Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование терапевтического эффекта совместной экспрессии генов цитозиндезаминазы и урацилфосфорибозилтрансферазы в опухолях

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование терапевтического эффекта совместной экспрессии генов цитозиндезаминазы и урацилфосфорибозилтрансферазы в опухолях"

Учреждение Российской академии наук Институт биоорганичсской химии им. академиков ММ. Шемякина и Ю.Л. Овчинникова

На правах рукописи

005002332

Кузьмин Денис Владимирович

ИССЛЕДОВАНИЕ ТЕРАПЕВТИЧЕСКОГО ЭФФЕКТА СОВМЕСТНОЙ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ЦИТОЗИНДЕЗАМИНАЗЫ И УРАЦИЛФОСФОРИБОЗИЛТРАНСФЕРАЗЫ В ОПУХОЛЯХ

03.01.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук ^ 7 НОЯ 2011

Научный руководитель к. б. н., с.н.с., Виноградова Т.В.

Москва 2011

005002332

Работа выполнена в лаборатории структуры и функций генов человека Учреждения Российской академии наук Института бноорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, Виноградова Т.В. Официальные оппоненты:

Лебедев Ю.Б., доктор биологических паук, Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН. Эльдаров М.А., кандидат биологических наук, Учреждение Российской академии наук Центр "Биоинжененерия" РАН.

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт биологии гена РАН.

Защита состоится «30» ноября 2011 г. в «....» часов на заседании Специализированного Совета Д002.019.01 при Учреждении Российской академии наук Институте бноорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова по адресу: 117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая 16/10.

С текстом диссертации можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова.

Автореферат разослан «28» октября 2011г.

Ученый секретарь Специализированного Совета,

доктор физ.-мат. наук

В.А. Олейников

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

По прогнозам ВОЗ заболеваемость и смертность, обусловленные онкологическими заболеваниями, во всем мире возрастут в 2 раза за период с 1999 года по 2020 год: с 10 до 20 млн. новых случаев и с 6 до 12 млн. регистрируемых смертей. В России онкологические заболевания уносят более 250 000 человек в год, рак диагностируется более чем у 500 000 ее граждан ежегодно. Несмотря на развитие и совершенствование традиционных подходов к лечению онкологических заболеваний, проблема лечения большинства форм рака остается чрезвычайно актуальной и весьма далекой от решения.

Одним из наиболее перспективных подходов к лечению онкологических заболеваний является генотерапия, которая основывается на введении терапевтических генно-инженерных конструкций в опухолевые клетки человека. Генотерапия объединяет в себе два различных терапевтических подхода: таргетную генотерапию и генную хирургию. Под таргетной генотерапией подразумевается введение генетического материала, продукт экспрессии которого приводит к устранению одной или нескольких «молекулярных причин», приведших к превращению нормальной клетки в опухолевую, например, супрессия активированных онкогенов, восстановление функциональной активности генов-супрессоров опухоли, индукция апоптоза в раковых клетках. В силу высокой специфичности таргетных генотерапевтических препаратов их воздействие всегда будет ограничено определенным типом опухоли, внутриопухолевой гетерогенностью клеток и индивидуальными генетическими особенностями пациента.

В случае генной хирургии продукт экспрессии доставляемого в клетку генетического материала прямо или опосредовано приводит к гибели всех опухолевых клеток, независимо от их индивидуальных особенностей, так как действие генной хирургии направлено на некоторое общее для всех раковых клеток свойство: высокий митотический потенциал, активный ангиогенез и др.

Генная хирургия включает два независимых подхода: терапия онколитическими вирусами и терапия генами суицидального воздействия. Среди генов суицидального воздействия наиболее перспективными с точки зрения противоопухолевой терапии являются гены, продукты экспрессии которых способны конвертировать нетоксичное пролекарство в токсичный для раковой клетки метаболит. Использование таких генов лежит в основе генетически направленной фермент/пролекарство терапии (GDEPT, Gene-Directed Enzyme Prodrug) опухолей. Наиболее перспективными являются системы GDEPT, основанные на введении в опухолевые клетки гена, превращающего внутри них нетоксичное пролекарство в токсичный агент, способный диффундировать в соседние клетки, убивая их при условии, что

они быстро реплицируются. Это явление получило название «эффект свидетеля» («bystander effect»). Для некоторых систем GDEPT, обладающих «эффектом свидетеля», было показано, что достаточно трансфицировать 10% клеток, чтобы вызвать полную резорбцию опухоли.

Среди множества созданных на сегодняшний день систем GDEPT одной из наиболее перспективных является система на основе цитозиндезаминазы (FCY1) и 5-фторцитозина (5-FC). Было показано, что FCY1 способен катализировать реакцию дезаминирования 5-FC, в результате чего образуется токсичное соединение 5-фторурацил (5-FU) (Elbs, Regulier et al. 2000). 5-FU ингибирует процесс деления клеток, препятствуя синтезу ДНК и сплайсингу РНК, и является стандартным антиметаболитом для химиотерапии широкого спектра опухолей. Использование системы FCT7/5-FC позволит существенно снизить побочную токсичность 5-FU, так как образование и накопление антиметаболита происходит строго внутри опухолевых клеток.

С терапевтической точки зрения преимуществом системы FCYU5-FC является то, что «эффект свидетеля» не зависит от наличия межклеточных контактов (Dachs, Hunt et al. 2009) и действие системы FCYU 5-FC направлено как на делящиеся, так и на неделящиеся опухолевые клетки.

Выполнение настоящей работы было стимулировано необходимостью создания эффективной GDEPT системы для дальнейшего внедрения в клинику. Были созданы и охарактеризованы по цитотоксическому эффекту системы FCYI/5-FC, подходящие для уничтожения клеток злокачественной меланомы и герминогенного рака яичек человека, а также система, которая может работать в широком спектре опухолевых клеток. Было показано, что 5% клеток, экспрессирующих суицидальный ген, достаточно, чтобы вызывать гибель более 80% клеток опухоли.

Таким образом, высокий терапевтический потенциал созданных GDEPT систем на основе FCUU5-FC позволяет надеяться на использование их в медицинской практике. Цель работы

Целью диссертационной работы было создание генно-инженерных конструкций, несущих гибридный ген FCU1, состоящий из генов цитозиндезаминазы и урацилфосфорибозилтрансферазы дрожжей, под контролем различных опухолеспецифических промоторов, и исследование циготоксического эффекта созданных экспрессионных конструкций на опухолевых клетках разного происхождения.

В ходе работы были решены следующие задачи:

1. Созданы экспрессионные конструкции, содержащие гибридный ген цитозиндезаминазы/урацилфосфорибозилтрансферазы (FCU1) под контролем различных

промоторов: промотора цитомегаповируса (CMV), промотора гена BIRC5, промотора гена NDUFV1, промоторов гена MIA человека и гена тирозиназы (Туг) мыши.

2. Проведена оценка эффективности и специфичности цитотоксического действия экспрессионных конструкций, содержащих ген FCU1 под контролем различных опухолеспецифичных промоторов, в присутствии 5-FC на опухолевые клетки.

3. Создана модифицированная система Cre-LoxP для усиления цитотоксического эффекта экспрессионных конструкций, несущих суицидальный ген FCUI.

4. В экспериментах in vitro проведена оценка «эффекта свидетеля» в системе FCUIÍ5-

FC.

Научная новизна и практическая значимость работы

Работа была выполнена в рамках НИР «Разработка терапевтических противоопухолевых средств на основе генно-терапевтического подхода».

Настоящая работа была направлена на создание GDEPT системы на основе гибридного гена FCUI с перспективой её использования в качестве основы для генно-терапевтичееких противораковых препаратов нового поколения, что и определяет практическую значимость работы.

Были создана GDEPT система, позволяющая направленно уничтожать опухолевые клетки меланомы. Был охарактеризован не описанный ранее регуляторный элемент, высоко активный в клетках герминогенного рака яичка и с его использованием создана GDEPT система, позволяющая направленно уничтожать клетки герминогенного рака яичек. Продемонстрирован высокий цитотоксический эффект созданных систем.

Также на основе гибридного гена FCU1 и промотора гена B1RC5 была создана GDEPT система, работающая в широком спектре опухолей. Впервые был исследован цитотоксический эффект такой системы на опухолевых клетках различного происхождения и показано, что использование этой системы при совместной обработке 5-FC индуцирует р53-зависимую гибель более 70% опухолевых клеток.

Для усиления цитопатического эффекта созданной системы впервые была использована модифицированная бинарная система векторов Cre-LoxP. Было показано, что бинарная терапевтическая система векторов увеличивает чувствительность опухолевых клеток к 5-FC. При этом профиль специфичности экспрессии терапевтического гена определялся специфичностью промотора гена BIRC5.

На модели клеточных линий показано, что 5% клеток, экспрессирующих ген FCUI, достаточно для того, чтобы вызвать гибель 80% опухолевых клеток. Были подобраны оптимальные условия использования созданной терапевтической системы, что необходимо для проведения экспериментов на моделях животных.

Было продемонстрировано, что различия в величине «эффекта свидетеля» коррелируют с различиями в чувствительности клеток к основным метаболитам 5-FC и 5-FU. Полученные результаты имеют не только практическую значимость, но и позволяют понять механизмы внутриклеточного метаболизма 5-FC, а также биохимические процессы, лежащие в основе «эффекта свидетеля», опосредованного системой FCU115-FC. Апробация работы

Результаты работы были представлены на российских и международных конференциях: Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 2010); VI Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2011), 15-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2011). Объём работы

Диссертационная работа изложена на страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, основных выводов и списка литературы из наименований. Диссертация содержит таблицы и рисунков. Публикации

По теме диссертационной работы опубликовано 2 статьи в зарубежных научных журналах. Результаты работы были представлены на российских и международных конференциях: International Conference on Biomolecular Science in honor of the 75lh anniversary of the birth of Professor Yuri Ovchinnikov (Москва, 2009); VI Московский международный конгресс "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2011); 15-ая Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2011).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Создание экспрессионных векторов, несущих гибридный ген FCU1 в качестве гена суицидального воздействия

В качестве суицидального гена нами был выбран ген FCYI, так как для системы FCY115-FC ранее было показано наличие выраженного «эффекта свидетеля», независящего от наличия межклеточных контактов. Нами была выбрана цитозиндезаминаза Saccharomyces cerevisiae, которая по сравнению с цитозиндезаминазой бактерий имеет ряд преимуществ: 1) более высокое сродство к 5-FC, что должно обеспечивать более эффективное дезаминирование 5-FC, приводящее к образованию токсичного метаболита 5-FU; 2) большую термостабильность и 3) фермент представляет собой димер, в то время как бактериальный аналог - гексамер.

Чтобы повысить цитотоксический эффект данной бОЕРТ системы, мы использовали гибридный ген КТУ-^С/Я/ (ГСШ). Ранее было показано, что продукт экспрессии РШИ (урацилфосфорибозилтрансфераза) катализирует превращение 5-Р11 в 5-Р11МР, который под действием клеточных ферментов превращается в наиболее токсичные метаболиты 5-РС: 5-ГаиМР и 5-риТР (Рис. 1).

5-FC FCYl FORI

5-FUTP -

5-FU » 5-F-uridine UDK » S-FÙMP

5-Fd

RR ,'MP

1

TS

DMA synthesis

RNA synthesis

Рисунок 1. Схема основных метаболических путей 5-FC а клетках, экспрессирующих гибридный ген FCU1. Фермент FUR1 способен шунтировать двухстадийную реакцию образования 5-FdUMP из 5-FU. Накопление 5-FdUMP приводит к ингибированию TS, вследствие чего нарушается синтез ДНК. Накопление 5-FUTP приводит к нарушению «созревания» молекул РНК. FCY1 - цитозиндеэаминаза, FUR] -урацилфосфорибозилтрансфераза, UDP-уридин фосфорилаза, UDK-уридин киназа, UK-уридинмоно- уридиндифосфат киназа, RR - рибонуклеотид редуктаза, TS - тимидилат синтаза, 5-FC - 5-фторцитозин, 5-FU - 5-фторурацил, S-F-uridin - 5-фторуридин, 5-FUMP - 5-фторуридин-5'-монофосфат, 5-FdUMP - 5-фтор-2'-дезоксиуридин-5'-монофосфат, S-FUTP - 5-фторуридин-5'-трифосфат (Chung-Faye, Chen et al. 2001).

Гибридный ген FCU1 был получен путем объединения кодирующих последовательностей двух генов: FCY1 (471 п.о., chrXVI:677,165-677,635 (данные «UCSC genome browser» 2008 г.)) и FUR1 (642 п.о., chrVIII:362,124-362,765 (данные «UCSC genome browser» 2008 г.)), которые ранее были амплифицированы с геномной ДНК штамма Saccharomyces cerevisiae arg4. Стоп и старт кодоны генов FCYI и FUR! были удалены олигенуклеотидным сайт-направленным мутагенезом. Фрагменты генов были разделены кодоном, соответствующим аланину, в результате чего образующийся гибридный белок должен был содержать аланиновый линкер между белками FCY1 и FUR1.

На Рис. 2 приведена общая схема векторов, несущих гибридный ген FCU1. В качестве базового вектора был выбран pGL3-BV («Promega»), из которого был удалён ген люциферазы. Затем в такой модифицированный вектор были последовательно (от 5-конца к

З'-концу) клонированы два элемента: 1) промотор/промотор с энхансером, направляющий экспрессию гена FCW; 2) собственно гибридный ген FCU1 (длина 1125 п.о.). Результирующая конструкция содержала сигнал полиаденилирования вируса SV40 (Simian vacuolating virus 40). Также между промотором и геном FCU1 из вектора pCI («Promega») была клонирована последовательность химерного интрона (133 п о.). Ранее было показано, что данный ингрон способен значительно повышать уровень экспрессии гена в клетках млекопитающих (Huang and Gorman 1990).

Рисунок 2. Общая схема строения созданных экспрессионных векторов. Стрелкой обозначен промотор, направляющий экспрессию суицидального гена; черной Г-образной стрелкой - точка начала транскрипции; V-образной линией - химерный интрон; прямоугольниками (слева направо) -ген FCUI и сигнал полиаденилирования SV40.

Для достижения достаточного терапевтического эффекта необходимо добиться высокой и в тоже время специфичной экспрессии суицидального гена.

Работа проводилась в двух направлениях: 1) создание систем для экспрессии гена FCU1 в специфических типах опухоли - для клеток герминогенного рака яичка использовали модифицированный промотор гена NDUFV1 (pmNUS), для клеток меланомы использовали промотор тирозиназы мыши или промотор гена Ml Л человека; 2) создание универсальной системы для экспрессии гена FCU1 в широком спектре опухолей-мишеней - для опухолей различного происхождения использовали промотор гена BIRC5.

В качестве системы сравнения во всех экспериментах использовали обладающую высокой активностью, но не опухолеспецифическую экспрессионную конструкцию, содержащую гибридный ген FCU1 под контролем сильного конститутивного промотора pCMV (Cytomegalovirus immediate early promoter).

Создание системы FCU1/S-FC для убийства раковых клеток меланомы

Для создания цитотоксической системы, работающей в клетках меланомы, были выбраны промоторы генов тирозиназы мыши (Туг) (-355...-61, относительно точки начала транскрипции) и гена MIA человека (-1373...-1, относительно точки начала транскрипции) для которых было показано, что их активность строго ограничена клетками меланомы (Siders, Halloran et al. 1998). Чтобы усилить экспрессию терапевтического гена, направляемую промоторами pMIA и рТуг, в 5'-область обоих промоторов был клонирован тандем из трёх тканеспецифических энхансеров (enhTyrl-З) гена тирозиназы мыши (-

FCU1 - Sv40 polyA -

14614...-14822, относительно точки начала транскрипции). Были получены след экспрессионные конструкции: епИТутЮ-рМ^-ГСШ, епЬТугЬЗ-рТуг-ЛГШ.

Для оценки терапевтического потенциала созданных экспрессионных векторов были определены значения Ю50 (концентрация вещества, при которой выживает 50% клеток) по 5-РС для трансфицированных клеток и 1С50 по 5-Ри для нетрансфицированных клеток. Клетки одной человеческой (А375), двух мышиных (В16-П и МЗ) меланомных клеточных линий и одной немеланомной меточной линии (для контроля тканеспецифичности цитотоксического эффекта, СаЫ, эпидермоидная карцинома лёгких) трансфицировали (не менее 3-х трансфекций для каждой клеточной линии) экспрессионными векторами: епЪТуг1-3-рМ1А-КЛЛ, епЬТуг1-3-рТуг-/гСШ, рСМУ-/гС6'/ (в качестве положительного контроля) и (без промотора)-ГС£Л (в качестве отрицательного контроля) (Табл. 1). Через 48 ч после трансфекции клеткам добавляли среду, содержащую 5-РС (5-ри) в концентрациях (0, 10, 50, 200, 500, 1000 мкМ). Клеточную среду обновляли каждые 48 ч. Спустя 120 ч проводили МТ5-тест, основанный на измерение оптической плотности клеточных сред после окраски живых клеток красителем МТЭ, образующим при окислении в митохондриях производное фиолетового цвета (формазан). Выживаемость клеток рассчитывали как процентное отношение оптической плотности сред трансфицированных клеток, обработанных 5-РС, к оптической плотности сред трансфицированных клеток, не обработанных 5-РС. С помощью математической модели нелинейной регрессии были построены графики сглаживающих кривых для экспериментальных значений выживаемости клеток (данные приведены в диссертации). Используя уравнения полученных кривых, были рассчитаны значения ГС50 по 5-РС и 5-Ии (Табл. 1).

Таблица 1. Чувствительность к 5-РС клеток, трансфицированных экспрессионными векторами, несущими гибридный ген РССН под контролем различных промоторов, и чувствительность нетрансфицированных клеток к 5-РЦ._

Клеточная линия IC50 для 5-FU, мкМ Трансфицированные клетки: IC50 для 5-FC, мкМ

pCMV-FCU1 enhTyrl-3-pMIA -FCU1 enhTyrl-3-рТуг-ЯГ67 (без промотора) - FCU1

А375 18 ± 4 59 ±2 121 ±58 427±174 -

МЗ 0,16±0 11 ±2 49 ±3 53 ±37 427 ± 83

B16-F1 0,15 ±0,07 189 ± 13 784 ±9 493 ± 38 -

Calul 110± 18 118 ± 10 - - -

Значения IC50 определяли минимум в трёх независимых экспериментах. Разброс соответствует стандартной ошибке среднего значения (SEM). «—» - определить значение IC50 не удалось.

Как видно из полученных .результатов (Табл. 1), чувствительность нетрансфицированных клеток к 5-ри значительно варьирует в зависимости от типа клеточной линии; при этом чувствительность меланомных клеточных линий к 5-ри

\

значительно выше (до 700 раз) чувствительности клеточной линии немеланомного происхождения.

Вектор, несущий промотор рТуг мыши, оказывает более сильный суицидальный эффект на клетки мышиной меланомы (МЗ, B16-F1), в то время как вектор, несущий промотор гена MIA человека, оказывает более сильный цитотоксический эффект на клетки меланомы человека (А375), то есть созданные экспрессионные конструкции сохраняют видоспецифичность. Промоторы pMIA и рТуг сохраняют меланомоспецифичность, поскольку трансфекция клеток линии Calul векторами enhTyrl-3-pMIA-FCW или enhTyrl-3-рТуг-ЛГШ не влияет на чувствительность клеток к 5-FC. Как видно из Табл. 1, созданные экспрессионные вектора enhTyrl-3-pMIA-FCW или enhTyr 1 -3-рТут-FCUJ при совместной обработке 5-FC оказывают специфическое цитотоксическое действие на раковые клетки меланомы, сравнимое с действием рСМV-FCU1.

Полученные данные указывают на высокий терапевтический потенциал созданных векторов enhTyrl-3-pMIA-FCW и enhTyr 1-3-pTyr-FCW. Трансфекция данными экспрессионными конструкциям в присутствии 5-FC в концентрации 1 мМ вызывает высоко тканеспецифическую супрессию роста клеток меланомы, сопоставимую с эффектом вектора рСМV-FCU1: более 70% клеток погибает спустя 120 ч после добавления 5-FC. Создание системы FCU115-FC для убийства клеток герминогенного рака яичка человека

Для создания цитотоксической системы, работающей в клетках герминогенного рака яичка человека, был выбран промотор гена NDUFV1 (NADH Dehydrogenase Ubiquinone FlaVoprotein i). На основе фрагмента промотора гена NDUFV1 (NUS, NDUFV1 Upstream Sequence, координаты -3574...-1, относительно точки начала транскрипции) путём удаления высоко консервативного фрагмента длиной 91 п.о. был получен модифицированный промотор mNUS (modified NUS). Промоторную активность исходного NUS (3665 п.о.) и модифицированного mNUS (3574 п.о.) промотора гена NDUFV1, определяли по уровню экспрессии репортерного гена в экспериментах по транзиентной трансфекции с использованием двойной люциферазной системы на панели различных опухолевых клеточных линий человека, а также культурах первичных тканей (результаты приведены в диссертации).

Было показано, что промотор pmNUS проявляет высокую активность в клетках герминогенного рака яичка (линии Тега-1 и ЕР2102) и практически не активен в клетках другого типа (результаты приведены в диссертации), то есть pmNUS является сильным, высоко тканеспецифическим промотором для недифференцированных клеток рака яичка человека.

Для оценки терапевтического потенциала системы ртЫШ/ГСШ^-РС был создан экспрессионный вектор ртЫШ-ГСШ. Экспрессию гена ЛГШ подтверждали методом вестерн-блот анализа с антителами к цитозиндезаминазе лизатов трансфицированых клеток НЕК293 и Тега-1 (данные приведены в диссертации).

Определение цитотоксического эффекта системы ртИИ51РСШ15-?С проводили на клеточных линиях Тега-1 и НЕК293 (трансформированные клетки почки эмбриона человека). Эксперимент с клетками НЕК293 являлся контролем тканеспецифичности системы. Клетки Тега-1 и НЕК293 были трансфицированы конструкциями pmNUS-FCC//, рСМУ-/"С(// (в качестве положительного контроля) и (без промотора)-ГСШ (в качестве отрицательного контроля). Клетки анализировали методом проточной цитометрии после двойного окрашивания клеток красителями Аннексии V - ФИТЦ / Пропидиум иодид через 48 ч после добавления 5-РС в концентрации 1 мМ.

Таблица 2. Чувствительность к 5-ИС клеток Тега-1 иНЕК.-293,трансфицироваш1ЫХ экслрессионными векторами, несущими гибридный ген РС'Ш под контролем промоторов рСМУ и ртИЩ.___

Название экспрессионной конструкции-" Тега-1 | НЕК-293

Двойное окрашивание Аннексии V - ФИТЦ /Пропидиум иодид

-5-РС + 5-ГС -5-РС + 5-ГС

(без промотора)- га// 9,0 %± 1,7% 10,7% ±2,6% 7,4% ±1,7% 8,6% ±2,9%

ртЫШ-КГШ 8,8% ±2,9% 59,1% ±3,9% 7,8 % ± 2,1 % 8,4 % ± 2,8 %

рСМУ-ГСШ 9,9% ±2,5% 64,9% ±5,6% 8,2 % ± 2,2 % 75,5 % ± 8,6 %

"Выживаемость клеток измеряли спустя 48 ч после добавления 5-РС. Приведенные данные отражают суммарное количество некротических и апоптотических клеток."- 5-РС" - в клеточную среду не

добавляли 5-РС;"+ 5-РС"- в клеточную среду добавляли 5-РС . Эксперимент проводили минимум в трех повторностях.

Результаты эксперимента приведены в Табл. 2. Для обеих клеточных линий в отсутствии 5-РС выраженной гибели клеток не наблюдалось (базальная смертность составляла -7-10%). Трансфекция конструкцией рСМ\-FCUl при совместной обработке 5-РС индуцировала гибель -67-84% клеток НЕК293 и -65-67% клеток Тега-1. Вектор рптЫШ-в присутствии 5-РС оказывал цитотоксическое действие только на клетки линии Тега-1, к концу эксперимента погибало ~59-62% клеток.

Из результатов экспериментов по определению цитотоксичности следует, что терапевтическая конструкция ртЫШ-ТСШ обладает высокой тканеспецифичностью по отношению к недифференцированным клетками рака яичка, а цитотоксический эффект, опосредованный промотором ртЫШ, сопоставим с цитотоксическим эффектом, опосредованным промотором рСМУ (Табл. 2). Полученные данные указывают на то, что

созданная GDEPT система в дальнейшем может быть использована как основа для генотерапевтического противоракового препарата для лечения герминогенных опухолей. Создание системы FCU115-FC с широким спектром противоопухолевого действия

С терапевтической точки зрения более перспективным подходом является создание универсальных GDEPT систем, что достигается использованием промоторов, активных в широком спектре опухолей.

Ранее в нашей лаборатории был клонирован и охарактеризован с точки зрения специфичности и активности фрагмент промотора гена BIRC5 (Baculoviral IAP Repeat Containing 5) - pSurv4 (-1456...+42 относительно точки инициации транскрипции). Было показано, что промотор pSurv4 активен в широком спектре опухолевых клеточных линий человека, при этом в нормальных хлетках его активность практически отсутствует. Активность промотора зависела от р53 статуса опухолевых клеток: низкая в клетках с р53(+) фенотипом и относительно высокая в клетках р53(-) фенотипом (Mityaev, Kopantzev et al. 2008). Именно поэтому для создания терапевтической системы с широким спектром опухолей-мишеней был создан вектор, в котором гибридный ген FCU1 находился под контролем промотора pSurv4.

Экспрессионной конструкцией pSurv4-FCf/i трансфицировали клетки линий НЕК293, Calul и А549 (карцинома легких человека) и определяли количество белка FCU1 в клеточных лизатах методом вестерн-блот анализа с антителами к цитозиндезаминазе. Было показано, что: 1) экспрессия гена FCU1 под контролем промотора pSurv4 приводит к накоплению FCU1 исключительно в клетках с мутантным р53-фенотипом (Рис. 3, дорожка №2); 2) промотор pCMV по сравнению с промотором pSurv4 обеспечивает существенно большее накопление FCU1 независимо от р53-статуса клеточной линии (Рис. 3, дорожка №1); 3) критическая промоторная активность у базового вектора pGL3-BV отсутствует, так как FCU1 не детектировали в лизатах клеток, трансфицированных беспромоторной конструкцией, несущей один лишь ген FCU1 (Рис. 3, дорожка №3).

Поскольку существуют данные, что белок р53 существенным образом снижает активность промотора гена BIRC5, являются ожидаемыми полученные нами результаты, указывающие на зависимость экспрессии гена FCU1, направляемой промотором pSurv4, от р53 статуса клеточной линии.

2 3

ЩШШф

HEK293/pS3(-)

i Calul/p53(-)

1 A549/p53(+)

Рисунок 3. Вестерн-блот анализ содержания белка FCY1 в лизатах трансфицированных клеток линий НЕК293, CaluI и А549. Трансфекции векторами 1 - рСМV-FCU1; 2 - pSurv4-fC'W; 3 - (без np0M0T0pa)-FC(//. В качестве первичных антител использовали овечьи IgG к цитозиндезаминазе («Santa-Cruz») (1:5000).

Чтобы количественно оценить цитотоксический потенциал вектора pSurv4-FCUJ, клетки НЕК293(р53(-)), Calul(p53(-)) и А549(р53(+)) транзиентно трансфицировали терапевтическим вектором и инкубировали с 5-FC (1 мМ). Цитотоксическое действие векторов оценивали спустя 48 ч. после трансфекции при помощи MTS-теста.

Трансфицированные и нетрансфицированные клетки были разделены на две группы, одну из которых инкубировали с 5-FC, другую - с клеточной средой. Были проведены четыре параллельных эксперимента: с нетрансфицированными клетками и клетками, трансфицированными векторами: (без промотора)-ТСШ, рСМW-FCU1 и pSurv4-FCW.

Количество мёртвых клеток среди трансфицированных беспромоторным вектором и нетрансфицированных клеток было одинаково (~9-15%) и не зависело от наличия в среде 5-FC (данные приведены в диссертации). В тоже время трансфекция вектором pCMV-FCUl при совместной обработке 5-FC вызывала гибель 85, 82 и 78% опухолевых клеток линий НЕК.293, CaluI и А549, соответственно (Рис. 4). В аналогичном эксперименте, когда трансфицированные вектором рСМV-FCU1 клетки инкубировали в среде без 5-FC, погибало менее 10% клеток (данные приведены в диссертации). Таким образом, мы показали, что цитотоксический эффект FCU1 был полностью зависим от 5-FC , что хорошо согласуется с ранее опубликованными данными. Трансфекция тех же клеточных линий вектором pSurv4-FCU1 вызывала гибель 68 и 52% клеток линии НЕК293(р53(-)) и Calul(p53(-)), соответственно. В случае клеток А549 с р53(+) фенотипом, трансфекция вектором pSurv4-FCU/ практически не вызывала 5-РС-зависимого цитотоксического эффекта.

Из результатов, приведенных на Рис. 4, следует, что пролекарство 5-FC не обладает выраженным цитотоксическим действием даже в концентрации 1 мМ. Сопоставление данных экспериментов по цитотоксичности с результатами вестерн-блот анализа клеточных

лизатов (Рис. 3 и Рис. 4) юказывает, что цитотоксический эффект пропорционален количеству нарабатываегого белка РСШ.

Цитотоксический эффект вектора р8шл>4-РС!У был значительно слабее по сравнению с эффектом вектора рСМУ-ЯСб' : в 5,5 раз в клетках с р53(+) фенотипом и в 2 раза в клетках р53(-) фенотипами. При этом гэсоило специфичности цитотоксического эффекта вектора р8игу4-РСШ совпадает с профилем специфичности активности промотора р8иг\'4.

Поскольку созданная система ОЕРТ на основе р5игу4-РС1Л/5-РС не была достаточно эффективной, была проведена работа по усилению экспрессии гена ГСМ для увеличения терапевтического потенциала системы.

Рисунок 4.

Выживаемость в присутствии 5-FC клеток,

трансфицированных экспрессирующими ген FC.U1 векторами. Спустя 24 ч. после трансфекции добавляли 1 мМ 5-FC. После 120 ч инкубации в среде с 5-FC клетки окрашивали красителем MTS и измеряли оптическую плотность клеточных экстрактов. Высота столбцов отражает процент выживших клеток спустя 120 ч после начала эксперимента.

Выживаемость рассчитывали как процентное отношение оптической плотности в экстрактах клеток, обработанных 5-FC, к оптической плотности в экстрактах клеток, не обработанных 5-FC. Приведены стандартные ошибки среднего (SEM).

Введение модифицированной системы Cre-LoxP для усиления экспрессии цитотоксического гена FCU1

Существенным недостатком «универсальных» промоторов и, в частности, промотора гена BIRC5 является их относительно низкая активность, не позволяющая обеспечить наработку необходимого и достаточного количества цитотоксического белка. Для преодоления этого ограничения используют различные системы усиления экспрессии суицидального гена: введение опухолеспецифических энхансерных элементов, введение бинарной системы Tat-tar ВИЧ, Cre-LoxP и др.

В данной работе для усиления экспрессии гена ЕСШ, направляемой промотором р8игу4, б-аша использована модифицированная система Сге-ЬохР. Ранее было показано, что введение системь, Сге-ЬохР позволяет добиться увеличения экспрессии репортерного гена от 1,5 до 15 оаз (1/е(1а, 1\уаЬа.чЫ е( а1. 2003). Кроме того, данная система усиления позволяет сохранить специфичность экспрессии репортерного гена; так как экспрессия гена Сге-рекомбиназы индуцируется олухолеспецифическим промотором. Принципиальная схема, использованная для усиления экспрессии суицидального гена ТСШ под контролем промотора р5шт4, приведена на Рис. 5.

Была создана бинарная система векторов, включающая: 1) вектор-активатор (рЗип/4-Сге), в котором последовательность, кодирующая Сге-рекомбиназу с сигналом ядерной локализации, находится под контролем промотора рБипЧ; 2) вектор-эффектор (рСМУ-£о.г/>-Яюр-ЬохР-РСШ), содержащий промотор рСМУ, отделённый от гена РС1Л «8(ор»-сигналом, состоящим из тандема трёх сигналов полиаденилирования вируса 8У40. С обеих сторон от «81ор»-сигнала в единой ориентации были клонированы ЬохР-сайты специфические для Сге-белка. Система Сге-ЬохР была модифицирована за счёт введения двух дополнительных сигналов полиаденилирования в область между промотором рСМУ и геном /ГС67.

ЛтвиршшшН tu'Kiwp

Эксирессм* гена FCU1

Рисунок S. Схема работы бинарной модифицированной опухолеспецифичной системы Сге-LoxP. При попадании в опухолевую клетку активационного (pSurv4-Cre) и эффекторного (рСМV-LoxP-Slop-LoxP-FCU1) векторов запускается каскад событий. I) активация промотора pSurv4 в опухолевых клетках вызывает наработку Сге-рекомбиназы; II) наработанная Cre-рекомбиназа узнает LoxP-сайты в составе эффекторного вектора и вырезает фрагмент, фланкированный этими сайтами; 3) в результате удаления «Stops-сигнала промотор pCMV индуцирует наработку терапевтического белка FCU1. Стрелками обозначены промоторы; прямоугольниками - гены; чёрными стрелками - LoxP-сайты; окружностью -«Stops-сигнал. «Stops-сигнал -последовательность, состоящая из тройного повтора сигнала полиаденилирования вируса SV40. NLS (Nuclear Localization Signal)_ сигнал ядерной локализации.

Созданную бинарную систему векторов использовали для транзиентной трансфекции клеток НЕК293, Са1и1 и А549, после чеего проводили вестерн-блот анализ клеточных лизатов с антителами к цитозиндезаминазе (Рис. 6).

Анализ показал: 1) только двойная трансфекция (вектором-активатором и вектором-эффектором) приводит к накоплению белка РСШ; 2) трансфекция клеток одним из векторов бинарной системы не приводит к накоплению белка РСШ, что свидетельствует об эффективной терминации транскрипции последовательностью, соответствующей «8Юр»-сигналу (Рис. 6, дорожка № 2); 3) введение системы Сге-ЬохР сохраняет зависимость экспрессии от р53-статуса, поскольку трансфекция р53(+) клеток бинарной системой векторов не приводила к накоплению белка РСШ (Рис. 6, дорожка № 3); 4) трансфекция р53(-) клеток бинарной системой векторов приводит к накоплению белка РСШ в количестве, сопоставимом с количеством белка, образующегося в результате трансфекции тех же клеток конструкцией рСМ\-FCUI (Рис. 6, дорожки № 1 и 3).

12 3 4

| НЕК293/р53(-) Са)и1/р53(-) А54.9/р53(+)

Рисунок 6. Вестерн-блот анализ содержания белка FCUIe клетках линий НЕК293, CaluI и AS49, трансфицированных конструкциями, экспрессирующими ген FCU1. 1 - рСМV-FCUJ', 2 - pCMV-LoxP-Stop-LoxP-FCUl; 3 - pCMV-LoxP-Slop-LoxP-FCUl и pSurv4-Cre (котрансфекция); 4 - (без промотора)-FCU¡. В качестве первичных антител использовали овечьи IgG к цитозиндезаминазе («Santa-Cruz») (1:5000). Указан р53 фенотип клеточной линии.

Таким образом, введение модифицированной бинарной системы векторов позволило существенно повысить количество белка FCU1 в клеточных линиях с р53(-) фенотипом (см. Рис. 6, дорожка №2 - без усиления).

Создание GEPT системы на основе Cre-LoxP//pCMV-Stop-FClW5-FC с широким спектром противоопухолевого действия

Для количественной оценки терапевтической эффективности системы было проведено сравнение чувствительности к 5-FC нескольких клеточных линий с различными р53 фенотипами, трансфицированных векторами: 1) pSurv4-FCW, 2) pCMV-FCW, 3) pSurv4-Cre и рСМV-LoxP-Stop-LoxP-FCU 1 в отношении 5:5 по количеству мкг. Это оптимальное соотношение количеств эффекторного и активационного векторов было подобрано экспериментально (данные приведены в диссертации).

Трансфицированные клетки в течение 120 ч инкубировали в среде с различными концентрациями 5-FC (0, 10, 50, 200, 500 и 1000 мкМ). Чтобы оценить исходную

чувствительность клеточных линий к активированному токсичному метаболиту, не трансфицированные клетки инкубировали в среде с 5-FU, используя те же концентрации, что и для S-FC. Выживаемость клеток оценивали при помощи MTS-теста. С помощью математической модели нелинейной регрессии были построены графики сглаживающих кривых для экспериментальных значений выживаемости клеток. Используя уравнения полученных кривых, были рассчитаны значения ICjo (концентрация вещества, при которой выживает 50% клеток) для 5-FC и 5-FU (Табл. 3).

Была проведена оценка эффективности трансфекции исследуемых клеточных линий. Для этого клетки трансфицировали экспрессионным вектором, несущим ген GFP (Green Fluorescent Protein) под контролем конститутивого промотора вируса SV40. Спустя 48 ч, когда экспрессия гена GFP достигала наибольших значений, методом FACS-анализа (Fluorescence-Activated Cell Sorting) определяли процент траисфицированных клеток как отношение количества GFP-положительных клеток к общему числу всех трансфицнрованных клеток.

Таблица 3. Чувствительность (1С>о) к 5-FC клеток, трансфицнрованных экспрессионными векторами, несущими гибридный ген FCU1 под контролем различных промоторов, и чувствительность

нетрансфицированных клеток к 5-FU.

Линия клеток Р53 стат ус Эффект ивность трансфе кции, % Нетрансфицирован ные клетки Трансфицированные клетки: IC50 для 5-FC, мкМ

ICso для 5-FU, мкМ pCMV-FCU1 pSurv4-FCU1 pCMV-LoxP- Stop-LoxP-FCUl + pSurv4-Oe

НЕК293 - 20 13 ±7 50 ±9 1160 ± 17 264 ±57

CaluI - 11 110 ± 18 118 ± 10 1010 ± 98 189 ±81

HT 1080 + 22 4 ± 2 233 ± 13 ND ND

А549 + 7 900 ±204 946± 180 ND ND

«—» - фенотип дефектный по р53 белку, «+» - фенотип с активным белком р53, «-» - определить значение IC50 не удалось. Значения IC50 определяли минимум в трех независимых экспериментах. Разброс соответствует стандартной ошибке среднего значения (SEM).

Из приведенных данных следует, что котрансфекция эффекторным и активационным векторами клеток с р53(-) фенотипом (НЕК293 и Са1и1) повышает чувствительность этих клеток к 5-РС по сравнению с чувствительностью клеток, траисфицированных одним лишь р5игу4-ЛГ6'/ вектором, в 4 и 5 раз, соответственно. Полученный результат демонстрирует высокую эффективность использования системы Сге-ЬохР для повышения чувствительности клеток данного типа к 5-РС. Котрансфекция системой векторов р5игу4-Ое и рСМЧ-1охР-З^р-ЬохР-РСШ даже при высоких концентрациях 5-РС практически не вызывает гибели клеток линий А549 и НТ1080 (фибросаркома человека), имеющих р53(+) фенотип. В связи с этим в экспериментах для этих двух линий значения 1С50 для 5-РС определить не удалось.

Клетки, транефицироваиные вектором pCMV-FCC//, демонстрировали различную чувствительность к 5-FC. Из результатов, полученных на нетрансфицированных клетках, следует, что чувствительность к 5-FU значительно варьирует в зависимости от типа клеточной линии.

Наблюдаемые различия в терапевтическом эффекте вектора рСМV-FCU1 мы связываем с различиями в эффективности трансфекции клеток, а так же с различиями в чувствительности к 5-FU (Табл. 3). Чувствительность нетрансфицированных клеток к 5-FU значительно выше чувствительности к 5-FC клеток, трансфицированных вектором pCMV-FCU1, что может быть объяснено следующими причинами: 1) в клетке может происходить неполное дезаминирование 5-FC; 2) часть молекул 5-FC может подвергаться модификации со стороны второго фермента, урацилфосфорибозилтрансферазы, и, таким образом, включаться в другие внутриклеточные метаболические пути; 3) часть образовавшегося 5-FU под действием клеточного фермента дигидропиримвдиндегидрогеназы может быть конвертировано в р-аланин и, таким образом, не участвовать в реализации цитотоксического эффекта.

Таким образом, созданная модифицированная система Cre-LoxP, в которой экспрессия гена Сге направляется промотором pSurv4, повышает накопление белка FCU1 и приводит к увеличению цитотоксического эффекта в присутствии 5-FC по сравнению с прямой регуляцией экспрессии гена FCU1 промотором pSurv4 в 4 и 5 раз в клеточных линиях с фенотипом р53(-) (НЕК293 и Calul, соответственно). Двойная трансфекция векторами pSurv4-Cre и рСМV-LoxP-Stop-LoxP-FCUl в присутствии 5-FC оказывает цитотоксический эффект, сопоставимый с эффектом вектора pCMV-FCW. При этом система Cre-LoxP повторяет профиль специфичности промотора pSurv4. Полученные результаты указывают на то, что созданная система векторов pSurv4-C>e и рСМW-LoxP-Stop-LoxP-FCUl может быть использована как базовая для дальнейших доклинических испытаний. Оценка «эффекта свидетеля» в системе FCU1!5-FC па опухолевых клеточных линиях человека

Как уже говорилось выше, одним из условий эффективности системы GDEPT является наличие «эффекта свидетеля» («bystander effect»), который может быть измерен как отношение количества нетрансфицированных опухолевых клеток, подвергшихся цитотоксическому воздействию со стороны продуцируемого GDEPT системой токсического агента, к числу клеток, экспрессирующих суицидальный ген.

Для оценки «эффекта свидетеля» в созданной системе FCW/5-FC был использован метод мозаичных культур. Определяя долю клеток, экспрессирующих ген FCUI, и сравнивая ее с долей клеток, погибающих к концу эксперимента, мы могли оценивать вклад

высвобождающегося и свободно диффундирующего в соседние клетки активного метаболита 5-FU в реализацию цитотоксического эффекта системы FCUH5-FC.

Определение «эффекта свидетеля» было проведено для четырёх клеточных линий, НЕК293, CaluI, А549 и НТ1080, ранее использованных для изучения различных параметров системы FCU1I5-YC. Клетки трансфицировали экспрессионным вектором рСМV-FCU1, активным во всех четырёх клеточных линиях, и вектором, который содержал ген GFP под контролем промотора вируса SV40 (для определения уровня трансфекции). Смешивая трансфицированные и нетрансфицированные клетки в различных процентных соотношениях, были созданы четыре мозаичные культуры, в которых количество клеток, подвергшихся трансфекции составляло 10%, 25%, 50% и 75%. В качестве контролен были использованы две немозаичные культуры, состоящие из 100% клеток, подвергшихся трансфекции, или из 100% нетрансфицированных клеток. Клетки инкубировали с 5-FC (1 мМ) в течение 120 ч, после чего выживаемость определяли при помощи MTS-теста (Рис. 7).

Реальную долю клеток, экспрессирующих ген FCUI [FCU1 -клетки) в составе мозаичной культуры, определяли по числу GFP-положительных клеток при помощи проточной цитофлуориметрии через 48 ч после трансфекции. Определив эффективность трансфекции для каждой клеточной линии и умножив эту величину на процентное содержание трансфицированных клеток (0, 10, 25, 50 ,75 и 100%), рассчитывали фактическую долю FCUI*-клеток в составе мозаичной культуры. Каждый эксперимент проводили в трёх повторностях (Рис. 7).

Рисунок 7. Определение «эффекта свидетеля» в системе FCU1I5-FC. Высота столбцов отражает среднее значение выживаемости клеток в MTS-тесте, рассчитанное как процентное отношение оптической плотности в средах

трансфицированных клеток,

обработанных 5-FC, к оптической плотности в средах

трансфицированных клеток, не обработанных 5-FC. Под диаграммой приведены фактические значения доли FCUF-клеток, рассчитанные для каждой клеточной линии как произведение эффективности

трансфекции и процентного содержания трансфицированных клеток. Разброс значений

соответствует стандартной ошибке среднего (SEM). Каждый эксперимент проводили минимум в трёх повторностях.

Количество трансфицированных клеток, нормированное на величину эффективности трансфекции,%

Результаты экспериментов, приведенные на Рис. 7, указывают на то, что «эффект свидетеля» в ряду анализируемых клеточных линий изменяется следующим образом: НТ1080> НЕК293> А549> СаМ.

Для того, чтобы оценить «эффект свидетеля» в разных клеточных линиях и исключить влияние эффективности трансфекции, мы определяли долю мёртвых опухолевых клеток при одинаковом числе РСШ*-клеток. Долю мёртвых клеток рассчитывали как «100% клеток - % выживших клеток» (Табл. 4, Рис. 7).

Таблица 4. Зависимость «эффекта свидетеля» в системе РСШ!5-РС от индивидуальных особенностей клеточной линии.

Клеточная Количество мёртвых IC50 для

линия клеток, %, 5-FU, мкМ

при 5% FCUt- клеток

НТ1080 82 ± 11 4±2

НЕК293 84 ±7 13 ± 7

А549 65 ±2 900 ±204

CaluI 38 ± 4 110± 18

Значения IC50 определяли минимум в трёх независимых экспериментах. Разброс соответствует стандартной ошибке среднего значения (SEM).

Из результатов эксперимента следует, что достаточно 5% клеток, экспрессирующих FCU1, чтобы вызвать гибель более 80% клеток опухоли для клеточных линий НТ1080 и НЕК293. Для клеток линии А549 эта цифра составляет 65%, а для клеточной линии CaluI -38%. Несмотря на более высокую чувствительность к 5-FU клеток CaluI по сравнению с клетками А549, «эффект свидетеля» для клеток А549 был выше. Данное явление может быть обусловлено более эффективным метаболизмом образующегося 5-FU в клетках CaluI, что может приводить к высвобождению из FCU1+-клеток CaluI меньшего количества токсичного метаболита.

Для оценки вклада второго фермента FUR1 в реализацию цитотоксического эффекта системы FCU1/5-FC было проведено сравнение чувствительности трансфицированных и нетрансфицированных клеток к 5-FU. Клетки четырёх клеточных линий HT 1080, НЕК293, CaluI и А549 были трансфицированы вектором рСМV-FCU1 и инкубировались с 5-FU в течение 120 ч. Полученные результаты суммированы в Табл. 5.

Полученные результаты (Табл. 5) косвенно указывают на то, что продукт экспрессии гибридного гена FCU1 обладает активностями каждого из двух ферментов: FCY1 и FUR1. Из результатов, приведенных в Табл. 5, следует, что FUR1 повышает чувствительность клеточной линии НЕК293 к 5-FU в 26 раз, CaluI - в 9 раз, А549 и НТ1080 - в 2 раза. Исходя из того, что значения IC50 по 5-FC для трансфицированных клеток выше значений IC50 по 5-FU для тех же, но нетрансфицированных клеток (Табл. 5) (при сохраняющейся величине

эффективности трансфекции), можно сделать вывод о том, что лимитирующей стадией в реализации цитотоксического эффекта можно считать стадию накопления 5-Р1Г внутри клетки. На примере клеточной линии А549 с низкой чувствительностью к 5-ри, можно видеть, что использование второго фермента в разы повышает эффективность 5-РС-зависимой супрессии.

Таблица. 5. Чувствительность к 5-Р1/ нетрансфицированных клеток и клеток, трансфицированных

конструкцией рСМ V-FCU1.

Клеточная ICW Трансфицированные Трансфицированные

линия для 5-FU, клетки клетки

мкМ ICjo для 5-FU, 1С5о для S-FC,

мкМ мкМ

НЕК293 13 ± 7 0,5 ± 0,02 50 ±9

Calul 110 ± 18 12 ± 3 240 ± 10

НТ1080 4 ± 2 2 ±0,5 233 ± 13

А549 900 ±204 420±120 946 ±180

Значения IC50 определяли минимум в трёх независимых экспериментах. Разброс соответствует стандартной ошибке среднего значения (SEM).

Таким образом, в данной работе были созданы и охарактеризованы по цитотоксическому эффекту GEPDT системы на основе FCUll5-FC, в которых суицидальный ген находился под контролем различных регуляторных элементов. Созданные цитотоксические системы, обладая опухолеспецифичностью, продемонстрировали цнтотоксический эффект, сопоставимый с системой, в которой экспрессию суицидального гена направляет сильный конститутивный промотор pCMV. При этом показано, что система FCUll5-FC обладает высоким «эффектом свидетеля»: менее 5 % клеток, экспрессирующих ген FCU1 достаточно, чтобы вызвать гибель более 80% клеток опухоли. Приведенные выше данные также указывают на то, что созданная система FCUHS-FC эффективна с точки зрения терапии опухолей, обладающих устойчивостью к 5-FU.

выводы

1. Получены экспрессионные конструкции, содержащие гибридный ген FCU1, кодирующий белок, состоящий из цитозиндезаминазы и фосфорибозилтрансферазы дрожжей, под контролем различных регуляторных элементов: раннего промотора цитомегаловируса (pCMV), промотора pSurv4 гена B1RC5, кодирующего сурвивин человека, промотора pmNUS гена NDUFV1, промоторов рТуг гена тирозиназы мыши и pMIA гена MIA человека.

2. Показано, что в культурах клеток FCUI под контролем этих промоторов способен эффективно конвертировать нетоксичный предшественник 5-фторцитозин в цитотоксичные продукты дезаминирования и фосфорибозилирования: 5-фторурацил, 5-фтор-УМФ, и 5-фтор-УТФ.

3. Показано, что экспрессия гибридного гена FCUI, находящегося под контролем промотора pSurv4, HociTT р53-зависимый характер. Цитотоксический эффект системы pSurv4/FC'f///5-фторцитозин снижен или практически отсутствует в клетках, содержащих белок р53 дикого типа.

4. Сконструирована система усиления опухолеспецифической экспрессии гена FCUI, в которой используется сочетание двух экспрессирующих конструкций: гена рекомбиназы Сге под контролем промотора pSurv4 и гена FCUI, отделенного от промотора pCMV терминатором транскрипции вируса SV40, который содержит по краям сайты узнавания рекомбиназы Сге (loxP-сайты). Показано, что одновременное введение этих двух конструкций в клеточные линии с фенотипом р53(-) приводит в присутствии 5-фторцитозина к увеличению цитотоксического эффекта в 4-5 раз по сравнению с прямой регуляцией экспрессии FCU1 промотором pSurv4. Это происходит за счет Cre-зависимого удаления терминатора, приводящего к экспрессии гена FCUI под контролем сильного промотора pCMV. Использование системы Cre-LoxP не приводит к усилению экспрессии гена FCUI в клетках с фенотипом р53(+).

5. Показано, что экспрессия гена FCUI, направляемая промотором pmNUS, вызывает высоко тканеспецифическую, 5-фторцитозин-зависимую супрессию клеток опухолей яичка герминогенного происхождения (Тега-1): более 60% клеток погибает спустя 48 часов после добавления в среду 5-фторцитозина. Цитотоксический эффект, обусловленный экспрессией гена FCUI под контролем промотора pmNUS в присутствии 5-фторцитозина, сопоставим с цитотоксическим эффектом, вызываемым экспрессией гибридного гена FCUI под контролем промотора pCMV.

6. Показано, что экспрессия гена ГССУ, в клетках меланомного происхождения направляемая меланомо-специфическими регуляторными элементами (тандем из трех энхансеров тирозиназы мыши в сочетании с промоторами рТуг мыши или рМ1А человека), в присутствии 5-фторцитозина вызывает высоко тканеспецифическую супрессию роста клеток: более 70% клеток погибает спустя 120 часов после добавления 5-фторцитозина.

7. Полученные системы могут использоваться для целей генно-терапевтического лечения рака.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ ИЗЛОЖЕНЫ В СЛЕДУЮЩИХ ПУБЛИКАЦИЯХ

Публикации в научных журналах

1. Denis V. Kuzmin. Tatyana V. Vinogradova, Eugene P. Kopantzev and Eugene D. Sverdlov. Cre-LoxP Mediated Strong Enhancement of pBIRC5 Promoter Driven Suicide of Cancer Cells with CD/UPRT and Fluorocytosine. The Open Gene Therapy Journal, 2010,5,31-39.

2. Kuzmin D. Gogvadze E, Kholodenko R, Grzela DP, Mityaev M, Vinogradova T, Kopantzev E, Malakhova G, Suntsova M, Sokov D, Ivies Z, Buzdin A. Novel strong tissue specific promoter for gene expression in human germ cells. BMC Biotechnol, 2010,10:58.

Материалы российских и международных конференций

1. Koozmin D.V.. Mityaev M.V., Vinogradova T.V., Kopantsev E.P., Sverdlov E.D. Study of the influence of gene- engineered constructs, carrying gene of suicidal action under the control of tumor specific promoter in the human cancer cell lines. International Conference on Biomolecular Science in honor of the 75lh anniversary of the birth of Professor Yuri Ovchinnikov. Moscow, Russia, September 29 - October 2,2009. Abstract book, v.2, p. 119.

2. Koozmin D.V.. Kuzmich A.I., Vinogradova T.V., Kopantsev E.P., Sverdlov E.D. Study Of The pBIRC5 Promoter Driven Suicide Of Cancer Cells With CD/UPRT And Fluorocytosine. VI Московский международный конгресс "Биотехнология: состояние и перспективы развития", Москва, 21-25 марта 2011 г., сборник тезисов устных и стендовых докладов, стр. 76-77.

3. Кузьмин Д.В., Кузьмич А.И., Виноградова Т.В., Копанцев Е.П., Свердлов Е.Д. Индукция гибели раковых клеток человека системой CD/UPRT/5-FC под контролем различных промоторов. 15-ая Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2011), сборник тезисов устных и стендовых докладов, стр. 156-157.

Подписано в печать:

28.10.2011

Заказ № 6157 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru