Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярные механизмы цитолитического действия лимфокин-активированных киллеров

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярные механизмы цитолитического действия лимфокин-активированных киллеров"

''' # ,.4

V

^ На правах рукописи

%

УДК 576.314.547.9155

САЩЕНКО ЛИДИЯ ПАВЛОВНА

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ЦИТОЛИТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ЛИМФОКИН-АКТИВИРОВАННЫХ КИЛЛЕРОВ

Специальности 03.00.03 - "молекулярная биология" 03.00.25 - "клеточная биология"

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва -1997 г.

Работа выполнена в Институте биологии гена РАН.

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Гнучев Н.В.

Официальные оппоненты: член-корреспондент РАЕН, доктор биологических наук, профессор Арион В .Я. доктор биологических наук, профессор Поляновский О.Л. доктор биологических наук, профессор Разин С.В.

Ведущая организация: Институт иммунологии Министерства здравоохранения и медицинской промышленности РФ.

Защита диссертации состоится " " ¡Х/и-^'ЪАЛ'А 1997 года в " -/У " часов на заседании Диссертационного совета Д.200.30.01 при Институте биологии гена РАН по адресу: 117334, г. Москва, ул. Вавилова, д. 34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 117984, г. Москва, ул Вавилова д. 32.

Автореферат разослан «дг " ^С^'Ь^р сг*~и_1997 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета

канд. фарм. наук

Грабовская Л.С.

Актуальность проблемы. В основе противоопухолевого иммунитета лежит способность цитолитических клеток иммунной системы узнавать и нейтрализовать клетки собственного организма с измененными аллоантигенами. Основная роль в цитолизе потенциально опасных для организма клеток отводится цитолитическим Т-лимфоцитам и естественным киллерам.

Открытие в 1982 году интерлейкина-2-зависимой цитотоксичности лимфоцитов периферической крови стало значительным событием в изучении механизмов клеточного иммунитета. Длительная инкубация клеток с шггерлейкином-2 позволила получить лимфоциты человека с высокой цитотоксичностью, не зависящей от иммунного статуса донора. Это свойство лимфокинактивировашшх киллеров обеспечило не только их применение для лечения злокачественных заболеваний, но и использование в качестве удобной модельной системы для изучения механизма цитиолитического действия.

Механизм цитолиза, опосредованного действием лимфоцитов можно описать единой схемой. Согласно этой схеме, взаимодействие рецепторов цитолитических лимфоцитов с соответствующими антигенными детерминантами клеток-мишеней приводит к активации эффектора. Результатом такой активации является повышенная экспрессия генов цитотоксических белков и выделение этих белков путем встраивания в мембрану лимфоцита или секреции в зону контакта с клеткой-мишенью. При взаимодействии рецепторов клетки-мишени с цитотоксическими белками, ассоциированными с мембраной, реализуется контактный путь лизиса. Секреция цитотоксических белков, заключенных в особые цитолитические гранулы, обеспечивает Са2+-зависимый, секреторный путь лизиса. Взаимодействие цитотоксических белков с клетками-мишенями индуцирует лизис этих клеток. После диссоциации конъюгатов (эффектор - клетка-мишень) в клетках-мишенях реализуются процессы, запрограммированные при активации лимфоцита. Лизис клеток может осуществляться как по пути апоптоза, так и некроза.

Хотя предложенная схема довольно четко обрисовывает основной путь лизиса, многие конкретные особенности цитолиза представляются недостаточно изученным.

Считается, что цитолитическое действие лимфоцитов связано с реализацией двух основных путей цитолиза: экспрессии Fas-лиганда на мембране лимфоцита и секреции перфорина и BLT-эстераз в зону контакта. В то же самое время показано, что Fas-лиганд встраивается только в мембрану специфических ЦТЛ, действие которых ограничено белками главного комплекса гкстосовместимости клеток-мишеней, а перфорин не всегда присутствует в гранулах ЕКК, ЛАК клеток и некоторых клопов ЦТЛ. Поэтому трудно объяснить все цитолитические эффекты Fas- или перфорип-зависимым апоптотическим лизисом. Также известно, что лимфоцит-зависимый цитолиз не ограничивается индукцией только апоптотических процессов. Поэтому, несмотря на успехи в изучении механизма цитолиза, многие вопросы остаются невыясненными.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы исследование механизма цитолитического действия ЛАК клеток на стадии активации лимфоцита и независимого лизиса клеток-мишеней. Основными задачами были:

1. Характеристика мембраносвязанных и секретированных цитотоксических белков ЛАК клеток.

2. Сравнительный анализ белков, секретированных по Са2+-зависимому и по Са2+-независимому механизмам.

3. Оценка вклада некротических и апоптотических характеристик в цитолитические процессы, индуцированные ЛАК клеток и их цитотоксическими белками.

4. Характеристика модуляторов ЛАК-зависимого цитолиза.

Научная новизна и практическая ценность. Показано изменение фенотипа ЛАК клеток при стимуляции ИЛ-2: на 3-4 сутки инкубации с ИЛ-2 ЛАК клетки представлены субпопуляцией ЕКК, на 6-7 сутки инкубации -субпопуляцией ЦТЛ. Установлено, что ЛАК клетки могут осуществлять контактный и секреторный пути цитолиза. Охарактеризованы мембраносвязанные и секретированные белки ЛАК клеток. Показано, что эти

белки не принадлежат к семейству ЮТ-белков. Детально описаны кальций-независимый механизм цитолиза ЛАК клеток. Установлено, что цитолиз ЛАК клеток при свзяывании ионов кальция обусловлен не только цитолитической активностью белков, ассоциированных с мембраной, но и секрецией цитотоксических белков. Проведен сравнительный анализ цитотоксических белков, секретироваиных по кальций-зависимому и кальций-независимому механизмам. Определены мол. массы этих белков. Показано, что ЛАК клетки секретируют гранулярные белки, а также выделяют широкий спектр цитотоксических белков без предварительной стимуляции. Установлено, что вклад апоптотических и некротических характеристик в цитолиз, индуцированный ЛАК клетками, зависит от физиологического состояния и типа клеток-мишеней, субпопуляции ЛАК клеток и времени инкубации клеток-мишеней с цитолитическими клетками. Показано, что цитотоксичность, опосредованная действием как мембрашшых, так и секреторных цитотоксических белков, характеризуется наличием дискретных цитолитических процессов. Установлено, что ВЬТ-эстеразы могут не только активировать, но и ингибировать апоптотическую гибель клеток. Показано, что белки сыворотки крупного рогатого скота и человека обладают способностью ингибировать ЛАК-зависимый цитолиз.

Работа принадлежит к фундаментальным исследованиям и расширяет современные представления о механизме действия цитолитических лимфоцитов. Полученные данные представляют также практический интерес. Описание мембранных и секреторных цитотоксических белков открывает перспективу получения их в гомогенном состоянии, создания на основе этих белков противоопухолевых препаратов и использовании их в медицинской практике для терапии и ранней диагностики онкологических заболеваний. Изучение механизма цитолиза опухолевых клеток и характеристика процессов, участвующих в регуляции ЛАК-зависимого циолиза, позволит разработать путь направленной регуляции цитолитического действия лимфоцитов.

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на 14-ом Международном биохимическом конгрессе (Прага, 1988), 17-ом Совещании по молекулярной и клеточной биологии (Лос-Анджелес, 1988), 2-ой Международной конференции по фактору некроза опухолей и связанным

цитокинам (Нана, Калифорния, 1989), Всесоюзном симпозиуме по хишш белка (Тбилиси, 1990), Всесоюзном симпозиуме по молекулярной и клеточной онкологии (Львов, 1990), Симпозиуме "Структура и функция регуляторных полипептидов" (Москва, 1992), на 8-ом Международном иммунологическом конгрессе (Будапешт, 1992), на 22-ом Совещании ФЕБО (Стокгольм, 1993), на 1-ом Европейском симпозиуме Белкового Общества (Давос, Швейцария, 1995), на 3-ей и 4-ой Евроконференции по апоптозу (Куенка, Испания, 1995, Капри, Италия, 1996), на Совещании ФЕБО (Барселона, 1996).

I. Результаты исследования.

Характеристика лимфокин-активнрованных киллеров.

ЛАК клетки представляют собой гетерогенную смесь мононуклеарных клеток крови и способны изменять свои свойства в зависимости от времени инкубации с ИЛ-2, а также от концентрации ИЛ-2. Описаны изменения ЛАК клетками фенотипа, специфичности к клеткам-мишеням, экспрессии мРНК для таких цитокинов, как ИЛ-1, TNF, ЛТ и у-ИФН, активности цитотоксических белков.

Для изучения изменения цитолитической активности ЛАК клеток при стимуляции их ИЛ-2 лейкоциты периферической крови человека инкубировали в присутствии 1000 ед мл"1 рекомбинантного ИЛ-2 в течение 8 суток. Цитотоксическую активность тестировали на линиях клеток эритролейкемии человека К-562 и мышиных фибробластов L-929.

Как видно из результатов, приведенных на рис. 1, ЛАК клетки эффективно лизировали как линии клеток К-562, так и L-929, хотя клетки К-562 являются более чувствительными мишенями для ЛАК клеток. Цитолитическая активность ЛАК клеток в отношении обеих линий клеток изменялась в процессе стимуляции ИЛ-2, образуя два максимума: на 3-4 сутки и на 6-7 сутки с падением цитогоксичносги на 5 сутки (рис.1). Полученные результаты подтверждались при исследовании цитотоксической активности секретированных белков. Цитотоксичность сулернатанта ЛАК клеток, полученного после инкубации лимфоцитов с клетками-мишенями, изменялась аналогично изменению активности самих ЛАК клеток. Также наблюдалось

Рис. 1. Цотолитическая активность ЛАК клеток в зависимости от времени инкубации с

ИЛ-2.

1. ( - ) - в качестве клеток-мишеней использовалалсь линия клеток 1.-929.

2. ( —) - в качестве клеток-мишеней использовалась линия клеток К-562.

Клетки инкубировали в течение 3 часов при 37°С, отношение ЛАК клетки / клетки-мишени составляло 20:1.

количество позитивных клеток (%)

Рис. 2 Изменение фенотипа популяции ЛАК клеток в зависимости от времени инкубации с ИЛ-2.

1 - эксперессия антигенного маркера СД16

2 - экспрессия антигенного маркера СДЗ

3 - экспрессия антигенного маркера СД8.

В качестве контроля использовали неспецифическую флуоресценцию необработанных антителами клеток.

наличие двух максимумов активности на 3-4 и 6-7 сутки с падением цитотоксичности на 5 сутки.

В составе популяции ЛАК клеток присутствуют клетки с поверхностными антигенами, характерными как для естественных киллеров, так и для цитолитических Т-лимфоцитов. Поэтому мы предположили, что характерное изменение цитотоксичности ЛАК клеток обусловлено изменением фенотипа этих клеток. Методом проточной цитофлуорометрии был определен уровень экспрессии клеточных маркеров CD3, CD8, CD 16 в зависимости от времени инкубации клеток с Ш1-2. Было установлено, что на 3-4 сутки культивирования с ИЛ-2 популяция содержит, главным образом, клетки с антигенами CD8 и CD 16, что характерно для субпопуляции ЕКК (ЫК-ЛАК клетки), на 6-7 сутки культивирования преобладают клетки с антигенами CD8 и CD3, характерными для субпопудяции ЦТЛ (Т-ЛАК клетки) (рис. 2). Таким образом, при использовании клеток одного донора, было показано, что в процессе культивирования лейкоцитов периферической крови с ИЛ-2 изменяется состав популяции ЛАК клеток.

Характеризуя популяцию ЛАК клеток, мы исследовали влияние ионов Са2+ на цитолитическое действие ЛАК клеток. Для этого ЛАК клетки получали в течение 8 суток культивирования с ИЛ-2 и определяли их активность в присутствии Са2+-связывающего реагента, EGTA.

На рис. 3 представлены результаты определения цитотоксичности ЛАК клеток в зависимости от времени инкубации с ИЛ-2. Можно видеть, что на 3-4 сутки культивирования, когда клетки преимущественно представлены субпопуляцией ИК-ЛАК, цитотоксичность снижается только на 10%, активность Т-ЛАК клеток в присутствии EGTA снижается более чем в 2 раза. Однако цитотоксичность не блокируется полностью на 6-ые сутки инкубации, а достигает 25%, т.е. Т-ЛАК клетки также проявляют цитотоксическое действие при связывании ионов Са2+.

Таким образом, мы показали, что цитотоксичность ЛАК клеток не изменяется пропорционально изменению времени стимуляции клеток ИЛ-2, а характеризуется двумя максимумами: на 3-4 сутки и на 6-ые сутки с падением на 5 сутки. Изменение цитотоксичности коррелировало с изменением фенотипа ЛАК клеток. На 3-4 сутки в популяции присутствуют в основном NK-ЛАК

цитотоксичность % 80

60

40

20

¿--I

I

•Г-1---1

т

т

т

0 1* 2* 3*. 4' 5' б' 7' 8

Рис. 3 Влияние ЕвТА на дагтолитаческуто активность ЛАК лкеток.

1 - цитотоксичность определялась без ЕвТА;

2 - цитотоксичпость определялась в присутствии 4 тМ НОТА.

ЦИТОТОКСИЧНОСТЬ %

40

гг

—I

сутки

20

8

16

32

64

Рис. 4 Зависимость циготоксической активности суммарной фракции мембран в зависимости от концентрации белка.

1. ЦитогоксЙчносхь фракции мембран №С-ЛАК клеток (3-ьи сутки стимуляции Ш1-2).

2. Цитотоксичность фракции мембран Т-ЛАК клеток (б-ые сутки стимуляции ИЛ-2).

В качестве клеток-мишеней использовали линию клеток К-562. Клетки 2 часа инкубировали с фракцией мембран, после чего определяли цитотоксическую активность.

клетки, на 6-7 сутки - Т-ЛАК клетки. Вне зависимости от фенотипа ЛАК клетки могут проявлять цитолитическую активность как в присутствии, так и в отсутствии ионов Са2+.

П. Анализ цитотоксических белков ЛАК клеток.

Как упоминалось выше, после связывания лимфоцита с рецепторами клеток-мишеней наступает стадия активации лимфоцита, осуществляемая как в присутствии, так и в отсутствии ионов Са2т. Эта стадия обусловлена секрецией в зону контакта или появлением на мембране лимфоцита цитотоксических белков. Общей чертой цитолитических Т-лимфоцитов, естественных киллеров и ЛАК клеток является наличие в цитоплазме лимфоцита цитолитических гранул, способных лизировать опухолевые клетки. Основными белками цитолитических гранул является перфорин, семейство сериновых эстераз (ВГ.Т-эстераз) и Са2+-связывающий белок - кальретикулин. Секреция белков, содержащихся в гранулах, является Са2+-зависимым процессом. Поэтому Са2+-зависимый механизм цитотоксичности объясняют экзоцитозом белков цитолитических гранул. Са2+-независимый механизм лизиса обычно связывают с активностью белков, ассоциированных с мембраной лимфоцита, хотя не исключена возможность секреции растворимых цитолитических белков в отсутствии экзогешюго кальция.

Анализируя цитотоксические белки ЛАК клеток, мы исследовали вклад в общую цитотоксичность ЛАК клеток активности мембраносвязанных цитотоксических белков, а также цитотоксических белков, секретируемых по Са2+-зависимому и по Са2+-независимому пути.

Цитотоксические белки, ассоциированные с мембранами.

Активность мембранных белков исследовали в период достижения максимальной активности ЛАК клеток, на 4 и 6 сутки стимуляции ИЛ-2.

Для получения мембранных белков фракцию мембран ЛАК клеток осаждали центрифугированием при 105000 g. Для удаления периферических белков препараты мембран обрабатывали 1 М фосфатным буфером (рН 7,4) и 0,1 М КаОН. Для удаления липидов проводили экстракцию мембранной фракции эфиром.

На рис. 4 приведена зависимость изменения цитотоксической активности от концентрации мембранных белков, полученных на 4 и б сутки шгкубашш с ИЛ-2. Можно видеть, что профили двух кинетических кривых различны и что максимальная цитотоксичность достигается для белков, полученных на 4 сутки, при более низкой концентрации, чем для белков, полученных на 6 сутки, т.е. в сравнении с мембранными белками Т-ЛАК клеток мембранные белки ЮС-ЛАК клеток обладают более высокой удельной активностью. Аналогичные результаты были получены при исследовании изменения цнтолитического действия мембранных белков в зависимости от времени инкубации с клетками-мишенями. Через 3 часа инкубации цитотоксичность белков МК-ЛАК клеток превышала в 1,5 раз цитотоксичность мембранных белков Т-ЛАК клеток.

Полученные результаты позволяют предположить, что мембраны ЫК-ЛАК клеток обладают высокой цитотоксичностью и что после 5 суток культивирования клеток с ИЛ-2 экспрессия мембранных белков, по-видимому, снижается.

Для идентификации мембранных цитотоксических белков мембраны солюбилизировали в буферном растворе, содержащем 2% БББ, и использовали электрофорез в 12% полиакриламидном геле в присутствии ББЗ с последующим электропереносом на мембрану из поливинштидендифторида.

Результаты электрофоретического анализа показали, что ЛАК клетки с различным фенотипом экспрессируют различные мембранные цитотоксические белки. Активность мембран ЫХ-ЛАК клеток связана с действием белков с мол. массой 40, 32, и 21 кДа, активность мембран Т-ЛАК клеток определяется действием белков с мол. массой 38 и 21 кД. Описанные белки были прочно связаны с цитоплазматической мембраной, так как их не удалось десорбировать с мембраны растворами с высокими значениями ионной силы (1 М фосфатный буфер) и рН (0,1 М №ОН). Однако, их свойства отличались от свойств интегральных мембранных белков, так как они элюировались с гидрофобной поливинилидендифторидной мембраны без добавления детергента.

Иммуноферментнын анализ мембраных белков ЛАК клеток с использованием поликлональиой сыворотки с ЮТ не показал наличия иммунореактивного материала среди идентифицировашшх цитотоксических

белков мембран. Следовательно, цитотокеичность мембран ЛАК клеток не связана с действием TNF и TNF-иммунореактивиых белков.

Цитотоксические белки, секретируемые по Са2+- зависимому механизму.

Цитолитические лимфоциты считаются секреторными клетками с прерывистым типом секреции, для которых регуляторным сигналом для начала секреции служит взаимодействие с клетками-мишенями. Поэтому для получения секреторных белков ЛАК клетки инкубировали с линией клеток К-562 в бессывороточный среде в течение 18 часов, суспензию клеток отделяли центрифугированием, а супернатант, обладающий цитотоксичностью использовали в качестве источника цитотоксических белков.

Для разделения цитотоксических белков суперантанта ЛАК клеток, полученных на 5 сутки стимуляции ИЛ-2, использовали ионообменную хроматографию на DEAE-Toyopearl (рис. 5). При тестировании цитотоксичности были идентифицированы две фракции, обладающие цитолитическим действием на клетки L-929: Ф1 и Ф2, элюирующиеся с колонки при различной ионной силе. Мы исследовали вклад активности каждой фракции в суммарную цитотокеичность ЛАК клеток. Для этого в идентичных условиях проводили хроматографическое разделение супернатантов ЛАК клеток, полученных с 1 по 8 сутки культивирования с ИЛ-2 (рис. 6). Цитотокеичность Ф2 достигала максимального значения на 3-4 сутки инкубаци, цитотокеичность Ф1 - на 6-7 сутки, что строго коррелировало с максимумами суммарной цитотоксической активности супернатанта и соответствовало изменению фенотипа ЛАК клеток. Полученные результаты позволяют предположить, что ЛАК клетки обладают специфичностью секреции цитотоксических.белков: Ж-ЛАК клетки выделяют при контакте с клетками-мишенями белки Ф2, Т-ЛАК клетки - белки Ф1.

Корреляция, обнаруженная между изменением фенотипа популяции ЛАК клеток и составом секретированных белков, была подтверждена дополнительными исследованиями. Фракционирование супернатантов классических ЕКК и классических ЦТЛ мыши на колонке DEAE-Toyopearl в условиях, аналогичных хроматографическому разделению супернатанта ЛАК

Рис. 5 Аналитическое хроматографическое разделение супернатангта ЛАК клеток, полученных на 5-ые сутки культивирования, на колонке DEAE-Toyopearl 650S. Колонка (1x4 см) уравновешивалась 0,01 М трис-HCl, pH 8,0. Разделение проводилось в градиенте концентрации NaCl.

( - ) А (280 км), (—) концентрация NaCl (...!...) шгготоксичность.

цитотоксичность %

Рис. 6 Цитотоксическая активность фракций Ф1 (1) и Ф2 (2) в зависимости от времени инкубации ЛАК клеток с ИЛ-2.

ЛАК клетки, полученные на каждый день культивирования с ИЛ-2, ot 1-го до &-го дня, инкубировали с клетками К-562 в течение 18 часов при 37°С, получе!шый супернатант разделяли на колонке ОЕАЕ-Тоуореаг1, в каждой фракции определяли щпотоксическую акпшность.

клеток человека, показало, что ЕКК мыши также секретировали белки, элюирующиеся во Ф2, а ЦТЛ мыши - белки, элюирующиеся в Ф1. (ЕКК выделяли из селезенки бестимусных мышей, в качестве ЦТЛ использовали смешанную культуру лимфоцитов BALB/c и СЗН).

Для идентификации цитотоксических белков Ф1 и Ф2 использовали электрофоретическое разделение белков в акр1иамидном геле с последующим электропереносом на мембрану из поливишздцендифторида, элюцией белков с мембраны и определением их цитотоксичности. Цитотоксическая активность NK-ЛАК клеток (Ф2) бьша обусловлена действием белков с мол. массой 75, 38, и 22 кД, цитотоксичность Т-ЛАК клеток (Ф1) - действием белков с мол. массой 40 и 30 кД.

Иммуноферментный анализ цитотоксических фракций Ф1 и Ф2 с антителами к ИФН-у и TNF и Fas-лиганду не обнаружил в составе этих фракций ни ИФН-у, ни TNF, ни белков, обладающих TNF- и Fas-лиганд-иммунореактивностью. Белки, охарактеризованные в этой работе, возможно, принадлежат к еще неописанному семейства у цитотоксических белков.

Цитотоксические белки, секретируемые по Са2+-нсзависимому механизму.

Установленная нами корреляция между снижением цитолитической активности Т-ЛАК клеток в присутствии 4мМ EGTA и уменьшением удельной активности мембранных белков ЛАК клеток, полученных на 6-ые сутки стимуляции ИЛ-2, позволяет связать Са2+-независимую активность ЛАК клеток с действием цитотоксических белков, ассоциированных с мембранами. Однако, возможность Са2+-независимой секреции белков нельзя исключить, хотя до настоящего времени не было показано выделение в среду растворимых медиаторов лизиса в отсутствии экзогенного Са2+.

Мы исследовали возможность выделения ЛАК клетками растворимых цитотоксических белков по Са2+-независимому пути. ЛАК клетки, полученные на 4-ые и 6-ые сутки культивирования с ИЛ-2, инкубировали с линией клеток К-562 в присутствии 4 мМ EGTA в течение 18 часов, смесь клеток отделяли центрифугированием и исследовали активность полученного супернатанта. Цитотоксичность тестировали на клетках L-929. О секреции гранулярных.

цитотоксичность % 60"

30 -

0 -1

1

00 (405 пт) ОЛТ

0.2

цитотоксичность

ВЬТ-эстеразная активность

СР1в+

СОЗ+

цитотоксичность % 60'

30-

0 -I

00 (405 пт) 0.'

0.2

ЦИТОТОКСИЧНОСТЬ

ВЬТ-эстеразная активность

С016+

С03+

Рис. 7. Цитотоксическая и ВЬТ-эстеразиая активность супернатанта №С-ЛАК клеток и Т-ЛАК клеток в отсутствии (А) и в присутствии 4 шМ ЕвТА.

Б

белков судили по активности ВЬТ-эстераз, протсолитичсских ферментов, присутствующих в цитолитических гранулах лимфоцитов и являющихся маркерами цитолитических гранул.

На рис. 7 приведены цитотоксическая и ВЬТ-эстеразная активность супернатантов ЛАК клеток, полученных в присутствии и отсутствии Са2+. Можно видеть, что супернатанты Ж-ЛАК клеток и Т-ЛАК клеток, полученные без ЕОТА, обладают как цитотоксической, так и ВЬТ-эстеразной активностью, т.е. клетки секретируют гранулярные белки. При секреции в присутствии НОТА ВЬТ-эстеразная активность, а, следовательно, и выделение гранулярных белков, щцибировалась на 90%, но при этом цитотоксичность супернатантов как ЫК-ЛАК клеток, так и Т-ЛАК клеток снижалась очень незначительно. Эти результаты свидетельствуют о том, что при взаимодействии с клетками-мишенями ЛАК клетки способны выделять в зону контакта не только белки гранул, здесь участвуют дополнительные секреторные механизмы.

Для характеристики белков, секретированных в присутствии ЕОТА, использовали стандартную ионообменную хроматографию на ОЕАЕ-Тоурсаг1. Результаты хроматографического разделения белков демонстрируют отсутствие специфической зависимости состава секретируемых белков от фенотипа ЛАК клеток (рис. 8). Можно видеть, что и Ж-ЛАК клетки, и Т-ЛАК клетки при связывании экзогенного Са2+ секретируют белки, элюирующиеся во Ф2. ЕОТА не влияет на секрецию белков ИК-ЛАК клеток, но ингибирует выделение белков, характерных для Т-ЛАК клеток, элюирующихся в Ф1. Электрофоретический анализ цитотоксических фракций с последующим электропереносом и элюцией белков с мембраны показал, что в присутствии ЕОТА и ЮС-ЛАК клетки, и Т-ЛАК клетки секретируют цитотоксические белки с мол. массой 75, 35, и 22 кД.

Цитотоксические белки, секретируемые без предварительной инкубации с клетками-мишенями.

Из литературных данных известно, что при секреции прерывистого типа синтезируемый клетками продукт депонируется в секреторных гранулах, содержимое которых выделяется только в ответ на специфический сигнал, различный для разных клеток. Так как активность цитолитических лимфоцитов

цитотоксичность % N301 (М)

Рис. '8

ЦИТОТОКСИЧНОСТЬ % ЫаС1 (М)

Рис. 8 9 Хромазюграфическое разделение на колонке ОЕАЕ-Тоуореаг1 супернатантов ЛАК клеток, полученных в присутствии 4 тМ ЕвТА (рис» 8 ) и в отсутствии клеток-мишеней без ЕвТА (рис. 9

( - ) А 280, ( —) концентрация №С1, () цитотоксичность белков КК-ЛАК клеток, (...«...) цитотоксичность белков Т-ЛАК клеток.

проявляется при контакте с клетками-мишенями и в цитоплазме лимфоцитов обнаружены цитолитические гранулы, принято считать, что для цитолитических лимфоцитов характерна секреция прерывистого типа и взаимодействие с клетками-мишенями служит сигналом для экзоцитоза белков цитолитических гранул. Морфологические исследования ультраструктуры лимфоцитов свидетельствуют о присутствии гипертрофированного, активного аппарата Гольджи в цитоплазме цитолитических лимфоцитов, поэтому не исключено, что эти клетки могут осуществлять и непрерывную секрецию без специфической стимуляции.

Для проверки этого предположения ЛАК клетки инкубировали в среде, не содержащей сыворотку, в отсутствии клеток-мишеней в течение 18 часов и исследовали цитотоксичность и белковый состав полученного супернатанта. Такие супернатанты обладали низкой цитолитической активностью, цитотоксичность белков, секретироваиных ЛАК клетками, не превышала 10%, цитотоксичность белков Ж-ЛАК клеток составляла 15%. Однако, после концентрирования и хроматографического разделения супернатантов на колонке ОЕАЕ-Тоуореаг1 с колонки элюировались белки с значительной цитотоксичностью (рис. 9). Белки, секретированные Т-ЛАК клетками, элюировались в Ф2 при той же ионной силе, что и белки, секретировацные в присутствии клеток-мишеней, и в ФЗ. Белки, секретируемые НК.-ЛАК клетками, элюировались в ФЗ. Не было обнаружено белков, элюирующихся в Ф1.

Электрофоретический анализ этих фракций показал, что белки, секретировашгые Т-ЛАК клетками, не различались по составу и включали цитотоксические белки с мол. массой 55, 38, 25 и 22 кД. Цитотоксичность белков, секретированных ИК-ЛАК клетками, обусловлена действием белков с мол. массой 70, 55, 38, 25,22 и 17 кД.

Суммируя вышеприведенные данные, можно выявить характерные особенности активации ЛАК клеток:

1. ЛАК клетки вне зависимости от изменения фенотипа могут реализовать как контактный, так и секреторный механизм лизиса. Экспрессия цитотоксических белков, связанных с мембраной, изменяется при стимуляции клеток ИЛ-2. На ранних этапах стимуляции с мембраной ИК-ЛАК клеток связаны цитотоксические белки с мол. массой 40, 30, и 21 кД, при длительной

инкубации клеток с ИЛ-2, с мембраной Т-ЛАК клеток ассоциированы цитотоксические белки с моя. массой 38 и 21 кД.

2. И КК-ЛАК клетки, я Т-ЛАК клетки могут осуществлять секрецию гранулярных белков при контакте с клетками-мишенями в присутствии ионов Са2+, а также секрецию цитотоксических белков при связывании экзогенного Са2+, когда блокирован экзоцитоз гранул. ЛАК клетки способны выделять широкий спектр цитотоксических белков без предварительной стимуляции, вероятно, по типу непрерывной секреции.

3. ЛАК клетки секретируют без предварительной инкубации с клетками-мишенями не менее 7 цитотоксических белков с мол. массой от 70 до 17 кД. Вне зависимости от фенотипа выделяются практически одни и те же белки, за исключением р70 и р17, которые не секретируются Т-ЛАК клетками.

Контакт с клетками-мишенями изменяет состав секрепгруемых белков. Также уменьшается число выделяемых белков, но увеличивается их удельная активность. ЯК-ЛАК клетки секретируют белки (р70, р38 и р22), которые могут выделяться и без предварительной стимуляции. При взаимодействии Т-ЛАК клеток с клетками-мишенями индуцируется специфичность секреции. Только в этих условиях выделяются белки р40 и рЗО.

Ионы Са2+ также вносят вклад в регуляцию секреции. В отсутствии ионов Са2+ исчезает зависимость состава секретированных белков от фенотипа секретирующих клеток. Т-ЛАК клетки приобретают способность выделять белки, которые секретируются без предварительной инкубации с клетками-мишенями.

Очистка и выделение в гомогенном состоянии цитотоксических белков.

Анализ белковых фракций, элюируемых с колонки, показал, что ЛАК клетки секретируют широкий спектр цитотоксических белков, но каяодый белок выделяется в очень низкой концентрации, хотя и с высокой удельной активностью. В этой связи особое значение приобретает разработка методов очистки и выделения в гомогеном состоянии цитотоксических белков ЛАК клеток.

Совместно с группой общих методов анализа первичной структуры ИБХ РАН (руководитель О.Ю. Чертов), был разработан методический подход к очистке цитотоксических белков ЛАК клеток. В предыдущей главе было показано, что состав белков и их удельная активность колеблется в зависимости от условий стимуляции секреции. С целью получения наибольшей активности исходного препарата цитотоксических белков подбирались индукторы секреции цитотоксических белков и было установлено, что наиболее эффективной является обработка лимфоцитов кальциевым ионофором А23187.

ЛАК клетки инкубировали с ионофором А23187 в концентрации 10"12 м в течение 18 часов в бессывороточной среде. Клетки отделяли центрифугированием, а полученный супернатант, содержащий цитотоксические белки, подвергали хроматографической очистке. Сочетание ионообменной, обращеннофазной и экслюзионной хроматографии с последующим выделением активных фракций с помощью препаративного электрофореза в ПААГ позволило получить белок р17 и пептид р5 в гомогенном состоянии и определить их Ы-концевую последовательность.

Ионообменная хроматография на колонке РЕАЕ-Тоуореаг!

Ф2

ФЗ

Обращеннофазная хроматография на колонке КискоэИ 300-5С4

I

П

эклкшюнная хроматография на колонке 8рЬегоае1 ТЭК 20008\У электорофорез в ПААГ

Схема 1. Очистка цитотоксических белков ЛАК клеток.

Цитотоксические белки, секретировашше при инкубации Т-ЛАК клеток с ионофором, связывались с ионообменником, цитотоксичпость детектировалась в двух фракциях Ф2 и ФЗ. Электрофоретический анализ этих фракций показал, что цитотоксичность Ф2 связана с действием белков с мол. массой 70, 38 и 22 кД. ФЗ обладала высокой цитотоксичностью.

ФЗ подвергалась дальнейшему разделению на колонке с обращенной фазой Ыис1ео:>;1 300-5С4, цитотоксической активностью обладали две фракции I и П. Каждая фракция подверг&тась эксклюзионной ВЭЖХ на колонке Spherogel-TSKG-2000SW. При хроматографировании фракции I цитотоксические белки элюировались в диапозоне молекулярных масс 70-40 кД и 20-10 кД, при разделении фракции П цитотоксическая активность соответствовала диалозону молекулярных масс 20-10 кД. Фракции после эксклюзионной хроматографии объединялись согласно диапозону молекулярных масс и разделялись при помощи электрофореза с последующим электропереносом на мембрану, элюции с мембраны и определением цитотоксичмости. Были идентифицированы 3 цитотоксических белка с мол. массами 70, 55 и 17 кД и пептид с мол. массой 5 кД.

Для белка р17 и пептида 5 кД с помощью газофазного секвенатора была установлена 1Ч-концевая последовательность. Сравнение полученной аминокислотной последовательности с банком данных первичных структур РЩ. показало, что Ы-концевой участок белка р17 имеет ограниченную степень гомологии с 57 к РНК-связывающим белком рРТВ-1 человека, Т-клеточным поверхностным гликопротеином СОЬЛЗ человека, а также трансформирующим белком с-МуС мыши.

Поиск в банке первичных структур (РШ.) показал, что определенная последовательность для р5 гомологична ГТФ-связывающему белку Об млекопитающих и ро1у(А)-связывающему белку человека.

Таким образом, предложена схема очистки и выделения цитотоксических белков ЛАК клеток, которая может быть использована для получения этих белков в индивидуальном состоянии.

III. Цитолитнческие процессы, индуцированные в клетках-мишенях.

Как мембраносвязанные, так и секретированные цитотоксические белки обладают специфичностью к соответствующим рецепторам на мембране клеток-мишеней и взаимодействуют с этими клетками. На стадии независимого лизиса лимфоцит диссоциирует с поверхности мишени, а в клетке-мишени активируются процессы, приводящие ее к лизису. Эта стадия цитолиза наименее изучена, хотя исследование механизма программированной гибели клеток является одним из актуальных направлений современной молекулярной биологии. Известны два возможных пути клеточной гибели - некроз и апоптоз. Некроз начинается с повреждения мембраны клетки, приводящего к необратимому нарушению гомеостаза и коллоидно-осмотическому лизису. При алоптозе в клетках, с повреждехшой мембраной активируются процессы деградации и гибель регулируется самой клеткой. Одним из отличительных признаков апоптоза является специфическая, межнуклеосомная фрагментация ДНК. Поэтому распространенный метод определения апогггогической гибели клеток основан на детекции низкомолекулярных фрагментов ДНК в цитоплазме с помощью электрофореза в агарозе, а также радиоактивного или флуоресцентного мечения.

При этом следует подчеркнуть, что транедукция сигнала, вызывающего гибель клетки, может быть направлена не только в ядро, но и в митохондрии, в лизосомы. Поэтому метаболически активный путь гибели не ограничивается активацией ферментов, катализирующих расщепление ДНК. Принципиальное значение в программированной гибели клеток имеет активация лизосомных и митохондриалышк ферментов, а также ферментных систем вторичных мессенджеров, реализующих передачу сигнала.

Распад ДНК также не ограничен образованием только олигонуклеосомных фрагментов, катализируемая Са2+, '-зависимыми

эндонуклеазами. Применение для изучения распада ДНК электрофореза в пульсирующем поле показало наличие крупных фрагментов, содержащих около 300 т.п.о. и соответствующих размеру петель хроматина, прикрепляющихся к ядерному матриксу. Образование таких фрагментов сопровождалось

изменением морфологии клетки, характерным для апоптотической гибели. Поэтому при отсутствии межнуклеосомной фрагментации ДНК не следует классифицировать гибель клетки по некротическому механизму без проведения дополнительных исследований.

Учитывая все эти особенности, мы исследовали гибель клеток на стадии независимого лизиса и установили, что цитолиз клеток-мишеней, индуцированный ЛАК клетками, фракциями мембран и секретированными цитотоксическими белками, может проходить как по пути апоптоза, так и некроза и имеет общие закономерности.

Цитолиз, индуцированный действием ЛАК клеток.

При изучении гибели клеток-мишеней, взаимодействующих с ЛАК клетками, проводили сравнительное исследование скорости проницаемости клеточной мембраны и фрагментации радиоактивно меченой ''Н тимидином ДНК. Отношение степени деградации ДНК (Д) к количеству мертвых клеток (М), окрашенных трипановым синим, определяет тип гибели. При %м > 1 целостность мембраны нарушается быстрее, чем происходит

%д расщепление ДНК, т.е. клетки гибнут некротически. При апоптотической смерти внутриядерные изменения в гибнущих клетках происходят с большей скоростью, чем процессы в мембране и

%М < 1,

На рис. 10 и 11 приведены результаты взаимодействия различных субпопуляций ЛАК клеток с линиями клеток К-562 и 1.-929. Можно видеть, что ЫК-ЛАК клетки вызывают преимущественно некротический путь гибели как в ЕКК чувствительных, так и в ЕКК резистентных клетках. (М/Д% = 2,5). Окрашивание клеток трипановым синим, свидетельствующее о повреждении мембраны, было замечено через 15 минут инкубации клеток и достигало максимального значения через 1 час. фрагментация ДНК протекла с более медленной скоростью - появление низкомолекулярных радиоактивных фрагментов ДНК было обнаружено через 1 час. инкубации. Т-ЛАК клетки индуцировали в клетках-мишенях смешанный тип цитолиза и для различных клеток-мишеней апоптотические и некротические признаки проявлялись в

Р>С. П

Рис. 10 Проницаемость мембран и фрагментация ДНК клеток К-562, индуцированные Ж-ЛАК клетками (А) и Т-ЛАК клетками (Е).

Рис, 11 .Проницаемость мембран и фрагментация ДНК клеток Ь-929, индуцированные МК-ЛАК клетками (А&и Т-ЛАК кяегками (Б).

Ш - проницаемость мембран О - проницаемость мембран в присутствии №1,01

А - фрагментация ДНК

различной последовательности. В клетках К-562 деградация ДНК вызывалась очень быстро (в течение 15 минут инкубации) и достигала максимальной через 3 часа взаимодействия клеток, тогда как проницаемость мембраны развивалась более медленно и становилась максимальной через 4 часа, таким образом, в первые 3 часа (М%/Д% < 1) индуцировались апоптотические характеристики, при более длительной инкубации клеток отношение проницаемости мембраны к деградации ДНК начинает расти (М%/Д% = 1,3) и некротические признаки становятся преобладающими. В линии клеток Ь-929 (в противоположность клеткам К-562) Т-ЛАК клетки на ранних стадиях цитолиза вызывают некроз (М%/Д% = 2,2) и апоптоз на более поздних стадиях цитолиза, через 4 часа М%/Д% = 0,7.

Анализируя полученные результаты, можно придти к заключению, что путь клеточной гибели зависит от типа клеток-эффекторов, физиологического состояния клеток-мишеней и времени инкубации клеток. Выше приводилось описание питотоксичсеких белков ЛАК клеток, секретируемых и связанных с мембраной. Было установлено, что при взаимодействии ЛАК клеток с клетками-мишенями у различных субпопуляций ЛАК клеток, по-видимому, реализуются различные механизмы активации лимфоцита, что приводит к экспрессии па мембране и секреции в зону контакта цитотоксических белков, имеющих различные мол. массы. В этом случае не исключена возможность взаимодействия этих белков с различными рецепторами и системами вторичных мессенджеров клеток-мишеней, активации тем самым различные механизмы цитолиза. Физиологическое состояние клетки-мишени также вносит свой вклад в реализацию пути гибели. Клетки могут различаться числом рецепторов к лигандам, вызывающим лизис, активацией генов, регулирующих лизис, способностью реагировать на сигналы к пролиферации и дифференцировке, стадиями клеточного цикла. Эти факторы могут вызывать различную чувствительность к лизису, индуцированному одними и теми же цитотоксическими белками.

Для выяснения роли лмзосомных ферментов в цитолизе, индуцированном действием ЛАК ктеток, мы исследовали взаимодействие цитолитических лимфоцитов с клетками-мишенями в присутствии ингибитора лизосом, МНЦСЬ.

Из результатов, представленных на рис. 10 и 11, можно видеть, что МК-ЛАК клетки и Т-ЛАК клетки индуцируют различные механизмы гибели в мишенях одного и того же типа. Лизис клеток К-562 и Ь-929 не шпибировался хлоридом аммония в течение 3-х часов их взаимодействия с МК-ЛАК клетками, т.е. лизосомные ферменты не участвовали в цитолизе клеток. В течение последующих 2 часов инкубации цитотоксичность начинает снижаться в присутствии этого реагента. Активность лимфоцитов ингибировалалсь на 25%. По-видимому, в эти часы инкубации начинают развиваться цитолитические процессы, для которых существенно важна активация лизосом.

На ранних стадиях взаимодействия Т-ЛАК клеток с теми же клетками-мишенями развиваются лизосомо-зависимый цитолиз. На более поздних стадиях индуцируются процессы, активность которых не не зависит от участия лизосомных ферментов. Цитолиз клеток 1.-929 практически полностью блокируется хлоридом аммония в течение 3 часов инкубации, ингибирование снижается по мере накопления апоптотических признаков и через 5 часов инкубации не превышает 10%. Ингибирование лизиса клеток К-562 составляет 50-60% через 3 часа взаимодействия эффекторов и клеток-мишеней и практически полностью исчезает через 5 часов инкубации.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что разделение гибели клеток на некроз, связанный с необратимым нарушением гомеостаза, и апоптоз, характеризующийся расщеплением ДНК на участки, соответствующие нуклеосомам, является в достаточной степени условным. Мы зарегистрировали при индукции цитолиза ЛАК клетками три типа гибели клеток:

1. Гибель клеток под действием ЯК-ЛАК клеток, когда повреждение мембраны клетки наступают быстрее, чем деградация ДНК, и лизосомные ферменты не регулируют этот процесс, может быть отнесена к классическому некрозу с нарушением водно-солевого баланса клетки.

2. Гибель клеток К-562, индуцируемая Т-ЛАК клетками, на первоначальных стадиях цитолиза сопровождается появлением низко.чолекулярных фрагментов ДНК в клетках с поврежденной мембраной и проходит по пути апоптоза.

3. Гибель клеток Ь-929 при взаимодействии с Т-ЛАК клетками ие может быть ассоциирована с коллоидно-осмотическим лизисом, хотя фрагментация ДНК происходит достаточно поздно в клетках с уже нарушенной проницаемостью мембраны. Однако, цитолиз в этом случае блокируется лизосомными ингибиторами, что свидетельствует об активации клеточного метаболизма, предшествующего повреждению цитоплазматической мембраны клетки. Отсутствие низкомолекулярных фрагментов ДНК на этой стации не исключает крупнофрагментарной деградации ДНК.

Цитолиз, индуцированный мембранными цитотокснческпми белками ЛАК клеток.

Для изучения цитолитического действия мембранных белков были выделены фракции мембран №С- и Т-ЛАК клеток, полученных на 4-ые и 6-ые сутки культивирования лимфоцитов с ИЛ-2. Лизис клеток Ь-929 н К-562 под действием препаратов мембран изучался в течение 1-48 часов. Кинетический анализ развития цитолиза показал, что кривая цитотоксичности не имеет линейной зависимости от времени инкубации мембран с клетками-мишенями, а характеризуется двумя максимумами цитолитической активности (рис. 12 и 13). Для клеток Ь-929 1-ый максимум цитотоксичности был зарегистрирован через 3 часа инкубации, 2-ой максимум - через 48 часов. Развитие цитолиза в отношении клеток К-562 зависело от фенотипа ЛАК клеток. Для мембран МС-ЛАК клеток максимумы цитолитической активности наблюдались через 3 часа и 48 часов инкубации, в то время как мембранные белки Т-ЛАК клеток индуцируют основной максимум цитотоксичности на 10-ый час инкубации, при этом отсутствует четко выраженный 1-ый максимум цитотоксичности, а процесс, развивающийся через 3 часа, вносит сравнительно низкий вклад в общую цитотоксичность.

Возможны два альтернативных объяснения дискретного характера кривой цитотоксичности. Появление двух максимумов цитолитической активности могут быть связаны как с существованием двух независимых процессов, протекающих с различной скоростью, так и являться отражением двух взаимосвязанных стадий одного процесса. Для выяснения этого вопроса

цитотоксичность % фрагментация ДНК %

Рис. 12 Проницаемость мембраны и фрагментация ДНК в клетках Ь-929, индуцированные фраадиямнТмембран КК-ЛАК клеток (А) и Т-ЛАК клеток (Б).

(... в •••) проницаемость мембран, (... О ...) проницаемость мембран в присутствии !ЫН4С1, (- -ш- -) проницаемость мембран в присутствии ЕйТА, ( - О -) фрагментация ДНК.

цитотоксичность % фрагментация ДНК %

Рис. 13 Проницаемость мембраны и фрагментация ДНК в клетках К-562, шшуциро ванные фракциями мембран ЫК-ЛАК клеток (А) и Т-ЛАК клеток (Б).

(..•в...) проницаемость мембран, (... О ...) проницаемость мембран в

присутствии МН4С1, (---д---) проницаемость мембран в присутствии ЕйТА,

(- О -) фрагментация ДНК.

мы исследовали кинетику изменения цитотоксической активности мембран ЛАК клеток в присутствии ингибитора лизосом - N11,01 и НОТА.

Результаты, приведенные на рис. 12 н 13, свидетельствуют об индукции мембранными белками дискретных цитолитических процессов, характеризующихся включением различных метаболических ферментативных процессов, приводящих к гибели клеток. Вне зависимости от фенотипа ЛАК клеток лизис, индуцированный фракциями мембран как в клетках К-562, так и в клетках Ь-929, ипгибировался при добавлении N11401 только в течение 3-х часов инкубации клеток с мембранами, к 5 часам инкубации наблюдалось полное исчезновение ингибирования, т.е. процессы, характеризующиеся более высокой скоростью цитолиза, являются лизосомо-зависимыми. Для развития цитотоксичностн, проявляющейся через 48 часов инкубации, по-видимому, не требуется активация лизосомных ферментов.

Действие ЕйТА на процессы, протекающие с различной скоростью, подтвердило их принципиальное различие: кальций принимает участие в транедукции сигналов цитолиза только для быстроразвивающихся процессов, долговременные процессы не ингибировались при связывании внеклеточного кальция (рис.12 и 13).

Для определения апоптотического и некротического путей гибели параллельно измерению цитотоксичностн исследовалась динамика фрагментации ДНК. Результаты на рис. 12 показывают, что фрагментация ДНК в клетках Ь-929 вызывается очень быстро, достигается максимальной через 1-3 часа инкубации мембран с клетками и значительно превышает увеличение проницаемости мембраны для трипанового синего, что свидетельствует о связи цитолитических процессов, развивающихся в это время, с апоптозом.

В то же самое время, механизмы фрагментации генома клеток К-562 различны в зависимости от фенотипа ЛАК клеток. Цитолиз под действием мембран, полученных из КК-ЛАК клеток, характеризуется наличием 2-х различных механизмов фрагментации ДНК (рис. 13). 1-ый максимум цитолиза не связан со специфическим образованием низкомолекулярных апоптотических фрагментов, в то время как 2-ой максимум соответствует развитию апоптотического процесса. Гибель клеток начинается с повреждения мембран клетки, фрагментация ДНК растет более медленно, но через 5 часов инкубации

накопление низкомолекулярных фрагментов ДНК превышает увеличение проницаемости мембраны для трипанового синего. Эти результаты свидетельствуют о том, что два максимума цитотоксичности соответствуют развитию процессов, характеризующихся различным расщеплением ДНК.

Цитолитические процессы, индуцированные мембранами Т-ЛАК клеток имеют иную динамику фрагментации ДНК. В течение 5 часов инкубации скорость образования низкомолекулярных фрагментов обгоняет увеличение проницаемости клеток-мишеней, после 5-го часа инкубации соотношение этих параметров изменяется - скорость повреждения мембраны становится меньше скорости накопления фрагментов ДНК. Согласно полученным результатам, быстроразвивающийся цитолитический процесс ассоциирован с апоптозом, а более поздние процессы включают механизмы, не связанные с низкомолекулярной фрагментацией ДНК. Так как дополнительные биохимические исследования показали, что эти процессы не являются ни лнзосомозависимыми, ни калиций-зависимыми, возможно, они связаны с развитием коллоидно-осмотического лизиса.

Таким образом, цитолиз, индуцированный мембранными белками ЛАК клеток характеризуется двумя процессами, различающимися скоростью лизиса, механизмом активациии метаболических путей при реализации сигнала и фрагментацией ДНК.

Цитолиз, индуцированный секрстированными цитотоксическимн белками ЛАК-клеток.

Цитотоксичность суммарных фракций белков, секретированных №С- и Т-ЛАК клетками определяли в течение 1-48 часов инкубации белков с линиями клеток К-562 и Ь-929. Источником цитотоксипеских белков служили супернатанты ЫК- и Т-ЛАК клеток, получаемых после 18 часовой инкубации с клетками-мишенями. Из данных, представленных на рис. 14 и 15, видно, что динамика развития цитолиза не достигает насыщения, а характеризуется несколькими максимумами цитолитической активности через 3, 8, 24 и 48 часов инкубации. Эти результаты подтверждают закономерности, установленные для цитолиза, индуцированного мембранными белками. Можно видеть, что цитотоксичность, вызываемая действием секретированных белков, составляет

цитотоксичность % фрагментация ДНК %

Рис. 14 Проницаемость мембраны и фрагментация ДНК в клетках 1.-929, индуцированные действием супернатаыгов Ж-ЛАК клеток (А) и Т-ЛАК клеток (Б).

(- О -) проницаемость мембран, (- □ -) проницаемость мембран в присутствии МН«С1, (- х -) проницаемость мембран в присутствии ЕйТА, фрагментация ДНК.

шгтотоксичностъ % ! фрагментация ДНК %

Рис. 15) Проницаемость мембран и фрагментация ДНК в клетках К-562, инлуцированные действием супернзтантоа №С-ЛАК клеток (А) и Т-ЛАК клеток (В).

(- О -) проницаемость мембран, (- О -) проницаемость мембран в присутствии №<01, (- х -) проницаемость мембран в присутствии ЕйТА, (... 9...) фрагментация ДНК.

сумму дискретных цитолитических процессов, протекающих с различной скоростью. Подобная дискретность цитотоксичности и индукция широкого спектра цитолитических процессов была установлена в последнее время для ряда биологически активных соединений.

Использование ингибитора лизосом и кальций-связывакицего реагента показало, что цитотоксические белки, секретированные ЛАК клетками, также, как и мембранные белки, индуцируют в разных типах клеток-мишеней цитолитические процессы, отличающиеся не только динамикой цитолиза, но и механизмом транедукции сигнала, вызывающего гибель клетки. На рис. 18 и 19 приведена цитотоксичность белков ЛАК клеток в присутствии N^01 и ЕОТА. Можно видеть, что быстроразвивающиеся процессы являются кальций- и лизосомо-зависимыми. Присутствие этих реагентов в среде ингибирует цитотоксичность через 3 часа взаимодействия белков с клетками и не оказывает влияния на длительные процессы. Возможно, что именно активация лизосом и включение кальций-зависимых регуляторных путей лизиса обеспечивает высокую скорость цитолиза.

Результаты, приведенные на рис. 14 и рис. 15, свидетельствуют о том, что вклад апоптотических и некротических характеристик в гибель клеток, опосредованную действием цитотоксических белков, зависит от типа лизируемой клетки. Можно видеть, что скорость фрагментации ДНК в клетках К-562 превышает увеличение проницаемости мембран для трипанового синего, т.е. цитолитические процессы, развивающиеся в течении 1-3 часов инкубации связаны с апоптозом. Появление фрагментов ДНК при электрофорезе в агарозном геле через 1 час и 24 часа взаимодействия белков с клетками показывает, что и длительные проессы также, как и кратковременные, включают апоптотические механизмы гибели (рис. 16).

Из результатов, привденных на рис. 16, видно, что одни и те же белки вызывают различные пути гибели в различных клетках. Цитолиз клеток Ь-929 характеризуется наличием двух различных механизмов фрагментации ДНК. 1-ый максимум цитолиза не связан с образованием апоптотических фрагментов, так как гибель клеток начинается с повреждения мембран, а деградация ДНК происходит с более медленной скоростью. Анализ ДНК при электрофорезе в агарозном геле не обнаруживает низкомолекулярных фрагментов через 3 часа

А

Рис. 16 Электрофоретический анализ ДНК в клетках К-562 (А) и Ь-929 (Б), индуцированный цитотоксическими белками ЬЖ-ЛАК клеток.

А. 1.2 - фрагментация ДТГК через 1 час и 24 часа взаимодействия цитотоксических белков с клетками.

3.4 - фрагментация ДНК в контрольных клетках.

Б. 1, 2, 3 - фрагментация ДНК через 2. часа, б часов и 24 часа взаимодействия цитотоксическнх белков с клетками.

4, 5, б - фрагментация ДНК в контрольных клетках

Рис. 17 Влияние актиномщдана Д на цитолигическую активность супернатанта Т-ЛАК клеток

В

- лизис клеток Ь-929, не инкубированных с акхиномишшом Д.

- лизис клеток Ь-929, преинкубированных в течение 1 часа с актиномищшом Д.

взаимодействия с клетками (рис. 16), т.е. первый максимум цитолиза связан с некротической гибелью клеток, но не с коллоидно-осмотическим лизисом. Развитию максимума цитотоксичности через 48 часов инкубации предшествует появление нуклеосомных фрагментов ДНК, обнаруженных при электрофорезе в агарозном геле, что соответствует адоптотическому процессу.

Анализ цитолитических процессов показал, что дискретность цитолиза в большей степени зависит от статуса клетки-мишени, чем от природы цитотоксического вещества. Цитотоксические белки, секрстированные различными субпопуляциями ЛАК клеток, оказывают влияние на относительную величину цитотоксичности каждого процесса и скорость развития этих процессов, но число цитолитических процессов зависит от физиологического состояния клеток-мишеней.

Можно предположить, что столь значительное различие клеток в чувствительности к цитолитическому агенту связано с гетерогенностью асинхронной культуры и с неодинаковым прохождением клетками стадий клеточного цикла. Для проверки этого предположения проводили предварительную инкубацию клеток с актиномицином Д, который не только блокирует синтез белка в клетках, но и вызывает синхронизацию клеток на границе в] и в фаз.

На рис. 17 приведено цитотоксическое действие белков Т-ЛАК клеток на клетки, обработанные и не обработанные актиномицином Д. Можно видеть, что динамика развития цитолиза клеток без актиномицина Д, как было показано и ранее, не достигает насыщения, цитотоксичность характеризуется несколькими максимумами, из которых наиболее четко выявлены максимумы, развивающиеся через 3 часа и 30 часов инкубации белков с клетками. При действии тех же белков на клетки, предварительно инкубированные с актиномицином Д, когда большая часть клеток находится в одной стадии клеточного цикла, профиль кинетической кривой цитотоксичности резко изменяется. Практически исчезают дискретные пики цитолитической активности, цитотоксическое действие проявляется через 5 часов инкубации белков с клетками, линейно увеличивается и достигает максимального значения через 8 часов инкубации. Эти результаты свидетельствуют о том, что

дискретность цитотоксичности зависит от степени синхронизации клеточных культур.

Суммируя вышесказанное, можно подчеркнуть, что цитолиз, индуцированный как ЛАК клетками, так и их мембранными и секретировашшми белками, имеет общие черты. Под действием этих индукторов клетки могут гибнуть как по пути апоптоза, так и некроза, причем вклад апоптотических и некротических характеристик в процесс цитолиза зависит от физиологического статуса и типа клетки-мишени, типа эффектора, природы цитотоксических белков и времени инкубации клеток с цитолитическими агентами. Отсутствие низкомолекулярных фрагментов ДНК не всегда ассоциируется с коллоидно-осмотическим лизисом. Цитотоксичность, опосредованная действием мембранных и секретированных белков, характеризуется наличием дискретных цитолитических процессов в асинхронных культурах, различающихся скоростью цитолиза, механизмами фрагментации ДНК и трансдукцией цитолитнческого сигнала.

IV. Факторы, влияющие на цитолитичсскую активность ЛАК клеток.

В последнее время достигнуты определенные успехи в исследовании механизма действия цитолитических лимфоцитов. Получены многочисленные клоны цитолитических клеток, достаточно полно описаны специфические мембранные антигены лимфоцитов, участвующие во взаимодействии с клетками-мишенями и активации лимфоцита. Охарактеризованы белки, содержащиеся в цитолитических гранулах, ответственные за секреторный путь лизиса. Обнаружение Рав-антигена и выделение Баз-лиганда привело к интенсивному изучению контактного пути лизиса. При исследовании апоптотической гибели установлена роль эндонуклеаз и протеаз в процессе цитолиза, выявлены гены, участвующие в программировании клеточной смерти. Однако, поскольку апоптоз, как нормальный физиологический процесс, регулируется посредством тех же вторичтге мессепджеров, что и реализация пролиферации и дифференцировки, наибольшие трудности встречаются при изучении регуляторных процессов, участвующих в передаче цитолитического сигнала. Но именно выявление путей модуляции цитолиза позволит обнаружить

различия, лежащие в основе апоптоза и нормального деления клетки, а также представит возможность направленной регуляции действия цитолитических лимфоцитов.

В настоящей работе мы исследовали влияние на активность ЛАК клеток таких известных передатчиков внешних и внутренних сигналов, как цикло-АМФ и протеинкиназа С. Мы также рассмотрели модуляцию цитолиза под действием белков цитолитических гранул, не обладающих прямым цитотоксическим действием, и белков сыворотки крови.

Участие протеинкиназы С и протеинкиназы А в процессах лизиса клеток, опосредованного действием цитотоксических белков ЛАК клеток.

Для многих вторичных мессенджеров, таких, как протеинкиназа С, тирозиновые киназы, цикло-АМФ-зависимые ферментные системы, были продемонстрированы противоположные эффекты на разных типах клеток. Активация этих посредников, участвующих в цепи передачи сигнала, может привести к неоднозначному действию. Показано, что эти факторы вовлечены в регуляцию апоптоза, но регуляция во многом зависит от сопряжения действия различных стимуляторов и от физиологического состояния клеток и может носить положительный или отрицительный характер.

Для установления корреляции между развитием различных цитолитических процессов и активацией вторичных мессенджеров, вовлеченных в транедукцию цитолитического сигнала, исследовалось действие цитотоксических белков ЛАК клеток на клетки с повышенной активностью протеинкиназы С и протеинкиназы А. С этой целью клетки предварительно инкубировались с активатором протеинкиназы С - РМА, и активатором протеинкиназы А - дибутирильным аналогом цикло-АМФ.

Результаты, приведенные на рис. 18, подтверждают различие быстрых и медленных процессов. Действие РМА и цикло-АМФ на цитотоксическое действие белков ЛАК клеток не зависело от типа клеток-мишеней. Можно видеть, что активаторы протеинкиназы С и протеинкиназы А оказывают различное влияние на цитолитическую активность белков ЛАК клеток. Предварительная инкубация клеток с РМА приводит к ингибированию как

часы

Рис. 18 Влияние РМА и цикло-АМФ на цитотоксическую активность супернатанта ЛАК клеток. В качестве клеток-мишеней использовагась линия клеток К-562 (А). В качестве клеток -мишеней использовалась линия клеток ^-дц (Б). В - цитотоксичность супернатанта • - цитотоксичность супернатанта в присутствии РМА А - цитотоксичность супернатанта в присутствии цихяо-АМФ

быстрых, так и медленных процессов. Подавление быстрых процессов было практически полным, блокирование медленных процессов снижалось по мере увеличения времени инкубации. Полученные результаты позволяют высказать предположение о том, что в изучаемой нами системе протеинкиназа С не только принимает участие в передаче цитолитических сигналов, но и активирует ферментные системы, приводящие к подавлению цитолиза. Цикло-АМФ приводит к противоположным эффектам для быстрых и медленных процессов. Цитолиз клеток, развивающийся в первые 3 часа инкубации с цитотоксическими белками, полностью ингибировался при активации протеинкиназы А. Увеличение цитотоксичности медленных процессов в клетках с повышенной концентрацией цикло-АМФ позволяет предположить участие протеинкиназы А в передаче апоптотических сигналов для медленных процессов.

Как правило, в литературе описывается активация различных протеинкиназ, приводящая к противоположным эффектам в различных тест-системах. Нами продемонстировано, что различное физиологическое состояние клеток одной линии, находящихся под действием одного цитолитического агента, может привести в различным последствиям активации протеинкиназы А.

Влияние ВЬТ-эстераз на цитолиз клеток, вызываемый цитотоксическими белками ЛАК клеток.

Гранзимы или ВЬТ-эстеразы, обнаруженные в гранулах цитолитических лимфоцитов, не обладают прямым цитотоксическим действием на клетки. Внимание к этим ферментам было привлечено после того, как были получены данные, свидетельствующие об их участии в регуляции апоптоза. Наибольший интерес представляли результаты, демонстрирующие, что совместная инкубация с клетками перфорина, обычно вызывающего коллоидно-осмотический лизис, и гранзима В приводит к апоптотической гибели клеток. Эти данные являются весомым свидетельством в пользу предположения о включении или усилении ВЬТ-эстеразами лизиса клеток по апоптотическому механизму.

Известно, что ЛАК клетки содержат цитолнтические гранулы и секретируют BLT-эстеразы в зону контакта при взаимодействии с клетками-мишенями. Поэтому представляется вероятным, что эти ферменты участвуют в регуляции цитолиза, индуцировашюго цитотоксическими белками ЛАК клеток.

При хроматографическом разделении ЛАК клеток на стандартной колонке DEAE-Toyopearl белки, обладающие цитотоксической и BLT-эстеразной активностью, элюировались в различных фракциях, при различной ионной силе. Совместная инкубация полученных фракций с линией клеток К-562 показала, что BLT-эстеразы оказывают влияние на цитотоксичность белков ЛАК клеток.

Белки, секретированные ЫК-ЛАК клетками, обладали заметной цитотоксичностыо. Также, как это было показано для супернатанта ЛАК клеток, динамика цитолиза, индуцированного белками очищенной фракции, не имела насыщаемого характера, а характеризовалась несколькими максимумами цитолитической активности. BLT-эстеразы оказывали неодинаковое действие на процессы, протекающие с различной скоростью. В присутствии BLT-эстераз цитотоксичность Ф2 активировалась через 24 часа и ингибировалась через 3, 30 и 48 часов инкубации с клетками-мишенями (рис. 196). Эти данные коррелировали с изменением фрагментации ДНК. Добавление гранзимов увеличивало число фрагментов ДНК через 24 часа и уменьшало через 30 часов инкубации.

Поскольку Ф2 не является гомогенным белком, а ее цитотоксичность обусловлена активностью 3-х белков с мол. массами 70, 38, и 22 кД, полученные результаты проверялись при исследовании цитолиза клеток К-562, индуцированного действием гомогенного препарата TNF. Можно видеть, что TNF также, как и белки Ф2, вызывал в клетках несколько цитолитических процессов, протекающих с различной скоростью (рис. 19в). BLT-эстеразы активировали действие TNF через 24 часа и ингибировали через 3, 30 и 48 часов инкубации. Динамика фрагментации ДНК соответствовала этой схеме: число фрагментов ДНК увеличивалось через 24 часа и уменьшалось через 30 часов инкубации.

Полученные результаты расширяют представлешм о регуляторной роли BLT-эстераз. Влияние BLT-эстераз на цитолитические процессы не

ЦИТОТОКСИЧНОСТЬ %

Рис. 19. Зависимость цитотоксической активности Ф2 (Б) и TNF (В) от времени инкубации с клетками-мишенями. ( - О - ) цитотоксичность Ф2 и TNF

(... ш... ) цитотоксичность Ф2 и TNF в присутствии BLT-эстераз.

ограничивается регуляцией активности гранулярного перфорина, который секретируется в зону контакта одновременно с этими ферментами. BLT-эстеразы могут участвовать в регуляции цитолиза под действием цитотоксических белков ЛАК клеток, секретированных при блок1фовании экзоцитоза цитолитических гранул, а также в регуляции TNF-зависимого лизиса, хотя TNF секретируется не только цитолитическими лимфоцитами. Следовательно, действие BLT-эстераз представляется достаточно универсальным.

Вопреки общепринятому мнению о том, что BLT-эстеразы усиливают апоптотический путь лизиса, в настоящей работе показано, что BLT-эстеразы могут не только активировать, но и ингибировать апоптоз. BLT-эстеразы оказывают различное действие на цитолитические процессы, протекающие с различной скоростью и характеризующиеся различными путями трансдукции цитолитического сигнала.

Ингпбирование цитолитического действия ЛАК клеток белками in сыворотки крупного рогатого скота и человека.

Исследование цитотоксического действия белков ЛАК клеток показало, что цитотоксичность супернатанта изменялась в широких пределах в зависимости от исходных препаратов ЛАК клеток, полученных от разных доноров. Электрофоретический анализ белков суперанатанта также показал, что количество мажорного белка с мол. массой 67 кД изменялось в тех же пределах.

Хроматографическое разделение полученных супернатантов на стандартной колонке DEAE-Toyopearl показало, что при значительном различии исходной цитотоксичноста супернатантов ЛАК клеток, цитотоксическая активность Ф1 и Ф2 имела сравнимые значения. Различия в исходной активности супернатантов могут быть связаны с различной концентрацией цитотоксических белков, секретируемых ЛАК клетками или с присутствием веществ, ингибирующих цитолиз и отделяющихся при хроматографическом разделении.

В каждой фракции, элюируемой с колонки, было проведено определение активности, ингибирукицей цитотоксическое действие супернатанта ЛАК клеток. Из результатов ионообменной хроматографии (рис. 20) можно видеть,

А 280 пт N301 (М)

Рис. 20 Хроматографичесхое разделение супернатанга ЛАК клеток на колонке ВЕАЕ-

ТоуореагЬ

( - ) А 280 нм, ( - - - ) концентрация (... ■ ...) ингибирование (%) циголитической

активности суперпатанта ЛАК клеток.

ингибирование (%)

Рис. 21 Ингйбирорание цитотоксической активности супернатанта ЛАК клеток в зависимости от концентрации фетуина.

1 - фетуин, выделенный из эмбриональной сыворотки телят

2 - коммерческий препарат фетушта

что наибольшей ингибирующей активностью обладают белки, эшоируюшиеся при ионной силе 0,19 М NaCl. Из этой фракции был выделен в гомогенном состоянии белков с мол. массой 67 кД. На рис. 21 приведено ингибирование этим белком цитотоксической активности белков ЛАК клеток.

В ИБХ РАН была определена N-концевая последовательность этого

белка:

Ile-Pro-Leu-Asp-Pro-Val-Gly-Tyr-Lys-Ser-

Поиск в банке первичных PER. показал, что данная последовательность идентична основному белку сыворотки крупного рогатого скота фетуину-гликопротеину с мол. массой 67 кД. Исследовшше способности коммерческого препарата фетуина ингибировать цитотоксическую активность показало, что этот белкок Ш1гибирует цитотоксичность ЛАК клеток в тех же концентрациях, что и выделенный нами белок из супернатанта ЛАК клеток (рис. 21).

Таким образом, в супернатанте ЛАК клеток был обнаружен белок, шцибирующий цитотоксичность лимфоцитов, и обладающий структурной и функциональной аналогией с фетуином из сыворотки крупного рогатого скота. Расхождение исходной цитотоксической активности в экспериментах можно объяснить различным содержанием фетуина в супернатантах.

Предварительная инкубация ЛАК клеток с 14С-радноактивно меченым белковым гидролизатом с последующим электрофоретическим анализом секретированных белков показали, что белок р67 не выделяется ЛАК клетками. Иммуноферментный анализ с использованием поликлональных антител к коммерческому фетуину, показал, что белок ассоциирован с мембраной ЛАК клеток.

В ИБХ РАН бьхл выделен из сыворотки человека белок, по ряду свойств аналогичный альбумину, но имеющий небольшие отличия в первичной структуре. Было установлено, что этот белок обладает способностью ингибировать цитотоксичность белков ЛАК клеток и его ингибирующая активность проявляется в тех же концентрация, что и для фетуина.

Вышеприведенные результаты позволяют сделать вывод о том, что в сыворотке крупного рогатого скота и человека присуствуют белки с одинаковой молекулярной массой 67 кД, но с различной первичной структурой, являющиеся модуляторами цитотоксичности. Способность этих белков ингибировать

цитолитическую активность ЛАК клеток позволяет предположить, что роль их in vivo заключается в поддержании определенного уровня активности цитолитических клеток.

Выводы.

1. Установлено изменение состава популящш ЛАК клеток в процессе культивирования лимфоцитов с высокими дозами ИЛ-2: на 3-4 сутки инкубации с ИЛ-2 ЛАК клетки представлены субпопуляцией с поверхностными антигенами, характерными для ЕКК, на 6-7 сутки на мембране ЛАК клеток преобладают антигены ЦТЛ. Показано, что вне зависимости от фенотипа ЛАК клетки мотуг проявлять цитолитическую активность как в присутствии, так и в отсутствии ионов кальция.

2. Выдвинута концепция механизма цитолиза, индуцированного ЛАК клектами. Впервые охарактеризованы контактный и секреторный пути лизиса. Установлено, что изменение фенотипа коррелирует с изменением состава секреторных и мембранных белков. Циготоксичность NK-ЛАК клеток при контактном механизме лизиса связана с встраиванием в мембрану цитотоксических белков с мол. массой 40, 30 и 21 кД, цитотоксичность Т-ЛАК клеток зависит от экспрессии мембранных белков с мол. массой 38 и 21 кД. ЫК-ЛАК клетки секретируют цитоткоснческие белки с мол. массой 75, 38 и 22 кД, Т-ЛАК клетки секретируют белки с мол. массой 40 и 30 кД.

3. Детально исследован кальций-независимый механизм цитолиза ЛАК клеток. Впервые показано, что цитотоксичность ЛАК клеток при связывании экзогенного кальция обусловлена как действием белков, ассоциированных с мембраной, так и секрецией цитотоксических белков. Проведен сравнительный анализ цитотоксических белков, секретированных по кальций-зависимому и кальций-независимому механизмам. Установлено, что в бескальциевой среде утрачивается специфичность секреции и изменяется состав секретированных белков: NK- иТ-ЛАК клетки секретируют цитотоксические белки с мол. массой 75,35 и 22 кД.

4. Установлено, что секреторный путь лизиса не ограничивается экзоцитозом белков, содержащихся в цитолитических гранулах. Показано, что ЛАК клетки секретируют не менее 7 цитотоксических белков с мол. массой от 70

до 17 кД без предварительной инкубации с клетками-мишенями. Выделение в гомогенном состоянии белка с мол. массой 17 кД и пептида с мол. массой 5 кД позволило установить, что эти белки не принадлежат к семейству TNF. Предложена гипотеза о возможности для ЛАК клеток осуществления секреции прерывистого типа - экзощггоза цитолитических гранул, а также секреции непрерывного типа при участии комплекса Гольджи.

5. Показано, что цитолиз клеток-мишеней, индуцированный ЛАК клетками, а также их мембранными и секреторными цитотоксическими белками, может осуществляться по апоптотическому и некротическому механизмам. Вклад апоптотических и некротических характеристик зависит от физиологического статуса и типа клетки-мишени, типа эффекторной клетки, степени сродства цитотоксических белков к рецепторам клеток-мишеней и времени инкубации клеток с цитолитическими агентами.

6. Показано, что цитотоксичность, опосредованная действием мембранных и секретированных белков ЛАК клеток, характеризуется наличием дискретных цитолитических процессов. Процессы, протекающие с высокой скоростью цитолиза, обладают относительно невысокой цитотоксхгчностью. Они являются лизосомо- и кальций-зависимыми и могут осуществляться как по апоптотическому, так и по некротическому пути. Процессы, характеризующиеся низкой скоростью цитолиза, достигают высокой цитотоксичности и реализуются за счет апоптотического мехашвма лизиса. Медленные процессы не требуют активации лизосомных ферментных систем и присутствия ионов кальция. Высказано предположение о том, что дискретность цитотоксичности связана с гетерогенностью клеток-мишеней.

7. Описан ряд факторов, принимающих участие в регуляции цитолиза келток-мишеней:

1. Показано, что повышение концентрации экзогенного кальция до 5 гпМ приводит к активации апоптотического пути лизиса.

2. Изучена роль классических вторичных мессенджеров, протеинкиназы С и протеинкиназы А, в трансдукции цитолитического сигнала. Показано, что активация протеинкиназы С в клетках-мишенях вызывает ингибирование цитолиза. Активация протеинкиназы А приводит к противоположным эффектам: при увеличении

концентрации цикло-АМФ в клетках, быстроразвивающиеся процессы иш ибируются с низкой скоростью цитолиза активируются.

3. Расширены представления о регуляторной роли гранулярных BLT-эстераз. Показано, что BLT-эстеразы принимают участие в регуляции цитолиза, индуцированного действием циготоксических белков ЛАК клеток и TNF. Установлено, что BLT-эстсразы могут не только активировать, но и ингибировать гибель клеток.

4. Показано, что клетка-мишень участвует в регуляции цитолитического процесса как на стадии активации лимфоцита, так и на стадии независимого лизиса. Сформулирована гипотеза о том, что блокирование лизиса в отсутствии ионов кальция на стадии "летальный удар" связано не прерыванием секреции цитотоксических белков, а с ингибированием быстроразвивающихся процессов лизиса клеток-мишеней.

8. Установлена новая функция для белка из сыворотки крупного рогатого скота, фетуина - способность ингибировать цитолиз, индуцированный ЛАК клетками и их цитотоксическими белками.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Сащенко Л.П., Гнучев Н.В., Кириллова М.А., Ребизова Т.В., Лукьянова Т.И., Луканидин Е.М. - Влияние ионов кальция на активность цитотоксического фактора естественных киллеров. - Доклады АН СССР, 1987, т. 26, № 5, стр. 1278-1280.

2. Гнучев Н.В., Сащенко Л.П., Лукьянова Т.И., Ребизова Т.В., Кириллова М.А., Луканидин Е.М., Ревазова Е.С. - Обнаружение перфориноподобного белка в составе растворимого цитотоксического фактора натуральных киллеров. -Молекулярная биология, 1987, т. 21, № 4, стр. 1117-1123.

3. Chertov O.Yu., Gnuchev N.V., Sashchenko L.P., Kirillova M.A., Lykyanova T.I., Rebizova T.V., Lukanidin E.M. - Cytotoxic protein of natural killers. - Journal of Cellular Biochemistry, 1988, v. 106, p. 165.

4. Чертов О.Ю., Красносельский А.Л., Луканидин E.M., Сащенко Л.П., Гнучев Н.В., Кириллова М.А., Ревазова Е.С. - Выделение цитотоксического фактора

из сыворотки голых мышей. - Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1989, т. CVII, № 3, стр. 329-331.

5. Sashchenko L.P., Gnuchev N.V., Kirillova М.А., Lykyanova T.I., Rebizova T.V., Chertov O.Yu., Lukanidin E.M. - Effect of antibodies to granular perforin and calmodulin on the activity of natural killer cytotoxic factor. - Biomedical Science, 1990, v. l,p. 291-294.

6. Редченко И.В., Сащенко Л.П., Гнучев H.B., Лукьянова Т.И., Кабанова О.Д., Хайдуков С.В., Луканидин Е.М. - Некоторые свойства перевиваемой линии клеток человека, обладающих активностью ЕКК. - Экспериментальная онкология, 1991, т. 13, № 4, стр. 36-39.

7. Сащенко Л.П., Гнучев Н.В., Кабанова О.Д., Лукьянова Т.Н., Редченко И.В., Савцова З.Д., Блишенко Е.Ю., Чертов О.Ю., Луканидин Е.М. -Функциональные изменения лимфокин-активированных лимфоцитов в зависимости от времени инкубации с ИЛ-2. - Доклады РАН, 1992, т. 324, стр. 475-479.

8. Сащенко Л.П., Гнучев Н.В., Лукьянова Т.И., Кабанова О.Д., Редченко И.В., Блищенко Е.Ю., Сатпаев Д.М., Хайдуков С.В., Чертов О.Ю., Луканидин Е.М. - Влияние ИЛ-2 на цитолитическую активность, экспрессию поверхностных маркеров и секрецию цитотоксических белков ЛАК клетками. -Экпериментальная онкология, 1992, т. 14, № 5, стр. 54-58.

9. Sashchenko L.P., Gnuchev N.V., Kirillova М.А., Lykyanova T.I., Rebizova T.V., Revazova E.S., Lukanidin E.M. - Separation of pore-forming and cytotoxic activities from natural cell cytotoxic factor. - FEBS Letters, 1988, v. 226, N 2, p. 261-264.

10. Sashchenko L.P., Kabanova O.D., Lykyanova T.I., Satpaev D.K., Chertov O.Yu., Gnuchev N.V. - The role of apoptotic and necrotic processes in cytolysis mediated by LAK cells with different phenotypes. - FEBS, 1993, v. 335, N 2, p. 270-272.

11. Sashchenko L.P., Gnuchev N.V., Lykyanova T.I., Redchenko I.V., Kabanova O.D., Lukanidin E.M., Blishchenko E.Yu., Satpaev D.K., Khaidukov S.V., Chertov O.Yu. - Time-dependent changes of LAK cell phenotypes correlate with the secretion of different cytotoxic proteins. - Immunology Letters, 1993, v. 37, p. 153157.

12. Гнучев Н.В., Сащенко Л.П., Кабанова О.Д., Лукьянова Т.И., Блшценко Е.Ю., Быковская С.Н. - Исследование фрагментации ДНК в клетках-мишенях, взаимодействующих с цитолитическими Т-лимфоцитами. - ДАН РАН, 1994, т. 335, № 4, стр. 522-524.

13. Гнучев Н.В., Сащенко Л.П., Кабанова О.Д., Лукьянова Т.И., Блшценко Е.Ю., Сатпаев Д.К., Чертов О.Ю. - Характеристика цитотоксических белков, секретируемых естественными киллерами из селезенки голых мышей. - ДАН РАН, 1994, т. 338, № 5, стр. 704-707.

14. Sashchenko L.P., Gnuchev N.V., Redchenko I.V., Kabanova O.D., Lykyanova T.I., Blishchenko fi.Yu., Satpaev D.K., Chertov O.Yu. - Contribution of membrane-associated cytotoxic proteins to cytolysis of L929 and K562 target cells with different phenotypes. - Immunology Letters, 1994, v. 39, p. 243-247.

15. Chertov O.Yu., Blishchenko E.Yu., Satpaev D.K., Sashchenko L.P., Lykyanova T.I., Kabanova O.D., Gnuchev N.V. - Inhibitory effect of calf serum fetuin on the activity of LAK cells derived factors and rTNF. - Immunology Letters, 1994, "V. 42, p. 97-100.

16. Satpaev D.K., Blishchenko E.Yu., Mirkina I.I., Yatskin O.N., Chertov O.Yu., Aebersold R., Sashchenko L.P., Lykyanova T.I., Kabanova O.D., Gnuchev N.V. -Novel cytotoxic proteins isolated from human LAK cells. - Protein Science, 1995, v. 4, p. 78.

17. Сащенко Л.П., Кабанова О.Д., Лукьянова Т.И., Гнучев Н.В. - Влияние ионов кальция на гибель клеток по пути апоптоза, индуцированную цитотоксическими белками ЛАК клеток. - ДАН РАН, 1995, т. 345, стр. 827829.

18. Сащенко Л.П., Кабанова О.Д., Лукьянова Т.И., Гнучев Н.В. - Изучение роли клеток-мишеней в процессе цитолиза, индуцированного действием лимфокин-активированных киллеров. - ДАН РАН, 1996, т. 346, стр. 820-823.

19. Sashchenko L.P., Lykyanova T.I., Kabanova O.D., Mirkina I.I., Yatskin O.N., Pongor S., Gnuchev N.V. - Different pathways of the release of cytotoxic proteins in LAK cells. - Immunology Letters, 1996, v. 53, p. 25-29.