Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Невирусный перенос генов с помощью новых липидных векторов

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Невирусный перенос генов с помощью новых липидных векторов"

На правах рукописи

БОГДАНЕНКО ЕЛЕНА ВАЛЕНТИНОВНА

НЕВИРУСНЫЙ ПЕРЕНОС ГЕНОВ С ПОМОЩЬЮ НОВЫХ ЛИПИДНЫХ ВЕКТОРОВ

03.00.23 — биотехнология 14.00.36 — аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 2006

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научные консультанты:

доктор химических наук, профессор

доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

доктор биологических наук

Ведущая организация:

Институт биологии гена РАН, г. Москва

Защита диссертации состоится " 2006 г. в час.

на заседании диссертационного совета Д 208.046.01 в Федеральном государственном учреждении науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского".

Жданов Ренат Ибрагимович Козлов Леонид Васильевич

Василов Раиф Гаянович

Лавров Вячеслав Федорович Лахтин Владимир Михайлович

Автореферат разослан " £ Ъ " м ^ с 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук С.Ю. Комбарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ

В связи с бурным развитием молекулярной биологии и биотехнологии появляется все больше возможностей по осуществлению задачи генетической коррекции и модификации генома соматических клеток организма. Одним из наиболее перспективных направлений являются работы в новой области — генетической, или генной терапии — для лечения широкого спектра наследственных заболеваний и патологических состояний. Это направление берет свое начало с 1990-х годов, с работ Френча Андерсена и его сотрудников по генотерапии недостаточности аденозиндезаминазы (Anderson, 1992). Ключевой стадией метода является перенос определенного терапевтического гена в соответствующие ткани и клетки с помощью ряда векторных систем. Самыми эффективными системами переноса генов в целях генотерапии оказались вирусные, однако они имеют ряд серьезных недостатков, среди которых опасность повторных введений комплексов с терапевтическими генами из-за возможности нежелательных иммунных реакций, вплоть до смертельного исхода, и инсерционного мутагенеза (Marshall, 2000; Wu and Burgess, 2004). Поэтому по всему миру ведется активный поиск невирусных медиаторов переноса генов, при использовании которых вместе с лигандами можно было бы достичь адресности и хорошей эффективности трансфекции (Templeton et al., 1997, Hashida et al., 2001).

В настоящее время известны основные закономерности распределения в организме катионных липидов как медиаторов трансфекции и их выведения из него. Определены оптимальные весовые соотношения между этими липидами и ДНК в комплексах. Обнаружено, что липосомы с высоким содержанием холестерина отличаются повышенной стабильностью, вероятно, благодаря повышению стабильности липидного бислоя, что предохраняет комплексы от распада при адсорбции белками плазмы крови (Bennett et al., 1995; Solodin et al., 1995; Templeton et al., 1997). Однако ввиду недостаточной эффективности и специфичности известных невирусных переносчиков

генов задача поиска новых липидных систем по-прежнему остается актуальной. Кроме того, почти отсутствуют данные о возможной иммуногенно-сти и токсичности таких систем и характере взаимодействия ДНК и липида в комплексе, влиянии липида на структуру ДНК. Познание закономерностей строения и биораспределения, проверка безопасности таких комплексов, придание им органоспецифичности приведет к созданию веществ, которые позволят осуществить цель генной терапии как части биотехнологии — замену поврежденных генов здоровыми без применения каких-либо дорогостоящих и опасных методов лечения. , . .

ЦЕЛЬ НАСТОЯЩЕГО ИССЛЕДОВАНИЯ -

разработка системы для исследования и тестирования потенциальных невирусных медиаторов трансфекции для направленного транспорта генов в целях безопасной и эффективной генотерапии.

В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1) изучить физико-химические свойства новых медиаторов трансфекции генов и их комплексов с ДНК;

2) оценить безопасность невирусных векторов, исследовав их цитоток-сичность и генотоксичность;

3) выявить эффективность препаратов — медиаторов переноса репор-терных генов в культуре эукариотических клеток;

4) определить влияние новых векторов на систему комплемента;

5) провести сравнение биораспределения комплексов [14С]-меченой ДНК с медиаторами трансфекции в зависимости от условий их введения животным;

6) доказать возможность переноса функциональных • генов с помощью новых векторов in vivo и эффективной трансфекции органов животных;

7) подтвердить правильность выбора фосфатидилхолина и холестерина в качестве липидов-помощников. , ..

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Разработана система тестов для характеризации новых липидных молекул в целях отбора медиаторов для направленного транспорта генов в локальной и системной генотерапии. Впервые оценены физико-химические свойства ли-поплексов на основе препаратов ХОЛЕНИМ и ДЕГА. Разработаны новые невирусные системы для переноса генов в культуры клеток in vitro и в ткани экспериментальных животных in vivo: рН-чувствительные липосомы, гидрофобные оли-гокатионы, гликокатионный липид, лактозилированные липосомы. Показано, что новые липиды и липосомы не влияют на рост эукариотических клеток в культуре и эффективны при переносе функциональных генов в культуры трансформированных клеток на уровне коммерческих препаратов. Обнаружено повышение эффективности трансфекции для липосом на основе гликозилирован-ного катионного липида (ГЛИКОКЛИП) в 1000 раз по сравнению с негликози-лированным (КЛИП), что свидетельствует о рецептор-опосредованном механизме трансфекции. Показано, что при внутрибрюшинном введении биораспределение [,4С]-ДНК не зависит от липидного состава липосом, а при внутривенном может определяться природой липида. Впервые при исследовании биораспределения использовалась ДНК не из прокариот, а из эукариот.

Исследовано влияние новых невирусных липидных систем и геносом на их основе на компоненты системы комплемента СЗЬ и С4Ь. Показано, что липосомы на основе ДИХОЛЕНИМа и фосфатидилхолина в концентрации, эквивалентной 0,0375 мг/мл иммуноглобулина, не влияют на эти компоненты, а липосомы на основе ДИХОЛЕНИМа и кардиолипина — слабо их активируют. Явление активации системы комплемента, опсонизации ли-поплексов и их клиренс с участием селезенки, печени и почек может быть использовано для достижения направленного переноса генов в эти органы.

Достигнута эффективная трансфекция in vivo гена бактериальной р-галакто-зидазы при введении геносом на основе лактозилированного диглицерида и препарата ДИХОЛЕНИМ в воротную вену печени. Гистохимически и спектро-фотометрически показана экспрессия этого гена в легких, печени и селезенке.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Предложены новые классы медиаторов переноса генов — ХОЛЕНИМы, гликолипиды, дикатионные липиды ДЕГА. Установлены закономерности переноса и экспрессии функциональных генов в зависимости от типа медиатора, липида-помощника, соотношения липид/ДНК, взаимодействия липоплексов с компонентами сыворотки питательной среды и крови. Обнаружено, что введение холестеринового остатка в структуру олигоэтилениминов улучшает характеристики соответствующих липоплексов: увеличивает соотношение гид-рофобности/гидрофильности, стабилизирует липоплекс и обеспечивает оптимальное значение критической концентрации мицеллообразования (ККМ). Выявлены закономерности биораспределения геносом в зависимости от их липидного состава и способа введения. Подтверждена способность веществ с глюкозными и лактозными группировками усиливать трансфекцию и придавать ей направленный характер. Определены причины повышения стабильности липоплексов при использовании холестерина как липида-помощника.

Обоснована возможность адресной доставки генов в селезенку, печень и почки при использовании явления слабой активации системы комплемента липоплексами.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Разработанный комплекс физико-химических, цитологических и иммунологических методов тестирования свойств невирусных систем может быть использован для отбора эффективных векторов для направленного переноса генов в генотерапии. С помощью этого комплекса охарактеризованы в качестве медиаторов трансфекции in vitro и in vivo новые классы рН-чувствительных ли-посом, поликатионов, гидрофобных олигокатионов ХОЛЕНИМ, гликолипи-дов и лактозолипида. Обнаружен эффективный перенос репортерных генов (p-Gal, GFP или Luc) в культуры эукариотических клеток посредством новых классов медиаторов трансфекции. Комплексы из липосом, содержавших ХО-

ЛЕНИМы и плазмидную ДНК, позволили добиться уровня экспрессии гена р-галактозидазы на уровне коммерческих препаратов.

Изучение свойств ХОЛЕН ИМов показало, что эти препараты стабилизируют двойную спираль ДНК, образуют с плазмидной ДНК комплексы размером 100—200 нм, не оказывают существенного влияния на рост клеток в культуре и синтез ДНК. Чем больше холестериновых остатков содержало вещество, тем меньшее его количество было необходимо для достижения оптимума трансфек-ции, что коррелирует с физико-химическими свойствами этих соединений.

Предложен метод прогнозирования биораспределения репортерного гена на основе результатов распределения комплексов новых переносчиков с [14С]-ДНК. С его помощью было установлено, что внутрибрюшинные введения таких комплексов приводят к одинаковому распределению ДНК, не зависящему от строения переносчика, а изменение соотношения ДНК/липид может влиять на биораспределение ДНК in vivo и уровень экспрессии репортерного гена in vitro так же сильно, как и замена одного липида на другой.

Показано, что уменьшение длины мостика в молекуле медиатора ДЕГА приводит к образованию более компактных комплексов с ДНК, что может быть верно и для других классов медиаторов. Липосомы из ДЕГА-3 оказались способными легко проникать через мембрану культивируемых клеток. Применение комплексов из липосом, содержавших ДЕГА-3 и плазмидную ДНК, позволило добиться значительного уровня экспрессии зеленого флуоресцентного белка in vitro.

Предложен метод оценки влияния невирусных векторов на иммунную систему, который позволяет отобрать из них безопасные для введения животным и человеку. Показано, что ДИХОЛЕНИМ не оказывает никакого влияния на систему комплемента, в случае КЛ-липоплексов наибольший вклад в их антикомплементарную активность вносит кардиолипин, в то время как в случае с ФХ-липоплексами — плазмидная ДНК. Слабой активацией комплемента объясняется значительное накопление [14С]-ДНК при использовании липоплексов на основе липосом ФХ/ДИХОЛЕНИМ в почках и печени и максимума эксп-

рессии гена ß-галактозидазы в селезенке, печени и легких при использовании липоплексов на основе липосом ФХ/ДИХОЛЕНИМ/лактозолипид. Предлагается использовать явление активации системы комплемента для достижения адресности доставки генов в выделительные органы (в первую очередь в печень).

Полученные результаты свидетельствуют о перспективности препаратов на ^ основе лактозилированного диглицерида (лактозолипида) и ГЛИКОКЛИПа, содержащих углеводные группировки. Комплексы из липосом, содержавших ГЛИКОКЛИП и ген люциферазы, позволили добиться уровня экспрессии белка в 1000 раз большего, чем при использовании негликозилированного ли-пида (КЛИП). Максимум накопления комплексов [14С]-ДНК и липосом из лактозолипида наблюдался в почках и в печени, а не в легких, что говорит о возможности направленного транспорта с помощью этого вещества.

Разработан метод количественной оценки экспрессии гена ß-галактозидазы in vivo с помощью спектрофотометрии гомогенатов органов, являющийся более объективным, чем гистохимический.

Разработанная методика введения комплексов липидов с ДНК в воротную вену мышам может быть использована в дальнейших работах по испытаниям вновь создаваемых векторов. Некоторые из новых невирусных систем могут быть использованы для переноса терапевтических генов в протоколах генотерапии моногенных наследственных заболеваний, в частности, муковисцидоза и миодистрофии Дюшенна, а также суицидного гена в протоколе генотерапии рака.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Материалы диссертации были доложены на:

I Международном Конгрессе «Congress on Molecular Medicine» (Берлин, Германия, 1997); школе НАТО «ASI Summer School on Gene Therapy» (Спет-сай, Греция, 1997); Keystone Symposium on Gene Therapy (Кистоун, США, 1997); 6th Symposium on Gene Therapy «Towards Gene Therapeutics», MDC Symposium (Berlin-Buch, Germany, 1998), IX и XI Школе-конференции по физико-химической биологии ИБХ РАН/ЮНЕСКО (Москва, 1999 и 2001);

на семинарах в Институте биологии гена РАН (Москва, декабрь 1999 г.), Московской медицинской академии им И.М. Сеченова (Москва, 2000 г.), Институте акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН (С.-Петербург, март 2001 г.), на семинарах Института биотехнологии Университета им. Мартина Лютера, Халле, Германия, 2002—2003, European Polymer Congress (Москва, 2005), the 9th National Congress on Medical Biology (Маниса, Турция, 2005).

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Сформированная система физико-химических, цитологических и иммунологических тестов и тестов in vivo позволяет отобрать из серии новых липидов эффективные векторы для направленного переноса генов в целях генотерапии.

2. Физико-химические методы исследования позволили определить, что новые липидные векторы ХОЛЕНИМ, липосомы ГЛИКОКЛИП/DOPE, КЛИП/ФХ, ГЛИКОКЛИПДЮРЕ/ХОЛЕНИМ и ДЕГА-3 образуют с ДНК сферические комплексы небольшого размера (до 100 нм), состоящие из гидрофильного кора, окруженного гидрофобной «шубой», стабильные при хранении и поэтому оптимальные для трансфекции.

3. Хорошая проницаемость через мембраны и нетоксичность позволяют новым липидным системам в комбинации с липидами-помощниками обеспечить эффективность трансфекции генов р-галактозидазы (ХОЛЕНИМы), люцифе-разы (ГЛИКОКЛИП) и зеленого флуоресцентного белка (ДЕГА-3) in vitro на уровне коммерческих препаратов, а в ряде случаев и выше. При трансфекции с помощью препаратов ХОЛЕНИМ эффективность зависит от соотношения гид-рофобность/гидрофильность: чем больше холестериновых остатков содержало вещество, тем меньшее его количество было необходимо для достижения оптимума трансфекции. Липидные векторы с адресными углеводными группами, в частности, ГЛИКОКЛИП, позволяют добиться более высокого уровня экспрессии белка, чем при использовании негликозилированного липида (КЛИП).

4. Новые липидные векторы при введении их животным в дозах до 150 мг на мышь не вызывают токсических явлений в виде видимых повреждений органов и ухудшения состояния животных. Они способны незначи-

тельно активировать систему комплемента, однако именно это явление может быть одной из причин адресной доставки комплексов с радиоактивной ДНК в выделительные органы наряду со способом введения, соотношением липид/ДНК и химической структурой липида.

5. Изучение трансфекционной способности новых векторов т умо с применением не только гистохимии, но и спектрофотометрии, позволяет увеличить эффективность поиска и отбора самых эффективных переносчиков генов в целях генотерапии. Наиболее эффективными из Исследованных нами являются препараты ХОЛЕНИМ и лактозолипид в виде липосом с фосфатидилхолином и холестерином,

ПУБЛИКАЦИИ

Основное содержание работы отражено в 17 научных публикациях (из которых 3 — в центральйой, 4 — в иностранной печати и 10 — в материалах международных и отечественных конференций и симпозиумов). Список публикаций приводится в конце автореферата.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ

Работа изложена на русском языке, состоит из введения, 6 глав, заключения, выводов и списка литературы. Библиография включает 223 наименования работ отечественных и зарубежных авторов. Общий объем диссертации составляет 227 страниц машинописного текста. Текст иллюстрирован 6 таблицами и 42 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В работе использовались глицирризин (СЬ), а-токофероловый эфир янтарной кислоты (ТБ), лактозолипид (лактозилированный диглицерид), ка-тионные липиды КЛИП1 (СЬ-1) и КЛИП6 (СЬ-6), катионный липид — производное пиридиния КЛИП, гликокатионный липид — гликозилиро-

ванное производное пиридиния ГЛИКОКЛИП, амфифильные димерные производные L-глютаминовой кислоты, содержащие в качестве мономеров два диэфирных остатка и два четвертичных аммониевых остатка, связанных между собой алифатическим спейсером (3 или 7 метиленовых остатков) — ДЕГА и вещества, которые по строению можно отнести к гидрофобным олигокатионам — новые холестериновые производные гексаэтилен/пропи-лен/имин/сополимера, искусственные сперминоподобные соединения — МОНОХОЛЕНИМ, ДИХОЛЕНИМ и ТРИХОЛЕНИМ (рис. 1).

Кривые плавления комплексов фрагментов геномной ДНК с веществами ХОЛЕНИМ измеряли на спектрофотометре VS4-2P при длине волны 260 нм; точность измерений температуры составляла ±0,5оС. Спектры флуоресценции пирена были получены на спектрофлуориметре MPF-44B Perkin-Elmer, спектры кругового дихроизма липоплексов, содержавших плазмиду pCMV-SPORT-p-Gal (BioLifeTech, кат. №10586-04) и вещества ХОЛЕНИМ — на спектрополяриметре Jasco J-600. Геномную ДНК спермы лосося фрагменти-ровали мягкой обработкой ультразвуком до дуплексов со средним размером 4 т.п.н. Водный раствор ДНК диализовали против буферного раствора 10 мМ NaCl /1 мМ трис-HCl и определяли его концентрацию спектрофотометрически.

Для получения электронных микрофотографий липоплексов их аликво-ты помещали на медную сетку, покрытую пленкой коллодия, и высушивали. Избыток комплекса удаляли, а остаток контрастировали 4% водным раствором уранил нитрата. После удаления красителя пленку.просушивали. Микрофотографии получали на фотопластинках фирмы «Kodak» на электронном микроскопе JEM 100В при ускоряющем напряжении 80 кВ. Изучение сродства липосом к клеточной мембране и их накопления в клетке проводили методом флуоресцентной микроскопии с использованием липо-фильного флуоресцентного зонда кумарина.

Липосомы были получены по методу упаривания из обращенной фазы при ультразвуковой обработке (Duzgunes et al., 1983). В качестве растворителя использовали хлороформ, диэтиловый эфир и хлористый метилен. Плен-

СН2СН2КНСН2СН2СН2М1а

сиг-ос,„н„

М-СНгСНгШСНгСНгСНгМИ, V

СИ2СН2МНСН2СН2СН21ЧН-С(0)0-С11о1 МОИОХОЛЕМШ

о^сизмнсщснгсн^м!!

/

^СН2СН2М1СН2СН2СН2М1-С(0)0-СЬо1 \

СН2СН2М1С112СН2СН2М1 -С(0)0-СНо1 ДИХОЛЕЮМ

С112СИ2М1СН2СИ2СН2М1-С(О)О-а101 /

^СН2СИ2Г^НСН2СН2СН2>Ш-С(0)0-Сио1 \

СНгСИгШСНгСНгСНгГШ-аОЮ-СЫЯ

ТРИХОЛЕИИМ

сн,^ -он

• ын, ••"г0

23,224-6

ГЛИЦИРРИЗИИОВАЯ КИСЛОТА

^(СНуСНу

СН'

соо сн^—соо

а- ТОКОФЕРОЛОВЫЙ ЭФИР ЯНТАРНОЙ КИСЛОТЫ

сн-о- с,»н„ \

сн2-!ч*-сн2сн2он / \ СН, СН,

КЛИП I

СН2-ОС,«Н„ /

сн-о- с,«н„ \

СН2-ОСН2ОС112СН21^(СН,),

клип б

НдзС,.ООС(СН,)а СН, СН, (СН^СООСиН*, \ / \ / Н„С,.ООССН-М*— (СН])Щ — N'-011СООС„Нм \ / СН, С11,

ДЕГА

онон

он

о

ОН I ОС16Н33

о

ЛАКТОЗИЛИРОВАИНЫЙ ДИГЛИЦЕРИД

"0Т5

¿НОС^Н^ СН2ОС18Н37

КЛИП и ГЛИКОКЛИП

~от$

снос18н„

Асб 1 СН20С1в1Ь, 11 ОАс

Рис. 1. Структурные формулы новых медиаторов переноса генов

ку ДЕГА гидратировали стерилизованной водой или физиологическим раствором и получали суспензию полибислойных липосом. Мицеллы из XOJIE-НИМов получали добавлением этих олигокатионных липидов к воде в виде раствора в глицерино-водо-этанольной смеси в соотношении 34:40:26, смесь озвучивали на ультразвуковой бане УЗДН-4 при 0вС в течение 10 мин. Поли-бислойные липосомы для трансфекции in vivo были сформированы из смеси, содержащей ФХ (70 мол. %), ДИХОЛЕНИМ (10 мол. %),) и лактозолипид (20 мол. %). Растворы исходных липидов хранили при -80°С, а липосомы — при 4°С под азотом и использовали в течение двух недель.

Тотальная [,4С]-тимидин меченая общая ДНК была получена из эукарио-тических клеток линии НГУК-1, выращенных на среде с [14С]-тимидином (15 мкКи/мл, «Изотоп», Россия). [14С]-аденозин меченая ДНК была выделена из клеток Е. coli, выращенных на среде Луриа-Бертани, содержащей [14С]-аде-нин (56 мКи/мМ, «Изотоп», Россия), по стандартной методике. [14С]-ДНК обрабатывали ультразвуком (УЗДН-2Т, Россия, 15 мин с 30-секундной остановкой после каждой минуты озвучивания при 0°С, 10 циклов) с образованием фрагментов 4—6 т.п.н. длиной (данные электрофореза). Радиоактивность ДНК определяли спустя 1 ч после добавления сцинтилляционной жидкости ЖС-8 к жидким пробам, находившимся в пластиковых пробирках.

Репортерную генетическую конструкцию — плазмиду pCMV-SPORT-ß-Gal — получили из лаборатории N. Duzgunes, Pacific Univercity, San Francisco (США). Для получения больших количеств плазмиды культуру трансформированного данной конструкцией штамма Е. coli XL-1 наращивали в ферментере (качалке) при 37+0,5"С в течение 14—16 ч (ночная культура) на жидкой микробиологической среде Луриа-Бертани (при соотношении 800 мл среды: 4 л воздуха) с добавкой 50 мг/мл ампициллина в качестве селективного компонента для клеток, имеющих плазмиду с соответствующим репортерным геном. При выделении и очистке плазмидной ДНК pCMV-SPORT-ß-Gal использовали модификацию методики (Birnboim Н., Doly J., 1979). Показатель D26O служил для оценки концентрации ДНК в пробе из расчета, что 2 единицы опти-

ческой плотности (D) соответствуют концентрации 0,1 мг ДНК в 1 мл раствора (Маниатис и др., 1984).

Цитотоксичность ХОЛЕНИМов оценивали на основе их влияния на рост клеток (количество клеток в % от исходного через 24 и 72 ч культивирования). Клеточный монослой окрашивали 0,2% красителем кристалл-виолет в 2% этаноле. После этого клетки промывали водой, краситель элюировали 10% уксусной кислотой (Адаме, 1983). Количество клеток вычисляли по значению оптической плотности при 595 нм. Эмпирически найдено, что 00595=0,1 соответствует 32 500 клеток в лунке, подсчитанным с применением камеры Горяева.

Влияние препаратов ХОЛЕНИМ и других липидов на синтез ДНК определяли по включению метки в растущие в культуре эукариотические клетки линии НГУК-1. В культуральную среду добавляли [14С]-тимидин («Изотоп», Россия) с удельной радиоактивностью 56 мКи/мМоль. Клетки высевали на 24-луночные плашки после их обработки 0,2% ЭДТА, приблизительно по 103 клеток на ячейку и культивировали в течение 3 дней в среде RPMI-1640 (Flow, UK), содержавшей 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 50 мкг/мл гентамицина. Далее рост клеток продолжался при 37"С в инкубаторе, в газовой среде из 5% СО2 и 95% воздуха.

После экспозиции клеток с меткой в течение 4 ч их промывали холодной средой Хэнкса, а затем фиксировали смесью этанола и ледяной уксусной кислоты (9:1) в течение ночи для отмывки несвязанного (14С]-тимидина. Для оценки уровня синтеза ДНК клетки лизировали в течение ночи 0,3 М КОН при 37вС. После нейтрализации полученных проб к ним добавляли жидкосцинтилляционный раствор Брэя в соотношении 1:5.

Исследование эффективности генного переноса с помощью липоплексов ХОЛЕНИМ проводили на культурах эукариотических клеток НГУК-1 (неврино-ма Гассерова узла крысы) и PC-12 (феохромоцитома надпочечников крысы). Для формирования трансфекционных комплексов смешивали растворы плазмидной ДНК и веществ ХОЛЕНИМ в различных весовых соотношениях, встряхивали смесь на шейкере (Vortex) и инкубировали 30 мин. при комнатной температуре.

Трансфекцию клеток липоплексом с плазмидой pCMV-SPORT-ß-Gal проводили через 24 ч после пассирования клеток в 96-луночные плашки по 5-Ю4 клеток в лунку. Для этого культуральную среду из лунок удаляли, промывали монослой средой без сыворотки, и к клеткам добавляли липоплекс ДНК/ХОЛЕНИМ в среде без сыворотки, и инкубировали в течение 5 ч при 37°С (5% СО2). Затем добавляли равный объем культуральной среды, содержащей 20%-ную сыворотку, и продолжали инкубацию еще 48 ч. После проведения трансфекции тщательно удаляли среду, не нарушая монослой, и добавляли в лунки раствор для лизиса клеток. Далее клетки замораживали при -70°С и оттаивали при комнатной температуре в течение 10 мин. Активность репортерного гена ß-галактозидазы определяли, используя в качестве субстрата хлорофенол-ге<1-Р-с1-галактопиранозид (N-Gal) (SIGMA). Инкубацию проводили в фосфатном буфере pH 8,0, содержащем 1 мг/мл N-Gal, 1мМ MgSÜ4, 10 мМ KCl, 50 мМ меркаптоэтанола и 0,5% бычьего сывороточного альбумина при 37°С до развития окрашивания (15 мин.). Расчет количества фермента в пробах проводили на основе разведений стандартного образца ß-галактозидазы (SIGMA, кат. №9031-11-2) (Felgner et al., 1994).

Для определения способность липосом ФХ/GL или ФХ/TS переносить ген ß-галактозидазы в культивируемые клетки линии L929 их трансфицировали по технологии (Ausubel et al., 1991). Трансфекция Са-фосфатным методом проходила в соответствии с методом, описанным (Graham and van der Eb, 1973).

Уровень активности люциферазы светлячков в клетках СНО после генного переноса с помощью препаратов липосом, приготовленных нами, был определен с использованием соответствующего набора фирмы «Промега» (Promega luciferase assay kit 1/22/97). Экспрессию плазмидной ДНК pEGFP-Nl (Clontech, 4,7 т.п.н.) клетками линии 293 определяли с помощью флуоресцентной микроскопии или проточной цитофлуорометрии. Данные по трансфекции во всех случаях представляют собой средние, полученные в 4 сериях независимых экспериментов (в каждой по 4 эксперимента); со стандартными отклонениями (М+/-о). Статистическая достоверность оценивалась с помощью t-критерия Стьюдента.

Для введения in vivo формировали нуклеолипосомные комплексы (ли-поплексы), смешивая [14С]-меченую радиоактивную или плазмидную ДНК с ХОЛЕНИМами или липосомами и инкубируя смесь в течение 30 мин. Комплексы вводили мышам инбредной линии ICR массой 36—40 г возрастом 4—6 мес внутрибрюшинно, в воротную вену печени или почечную артерию.

Вещества ХОЛЕНИМ вводились в различных соотношениях с (14С]-ти-мидин меченой ДНК, а липоплексы, состоявшие из [14С]-аденозин меченой ДНК и липосом фосфатидилхолин/лактозилированный диглицерид, имели соотношение этих составляющих 1:2 (80 мкг ДНК и 160 мкг липосом). Через сутки после введений животных забивали и извлекали у них внутренние органы, которые сначала взвешивали, а затем лизировали 0,6 N раствором КОН при 37вС. Лизаты нейтрализовывали 0,6 N раствором НСЮ4. В случае использования в качестве переносчика чистых веществ ХОЛЕНИМ сцинтил-ляционную жидкость добавляли к жидкой нейтрализованной пробе. В случае использования лактозилированных липосом пробы наносили на фильтры, которые после просушивания и помещения во флаконы заливали сцинтил-ляционной жидкостью. Подсчет радиоактивности велся в счетчике «Rakbe-ta». Проводили пересчет содержания метки на единицу массы органа.

Доставка плазмиды pCMV-SPORT-ß-Gal для достижения экспрессии гена ß-галактозидазы в органах мышей осуществлялась липосомами, состоящими из фосфатидилхолина и ДИХОЛЕНИМа (1:1 по массе), и в комплексе со смешанными липосомами состава фосфатидилхолин/лактозоли-пид/ ДИХОЛЕНИМ (100 мкг ДНК на 160 мкг липосом).

Для проверки влияния фосфатидилхолиновых и кардиолипиновых липосом, олигокатиона ДИХОЛЕНИМ, плазмидной ДНК и приготовленных из них липоплексов на систему комплемента, а именно на активацию компонентов СЗЬ и С4Ь, эти соединения инкубировали с комплементом морской свинки. Эритроциты барана использовали во временном интервале между 10 и 30 днями после 10 дней от взятия крови. Сыворотка крови морской свинки была использована как комплемент. Реагент R4 (комплемент с нулевой актив-

ностью С4 компонента) был приготовлен обработкой гидразин-гидратом. Агрегированный иммуноглобулин человека IgG (agg.) был выбран в качестве стандарта для оценки антикомплементарной активности. Для приготовления агрегированного IgG человека гамма-глобулин (10 мг/мл в VBS) нагревали при 63°С 30 мин, центрифугировали 15 мин при 3000 g (после остывания), подвергали гелевой хроматографии на Sephadex G-200 и собирали первую фракцию с высокой молекулярной массой. Антикомплементарная активность была определена как разница между числом ячеек с половинным лизисом в контрольной серии и числом ячеек в серии с известной концентрацией IgG.

Измерение антикомцлементарной активности липоплексов выполнялось тем же способом. Образцы препарата добавлялись к раствору вместо IgG (agg). Антикомплементарная активность всех препаратов выражена в конечных концентрациях IgG (agg), имеющих тот же самый уровень активности.

Для определения содержания ДНК в органах животных было определено количество общей ДНК в аликвоте лизата каждого образца по Шмидту и Тангаузену, модификация Флека и Манро (Fleck, 1962) Данные в этом случае представляли величиной срм (count per minute) на 1 мг ДНК. Наиболее приемлемой формой представления распределения метки была выбрана доля содержания метки в органе, нормированная на массу органа.

(срм в органе / срм во всех органах) масса органа

При гистохимическом исследовании сразу после вскрытия мышей их органы замораживали при -80°С. Срезы органов толщиной 25 мкм получали с помощью криостатированного микротома и монтировали их на предметном стекле. На них наносили 200 мкл фосфатно-солевого буфера (ФСБ) с рН 7,5, содержавшего Х-Gal (6 мг/мл), MgS04 (1 мМ/л), 4 мМ K4[Fe(CN)6] и 4 мМ K3[Fe(CN)6]. X-Gal предварительно растворяли в ДМСО (6 мг на 200 мкл). Стекла помещали во влажную камеру, а ее — в термостат на 37°С и фиксировали время развития окрашивания (30—50 мин). После этого стекла со срезами погружали в 2,5% глутаровый альдегид на 2 ч при -f4eC. Для

визуализации клеточных структур (главным образом ядер) срезы докрашивали гематоксилином. Далее после проводки поочередно в 70%, 96% и 100% спирте, смеси спирта и ксилола (1:1), о-ксилоле срезы заключали в капли канадского бальзама под покровные стекла (Ченцов, 1988).

Для спектрофотометрического определения р-галактозидазной активности in vivo прооперированных животных забивали через двое суток. Их органы гомогенизировали в ФСБ с рН 8,0, содержавшем 1 мМ Mg2+, 10 мМ К+, в охлажденном во льду гомогенизаторе. К 1 мл гомогената добавляли 100 мкл субстрата N-Gal и 100 мкл меркаптоэтанола. Смесь перемешивали на Vortex и разделяли на две части — опытную и контрольную. Инкубацию опытной части проводили в течение получаса в термостате при 37'С, а контрольной — на льду. Затем обе пробирки центрифугировали по 7,5 мин. при 11 000 об./мин. Супернатант собирали в пробирку и держали на холоду. Буфером ФСБ с рН 8,0 заполняли кюветы, добавляли в них по 200 мкл реакционной смеси. По стандарту фермента SIGMA, cat. №9031-11-2, определяли удельную активность |3-галактозидазы в различных разведениях, при D5go,соответствующей максимуму поглощения света продуктом работы фермента в видимой области спектра. На основании измерений оптической плотности проб строилась калибровочная кривая для оценки активности фермента в гомогенатах органов. Расчетный коэффициент уточняли аппроксимацией (к линейной прямой пропорциональности) методом наименьших квадратов (программа MS Excel).

Значения D5go для гомогенатов органов, инкубированных при 37°С, измерялись относительно тех же проб, которые в это время держали на ледяной бане (контрольные пробы). По разнице активности фермента в опыте и контроле (концентрации продукта реакции с N-Gal) определяли активность бактериальной, т.е. трансгенной, р-галактозидазы. На основании измерения вышеуказанных стандартов производился пересчет в международные единицы ферментативной активности (и) на грамм органа.

Методом импульсной метки исследовали выведение меченых по [2-14С]-ацетату фосфолипидов и нейтральных липидов из тимоцитов крыс in vitro. Свежевыделенные тимоциты инкубировали в среде, содержащей [2- 14С]-ацетат. После 30 мин. инкубации клетки отмывали от радиоактивной метки и инкубировали с немеченым ацетатом 20 и 40 мин. Липиды тимоцитов разделяли методом тонкослойной хроматографии. Сравнивали величины общей и удельной радиоактивности клеток, общих липидов и индивидуальных нейтральных липидов и фосфолипидов (Мэдди, 1979; Бергельсон, 1981).

Электронные микрофотографии комплексов ДНК с ХОЛЕНИМами получены совместно с А.Г. Погореловым (ИТЭБ РАН, г. Пущино). Исследование комплексов ДНК с препаратами ХОЛЕНИМ проведено совместно с А.И. Петровым (ИТЭБ РАН). Атомно-силовые микрофотографии липоплексов на основе плазмиды pEGFP-Nl, препаратов ДЕГА-3 и ДЕГА-7 получены совместно с А. Эль-Кади (физфак МГУ им. М.В. Ломоносова). Данные о цито- и генотоксичности препаратов ХОЛЕНИМ, КЛИП-1 и КЛИП-6, эффективности генного переноса с помощью липоплексов ХОЛЕНИМ, ФХ/GL или ФХ/TS in vitro получены совместно с О.В. Подобед и Т.А. Цветковой (НИИБМХ РАМН, г. Москва). Способность ДЕГА проникать через мембрану клеток и переносить плазмидную ДНК изучена совместно с A.A. Московцевым (НИИОПП РАМН, Москва). Влияние невирусных систем на компоненты системы комплемента изучено совместно с В.А. Гузовой и Л.В. Козловым (МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского, Москва). Исследование in vivo биораспределения [14С]-ДНК и экспрессии гена ß-галактозидазы после его переноса ли-посомами на основе ДИХОЛЕНИМа и лактозилированного диглицерида выполнено совместно с Ю.В. Свиридовым (НИИ БМХ РАМН, г. Москва). Метаболизм липидов тимоцитов крыс в условиях in vitro изучен совместно с Л.Н. Маркевич, Т.П. Кулагиной и И.К. Коломийцевой (ИБК РАН, Пущино).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Физико-химические свойства ХОЛЕНИМов, липосом ГЛИКОКЛИП/DOPE, КЛИП/ФХ, ГЛИКОКЛИПДЮРЕ/ХОЛЕНИМ и ДЕГА-3

Для исследования соотношения строения веществ ХОЛЕНИМ (и ли-поплексов на их основе) и их активности в генном переносе необходимо было прежде всего исследовать взаимодействие этих соединений с нуклеиновыми кислотами, а также их влияние на структуру ДНК. Гидрофильная часть веществ ХОЛЕНИМ включает группы, характерные для структуры природных полиаминов спермина и спермидина, которые обладают сродством к двойной спирали ДНК и стабилизируют ее, а также полиэтиленими-на, активного в генном переносе.

Для доказательства того, что вещества ХОЛЕНИМ образуют комплексы с ДНК, в качестве флуоресцентного зонда использовали пирен, колебательная структура спектров испускания которого чрезвычайно чувствительна к полярности его локального окружения. На рис. 2 (а) представлена зависимость величины спектрального параметра I3/I1, наиболее чувствительного к гидрофобно-сти микроокружения, от концентрации веществ ХОЛЕНИМ при постоянной концентрации ДНК (II и 13 — амплитуды колебательных полос спектров эмиссии мономерной формы пирена при 383 и 372 нм). Из приведенных данных следует, что величина этого отношения практически не зависит от концентрации ХОЛЕНИМов вплоть до достижения пороговой величины, выше которой наблюдается ее резкое возрастание (в отсутствие ДНК параметр I3/I1 не зависит от концентрации соединений ХОЛЕНИМ во всем их диапазоне). Эти значения, различные для веществ I (6,0-Ю"3 М), II (8,6-Ю"5 М) и III (1,0-10"4 М), соответствуют образованию их комплексов с ДНК, содержащих гидрофобные кластеры, в которые переходят молекулы пирена, и могут трактоваться как критические концентрации мицеллообразования.

Существует хорошая корреляция между величиной ККМ и снижением общего положительного заряда полярных группировок ХОЛЕНИМов, и можно

а) 0 80

0,75-

t

0,70-~Г' 0,650,600,55-

0,50

MOHO

• без ДНК

1 да

< три

«i #

..»...<»"•'' »—•—••—

—i-1-1-1—

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

-//-т

i1 ' i ■ i ' i ■ i 1 i ■ 4 6 8 10 12 14 16

Концентрация холенимов, хЮ'М

б)

0,45-

0,40-

0,35-

0,30-

«• «

» »>

20

40 60 80

Тсмшрэтура, "С

100

Рис. 2. Физико-химические свойства ХОЛЕНИМов:

а — зависимость величины параметра спектра эмиссии пирена I3/I1 от концентрации веществ MOHO-, ДИ- и ТРИХОЛЕНИМ (I3 и Ij — амплитуды колебательных полос спектров эмиссии мономерной формы пирена при 383 и 372 нм) в присутствии ДНК спермы лосося (45 мкМ по фосфату(о)); б — УФ-кривые плавления ДНК спермы лосося в буферном растворе 10 мМ NaCl / 1 мМ трис-HCl, рН 7,2 (о), и в тех же условиях в присутствие препаратов MOHO-, ДИ- и ТРИХОЛЕНИМа, 1,0±0,2.10'4 М

утверждать, что ХОЛЕНИМы связываются с ДНК, образуя гидрофобную «шубу» вокруг ее спирали, а энергетически невыгодный контакт гидрофобных холестериновых остатков с водным окружением приводит при определенной концентрации к снижению растворимости комплексов. Введение холестеринового фрагмента в структуру олигоэтилениминов улучшает характеристики соответствующих липоплексов: увеличивает соотношение гидрофобности/гидрофи-льности, стабилизирует липоплекс и обеспечивает оптимальное значение ККМ.

Для подтверждения существования стабильных комплексов ДНК/ХОЛЕ-НИМ нами было изучено влияние веществ ХОЛЕНИМ на кривые плавления геномной ДНК. Температура плавления ДНК-дуплексов в буферном растворе составляла 72*С при гиперхромном эффекте, равном 40%, что свидетельствовало о сохранении нативной двухспиральной структуры получаемых дуплексов при обработке геномной ДНК ультразвуком. Из рис. 2 (б) следует, что комплексы ДНК с веществами I, II или III имеют более высокую температуру плавления, чем фрагменты ДНК, на 8, 5 или 4°С соответственно. Таким образом, эти вещества стабилизируют двойную спираль ДНК, причем стабилизирующий эффект ослабевает от MOHO- к ДИ- и ТРИХОЛЕНИМу. Очевидно, что электростатические взаимодействия между аминогруппами веществ I — Пи отрицательно заряженными фосфатными группами полинуклеотид-ной цепи являются важными для стабилизации комплексов. Наблюдается хорошая корреляция между величиной ДТщ, и зарядом ХОЛЕНИМ — стабилизирующий эффект тем выше, чем больше заряд.

Анализ спектров кругового дихроизма плазмиды pCMV-SPORT-ß-Gal и ее комплексов с веществами I — III позволяет сделать вывод о том, что они практически идентичны, т.е. и эти вещества не влияют на структуру двойной спирали ДНК, которая остается в В-конформации.

Комплексы геномной ДНК или плазмиды с ХОЛЕНИМами при электронно-микроскопическом исследовании представляют собой сферические частицы диаметром от 100 до 300 нм (рис. 3). Тот факт, что размер частиц

Рис. 3. Электронные микрофотографии комплексов ХОЛЕНИМов с плаз-мидой рСМУ-5Р(ЖТ-0-Са1 (а, б) и геномной ДНК (в): а — комплекс с МОНОХОЛЕНИМом; б — комплекс с ДИХОЛЕНИМом; в — комплекс с ТРИХОЛЕНИМом

ДНК/ХОЛЕНИМ значителен и относительно независим от молекулярной массы ДНК, необычен для простой мицеллярной структуры.

Для частиц КЛИП/ФХ величина +/- соотношения зарядов составляла 1,0, для ГЛИКОКЛИП/DOPE 1,6 и в случае смешанных липосом ГЛИ-КОКЛИП/ТЮРЕ/ХОЛЕНИМ — 3,2. Размер частиц липоплексов, сформированных из указанных липосом и плазмидной ДНК, составлял 100—200 нм, что приемлемо для экспериментов in vitro. рН-чувствительные липосомы, использованные в работе, имели состав: фосфатидилхолин (70 мол. %), холестерин (10 мол.%) и глицирризин (GL) или ос-токофероло-вый эфир янтарной кислоты (TS) по 20 мол. %. Заряженные отрицательно, они представляли собой небольшие монобислойные везикулы (100+20 нм).

При приготовлении ДНК-липосомных комплексов с ДЕГА выяснилось, что оптимальное время инкубации достигало 2 ч. С помощью атомного силового микроскопа было установлено, что липоплексы с ДЕГА-3 имели тороидальную форму, а с ДЕГА-7 — стержнеобразную. Расчеты показывают, что мицеллярная фаза является преобладающей в первом случае, а гексагональная — во втором. Реконструкция липоплексов, состоящих из липида ДЕГА-3 и плазмиды -pEGFP-Nl, представлена на рис. 4, а липоплексов из ДЕГА-7 и pCMV-SPORT-p-Gal - на рис. 5.

При использовании кумарин-меченых липосом ДЕГА-3 использовались клетки линии MCF-7. Время инкубации клеток с липосомами составляло 5 или 15 мин. Если в первом случае флуоресценция наблюдалась только по периметру клетки (рис. 6а), то во втором — также и в компартментах цитоплазмы (рис. 6Ь). Это говорило о том, что, по всей вероятности, комплексы из липосом ДЕГА-3 и ДНК будут обладать способностью проникать через мембраны клеток и продвигаться по направлению к клеточному ядру, что является необходимым условием успешной трансфекции. Это было подтверждено дальнейшими нашими исследованиями.

Таким образом, исследование физико-химических свойств должно быть включено в систему тестов потенциальных векторов, так как оно дает ин-

Рис. 4. Атомно-силовые микрофотографии липоплексов на основе плазми-ды рЕОРР-Ш и ДЕГА-3 после адгезии на поверхности слюды: соотношение липид/ДНК г =1,5 (а), 3 (б) и 7,5 (в)

о

Рис. 5. Атомно-силовые микрофотографии липоплексов и липосом из ДЕГА-7 на поверхности слюды:

а — г = 6, время инкубации 1 ч; б — г = 6, агрегация частиц липоплекса из ДЕГА-7, время инкубации 2 ч

Рис. 6. Взаимодействие липосом ДЕГА-3, меченых кумарином, с клеткой MCF-7

формацию о размере, форме и стабильности липоплексов, соотношении зарядов +/- и величин гидрофобности/гидрофильности, что во многом и определяет эффективность трансфекции с их помощью.

Влияние препаратов на рост линий эукариотических клеток и на синтез в них ДНК

После изучения физико-химических свойств медиаторов переноса генов и перед использованием их для переноса функциональных генов в клетки эукариот in vitro и in vivo необходимо, по нашему мнению, исследовать влияние веществ-переносчиков на рост эукариотических клеток в культуре и на синтез в них ДНК.

На рис. 7 представлены результаты изучения влияния ХОЛЕНИМов на рост клеток НГУК-1 и синтез в них ДНК, поскольку культивируемые глиаль-ные клетки являются очень чувствительными к любому воздействию. В концентрациях, близких к использованным при трансфекции, эти вещества не вызывали достоверного угнетения роста клеточной культуры как через 24 ч, так и через 72 ч. Вместо ингибирования роста культуры клеток через 72 ч наблюдался прирост, составляющий 12% (для 3,5 мкг/мл). Влияние на синтез ДНК оценивалось как степень встраивания [14С]-тимидина.в геномную ДНК. Вещества ХОЛЕНИМ I-III в концентрациях 3,5, 2,7 или 1,9 мкг/мл со-

120' 100 — " 80 — . 60 — 40'— ' 20 — 0-1—-

Монохоленим, Монохоленим, Дихоленим, 2,7 мкг/мл Дихоленим, 27 мкг/мл Трихопеним, Трихоленим, 19 мкг/мл

3,5 мкг/мл 35 мкг/мл 1,9 мкг/мл

Рис. 7. Влияние ХОЛЕНИМов на синтез ДНК и рост культуры клеток НГУК-1, % к контролю

ответственно практически не изменяют синтеза ДНК в клетках через 24 ч, а в 10-кратных концентрациях вызывают ингибирование синтеза ДНК в клетках на 21, 25 или 30% соответственно. Как оказалось, препараты ГЛИКОКЛИП, ГЛИКОКЛИП/БОРЕ, КЛИП/ФХ и лактозилированный диглицерид почти не оказывали влияния на рост клеток НГУК-1 в обеих использованных концентрациях (рис. 8). Наблюдалось существенное снижение синтеза ДНК при обеих концентрациях (6 и 60 мкг/мл) для этих препаратов, кроме КЛИП/ФХ. Только 10-кратная доза липосом КЛИП/ФХ (60 мкг/мл) оказывала влияние на синтез ДНК: он составлял 55,5±11,7% (р<0,05) по сравнению с контролем.

Оптимальные липидные векторы не должны быть цитотоксичными и значительно влиять на синтез ДНК клетками. В результате изучения указанных липидных препаратов оказалось, что они нетоксичны для клеток в широком диапазоне концентраций (1,9—60 мкг/мл). Использованные в работе липи-ды-помощники фосфатидилхолин и холестерин являются природными соединениями эукариот и в литературе нет сведений о какой-либо цитотоксич-ности этих липидов. Поэтому полученные данные позволили отобрать для создания невирусных систем генного переноса и дальнейших экспериментов по трансфекции липиды, нетоксичные для ряда эукариотических клеток.

Исследование эффективности трансфекции эукариотических клеток с помощью новых липидных векторов

Популяции клеток, синтезировавшие зеленый флуоресцентный белок, были получены в результате трансфекции линий МСР-7 и БКОУ-З комплексами ДЕГА-З/рЕвРР-Ш. Интенсивность флюоресценции рассчитывали с учетом анализа гистограмм. На гистограммах по оси X отображали интенсивность флуоресценции, по оси У — число событий (число клеток). Процент трансфицированных клеток определяли по соотношению площадей двух пиков в канале ИЫ (515—545 нм), один из которых отражал присутствие в популяции трансфицированных клеток, синтезирующих флуоресцирующий ОРР, а другой — нетрансфицированных, обладающих только аутофлуоресценцией. Эффективность трансфекции липоплексами на осно-

120

100

2 с; о о. н-X

о

80

60

40

20

0

1

1

■ К'

-;ПКЛИП/ФХ

¡□ГЛИКОКЛИПЮОРЕ

ЭГЛИКОКЛИП

! □ Лактозилированный , диглицерид

1

Рост клеток, 6 м кг/мл

Рост клеток, 60 м кг/мл

Синтез ДНК, 6 м кг/мл

Синтез ДНК/ 60 мкг/мл

Рис. 8. Влияние ГЛИКОКЛИПа, лактозилированного диглицерида, липо-сом КЛИП/ФХ и ГЛИКОКЛИПДЮРЕ на синтез ДНК и рост культуры клеток НГУК-1, % к контролю

Рис. 9. Флуоресцентные микрофотографии культуры клеток 293 после переноса плазмиды pEGFP-Nl с помощью липосом на основе дикатионноголи-пида ДЕГА-3: а — снятые в светлом поле, б — снятые в темном поле. Флуоресцентный микроскоп AXIOSKOP 20 Carl Zeiss с системой цифрового анализа изображения хЗОО

ве ДЕГА-3 была равна 19% (погрешность 2%) для обеих линий клеток, на основе Липофектина (контроль) — 27% (погрешность 2%).

Клетки линии 293 трансфицировали комплексами, состоящими из ДЕ-ГА-3/pEGFP-Nl и ДЕГАЗ/pCMV-SPORT-ß-Gal. На рис. 9 представлены микрофотографии клеток, успешно трансфицированных этими комплексами, полученные методами флуоресцентной (а, ЗООх) и световой микроскопией (б, ЗООх) соответственно. По сравнению с комплексом Липофектинк/ pEGFP-Nl комплекс ДЕГА-3/pEGFP-Nl оказался не менее эффективным.

На рис. 10а представлены данные по эффективности трансфекции клеток НГУК-1 плазмидой pCMV-SPORT-ß-Gal с помощью геносом на основе препаратов МОНОХОЛЕНИМ и ДИХОЛЕНИМ при различных соотношениях ДНК/олигокатион. Максимальный уровень экспрессии гена в этих клетках был достигнут для комплекса ДНК/МОНОХОЛЕНИМ в соотношениях 2:1 или 1:1 — 32—35 пг белка на 105 клеток. Для геносом ДНК/ДИХОЛЕНИМ в соотношениях 2:1 и 1:1 уровень экспрессии был 17 и 25 пг на 105 клеток соответственно. Уровень экспрессии гена ß-галактозидазы в клетках PC-12 был существенно выше, чем в случае с клетками НГУК-1 (рис. 106). Наибольшая

эффективность экспрессии — 187 и 113 пг/105 клеток — была достигнута для МОНОХОЛЕНИМа и ДИХОЛЕНИМа соответственно при соотношении ДНК/олигокатион 1:0,5. Для препарата ТРИХОЛЕНИМ наибольшая эффективность генного переноса достигается при соотношении ДНК/олигокатион 1:0,3 — 56,6 пг/105 клеток, наименьшая — для вещества III при соотношении 1:1,5 (7,5 пг/105 клеток). Эти результаты означают, что чем больше холестериновых остатков содержит агент трансфекции, тем меньшее его количество необходимо для достижения оптимума трансфекции. Наиболее эффективными оказались липоплексы на основе MOHO- и ДИХОЛЕНИМа. Эти данные коррелируют с физико-химическими свойствами соединений I-III.

рН-чувствительные липосомы оказались способными переносить ген p-Gal (в составе плазмиды pQE-Lac Z) в клетки L929 в присутствие ионов Са (20—50 мМ). Экспрессия трансгена наблюдалась визуально у 0,5% клеток для обоих типов липосом (появлялось голубое окрашивание при добавлении реагента X-Gal при рН 7,5). Однако эффективность экспрессии была вдвое ниже, чем при использовании Са-фосфатной трансфекции.

На рис. 11а приведены результаты тестирования экспрессии гена бактериальной (3-галактозидазы (штазмида pCMV-SPORT-p-Gal) в клетках НГУК-1

35 30 25 20 15 10 5 0

Рис. 10. Эффективность трансфекции клеток НГУК-1 (а) и РС-12 (б) с помощью ХОЛЕНИМов плазмидной генетической конструкцией рСМУ-8РО11Т-0-Са1 (пг/105 клеток)

после переноса с помощью липосом, содержащих вещества ХОЛЕНИМ. Наибольший уровень экспрессии обеспечил генный перенос с помощью липосом, содержащих катионные липиды DOTMA и DOPE и препараты ХОЛЕНИМ или гликокатионный липид при соотношении ДНК/липид 1:5. Для липосом, содержащих вещества МОНОХОЛЕНИМ на основе DOTMA или DOPE, эффективность трансфекции была существенно выше и достигала 50 нг на 105 клеток.

Эффективность генного переноса липосомами на основе КЛИПа и ГЛИКОКЛИПа изучалась при использовании плазмиды pCMV-Luc и клеток СНО (рис. 116) в сравнении с соответствующими данными по коммерческому препарату DOSPER. Введение глюкозного остатка в структуру ка-тионного липида значительно усиливает трансфекцию: величина RLU липосом ГЛИКОКЛИП/DOPE равна 7х106. Величина RLU для липосом на основе ГЛИКОКЛИПа и препарата ХОЛЕНИМ только ненамного меньше, чем в случае переноса с помощью DOSPER, что говорит о перспективности испытываемых нами веществ для переноса генов.

Рис. 11. Эффективность трансфекции клеток невриномы Гассерова узла крысы (НГУК-1) плазмидной генетической конструкцией pCMV-SPORT-0-Gl (нг р-галактозидазы/105 клеток) (а) й клеток СНО плазмидой рСМУ-Ьис (б)

при использовании различных комбинаций ДНК с липосомами

Таким образом, изучение эффективности липоплексов является необходимым и ключевым этапом оценки их перспективности. Чтобы оказаться эффективными in vivo, исследуемые векторы должны обеспечивать трансфекцию культур клеток по меньшей мере на уровне коммерческих препаратов и содержать адрес (напр., углеводный) для рецептор-опосредованного слияния с клеткой.

Влияние новых липидных медиаторов на иммунную систему и характер биораспределения [14С]-меченой ДНК

Новые липидные векторы MOHO-, ДИ- и ТРИХОЛЕНИМ вводились мышам внутрибрюшинно для оценки их токсичности в дозах 50, 100 и 150 мг. В первых двух случаях не наблюдалось каких-либо видимых повреждений внутренних органов и ухудшения состояния животных. Доза 150 мг вызывала появление кровоизлияний на печени, увеличение почек и селезенки.

Для оценки свойств новых липидных медиаторов трансфекции исследовалось их влияние на один из ключевых этапов иммунного ответа — активацию системы комплемента, а именно его компоненты СЗЬ и С4Ь. Для этого фосфа-тидилхолиновые (ФХ) или кардиолипиновые (KJI) липосомы, плазмидная ДНК и липоплексы, приготовленных из них, инкубировали с комплементом морской свинки. Человеческий IgG (agg.) был выбран как стандарт для оценки антикомплементарной активности. Его способность связываться с С1 компонентом комплемента и активировать классический путь хорошо известна. Сверх того, иммуноглобулин IgG может активно присоединять появляющиеся СЗЬ и С4Ь компоненты.

Табл. 1 показывает оценку антикомплементарной активности ФХ и КЛ липосом, плазмидной ДНК и липоплексов с начальной концентрацией 1 мг/мл. Колонка 4 представляет антикомплементарную активность в виде концентрации IgG (agg.), демонстрирующего равную активность. КЛ-липосомы давали антикомплементарную активность, равную активности 0,075 мг/мл агрегированного IgG (10,7 мкг/мл в системе, 3-й ряд), ФХ-липо-сомы не проявили антикомплементарной активности и не влияли на комплемент (4-й ряд), а активность плазмидной ДНК соответствовала активности, продемонстрированной 0,0375 мг/мл (5,36 мкг/мл в плашке) IgG (agg.).

Таблица 1

Антикомплементарная активность (А) агрегированного нагревом

№ (agg.), мг/мл Количество ячеек с 50% лизисом А

1 0 (контроль комплемента) 6

2 0 (контроль системы) 10 0

3 1,2 0 10

4 0,6 3 7

5 0,3 5 5

6 0,15 7 3

7 0,075 8 2

8 0,0375 9 1

Примечание. * Данные основаны не менее чем на 10 сериях экспериментов

Таблица 2

Антикомплементарная активность липосом, ДНК и геносом

№ Препарат** Количество ячеек с полулизисом А Активность препарата в эквиваленте да (ашЕ.)**, мг/мл

1 0 (контроль комплемента) 6 — —

2 0 (контроль системы) 10 0 0

3 Липосомы КЛ/ДИХОЛЕНИМ (1 мг/мл) 8 2 0,075

4 Липосомы ФХ/ ДИХОЛЕНИМ (1 мг/мл) 10 0 0

5 Плазмида (рСМУ-БРСЖТ-Ьасг, 1 мг/мл) 9 1 0,0375

6 3 объема #3+1 объем раствора плазмиды 8 2 0,075

7 3 плазмида #4+1 объем раствора плазмиды 9 1 0,0375

Примечание. ** Во всех случаях указаны начальные концентрации препарата липосом. Реальные концентрации препаратов в 7 раз меньше. Это необходимо для сравнения двух реальных концентраций, выраженных в микрограммах эффектора, которые являются эквивалентом ^О (а^): начальная концентрация 0,075 мг/мл соответствует 10,7 мкг/мл реальной концентрации, и 0,0375 мг/мл соответствует 5,36 мкг/мл

Эти данные соответствуют данным Chonn et al. о классическом пути активации комплемента отрицательно заряженными липосомами и об отсутствии активации комплемента нейтральными фосфолипидными липосомами, основанными на ФХ или DPPC. Поскольку начальная концентрация препаратов липосом соответствовала концентрации IgG (agg.) или других иммуно-генных комплексов, способных активировать комплемент, но в окружении которых не проявляются никакие патологические разрушения, то испытанные вещества не могут быть причиной каких-либо патологических нарушений. Из наших результатов следует, что в случае KJI-липоплексов наибольший вклад в их антикомплементарную активность вносит кардиолипин, в то время как в случае с ФХ-липоплексами — плазмидная ДНК. Третий компонент изученных липоплексов, ДИХОЛЕНИМ, не оказывает никакого влияния на систему комплемента в тех же концентрациях (данные не приведены).

Полученные результаты подтверждают точку зрения, что липоплексы, сформированные из нейтральных липосом/мицелл, могут использоваться в будущем для создания инъекционных форм невирусных систем переноса генов.

Характеристики иммунного ответа на введение липоплексов, наряду со структурой и физико-химическими свойствами, могут обусловливать и профиль биораспределения ДНК при проведении трансфекции in vivo, т.е. в экспериментальной и клинической генотерапии. Для исследования этого вопроса мы в работе впервые использовали липоплексы на основе ДНК эука-риотического происхождения ([14С]-тимидин меченую ДНК).

На рис. 12 представлены результаты изучения биораспределения [14С]-ДНК после внутрибрюшинного введения ее геносом с препаратами ДИ- и ТРИХОЛЕНИМ (соотношение 1:1, w/w) и с рН-чувствительными липосомами, состоящими из глицирризина и ФХ или а-токоферолового эфира янтарной кислоты и ФХ. Геносомы во всех случаях распределяются в основном между селезенкой и кишечником. Биораспределение геносом [14С]-ДНК с препаратом МОНОХОЛЕНИМ аналогично. Эти факты не

противоречат литературным данным по использованию катионных липо-сом и других ДНК-переносящих агентов при этом способе введения.

При введении комплекса [14С]-ДНК (50 мкг) с ДИХОЛЕНИМом в соотношении 1:1 в почечную артерию наблюдается не более чем двухкратное увеличение включения метки в оперированную почку по сравнению с интактной (рис. 13). При этом максимальное включение метки наблюдается в сердце, на втором месте — легкие, как и при разных вариантах внутривенного введения. Это вполне объяснимо тем, что капиллярная сеть почек негустая, а кровоток в них очень быстрый, так что кровь быстро попадает в венозную систему и серд-

Массовая доля метки от метки во всех исследованных органах

□ Г ;

■тя

¿Гь л к

Почки

Селезенка Кишечник Печень

Сердце Легкие

Рис. 12. Биораспределение 14С-ДНК в комплексе с ХОЛЕНИМами и рН-чувст-вительными липосомами (Г — глицирризин/ФХ, ТЯ — токофероловый эфир янтарной кислоты/ФХ) в организме мышей при внутрибрюшинном введении

70000 ? 60000 г боооо

§■40000 I 30000

е 20000 5 10000

ДШДИХОЛЕНИМ 1:1 \nZ\N

п п п

<гГ „о?

/

-Г

о?

&

о*

0

1400 51200 "1000

ДНК/ДИХОПЕНИМ 2:1 (\л«И

Рис. 13. Биораспределение [14С]-ДНК в зависимости от соотношения ДИ-ХОЛЕНИМ/ДНК при введении комплекса в левую почечную артерию

це. При изменении весового соотношения между [14С]-ДНК (15 мкг) и ДИ-ХОЛЕНИМом на 2:1 картина распределения резко меняется. Метка практически не обнаруживается в интактной почке, а также в селезенке и кишечнике. На первом месте по количеству аккумулированной [14С]-ДНК находится сердце, на втором — печень, на третьем — оперированная почка, и только на 4-м — легкие, что уже значительно отличается от распределения обычных катионных препаратов. Это подтверждает тропность ДИХОЛЕНИМа к печени при определенных способах введения ее комплексов с ДНК.

Результаты изучения распределения геносом [14С]-ДНК с ДИХОЛЕ-НИМом при их введении в воротную вену печени мыши представлены на рис. 14. Максимальное содержание [,4С]-ДНК при введении комплексов ДНК/ДИХОЛЕНИМ (1:1) оказалось в четырех органах примерно в равных количествах (в пределах интервала достоверности): печени, селезенке, сердце и легких — почти по 20%, в 4 раза меньшие количества — в почках и кишечнике. При изменении соотношения ДНК/ДИХОЛЕНИМ до 2:1 максимум [14С]-ДНК обнаруживается в печени, сильно уменьшается ее содержание в легких. Данные по биораспределению геносом [14С]-ДНК/МОНОХОЛЕ-НИМ и геносом [14С]-ДНК/ТТИХОЛЕНИМ (соотношение ДНК/олигока-тион 1:1 при их введении в воротную вену мышей представлены на рис. 15. Для МОНОХОЛЕНИМа максимальное содержание [14С]-ДНК было в селезенке и сердце (25 и 20%, соответственно), затем — в печени и почках (15%).

30 000 S 25 000 2 20 000 о 15 000 -g 10 000 g- 5 000 0

ДНК/ДИХОЛЕНИМ 1:1 w/w

- - ---------------

п п

с/

3500 3 3000 га 2500

ДНК/ДИХОЛЕНИМ 2:1 (w/w)

Рис. 14. Биораспределение [14С]-ДНК в зависимости от соотношения ДИ-ХОЛЕНИМ/ДНК при введении комплекса в воротную вену печени

В случае ТРИХОЛЕНИМа максимальное содержание [14С]-ДНК обнаружено в печени (25%), почках (20%), и крови (15%).

Таким образом, при весовом соотношении ДНК/ХОЛЕНИМ 1:1 наиболее заметно различие в тропности между моно- и трихолестериновыми производными, а для ДИХОЛЕНИМа характерен промежуточный вид распределения комплексов. Высокое содержание [14С]-ДНК в крови для комплекса с трихолестериновым производным может косвенно указывать на их сильное взаимодействие с клеточными элементами крови, а повышенное включение метки в печень — что в этом органе осуществляется утилизация материала разрушенных эритроцитов. Изменение весового соотношения ДНК/олигокатионит в комплексе с 1:1 до 2:1 влияет на тропность к различным органам в тех же пределах, что и использование различных холестериновых производных олигоэтиленимина при одном и том же весовом соотношении. Это объясняется тем, что МОНОХОЛЕНИМ при одном и том же весовом сотношении с ДНК содержит в 2 раза больше катионных групп, чем ТРИХОЛЕНИМ. Такая ситуация соответствует той, когда использует-сяДИХОЛЕНИМ, то есть количество катионных групп также изменяется в

Рис. 15. Биораспределение [14С]-ДНК в зависимости от строения ХОЛЕ-НИМа при соотношении ХОЛЕНИМ/ДНК 1:1, доля метки (% сргп) от общего счета во всех органах при введении комплекса в воротную вену печени

2 раза по отношению к ДНК. Однако количественное соотношение между гидрофобной и гидрофильной составляющими меняется противоположным образом, что может определять изменения в картине распределения.

Амфифильные липосомы, состоящие из фосфатидилхолина и ДИХОЛЕ-НИМа (1:1 по массе), были использованы для переноса [14С]-тимидин меченой ДНК и плазмиды рСМУ-5Р011Т-Э-Са1 при внутривенной инъекции, при соотношении липид/ДНК 1,6:1 (по массе). В опытах по переносу меченой ДНК липосомами фосфатидилхолин/ДИХОЛЕНИМ включение метки происходит преимущественно в легкие (рис. 16). Это соответствует распределению ДНК при использовании в генном переносе катионных липосом, которое описано в литературе.

Эксперимент по переносу [14С]-аденозин меченой ДНК липосомами, содержащими лактозилированный диглицерид и фосфатидилхолин, показал, что максимум метки после пересчета на 1 г органа наблюдался не в печени, как ожидалось на основании химического строения гликолипида (рецептор-опосредованный механизм интернализации), а в почках. В печень включалось второе по величине количество [14С]-ДНК, однако содержание метки в этом органе было значительно выше, чем в легких (рис. 17), в которых обычно при внутривенных инъекциях комплексов катионных липосом с

0,3 ,

Рис. 16. Биораспределение [14С]-ДНК в комплексе с липосомами ФХ/ДИ-ХОЛЕНИМ при введении в воротную вену печени (массовая доля метки от метки во всех исследованных органах)

ДНК наблюдается «эффект первого прохода». Поскольку при использовании липосом, содержащих лактозилированный диглицерид и фосфатидилхолин, такого эффекта не было, то можно сказать, что наблюдалась тропность комплекса этих липосом с [14С]-ДНК к печени и почкам. Возможно также, что максимум метки в почках объясняется тем, что через 24 ч после операции она уже могла начать выводиться, т.к. почки — выделительный орган.

Результаты изучения биораспределения [14С]-ДНК косвенно свидетельствуют о роли иммунной системы в этом процессе. Поскольку поведение ХОЛЕ-НИМов, липосом фосфатидилхолин/ДИХОЛЕНИМ и фосфатидилхолин/лак-тозолипид/ДИХОЛЕНИМ адекватно поведению иммунных комплексов, то это предполагает опсонизацию этих объектов фрагментами компонентов СЗ и С4 и их клиренс с участием таких органов, как селезенка, печень, почки и легкие. Таким образом, слабая активация системы комплемента может рассматриваться как полезное свойство липоплексов, обусловливающее векторность доставки объекта в нужные органы и ткани, и должно использоваться при создании новых векторов. Поэтому изучение иммунных свойств липоплексов должно быть включено в систему тестов по отбору эффективных медиаторов переноса генов.

Рис. 17. Распределение липоплекса [14С]-аденозин меченой ДНК и липосом фосфатидилхолин/лактозолипид в органах мышей после введения в воротную вену печени, срт/г органа (п=4)

Невирусный перенос функционального гена in vivo

Амфифильные липосомы, состоящие из фосфатидилхолина и ДИХОЛЕ-НИМа (1:1 по массе), были использованы для переноса плазмиды pCMV-SPORT-ß-Gal при внутривенной инъекции, при соотношении ли-пид/ДНК 1,6:1 (по массе). Через 2 суток после переноса гена ß-галактозида-зы инкубацией срезов органов с субстратом X-Gal, который под действием этого фермента разлагается с выделением ярко-синего красителя индиго, удалось обнаружить экспрессию гена в легких и селезенке мышей гистохи-мически. Следовательно, эти комплексы оказались способными проникать через эндотелий сосудов внутренних органов (рис. 18).

Мы обнаружили экспрессию гена ß-галактозидазы и при переносе плазмиды pCMV-SPORT-ß-Gal (100 мкг) липосомами фосфатидилхолин/лакто-золипид/ДИХОЛЕНИМ (160 мкг). Гистохимическим методом мы обнаружили экспрессию преимущественно в клетках печени, она была невысокой

Рис. 18. Гистохимический препарат легкого мыши ICR после введения в воротную вену печени геносом из плазмиды pCMV-SPORT-P-Gal и липосом ФХ/ДИХОЛЕНИМ (1:1)

и наблюдалась в основном в эпителии кровеносных сосудов и непосредственно вблизи от них, что может говорить о недостаточной проницаемости комплексов. При более длительной экспозиции с субстратом на срезах печени наблюдается образование индиго в виде небольших, менее 1 мкм ярко-голубых гранул как на опытных, так и на контрольных срезах. Можно предположить, что это связано с локализацией эндогенного фермента в ли-зосомах или других компартментах цитоплазмы клеток печени. Почки обнаружили значительную эндогенную активность ¡3-галактозидазы, и поэтому трудно было найти разницу в окрашивании между опытом и контролем. Кроме того, реакция с Х-ва! была заметна в легких и селезенке (рис. 19).

"""'"'■•'

p jt V

«' Л

V'<•/у* '

t

' vvW, .

It 1.V V« ii

i »Ф^ж^^У*

' -—A V;lj • V-" ■ Г 4 W / Г v

i ^ т . ( * J. «• - * i- • •• ь ^'

».a-«'4*'-,* -'1* '

v. »*

■r.. Л.

• , i.» I W w * л • M J >

Рис. 19. Гистохимический препарат селезенки мыши ICR после введения в воротную вену печени геносом из pCMV-SPORT-0-Gal и липосом ФХ/лак-тозолипид/ДИХОЛЕНИМ (1:1,6)

0,35 5 0,3 §0.25

е- о,2

^0,15 0,1 0,05 0

ж &

о?

.4*

е>

#

<>ч

>>

0

Рис. 20. Активность бактериальной Р-галактозидазы (фотометрическое определение) в органах мышей после внутривенного введения липоплекса на основе плазмиды рСМУ-8РСЖТ-0-Са1 и липосом фосфатидилхо-лин/лактозолипид/ДИХОЛЕНИМ

Для более точной оценки экспрессии гена р-галактозидазы в органах мышей после введения комплекса плазмиды с липосомами фосфатидилхо-лин/лактозолипид/ДИХОЛЕНИМ нами был разработан метод измерения активности этого фермента спектрофотометрически. Максимум ферментативной активности наблюдался в селезенке (рис. 20), и был почти равным в легких и печени. Таким образом, проведенные эксперименты показали, что лактозилированный диглицерид, использованный нами для переноса радиоактивной и плазмидной ДНК в составе липосом, изменял их тропность по сравнению с обычными катионными липосомами. Эффект «первого прохода», типичный для веществ этого класса, отсутствовал при введении метки в комплексе с липосомами фосфатидилхолин/лактозилированный диглицерид, и был значительно снижен при введении комплекса плазмиды с липосомами фосфатидилхолин/лактозолипид/ДИХОЛЕНИМ. Очевидно, вещества данного класса (с углеводными гуппировками) должны и дальше исследоваться на предмет поиска подходящего переносчика генов для целей генной терапии.

Динамика синтеза и распада липидов в клетке

Знание динамики синтеза и распада липидов в клетке может помочь в понимании того, как происходит включение липидов геносом в состав клеток и предположить, какие липиды и в каких количествах следует включать в липосомы. С этой целью нами был проведен эксперимент по включению меченого [2- 14С]-ацетата в клетки тимуса крысы и скорости выведения метки из клеток. Анализируя полученные данные о включении метки в липиды in vitro, можно сказать, что при инкубации тимоцитов в течение 50 и 70 мин. происходит значительное снижение включения [2-14С]-ацетата в моногли-цериды по сравнению с включением метки в жирные кислоты (табл. 3). Среди индивидуальных фосфолипидов в течение данного времени инкубации достоверное уменьшение включения метки отмечается у фосфатидил-серина и фосфатидилинозитола, по которому можно судить о времени полувыведения этих фосфолипидов из клеток тимуса. Увеличению включения метки во фракцию общих фосфолипидов и фосфатидилхолин соответствовало крайне незначительное уменьшение включения метки в свободные жирные кислоты.

Таблица 3

Включение 214С-ацетата в фосфолипиды тимоцитов крыс в условиях in vitro

. Фосфолипиды Общая радиоактивность

30 мин 50 мин 70 мин

Фосфатидилхолин 100% 148,7 ± 19,1 102,3 ± 37,7

Сфингомиелин 100% 56% 23%

Фосфатидилсерин 100% 62,3 ± 6,4 56,7 ± 2,8

Фосфатидилинозитол 100% 90,7 ± 18,2 77,3 ± 4,7

Фосфатидилэтаноламин 100% 101,7 ± 7,9 99,3 ± 9,0

Кардиолипин 100% 30,5 ± 1,8 14,0 ± 5,3

Оказалось, что различные липиды ведут себя по-разному (рис. 21). Так, после включения ацетата в холестерин метка остается на одном уровне в течение всего времени культивирования тимоцитов даже после отмывки кле-

Рис. 21. Кинетика выведения меченых нейтральных липидов (а) и фосфоли-пидов (б) из тимоцитов крыс: . а) включение в тимоциты — 1, холестерин — 2, моноглицериды — 3, жирные кислоты — 4; б) включение в общие фосфолипиды — 5, фосфатидилхолин — 6, фосфатидилсерин — 7, фосфатидилинозитол — 8, фосфатидилэтаноламин — 9

ток от метки. В то же время меченый фосфатидилхолин продолжает накапливаться в тимоцитах уже после отмывки метки еще в течение 20 мин, после чего его содержание резко падает. Следовательно, холестерин будет придавать геносомам устойчивость, так как он обменивается медленно, а фосфатидилхолин — хорошую биодеградабельность.

выводы

1. Разработан комплекс тестов для характеризации новых невирусных систем для локальной и системной генотерапии, включающий: а) оценку влияния липидов и липоплексов на рост эукариотических клеток в культуре и на синтез в них ДНК; б) оценку эффективности переноса с их помощью репортерных генов в культуры клеток; в) оценку биораспределения липоплексов, сформированных из липида и [14С]-ДНК эукариот, в тканях экспериментальных животных (мыши) при трех способах введения (внутрибрю-шинно, в воротную вену печени и почечную артерию); г) оценку способности и эффективности липоплексов, сформированных изданной невирусной системы и функционального гена, переносить функциональные гены в ткани экспериментальных животных (мыши) при введении в воротную вену печени; а также д) оценку влияния невирусной системы на компоненты системы комплемента.

2. Препараты ХОЛЕНИМ, липосомы ГЛИКОКЛИП/DOPE, КЛИП/ФХ и ГЛИКОКЛИП/БОРЕ/ХОЛЕНИМ, ДЕГА-3 образуют с плазмидной ДНК компактные и стабильные комплексы, оптимальные для трансфекции in vitro и in vivo.

3. Новые липидные векторы безопасны, не подавляют рост эукариотических клеток в культуре, а снижение синтеза ДНК наблюдается только при использовании высоких концентраций лактозилированного диглицерида и липосом ГЛИКОКЛИП/DOPE, КЛИП/ФХ.

4. Комплексы из липосом, содержащих липиды ХОЛЕНИМ, ГЛИ-КОКЛИП, ДЕГА-3 и плазмидную ДНК, позволяют добиться эффективности экспрессии репортерных генов на уровне коммерческих препаратов. Чем больше холестериновых остатков содержит ХОЛЕНИМ, тем меньшее его количество необходимо для достижения оптимума трансфекции.

5. Липосомы на основе ДИХОЛЕНИМа и фосфатидилхолина в концентрации, эквивалентной 0,0375 мг/мл агрегированного иммуноглобулина IgG,

не влияют на уровень компонентов СЗЬ и С4Ь системы комплемента, а липо-сомы на основе ДИХОЛЕНИМа и кардиолипина — слабо их активируют.

6. Влияние весового соотношения медиатор/ДНК и химического строения медиатора на распределение [14С]-ДНК при внутривенных и внутриар-териальных введениях существует, а при внутрибрюшинных — отсутствует. Комплексы [14С]-ДНК с липосомами ФХ/ДИХОЛЕНИМ распределялись в основном между легкими и селезенкой; введение в их состав лактозолипида приводило к максимуму накопления метки в почках и печени.

7. Разработан метод тестирования экспрессии гена р-галактозидазы; после введения мышам в составе липосом ФХ/ДИХОЛЕНИМ и ФХ/лактозо-липид/ДИХОЛЕНИМ обнаружен значительный уровень экспрессии этого гена в тканях селезенки, печени и легких.

8. Изучение кинетики обмена фосфатидилхолина и холестерина в клетке подтверждает правильность их выбора в качестве липидов-помощников: холестерин обменивается медленно и необходим для увеличения устойчивости геносом, фосфатидилхолин — быстро и нужен для хорошей биодеграда-бельности комплексов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Sviridov Yu.V., Bohdanenko O.V., Pogorelov A.G., Duzgunes N., Vlas-sov V.V., Zhdanov R.I. Oligoethylenimine hydrophobic polycations as in vivo gene delivery system 11 6-th Symposium on Gene therapy MDC symposium, 1998. — In Book of abstracts, P. 94.

2. Zhdanov R.I.,Venanzi F.M, Amichi A., Petrelli C., Moretti P., Petrelli F., Podobed O.V., Lavrenova T.P., Tsvetkova T.A., Sviridov Yu.V., Konstanti-nov I.O., Bohdanenko O.V. In vitro and in vivo non-cationic lipofection // J. Gene Med. — Abstracts of 6th of the European Meeting, 1998. — N1. — P. 89.

3. Свиридов Ю.В., Богданенко E.B., Дюзгюнеш H. Перенос in vivo плаз-миды в комплексе с холестериновым производным сополимера олигоэти-лен/пропилен/имина и экспрессия модельного гена в тканях экспериментальных мышей Ц III Городская научная конференция молодых ученых. Тезисы докладов. — Пущино. — 1998. — С. 170.

4. Жданов Р.И., Подобед О.В., Абакумова О.Ю., Свиридов Ю.В., Богданенко Е.В., Гайчевский Д.А., Дябина О.С., Борисенко А.С. Невирусные системы доставки генов на основе фосфолипидов // VI Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». Тезисы докладов. — Москва. — 1999. - С. 407.

5. Подобед О.В., ЦветковаТ.А., Свиридов Ю.В., Богданенко Е.В., Мур-зина Т.А., Жданов Р.И., Власов В.В // Липид-нуклеиновые комплексы (ге-носомы) для переноса генов in vitro и in vivo // VI Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». — Тезисы докладов. — Москва. — 1999. - С. 458.

6. Богданенко Е.В., Свиридов Ю.В., Московцев А.А., Жданов Р.И. Невирусный перенос генов in vivo в целях генной терапии // Вопросы Мед. Химии (Биомед. Химия). — 2000. — №3. — С. 226—245.

7. Zhdanov R.I., Sviridov Yu.V., Podobed O.V., Bogdanenko E.V., Kone-vets D.N., Vlassov V.V. — Non-viral systems for lipid-directed gene delivery. Organ tropicity of genosomes formed of genomic [,4C] DNA and MONO-, DI-

and TRICHOLENIMs in mice depending on lipid composition // 11th International Biotechnology Symposium and Exhibition. — Berlin, 2000. Book of abstracts. — IV.7.

8. Zhdanov R.I., Moscovtsev A.A., Ermakov A.S., Podobed O.V., Bogdanen-ko E.V., Bronova D.D., Sviridov Yu.V., Konevets D.A., Vlassov V.V. Organ tropi-city of genosomes formed of genomic 14C-DNA and MONO-, DI-, and TRICHOLENIMs in mice depending on lipid composition // Mol. Therapy. — 2000. - V.l. - №5. - S341-S342.

9. Sviridov Yu.V., Zhdanov R.I., Podobed O.V., Tsvetkova T.A., Konstanti-nov I.O., Bogdanenko E.V. Lac-Z gene transfer into L929 eels and [14C] DNA distribution following intraperitoneal administration of new pH-sensitive lipoplex in mice // Cytobios. — 2001. — V. 106. — Suppl 1. — P. 7—14.

10. Kozlov L.V., Zhdanov R.I., Guzova V.A., Podobed O.V., Sviridov Yu.V., Bohdanenko O.V. and Ermakov A.S. Action of non-viral gene delivery vectors on human complement system: low anticomplementary activity of lipoplexes based on LacZ plasmid and phospholipid/oligocation liposomes // Cytobios. — 2001. — V. 106 (Supplement). — P. 67—74.

11. Богданенко E.B., Свиридов Ю.В., Себякин Ю.Л., Жданов Р.И. Использование лактозилированного диглицерида для адресной доставки ДНК // Труды конференции «От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям». — Пущино. — 11—14 ноября 2002. — С. 56.

12. Маркевич Л.Н., Богданенко Е.В., Кулагина Т.П., Коломийцева И.К. Метаболизм липидов тимоцитов крыс в условиях in vitro // Труды конференции «От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям». — Пущино. — 11—14 ноября 2002. — С. 99.

13. Zhdanov R.I., Bogdanenko E.V., Moskovtsev А.А., Podobed O.V., Duz-gunes N. Liposome-mediated gene delivery: dependence on lipid structure, glyco-lipid mediated targeting, and immunological properties // Methods in Enzymolo-gy (Academic): Liposomes, Part C: Gene transfer and therapy. — V. 373. — 2003. — P. 433—465.

14. Жданов Р.И., Богданенко Е.В., Петров А.И., Подобед О.В., Коне-вец Д.Н., Власов В.В. Липоплексы на основе холестериновых производных олигоэтиленпропиленимина в генном переносе in vitro и in vivo // Докл. Акад. Наук. — 2005. — т. 401. — №4. — С. 1—6.

15. Богданенко Е.В., Жданов Р.И., Себякин ЮЛ., Зарубина Т.В., Власов В.В. Гликолипид с остатком лактозы — новый агент для адресной доставки ДНК в целях генной терапии // Докл. Акад. Наук. — 2005. — т. 401. - №5. - С. 145-149.

16. Zhdanov R.I., Shmirina A.S., Krylov A.S., Bogdanenko E.V. Hybrid systems based on DNA, polymers and synthetic lipids or membranes: preparation, structure, thermodynamics and gene transfer // European Polymer Congress, Moscow. — 2005.

17. Zhdanov R.I., Bogdanenko E.V., Shmyrina A.S., Serebrennikova G.A., Sebyakin Yu.L., Vlassov V.V. Non-viral systems for targeted gene delivery based on glycolipids and cholesterol derivatives of oligoethylenimine. In: Nanoencap-sulation Technologies: Frontiers of Nanotherapy. — M.R. Mozafari, ed., chapter 5. — 2005.

Сдано в набор 15.03.2006. Подписано в печать 21.03.2006. Формат издания 60x90/16. Бумага офсетная. Усл. печ. л. 6,0. Тираж 100 экз. Заказ №95. Верстка и печать выполнены силами редакционно-издательской группы ГУ НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН; Москва, Балтийская ул., д. 8.

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Богданенко, Елена Валентиновна

Список сокращений.

Общая характеристика работы

1. Обзор литературы. Невирусный перенос генов в экспериментальной генотерапии.

1.1. Введение.

1.2. Перенос ДНК в "голом" виде.

1.3. Типы векторов, их достоинства и недостатки.

1.4. Механизм генного переноса.

1.5. Доставка генетических конструкций в ядро.

1.6. Применение в опытах и в практике различных невирусных систем.

1.6.1. Характеристика катионных липосом и их комплексов с ДНК.

1.6.2. Основные закономерности при использовании геносом in vivo.

1.6.3. Хитозаны и их взаимодействие с мембранами.

1.6.4. Полиамины.

1.6.5. Аминокислоты и белки.

1.6.6. Анионные рН-чувствительные полимеры.

1.6.7. Полиэтиленгликоль и циклодекстрины.

1.6.8. Полиэтиленимины.

1.6.9. Полиуретан.

1.6.10. Полипропиленимины.

1.6.11. Наносферы.

1.6.12. Конъюгаты.

1.6.13. Магнитолипосомы.

1.7. Введение геносом людям.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Невирусный перенос генов с помощью новых липидных векторов"

АКТУАЛЬНОСТЬ.

В связи с бурным развитием молекулярной биологии и биотехнологии появляется все больше возможностей по осуществлению задачи генетической коррекции и модификации генома соматических клеток организма. Одним из наиболее перспективных направлений являются работы в новой области - генетической, или генной терапии -для лечения широкого спектра наследственных заболеваний и патологических состояний. Это направление берет свое начало с 1990-х г.г., с работ Френча Андерсена и его сотрудников по генотерапии недостаточности аденозиндезаминазы (Anderson, 1992). Ключевой стадией метода является перенос определенного терапевтического гена в соответствующие ткани и клетки с помощью ряда векторных систем. Самыми эффективными системами переноса генов в целях генотерапии оказались вирусные, однако они имеют ряд серьезных недостатков, среди которых опасность повторных введений комплексов с терапевтическими генами из-за возможности нежелательных иммунных реакций, вплоть до смертельного исхода, и инсерционного мутагенеза (Marshall, 2000; Wu and Burgess, 2004). Поэтому по всему миру ведется активный поиск невирусных медиаторов переноса генов, при использовании которых вместе с лигандами можно было бы достичь адресности и хорошей эффективности трансфекции (Templeton et al., 1997, Hashida et al, 2001).

В настоящее время известны основные закономерности распределения в организме катионных липидов как медиаторов трансфекции и их выведения из него. Определены оптимальные весовые соотношения между этими липидами и ДНК в комплексах. Обнаружено, что липосомы с высоким содержанием холестерина отличаются повышенной стабильностью, вероятно, благодаря повышению стабильности липидного бислоя, что предохраняет комплексы от распада при адсорбции белками плазмы крови (Bennett et al., 1995; Solodin et al., 1995; Templeton et al., 1997). Однако, ввиду недостаточной эффективности и специфичности известных невирусных переносчиков генов, задача поиска новых липидных систем по-прежнему остается актуальной. Кроме того, почти отсутствуют данные о возможной иммуногенности и токсичности таких систем и характере взаимодействия ДНК и липида в комплексе, влиянии липида на структуру ДНК. Познание закономерностей строения и биораспределения, проверка безопасности таких комплексов, придание им органоспецифичности приведет к созданию веществ, которые позволят осуществить цель генной терапии как части биотехнологии -замену поврежденных генов здоровыми без применения каких-либо дорогостоящих и опасных методов лечения.

ЦЕЛЬ НАСТОЯЩЕГО ИССЛЕДОВАНИЯ разработка системы для исследования и тестирования потенциальных невирусных медиаторов трансфекции для направленного транспорта генов в целях безопасной и эффективной генотерапии. В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1) изучить физико-химические свойства новых медиаторов трансфекции генов и их комплексов с ДНК;

2) оценить безопасность невирусных векторов, исследовав их цитотоксичность и генотоксичность;

3) выявить эффективность препаратов - медиаторов переноса репортерных генов в культуре эукариотических клеток;

4) определить влияние новых векторов на систему комплемента;

5) провести сравнение биораспределения комплексов [i4C]-меченой ДНК с медиаторами трансфекции в зависимости от условий их введения животным;

6) доказать возможность переноса функциональных генов с помощью новых векторов in vivo и эффективной трансфекции органов животных;

7) подтвердить правильность выбора фосфатидилхолина и холестерина в качестве липидов-помощников.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Разработана система тестов для характеризации новых липидных молекул в целях отбора медиаторов для направленного транспорта генов в локальной и системной генотерапии. Впервые оценены физико-химические свойства липоплексов на основе препаратов ХОЛЕНИМ и ДЕГА. Разработаны новые невирусные системы для переноса генов в культуры клеток in vitro и в ткани экспериментальных животных in vivo: рН-чувствительные липосомы, гидрофобные олигокатионы, гликокатионный липид, лактозилированные липосомы. Показано, что новые липиды и липосомы не влияют на рост эукариотических клеток в культуре и эффективны при переносе функциональных генов в культуры трансформированных клеток на уровне коммерческих препаратов. Обнаружено повышение эффективности трансфекции для липосом на основе гликозилированного катионного липида (ГЛИКОКЛИП) в 1000 раз по сравнению с негликозилированным (КЛИП), что свидетельствует о рецептор-опосредованном механизме трансфекции. Показано, что при внутрибрюшинном введении биораспределение [14С]-ДНК не зависит от липидного состава липосом, а при внутривенном может определяться природой липида. Впервые при исследовании биораспределения использовалась ДНК не из прокариот, а из эукариот.

Исследовано влияние новых невирусных липидных систем и геносом на их основе на компоненты системы комплемента СЗЬ и С4Ь. Показано, что липосомы на основе ДИХОЛЕНИМа и фосфатидилхолина в концентрации, эквивалентной 0,0375 мг/мл иммуноглобулина, не влияют на эти компоненты, а липосомы на основе ДИХОЛЕНИМа и кардиолипина - слабо их активируют. Явление активации системы комплемента, опсонизации липоплексов и их клиренс с участием селезенки, печени и почек может быть использовано для достижения направленного переноса генов в эти органы.

Достигнута эффективная трансфекция in vivo гена бактериальной (3-галактозидазы при введении геносом на основе лактозилированного диглицерида и препарата ДИХОЛЕНИМ в воротную вену печени. Гистохимически и спектрофотометрически показана экспрессия этого гена в легких, печени и селезенке.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Предложены новые классы медиаторов переноса генов -ХОЛЕНИМы, гликолипиды, дикатионные липиды ДЕГА. Установлены закономерности переноса и экспрессии функциональных генов в зависимости от типа медиатора, липида-помощника, соотношения липид/ДНК, взаимодействия липоплексов с компонентами сыворотки питательной среды и крови. Обнаружено, что введение холестеринового остатка в структуру олигоэтилениминов улучшает характеристики соответствующих липоплексов: увеличивает соотношение гидрофобности/гидрофильности, стабилизирует липоплекс и обеспечивает оптимальное значение критической концентрации мицеллообразования (ККМ). Выявлены закономерности биораспределения геносом в зависимости от их липидного состава и способа введения. Подтверждена способность веществ с глюкозными и лактозными группировками усиливать трансфекцию и придавать ей направленный характер. Определены причины повышения стабильности липоплексов при использовании холестерина как липида-помощника.

Обоснована возможность адресной доставки генов в селезенку, печень и почки при использовании явления слабой активации системы комплемента липоплексами.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Разработанный комплекс физико-химических, цитологических и иммунологических методов тестирования свойств невирусных систем может быть использован для отбора эффективных векторов для направленного переноса генов в генотерапии. С помощью этого комплекса охарактеризованы в качестве медиаторов трансфекции in vitro и in vivo новые классы рН-чувствительных липосом, поликатионов, гидрофобных олигокатионов ХОЛЕНИМ, гликолипидов и лактозолипида. Обнаружен эффективный перенос репортерных генов ф-Gal, GFP или Luc) в культуры эукариотических клеток посредством новых классов медиаторов трансфекции. Комплексы из липосом, содержавших ХОЛЕНИМы и плазмидную ДНК, позволили добиться уровня экспрессии гена (3-галактозидазы на уровне коммерческих препаратов.

Изучение свойств ХОЛЕНИМов показало, что эти препараты стабилизируют двойную спираль ДНК, образуют с плазмидной ДНК комплексы размером 100-200 нм, не оказывают существенного влияния на рост клеток в культуре и синтез ДНК. Чем больше холестериновых остатков содержало вещество, тем меньшее его количество было необходимо для достижения оптимума трансфекции, что коррелирует с физико-химическими свойствами этих соединений.

Предложен метод прогнозирования биораспределения репортерного гена на основе результатов распределения комплексов новых переносчиков с [14С]-ДНК. С его помощью было установлено, что внутрибрюшинные введения таких комплексов приводят к одинаковому распределению ДНК, не зависящему от строения переносчика, а изменение соотношения ДНК/липид может влиять на биораспределение ДНК in vivo и уровень экспрессии репортерного гена in vitro так же сильно, как и замена одного липида на другой.

Показано, что уменьшение длины мостика в молекуле медиатора ДЕГА приводит к образованию более компактных комплексов с ДНК, что может быть верно и для других классов медиаторов. Липосомы из ДЕГА-3 оказались способными легко проникать через мембрану культивируемых клеток. Применение комплексов из липосом, содержавших ДЕГА-3 и плазмидную ДНК, позволило добиться значительного уровня экспрессии зеленого флуоресцентного белка in vitro.

Предложен метод оценки влияния невирусных векторов на иммунную систему, который позволяет отобрать из них безопасные для введения животным и человеку. Показано, что ДИХОЛЕНИМ не оказывает никакого влияния на систему комплемента, в случае КЛ-липоплексов наибольший вклад в их антикомплементарную активность вносит кардиолипин, в то время как в случае с ФХ-липоплексами -плазмидная ДНК. Слабой активацией комплемента объясняется значительное накопление [14С]-ДНК при использовании липоплексов на основе липосом ФХ/ДИХОЛЕНИМ в почках и печени и максимума экспрессии гена (3-галактозидазы в селезенке, печени и легких при использовании липоплексов на основе липосом

ФХ/ДИХОЛЕНИМ/лактозолипид. Предлагается использовать явление активации системы комплемента для достижения адресности доставки генов в выделительные органы (в первую очередь в печень).

Полученные результаты свидетельствуют о перспективности препаратов на основе лактозилированного диглицерида (лактозолипида) и ГЛИКОКЛИПа, содержащих углеводные группировки. Комплексы из липосом, содержавших ГЛИКОКЛИП и ген люциферазы, позволили добиться уровня экспрессии белка в 1000 раз большего, чем при использовании негликозилированного липида (КЛИП). Максимум накопления комплексов [14С]-ДНК и липосом из лактозолипида наблюдался в почках и в печени, а не в легких, что говорит о возможности направленного транспорта с помощью этого вещества.

Разработан метод количественной оценки экспрессии гена (3-галактозидазы in vivo с помощью спектрофотометрии гомогенатов органов, являющийся более объективным, чем гистохимический.

Разработанная методика введения комплексов липидов с ДНК в воротную вену мышам может быть использована в дальнейших работах по испытаниям вновь создаваемых векторов. Некоторые из новых невирусных систем могут быть использованы для переноса терапевтических генов в протоколах генотерапии моногенных наследственных заболеваний, в частности, муковисцидоза и миодистрофии Дюшенна, а также суицидного гена в протоколе генотерапии рака.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Материалы диссертации были доложены на: I Международном Конгрессе "Congress on Molecular Medicine" (Берлин, Германия, 1997); школе НАТО "ASI Summer School on Gene Therapy" (Спетсай, Греция, 1997); Keystone Symposium on Gene Therapy (Кистоун, th

США, 1997); 6Ш Symposium on Gene Therapy "Towards Gene Therapeutics", MDC Symposium (Berlin-Buch, Germany, 1998), IX и XI Школе-конференции по физико-химической биологии ИБХ РАН/ЮНЕСКО (Москва, 1999 и 2001); на семинарах в Институте биологии гена РАН (Москва, декабрь 1999 г.), Московской медицинской академии им И.М. Сеченова (Москва, 2000 г.), Институте акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН (С.-Петербург, март 2001 г.), на семинарах Института биотехнологии Университета им. Мартина Лютера, Халле, Германия, 2002-2003, European Polymer Congress (Москва, 2005), the 9th National Congress on Medical Biology (Маниса, Турция, 2005).

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Сформированная система физико-химических, цитологических и иммунологических тестов и тестов in vivo позволяет отобрать из серии новых липидов эффективные векторы для направленного переноса генов в целях генотерапии.

2. Физико-химические методы исследования позволили определить, что новые липидные векторы ХОЛЕНИМ, липосомы ГЛИКОКЛИП/DOPE, КЛИПУФХ, ГЛЖОКЛИПЛЮРЕ/ХОЛЕНИМ и ДЕГА-3 образуют с ДНК сферические комплексы небольшого размера (до 100 нм), состоящие из гидрофильного кора, окруженного гидрофобной «шубой», стабильные при хранении и поэтому оптимальные для трансфекции.

3. Хорошая проницаемость через мембраны и нетоксичность позволяют новым липидным системам в комбинации с липидами-помощниками обеспечить эффективность трансфекции генов ß-галактозидазы (ХОЛЕНИМы), люциферазы (ГЛИКОКЛИП) и зеленого флуоресцентного белка (ДЕГА-3) in vitro на уровне коммерческих препаратов, а в ряде случаев и выше. При трансфекции с помощью препаратов ХОЛЕНИМ эффективность зависит от соотношения гиброфобность/гидрофильность: чем больше холестериновых остатков содержало вещество, тем меньшее его количество было необходимо для достижения оптимума трансфекции. Липидные векторы с адресными углеводными группами, в частности, ГЛИКОКЛИП, позволяют добиться более высокого уровня экспрессии белка, чем при использовании негликозилированного липида (КЛИП).

4. Новые липидные векторы при введении их животным в дозах до 150 мг на мышь не вызывают токсических явлений в виде видимых повреждений органов и ухудшения состояния животных. Они способны незначительно активировать систему комплемента, однако именно это явление может быть одной из причин адресной доставки комплексов с радиоактивной ДНК в выделительные органы наряду со способом введения, соотношением липид/ДНК и химической структурой липида.

5. Изучение трансфекционной способности новых векторов in vivo с применением не только гистохимии, но и спектрофотометрии, позволяет увеличить эффективность поиска и отбора самых эффективных переносчиков генов в целях генотерапии. Наиболее эффективными из исследованных нами являются препараты ХОЛЕНИМ и лактозолипид в виде липосом с фосфатидилхолином и холестерином.

ПУБЛИКАЦИИ

Основное содержание работы отражено в 17 научных публикациях (из которых 3 - в центральной, 4 - в иностранной печати и 10 - в материалах международных и отечественных конференций и симпозиумов). Список публикаций приводится в конце автореферата.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ

Работа изложена на русском языке, состоит из введения, 6 глав, заключения, выводов и списка литературы. Библиография включает 223 наименования работ отечественных и зарубежных авторов. Общий объем диссертации составляет 227 страниц машинописного текста. Текст иллюстрирован 6 таблицами и 42 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Богданенко, Елена Валентиновна

ВЫВОДЫ

1. Разработан комплекс тестов для характеризации новых невирусных систем для локальной и системной генотерапии, включающий: а) оценку влияния липидов и липоплексов на рост эукариотических клеток в культуре и на синтез в них ДНК; б) оценку эффективности переноса с их помощью репортерных генов (Lac Z, Luc) в культуры клеток; в) оценку биораспределения липоплексов, сформированных из липида и [14С]-ДНК эукариот, в тканях экспериментальных животных (мыши) при трех способах введения (внутрибрюшинно, в воротную вену печени и почечную артерию); г) оценку способности и эффективности липоплексов, сформированных из данной невирусной системы и функционального гена (ß-Gal или GFP), переносить функциональные гены в ткани экспериментальных животных (мыши) при введении в воротную вену печени; а также д) оценку влияния невирусной системы на компоненты системы комплемента.

2.Препараты ХОЛЕНИМ, липосомы ГЛИКОКЛИП/DOPE, КЛИП/ФХ и ГЛЖОКЛИПЯЮРЕ/ХОЛЕНИМ, ДЕГА-3 образуют с плазмидной ДНК компактные и стабильные комплексы, оптимальные для трансфекции in vitro и in vivo.

3. Новые липидные векторы безопасны, не подавляют рост эукариотических клеток в культуре, а снижение синтеза ДНК наблюдается только при использовании высоких концентраций лактозилированного диглицерида и липосом ГЛИКОКЛИП/DOPE, КЛИП/ФХ.

4. Комплексы из липосом, содержащих липиды ХОЛЕНИМ, ГЛИКОКЛИП, ДЕГА-3 и плазмидную ДНК, позволяют добиться эффективности экспрессии репортерных генов на уровне коммерческих препаратов. Чем больше холестериновых остатков содержит ХОЛЕНИМ, тем меньшее его количество необходимо для достижения оптимума трансфекции.

5. Липосомы на основе ДИХОЛЕНИМа и фосфатидилхолина в концентрации, эквивалентной 0,0375 мг/мл агрегированного иммуноглобулина IgG, не влияют на уровень компонентов СЗЬ и С4Ь системы комплемента, а липосомы на основе ДИХОЛЕНИМа и кардиолипина - слабо их активируют.

6. Влияние весового соотношения медиатор/ДНК и химического строения медиатора на распределение [14С]-ДНК при внутривенных и внутриартериальных введениях существует, а при внутрибрюшинных -отсутствует. Комплексы [14С]-ДНК с липосомами ФХ/ДИХОЛЕНИМ распределялись в основном между легкими и селезенкой; введение в их состав лактозолипида приводило к максимуму накопления метки в почках и печени.

7. Разработан метод тестирования экспрессии гена (3-галактозидазы; после введения мышам в составе липосом ФХ/ДИХОЛЕНИМ и ФХ/лактозолипид/ДИХОЛЕНИМ обнаружен значительный уровень экспрессии этого гена в тканях селезенки, печени и легких.

8. Изучение кинетики обмена фосфатидилхолина и холестерина в клетке подтверждает правильность их выбора в качестве липидов-помощников: холестерин обменивается медленно и необходим для увеличения устойчивости геносом, фосфатидилхолин - быстро и нужен для хорошей биодеградабельности комплексов.

Заключение.

В подавляющем большинстве современных работ по генному переносу in vivo используются количественные методы оценки активности чужеродного гена в среднем на всю биомассу органа. В то же время нами в опытах по количественному измерению активности [3 -галактозидазы, используемой в качестве модельного гена, во внутренних

Табл.6.

Включение [214С]-ацетата в фосфолипиды тимоцитов крыс в условиях in vitro.

Фосфолипиды Общая радиоактивность

30 мин 50 мин 70 мин

Фосфатидилхолин 100% 148,7 ± 19,1 102,3 ±37,7

Сфингомиелин 100% 56% 23%

Фосфатидилсерин 100% 62,3 + 6,4 56,7+ 2,8

Фосфатидилинозитол 100% 90,7 ± 18,2 77,3 ± 4,7

Фосфатидилэтаноламин 100% 101,7 ± 7,9 99,3 ± 9,0

Кардиолипин 100% 30,5 ± 1,8 14,0 ± 5,3

Рис.42. Кинетика выведения меченых нейтральных липидов (А) и фосфолипидов (Б) из тимоцитов крыс.

А. Включение в тимоциты - 1, холестерин - 2, моноглицериды - 3, жирные кислоты - 4.

Б. Включение в общие фосфолипиды - 5, фосфатидилхолин - 6, фосфатидилсерин - 7, фосфатидилинозитол - 8, фосфатидилэтаноламин - 9. органах мышей установлен высокий уровень эндогенной активности этого фермента в почках и печени и довольно значительный - в селезенке. Это затрудняет количественную оценку экспрессии трансфицируемого гена во всем органе. Однако оценка активности фермента в клетках какой-либо ткани представляется более ценной, чем во всех клетках органа, поскольку метаболической коррекции обычно необходимо подвергать клетки определенного типа, принадлежащие к одной из тканей органа. В связи с этим определение "брутто" -активности модельного гена на биомассу всего органа может быть не вполне информативной по сравнению с такими количественными морфологическими методами, как цитофотометрия или микрорадиоавтография. В случае гистохимических методов необходимы условия равного доступа субстрата, обычно растворяемого в реакционном буфере, ко всем участкам гистологического среза. Для достижения этой цели предпочтительнее метод инкубации свободноплавающих срезов по сравнению с методом предварительного монтирования срезов на подложке, хотя последний и несколько удобней в выполнении. Но в обоих вариантах остаются краевые эффекты, не позволяющие адекватно сравнивать ферментативую активность на краю срезов и в их центре из-за более легкого доступа субстрата к краю срезов. В связи с этим перспективными можно считать методы использования неэнзиматически скринируемых маркерных генов, продуктами которых являются флюоресцирующие белки (фотолюминесценция), например белок A. victoria, на основе гена которого уже создано много модельных генетических конструкций. Для широкого использования в гистохимии нужен метод получения достаточно стабильных препаратов, исключающих денатурацию белка. Необходим подбор специальных красителей для визуализации мембранных, ядерных и др. клеточных структур, которые позволяли бы окрашивать нефиксированную ткань и не разрушали продукт работы модельного гена.

Локальная доставка геносом при использованием кровотока в полной мере в мире не достигнута, но в этом направлении делаются значительные успехи, чему является примером наша работа. Этот метод безусловно должен найти применение наряду с использованием тканеспецифичных лигандов. Он будет совершенствоваться и останется необходимым, пока применение лигандов ограничивается физиологическими факторами (иммунными и т. п.), а метод применения тканеспецифичных промоторов в исследовательской практике еще находится в начале развития.

Полученные нами результаты свидетельствуют о возможности дальнейшего эффективного поиска стабильных комплексов ДНК с липидами, в том числе органо- и тканеспецифичных. Так, ХОЛЕНИМы, взаимодействуя с ДНК, образуют гидрофобную «шубу» из холестериновых остатков вокруг двойной спирали ДНК, не вызывая изменений в структуре ее двойной спирали. Они способны легко диссоциировать в перинуклеарном пространстве, что является ключом к достижению эффективности трансфекции (Lasic, 1997), и в этом вероятная причина повышенного уровня трансфекции (как in vitro, так и in vivo) для комплексов ДНК/ХОЛЕНИМы.

Особенности строения комплексов плазмидной ДНК с катионными, рН-чувствительными и гликолипосомами, по-видимому, обусловили получение высокой эффективности трансфекции эукариотических клеток в культуре для ряда композиций, сравнимой с уровнем генного переноса с помощью известных коммерческих препаратов: липофектина, DOT АР, DOTMA или DOSPER. При изучении биораспределения геносом при введении в воротную вену печени обнаружена зависимость их тропности от строения липида-переносчика.

При этом же способе введения спектрофотометрически и гистохимически показана экспрессия функционального гена (pCMV-SPORT-b-Gal) в тканях печени, селезенки и легкого. Разработанные в работе липосомы и геносомы на основе pH-чувствительных липосом, гидрофобных олигокатионов и гликолипидов могут быть перспективны для использования в качестве инъекционных невирусных систем для системного введения в протоколах генотерапии. В процессе работы были разработаны методы и тесты, которые могут быть использованы в дальнейшем как комплекс тестов для характеристики любых новых невирусных систем доставки терапевтических генов, в том числе оценки влияния на иммунную систему.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Богданенко, Елена Валентиновна, Москва

1. Авцин А.П. Новая клеточная линия невриномы Гассерова узла крысы НГУК-1. // Цитология. - 1989. - №. 1.-С. 97-101.

2. Адаме Р. Методы культивирования клеток для биохимиков. М.: Мир, 1983.-263 С.

3. Бергельсон Л.Д., Дятловицкая Э.В., Молотковский Ю.Г., Батраков С.Г., Барсуков Л.И., Проказова Н.В. Препаративная биохимия липидов. М.: Наука, 1981.-256 С.

4. Биология развития млекопитающих. Методы. Под ред. М. Манк. Пер. с англ. М., Мир: 1990. - 406 С.

5. Жданов Р.И., Куценко Н.Г., Федченко В.И. Невирусные методы переноса генов в генной терапии. // Вопр. Мед. Химии. 1997. - Т. 43. -№ 1.-С. 3-11.

6. Жданов Р.И., Хусаинова P.C., Иваницкий Г.Р., Борисенко A.C. Невирусные векторы в генной терапии. Новый подход в липофекции. // Вопросы Биол. Мед. Фарм. Химии. 2000. - №1. - С. 10-17.

7. Иммунология. Справочник. Под ред. Г. Бундшу и Б. Шнеевайса. Пер. с нем. Киев: Наукова думка, 1981. - 480 С.

8. Козлов Л.В., Крылова Ю.И., Чих В.П., Молчанова H.H. Модифицированные методы определения функциональной активности факторов комплемента С2, СЗ, С4 and С5.// Биоорг. Химия. 1982. - Т. 8. - № 5. - С. 652-659.

9. Козлов JT.B., Лебедева T.B. Ингибирование образования С5-конвертазы комплемента. //Биоорг. Химия. 1998. - Т. 24. - № 5. - С.350 -355.

10. Козлов Л.В., Лахтин В.М., Скороходова Т.Г., Баталова Т.Н., Шойбонов Б.Б., Дьячков В.Л., Гузова В.А., Матвеевская Н.С. Ингибирование связывания активированного С4Ь-компонента комплемента с мишенью. Н Биоорг. Химия. 2000. - Т.26. - № 11. - С. 817- 824.

11. Кривцов Г.Г., Жданов Р.И. Адресная доставка функциональных генов в генотерапии с помощью углевод-содержащих векторов. // Вопр. Мед. Химии. 2000. - Т.46. - №3. - С. 246 - 255.

12. Кузнецов A.B., Кузнецова И.В. Связывание экзогенной ДНК pRK311acZ сперматозоидами кролика, ее перенос в ооциты и экспрессия в доимплантационных эмбрионах. // Онтогенез. 1995. - № 4. - С. 300 -309.

13. Кривцов Г.Г., Жданов Р.И. Адресная доставка функциональных генов в генотерапии с помощью углеводсодержащих векторов. // Вопросы Медицинской Химии. 2000. - т.46. - № 3. - С. 246-255.

14. Маниатис Т., Фрицш Е.Ф., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984.-479 С.

15. Плохинский Н.А. Биометрия. М.: Издательство Московского Университета, 1970. - 367 С.

16. Ченцов Ю.С. Практикум по цитологии. М.: Издательство Московского Университета, 1988. - 294 С.

17. Akinc A., Anderson D.G., Lynn D.M., Langer R. Synthesis of poly(beta-amino ester)s optimized for highly effective gene delivery. // Bioconjug. Chem. 2003. - V.14(5). - P. 979 - 988.

18. Anderson W.F. Human gene therapy. // Science. 1992. - V. 256. - P. 808-813.

19. Aoki Y., Hosaka S., Kawa S., Kiyosawa K. Potential tumor-targeting peptide vector of histidylated oligolysine conjugated to a tumor-homing RGD motif. // Cancer Gene Ther. 2001. - V. 8. - № 10. - P.783-787.

20. Ausubel F.M., Brent R., Kingston R.E., Moore D.D., Seidman I.G., Smith J.A., Struhl K. // Currant protocols in molecular biology. Suppl. 17, unit 9.4.1. New York: Wiley, 1991.

21. Bennett M.J., Nantz M.H., Balasubramanian R.P., Gruenert D.C., Malone R.W. Cholesterol enhances cationic liposome-mediated DNA transfection of human respiratory epithelial cells. //Biosci. Rep. 1995. -V.15. - P. 47 - 53.

22. Birnboim H., Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. // Nucl. Acids Res. 1979. - V.7. - N.6. - P. 1513-1522.

23. Boletta A., Benigni A., Lutz J., Remuzzi G., Soria M., Monaco L. Nonviral gene delivery to the rat kidney with polyethylenimine. // Human Gene Therapy. 1997. - N. 8. - P. 1243 - 1251.

24. Bottger M., Zaitsev S.V., Otto A., Haberland A., Vorob'ev V. Acid nuclear extracts as mediators of gene transfer and expression. // Biochim Biophys. Acta. 1998,-V.1395. -№ l.-P. 78-87.

25. Brigham K.L., Meyrick B., Christman B., Magnuson M., King G., Berry L. In vivo transfection of murine lungs with a functioning procaryotic gene using a liposome vehicle. // Am. J. Med. Sci. 1989. - Vol. 298. - P. 278 -281.

26. Canonico A.E., Plitman J.D., Conary T.J., Meyrick B.E., Brigham K.L. No lung toxicity after repeated aerosol or intravenous delivery of plasmid-cationic complexes. // J. Appl. Physiol. 1994. - Vol. 77. - P. 415 - 419.

27. Capecchi M.R. High efficiency transformation by direct microinjection DNA into cultured mammalian cells. // Cell. 1980. -N. 22. - P. 479-488.

28. Cemazar M., Wilson I., Dachs G.U., Tozer G.M., Sersa G. Direct visualization of electroporation-assisted in vivo gene delivery to tumors using intravital microscopy spatial and time dependent distribution. II BMC Cancer. - 2004. - V.4. - № 1. - P. 81.

29. Cheng P.-W. Receptor ligand-facilitated gene transfer: enhancement of liposome-mediated gene transfer and expression by transferrin. // Hum. Gene Ther. 1996. - V. 7. - № 3. - P. 275-282.

30. Cheung C.Y., Murthy N., Stayton P.S., Hoffman A.S. A pH-sensitive polymer that enhances cationic lipid-mediated gene transfer. // Bioconjug Chem. 2001. - V. 12. - № 6. - P. 906-910.

31. Cheung C.Y., Stayton P.S., Hoffman A.S. Poly. № propylacrylic acid)-mediated serum stabilization of cationic lipoplexes. // J. Biomater. Sci. Polym. Ed.- 2005.- V.16. - № 2. - P. 163-179.

32. Chin D.J., Green G.A., Zon G., Szoka F.C., Straubinger R.M. Rapid nuclear accumulation of injected oligodeoxyribonucleotides. // New Boil. -1990. -N. 2.-P. 1091-1100.

33. Chiou H.C., Tangco M.V., Levine S.M., Robertson D., Kormis K., Wu C.H., Wu G.Y. Enhanced resistance to nuclease degradation of nucleic acids complexed to asialoglycoprotein polylysine carriers. // Nucleic Acids Res. -1994. - V. 24.-P. 5439-5446.

34. Chonn A., Cullis P.R., Devine D.V. The role of surface charge in the activation of the classical and alternative pathways of complement by liposomes.//J. Immunol. -1991.-V. 146.-P. 4234-4241.

35. Corsi K., Chellat F., Yahia L., Fernandes J.C. Mesenchymal stem cells, MG63 and HEK293 transfection using chitosan-DNA nanoparticles. // Biomaterials. 2003. - V.24. - № 7. - P. 1255-1264.

36. Couzin J. RAC confronts in utero gene therapy proposals. // Science. -1998.-V. 282.-№ 5386.-P. 27.

37. Cui Z., Mumper R.J. Plasmid DNA-entrapped nanoparticles engineered from microemulsion precursors: in vitro and in vivo evaluation. // Bioconjug. Chem. 2002. - V.13. - № 6. - P.1319-1327.

38. Curiel D.T.,Agarwal S., Wagner E., Cotten M. Adenovirus enhansement of transferrin-mediated gene delivery. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1991. -N88.-P. 8850-8854.

39. Dasi F., Benet M., Crespo J., Crespo A., Alino S.F. AsiaJofetuin liposome-mediated human alphal-antitrypsin gene transfer in vivo results in stationary long-term gene expression. // J. Mol. Med. 2001. - V.79. - № 4. - P. 205212.

40. Deas O, Angevin E., Cherbonnier C, Senik A., Charpentier B., Levillain J.P., Oosterwijk E., Hirsch F., Durrbach A. In vivo-targeted gene delivery using antibody-based nonviral vector. // Hum. Gene Ther. 2002.- V.13. - № 9. - P.1101-1114.

41. Debs R.J., Freedman L.P., Edmunds S, Gaensler K.L., Duzgunes N., Yamamoto K.R. Regulation of gene expression in vivo by liposome-mediated delivery of a purified transcription factor. - J. Biol. Chem. - 1990. -Vol. 265.-№18.-P. 10189- 10192.

42. Dufes C, Keith W.N, Bilsland A, Proutski I, Uchegbu I.F, Schatzlein A.G. Synthetic anticancer gene medicine exploits intrinsic antitumor activity of cationic vector to cure established tumors. // Cancer Res. 2005.- V.65. -№ 18.-P. 8079-8084.

43. Dzau J.V., Mann M.J, Morishita R., Kaneda Y. Fusigenic viral liposome for gene therapy in cardiovascular diseases. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. -N. 93.-P. 11421-11425.

44. Eliyahu H., Makovitzki A., Azzam T., Zlotkin A., Joseph A., Gazit D., Barenholz Y., Domb A.J. Novel dextran-spermine conjugates as transfecting agents: comparing water-soluble and micellar polymers. // Gene Ther. -2005. V.12. - № 6.-P. 494-503.

45. Erbacher P., Zou S., Bettinger T., Steffan A.M., Remy J.S. Chitosan-based vector/DNA complexes for gene delivery: biophysical characteristics and transfection ability. //Pharm. Res. -1998. V.15. - № 9. p. 1332-1339.

46. Ewert K., Ahmad A, Evans H.M., Schmidt H.W., Safinya C.R. Efficient synthesis and cell-transfection properties of a new multivalent cationic lipid for nonviral gene delivery. // J. Med. Chem. 2002. - V.45. - № 23. - P. 50235029.

47. Feigner P. L., Gadek T. R., Holm M., Roman R., Chan H. W., Wenz M., Northrop J. P., Ringold J. M., Danielsen M. Lipofectin: a highly efficientlipid-mediated DNA transfection procedure. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987.-V.84.-P. 7413-7417.

48. Ferber D. Gene therapy: safer and virus-free? // Science. 2001. - V.294. -P. 163 8-1642.

49. Feng D.M., He C.X., Miao C.Y., Lu B., Wu W.J, Ding Y.F, Xue J.L.Conditions affecting hydrodynamics-based gene delivery into mouse liver in vivo. // Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 2004. - V. 31. - № 12. - P.850-855.

50. Fleck A., Munro H.N. The precision of ultraviolet absorption measurements in the Schmidt-Thanhauser procedure for nucleic acid estimation. //Biochim. Biophys. Acta. 1962. -V. 55. - P. 571-583.

51. Fong C.L, Mok C.L, Hui K.M. Intramuscular immunization with plasmid coexpressing tumour antigen and Flt-3L results in potent tumour regression. // Gene Ther. 2006. - V. 13. - № 3. - P. 245 - 256.

52. Fong S, Liu Y, Heath T, Fong P, Liggitt D, Debs R.J. Membrane-permeant, DNA-binding agents alter intracellular trafficking and increase the transfection efficiency of complexed plasmid DNA. // Mol. Ther. 2004. -V.10. - № 4. - P. 706-718.

53. Forrest M.L, Gabrielson N, Pack D.W. Cyclodextrin-polyethylenimine conjugates for targeted in vitro gene delivery. // Biotechnol. Bioeng. 2005. -V. 89. -№ 4. -P. 416-423.

54. Gao S., Chen J., Xu X., Ding Z., Yang Y.H., Hua Z., Zhang J. Galactosylated low molecular weight chitosan as DNA carrier for hepatocyte-targeting. //Int. J. Pharm. -2003. -V.255. № 1-2. - P. 57-68.

55. Gaucheron J., Boulanger C., Santaella C., Sbirrazzuoli N., Boussif O., Vierling P. In vitro cationic lipid-mediated gene delivery with fluorinated glycerophosphoethanolamine helper lipids. // Bioconjug. Chem. 2001. -V.12. - № 6. - P. 949-963.

56. Goren D., Horowitz A.T., Zalipsky S., Woodle M.C., Yarden Y., Gabizon A. Targeting of stealth liposomes to erbB-2 (Her/2) receptor: in vitro and in vivo studies. // Br. J. Cancer. 1996. - Vol.74. - P. 1749 -1756.

57. Gosselin M.A., Guo W., Lee R.J. Efficient gene transfer using reversibly cross-linked low molecular weight polyethylenimine. // Bioconjug Chem. -2001. V. 12. - № 6. - P. 989-994.

58. Goula D., Remi S., Erbacher P., Wasowich M., Levi G., Abdallah B., Demeneix B.A. Size, diffusibility and transfection performance of linear PEI/DNA complexes in the mouse central nervous system. // Gene Therapy. -1998.-V.5.-№5. -P. 712-717.

59. Graham F.L., van der Eb A.J. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. // Virology. 1973. - V.52. - № 2. - P. 456

60. Graham F.L, van der Eb A.J. Transformation of rat cells by DNA of human adenovirus 5. // Virology. 1973. - V.54. - № 2. - P. 536 - 539.

61. Grove J.E., Lutzko C, Priller J, Henegariu O, Theise N.D, Kohn D.B, Krause D.S. Marrow-derived cells as vehicles for delivery of gene therapy to pulmonary epithelium. // Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 2002. - V. 27. - № 6.-P. 645-651.

62. Hadjantonakis A.K., Gertsenstein M., Ikawa M, Okabe M, Nagy A. Generating green fluorescent mice by germline transmission of green fluorescent ES cells. // Mech Dev. 1998. - V. 76. - №1-2. - P. 79-90.

63. Harrison R.A., Lachmann P.J. Complement technology. In Handbook of Experimental Immunology. 4th Ed. Vol. 1. Immunochemistry. Ch. 39. Weir D.M, Herzenberg L.A, eds. Blackwell Science Publications. -1986.

64. Hart I.R. Tissue specific promoter in targeting systematically delivered gene therapy. // Semin. Oncol. 1996. - No 1. - P. 154 - 158.

65. Hashida M, Nishikawa M, Yamashita F, Takakura Y. Cell-specific delivery of genes with glycosylated earners. // Adv. Drug Deli v. Rev. 2001. - V.52.-№3.-P. 187-196.

66. Hazinski T.A., Ladd P.A, DeMateo C.A. Localization and induced expression of fusion genes in the rat lung. // Am. J. Resp. Cell. Mol. Biol. -1991.-№2.-P. 206-209.

67. Hodgson C.P, Solaiman F. Virosomes: cationic liposomes ennance retroviral transduction. // Nat Biotechnol. 1996. - V. 14. - N. 3. - P. 339-342.

68. Hofland H.E, Masson C, Iginla S, Osetinsky I, Reddy J.A, Leamon C.P, Scherman D, Bessodes M, Wils P. Folate-targeted gene transfer in vivo. // Mol Ther. 2002. - V.5. - № 6. - P.739-744.

69. Huebner S, Battersby B.J, Grimm R, Cevc G. Lipid-DNA complex formation: reorganization and rupture of lipid vesicles in the presence of DNA as observed by cryoelectron microscopy. // Biophys. J. 1999. -Vol. 76. - P. 3158-3166.

70. Hui S.W, Langner M, Zhao Y.L, Ross P, Hurley E, Chan. K. The role of helper lipids in cationic liposome-mediated gene transfer. // Biophys. J. -1996.-V. 71.-P. 590-599.

71. Ikawa M, Yamada S, Nakanishi T, Okabe M. Green mice and their potential usage in biological research. // FEBS Lett. 1998. - V. 430. - № 1-2. -P. 83-87.

72. Ishida S, Sakiya Y, Taira Z. Disposition of glycyrrhizin in the perfused liver of rats. // Biol. Pharm. Bull. 1994. - V. 17. - № 7. - P. 960-969.

73. Ishii T, Okahata Y, Sato T. Mechanism of cell transfection with plasmid/chitosan complexes. // Biochim. Biophys. Acta. 2001. - V.1514. -№ l.-P. 51-64.

74. Ivanova M.M, Rosenkranz A.A., Smirnova O.A., Nikitin V.A, Sobolev A.S, Landa V, Naroditsky B.S, Ernst L.K. Receptor-mediated transport offoreign DNA into preimplantation mammalian embryos. 11 Mol. Reprod. Dev.-1999.-V. 54.-N. 2.-P. 112-120.

75. Iyer M., Berenji M., Templeton N.S., Gambhir S.S. Noninvasive imaging of cationic lipid-mediated delivery of optical and PET reporter genes in living mice. // Mol Ther. 2002. - V. 6. - № 4. - P. 555-562.

76. Jiang H., Cooper B., Robey F.A. and Gewurz H. DNA binds and activates complement via residues 14-26 of the human Clq A chain. 11 J. Biol. Chem. -1992. V. 267. - P. 25597-25601.

77. Jolli D. Viral vector systems for gene therapy. // Cancer Gene Ther. -1994.-Vol 1,-P. 51-64.

78. Jones J.M., Petrofski J.A., Wilson K.H., Steenbergen C., Koch W.J., Milano C.A. beta2 adrenoceptor gene therapy ameliorates left ventricular dysfunction following cardiac surgery. // Eur. J. Cardiothorac. Surg. 2004. -V. 26. - № 6. - P.1161-1168.

79. Kalyanasundaram K., Thomas J.K. Enviromental effects on vibronic band intensities in pyrene monomer fluorescence and their application in studies of micellar systems. //J. Am. Chem. Soc. 1977. - V. 99. - P. 2039-2044.

80. Kaneda Y. Development of a novel fusogenic viral liposome system (HVJliposomes) and its applications to the treatment of acquired diseases. // Mol. Membr. Biol.- 1999.-Vol. 16.-P. 119- 122.

81. Katsube K., Bishop A.T., Friedrich P.F. Transduction of rabbit saphenous artery: a comparison of naked DNA, liposome complexes, and adenovirus vectors. // J. Orthop. Res. 2004. - V.22. - № 6. - P. 1290-1295.

82. Kaul G., Amiji M. Cellular interactions and in vitro DNA transfection studies with poly(ethylene glycol)-modified gelatin nanoparticles. // J. Pharm. Sci. -2005. -V. 94. № 1. - P. 184-198.

83. Kawano T., Okuda T., Aoyagi H., Niidome T. Long circulation of intravenously administered plasmid DNA delivered with dendritic poly(L-lysine) in the blood flow. // J. Control. Release. 2004. - V. 99. - № 2. -P.329-337.

84. Kichler A., Leborgne C., Marz J., Danos O., Bechinger B. Histidine-rich amphipathic peptide antibiotics promote efficient delivery of DNA into mammalian cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2003. V. 100. - № 4. -P.1564-1568.

85. Kikuchi A., Aoki Y., Sugaya S., Serikawa T., Takakuwa K., Tanaka K., Suzuki N., Kikuchi H. Development of novel cationic liposomes for efficient gene transfer into peritoneal disseminated tumor. // Hum. Gene Ther. -1999. -Vol. 10.-P. 947-955.

86. Klink D.T., Glick M.C., Scanlin T.F. Gene therapy of cystic fibrosis (CF) airways: a review emphasizing targeting with lactose. // Glycoconj J. 2001. -V.18. - № 9. - P. 731-40.

87. Koltover I., Salditt T, Raedler J. O, Safmya C. R. An inverted hexagonal phase of cationic liposome-DNA complexes related to DNA release and delivery. // Science. 1998. -V. 281. - P. 78-81.

88. Koping-Hoggard M, Mel'nikova Y.S, Varum K.M., Lindman B, Artursson P. Relationship between the physical shape and the efficiency of oligomeric chitosan as a gene delivery system in vitro and in vivo. // J. Gene Med.-2003.-V. 5. № 2. - P.130-141.

89. Kwok K.Y, Park Y, Yang Y, McKenzie D.L, Liu Y, Rice K.G. In vivo gene transfer using sulfhydryl cross-linked PEG-peptide/glycopeptide DNA co-condensates.//J. Pharm. Sei.-2003. V.92. - № 6. - P. 1174-1185.

90. Lasic D.D. Liposomes in Gene Delivery. New York: CRC Press, Boca Raton,1997.-295 PP.

91. Lee K.Y., Kwon I.C., Kim Y.H., Jo W.H., Jeong S.Y. Preparation of chitosan self-aggregates as a gene delivery system. // J. Controlled Release.1998.-V. 51 .-№2-3.-P. 213-220.

92. Lee M, Nah J.W., Kwon Y., Koh J.J., Ko K.S., Kim S.W. Water-soluble and low molecular weight chitosan-based plasmid DNA delivery. // Pharm. Res. 2001. - V. 18. - № 4. - P. 427-431.

93. Lee T.W., Matthews D.A., Blair G.E. Novel molecular approaches to cystic fibrosis gene therapy. // Biochem. J. 2005. - V. 387(Pt 1). - P. 1-15.

94. Liu Y, Liggitt D, Zhong W, Tu G, Gaensler K, Debs R. Cationic liposome-mediated intravenous gene delivery. // J. Biol. Chem. 1995. - V. 270.-P. 24864-24870.

95. Liu Y, Thor A, Shtivelman E, Cao Y, Tu G, Heath T.D, Debs R.J. Systemic gene delivery expands the repertoire of effective antiangiogenic agents.//J. Biol. Chem .- 1999. Vol.274. - P. 13338- 13344.

96. Liu X, Tian P, Yu Y, Yao M, Cao X, Gu J. Enhanced antitumor effect of EGF R-targeted p21WAF-l and GM-CSF gene transfer in the established murine hepatoma by peritumoral injection. // Cancer Gene Ther. 2002. -V.9. - № 1. - P.100-108.

97. Liu X, Tian P.K, Ju D.W, Zhang M.H, Yao M, Cao X.T, Gu J.R. Systemic genetic transfer of p21WAF-l and GM-CSF utilizing of a novel oligopeptide-based EGF receptor targeting polyplex. // Cancer Gene Ther. -2003.-V.10.-№7.-P. 529-539.

98. Lu H, Zhang Y, Roberts D.D, Osborne C.K, Templeton N.S. Enhanced gene expression in breast cancer cells in vitro and tumors in vivo. // Mol Ther. 2002. - V.6. - № 6. - P.783-792.

99. Malone R.W, Feigner P, Verma I.M. Cationic liposome-mediated RNA transfection. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1989. - Vol. 88. - P. 6077 - 6081.

100. Mansouri S, Lavigne P, Corsi K, Benderdour M, Beaumont E, Fernandes J.C. Chitosan-DNA nanoparticles as non-viral vectors in gene therapy: strategies to improve transfection efficacy. // Eur. J. Pharm. Biopharm.-2004.-V.57.-№ l.-P. 1-8.

101. Marjan J., Xie Z., Devine D.V. Liposome-induced activation of the classical complement pathway does not require immunoglobulin. // Biochim. Biophys. Acta. 1994. - V.35. - P. 1192

102. Marshall E. Biomedicine:gene therapy on trial. // Science. 2000. -V.288. - P.951-957.

103. Maurer N., Mori A., Palmer L., Monck M.A., Mok K.W., Mui B., Akhong Q.F., Cullis P.R. Lipid-based systems for the intracellular delivery of genetic drugs. // Mol. Membr. Biol. 1999. - Vol. 16. - No 1. - P. 129 - 140.

104. Masson C., Garinot M., Mignet N., Wetzer B., Mailhe P,. Scherman D., Bessodes M. pH-sensitive PEG lipids containing orthoester linkers: new potential tools for nonviral gene delivery. // J. Control. Release. 2004. -V.99. - № 3. p. 423-434.

105. Mastrobattista E., Kapel R.H., Eggenhuisen M.H., Roholl P.J., Crommelin D.J., Hennink W.E., Storm G. Lipid-coated polyplexes for targeted gene delivery to ovarian carcinoma cells. // Cancer Gene Ther. -2001. V.8. - № 6. - P. 405-413.

106. Mazda O. Improvement of nonviral gene therapy by Epstein-Barr virus . -№ EBV)-based plasmid vectors. // Curr Gene Ther. 2002. - V.2. - № 3. - P. 379-392.

107. McKay T., Reynolds P., Jezzard S., Curiel D., Coutelle C. Secretin-mediated gene delivery, a specific targeting mechanism with potential for treatment of biliary and pancreatic disease in cystic fibrosis. // Mol. Ther.2002. -V.5. № 4. - P. 447- 454.

108. Medvedev A.E., Fuchs B.B., Rakhmilevich A.L. A study of the action of immunosuppressive factors from tumour cells on lymphocytes and macrophages in vitro and on the graft-versus-host reaction in mice. // Biomed Sci. 1990. - V. 1. -N. 3. - P. 261-266.

109. Miller A. D. Human gene therapy comes on age. // Nature. 1992. - Vol. 357.-P. 455-460.

110. Niidome Т., Huang L. Gene therapy progress and prospects: nonviral vectors. // Gene Ther. 2002. - V.9. - № 24. - P.1647-1652.

111. Nishikawa M, Nakano T, Okabe T, Hamaguchi N, Yamasaki Y, Takakura Y, Yamashita F, Hashida M. Residualizing indium-111-radiolabel for plasmid DNA and its application to tissue distribution study. // Bioconjug Chem. 2003. - V. 14. - № 5. - P. 955-961.

112. Ochiya T, Takahama Y, Baba-Toriyama H, Tsukamoto M, Yasuda Y, Kikuchi H, Terada M. Evaluation of cationic liposome suitable for gene transfer into pregnant animals. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. -N. 10.-P. 358 -365.

113. Ogris M, Carlisle R.C, Bettinger T, Seymour L.W. Melittin enables efficient vesicular escape and enhanced nuclear access of nonviral gene delivery vectors. J. Biol. Chem. -2001. -V.276. - № 50. - P. 47550-47555.

114. Ogris M, Wagner E. Tumor-targeted gene transfer with DNA polyplexes. // Somat. Cell. Mol. Genet. 2002. - V.27. - № 1-6. - P.85-95.

115. Oh Y.K, Kim J.P, Yoon H, Kim J.M, Yang J.S, Kim C.K. Prolonged organ retention and safety of plasmid DNA administered in polyethylenimine complexes. // Gene Ther. 2001. - V.8. - № 20. - P. 1587-1592.

116. Ohlfest J.R, Frandsen J.L, Fritz S, Lobitz P.D, Perkinson S.G, Clark K.J, Nelsestuen G, Key N.S, Mclvor R.S, Hackett P.B, Largaespada D.A.

117. Phenotypic correction and long-term expression of factor VIII in hemophilic mice by immunotolerization and nonviral gene transfer using the Sleeping Beauty transposon system. // Blood. 2005. - V. 105. - № 7. - P.2691-2698.

118. Ono T, Fujimo J.T, Tschiya T, Tsuda M. Plasmid DNAs directly injected into mice brain with lipofectin can be incorporated and expressed by brain cells. // Neurosci. Lett. 1990. - Vol. 117. - P. 259 - 263.

119. Ortiz-Urda S, Thyagarajan B, Keene D.R, Lin Q, Fang M, Calos M.P., Khavari P.A. Stable nonviral genetic correction of inherited human skin disease. // Nat. Med. 2002. - V.8. - № 10. - P. 1166-1170.

120. Osaka S, Tsui H, Kiwada H. Uptake of liposomes surface-modified with glycyrrizin by primary cultured rat hepatocites. // Biol. Pharm. Bull. 1994. -V.17. - N.7. - P.940-943.

121. Ozbas-Turan S, Aral C, Kabasakal L, Keyer-Uysal M, Akbuga J. Co-encapsulation of two plasmids in chitosan microspheres as a non-viral gene delivery vehicle. // J. Pharm. Pharm. Sci. 2003. - V.6. - № 1. - P. 27-32.

122. Palffy R, Gardlik R, Hodosy J, Behuliak M, Resko P, Radvansky J, Celec P. Bacteria in gene therapy: bactofection versus alternative gene therapy. // Gene Ther. -2006. V. 13. - № 2. - P. 101-105.

123. Plank C., Mechtler K., Szoka F.C.Jr., Wagner E. Activation of the complement system by synthetic DNA complexes: a potential barrier for intravenous gene delivery. // Hum Gene Ther. 1996. - V.7. - № 12. -P.1437-1446.

124. Plank C., Oberhauser B., Mechtler K., Koch C., Wagner E. The influence of endosome-disruptive peptides on gene transfer using synthetic virus-like gene transfer systems. // J. Biol. Chem. 1994. - V. 269. - № 17. - P. 12918 -12924.

125. Pollard H., Remy J.-S., Loussouarn G., Demolombe S., Behr J.-P., Escande D. Polyethylemine but not cationic lipids promotes transgene delivery to the nucleus in mammalian cells. // J. Biol. Chem. 1998. - V. 273. - P. 7507-7511.

126. Pun S.H., Bellocq N.C., Liu A., Jensen G., Machemer T., Quijano E., Schluep T., Wen S., Engler H., Heidel J. Davis M.E. Cyclodextrin-modified polyethylenimine polymers for gene delivery. // Bioconjug. Chem. 2004. -V.15. - № 4. - P. 831-840.

127. Pun S.H., Davis M.E. Development of a nonviral gene delivery vehicle for systemic application. // Bioconjug. Chem. 2002. - V.13. - № 3. - P.630-639.

128. Qu B., Rosenberg R.N., Li L., Boyer P.J., Johnston S.A. Gene vaccination to bias the immune response to amyloid-beta peptide as therapy for Alzheimer disease. // Arch. Neurol. 2004. - V.61. - № 12. - P. 1859-1864.

129. Ramani K., Bora R.S., Kumar M., Tyagi S.K., Sarkar D.P. Novel gene delivery to liver cells using engineered virosomes. // FEBS Lett. 1997. - V. 404-N. 2-3.-P. 164-168.

130. Ramani K., Hassan Q., Venkaiah B., Hasnain S.E., Sarkar D.P. Site-specific gene delivery in vivo through engineered Sendai viral envelopes. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1998. V. 95 - N. 20. - P. 11886-11890.

131. Ravi Kumar M.N., Bakowsky U., Lehr C.M. Preparation and characterization of cationic PLGA nanospheres as DNA carriers. // Biomaterials. 2004. - V.25. - № 10. -P. 1771-1777.

132. Raedler J.O, Koltover I., Salditt T., Safinya C.R. Structure of DNA-cationic liposome complexes: DNA intercalation in multilamellar membranes in distinct interhelical packing regimes. // Science. 1997. - V.275. - P.810-814.

133. Richardson S.C., Kolbe H.V., Duncan R. Potential of low molecular mass chitosan as a DNA delivery system: biocompatibility, body distribution and ability to complex and protect DNA. // Int. J. Pharm. 1999. - V. 178. - № 2. -P.231-43.

134. Rochlitz C.F. Gene therapy of cancer. // Drugs Today (Bare). 2000. -V. 36.-№9.-P.619-629.

135. Roessler B.J., Davidson B.L. Direct plasmid mediated transfection of adult micrine brain cells in vivo using cationic liposomes. // Neurosci. Lett. -1994.-Vol. 167.-P. 5-10.

136. Rosengarten 0, Horowitz A.T, Tzemach D, Huang L, Gabizon A. In vitro cytotoxicity and pharmacokinetics of cationic liposomes in mice. // Abstracts. Cancer Gene Ther. - 1994- Vol.1:- P. 301-336.

137. Rudolph C, Schillinger U., Plank C, Gessner A, Nicklaus P, Muller R, Rosenecker J. Nonviral gene delivery to the lung with copolymer-protected and transferrin-modified polyethylenimine. // Biochim. Biophys. Acta. 2002. -V.1573. -№ 1. - P. 75-83.

138. Schlingensiepen R, Brysch K.-Schlingensiepen H. Antisense From Technology to Therapy. - Berlin; Vienna: Blackwell Science, 1997.

139. Schofield J.P., Caskey C.T. Non-viral approaches to gene therapy. // Br. Med. Bull. 1995. - N.51. - P.56-71.

140. Segura T., Shea L.D. Surface-tethered DNA complexes for enhanced gene delivery.//Bioconjug Chem.-2002. V.13. - № 3. - P. 621-629.

141. Seki M., Iwakawa J, Cheng H, Cheng P.W. p53 and PTEN/MMAC1/TEP1 gene therapy of human prostate PC-3 carcinoma xenograft, using transferrin-facilitated lipofection gene delivery strategy. // Hum. Gene Ther. 2002. - V.13. - № 6.- P. 761-773.

142. Sen J., Chaudhuri A. Design, syntheses, and transfection biology of novel non-cholesterol-based guanidinylated cationic lipids. // J. Med. Chem. -2005. V.48. - № 3. - P. 812-820.

143. Shi H.Y., Liang R., Templeton N.S., Zhang M. Inhibition of breast tumor progression by systemic delivery of the maspin gene in a syngeneic tumor model. // Mol. Ther. -2002. V.5. - № 6. -P.755-761.

144. Shinkai M., Ito A. Functional magnetic particles for medical application. // Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 2004. - V.91. - P. 191-220.

145. Singhal A, Huang L. In Gene Therapeutics: Methods and Applications of Direct Gene Transfer. J. A. Wolf, editor. Birkhauser, Boston, Massachusetts. 1994.

146. Smaglik P. After Gene Therapy Death: Investigators ponder what went wrong. // The Scientist. 1999 (a). -V. 13. - N.21. - P. 1.

147. Smaglik P. Gene therapy death may delay new trials. // The Scientist. -1999.-№6.-V.13.-N. 22.-P. 9.

148. Solodin I, Brown C.S, Bruno M.S., Chow C.Y, Jang E.H, Debs R.J, Heath T.D. A novel series of amphiphilic imidazolinum compounds for in vitro and in vivo gene delivery. // Biochemistry. 1995. - V. 34. - P. 13537 -13544.

149. Stefanidakis M., Koivunen E. Peptide-mediated delivery of therapeutic and imaging agents into mammalian cells. // Curr. Pharm. Des. 2004. -V.10. - № 24. - P. 3033-3044.

150. Stewart M.K., Plautz G., Buono L., Yang Z., Xu L., Gao X., Huang L., Nabel E.G., Nabel G.J. Gene transfer in vivo with DNA-lipid complexes: safety and acute toxicity in mice. // Hum. Gene Ther. 1992. - № 3. - P. 267 -275.

151. Stribling R., Brunette E., Liggit D., Gaensler K., Debs R. Aerosol gene delivery in vivo. II Proc. Natl. Acad. Sci. 1992. - P. 11277 - 11281.

152. Sung S.J., Min S.H., Cho K.Y., Lee S., Min Y.J., Yeom Y.I., Park J.K. Effect of polyethylene glycol on gene delivery of polyethylenimine. // Biol. Pharm. Bull. 2003. - V.26. - № 4. - P. 492-500.

153. Takano S., Aramaki Y., Tsuchiya S. Physicochemical properties of liposomes affecting apoptosis induced by cationic liposomes in macrophages. // Pharm. Res. 2003. - V.20. - № 7. - P.962-968.

154. Templeton N.S., Lasic D.D., Frederik P.M., Strey H.H, Roberts D.D.,

155. Pavlakis G.N. Improved DNA:liposome complexes for increased systemic delivery and gene expression. // Nature Biotechnology. 1997. - V. 15.-P. 647-652.

156. Thierry A.R., Lunardi-Iskandar Y., Bryant J.L., Rabinovich P., Gallo

157. R.C, Mahan L.C. Systemic gene therapy: biodistribution and long-term expression of a transgene in mice. // Proc. Nat. Acad. Sci. 1995. - V.92. -N.21-P.9742-9746.

158. Tjelle T.E, Salte R, Mathiesen I, Kjeken R. A novel electroporation device for gene delivery in large animals and humans. // Vaccine. 2005. -Sep 12; Epub ahead of print. Related Articles, Links

159. Tomasoni S, Benigni A. The goal of intragraft gene therapy. // Contrib. Nephrol. -2005. V.146. -P.143-150.

160. Tomlinson E. Artificial Self-Assembling Systems for Gene Transfer. Book of Abstracts, CHI, Boston, 1995.

161. Tsukamoto M, Ochiya T, Yoshida S, Sugimura T, Terada M. Gene transfer and expression in progeny after intravenous DNA injection into pregnant mice. // Nature Genet. 1995. - V. 9 -N. 3. - P. 243-248.

162. Van Raamsdonk J.M, Ross C.J, Potter M.A, Kurachi S, Kurachi K, Stafford D.W, Chang P.L. Treatment of hemophilia B in mice with nonautologous somatic gene therapeutics. // J. Lab. Clin. Med. 2002. -V.139. - № 1,-P. 35-42.

163. Wagner E., Zenke M., Cotten M., Beng H., Birnsteil M. Transferrin-polycation conjugates as carriers for DNA uptake into cells. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA- 1990. -V. 87. N. 9. - P. 3410-3414.

164. Wagner J., Madry H., Reszka R. In vivo gene transfer: focus in the kidney. // Nephrol. Dial. Transpl. 1995. - N. 10. - P. 1801-1807.

165. Wang C., Huang L. Plasmid DNA adsorbed to pH-sensitive liposomes efficiently transforms the target cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. -N.84. - P.7851-7855.

166. Weng L., Liu D., Li Y., Cao S., Feng Y. An archaeal histone-like proteinas an efficient DNA carrier in gene transfer. // Biochim. Biophys. Acta. -2004. -V. 1702. № 2. - P. 209-216.

167. Wolfert M.A, Seymour L.W. Chloroquine and amphipatic peptide helices show synergetic transfection in vitro. // Gene Therapy. 1998. - N. 5. -P. 409-414.

168. Wu X, Burgess S.M. Integration target site selection for retroviruses and transposable elements. // Cell. Mol. Life Sci. 2004. - V.61. - № 19-20. -P.2588-2596.

169. Yang F., Cui X., Yang X. Interaction of low-molecular-weight chitosan with mimic membrane studied by electrochemical methods and surface plasmon resonance. // Biophys. Chem. 2002. - V.99. - № 1. - P.99-106.

170. Yang T.F., Chin W.K., Cherng J.Y., Shau M.D. Synthesis of novel biodegradable cationic polymer: N,N-diethylethylenediamine polyurethane as a gene carrier. // Biomacromolecules. 2004. - V.5. - № 5. - P. 1926-1932.

171. Yu W., Shimoyama A., Uneda T., Obika S., Miyashita K., Doi T., Imanishi T. Gene transfer mediated by YKS-220 cationic particles: convenient and efficient gene delivery reagent. // J. Biochem. (Tokyo). 1999. -V. 125. -N. 6.-P. 1034- 1038.

172. Zabner J., Fasbender A.J., Moninger T., Poellinger K. A., Welsh M. Cellular and molecular barriers to gene transfer by a cationic lipids. // J. Biol. Chem.- 1995.-V. 270.-N. 18.-P. 18997-19007.

173. Zauner W., Blaas D., Kuechler E., Wagner E., Rhinovirus-mediated endosomal release of transfection complexes. // J. Virol. 1995. - N. 69. - P. 1085-1092.

174. Zhang F., Feketeota E., Gould Fogerite, Mannino R.J. DNA cochleates as mediators of in vivo gene expression, in artificial self-assembling systems for gene transfer. - Boston: Book of abstracts, CHI,. - 1995.

175. Zhang X.Q, Wang X.L, Huang S.W, Zhuo R.X, Liu Z.L, Mao H.Q, Leong K.W. In vitro gene delivery using polyamidoamine dendrimers with a trimesyl core. // Biomacromolecules. 2005. - V.6. - № 1. - P. 341-350.

176. Zhu J, Liggitt D, Liu Y, Debs R. Systemic gene expression after intravenous DNA delivery in adult mice. // Science. 1993. - V. 261. - P. 209 -211.

177. Zhu J, Zhang L, Hanich U.K., Feigner P.L, Reszka R. A continuous gene delivery system for in vivo liposome mediated gene therapy. // Gene Therapy. 1996. - N.3. - P. 472-476.

178. Zou Y, Zong G, Ling Y.H, Hao M.M, Lozano G, Hong W.K, Perez-Soler R. Effective treatment of early endobronchial cancer with regional administration of liposome-p53 complexes. // J. Natl. Cancer Inst. - 1998. -V. 90.- P. 1130- 1137.

179. Zwirner J, Dobos G, Gotze O. A novel ELISA for the assessment of classical pathway of complement activation in vivo by measurement of C4-C3 complexes. //J. Immunol. Methods. 1995. -V. 186. - P. 55-63.