трансфекции».

3. Введение супрессорных тРНК модельным мышам mdx приводит к частичному восстановлению синтеза дистрофина.

4. Пептиды D1 и D2, FP1 и FP4 способны компактизовать ДНК, доставлять ее в клетки млекопитающих in vitro и обеспечивать экспрессию маркерных генов, значительно превышающую таковую при введении чистой плазмиды.

5. Модификация лизиновых дендримеров остатками пальмитиновой кислоты приводит к изменению структуры комплексов ДНК-пептид и способствует их проникновению в клетку.

6. Присоединение к линейным альфа-спиральным пептидам остатков каприновой кислоты увеличивает их мембраноактивные свойства и повышает эффективность трансфекции.

1 Обзор литературы.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Киселёв, Антон Вячеславович

5Выводы.

1. Введение генетической конструкции, содержащей кДНК гена дистрофина, в составе катионных липосом LipofectAMINE мышам mdx не приводит к существенному повышению уровня экспрессии гена дистрофина.

2. Нейтральные нуклеопептидиые комплексы pHSADy/K8-JTS-l в опытах in vivo позволяют добиться трансфекции до 4% мышечных волокон.

3. Экспрессия гена дистрофина после инъекции нуклеопептидных комплексов pHSADy/K8-JTS-l в скелетных мышцах, отдаленных от места введения, подтверждает гипотезу «дистантной трансфекции».

4. Введение супрессорных тРНК мышам mdx приводит к увеличению до 2,5% числа дистрофин-положительных мышечных волокон

5. Пептиды D1 и D2, FP1 и FP4 способны доставлять чужеродную ДНК в клетки млекопитающих in vitro и обеспечивать экспрессию маркерных генов, значительно превышающую таковую при введении чистой плазмиды.

6. Присоединение к лизиновым дендримерам остатков пальмитиновой кислоты приводит к изменению структуры комплексов ДНК-пептид и повышает эффективность их проникновения в клетку.

7. Добавление к линейным альфа-спиральным пептидам остатков каприновой кислоты увеличивает их мембраноактивные свойства и повышает эффективность трансфекции.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Киселёв, Антон Вячеславович, Санкт-Петербург

1. Баранов B.C., Баранов А.Н., Зеленин A.B. Современное состояние и перспективы генной терапии миодистрофии Дюшенна в мире и в России // Генетика. 2001. том 37 (8). С. 1-9.

2. Баранов B.C., Баранов А.Н. Генная терапия моногенных наследственных болезней. Миодистрофия Дюшенна. // Вопросы медицинской химии. 2000. Т. 46. С.279-292.

3. Горбунова В.Н., Савельева-Васильева Е.А., Красильников В.В. Молекулярная неврология. Часть 1 / С.-Петербург. Интермедика. 2000. С. 320

4. Лазарев В.Н., Говорун В.М., Александрова Н.М., Лопухин Ю.М. Генная терапия хронических инфекционных заболеваний урогенитального тракта с использованием цитотоксических пептидов // Вопросы медицинской химии, 2000. Т. 46(3):324-31.

5. Михайлов В.М., Зеленин А.В., Штейн Г.И. и др. Диффернцировка мышечных волокон мышей mdx после баллистической трансфекции кДНК гена дистрофина человека // Цитология. 1998. Т. 40. С. 394-400

6. Синогеева Н.И., Богданова М.А., Алейникова Т.Д. и др. Экспрессия маркерных генов в мышечных волокнах после трансфекции in vivo опосредованной лактоферрином. // Генетика. 2001. Т. 36. С. 749-757.

7. Abbs S, Yau SC, Clark S, Mathew CG, Bobrow M. A convenient multiplex PCR system for the detection of dystrophin gene deletions: a comparative analysis with cDNA hybridisation shows mistypings by both methods // J. Med. Genet .1991. V. 28(5). P. 304-11.

8. Acsadi G, Dickson G, Love DR, Jani A, Walsh FS, Gurusinghe A, Wolff JA, Davies KE. Human dystrophin expression in mdx mice after intramuscular injection of DNA constructs // Nature. 1991. V. 352. P. 815-8.

9. Acsadi G, Massie B, Jani A. Adenovirus-mediated gene transfer into striated muscles //J. Mol. Med. 1995. V. 73(4). P. 165-80.

10. Ahn AH, Kunkel LM. Syntrophin binds to an alternatively spliced exon of dystrophin // J. Cell. Biol. 1995. V. 128(3). P. 363-71.

11. Andre B, Springael JY. WWP, a new amino acid motif present in single or multiple copies in various proteins including dystrophin and the SH3-binding Yes-associated protein YAP65 // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994. V. 205(2). P. 1201-5.

12. Anwer K, Earle KA, Shi M et al. Synergistic effect of formulated plasmid and needle-free injection for genetic vaccines // Pharm Res. 1999. V. 16(6). P.889-95.

13. Armeanu S, Pelisek J, Krausz E et al. Optimization of nonviral gene transfer of vascular smooth muscle cells in vitro and in vivo // Mol Ther. 2000 V.l(4). P.366-75.

14. Atkinson J., Martin R. Mutations to nonsense codons in human genetic disease: implications for gene therapy by nonsense suppressor tRNAs. // Nucleic Acids Res. 1994. V. 25. P. 1327-34

15. Azzam T, Eliyahu H, Shapira L, Linial M, Barenholz Y, Domb AJ. Polysaccharide-oligoamine based conjugates for gene delivery // J Med Chem. 2002. V.45(9). P. 1817-24

16. Baehner RL, Kunkel LM, Monaco AP, Haines JL, Conneally PM, Palmer C, Heerema N, Orkin SH. DNA linkage analysis of X chromosome-linked chronic granulomatous disease// Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1986. V. 83(10). P. 3398401.

17. Bartlett RJ, Stockinger S, Denis MM et al. In vivo targeted repair of a point mutation in the canine dystrophin gene by a chimeric RNA/DNA oligonucleotide // Nat Biotechnol. 2000.V. 18(6). P.615-22

18. Bartley JA, Patil S, Davenport S, Goldstein D, Pickens J. Duchenne muscular dystrophy, glycerol kinase deficiency, and adrenal insufficiency associated with Xp21 interstitial deletion // J. Pediatr. 1986. V. 108(2). P. 189-92.

19. Barton-Davis ER, Cordier L, Shoturma DI, Leland SE, Sweeney HL. Aminoglycoside antibiotics restore dystrophin function to skeletal muscles of mdx mice // J Clin Invest. 1999. V. 104(4). P.375-81.

20. Behr JP, Demeneix B, Loeffler JP, Perez-Mutul J. Efficient gene transfer into mammalian primary endocrine cells with lipopolyamine-coated DNA // Proc Natl Acad Sci USA. 1989. V.86(18). P.6982-6.

21. Bies RD, Caskey CT, Fenwick R. An intact cysteine-rich domain is required for dystrophin function //J. Clin. Invest. 1992. V. 90(2). P. 666-72.

22. Blaese RM Optimism regarding the use of RNA/DNA hybrids to repair genes at high efficiency // J Gene Med. 1999. V.l(2). P. 144-7.

23. Blake et al. Function and genetics of dystrophin and dystrophin-related proteins in muscle // Physiol Rev. 2002. V. 82. P. 291-329

24. Bloomfield VA. DNA condensation by multivalent cations // Biopolymers. 1997. V.44(3). P. 269-82.

25. Brown SC, Lucy JA. Functions of dystrophin. / In "Dystrophin. Gene, protein and cell biology". Edited by Brown S.& Lucy J. Cambrige Univ. Press. 1997. P.162 -200.

26. Bulfield G, Siller WG, Wight PA, Moore KJ. X chromosome-linked muscular dystrophy (mdx) in the mouse // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1984. V. 81(4). P. 1189-92.

27. Burmeister M, Monaco AP, Gillard EF, van Ommen GJ, AffaraNA, FergusonSmith MA, Kunkel LM, Lehrach H. A 10-megabase physical map of human Xp21, including the Duchenne muscular dystrophy gene // Genomics. 1988. V. 2(3). P. 189-202.

28. Buvoli M., Buvoli A., Leinwand L.A. Suppression of nonsense mutations in cell culture and mice by multimerized suppressor tRNA genes. // Mol. Cell Biol. 2000. V. 20. P. 3116-3124.

29. Byers TJ, Lidov HG, Kunkel LM An alternative dystrophin transcript specific to peripheral nerve // Nat Genet. 1993. V.4(l). P.77-81

30. Campbell KP. Three muscular dystrophies: loss of cytoskeleton-extracellular matrix linkage // Cell. 1995. V. 80(5). P. 675-9.

31. Campeau P, Chapdelaine P, Seigneurin-Venin S, Massie B, Tremblay JP. Transfection of large plasmids in primary human myoblasts // Gene Ther. 2001 V.8(18). P.1387-94

32. Canki N, Dutrillaux B. Two cases of familial paracentric inversion in man associated with sex chromosome anomaly. 47,XXY,inv(5)(q21q32) and 45,X,inv(7)(ql 1.3q22.3) // Hum. Genet. 1979. V. 47(3). P. 261-8.

33. Carpenter S, Karpati G, Robitaille Y, Melmed C. Cylindrical spirals in human skeletal muscle // Muscle Nerve. 1979. V. 2(4). P. 282-7.

34. Carpenter JL, Hoffman EP, Romanul FC, Kunkel LM, Rosales RK, Ma NS, Dasbach JJ, Rae JF, Moore FM, McAfee MB, et al. Feline muscular dystrophy with dystrophin deficiency // Am. J. Pathol. 1989. V. 135(5). P. 909-19.

35. Cavazzana-Calvo M, Hacein-Bey S, de Saint Basile G et al. Gene therapy of human severe combined immunodeficiency (SCID)-Xl disease // Science. 2000 V.288. P. 669-72.

36. Chamberlain JS, Gibbs RA, Ranier JE, Nguyen PN, Caskey CT. Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification //Nucleic Acids Res. 1988. V. 16(23). P. 11141-56.

37. Ciftci K, Levy RJ. Enhanced plasmid DNA transfection with lysosomotropic agents in cultured fibroblasts // Int J Pharm. 2001. V.218(l-2). P.81-92

38. Clemens PR, Kochanek S, Sunada Y, Chan S, Chen HH, Campbell KP, Caskey CT. In vivo muscle gene transfer of full-length dystrophin with an adenoviral vector that lacks all viral genes // Gene Ther. 1996. V. 3(11). P. 965-72.

39. Clerk A, Morris GE, Dubowitz V, Davies KE, Sewry CA. Dystrophin-related protein, utrophin, in normal and dystrophic human fetal skeletal muscle // Histochem. J. 1993. V. 25(8). P. 554-61.

40. Chomczynsci P, Sacchi N. Single-Step method of RNA isolation by acid guanidinum thiocyanate-phenol-chlorophorm extraction. //Anal. Biochem. 1987. V. 162. P.156-159.

41. Cooper BJ, Winand NJ, Stedman H, Valentine BA, Hoffman EP, Kunkel LM, Scott MO, Fischbeck KH, Kornegay JN, Avery RJ, et al. The homologue of the Duchenne locus is defective in X-linked muscular dystrophy of dogs // Nature. 1988. V. 334. P. 154-6.

42. Corbi N, Libri V, Fanciulli M, Tinsley JM, Davies KE, Passananti C The artificial zinc finger coding gene 'Jazz' binds the utrophin promoter and activates transcription // Gene Ther. 2000. V.7(12). P. 1076-83

43. Cox GA, Cole NM, Matsumura K, Phelps SF, Hauschka SD, Campbell KP, Faulkner JA, Chamberlain JS. Overexpression of dystrophin in transgenic mdx mice eliminates dystrophic symptoms without toxicity // Nature. 1993. V. 364. P. 725-9.

44. Cullen MJ, Fulthorpe JJ. Stages in fibre breakdown in Duchenne muscular dystrophy. An electron-microscopic study // J. Neurol. Sei. 1975. V. 24(2). P. 179200.

45. Czaplinski K., Ruiz-Echevarria M.J., Gonzalez C.I., Peltz S.W. Should we kill the messenger? The role of the surveillance complex in translation termination and mRNA turnover. //Bioessays. 1999. V. 21. P. 685-696.

46. Dai YF, Qiu XF, Xue JL, Liu ZD. High efficient transfer and expression of human clotting factor IX cDNA in cultured human primary skin fibroblasts from hemophilia B patient by retroviral vectors // SCI CHINA B. 1992. V. 35(2). P. 183-93.

47. Davison MD, Critchley DR. alpha-Actinins and the DMD protein contain spectrin-like repeats // Cell. 1988. V. 52(2). P. 159-60.

48. Deconinck N, Tinsley J, De Backer F, Fisher R, Kahn D, Phelps S, Davies K, Gillis JM. Expression of truncated utrophin leads to major functional improvements in dystrophin-deficient muscles of mice // Nat. Med. 1997. V. 3(11). P. 1216-21.

49. Decrouy A, Renaud JM, Lunde JA, Dickson G, Jasmin BJ. Mini- and full-length dystrophin gene transfer induces the recovery of nitric oxide synthase at the sarcolemma of mdx4cv skeletal muscle fibers // Gene Ther. 1998. V. 5(1). P. 5964.

50. Den Dünnen JT, Bakker E, Breteler EG, Pearson PL, van Ommen GJ. Direct detection of more than 50% of the Duchenne muscular dystrophy mutations by field inversion gels//Nature. 1987. V. 329. P. 640-2.

51. Dickson G, Azad A, Morris GE, Simon H, Noursadeghi M, Walsh FS. Co-localization and molecular association of dystrophin with laminin at the surface of mouse and human myotubes // J. Cell Sei. 1992. V. 103(4). P. 1223-33.

52. Dickson G, Roberts ML, Wells DJ, Fabb SA. Recombinant micro-genes and dystrophin viral vectors//Neuromuscul Disord. 2002 V.12 Suppl 1. P. S40-4.

53. Discher BM, Won YY, Ege DS, Lee JC, Bates FS, Discher DE, Hammer DA. Polymersomes: tough vesicles made from diblock copolymers // Science. 1999. V. 284. P. 1143-6.

54. Dunckley MG, Wells DJ, Walsh FS, Dickson G. Direct retroviral-mediated transfer of a dystrophin minigene into mdx mouse muscle in vivo // Hum. Mol. Genet. 1993. V. 2(6). P. 717-23.

55. Edwards JH. The population genetics of Dushenne: natural and artificial selection //J. Med. Genet. 1986. V. 23. P. 521-530.

56. Emery AEH. Population frequency of inherited nueromuscular diseases a world survey//Neuromuscular Disorders. 1991.V. 21. P. 19-29.

57. England SB, Nicholson LV, Johnson MA, Forrest SM, Love DR, Zubrzycka-Gaarn EE, Bulman DE, Harris JB, Davies KE. Very mild muscular dystrophyassociated with the deletion of 46% of dystrophin //Nature. 1990. V. 343. P. 1802.

58. Ervasti JM, Campbell KP. Membrane organization of the dystrophin-glycoprotein complex // Cell. 1991. V. 66(6). P. 1121-31.

59. Fassati A, Wells DJ, Walsh FS, Dickson G Transplantation of retroviral producer cells for in vivo gene transfer into mouse skeletal muscle // Hum Gene Ther. 1996 V.7(5). P.595-602

60. Fassati A, Murphy S, Dickson G. Gene therapy of Duchenne muscular dystrophy //Adv. Genet. 1997. V. 35. P. 117-53.

61. Feero WG, Li S, Rosenblatt JD, Sirianni N, Morgan JE, Partridge TA, Huang L, Hoffman EP. Selection and use of ligands for receptor-mediated gene delivery to myogenic cells // Gene Ther. 1997. V. 4(7). P. 664-74.

62. Felgner PL, Gadek TR, Holm M et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure // Proc Natl Acad Sei USA. 1987. V. 84(21). P. 7413-7

63. Ferrier P, Bamatter F, Klein D. Muscular Dystrophy (Duchenne) in a girl with Turner syndrome // J. Med. Genet. 1965. V. 2. P. 38-46.

64. Fominaya J, Gasset M, Garcia R, Roncal F, Albar JP, Bernad A. An optimized amphiphilic cationic peptide as an efficient non-viral gene delivery vector. // J Gene Med. 2000. V.2(6). P.455-64

65. Gollins H, McMahon J, Wells KE, Wells DJ. High-efficiency plasmid gene transfer into dystrophic muscle // Gene Ther. 2003. V.10(6). P.504-12

66. Gorecki DC, Monaco AP, Derry JM, Walker AP, Barnard EA, Barnard PJ. Expression of four alternative dystrophin transcripts in brain regions regulated by different promoters // Hum. Mol. Genet. 1992. V. 1(7). P. 505-10.

67. Gorospe RJ, Bronwen KN, Hoffman EP. Pathophysiology of dystrophin deficiency: a clinical and biological enigma. / In "Dystrophin. Gene, protein and cell biology". Edited by Brown S.& Lucy J. Cambrige Univ. Press. 1997. P. 200230.

68. Gottschalk S, Sparrow JT, Hauer J, Mims MP, Leland FE, Woo SL, Smith LC. A novel DNA-peptide complex for efficient gene transfer and expression in mammalian cells // Gene Ther. 1996. V. 3(5). P. 48-57.

69. Grady RM, Teng H, Nichol MC, Cunningham JC, Wilkinson RS, Sanes JR Skeletal and cardiac myopathies in mice lacking utrophin and dystrophin: a model for Duchenne muscular dystrophy // Cell. 1997. V. 90(4). P.729-38

70. Gussoni E, Blau HM, Kunkel LM. The fate of individual myoblasts after transplantation into muscles of DMD patients // Nat Med. 1997. V. 3(9). P. 970-7.

71. Harper SQ, Hauser MA, DelloRusso C et al. Modular flexibility of dystrophin: implications for gene therapy of Duchenne muscular dystrophy // Nat Med. 2002 V.8(3). P.253-61

72. Hilleren P., Parker R. mRNA surveillance in eukaryotes: kinetic proofreading of proper translation termination as assessed by mRNP domain organization? // RNA. 1999. V. 5. P. 711-719.

73. Hoffman EP, Brown RH Jr, Kunkel LM. Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus // Cell. 1987. V. 51(6). P. 919-28.

74. Hofmann K, Bucher P. The rsp5-domain is shared by proteins of diverse functions // FEBS Lett. 1995. V. 358(2). P. 153-7.

75. Howell JM, Fletcher S, Kakulas BA, O'Hara M, Lochmuller H, Karpati G. Use of the dog model for Duchenne muscular dystrophy in gene therapy trials // Neuromuscul. Disord. 1997. V. 7(5). P. 325-8.

76. Hudgins WR, Fibach E, Safaya S, Rieder RF, Miller AC, Samid D Transcriptional upregulation of gamma-globin by phenylbutyrate and analogous aromatic fatty acids // Biochem Pharmacol. 1996 Oct 25;52(8):1227-33

77. Kam Z, Josephs R, Eisenberg H, Gratzer WB. Structural study of spectrin from human erythrocyte membranes // Biochemistry. 1977. V. 16(25). P. 5568-72.

78. Kaufman R.J. Correction of genetic disease by making sense from nonsense. // J. Clin. Invest. 1999. V. 104. P. 367-368.

79. Kay MA, Liu D, Hoogerbrugge PM. Gene therapy // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997. V. 94(24). P. 12744-6.

80. Kenwrick S, Patterson M, Speer A, Fischbeck K, Davies K. Molecular analysis of the Duchenne muscular dystrophy region using pulsed field gel electrophoresis // Cell. 1987. V. 48(2). P. 351-7.

81. Khurana TS, Rosmarin AG, Shang J, Krag TO, Das S, Gammeltoft S. Activation of utrophin promoter by heregulin via the ets-related transcription factor complex GA-binding protein alpha/beta// Mol. Biol. Cell. 1999. V. 10(6). P. 2075-86.

82. Kisselev L.L., Buckingham R.H. Translational termination comes of age. // Trends in Biochem. Sci. 2000. V. 25. P. 561-566.

83. Kling J. Making gene therapy deliver // Molecular Genetics. 1996. V. 80. P.35-45

84. Koenig M, Kunkel LM. Detailed analysis of the repeat domain of dystrophin reveals four potential hinge segments that may confer flexibility // J. Biol. Chem. 1990. V. 265(8). P. 4560-6.

85. Koenig M, Monaco AP, Kunkel LM. The complete sequence of dystrophin predicts a rod-shaped cytoskeletal protein // Cell. 1988. V. 53(2). P. 219-26.

86. Kren BT, Bandyopadhyay P, Steer CJ. In vivo site-directed mutagenesis of the factor IX gene by chimeric RNA/DNA oligonucleotides // Nat Med. 1998. V.4(3). P.285-90

87. Law PK, Goodwin TG, Fang Q et al. Cell transplantation as an experimental treatment for Duchenne muscular dystrophy // Cell Transplant. 1993. V.2(6). P.485-505

88. Lee JT, Jaenisch R. A method for high efficiency YAC lipofection into murine embryonic stem cells //Nucleic Acids Res. 1996. V. 24(24). P. 5054-5.

89. Lemieux P, Guerin N, Paradis G et al. A combination of poloxamers increases gene expression of plasmid DNA in skeletal muscle // Gene Ther. 2000 V. 7(11). P.986-91.

90. Lindenbaum RH, Clarke G, Patel C, Moncrieff M, Hughes JT. Muscular dystrophy in an X; 1 translocation female suggests that Duchenne locus is on X chromosome short arm // J. Med. Genet. 1979. V. 16(5). P. 389-92.

91. Love, DR, Hill DF, Dickson G, Spurr NK, Byth BC, Marsden RF, Walsh FS, Edwards YH, and Davies KE An autosomal high molecular weght transcript in sceletal muscle with homology to dystrophin // Nature. 1989. V. 339. P. 55-58

92. Lu QL, Mann CJ, Lou F, Bou-Gharios G, Morris GE, Xue SA, Fletcher S, Partridge TA, Wilton SD Functional amounts of dystrophin produced by skipping the mutated exon in the mdx dystrophic mouse // Nat Med. 2003. V. 9(8). P. 100914.

93. Mann CJ, Honeyman K, Cheng AJ, Ly T, Lloyd F, Fletcher S, Morgan JE, Partridge TA, Wilton SD. Antisense-induced exon skipping and synthesis of dystrophin in the mdx mouse. // Proc Natl Acad Sci USA. 2001. V.98(l) P. 42-7

94. Matsumura K, Tome FM, Collin H, Azibi K, Chaouch M, Kaplan JC, Fardeau M, Campbell KP. Deficiency of the 50K dystrophin-associated glycoprotein in severe childhood autosomal recessive muscular dystrophy // Nature. 1992. V. 359. P. 320-2.

95. Matsuo M, Masumura T, Nakajima T, Kitoh Y, Takumi T, Nishio H, Koga J, Nakamura H. A very small frame-shifting deletion within exon 19 of the Duchenne muscular dystrophy gene // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1990. V. 170(2). P. 963-7.

96. Mendell JR, Kissel JT, Amato AA et al. Myoblast transfer in the treatment of Duchenne's muscular dystrophy // N Engl J Med. 1995. V. 333(13). P.832-8

97. Mokri B, Engel AG. Duchenne dystrophy: electron microscopic findings pointing to a basic or early abnormality in the plasma membrane of the muscle fiber. // Neurology. 1975. V. 25(12). P. 1111-20.

98. Monaco AP, Bertelson CJ, Colletti-Feener C, Kunkel LM. Localization and cloning of Xp21 deletion breakpoints involved in muscular dystrophy // Hum. Genet. 1987. V. 75(3). P. 221-7.

99. Morris GE, Simmons C, Nguyen TM. Apo-dystrophins (Dp 140 and Dp71) and dystrophin splicing isoforms in developing brain // Biochem Biophys Res Commun. 1995. V. 215(1). P.361-7

100. Morris MC, Vidal P, Chaloin L, Heitz F, Divita G A new peptide vector for efficient delivery of oligonucleotides into mammalian cells // Nucleic Acids Res. 1997. V.25(14). P.2730-6

101. Morris MC, Chaloin L, Heitz F, Divita G. Translocating peptides and proteins and their use for gene delivery. // Curr Opin Biotechnol. 2000 Oct;l l(5):461-6.

102. Mountain A. Gene therapy: the first decade. // Trends Biotechnol. 2000. V. 18(3). P. 119-28

103. Murakami T, Nishi T, Kimura E et al. Full-length dystrophin cDNA transfer into skeletal muscle of adult mdx mice by electroporation // Muscle Nerve. 2003. V.27(2). P.237-41

104. Naffakh N, Bohl D, Salvetti A, Moullier P, Danos O, Heard JM. Gene therapy for lysosomal disorders //Nouv Rev Fr Hematol. 1994. V. 36. Suppl. 1. P. SI 1-6.

105. Ohmori N, Niidome T, Tomomitsu Hatakeyama, Hisakazu Mihara, and Haruhiko Aoyagi, Interaction of alpha-Helical Peptides with Phospholipid Membrane: Effects of Chain Length and Hydrophobicity of Peptides // J. Peptide Res. 1998. V.5l.P. 103-109

106. Ohsaki M, Okuda T, Wada A, Hirayama T, Niidome T, Aoyagi H. In Vitro Gene Transfection Using Dendritic Poly(L-lysine). // Bioconjug Chem. 2002. V. 13(3). P.510-7

107. Partridge T. Pathophysiology of muscular dystrophy // Br. J. Hosp. Med. 1993. V. 49(1). P. 26-36.

108. Perkins KJ, Davies KE The role of utrophin in the potential therapy of Duchenne muscular dystrophy//Neuromuscul Disord. 2002. V.12 Suppl l.P. S78-89

109. Phillips WD, Noakes PG, Roberds SL, Campbell KP, Merlie JP. Clustering and immobilization of acetylcholine receptors by the 43-kD protein: a possible role for dystrophin-related protein // J. Cell Biol. 1993. V. 123(3). P. 729-40.

110. Pillers DM, Weleber RG, Woodward WR, Green DG, Chapman VM, Ray PN. mdxCv3 mouse is a model for electroretinography of Duchenne/Becker muscular dystrophy // Invest. Ophthalmol. Vis. Sei. 1995. V. 36(2). P. 462-6.

111. Pitard B, Pollard H, Agbulut O et al. A nonionic amphiphile agent promotes gene delivery in vivo to skeletal and cardiac muscles // Hum Gene Ther. 2002 V.13(14). P. 1767-75

112. Pollard H, Remy JS, Loussouarn G, Demolombe S, Behr JP, Escande D. Polyethylenimine but not cationic lipids promotes transgene delivery to the nucleus in mammalian cells // J. Biol. Chem. 1998. V. 273(13). P. 7507-11

113. Ponting CP, Blake DJ, Davies KE, Kendrick-Jones J, Winder SJ. ZZ and TAZ: new putative zinc fingers in dystrophin and other proteins // Trends Biochem. Sci. 1996. V. 21(1). P. 11-13.

114. Prior TW, Papp AC, Snyder PJ, Burghes AH, Bartolo C, Sedra MS, Western LM, Mendell JR. A missense mutation in the dystrophin gene in a Duchenne muscular dystrophy patient // Nat. Genet. 1993. V. 4(4). P. 357-60.

115. Pouton CW, Seymour LW. Key issues in non-viral gene delivery. // Adv Drug Deliv Rev. 1998. V. 34(1). P.3-19

116. Roberts RG, Coffey AJ, Bobrow M, Bentley DR. Determination of the exon structure of the distal portion of the dystrophin gene by vectorette PCR // DMD Genomics. 1992. V. 13(4). P. 942-50.

117. Rando TA, Disatnik MH, Zhou LZ Rescue of dystrophin expression in mdx mouse muscle by RNA/DNA oligonucleotides // Proc Natl Acad Sci USA. 2000. V.97(10). P.5363-8.

118. Rando TA. Oligonucleotide-mediated gene therapy for muscular dystrophies // Neuromuscul Disord. 2002. V.12. Suppl 1. P. S55-60

119. Reynolds PN, Feng M, Curiel DT Chimeric viral vectors—the best of both worlds? // Mol Med Today. 1999. V.5(l). P.25-31

120. Rittner K, Benavente A, Bompard-Sorlet A, Heitz F, Divita G, Brasseur R, Jacobs E. New basic membrane-destabilizing peptides for plasmid-based gene delivery in vitro and in vivo. // Mol Ther 2002. V. 5(2). P.104-14

121. Roberts ML, Wells DJ, Graham IR et al. Stable micro-dystrophin gene transfer using an integrating adeno-retroviral hybrid vector ameliorates the dystrophic pathology in mdx mouse muscle // Hum Mol Genet. 2002. V.l 1(15). P.1719-30

122. Rowland LP. Biochemistry of muscle membranes in Duchenne muscular dystrophy // Muscle Nerve. 1980. V. 3(1). P. 3-20.

123. Ruponen M, Ronkko S, Honkakoski P et al. Extracellular glycosaminoglycans modify cellular trafficking of lipoplexes and polyplexes // J Biol Chem. 2001. V. 276(36). P.33875-80.

124. Salvatori S, Biral D, Furlan S, Marin O. Identification and localization of the myotonic dystrophy gene product in skeletal and cardiac muscles // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994. V. 203(3). P. 1365-70.

125. Sambrook J, Fritch EF, Maniatis T. Molecular cloning. / Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989.

126. Samoylova TI, Smith BF. Elucidation of muscle-binding peptides by phage display screening // Muscle Nerve. 1999. V. 22(4). P.460-6.

127. Shah DS, Sakthivel T, Toth I, Florence AT, Wilderspin AF. DNA transfection and transfected cell viability using amphipathic asymmetric dendrimers // Int J Pharm. 2000. V.208(l-2). P.41-8

128. Sheldon K, Liu D, Ferguson J, Gariepy J. Loligomers: design of de novo peptide-based intracellular vehicles. // Proc Natl Acad Sci USA. 1995. V. 92(6). P.2056-60

129. Sicinski P, Geng Y, Ryder-Cook AS, Barnard EA, Darlison MG, Barnard PJ. The molecular basis of muscular dystrophy in the mdx mouse: a point mutation // Science. 1989. V. 244. P. 1578-80

130. Simeoni F, Morris MC, Heitz F, Divita G Insight into the mechanism of the peptide-based gene delivery system MPG: implications for delivery of siRNA into mammalian cells //Nucleic Acids Res. 2003 V. 31(11). P.2717-24

131. Smaglik P. Tighter watch urged on adenoviral vectors.with proposal to report all 'adverse events' //Nature. 1999. V.402. P.763-767

132. Sparrow JT, Edwards V V, Tung C, Logan MJ, Wadhwa MS, Duguid J, Smith LC Synthetic peptide-based DNA complexes for nonviral gene delivery // Adv Drug Deliv Rev. 1998. V.30 (1-3). P. 115-131

133. Stratford-Perricaudet LD, Makeh I, Perricaudet M, Briand P. Widespread long-term gene transfer to mouse skeletal muscles and heart // J. Clin. Invest. 1992. V. 90(2). P. 626-30.

134. Subramanian A, Ranganathan P, Diamond SL. Nuclear targeting peptide scaffolds for lipofection of nondividing mammalian cells //Nat Biotechnol. 1999. V.17(9). P.873-7.

135. Temple G.F., Dozy A.M., Roy K.L., Kan Y.W. Construction of a functional human suppressor tRNA gene: an approach to gene therapy for beta-thalassaemia. //Nature. 1982. V. 308. P. 537-540.

136. Tinsley JM, Blake DJ, Roche A, Fairbrother U, Riss J, Byth BC, Knight AE, Kendrick-Jones J, Suthers GK, Love DR, et al. Primary structure of dystrophin-related protein //Nature. 1992. V. 360. P. 591-3.

137. Tinsley JM, Potter AC, Phelps SR, Fisher R, Trickett JI, Davies KE. Amelioration of the dystrophic phenotype of mdx mice using a truncated utrophin transgene //Nature. 1996. Vol. 384. P. 349-53.

138. Trivedi RA, Dickson G. Liposome-mediated gene transfer into normal and dystrophin-deficient mouse myoblasts // J. Neurochem. 1995. V. 64(5). P. 2230-8.

139. Turner G, Dunckley M, Dicson G. Gene therapy of Duchenne muscular dystrophy. / In "Dystrophin. Gene, protein and cell biology". Edited by Brown S.& Lucy J. Cambrige Univ. Press. 1997. P. 275-309.

140. Wagner E, Cotten M, Foisner R, Birnstiel ML Transferrin-polycation-DNA complexes: the effect of polycations on the structure of the complex and DNA delivery to cells // Proc Natl Acad Sci U S A. 1991 V. 88(10). P.4255-9

141. Wagner KR, Hamed S, Hadley DW et al. Gentamicin treatment of Duchenne and Becker muscular dystrophy due to nonsense mutations // Ann Neurol. 2001. V. 49(6). P.706-11

142. Wakefield PM, Tinsley JM, Wood MJ et al. Prevention of the dystrophic phenotype in dystrophin/utrophin-deficient muscle following adenovirus-mediated transfer of a utrophin minigene // Gene Ther. 2000. V. 7(3). P. 201-4

143. Walton JN Carrier detection in X-linked muscular dystrophy // J Genet Hum. 1969. V.17(3). P.497-510

144. Wang B, Li J, Xiao X. Adeno-associated virus vector carrying human minidystrophin genes effectively ameliorates muscular dystrophy in mdx mouse model // Proc Natl Acad Sci USA. 2000 V. 97(25). P. 13714-9

145. Watkins SC, Cullen MJ. A quantitative study of myonuclear and satellite cell nuclear size in Duchenne's muscular dystrophy, polymyositis and normal human skeletal muscle //Anat. Rec. 1988. V. 222(1). P. 6-11.

146. Wells DJ, Wells KE Gene transfer studies in animals: what do they really tell us about the prospects for gene therapy in DMD? // Neuromuscul Disord. 2002 V.12. Suppl 1 .P. SI 1-22

147. Wells DJ, Wells KE, Walsh FS, Davies KE, Goldspink G, Love DR, ChanThomas P, Dunckley MG, Piper T, Dickson G. Human dystrophin expression corrects the myopathic phenotype in transgenic mdx mice // Hum. Mol. Genet. 1992. V. 1(1). P. 35-40.

148. Wells DJ, Ferrer A, Wells KE Immunological hurdles in the path to gene therapy for Duchenne muscular dystrophy // Expert Rev Mol Med. 2002. V. 4. P. 1-23.

149. Wilton SD, Lloyd F, Carville K, Fletcher S, Honeyman K, Agrawal S, Kole R. Specific removal of the nonsense mutation from the mdx dystrophin mRNA using antisense oligonucleotides //Neuromuscul. Disord. 1999. Vol. 9(5). P. 330-8.

150. Winand NJ, Edwards M, Pradhan D, Berian CA, Cooper BJ. Deletion of the dystrophin muscle promoter in feline muscular dystrophy // Neuromuscul. Disord. 1994. V. 4(5-6). P. 433-45.

151. Winder SJ, Knight AE, Kendrick-Jones J. Protein structure / In "Dystrophin. Gene, protein and cell biology". Edited by Brown S.& Lucy J. Cambrige Univ. Press. 1997. P. 26-52.

152. Wolfert MA, Seymour LW. Chloroquine and amphipathie peptide helices show synergistic transfection in vitro.//Gene Ther. 1998. V. 5(3). P.409-14.

153. Wolff JA, Dowty ME, Jiao S et al. Expression of naked plasmids by cultured myotubes and entry of plasmids into T tubules and caveolae of mammalian skeletal muscle // J Cell Sci. 1992. V. 103. P. 1249-59

154. Wu CH, Sapozhnikov E, Wu GY Evaluation of multicomponent non-viral vectors for liver directed gene delivery // J Drug Target. 2002. V.10(2). P. 105-11

155. Wyman TB, Nicol F, Zelphati O, Scaria PV, Plank C, Szoka FC Jr. Design, synthesis, and characterization of a cationic peptide that binds to nucleic acids and permeabilizes bilayers. // Biochemistry 1997. V.36(10). P.3008-17

156. Yanagihara I, Inui K, Dickson G, Turner G, Piper T, Kaneda Y, Okada S. Expression of full-length human dystrophin cDNA in mdx mouse muscle by HVJ-liposome injection // Gene. Ther. 1996. Vol. 3, N6. P. 549-53.

157. Yang L, Lochmuller H, Luo J, Massie B, Nalbantoglu J, Karpati G, Petrof BJ. Adenovirus-mediated dystrophin minigene transfer improves muscle strength in adult dystrophic (MDX) mice // Gene Ther. 1998. V. 5(3). P. 369-79.

158. Zatz M, Vianna-Morgante AM, Campos P, Diament AJ. Translocation (X;6) in a female with Duchenne muscular dystrophy: implications for the localisation of the DMD locus // J. Med. Genet. 1981. V. 18(6). P. 442-7.

159. Zelenin AV, Kolesnikov VA, Tarasenko OA et al. Bacterial beta-galactosidase and human dystrophin genes are expressed in mouse skeletal muscle fibers after ballistic transfection // FEBS Lett. 1997. V.414(2). P.319-22

160. Zhang G, Budker V, Williams P, Subbotin V, Wolff JA. Efficient expression of naked DNA delivered intraarterially to limb muscles of nonhuman primates. // Hum Gene Ther. 2001. V.12(4). P.427-38

161. Я чрезвычайно благодарен руководителю группы генной терапии Баранову Александру Николаевичу за искреннюю поддержку и терпение в течение долгих лет совместной работы.

162. Я благодарен своему самому первому научному руководителю Татьяне Эдуардовне Иващенко за мое обучение и помощь в обсуждении результатов. Искренне благодарен Ольге Александровне Горюхиной за помощь в подготовке диссертационной работы.

163. В завершение, я искренне благодарю Лесину Евгению Александровну, с которой мы долгое время работаем в группе генной терапии, за многолетнюю поддержку и участие в моей судьбе. Пользуясь представленной мне возможностью, я хочу предложить ей руку и сердце.

Информация о работе

Киселёв, Антон Вячеславович
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2005
ВАК 03.00.04

Диссертация

Невирусные носители для доставки ДНК в клетки млекопитающих с целью генотерапии миодистрофии Дюшенна - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы