Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Протеазы как цитотоксические агенты и маркеры злокачественных опухолей лёгкого

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Протеазы как цитотоксические агенты и маркеры злокачественных опухолей лёгкого"

На правах рукописи

ШУБИН АНДРЕЙ ВЛАДИМИРОВИЧ

Протеазы как цитотоксические агенты и маркеры злокачественных опухолей лёгкого

03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва - 2014

6 НОЯ 2014

005554327

Работа выполнена в лаборатории белковой инженерии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт молекулярной генетики Российской академии наук.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

ведущий научный сотрудник Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт молекулярной генетики Российской академии наук, доктор химических наук, доцент Илья Валерьевич Демндюк

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

член-корреспондент Российской академии наук, доктор химических наук, профессор, начальник отделения молекулярной биологии НБИКС центра НИЦ «Курчатовский институт» Сергей Евгеньевич Северин

доктор биологических наук, профессор,

зав. Лабораторией биологии клетки Федерального

государственного бюджетного учреждения науки

Институт молекулярной биологии

им. В.А. Энгельгардга Российской академии наук

Владимир Сергеевич Прасолов

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук

Защита диссертации состоится 9 декабря 2014 г. в ^ -< часов на заседании Диссертационного совета Д 002.235.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардга Российской академии наук по адресу: 119991 г. Москва, ул. Вавилова, 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардга Российской академии наук по адресу: 119991 г. Москва, ул. Вавилова, 32.

Автореферат разослан

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность и гтепепь разработанности темы исследования

Протеазы формируют одно из наиболее многочисленных и разнообразных семейств ферментов. В геноме человека около 1,7% всех генов кодируют протеазы, что превышает число генов киназ и уступает лишь количеству генов транскрипционных факторов [Keller, 2007]. Первоначально считалось, что роль протеаз в живых системах ограничивается процессами неселекгивной деградации белка. Однако по мере того как исследования охватывали все большее число протеолитических ферментов, стало ясно, что их функции выходят далеко за рамки катаболизма белков. На сегодняшний день установлено, что протеазы функционируют в составе многочисленных сигнальных путей, осуществляя селективную активацию и инактивацию разнообразных субстратов (ферментов, структурных белков, ростовых факторов, рецепторов, гормонов, цигокинов и хемокинов) [Antalis, 2010]. Таким образом, протеазы обеспечивают регуляцию многих процессов как на уровне отдельных клеток (например, аутофагию, убиквитин-протеасомную деградацию белков, пролиферацию и программированную гибель клеток), так и в масштабах организма (сворачивание крови, развитие иммунного ответа, ангиогенез, реструктурирование и регенерацию тканей) [López-Otín, 2008].

Нарушение протеолитической регуляции является весомым фактором в развитии многих патологических состояний, в том числе воспаления [Ma, 2012], нейродегенеративных процессов [Azuma, 2008; Camins, 2006], мышечных дистрофий [Ermolova, 2011], диабета [Mesallamy, 2013; Walder, 2005]. Важную роль протеазы играют в развитии онкологических заболеваний [Broder, 2013; Dian, 2013; Kontos, 2012]. Для опухолевых клеток характерно повышение уровней экспрессии ряда протеаз (например, катепсинов, калликреинов, металлопротеаз и калпаинов), которые участвуют в деградации внеклеточного магрикса, процессинге митогенных факторов и запуске сигнальных каскадов, активирующих пролиферацию и миграцию раковых клеток [Findeisen, 2012; Storr, 2011]. Некоторые типы опухолевых клеток демонстрируют снижение экспрессии или дисфункцию онкосупрессорных протеаз, ответственных за развитие апоптотической гибели [Hector, 2012; López-Otín, 2007; Olsson, 2011; Stupack, 2006]. Таким образом, протеазы во многом обуславливают агрессивность злокачественных опухолей и резистентность малигнизированных клеток к индукторам клеточной гибели.

В злокачественных опухолях происходит изменение экспрессии генов целого ряда протеолитических ферментов. При этом уровни экспрессии генов протеаз в опухоли часто коррелируют с ее агрессивностью и в связи с этим рассматриваются как факторы диагностики, подбора оптимальной терапевтической стратегии и прогноза сроков повторного развития заболевания [Werle, 2004; Yang, 2013; Jiao, 2013; Kawakubo, 2013; Shariat, 2011]. Поиск новых протеаз-маркеров развития опухолей и разработка надежных методик их детекции являются актуальным направлением исследований, направленных на диагностику, профилактику и прогноз повторного развития онкологических заболеваний [Findeisen, 2012].

Вовлеченность в прогрессию раковых опухолей и участие в клеточной гибели делает протеазы привлекательными терапевтическими мишенями и агентами. С одной стороны,

\

ингибиторы протеаз способны снижать пролиферагивную, инвазивную и миграционную активность малигнизированных клеток, и поэтому в будущем могут стать эффективными средствами адьювантной противораковой терапии [Gomes-Giacoia, 2013; Gocho, 2013; Elie, 2010; Mataga, 2012]. С другой стороны, протеазы различных организмов и вирусов могут вызывать гибель опухолевых клеток, в том числе резистентных к индукторам апоптоза, что позволяет рассматривать протеазы как перспективные агенты противораковой генной терапии [Liu, 2009; Cao, 2013].

Несмотря на очевидный потенциал, на сегодняшний день протеазы не получили широкого применения в диагностике и терапии онкологических заболеваний. Это связано с недостаточной изученностью механизмов цитотоксического действия протеаз и их функций в развитии злокачественных опухолей. Изучение этих аспектов действия протеаз является актуальным направлением исследований.

Hi""- и 1я/1ячн исследования

Целью настоящей работы являлась характеристика цитотоксического действия протеаз на раковые клетки и анализ изменений экспрессии генов протеолитических ферментов, участвующих в развитии онкологических заболеваний.

В соответствии с целью, были поставлены следующие задачи:

1. Анализ экспрессии генов катепсинов В и D, пробелокконвертаз и магриксных металлопротеаз-2 и -14 на уровне мРНК при раке лёгкого человека.

2. Создание экспериментальной системы для оценки in vitro способности кандидатых генов вызывать клеточную гибель.

3. Оценка цитотоксического действия протеаз 2А полиовируса человека, протеазы ЗС вируса гепатита А человека, катепсинов В и D человека и их модифицированных вариантов.

4. Характеристика цитотоксического действия отобранных протеаз на опухолевые клетки лёгкого человека в культуре.

Няучияя нпвична исглрповзния

В рамках исследования получены оригинальные данные об экспрессии генов катепсинов В и D, магриксных металлопротеаз-2 и -14 и всех пробелокконвертаз на уровне мРНК при раке лёгкого человека, а также о циготоксическом действии протеазы ЗС вируса гепатита А человека на клетки человека. Все результаты исследования являются новыми. В том числе:

- впервые показано, что изменение экспрессии генов пробелокконвертаз на уровне мРНК при раке лёгкого человека происходит по нескольким сценариям;

- впервые продемонстрировано снижение уровня экспрессии гена катепсина D на уровне мРНК в раковых опухолях лёгкого человека;

- впервые охарактеризован цитотоксический эффект протеазы ЗС вируса гепатита А человека (ЗСрго). Впервые показано, что, в отличие от ЗС протеаз других пикорнавирусов, ЗСрго индуцирует каспазонезависимую клеточную гибель, которая сопровождается образованием цитоплазматических вакуолей с не описанными ранее свойствами.

Практическая значимость исследования

Полученные в ходе исследования данные могут быть использованы при разработке новых методов терапии и диагностики онкологических заболеваний. В частности, полученные результаты позволяют считать мРНК гена катепсина D маркером опухолевых тканей легкого. Обнаруженные в работе сценарии изменения экспрессии генов пробелокконвертаз, вероятно, отражают неизвестные свойства опухолей, и в будущем могут быть использованы для классификации и выбора стратегии лечения онкологических заболеваний. Проведенная в исследовании характеристика цитотоксического действия протеазы ЗС вируса гепатита А человека позволяет считать этот фермент потенциальным терапевтическим агентом для лечения рака легкого.

Положения. ПЫНПГНММГ НЯ ЧЯТННТУ

1. Уровень мРНК гена катепсина D снижен в злокачественных опухолях легкого человека.

2. Изменение экспрессии генов пробелокконвертаз на уровне мРНК при раке лёгкого происходит по нескольким основным сценариям, для которых характерно наибольшее повышение или наименьшее снижение экспрессии генов FURIN, PCSKI или PCSK6 в тканях опухоли по сравнению с окружающей нормальной тканью.

3. Предложена экспериментальная система для оценки in vitro способности генов вызывать клеточную гибель. Эффективность системы подтверждена при тестировании цитотоксического действия генов клеточных и вирусных протеаз: катепсинов В и D, их модифицированных вариантов, протеаз 2А полиовируса человека и ЗС вируса гепатита А человека.

4. Протеаза ЗС вируса гепатита А человека (ЗСрго) способна вызывать гибель клеток человека, в том числе раковых. В отличие от ЗС протеаз других пикорнавирусов, индуцированная ЗСрго клеточная гибель является каспазонезависимой и сопровождается вакуолизацией нескольких типов органелл эндосомально-лизосомального компартмента.

Степень достоверности результатов исследования

Все результаты исследования были воспроизведены в нескольких независимых экспериментах. Цитотоксический эффект протеазы ЗС вируса гепатита А человека продемонстрирован на нескольких линиях клеток. Изучение экспрессии генов протеаз в опухолевых тканях лёгкого человека осуществлялось на выборке, позволяющей провести статистический анализ полученных данных.

Апробация результатов исследования

Основные результаты работы были представлены на молодежных школах-конференциях «Методы культивирования клеток» (Санкт-Петербург, 2008), «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2010), «Геномика и биология клетки» (Звенигород, 2010), «Непостоянство генома» (Звенигород, 2012), Всероссийских конгрессах «Белки и пептиды» (Казань, 2010; Петрозаводск, 2012), международном симпозиуме «Control of Gene Expression and Caneen) (Москва, 2010) и 38-м конгрессе Европейского биохимического общества (С-Петербург, 2013).

ТТуйликапии

По теме исследования опубликованы 1 статья в отечественном и 3 стаггъи в зарубежных рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК, а также 8 тезисов стендовых и устных докладов на российских и международных научных конференциях.

Работа выполнена при участии сотрудников лаборатории белковой инженерии и лаборатории молекулярной диагностики Института молекулярной генетики РАН, группы электронной микроскопии Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардга РАН, лаборатории структуры и функций генов человека Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, лаборатории регуляции клеточных и вирусных онкогенов Российского онкологического научного центра им. H.H. Блохина РАМН.

Работа проводилась при поддержке грантов РФФИ (12-04-00961 и 13-04-40172), гранта в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на 2007-2012 годы» (государственный контракт No 02.512.12.2050), программ фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» и «Фундаментальные науки - медицине».

Структура II объем работы

Диссертация изложена на 124 страницах, включает б таблиц, 18 рисунков и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, выводы, благодарности, список сокращений, список литературы (534 источника), приложение.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Анализ экспрессии генов протеаз в тканях опухолей лёгкого человека

Протеазы играют важную роль в развитии онкологических заболеваний, способствуя инвазии и метастазированию опухолей. Признаком вовлеченности протеаз в развитие злокачественной опухоли может служить изменение уровня экспрессии кодирующих их генов в опухолевой ткани. Таким образом, количественное измерение уровня экспрессии генов протеаз в опухолевых тканях представляется относительно простым способом получения предварительной информации об участии протеазы в развитии опухоли. Такая информация может служить основой доя разработки систем диагностики онкологических заболеваний, для валидации протеаз-терапевтических мишеней, а также для исследования молекулярных механизмов участия протеаз в прогрессии опухолей. В данной работе осуществлен сравнительный анализ экспрессии генов катепсинов В и D, пробелокконвертаз и матриксных металлопротеаз-2 и -14 на уровне мРНК в опухолях легких человека и окружающих их нормальных тканях без гистологических патологий.

Экспрессия гена катепсина D снижена в опухолевых тканях легкого человека

Лизосомальные протеолитические ферменты катепсины В и D (CathB и CathD, соответственно) играют важную роль в прогрессии раковых опухолей [Podgorski, 2003; Leto, 2004; Liaudet-Coopman, 2006]. В малигнизированных клетках происходит значительное

усиление секреции неактивных предшественников и зрелых активных CathB и CathD во внеклеточное пространство [Саропу, 1989; Sloane, 1994; Hazen, 2000; Turk, 2004]. Секретированный зрелый CathB непосредственно, а также за счет активации предшественников матриксных металлопротеаз, участвует в деградации внеклеточного матрикса и, таким образом, способствует инвазии опухоли и распространению малигнизированных клеток [Kcppler, 1996; Roshy, 2003; Sevenich, 2010]. Секретированный CathD высвобождает из внеклеточного матрикса ангиогенные факторы, активирует матриксные металлопротеазы и расщепляет внеклеточные ингибиторы протеаз, что приводит к прорастанию в опухоль кровеносных сосудов и повышению инвазивной способности опухоли [Briozzo, 1991]. Кроме этого, неактивный секретированный предшественник CathD действует как мнтогенный фактор и стимулирует пролиферацию опухолевых и окружающих их нормальных клеток [Fusck, 1994; Glondu, 2001; Ohri, 2008; Masson, 2010].

Корреляции между экспрессией генов катепсинов В и D (CTSB и CTSD, соответственно) на уровне мРНК и белка, с одной стороны, и стадией, агрессивностью и вероятностью повторного возникновения опухоли, с другой стороны, показаны для опухолей желудка, мозга, прямой кишки, молочной и предстательной желез и других злокачественных новообразований [Foekens, 1999; Konduri, 2001; Levicar, 2002; Bossard, 2003; Leto, 2004; Niedergethmann, 2004; Troy, 2004; Nomura, 2005; Czyzewska, 2008; Devetzi, 2009]. Эти данные позволяют рассматривать CathD и CathB в качестве потенциальных диагностических маркеров злокачественных опухолей, подходящих для оценки рисков повторного возникновения опухоли [Schwartz, 1995; Lah, 2000; Wozniak, 2002; Bossard, 2003; Niedergethmann, 2004; Turk, 2004; Devetzi, 2009].

Экспрессия CTSD и CTSB была исследована нами с помощью метода количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией и детекцией продуктов в реальном времени (rtPCR) в 30 парных образцах опухолевой и нормальной ткани лёгкого, полученных у пациентов с диагнозом «мелкоклеточная карцинома лёгкого» и «немелкоклеточная карцинома легкого (стадии I-III). Уровень мРНК CTSB в проанализированных нами образцах значительно варьирует и не коррелирует со стадией и другими клиническими характеристиками опухоли (рис. 1). В то же время согласно литературным данным экспрессия CTSB на уровне белка в опухолевых тканях повышена [Werle, 2000; Werle, 2004; Sloman, 1996; Mori, 1997] и лишь в некоторых случаях коррелирует с характеристиками опухоли [Werle, 1995; Mori, 1997]. Можно предположить, что несоответствие между содержанием мРНК и белкового продукта CTSB объясняется пост-транскрипционной регуляцией экспрессии этого гена. В пользу этого свидетельствуют опубликованные данные о том, что в опухолевых клетках различного происхождения обнаружены альтернативные транскрипты CTSB, для которых характерна повышенная частота инициации трансляции [Yan, 2003]. Кроме этого, секретированный опухолевыми клетками CathB способен связываться с клеточной мембраной и за счет этого приобретать повышенную устойчивость к деградации [Almeida, 2001].

Уровень мРНК CTSD в проанализированных нами образцах опухолей значительно снижен (р<0,01) (рис. 1). Эти данные не согласуются с результатами большинства опубликованных работ, в которых сообщается о повышенной экспрессии CTSD на уровне белка в опухолях легкого [Chyczewski, 1997; Wang, 1998; Wozniak, 2002; Werle, 2004; Domagala, 1992; Joensuu,

7

|[|||| ИМ"1'"

3 13 24 25 12 4 14 29 9 11 16 30 15 27 22 19 1 18 7 26 В 2 6 17 23 28 5 20 10

Образец

Рисунок I. Изменение экспрессии генов СТБО и СТЯВ при раке легкого. Приведены отношения уровней экспрессии генов СГ5В (серые столбцы) и СТ50 (черные столбцы) в опухоли к уровням экспрессии в окружающей ткани без гистологических патологий.

1995]. В то же время с нашими данными согласуются результаты работы ЯшЬа1 и др., в которой показано сниженное содержание СаЛВ в опухолях легкого человека [ЯиШа1, 2003]. Статистически значимых корреляций между содержанием мРНК СТ5И и характеристиками опухолей обнаружено не было, что согласуется с результатами части опубликованных работ об экспрессии С7Ж на уровне белка [СИусгемзЫ, 1997; \Vozniak, 2002]. Имеющиеся к настоящему времени данные не позволяют объяснить несоответствие между уровнями белкового продукта и мРНК СГЖ. Полученные нами данные позволяют предположить, что в клетках опухолей лёгкого экспрессия СТБИ, так же как и экспрессия СГХВ, регулируется на посттранскрипционном уровне. В проведенных ранее исследованиях с помощью измерения протеолитической активности было показано, что уровень экспрессии СаЛО превосходит уровень экспрессии СаШВ в опухолевых тканях легкого (ЪесЫой, 1996]. Однако на уровне мРНК мы обнаружили обратную ситуацию. Сопоставление этих данных также позволяет предположить пост-транскрипционную регуляцию экспрессии С7Ж и СТБВ.

Таким образом, сравнение наших результатов с опубликованными ранее данными демонстрирует значительное различие между экспрессией генов СГ£Я и С7Ж на уровне мРНК и белка в опухолевых тканях легкого человека. Эти различия могут свидетельствовать о регуляции экспрессии генов СУ55 и С75Х> на пост-транскрипционном уровне. В то же время мы обнаружили, что уровень мРНК С75Х> значительно снижен в опухолевых тканях легкого. Эти результаты позволяют рассматривать мРНК СГЖ в качестве маркера злокачественных опухолей легкого человека.

ю

■г.

н

з: о о ф о. с о 1 1

о

>5 О X со о о. >ч од -

ф

Ф 3 о X 0.01 1

О

0.001 1

21

1 SCO p III 2 2 0 Y

2 see p II 3 0 0 Y

3 sec с I 1 0 0 Y

4 see p I 1 0 0 N

5 see с II 3 0 0 N

6 see с III 3 2 0 Y

7 see с I 1 0 0 N

8 AdC p II 3 0 0 -

Э see с II 3 0 0 N

10 see p II 3 0 0 N

11 see с I 1 0 0 N

12 see с I 1 0 0 N

13 see с II 2 1 0 N

14 see р II 3 0 0 Y

15 see с II 3 0 0 Y

16 see с II 3 0 0 N

17 SCLC р III ■ ■ . ■

18 AdC р II 3 0 0 ■

19 AdC р II 3 0 0 -

20 sec с II 3 0 0 Y

21 sec с II 3 0 0 N

22 sec с III 3 1 0 Y

23 see с II 3 0 0 N

24 sec р I 2 0 0 N

25 see с II 3 0 0 Y

26 AdC/SCC Р III 3 1 0 ■

27 see р III 3 1 0 Y

28 AdC р II 2 1 0 ■

29 see с III 3 1 0 N

30 sec с II 3 0 0 Y

Рисунок 2. Характеристики исследованных образцов и представление в виде карты интенсивностей отношений экспрессии генов в опухоли к экспрессии в окружающей нормальной ткани. Б С С, плоскоклеточная карцинома легкого; вБСС, железисто-плоскоклеточная карцинома легкого; АёС, аденокарцинома легкого; ЗСЬС, мелкоклеточная карцинома легкого; Р, периферическая локализация опухоли; С, центральная локализация опухоли; У, опухоль с ороговением; N1, опухоль без ороговения; -, нет данных. Данные на карте интенсивностей представлены как логарифм с основанием 2. Серые клетки соответствуют образцам, для которых мРНК не была детектирована в норме и в опухоли.

Изменение экспрессии генов пробелокконвертаз при раке легкого человека происходит по нескольким отдельным сценариям

Пробелокконвертазы (ПК) - семейство белков, объединяющее девять высоко специфичных субтилизинподобных сериновых эндопептидаз млекопитающих [Seidah, 2011]. Ключевой функцией этих ферментов является процессинг и активация многочисленных субстратов -нейропептидов, пептидных гормонов, факторов роста и дифференцировки, адгезивных молекул, белков внеклеточного матрикса, рецепторов, ферментов, факторов коагуляции крови и плазматических белков. Многие субстраты ПК ассоциированы с онкологическими заболеваниями и принимают непосредственное участие в прогрессии опухолей, влияя на пролиферацию, мобильность, адгезивную способность раковых клеток. Это позволяет рассматривать ПК в качестве перспективных терапевтических мишеней [Chretien, 2008]. К настоящему времени осуществлен ряд исследований, показывающих, что уровень экспрессии ПК при раке изменен. При этом обнаружены корреляции экспрессии ПК с агрессивностью опухолей и выживаемостью пациентов [Page, 2007]. Эти данные позволяют предположить, что

экспрессионный статус системы ПК может быть использован для классификации опухолей и прогноза течения онкологических заболеваний.

В данной работе на примере рака легкого человека проведена оценка информативности подхода, основанного на профилировании экспрессии генов системы ПК. С этой целью в 30 парных образцах опухолевой и нормальной ткани, полученных у пациентов с диагнозом «мелкоклеточная карцинома лёгкого» и «немелкоклеточная карцинома легкого (стадии I-III), впервые одновременно изучена экспрессия всех генов ПК на уровне мРНК с использованием количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией и детекцией продуктов в реальном времени. Кроме того, исследована экспрессия генов двух матриксных металлопротеаз (ММР2 и MMPI4), являющихся субстратами ПК [Sato, 1996; Remacle, 2006; Коо, 2009] и играющих важную роль в инвазии и метастазировании опухолей [Sato, 1996].

Экспрессия генов MBTPSI, PCSK7, ММР2 и ММР14 была обнаружена во всех (a PCSK5 -практически во всех) образцах опухолевой и нормальной ткани. Напротив, мРНК гена PCSK4 детектировалась лишь двух опухолевых образцах. Остальные гены демонстрировали более сложные экспрессионные профили. Транскрипт PCSK9 был обнаружен в 29 образцах нормальной ткани, но лишь в 18 образцах опухолей. PCSK6 - примерно в 2/3 нормальных и опухолевых образцов, a PCSK2 - в 15 и 11, соответственно. Наиболее заметно различалась экспрессия в норме и опухоли для FURIN и PCSK1. Образцы, в которых детектировалась мРНК этих генов, более чем в два раза чаще встречались среди опухолевых. При этом в значительной части как опухолевых (21/30 для PCSK1 и 8/30 для FURIN), так и нормальных образцов (26/30 для PCSKI и 20/30 для FURIN) экспрессия не была обнаружена (рис. 2). Описанная ситуация показывает, с одной стороны, существенные различия в экспрессии отдельных генов ПК в раковых опухолях легких человека, а с другой стороны - высокую вариабельность экспрессионных паттернов ПК между индивидами.

Сравнение уровней экспрессии исследуемых генов в опухоли и нормальной ткани показало, что между ними наблюдаются статистически значимые различия, а именно - повышение количества транскриптов гена FURIN (р<0,00005) и снижение количества мРНК генов PCSK2 (р<0,007), PCSK5 (р<0,0002), PCSK7 (р<0,002), PCSK9 (р<0,00008) и MB TPS 1 (р<0,00004). В случае PCSKI наблюдалась тенденция к повышению уровня мРНК (рис. 2). Таким образом, в нашей выборке экспрессия семи (кроме PCSK6) из восьми генов ПК, мРНК которых детектируется в легких, меняется при малигнизации однонаправленно. Этот результат является новым, поскольку количественное сравнение уровня мРНК для большинства генов ПК в норме и опухоли до настоящего времени не проводилось. В то же время для FURIN высокий уровень экспрессии в опухоли при немелкоклеточных карциномах легкого (HMKJ1) [Schalken, 1987; Mbikay, 1997] и других видах рака [Lopez de Cicco, 2004; Page, 2007] был продемонстрирован ранее. Статистически значимых различий между уровнями экспрессии в опухоли и нормальной ткани для ММР2 и ММР14 обнаружено не было. Этот результат, однако, не противоречит данным об одновременном повышении уровня экспрессии этих генов в опухолевых и стромальных клетках при НМКЛ [Сох, 2001; Yamamura, 2002; Ishikawa, 2004].

Между профилями экспрессии исследованных генов были найдены умеренные статистически значимые (р<0,05) попарные корреляции (табл. 1). Наборы коррелирующих

10

10 11 12

13

14

15

16

17

18

19

20 21 22

23

24

25

26

27

28

29

30

Рисунок 3. Кластеризация образцов по профилям изменения экспрессии пробелокконвертаз в опухоли относительно нормальной ткани. Отношения экспрессии опухоль/норма на карте интенсивностей нормализованы по рядам и представлены в линейной шкале. Серые клетки соответствуют образцам, для которых мРНК не была детектирована в норме и в опухоли. Длины ветвей отражают расстояния между узлами дендрограммы.

профилей для нормальных и опухолевых тканей значительно отличаются. Таким образом, если считать обнаруживаемые корреляции свидетельством согласованной регуляции, можно сделать вывод, что в опухолях регуляция экспрессии генов ПК и матриксных металлопротеаз изменена. Наиболее значимый, на наш взгляд, результат был получен при сопоставлении паттернов изменения экспрессии генов ПК в опухоли по сравнению с нормой. Кластерный анализ показал, что исследованные образцы могут быть разделены на 4 группы (рис. 3), которые не коррелируют с доступными нам клиническими характеристиками опухолей. Три из выявленных кластеров (Cl, С2 и СЗ) в совокупности охватывают 80% образцов. Каждый из этих кластеров достаточно однороден и характеризуется наличием одного ключевого гена: FURIN для С1, PCSK1 для С2 и PCSK6 для СЗ. Как правило, экспрессия этого гена в опухоли наиболее сильно повышена, но в некоторых случаях неизменна или слабо снижена при существенном уменьшении количества мРНК других ПК. Дополнительным признаком кластера С1 является отсутствие экспрессии PCSKI в большинстве образцов, а СЗ - PCSK1 и FUR1N или одного из этих генов более чем в половине случаев. Четвертая группа (С4) более гетерогенна. Образцы, составляющие этот кластер, характеризуются сходством изменений экспрессии генов PCSK5,

Таблица 1. Корреляции для профилей экспрессии исследуемых генов.

Нормальная ткань

FURIN Пары генов p^g^j FURIN MUP14 MBTPSI MBTPS1 MBTPS1 PCSK7 PCSK7 PCSK5 MMP2 PCSK5 PCSK9 PCSK2 PCSK9 PCSK5

Rs 0,64 -0,67 0,53 0,45 0,65 0,38 0,78 0,58

Опухолевая ткань

FURIN Пары генов FURIN MBTPS1 MBTPS1 PCSK6 MBTPSI PCSK7 MBTPSI MMP2 PCSK6 MMP2 PCSK7 MMP2

R, 0,56 0,53 0,63 0,42 0,65 0,47 0,51

Опухолевая ткань /Нормальная ткань

FURIN Пары генов pQ^Kl FURIN PCSK9 MBTPSI PCSK7 MBTPSI MMP2 PCSKI PCSK5 PCSK7 PCSK5 PCSK7 MMP2

Rs 0,77 0,51 0,64 0,65 -0,66 0,61 0,61

Rs - коэффициент корреляции Спирмена (р<0,05).

PCSK7, PCSK9 и MBTPSI, а также, в большинстве случаев, отсутствием мРНК генов FURIN и PCSK1. Таким образом, изменение экспрессии генов ПК в раковых опухолях легких происходит по ограниченному числу сценариев.

Подводя итог, следует констатировать, что при профилировании экспрессии генов системы ПК на уровне мРНК в злокачественных опухолях легких наиболее информативным является сравнение экспрессии в опухоли и окружающей ткани без гистологических признаков патологии. В результате сопоставления паттернов экспрессии генов ПК были выявлены несколько типов НМКЛ, отличающихся сценариями изменения экспрессии генов ПК.

Характеристика цитотоксических эффектов генов протеаз

Развитие генной терапии привело к появлению новых подходов к лечению онкологических заболеваний. Один из таких подходов заключается в использовании в качестве противораковых агентов генов, вызывающих гибель опухолевых клеток. В рамках этого подхода создан ряд перспективных лекарственных средств, часть из которых находится в стадии доклинических или клинических испытаний. Два геннотерапевтических препарата (гендицин и онкорин), представляющие собой генетически модифицированные аденовирусы, в настоящее время применяются в Китае. В то же время в связи с разнообразием свойств раковых опухолей найти одно универсальное средство для лечения всех онкологических заболеваний не представляется возможным. В связи с этим актуальным является поиск новых цитотоксических геннотерапевтических агентов и характеристика их действия на раковые клетки. Имеющиеся данные о важной роли протеолитических ферментов в клеточной гибели позволяют предложить гены протеаз в качестве потенциальных противораковых цитотоксических агентов. Цель данной части работы состояла в поиске новых генов протеаз, способных вызывать гибель раковых клеток, и характеристике их цитотоксического действия.

Оценка токсического эффекта при транзиентной экспрессии генов протеаз в клетках линии НЕК293

Для поиска новых генов протеаз, способных вызывать клеточную гибель, необходима экспериментальная система, позволяющая оценивать цитотоксические эффекты кандидатных генов. Цитотоксическое действие генов может быть исследовано с применением стабильно экспрессирующих их клеточных линий. Однако создание таких линий связано с существенными временными и материальными затратами. В связи с этим развитие получили альтернативные подходы, основанные на транзиентной экспрессии кандидатных генов. В данной работе была проведена оценка токсических эффектов генов протеазы ЗС вируса гепатита А человека (ЗСрго), протеазы 2А полиовируса человека (2Арго), а также катепсинов В и D человека (CathB и CathD) и их модифицированных вариантов, лишенных сигнальных пептидов (CathB* и CathD*).

Имевшиеся к началу работы данные о функциях и свойствах протеаз 2Арго и ЗСрго пикорнавирусов позволяла предположить, что эти ферменты могут являться эффективными индукторами клеточной гибели. Показано, что индивидуальная экспрессия протеаз 2А и ЗС некоторых пикорнавирусов в клетках эукариот приводит к угнетению трансляции белков клетки хозяина путем протеолиза факторов инициации трансляции семейства eIF4 [Barco, 2000], индукции апоптоза через механизмы, связанные с активацией каспазы-3 и проаптотических медиаторов Вах и Bid, а также к инактивации систем внутриклеточного противовирусного иммунитета [Calandria, 2004]. Мы протестировали две протеазы - протеазу 2А полиовируса, способность которой вызывать клеточную гибель была известна ранее, и ЗС протеазу вируса гепатита А, цитотоксическое действие которой ранее не изучалось.

CathB и CathD в норме присутствуют в лизосомах и эндосомах клеток. При этом активация специфических рецепторов, окислительный стресс, активация р53 и другие стрессорные факторы могут индуцировать высвобождение катепсинов в цитозоль. В зависимости от количества вышедших в цитоплазму активных катепсинов клетка гибнет по пути апоптоза, каспазонезависимой программированной клеточной гибели или некроза [Fehrenbacher, 2005]. Таким образом, для реализации цитотоксического действия катепсинов необходима их цитоплазматическая локализация. В нашей работе для обеспечения цитоплазматической локализации CathB и CathD были сконструированы их модифицированные варианты с удаленными сигнальными пептидами.

Оценка токсических эффектов выбранных генов протеаз проведена на клетках линии почки эмбриона человека НЕК293, обеспечивающей высокие уровни экспрессии широкого круга рекомбинантных генов [Thomas, 2005]. Для регуляции экспрессии целевых генов была применена коммерческая система Tet-Off (Clontech) [Gossen, 1994]. Полученная нами клеточная линия НЕК293 G7, конститутивно экспрессирующая ген белка-трансактиватора tTA, позволяла подавлять экспрессию целевого гена под контролем tTA-зависимого промотора в присутствии в культуральной среде антибиотика доксициклина. В качестве экспрессионного вектора был использован совместимый с системой Tet-Off вектор pBI-EGFP. Этот вектор содержит двунаправленный tTA-зависимый промотор цитомегаловируса, что позволяет одновременно

Рисунок 4. Флуоресценция клеток в контрольных и опытных культурах. Слева указано время от момента трансфекции. Контроль - клеточная культура, трансфицированная вектором рВГ-ЕОРР; ЗСрто, 2Арго, СаШВ, Са^В*, СагЫ), СагШ* - клеточные культуры, трансфицированные несущими тестируемые гены векторами.

экспрессировать в клетке два гена - репортерный и целевой [Baron, 1995]. Репортерным является ген зеленого флуоресцентного белка (eGFP).

Введение pBi-EGFP методом липофекции и экспрессия репортерного гена не оказывали заметного влияния на жизнеспособность клеток НЕК293. Значительное количество проявляющих зеленую флуоресценцию клеток обнаруживалось на вторые сутки после трансфекции и продолжало медленно расти до конца наблюдений (рис. 4). При этом подавляющее большинство трансфицированных клеток демонстрировало типичную для линии НЕК293 морфологию. Во всех дальнейших экспериментах культура, трансфицированная рВ1-EGFP, использовалась нами в качестве контроля.

На основе плазмиды pBI-EGFP был сконструирован набор векторов, содержащих гены протеаз ЗС вируса гепатита А человека (рЗСрго), 2А полиовируса человека (p2Apro), а также катепсинов В и D (pCathB и pCathD) и их модифицированных вариантов с удаленными сигнальными пептидами (pCathB* и pCathD*). В культурах НЕК293, трансфицированных векторами pCathD, pCathB, pCathD* и pCathB*, динамика накопления клеток, демонстрирующих зеленую флуоресценцию, не отличалась от наблюдаемой в контрольной культуре (рис. 4). При введении плазмид рЗСрго и р2Арго количество зеленых клеток, как и в контроле, увеличивалось в течение 3-х суток после трансфекции, однако затем быстро уменьшалось. Сравнение динамики накопления трансфицированных клеток указывает на то, что ЗСрго и 2Арго обладают цитотоксическим действием, в то время как CathB, CathD и их варианты с удаленными сигнальными пептидами не оказывают заметного влияния на жизнеспособность клеток.

Этот вывод подтверждают количественная оценка гибели (рис. 5) и анализ морфологии клеток во всех культурах, проведенные через 72 ч после трансфекции, когда для ЗСрго и 2Арго

х

Г | 80

i g 60

h

Ь

I

f

1

íi

ЗСрго lAprc

наблюдалось наибольшее число флуоресцирующих клеток. В случае CathB и CathD доли погибших клеток в культуре совпадали для трансфицированных и нетрансфицированных субпопуляций, при этом не отличались существенно от аналогичных значений для контрольной культуры. Более того, клетки,

экспрессирующие гены катепсинов,

Piicvhok 5. Выживаемость клеток в опытных и морфологически не отличались ОТ контрольных культурах через 72 часа после трансфицированных клеток в контрольной трансфекции. Выживаемость клеток рассчитывалась

как отношение доли живых клеток в опытной культуре к культуре (данные не показаны). Отсутствие доле живых клеток в контрольной культуре. Данные для

цитотоксического действия у катепсинов трансфицированных клеток отображены серыми

столбцами, для нетрансфицированных клеток - белыми согласуется с опубликованными ранее столбцами. ЗСрго. 2аРго, CathD. CathD*, CathB и

данными, которые демонстрируют, что CathB* - клеточные культуры, трансфицированные

векторами, несущими соответствующие тестируемые

многократное увеличение экспрессии генов ,,

f : г гены. Нежизнеспосооными считали потерявшие

CathB и CathD (обнаруженное, в частности, распластанность клетки округлой формы.

демонстрирующие конденсацию хроматина и при развитии злокачественных г.

r г кариорексис. Средние значения рассчитаны по

новообразований [Shubin, 2010]) не приводит результатам трех независимых экспериментов, в каждом , , i из которых проанализировано не менее 300 клеток

к цитотоксическому эффекту [Gocheva, 2007]. каждо/субпопуляции. доверИтельные интервалы

Гены модифицированных катепсинов приведены для Р=0,95.

CathD* и CathB*, в отличие от генов

полноразмерных катепсинов, по-видимому, проявляли слабое цитотоксическое действие (рис. 5). Причина слабого цитотоксического эффекта генов CathD* и CathB* не ясна, и, возможно, связана с неэффективным фолдингом катепсинов в цитоплазме. При тестировании ЗСрго и 2Арго через 3 суток после введения генов более 90% трансфицированных клеток демонстрировали признаки гибели. Среди нетрансфицированных жизнеспособными оставались более 90% клеток в случае гена ЗСрго и около 55% клеток в случае гена 2Арго (рис. 5). Следует отметить существенный уровень гибели не демонстрирующих зеленой флуоресценции клеток в культурах при трансфекции вектором р2Арго. Можно предположить, что этот эффект связан со способностью 2Арго угнетать систему биосинтеза белка хозяйской клетки [Barco, 2000]. Вероятно, в результате действия протеазы в существенной части трансфицированных клеток накапливается недостаточное для детекции количество EGFP. В пользу этого свидетельствует и низкий средний уровень флуоресценции «зеленых» клеток в культуре с 2Арго по сравнению с контролем и остальными опытными культурами (данные не показаны). По-видимому, в случае 2Арго используемый экспериментальный подход не позволяет выявить значительную часть экспрессирующих ген интереса клеток.

Таким образом, с использованием предложенной экспериментальной системы для оценки цитотоксических эффектов кандидатных генов показана способность генов 2Арго и ЗСрго вызывать гибель клеток. Полученные результаты согласуются с опубликованными данными о цитотоксическом действии изученных протеаз ЗС и 2А пикорнавирусов, при этом

15

цитотоксическое действие протеазы ЗС вируса гепатита А человека было продемонстрировано впервые.

Из всех исследованных генов наиболее интересным представляется ген протеазы ЗС вируса гепатита А человека, цитотоксическое действие которой впервые выявлено в данной работе. На следующем этапе работы была проведена характеристика цитотоксического действия гена ЗСрго на опухолевые клетки человека в культуре.

Протеаза ЗС вируса гепатита А человека вызывает каспазонезависимую клеточную гибель и вакуолизацию органелл зндосомально-лизосомального кампартмента

Протеазы ЗС являются основными протеолитическими ферментами пикорнавирусов. Эти ферменты осуществляют процессинг вирусных полипротеинов, обеспечивая образование интермедиатов и зрелых форм белков вируса (см. для обзора [Lin, 2009]). Помимо этой основной функции, ЗС протеазы способны расщеплять белки клетки-хозяина. Гидролизуя факторы транскрипции и трансляции [Clark, 1991; Clark, 1993; Yalamanchili, 1997; Belsham, 2000], гистоны [Falk, 1990], белки цитоскелета [Joachims, 1995; Armer, 2008] и факторы внутриклеточного противовирусного иммунитета [Neznanov, 2005; Mukherjee, 2011; Lei, 2013], ЗС протеазы подавляют функционирование хозяйской клетки и вызывают ее гибель.

Во всех известных случаях ЗС протеазы пикорнавирусов вызывают гибель клеток по пути апоптоза [Li, 2002; Calandria, 2004; Chau, 2006]. Данных о характере цитотоксического действия ЗС протеазы вируса гепатита А человека (ЗСрго) - единственного протеолитического фермента этого вируса - до настоящего времени не было. В то же время известно, что ЗСрго расщепляет белки клетки-хозяина, относящиеся к тем же функциональным классам, что и субстраты других ЗС протеаз. Таким образом, можно ожидать, что ЗСрго, аналогично другим ЗС протеазам, будет вызывать апоптоз. Однако в представленном исследовании мы впервые обнаружили, что протеаза ЗС вируса гепатита А человека, в отличие от ЗС протеаз других пикорнавирусов, вызывает каспазонезависимую клеточную гибель, которая сопровождается вакуолизацией зндосомально-лизосомального компартмента гибнущей клетки.

Экспрессия генов ЗСрго и ее каталитически неактивного варианта

В качестве экспрессионного был применен описанный ранее вектор pBI-EGFP. ЗСрго была экспрессирована в немодифицированном (вектор pBI-EGFP/ЗС) и каталитически неактивном виде (вектор pBI-EGFP/3Cmut). Для инактивации протеазы в ее каталитический центр была введена мутация Cysl72—>А1а, которая приводит к супрессии протеолитической активности фермента [Peters, 2005].

Для осуществления экспрессии нами были получены моноклональные линии клеток аденокарциномы легкого человека А549 Tet-Off Advanced и эпидермоидной карциномы легкого человека Calu-1 Tet-Off Advanced (далее обозначены как А549 и Calu-1). После введения векторов pBI-EGFP/ЗС и pBI-EGFP/3Cmut в клетках полученных линий была обнаружены соответствующие транскрипты.

Для характеристики влияния ЗСрго на клетки культуры А549 и Calu-1 были транзиентно трансфицированы векторами pBI-EGFP/ЗС (далее обозначены как А549/ЗСрго и Calu-l/3Cpro,

16

Рисунок 6. Действие протеазы ЗС вируса гепатита А человека на опухолевые клетки человека в культуре. А. Изменение количества содержащих свРР клеток. В течение 144 ч после трансфекции проводили подсчет доли еСРР-содержащих клеток культур А549 и Са1и-1. несущих векторы рВ1-КОГР/ЗС (темные точки, сплошная линия) и рВ1-ЕСРР (светлые точки, пунктирная линия) от общего числа клеток в культурах. Приведены средние значения по данным как минимум двух независимых экспериментов, в каждом из которых были проведены 4 измерения. Доверительные интервалы рассчитаны для Р=95%. В. Морфология содержащих еОИР клеток через 48 ч п/т. N - клетки с нормальной морфологией. Я/В - клетки, демонстрирующие потерю распластанности, приобретение округлой формы. V - вакуолизированные клетки. С. Изменение доли содержащих еОГР клеток с разной морфологией в контрольных (серые столбцы) и опытных (белые столбцы) культурах. Приведенные значения являются усредненным результатом подсчета по итогам как минимум двух независимых экспериментов. Для каждой временной точки проводили подсчет 200 клеток в трех повторах. Доверительные интервалы рассчитаны для Р=95%.

соответственно), рВ1-ЕОРР/ЗСтЩ (А549/ЗСтШ и Са1и-1/ЗСтЩ, соответственно) и рВ1-ЕОРР, не несущим гена ЗСрго (А549/Моск и Са1и-1/Моск, соответственно). В контрольных культурах А549/Моск и Са1и-1/Моск наблюдалось постепенное увеличение количества еОРР-содержащих клеток (рис. 6 А). К концу времени наблюдений (144 ч) их доля составляла около 30% от общего числа клеток в культуре. При этом в течение всего времени наблюдений большинство еОРР-содержащих клеток сохраняло характерную для этих линий морфологию (рис. 6 В). Аналогичная картина наблюдалась в культурах А549/ЗСшЩ и Са1и-1/ЗСтЩ.

В опытных культурах А549/ЗСрго и Са1и-1/ЗСрго доля еОРР-содержащих клеток через 48 ч п/т достигала максимума (8-10%) и уменьшалась до 1-2% через 72 ч. Через 96 ч обнаруживались лишь единичные еОРР-содержащие клетки (рис. 6 А). Значительная часть еОРР-содержащих клеток опытных культур имела измененную морфологию. Кроме клеток с нормальной морфологией, наблюдались клетки, которые теряли распластанность, приобретали округлую форму и демонстрировали сокращение клеточного объема с сохранением гладкой плазматической мембраны или ее блеббингом (рис. 6 В). Эти клетки имели морфологию, характерную для гибели по пути апоптоза. Также были обнаружены клетки, сохранявшие распластанность, но содержащие большое количество цитоплазматических вакуолей. Соотношение клеток с разной морфологией изменялось с течением времени (рис. 6 С). Через 24 ч большинство клеток сохраняло нормальную морфологию. Через 48 ч значительная часть клеток (около 20%) была вакуолизирована. Доля вакуолизированных клеток не менялась вплоть

17

до 72 ч п/т. Через 96 ч п/т большинство eGFP-содержащих клеток имели округлую форму, а клетки с нормальной морфологией и вакуолизированные клетки практически не обнаруживались. Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что ЗСрго вызывает гибель клеток, которая сопровождается накоплением цитоплазматическмх вакуолей. При этом вакуолизация клеток и их гибель зависят от протеолитической активности ЗСрго.

Вызываемая ЗСрго клеточная гибель не сопровождается активацией каспаз

Для определения типа вызываемой ЗСрго гибели были оценены состояние ядер и хроматина, локализация фосфатидилсерина, а также активация каспаз в экспрессирующих ЗСрго клетках. Контрольные клетки A549/Mock и Calu-1/Mock в течение всего времени наблюдений (72 ч) характеризовались нормальной морфологией ядра и состоянием хроматина. Большинство клеток А549/ЗСрго и Calu-l/3Cpro округлой формы через 48 ч демонстрировало конденсацию хроматина и кариорексис, а некоторые вакуолизированные клетки - деформацию ядра и частичную конденсацию хроматина в местах контакта ядра с вакуолями. Через 72 ч в большинстве вакуолизированных клеток наблюдалась выраженная конденсация хроматина, в то время как ядра выглядели фрагментированными (рис. 7). Тот факт, что фрагменты ядер были «зажаты» в пространстве между вакуолями, дает возможность предположить, что изменение морфологии ядер происходило в результате механического воздействия со стороны вакуолей. Вакуолизированные клетки не демонстрировали «блеббинга» плазматической мембраны и сохраняли распластанность. При этом хроматин вакуолизированных и округлых клеток не прокрашивался иодидом пропидия, что указывает на сохранение клетками интактной плазматической мембраны и свидетельствует об отличной от некроза гибели.

Конденсация хроматина, кариорексис и сокращение клеточного объема являются признаками апоптоза - клеточной гибели, как правило сопровождающейся экспонированием фосфатидилсерина во внешнем слое плазматической мембраны и активацией каспаз [Galluzzi, 2012]. Однако на поверхности клеток А549/ЗСрго и Calu-l/3Cpro фосфатидилсерин не был обнаружен. Использование пан-каспазного флуоресцентного реагента FLICA позволило выявить лишь единичные клетки, содержащие активированные каспазы, через 48 и 72 ч п/т (рис. 7). Кроме этого, инкубация культур с ингибитором каспаз z-VAD-fmk не предотвращала вакуолизации и не оказывала заметного влияния на выживаемость экспрессирующих ген ЗСрго клеток. Такое сочетание признаков было описано ранее для альтернативных апоптозу типов клеточной гибели [Pradelli, 2010; Johnson, 2000; Kroemer, 2005; Constantinou, 2009]. Полученные данные свидетельствуют о том, что ЗСрго, в отличие от протеаз других пикорнавирусов, вызывает каспазонезависимую гибель клеток.

В развитии каспазонезавиеимых путей клеточной гибели важную роль играют цистеиновые протеазы - катепсины и калпаины [Guicciardi, 2004; Stoka, 2006; Han, 2009; Song, 2011], которые в отсутствие активированных каспаз способны выполнять их функции [Kaznelson, 2004; Yamashima, 2004; Harwood, 2005; McCall, 2010]. Однако инкубация культур А549/ЗСрго и Calu-l/3Cpro с ингибитором лизосомальных цистеиновых протеаз Z-FA-fmk не предотвращала вакуолизацию и не приводила к заметному изменению выживаемости трансфицированных

клеток. Аналогичная картина наблюдалась в случае ингибитора каспаз Z-VAD-fmk, который в высоких концентрациях (более 10 мкМ) способен кроме каспаз ингибировать цистеиновые катепсины и калпаины [Wolf, 1999; Schotte, 1999]. По-видимому, катепсины и калпаины, так же как и каспазы, не вовлечены в реализацию вызванной ЗСрго гибели. В реализации еще одного альтернативного апоптозу каспазонезависимого пути клеточной гибели - некроптоза - ключевую роль играет киназа Rip-1 [Holler, 2000]. Однако специфический ингибитор этого фермента некростатин-1 [Han, 2009; Degterev, 2008] не оказывал какого-либо влияния на вакуолизацию и выживаемость клеток А549/ЗС и Calu-1/ЗС.

Вызываемые ЗСрго вакуоли формируются из оргаиелл эндосомально-лизосомального компартмента

Цитоплазматическая вакуолизация является признаком ряда патологических состояний [Hirabayashi, 2001; Kourie, 2002; Manfredi, 2005; Vigliano, 2011; Kar, 2009; Su, 2009; Watanabe,

2009] и часто сопровождает каспазонезависимую гибель клеток [Han, 2009; Alcalá, 2008; Cagnol,

2010]. Так как при различных типах каспазонезависимой клеточной гибели вакуоли образуются из различных органелл, то выяснение свойств и происхождения вакуолей может позволить определить тип клеточной гибели.

Для установления происхождения и дальнейшей характеристики цитоплазматических вакуолей был использован набор векторов, кодирующих флуоресцентные белки, адресованные в различные компартменты клетки. Визуализация митохондрий проводилась с помощью цианового флуоресцентного белка, слитого с сигналом митохондриальной сортировки VIII субьединицы цитохром с-оксидазы человека (CFP-mito), позволяющим обнаруживать мембраны митохондрий независимо от функционального состояния этих органелл [Rizzuto, 1995]. Через 72 ч после траснфекции CFP-mito накапливался в митохондриях экспрессирующих ген ЗСрго клеток, однако не обнаруживался в мембранах или просвете вакуолей.

Рисунок 7. Характеристика клеток, экспрессирующих ген ЗСрго. На рисунке представлено изображение культуры Calu-1/ЗСрго через 72 ч п/т Хроматин был визуализирован с помощью интеркалирующего красителя Хехст 3325 8 (канал Hoechst). eGFP - канал флуоресценции зеленого флуоресцентного белка. Merged - совмещенный канал. Детекция активированных каспаз проводилась с помощью флуоресцентного реагента FL1CA (канал FLICA). eGFP-содержащие клетки с нормальной морфологией показаны голубыми стрелками. В накапливающих eGFP вакуолизированных и округлых клетках (показаны белыми и зелеными стрелками, соответственно) хроматин конденсирован при отсутствии активации каспаз. Активация каспаз наблюдалась в единичных накапливающих eGFP клетках (показаны красными стрелками). Часть клеток, не накапливающих eGFP (показаны желтыми стрелками), демонстрируют конденсацию хроматина, кариорексис и активацию каспаз - признаки, свидетельствующие о гибели по пути апоптоза.

Для визуализации ЭПР использовался красный флуоресцентный белок с С-концевой последовательностью SEJCDEL, обеспечивающей задержку белка в мембранах ЭПР (er-RFP) [Klee, 2005]. В контрольных клетках A549/Mock и Calu-1/Mock er-RFP локализовался в гранулах, имеющих характерный для ЭПР паттерн локализации. В то же время в вакуолизированных клетках А549/ЗСрго и Calu-1/ЗСрго er-RFP равномерно распределялся в цитоплазме и не обнаруживался в просвете вакуолей и их мембранах. Полученные результаты свидетельствуют о нарушениях функционирования ЭПР и, возможно, его деградации. Компоненты транс-сети Гольджи были визуализированы с использованием RFP с сигналом сортировки в аппарат Гольджи ß-1,4-галактозилтрансферазы человека. Как и в клетках контрольных культур, в вакуолизированных клетках этот флуоресцентный белок накапливался в отдельных органеллах и не обнаруживался в просвете и мембранах вакуолей. Таким образом, вызываемая ЗСрго вакуолизация не затрагивает эндоплазм этический ретикулум, митохондрии и аппарата Гольджи. Эти данные позволяют заключить, что гибель клеток не идет по путям параптоза, онкоза или некроптоза [Han, 2009; Sperandio, 2000].

Визуализация лизосом и поздних эндосом была осуществлена с использованием флуоресцентного белка mKate2, слитого с белком LAMP-1 (Ll-mKate2). Через 48 ч п/т в клетках культур А549/ЗСрго и Calu-1/ЗСрго, не содержащих больших вакуолей, белок Ll-mKate2 локализовался в везикулах, которые формировали кластеры или были рассредоточены в цитоплазме (рис. 8 А). При этом в вакуолизированных клетках Ll-mKate2 обнаруживался в мембранах всех вакуолей (рис. 8 В). Следует отметить, что по сравнению с клетками без вакуолей, в цитоплазме вакуолизированных клеток содержалось намного меньше везикул с Ll-mKate2. Совокупность полученных данных указывает на формирование вакуолей из органелл эндосомально-лизосомального компартмента и позволяет предположить, что центрами образования вакуолей являются кластеры этих органелл.

Визуализация отдельных популяций эндосом была проведена с помощью цитоплазматических ГТФаз семейства Rab, специфически ассоциирующихся с мембранами эндосомально-лизосомальных органелл различных типов [Blümer, 2013]. Белки слияния Rab5-eYFP, Rab7-eCFP, DsRed-Rab9 и DsRed-Rabll были использованы как маркеры ранних эндосом, поздних эндосом/лизосом, эндосом, рециркулирующих в транс-сеть Гольджи и плазматическую мембрану, соответственно [Schwartz, 2007; Stenmark, 2009]. В вакуолизированных клетках А549/ЗСрго и Calu-l/3Cpro все использованные белки накапливались в мембранах вакуолей (рис. 8 C-F). Полученные результаты указывают на участие в формировании вакуолей нескольких типов органелл эндосомально-лизосомального компартмента.

Для оценки зависимости ЗСрго-индуцированной вакуолизации от функций Rab5 и Rab7 были использованы их доминантно-негативные варианты Rab5/N133I (не способен связывать ГТФ [Bucci, 1992]) и Rab7/T22N (постоянно ассоциирован с ГДФ [Spinosa, 2008; Papini, 1997]), слитые с флуоресцентным белком DsRed. В клетках А549/ЗСрго и Calu-1/ЗСрго, демонстрирующих высокий уровень экспрессии Rab5/N1331 и Rab7/T22N, обнаруживались вакуоли, причем обе ГТФазы были ассоциированы с мембранами вакуолей (рис. 8 G, Н). По своему размеру и морфологии эти вакуоли не отличались от наблюдаемых в клетках, экспрессирующих ген ЗСрго. Таким образом, вакуолизация не зависит от функций этих ГТФаз.

20

в

н

Рисунок 8. Происхождение индуцированных ЗСрго вакуолей. Вакуолизированные клетки А549/ЗСрго и Са1и-1/ЗСрго, экспрессирующие: гены белков слияния Ь1-тКа1е2 через 48 ч п/т (А) и 72 ч п/т (В), 11аЬ5-еСРР (С), ЯаЬ7-еУРР (О), ОзКес1-КаЬ9 (Е), ОзКеё-ЯаЬП (Е), ОзКес1-11аЬ7с1п (О, 08Яс(1-КаЬ5с1п (Н) и ЬСЗ-ЯРР (I) через 72 ч п/т (с!п - доминантно-негативный вариант ГТФаз).

«GFP

fcGFP+Rab5*CFP

Rab7-eYf=P

Rab7-eVFP

eOFr»DbR0(t-Rab9

<sGFP-*.D»Reit-R<ito1l| oGI P

aGFP

ll»Ke(IKali/dii

OaReil-R<|b5(lii

©GF P

oGFP

Аутофагия не существенна для индуцированной ЗСрго вакуолизации и клеточной гибели

Клеточная гибель и цитоплазматическая вакуолизация могут развиваться вследствие нарушения процесса аутофагии [Hayer-Hansen, 2005; Hansen, 2007]. Для оценки участия аутофагосом в формировании индуцированных ЗСрго вакуолей был использован специфический для этих органелл белок LC3, слитый с mRFP. Было обнаружено, что этот белок не накапливается в мембранах, но диффузно распределяется в просвете вакуолей (рис. 8 I). Это указывает на участие аутофагосом в образовании вакуолей. Формирование вакуолей с участием аутофагосом наблюдаются при использовании ряда агентов, вызывающих нарушения процесса аутофагии. Для некоторых случаев установлено, что эти нарушения происходят вследствие конститутивной активации сигнального пути киназ ERK.1/2. Однако инкубация экспрессирующих ЗСрго клеток с ингибиторами киназ этого сигнального пути (PD98059 и Sc-353669) не предотвращала вакуолизацию и не оказывала заметного влияния на выживаемость клеток. Использование 3-метиладенина - ингибитора фосфатидилинозитол-3-киназы класса 3, предотвращающего образование аутофагосом [Bloramaart, 1997; Petiot, 2000] -также не оказывало заметного эффекта. В то же время, инкубация клеток с ингибитором вакуолярной АТФазы бафиломицином А1, часто используемым в качестве блокатора аутофагии [Jahrciss, Menzies, Rubinsztcin, 2008], полностью предотвращала вакуолизацию, но при этом не оказывала влияния на гибель клеток. Поскольку бафиломицин А1 блокирует не только формирование аутолизосом, но и слияние органелл пути эндоцитоза [Mousavi, 2001; Clague, 1994], этот результат, на фоне отсутствия эффекта 3-метиладенина, вновь указывает на формирование вакуолей вследствие слияния органелл эндосомально-лизомального компартмента. Таким образом, полученные данные указывают, что вызываемая ЗСрго вакуолизация и гибель клеток не зависят от аутофагии. Эффект бафиломицина А1 позволяет сделать еще одно важное заключение: вакуолизация не является событием, необходимым для гибели клеток под действием ЗСрго.

Проведенная в данной работе характеристика цитотоксического действия ЗС протеазы вируса гепатита А человека позволила установить, что ЗСрго вызывает гибель клеток, которая не зависит от функционирования каспаз и сопровождается накопление цитоплазматических вакуолей. Цитотоксическое и вакуолизирующее действие ЗСрго зависят от ее каталитической активности. Вызванные ЗСрго вакуоли обладают уникальными свойствами и формируются из нескольких типов органелл эндосомалыю-лизосомального компартмента. Полученные данные указывают, что ЗСрго вызывает каспазонезависимую клеточную гибель с ранее не описанными морфологическими признаками.

Вызываемую ЗС протеазой вакуолизацию интересно рассмотреть в контексте «цитопатического эффекта» пикорнавирусов, который выражается в характерных морфологических изменений компартментов инфицированных клеток. В случае вируса гепатита А и других пикорнавирусов цитопатический эффект выражается в раздувании цистерн ЭПР, формировании многослойных мембранных образований, а также накоплении

цитоплазматических вакуолей. Полученные результаты позволяют предположить участие протеазы ЗС в развитии цитопатической морфологии инфицированных клеток, и, таким образом, могут отражать ранее неизвестные аспекты взаимодействия вируса гепатита А человека с хозяйской клеткой. Поэтому механизм действия ЗСрго на эндосомально-лизосомальный компартмент, и роль этой протеазы в развитии цитопатического эффекта вируса требует дальнейших исследований.

ВЫВОДЫ

1. Уровень мРНК гена катепсина D при немелкоклеточном раке лёгкого снижен. Полученные данные позволяют рассматривать мРНК гена катепсина D в качестве маркера опухолевые тканей лёгких.

2. При раке легкого изменение экспрессии генов пробелокконвертаз происходит по нескольким основным сценариям. Для этих сценариев характерно повышение экспрессии генов FURIN, PSCK1 или PCSK6. Обнаруженные сценарии, вероятно, отражают различия в происхождении и/или свойствах опухолей.

3. Протеаза ЗС вируса гепатита А человека (ЗСрго) проявляет цитотоксическое действие, обусловленное ее каталитической активностью.

4. В отличие от ЗС протеаз других пикорнавирусов, ЗСрго вызывает каспазонезависимую гибель клеток человека, в том числе раковых.

5. Протеаза ЗС вируса гепатита А человека нарушает функционирование эндосомально-лизосомального компартмента, вызывая цигоплазматическую вакуолизацию. Полученные данные, по-видимому, указывают на ранее неизвестные аспекты взаимодействия вируса гепатита А человека с хозяйской клеткой.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в научных журналах:

1. Shubin A.V., Demidyuk I.V., Kurinov A.M., Demkin V.V., Vinogradova T.V., Zinovyeva M.V., Sass A.V., Zborovskaya I.B., Kostrov S.V. Cathepsin D messenger RNA is downregulated in human lung cancer. // Biomarkers. 2010. V. 15. N. 7. P. 608-613.

2. Demidyuk I.V., Shubin A.V., Gasanov E.V., Kostrov S.V. Propeptides as modulators of functional activity of proteases. // Biomolecular concepts. 2010. V. 1. N. 1-2. P. 305-322.

3. Шубин A.B., Лунина H.A., Шедова E.H., Рощина М.П., Демидюк И.В., Виноградова Т.В., Копанцев Е.П., Чернов И.П., Костров С.В. Оценка токсического эффекта при транзиентной экспрессии генов протеаз в клетках линии НЕК293. // Биотехнология. 2012.

No 4. С. 82-88.

4. Demidyuk I.V., Shubin A.V., Gasanov E.V., Kurinov A.M., Demkin V.V., Vinogradova T.V., Zinovyeva M.V., Sass A.V., Zborovskaya I.B., Kostrov S.V. Alterations in gene expression of proprotein convertases in human lung cancer have a limited number of scenarios. // PLoS ONE. 2013. V. 8. N. 2. P. e55752.

Тезисы конференций:

1. Шубин A.B., Лунина Н.А., Новосадова Е.В., Демидюк И.В., Костров С.В. Гены протеиназ как потенциальные агенты противораковой терапии. // Молодежная научная школа «Методы культивирования клеток» 6-10 октября 2008 г. Цитология. 2008. Т. 50. No 9. С. 832.

2. Шубин А.В., Демидюк И.В., Дёмкин В.В., Куринов А.М., Зиновьева М.В., Ксотров С.В. Количественное определение экспрессии генов катепсинов В и D на уровне мРНК в раковых опухолях легкого человека. // XXII Зимняя молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" 8-11 февраля 2010 г. Сборник тезисов. С. 15.

3. Shubin А.V., Demidyuk I.V., Kurinov A.M., Demkin V.V., Vinogradova T.V., Zinovyeva M.V., Sass A.V., Zborovskaya I.B., Kostrov S.V. Cathepsin D mRNA level is reduced in lung cancer. // Proceedings of the International Symposium "Control of Gene expression and Cancer" June 21-25, 2010. P. 53-54.

4. Шубин A.B., Демидюк И.В., Куринов A.M., Демкин B.B., Семёнова Г.В., Зиновьева М.В., Сасс А.В., Зборовская И.Б., Костров С.В. Уровень мРНК катепсина D снижен в раковых опухолях лёгких человека. // IV международная школа молодых учёных по молекулярной генетике "Геномика и биология клетки". 29 ноября - 3 декабря 2010 г. С. 225-6.

5. Шубин А.В., Лунина Н.А., Рощина М.П., Демидюк И.В., Костров С.В. Протеаза ЗС вируса гепатита А человека вызывает каспазонезависимую гибель раковых клеток. // Всероссийский симпозиум "Белки и пептиды 2011". 8-12 августа 2011 г. С. 423.

6. Демидюк И.В., Шубин А.В., Гасанов Е.В., Куринов A.M., Демкин В.В., Виноградова Т.В., Зиновьева М.В., Сасс А.В., Зборовская И.Б., Костров С.В. Изменение экспрессии генов пробелокконвертаз при раке легкого. // Конгресс "Белки и пептиды 2011". 8-12 августа 2011 г. С. 132.

7. Шубин А.В., Комиссаров А.А., Рощина М.П., Лунина Н.А. Протеаза ЗС вируса гепатита А человека вызывает каспазонезависимую гибель клеток. // V Международная школа молодых ученых по молекулярной генетике "Непостоянство генома". 3-7 декабря 2012 г. Сборник тезисов. С. 71.

8. Shubin A.V., Lunina N.A., Roshina М.Р., Komissarov A.A., Demidyuk I.V., Kostrov S.V. Cytotoxic effect of human hepatitis A 3C protease is accompanied by cytoplasmic vacuolization. // Federation of European Biochemical Societies Congress «Mechanisms in Biology», July 6-11, 2013 St. Petersburg, Russia. FEBS Journal. 2013. V. 280 (Suppl. 1). P. 366.

Подписано в печать:

15.10.2014

Заказ № 10299 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru