Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Тканеспецефическая экспрессия генов бактериальной и-галактозидазы и дистрофина человека в трансфицированных скелетных мышцах мыши

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Тканеспецефическая экспрессия генов бактериальной и-галактозидазы и дистрофина человека в трансфицированных скелетных мышцах мыши"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

им. М.В.Ломоносова

Биологический факультет

На правах рукописи УДК 591.86:57.085.1

- В ДПР шз

Шафеи Рамин Ахмедович

ТКАНЕСПЕЦИФИЧЕСКАЯ ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ БАКТЕРИАЛЬНОЙ Р-ГАЛАКТОЗИДАЗЫ И ДИСТРОФИНА ЧЕЛОВЕКА В ТРАНСФИЦИРОВАННЫХ СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦАХ МЫШИ

03.00.11. - эмбриология, гистология и цитология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 1998 -

Работа выполнена на Кафедре эмбриологии Биоло факультета МГУ имени М.В.Ломоносова и в Ла( функциональной морфологии хромосом Института мол( биологии РАН.

доктор биологических наук, профессор А.В.Зеленин доктор биологических наук, профессор Д.В.Попов

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, профессор С.Г.Васецкий

доктор биологических наук, профессор В.С.Прасолов

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Институт общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН

Зашита диссертации состоится " 16 " аир -г и ^_ ;

в 16 часов на заседании специализированного совета Д. при Московском государственном университет М.В.Ломоносова по адресу: 119899, Москва, МГУ, Биол< факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета Московского государственногс университета им. М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан " /6 " ¡мл^а 1998 г.

Ученый секретарь специализированного совета

• НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

кандидат биологических наук

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Для решения многих теоретических и практических задач биологии применяют трансфекцию (искусственный перенос генетической информации в клетки). В настоящее время разработаны методы, позволяющие вводить гены в культуры клеток, в эксплантаты органов и тканей, в гаметы, в зиготы и эмбрионы, либо в отдельные части целого организма. Большое распространение в последние несколько лет получила трансфекция скелетных мышц млекопитающих. Перенос генов в скелетные мышцы возможно осуществлять в следующих целях: решение теоретических вопросов миогенеза (Lescaudron et al., 1993), изучение работы мышечных клеток (Levitt, 1995) и патологии мышц (Matsumura, 1993), генетическая терапия наследственных заболеваний мускулатуры (Morgan, 1994), генетическая иммунизация (Davis, 1995) и пр. Существуют следующие методы трансфекции скелетных мышц: внутримышечная инъекция водного раствора ДНК (Furth et al., 1995), внутримышечная инъекция ДНК в составе вирусных векторов (Dunckley et al., 1993), внутримышечная инъекция раствора ДНК с добавлением дефектных вирусов (O'Connell et al., 1995), внутримышечная инъекция ДНК в составе липидных комплексов (Yanagihara et al., 1996), баллистическая трансфекция мышц (Zelenin et al., 1997) и различные модификации перечисленных методов.

Среди генетических заболеваний мышц особое внимание уделяют мышечной дистрофии Дюшенна/Беккера. Лечение именно этого заболевания представляется наиболее вероятным с помощью "генной коррекции" мышечных волокон. Из-за мутаций одного из генов Х-хромосомы (названного геном дистрофина) в мышечных волокнах больных отсутствует структурный белок дистрофии. Введение "здорового" гена дистрофина в мышечные волокна больных и его экспрессия в них предположительно может способствовать исчезновению симптомов заболевания или предотвратить развитие мышечной дистрофии.

В этой связи актуальным является изучение механизмов переноса ДНК в клетки скелетных мышц, выяснение биологических процессов, сопутствующих и следующих за указанным переносом, исследование восприимчивости к трансфекции различных типов клеток в мышцах, изучение длительности экспрессии введенных

генов и условий, от которых она зависит, разработка эффективных, удобных и практичных методов трансфекции скелетных мышц.

Цель исследования. Целью данного исследования являлось осуществление трансфекции скелетных мышц мышей линии С57ВЬ здорового фенотипа и с мутацией тс1х (недостаток дистрофина) путем введения генетических конструкций, содержащими гены бактериальной р-галактозидазы и дистрофина человека, для определения оптимальных условий переноса генетического материала в скелетные мышцы мыши, обеспечивающих экспрессию введенных генов, сравнения эффективности, трудоемкости и травматичное™ различных методов введения генетического материала в скелетные мышцы мыши, изучения картины экспрессии введенных генов в трансфицированных мышцах, изучения возможности применения описанных методов трансфекции при лечении наследственных заболеваний скелетной мускулатуры.

Научная новизна работы. Впервые осуществлен перенос гена дистрофина в скелетные мышцы мутантных мышей С57ВЬ/10тс1х методом баллистической трансфекции. Успешный перенос и экспрессия гена подтверждена методами иммуногистохимии. Впервые показано присутствие продукта введенного гена р-галактозидазы в мышечных волокнах на сроках, превышающих 9 суток после баллистической трансфекции. Подробно изучено изменение количества мышечных волокон, содержащих чужеродные белки — продукты введенных генов — с течением времени после баллистической трансфекции.

Научно-практическое значение работы. Показано, что разработанный метод баллистической трансфекции мышц может успешно применяться в экспериментах по переносу генов в мышечные волокна млекопитающих. В частности, являясь одним из наиболее эффективных методов трансфекции мышц, может быть использован для разработки методов генетической терапии мышечной дистрофии Дюшенна.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международных научных симпозиумах (Москва -1994, Анкара - 1995, Нью-Йорк - 1996), систематически обсуждались на семинарах Кафедры эмбриологии МГУ и Лаборатории функциональной морфологии хромосом Института молекулярной биологии РАН.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 3 статьи в научных журналах, 1 статья принята к печати и будет опубликована в 1998 году.

Структура работы. Материалы диссертации изложены на 116 страницах машинописного текста и сгруппированы в следующие разделы: введение, обзор литературы, описание использованных методов, изложение результатов, статистическая обработка результатов, обсуждение результатов и выводы. Работа проиллюстрирована 14 рисунками и 4 таблицами.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проводили на самцах лабораторных мышей (Mus musculus) линий C57BL/6 и C57BL/10 с мутацией mdx (muscular dystrophy X-chromosome-linked). Трансфекции подвергали поверхностную и среднюю ягодичные и четырехглавую мышцы. Ген Р-галактозидазы вводили в составе плазм иды pSV-p-galactosidase (Promega), ген дистрофина человека вводили в составе плазмиды pDMD, в качестве контрольной использовали плазмиду pGEM-7Zf(+). Постановка и обработка методики экспериментальных исследований по введению pSV-P-gal проводились под руководством доцента Кафедры эмбриологии, к.б.н. М.Л. Семеновой, также принимавшей участие в обработке и интерпретации полученных результатов. Перенос генов осуществляли методами баллистической трансфекции, внутримышечной инъекции раствора ДНК, инъекции ДНК в комплексе с липидами (фосфатидилхолин / стеариламин / холестерол) - липофекцией. Эксперименты с геном дистрофина человека осуществляли совместно с Лабораторией пренатальной диагностики Института акушерства и гинекологии РАМН (С-Пб). Эксперименты с липофекцией проводили совместно с Лабораторией генной терапии Института биологической и медицинской химии РАМН (Москва). При любом способе трансфекции мышь наркотизировали, обрабатываемую мышцу открывали, производя разрез кожи.

Баллистическую трансфекцию проводили, применяя ускоритель металлических микрочастиц, сконструированный в Лаборатории функциональной морфологии хромосом Института молекулярной биологии РАН (Колесников и др., 1988). Для

переноса ДНК использовали смесь микрочастиц вольфрама (ё=7,5+0,5мкм) и золота (ё=1,6+0,1мкм) в массовом соотношении 4:1. ДНК на микрочастицы осаждали кальций-фосфатным методом. Микрочастицы с ДНК помещали на пластиковый пыж, которому придавали высокую скорость за счет взрыва гремучей ртути. Летящий пыж задерживало стопорное кольцо, расположенное в конце ствола ускорителя, а микрочастицы с ДНК на большой скорости проникали в оперируемую мышцу мыши. В каждом "выстреле" использовали по 10 мг частиц, на которые осаждали 10 мкгДНК.

Внутримышечную инъекцию ДНК осуществляли в виде водного раствора и в виде эмульсии липосом с ДНК. Водный раствор ДНК вводили шприцом в объеме 50 мкл с концентрацией ДНК 0,2 мкг/мкл (по 10 мкг ДНК на укол). Водную эмульсию липосом также вводили в объеме 50 мкл с массовой концентрацией ДНК 0,2 мкг/мкл (по 10 мкг ДНК на укол). Липосомы, включающие фосфатидилхолин, стеариламин и холестерол в массовом соотношении 7:2:1, формировали методом экструзии водной дисперсии липидов через двойную поликарбонатную мембрану с диаметром пор 200 нм. ДНК с липосомами инкубировали 30 мин в присутствии ионов (50тМ) в буфере, содержащем ЮмМ ЫаС1, ЮмМ трис-НС1, рН7,2.

Присутствие чужеродных белков изучали на замороженных и парафиновых срезах трансфицированных мышц. Наличие (3-галактозидазы исследовали через 3, 9, 21, 33, 90 и 180 суток после введения гена. Наличие дистрофина исследовали через 3, 17 и 60 суток после введения гена. Р-галактоз ид азу выявляли, проводя цветную индигогенную реакцию (ферментативное расщепление субстрата "Х-гал" с высвобождением красителя индиго). Дистрофии выявляли иммунными реагентами с флуоресцентной (ФИТЦ) и ферментной (пероксидаза хрена) метками.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Травматичность методов трансфекции. Все успешные методы трансфекции мышц оказали травмирующее действие на ткань. Однако существуют отличия в картине деструктивных изменений мышц после различных методов введения ДНК. Так через 3 суток после введения водного раствора ДНК в мышце

обнаруживали области разрушающихся мышечных волокон и области, где встречали одноядерные клетки; в местах дегенерации было большое скопление лизосом; пораженные участей имели неправильную форму и, видимо, соответствовали областям проникновения раствора ДНК между мышечными пучками. После проникновения металлических микрочастиц в мышечную ткань повреждения носили неглубокий, поверхностный характер, отсутствовали дегенерирующие мышечные волокна, а вся область регенерации была заполнена одноядерными (миогенными и немиогенными) клетками; область повреждения строго соответствовала области проникновения микрочастиц в мышцу. В липофицированных мышцах область повреждения была не так обширна, как после введения водного раствора ДНК; картина дегенерации и регенерации мышечных волокон была схожей.

Между успехом трансфекции и травмированием мышцы прослеживается связь. Так введение водного раствора ДНК (повреждение мышцы) обеспечивает достоверно более эффективный перенос плазмиды по сравнению с введением раствора ДНК на фосфатно-солевом буфере (без повреждения мышцы). Кроме того, на гистологических срезах генетически измененные (окрашенные) волокна часто располагаются в непосредственной близости от распадающихся волокон и размножающихся промиобластов (см. рис. 1а).

Эффективность методов трансфекции. Под

эффективностью метода трансфекции мышцы понимали вероятность присутствия продукта введенного гена в мышечных волокнах обработанной мышцы через определенное время после переноса данного гена. Эффективность различных методов изучали на мышах линии С57ВЬ/6, в ягодичные мышцы которых вводили плазмиду с геном бактериальной (3-галактозидазы. Были проверены методы баллистической трансфекции, внутримышечной инъекции раствора ДНК, инъекции ДНК в комплексе с липидами (см. выше), а также инъекции раствора ДНК на фосфатно-солевом буфере и внутримышечного введения плазмиды в виде нерастворимой кальциевой соли ДНК.

Результаты экспериментов показали, что вероятность появления в мышечной ткани бактериальной р-галактозидазы — продукта введенного гена — зависит от метода введения ДНК.

Наибольшую эффективность демонстрировал метод баллистической трансфекции — в 9 случаях из 16 в обработанных мышцах был обнаружен продукт введенного гена, менее эффективны оказались метод внутримышечной инъекции ДНК (3/19) и метод липофекции (2/10). Большая эффективность баллистической трансфекции подтверждена статистически: с вероятностью ошибки 5% можно утверждать, что доверительный интервал для вероятности успешного переноса и экспресии гена Р-галактозидазы в мышце после баллистического введения лежит в границах 33-77%, после инъекции раствора — 6-38%, после липофекции — 6-51%.

Попытки повысить результативность трансфекции, инъецируя в мышцу не чистый водный раствор ДНК, а раствор ДНК в фосфатно-солевом буфере и коллоидный раствор кальциевой соли ДНК, не привели к успеху; напротив, ни одного успешного случая трансфекции обнаружено не было.

Продолжительность присутствия продукта введенного гена в мышцах. Продолжительность сохранения продуктов введенных генов в мышечных волокнах изучали в экспериментах на мышах линий С57ВЬ/6 и С57ВЬ/10тс1х. Перенос генов Р-галактозидазы и дистрофина осуществляли с помощью баллистической трансфекции. В случае введения гена Р~ галактозидазы регистрировали присутствие или отсутствие чужеродного белка в целой мышце; в случае введения гена дистрофина подсчитывали количество мышечных волокон с чужеродным белком. Присутствие продуктов интродуцированных генов изучали через определенные промежутки (см. выше, также таблицу).

Количество мышей с чужеродной р-галактозидазой в трансфицированных мышцах достоверно не изменялось через 3 и 9 суток после переноса гена. На более продолжительных сроках Р-галактозидаза в обработанной мышце была обнаружена лишь в одном случае из 16 в органе, отпрепарированном через 3 месяца после введения гена (см. рис. 16). Таким образом, вероятность обнаружить продукт гена р-галактозидазы в мышце спустя 21 сутки после трансфекции достоверно ниже, чем в первые 9 дней после переноса ДНК. Все мышечные волокна нормальных немутангных мышей содержат дистрофии, что было подтверждено в контрольном

А

Волокна, содержащие

- . ' Т4^^ р-галактозидазу.

г

*>. « А; '.—'-"•У-.' у-:-': — '■ ! •_Область дегенери-

*" • '• рующих волокон • .....-г', * ;: \.> .

Рисунок 1. Ягодичная мышца мыши через 3 (А) и 90 (Б) суток после переноса гена бактериальной р-галактозидазы. Мышечные волокна, содержащие р-галактозидазу, после специальной обработки приобретают синюю (темную) окраску.

А: Гистологический срез мышцы (докрашен эозином). Генетически измененные мышечные волокна прилегают к области дегенерации мышечных волокон. (Увеличено в 50 раз).

Б: Тотальный препарат мышцы. Генетически измененные мышечные волокна располагаются рядом, образуя окрашенную область. (Увеличено в 10 раз).

эксперименте на мышах линии C57BL/10 (см. рис.2а). Мышечные волокна мышей линии C57BL/10 с мутацией mdx (нарушение гена дистрофина) не содержат дистрофии, за исключением небольшого количества так называемых "ревертантных" волокон, синтез дистрофина в которых происходит, видимо, за счет обратной мутации гена (см. рис.2б). В контрольном эксперименте было показано, что доля "ревертантных" волокон от общего числа мышечных волокон в четырехглавой мышце бедра у мышей с мутацией mdx равна 0,1-0.7%. После баллистического переноса гена дистрофина в мышцы мышей mdx доля мышечных волокон с дистрофином достоверно увеличивалась (см. рис.2в, также таблицу). Данные, приведенные в таблице, отражают доли мышечных волокон, в которых дистрофии располагался по периферии симпласта, то есть занимал естественное "субсарколеммное"

Среднее значение и границы доверительного интервала (а=0,1) для доли мышечных волокон, содержащих дистрофин, в мышцах мышей тс!х.

Группа Средн. значение долей % Доверит. интервал %

нет переноса 0,4 0,1-0,7

3 суток после переноса рБМО 1,8 0,0 - 6,2

17 суток после переноса рБМЭ 2,5 1,2-3,8

60 суток после переноса рБМБ 3,4 1,6 - 5,2

17 суток после переноса рБУ-Р^а! 0,4 -

Рисунок 2. Поперечные гистологические срезы четырехглавой мышцы бедра мыши, обработанные I антителами кролика против дистрофина и II антителами овцы, конъюгированными с ФИТЦ. Фотографии получены с помощью люминесцентного микроскопа. А: Мышь нормального фенотипа; дистрофии присутствует во всех мышечных волокнах и занимает в них периферическое положение. Б: Мышь с мутацией гпс1х (мышечная дистрофия); дистрофии в мышечных волокнах отсутствует, за исключением небольшого числа «ревертантных» волокон (расположено в верхней части снимка).

В: Мышь с мутацией шёх через 2 месяца после баллистического переноса гена дистрофина. В части мышечных волокон присутствует дистрофии.

положение. Количество таких волокон в трансфицированных мышцах с течением времени увеличивалось. Кроме того, были обнаружены мышечные волокна с ненормальным расположением дистрофика по всему объему миосимпласта. Количество таких волокон с течением времени уменьшалось.

Характер расположения генетически измененных мышечных волокон. Различить на гистологических срезах мышц область проникновения ДНК при трансфекции трудно. Некоторым ориентиром при этом могут служить дегенерирующие мышечные волокна и скопления одноядерных клеток, сопутствующие де- и регенерационным процессам. Кроме того, после баллистической трансфекции в мышечной ткани остаются металлические микрочастицы, видимые в световой микроскоп. Судя по этим признакам, при введении препаратов ДНК шприцом плазмида распространяется по большему объему мышцы, чем при введении ДНК на микрочастицах. Большая часть микрочастиц не проникает в мышцу глубже 100 мкм, в этой области мышечные волокна полностью разрушаются, вместо них располагаются одноядерные клетки. Дальше по отношению к движению потока частиц после выстрела (100-200 мкм), по мере уменьшения плотности проникших частиц, наряду с одноядерными клетками встречались целые мышечные волокна, внутри части из них присутствовали проникшие микрочастицы. Глубже от поверхности (300-1000 мкм) находили область, в которой деструктивные изменения были минимальны и присутствовали отдельные микрочастицы (в мышечных волокнах). Глубже 1000 мкм микрочастицы проникали крайне редко. Обычно окрашенные мышечные волокна, содержащие продукты введенных генов, обнаруживали в зоне, где поток проникающих в ткань микрочастиц был не очень плотным. Однако связь между локализацией проникших в мышцу частиц и расположением генетически измененных волокон прослеживается нечетко. Встречаются окрашенные на р-галактозидазу волокна без видимых в световой микроскоп микрочастиц, в то же время многие мышечные волокна, в которые проникли частицы, не окрашены в синий цвет. Кроме того, мышечные волокна с р-галактозидазой, нередко располагались в толще мышцы, далее 1000 мкм от ее поверхности.

Мышечные волокна, содержащие чужеродные белки — продукты введенных генов — часто располагались группами, непосредственно соприкасаясь друг с другом (см. рисунки). Наблюдалась тенденция к увеличению количества таких волокон в группах с течением времени после трансфекции; так некоторые мышечные волокна, содержащие Р-галактозидазу, в течении первых 9 суток после баллистической трансфекции образовывали группы по 4-5 штук, спустя 3 месяца была обнаружена окрашенная область ткани, содержащая около 25 генетически измененных мышечных волокон. Подобное же явление было характерно и для мышечных волокон с экспрессией введенного гена дистрофина.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Проникновение генетических конструкций в клетку.

Механизм прохождения ДНК в ядра мышечных волокон достоверно неизвестен. Вероятно, пути проникновения ДНК при различных методах трансфекции различны. На это указывает различная эффективность разных методов трансфекции мышц.

Относительно проникновения ДНК в мышечные волокна при баллистической трансфекции можно высказать несколько предположений. Исходной теоретической базой для этого метода являлась гипотеза, что металлические микрочастицы с осажденной ДНК способны проникать в клетки, проходя сквозь мембраны за счет своей большой скорости. Действительное проникновение микрочастиц в мышечные волокна подтверждено изучением гистологических срезов скелетных мышц (а ранее показано для многих других типов клеток). Однако фактические данные о том, что ДНК проникает в клетки именно с микрочастицами, отсутствуют. Нельзя отрицать, что ДНК отсоединяется от микрочастиц во время движения их сквозь мышечную ткань. На гистологических срезах обнаружены мышечные волокна, содержащие чужеродный белок, но не содержащие микрочастиц. Впрочем, возможно, механизм проникновения ДНК в такие мышечные волокна был иным.

В качестве одной из неподтвержденных гипотез, объясняющих механизм проникновения ДНК в мышечные волокна может быть предложена следующая: часта мышечных волокон захватывает металлические микрочастицы с ДНК за счет неспецифического

эндоцитоза, подобно тому, как это происходит с клетками в культуре при их трансфекции кальций-фосфатным методом (Щелкунов, 1986).

Также нельзя исключить возможность проникновения ДНК в мышечные клетки через повреждения в сарколемме, вызванные прохождением микрочастиц. Косвенным подтверждением тому может служить тот факт, что многие генетически модифицированные волокна являются сохранившимися волокнами среди разрушенных, то есть, возможно, это волокна, лежавшие на пути прохождения большого количества микрочастиц, сумевшие сохраниться после разрушительного воздействия, в то время как большинство прочих волокон этой области дегенерировало. Но существуют аргументы против высказанной гипотезы: локализация измененных мышечных волокон в области дегенерации характерна и для методов инъекции водного раствора ДНК и для метода липофекции (в данном случае введение комплекса ДНК/фосфатидилхолин/стеариламин/холестерол), кроме того, трансфекция микрочастицами без ДНК ткани, покрытой раствором ДНК, не является успешной.

Возможны два пути генетической модификации мышечных волокон при баллистическом методе: путем непосредственного переноса ДНК в ядра мышечных волокон и путем слияния трансфицированных клеток-сателлитов. Эти механизмы не исключают друг друга, напротив, вероятно происходят оба процесса; но неизвестно насколько значителен вклад каждого из способов в образование генетически измененных мышечных волокон.

В пользу гипотезы о непосредственном переносе ДНК в мышечные волокна говорит то, что чужеродные белки обнаруживаются в них уже спустя 3 суток. Этого времени недостаточно для образования нового мышечного волокна из клеток-предшественников, для этого нужно 3-4 недели. Кроме того, как уже неоднократно было отмечено, такие модифицированные волокна спустя трое суток после трансфекции представляются единичными уцелевшми волокнами в области некроза и регенерации, вызванных массивным проникновением микрочастиц. То есть в них очевидно попали микрочастицы, но эти волокна не подверглись дегенерации и в них появились чужеродные белки.

В пользу гипотезы об участии клеток-сателлитов в генетической модификации мышечных волокон говорит следующее. Генетически измененные волокна имеют тенденцию располагаться группами, непосредственно соприкасаясь друг с другом; причем, чем больше срок исследования после трансфекции, тем больше генетически измененных волокон составляют группу (см. выше). Такая характеристика расположения измененных волокон может быть объяснена тем, что перенос ДНК произошел в клетки-сателлиты (миосателлитоциты), которые после травмирования мышцы "выстрелом" перешли в активное состояние, то есть преобразовались в промиобласты. В ходе регенерации промиобласты размножаются, поэтому в случае успешного переноса плазмиды хотя бы в одну клетку-спутник, возможно появление целой группы генетически измененных промиобластов. Измененные миобласты, соединяясь друг с другом и с другими популяциями миобластов, могут образовать как одно, так и несколько мышечных волокон, расположенных рядом. Соединение миобластов — процесс, растянутый во времени. Соединяются друг с другом не только миобласты, но также миобласты и миотубы. Поэтому со временем число модифицированных волокон, расположенных рядом может возрастать. Появление генетически измененных мышечных волокон через трое суток после трансфекции также можно объяснить слиянием трансфицированных меток-сателлитов с мышечными волокнами. Подобное слияние допускают некоторые авторы (Каг^апеп, 1995), другие отрицают (МсСопшск, 1992).

Генетическая модификация мышечных волокон после внутримышечной инъекции водного раствора соответствующей плазмиды — факт мировой наукой необъясненный. При внутримышечном введении водных растворов препаратов они прежде всего оказываются в межклеточном пространстве мышечной ткани, откуда ДНК каким-то образом проникает внутрь мышечных волокон. Неизвестно, существует ли некий биологический смысл в таком проникновении, или же перенос ДНК осуществляется как побочное явление каких-либо процессов, либо мышечным клеткам вообще свойственен неспецифический эндоцитоз макроанионов. Остается открытым вопрос, почему именно мышечные клетки столь легко усваивают чужеродный генетический материал.

Хотя хорошо обоснованных ответов на эти вопросы дать, исходя из имеющихся данных, невозможно, есть основания предполагать, что проникновение ДНК связано с процессами де- и регенерации мышц. В пользу этого предположения говорят как результаты данного исследования, так и работы ряда авторов (Davis et al., 1993а; 1993b; 1995; Takeshita et al., 1996). В этих работах показано (но статистически не доказано), что трансфекция регенерирующей ткани эффективнее. Если трансфекция действительно связана с происходящими де- или регенерацией мышц, то возможно предположить два варианта: 1) перенос ДНК непосредственно в мышечные волокна происходит через повреждения в сарколемме; 2) проникновение ДНК происходит в предшественники мышечных волокон. Возможно, перенос плазмиды в предшественники осуществляется на стадии активации клеток-спутников. Переход этих клеток в активное состояние сопровождается, в том числе, увеличением объема цитоплазмы посредством образования многочисленных пиноцитозных пузырьков (Клишов, 1981). Возможно, ДНК проникает в эти клетки в процессе неспецифического эндоцитоза.

Посредством эндоцитоза возможно проникновение ДНК также в поврежденные волокна, поскольку для поврежденных мышечных волокон характерана фрагментация, почкование и образование эндоцитозных пузырьков (что впрочем, как правило, является предвестником их гибели) (Дмитриева, 1975; Naidoo, 1992, 1993).

Перенос генов в клетки при помощи комплексов ДНК/липиды теоретически может происходить за счет встраивания липофильной компоненты таких комплексов в цитоплазматическую мембрану клеток. После присоединения комплексов к внешней мембране клетки связи внутри них могут измениться и ДНК отсоединится во вне- или внутриклеточный матрикс. Тем не менее, есть основания предполагать, что в опытах по липофекции мышц, описанных в данном труде, механизм трансфекции был иным. Как и после баллистической трансфекции и после инъекции водного раствора ДНК, после внутримышечного введения коллоидного раствора комплекса ДНК/липиды расположение генетически измененных мышечных волокон ассоциировалось с областями регенерации мышц. Эффективность переноса плазмиды с помощью липофекции

достоверно не отличалась от эффективности переноса после введения раствора ДНК. Поэтому можно предположить, что комплекс ДНКУфосфатидилхолин/стеариламин/холестерол, попадая в межклеточную жидкость, разружается с высвобождением свободной плазмиды, которая затем переносится в клетки тем же путем, что и при введении водного раствора ДНК. Разумеется, разрушение коплекса — процесс обратимый и происходит до определенной, неустановленной точки равновесия. Нельзя исключить и тот случай, что комплекс ДНК/липиды проникает в клетки при эндоцитозе.

Экспрессия иитродуцируемых генов. Экспрессия введенных генов в клетках возможна в случаях, если они находятся в составе транскрибируемых участков хромосом, либо в составе автономно-транскрибируемых эписом. Вводимые в описываемой работе плазмиды способны к автономной транскрипции, но не способны к репликации в эукариотеческой клетке. Подобная "внехромосомная" экспрессия введенных генов может носить лишь временный характер, так как чужеродная ДНК вне хромосом уничтожается клеткой. Напротив, экспрессия генов, вошедших в состав хромосом, может быть длительной.

На основании полученных результатов невозможно дать точный ответ, в каком состоянии находились введенные гены в мышечных волокнах: в хромосомном или внехромосомном. Исходя из результатов с баллистическим введением плазмиды рБУ-Р-^а! в мышцы, когда в первые 9 суток после трансфекции частота появления мышц с волокнами, содержащими р-галактозидазу, составляла 56%, а в период от 3 недель до 3 месяцев — только 7%, можно предположить, что в основном экспрессия генов, наблюдающаяся в первое время, происходит с внехромосомных плазмид (временная экспрессия); длительное же присутствие Р~ галактозидазы в мышцах обусловлено экспрессией гена 1асг, встроившегося в хромосому.

В пользу такого предположения говорит и тот факт, что мышечные волокна, содержащие р-галактозидазу через 90 суток и содержащие дистрофии через 60 суток, располагались большими группами (см. выше). Таким образом, можно предположить, что эти волокна произошли от единого клона миобластов, которому дала начало трансфицированная клетка-предшественник. В ходе

многочисленных митотических делений свободная плазмида должна была бы "потеряться" (по крайней мере у части потомков) и единая группа генетически измененных волокон не могла бы образоваться. Напротив, многочисленные митозы и предшествующая репликация ДНК благоприятны для интеграции введенного гена в хромосомы (Уотсон, 1986; Макарова и др., 1988).

Таким образом, введенные генетические конструкции присутствуют в мышечных клетках, вероятно, как в свободном, так и в интегрированном состояниях. В первом случае экспрессия введенных генов встречается чаще, носит временный характер; во втором случае экспрессия встречается реже и длится дольше. По-видимому, интеграция введенных генов чаще происходит при попадании чужеродной ДНК в клетки-предшественники мышечных волокон.

ВЫВОДЫ

1) Введение в скелетные мышцы мыши линии С57ВЬ/61 гена Р-галактозидазы в составе вектора 8У-Р~§а1 приводит к появлению в мышечных волокнах продукта этого гена.

2) Вероятность появления чужеродного белка в мышечной ткани зависит от метода введения ДНК в ткань. При введении гена методом баллистической трансфекции вероятность появления продукта введенного гена выше, чем при введении методами внутримышечной инъекции водного раствора ДНК, раствора ДНК на фосфатно-солевом буфере или коллоидного раствора комплекса ДНК/фосфатидилхолин/стеариламин/холестерол.

3) С течением времени после трансфекции количество мышечных волокон, содержащих чужеродный белок р-галактозидазу, уменьшается. Максимальный срок существования генетически измененных волокон, который был зафиксирован, — три месяца после баллистической трансфекции.

4) Введение гена дистрофина человека в составе вектора рОМО методом баллистической трансфекции в мышцы мышей с недостатком дистрофина (линия тс1х) приводит к увеличению количества мышечных волокон, содержащих дистрофии, в трансфицированной мышце в среднем в 8,5 раз.

5) С течением времени после баллистической трансфекции количество мышечных волокон, содержащих дистрофии, увеличивается.

6) Исследованные методы трансфекции мышц оказывают повреждающее действие на ткань. Мышечные волокна, содержащие продукты введенных генов, чаще встречаются в области регенерации мышц.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Зеленин А.В., Колесников В.А., Алимов А.А., Зеленина И.А., Семенова М.Л., Шафеи Р.А. Баллистическая трансфекция и генетическая трансформация клеток животных in vitro and in vivo / Межд. Симпозиум «Механизмы развития...» // Онтогенез. 1994. V.25. N4. Р.88-90.

2. Колесников В.А., Зеленина И.А., Семенова М.Л., Шафеи Р., Зеленин А.В. Баллистическая трансфекция клеток млекопитающих in vivo // Онтогенез. 1995 Т.26 N6. С. 276-280.

3. Shafei R.A., Semenova M.L., Zelenina I.A., Kovalenko D.V., Kolesnikov V.A., Zelenin A.V. Expression in mouse skeletal muscles of bacterial beta-galactozidase gene introduced by ballistic transfection / Euroasian symposium on current trends in biotechnology // Karadeniz Journal of Medical Sciences. 1995. V.8, P. 244.

4. Kovalenko D.V., Shafei R.A., Zelenina I.A., Semenova M.L., Zhdanov R.I. Comparison of different methods of DNA-transfection in vivo using techniques of direct injection in muscles of mouse / Euroasian symposium on current trends in biotechnology // Karadeniz Journal of Medical Sciences. 1995. V.8. P. 238-239.

5. Коваленко Д.В., Шафеи P.A., Зеленина И.А., Семенова М.Л., Самуилова О.В., Жданов Р.И. Металлонуклеолипосомные комплексы как средство доставки генов в скелетные мышцы мыши in vivo. // Генетика. 1996. Т.32, N 9, С.1299-1301.

6. Zelenin A.V., Shafei R.A., Semenova M.L., Zelenina I.A., Kovalenko D.V., Kolesnikov V.A. Beta-galactozidase gene is expressed in mouse skeletal muscles after ballistic transfection / Cold Spring Harbor Lab. Meetingon Gene Therapy // Abstracts of papers 1996, P. 345.

7. Шафеи P.A., Коваленко Д.В., Семенова M.JI. Промотор-специфическая экспрессия гена LacZ в скелетной мышце мыши, введенного методом высокоскоростной баллистической трансфекции / "Молодежь и наука — третье тысячелетие" ("YSTM") // Сборник тезисов. 1996.

8. Zeleniп A.V., Kolesnikov V.A., Tarasenko O.A., Shafei R.A., Zelenina I.A Mikhailov V.M., Semenova M.L., Kovalenko D.V., Artemyeva O.A., Ivaschenko Т.Е., Evgrafov O.V., Dickson G., Baranov V.S. Bacterial в-galactosidase and human dystrophin genes are expressed in mouse skeletal muscle fibers after ballistic transfection // FEBS lett. 1997. V.414, P.319-322.

9. Зеленин A.B., Тарасенко O.B., Колесников B.M., Михайлов В.М., Киселев A.B., Баранов А.Н., Зеленина И.А., Шафеи Р.А, Иващенко Т.Э., Евграфов О.В., Артемьева О.В., Кащеева Т.К., Диксон Дж., Баранов B.C. Экспрессия гена дистрофина человека в скелетных мышцах мышей mdx после баллистической трансфекции // Генетика. 1998. Т.32. N.6. Принято к печати.

10. Михайлов В.М., Зеленин A.B., Колесников В.М., Штейн Г.И., Тарасенко А.О., Шафеи P.A., Киселев A.B., Баранов А.Н., Зеленина И.А., Иващенко Т.Э., Евграфов О.В., Артемьева О.В., Кащеева Т.К., Диксон Дж., Баранов B.C. Влияние экспрессии кДНК гена дистрофина человека на дифференцировку мышечных волокон мышей mdx после баллистической трансфекции // Цитология. 1998. Принято к печати.