Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Белки растворимого цитотоксического фактора естественных киллеров и их функциональное значение в цитолитическом процессе

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Белки растворимого цитотоксического фактора естественных киллеров и их функциональное значение в цитолитическом процессе"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР

ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИШГШ им.В .А .БИГЕЛБГАРДЕА ''

БЕЛКИ РАСТЗОРИМОГО ЦИТОТОКСИЧЕСГОГО «¡АКТОРА ЕСТЕСТВЕННЫХ КИЛЛЕРОВ И ИХ ФУНКШЮНАЛЫЮЕ ЗНАЧЕНИЕ В ЦИГОЛИТИ-

ЧЕСКОМ ПРОЦЕССЕ

«• «п

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических надк

На правах руколяси

ПЕТРОВА МАРИНА АНАТОЛЬЕВНА

УДК 612.017.13

Москва 1991

Работа дополнен? в лаборатория биосинтеза нукяешовы^ кислот Института молекулярной биологии им, В Л .2нгельгарта АН СССГ.

Научный руководитель:

доктор биологических наук Луканидин'Б-.Ы.

кандидат биологически* наук Сащвнко Л .П.

Официальные оппсаенгн: доктор биологических наук ПоляновскаЗ О.Л.

доктор биологпческвт 1.:ук Лрион В.Я.

Веду(щан организация: Институт бкоорганичзской хеши т. н.м» Шемякина.

Залита состоится " " ^/¿^с/гЛ1991г. в, часов

на заседании специализированного совета Д.002.79.01 вря Института молездлярной биологии пи. В.А.Энгельгарта АН СССР по адресу: 1179Р4, Москва, ул.Ваввлоза, 32.

С диссертацией ьояно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А.Эстельгарта АН СССР

Автореферат разослан " ¿С&^еУРсЯ 1291г, ч

■ Учений оекретарь специализированного совета

кандидат химических наук

общая характеристика. ракш

Актуальность проблем.

Изучение механизмов противоопухолевого пммуяитета неразрывно связано о расшифровкой механизма цитотоксического действия эффек-торных лимфоцитов -естественных киллеров. В последние года наметился нозый подход к понимания этой проблеш, заключающийся в выделении цитотоксических медиаторов, секретируемнх эффектэрными лимфоцитам и изучении их цитотоксического действия. Били получены в гомогенном состоянии фактор некроза опухолей, сенротируемый макрофагами, а такяь лтфотоксин - белок, выделяемый цитолитвчс сними •• Т-лим$оцитами. Однако до спх пор не охарактеризованы белки, выделяемые естественными киле рами. По современным представлениям, естественные киллеры - особая группа лимфоцитов, не принадлежащия нп к Т-, на к В-лшифоцитам, способная к спонтанному лизису опухолевых клеток in vivo . Естественные каглеры слособны лизироватв широкий спектр опухолевых клеток tn vi tro » что привлекает к ним пристальное внимание многих исследователей.

В 1981 году был обнаружен растворимый цитотоксический фактор - nkcf- секретируемый естественными киллераглл при инкубации с лпниай эритролейкемии К-662. Свойства этого фактора интенсивно изучаются в течение ряда лет. Но до сих пор не установлено, какие белки входят в состав нкср .какова их функциональная роль в процессе цитолиза/В этой связи изучение белгового состава nscí . выяснение функциональной роли белков икс? в цитотэксическом действии, естественных киллеров на опухолевые клетки ос-обенно актуально. Применение такого подхода позволило бы приблизиться к понимании механизма противоопухолевого иммунитета.

Цель работы. В настоящей работе была поставлена задача изучения белкового состава нкср , исследования цитолитической активности nkcf и возможной функциональной роли отдельных белков в процессе цитотоксического действия икс?

. Научная новизна и практическая ценность работы. В нашей работе было проведено исследование белкового состава hkcf - растворимого цитотоксптческого фактора естественных киллеров. Показано, что nkcf не является гомогенным белком,-'а прздстазляет собой сложный белковый комплекс, состоящий как минимум из 7белков. Было продемонстрировано, что белковый состав нкср аналогичен белково-

му составу гранул цитолитических лш.йгацитсв. икс? обладазт-порофор-шрующей п яьт-эстеразной активностью, что позволяв? говорить о функциональном сходстве нхср о гранулярными балками. Ппи изучении функциональной роли белков нкср было показано, что ритотохсвческое действие иксг зависит от концентрации ионов лальция в среде. При высокой концентрации ионов кальция екср-зависимый цитолиз представляет собой двухстздийшй процесс, начинающийся с образования пор на мембране опухолевых клеток, но образование лор не является достаточным условием для гибели клетки. Гибель клеток-миленей наступает через 24 часа при участии шгаорюге белков иксе , в состав которых входит вьт-эстераза.

Апробация работа. Материалы диссертации докладывались на конкурсе молодых ученых Института молекулярной биологии (1988), Международном биохимическом конгрессе в Праге (1988).

рубрикации. По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы. Список публикаций приведен конце автореферата,

Объс.л работы. Диссертация состоит из введения, трех глав (обзор литературы, материалы и метода, результаты и их обсуждение), выводов и списка цитированной литературы (145 ссылок). Работа изложена на _ страницах машинописного текста, содержит 18

рлсунков.

ЮДЗРЗШ1ИЕ РАБОТЫ

I. Цитолитическлй фактор естественных киллеров -это сложный полифункцисналышй белковый комплекс

Для получения ыкер испол! зовали естествешше киллеры, вк-деленные по методу Тимонена и соавторов из селезеночной суспензии бестимусшх крыс линии асиБтг . Белковый состав икср изучали метолом электрофореза в полиакраламидном геле в присутствии до~ децилсульфата натрия. Показано, что шеер представляет собой словами белковый комплекс, состоящий из 6-7 полос, электрофорз-тическая подвижность которых соответствует белкам с молекулярной массой 66-62, 58, 42, 38, 30-28, 24, 17, 14-12 гДа. Необходимо отметить, что. качественный состав белков не изменяется, хотя количественное соотношение белковых полис гложет варьировать. Так,

отдельные образцы яке? на 70-90$ состоят из полос, злектрофоре-тическая подвижность которых соответствует белкам с молекулярной иассой 58 и 66-62 вДа.

Известно, что естественные кшиерц содержат большое количество цитолитически активных гранул. Оказалось, что белковый состав вкср практически совпадает с составом цитолитических дафоцитов. Ранее Ыейсоном и Чопом и Пастернаком было показано наличие порофоршрующей п вьг-зстеразной активности гранул. Поэтому мн решили выяснить, обладает ли перфорирующей и вы-эс-теразной активностью препарат нкер . При исследовании цитоли-тической активности ¡гке? установлено, что в присутствии 5!{.1 СсСг^ препарат шсср способен лизирэвать опухолевые клетки-г.т-Ветга в течение 20 минут инкубация, т.е. проявлять цитстоксичес-кое действие аналогичное эффекту гранулярного- перфорина. Другим Щелком, характерном для'Цитолитических гранул, является

вьт -эстераза. Обработка препарата ■ икс? фссфометилсульфо-флу.эридом - ингибитором эстеразпой активности приводи?' к подавлению нкер-зависпг'ого лизиса опухолевых клеток. Таким образом, ехс? представляет собой белковый комплекс, обладающий рерфорирующей и эстеразной.активзостьн, что позволяет говорите р фухпщиональном сходстве К1юр с гранулярными белками.

2. Цитолиз клеток под действием цкср -ипого-ступенчатый катацийзавлсишй процесс.

В нашей работе т исследовали влияние ионов кгльция на цитолиз клетотс-шпеней под действием нкер .поскольку нют обладает перфорирующей активностью, проявляющейся в присутствии повышенной концентрации ионов кальция. Еа рисунке I приведены графики зависимости цатолитической активности жег от времени инкубации с клетками-мишенями линии К-562 в присутствии различной концентрации ионов кальция.

В обичэдх условиях (111,5 Са&20 цитолиз развивается сравнительно медленно, достигая каксиму.'ла через 48 часов интубации (рис.1,2). Повышение концентраций ионов кальция вдвое практически вдвое увеличивает цитолитическук активность жер . Дальнейшее увеличение концентрации ионов кальция приводит не только к

вреня(час)

Рио. I. Влияние ионов калхция на щ;тотоксиче скую'активность якср .

а) активность нхс? в присутствии 1Ш ЭГТА (I), 1М СаО,2(2),

2Ш СаСь2(3), 5ШСа£Ь2(4) добавление БиМЭГТА через 1,5 часа инку- . бации ыксрс кдегкаш-мииеищи (5); удаление ыксг из инкубационной проиы через 1,5 часа после начала инкубации (6).

б)*активность якср в присутствии 5ш сасц^•

ускорению процесса цитолиза, но и меняет характер кривой зависимости цитолитической активности нкср от времени иккубапии. В этих условиях (БШСаСьз) выявляются два п:иса цитолитической активности жср наступав'? чароз 20-30 минут инкубации и достигает 35$ цитолиза. Затем следует латентный период, во время которого краситель но проникает в клетки-мишени, а через 24 часа инкубации наблюдается второй глакспмум цитолитической рктпвпости. За 24 часа инкубации под действием икс? погибает в средне?: 70-60$ клеток-мишеней. Как видно из рис.1.5 добавление ЭГТА в концентрации 5Ш через 1,5 чаба инкубации мало влияет на актпз-ность второго пика, наблюдается ингибпрование лпзяса клеток-мишеней липь па 20%. Более того, удаление через 1,5 часа из инкубацион-лоа среда пкср и последующая инкубация отштых клеток в культу-ральной орзде не предотвращай1 появление второго пика цитолитической активности, кривкэ• 4 я 6 па рисунке I практически совпадают. По-видишму, программирование клетки душ лизиса происходит I в перше 30 минут взаимодействия.

Поскольку два пика активности нкср проявлялись при высокой концентрации кальция, ш решили исследовать влияние на циготок-сическое действие икзр апгитал к двум белкам, действие которых связано с ионами кальция лерфорнн?, гдльцийзавЕсимому цитоткси-часкому белку цитолитических грапул, и каломодулину- универсальному регулятору действия. кальция.

На рис.2 доказано, что добавление антател к гранулярное перфорипу приводит к практически полному ингибированшз первого, двадцатиминутного максимума цитолитической активности мер Пря этом'наблцдается и сшиенот активности шссг и через 24 часа, что'указывает на взаимосвязь двух пикьв цитолиза под действием нкср

Цитолитическая активность препарата НКСР , обработанного антителами к каломодулину определялась при концентрации 1гЛСа&2 в инкубационной среде. Как показано на рис.3, при этой концентрации ионов кальция препарат ыкор не обладает двадцатиминутной цитолитической активностью. При обработка антителами к каломодулину гибель клеток-мишеней представляет собой дискретный двухступенчатый процесс. Первый пик цитолиза проявляется через 30 минут инкубации икс? с клетками-шшештмп,' ¿торой - через 24 часа, как и в присутствии 5Ш.

з

spsH2('2aci

Рис,2. Влияние антител. к гранулярному нерфорицу ка цптолитэтео-х;уа активность н зу . Активность жсе1 в присутствии

| зреня(час) ,

Рис.3. Влияние антител к калмодулину на цитолитичесвую активность жср .

а) активность 1;кс? в присутствии 5ьМ Се

б) активность 3XCF в присутствии СаС^ до обработки антителами к калмодулину

в) активность икс? в присутствии 1Ш СаСЬ^ после обработки антителами к калмодулину,

Таким образом, подавление первого пика цитолитической активности гко? с помощью антител к гранулярному перфприпу приводит к снижению и второго максимума цитолиза. Напротив, обработка препарата ли? антителами к каломодуллцу приводит к образованию первого-ЗОминутного- и второго - 24чпсового максимумов цитолитичзско!! активности икс?

Исходя из того, что шсс? является сложным белковым фактором, ложно предположить, что на разных стадия:: цпбелп опухолевых клеток действуют различные белка ккср • На рисунке 4 приводятся графлен зависимость цитолитической активности от концентрации ккер » Можно видеть, что активность. первого пита практически не зависит от концентрации белка. Кривая выходит на плато уже при концентрации 50нг/мл. В то же время активность второго пика увеличивается прямо пропорционально концентрации белка. При концентрации балла 50 кг/ш (то есть а условиях образов,пеня первого пика цитолиза) 24 часовая активность икс? близка к нулю. В этом случае метка остаются живыми, несмотря на то, что они пропял стадию образования пор; Мояно сказать, что .для гибели клеток, через-24 часа требуется участие других белков нкез? • прячем, чем вше концентрация этих белков. тем вшие цатолитеская активность икс? • После -гого, как был выделен перфоран из гранул т-кшиероз я ПК-клеток и была обнаружена способность пер$ор1:га л^зировать эритроциты, образуя лоры на мембране, в литературе сломалось мнение о том, что действие .натуральных киллеров на клвтку-миыень сводится к секреции перфо-р::па з межклеточное пространство и что клеткп-мшенп погибают сразу же посла образования пер на цптоплазкатической мембране. Наша результаты показывают, что образование пор недостаточно для гчбелл клетки. Возможно, цптотокспческое действие ¡псср в течение первых 30 кинут инкубации з присутствии ой.! Сасря~ зано с образование:.! пор на мембране клзткгм.жшеня. В образующиеся поры проникает краситель - трипановый синий - клетка, выглядит "мертвой". Затем наступает латентный период, в течепйе которого клетки ке окрашиваются. Видимо в это время клотка-мпшень восстанавливает целостность плазматической мембраны, сбрасывая поврежденные фрагменты. Образование пор не является достаточным условием для гибели клеток. Гибель меток ввязана со вторым

этапов цитолиза и наступает лишь через 24 часа. В первые 30 • минут взаимодействия происходит программирование клетки для лизиса, возможно, это связано с лереданей трансмеибранного сигнала с помощью белков' икс?, вероятно, разные белки нкср принимает участие в разкг-х стадиях процесса под действием ИКС? . таким образом, при изучении влияния ионов кальция на цитоличео-хую активность икс? было показано, что циголитическое действие мкср значительно увеличивается с повышением концентрации ионов кальция. При внсокой концентрации кальция икс* -зависи- . шй лизис клеток-мишеней предстагляет собой двухстадийный процесс который начинается с образования пор на мембране клеток-мишеней. Образование пир не является достаточным условием для гибели клетки. Гибель клеток-ыишенсй наступает через 24 часа при участий других белков нкср .

Г5. Характеристика белков нкср , обладающих перфорирующей и цитолитической активностью.

Показав, что ыкср -зависимый цитолиз представляет собой > двухстадийный процесс, и допустив, что за каждую стадию ответственны различные белки, ыы перешл:; к характеристика!! »тих белков.

Поскольку первая стадия цитолиза под действием мер подавляется антителами к перйорану, мы решили выяснить, какие белка в составе ыкср способны взаимодействовать с антителами к гранулярному перфорину. Для этого проводили разделение белков НКСР - методом электрофореза в полиакриламидлом геле с последующим переносом их на нитроцеллюлозные фильтры п обработки фильтров анти. телами-к перфорину из гранул цитолитических лимфоцитов (рис.5).

Как видно из рисунка 5, из всех белков нкср взаимодействует с антителами к перфорпцу только I белок, электрофоретичеекая подвишюсть которого совпадает с электрофоретической подвижностью перфорина (в невосстанавливающих условиях 62 лДа). Этот белок ыы условно назвали перфориноподобным.

Для дальнейшего изучения физико-хишческих свойств перфо-рииоподобного белка мер ч сравнения его с гранулярныл перфо-рином, мы проводили гельфильтрацшо препарата ыкср на колонке

центрации.

а) активность тссз? через 30 минут инкубации

б) активность икср через 24 часа инкубации

68 — ЩЩхвя*."

I '

45 —да

г

25

» 1 .

1 ;

'ас .5. Взаимодействие белков жср с антителами к гранулярному перфорину. .

1. Електрофорез белков нксрв 1&% лолакрилашдоом геле ' в присутствии додецплсульфата натрия. ' ;

2. Обработка белков икс® » перенесенных на нитроцеллюлоз- ; ный фильтр, сывороткой кролика, содержащей антитела к 'пер-форину (1:100).

2SI-4CC0 3V/ в sex se условиях, в которых Иейсоиок к Чоном било проведено выдиение перфорида из гранул цитолитаческих Т-лимфоцптоз.

На рисунке 6 ярпьодахся профчль эволюции препарата s;ccF с колоша; 2SÜ-4CG0 sví , При разделении бойков. iíicc? а вдкой белковой фракции определяли лорфс-рирук:цуэ активаосяь са 20 ш-щч з itpisG3Tci'Bn,i а;.;,! Сай,2« ци'-одптвчзскуа активность за 24 часа при 5:,iA C¿C¿2, а ~aKKS датолаютеокую акгизнзо'гэ в присутствен Iii.? oaCbg 'через РА я 48 часов тяубащш»

Как зидпэ ns рисунка 6, перфорирующей активностью з присутствии 5i.il Са0.2 обладает белковая фракция к 19. Количество кдеток-шпопой, окраашваошре уризановам синим, достигает 35$ за 20 минут инкубации. Электрофоретичасккй анализ данной фракции пс- .. ■ казгл присутствие о-злка с тдецуяцрпой кассой 60 &Ва,пе,рфорш:о-иодобнай белок ыкез? злюпруется в полном объема колонки после соловой фракции, что совладав? с поввдзккен гранулярного перфо-рина, как показано Мойсонсм л Чоиом. '

При гаяьфш&трада препарата шя? на колоша -132-4000 sví .обнарукева группа бзлков, обладающая аптстотаическигд действием па клояшнашиш црк низкой концентрации ионов вальишх в среде, Э'л; белки выходят в начале элацнмшого объема колонки практически в одной фракции (фр.й 4). Цатолатическак активность данной §раакщш достигав« 80$ ва 48 чаоов инздбацпи (рио.7).

Следует отметите, что.исследуя щгеотоксичпость белковых фракций ш не обнаружил;: высокой кальцайзевисимой цитолптической активности через 24 часа, которая характерна для «сходного препарата KKCF- » Питолитическая активность фракции Га 4 за 24 часа достигает 30$ и практически не зависит от концентрации, ионов кальция. Вероятно, зте связано с отделением На колонке пегйорзно-подобиого белка.

Для дальнейшей характеристики белков нксг , проявляющих цптотокепчность в присутствии Ii\tí CaCbg мы провели фракционирование на хромагографзче ской колонке шш-toyoperl • Белки олюировали с колоша 0.0-0.8 í.í градиентом концентрации щсъ 00 скорости; 15 ш/час. Белковые фикции с5нли тестированы па цито-токсячаос.«.'* ка К-662 в течение 48 часов тодбадии при М CaC¿2. в среде (рас.8).

40-

1 20 ¿0-

У

Iм- /'

о

г\

V

13

О 5 10 15 20 ,!0ИеР «Ми-

яо.б. Цгтолжшеская активность фравщф йхор посхг разделения на холопке тах-МШ 3'.7 в присутствие 5г-11 СаСН о, л шп-убациошюй среде, а) активность эа 24 "аса пшсубацн;;. ....сО.щегизносгь за 20 шну? ятн&шш«

ис.

5

I

10

15

кокер фракции

Цнтолитическая активность .белковых фракций икс/ носло раздо--ления на колонке тбк-чоосот з присутствии 1мМ са012 чероз 48 часов, ! инкубации.

Как видно аз рисунка 8 цитотокснчэское дгйстзко на клетки киеэня проявляли фракции fêS 9,10. Япзпс клсток-мшекай под действием фракции të 9 достигал 27%, под действием фракции J510 -составил 21%.

Электрофорзтачеекай анализ фракций Шг 9,10 показал присутствие белков с молекулярной массой 60 uEg в невосстановлзн-шх условиях (26-30 кЕа пра восстановлении). Предположив наличие эстеразп в данных фракциях, ш провидя определение ыя-эотеразной активности. Оказалось, что макспмукн вьт-эстераз-ной и цитодитической активности за 48 часов 'практически совпадают.

Для поделарования исходного цитотоксического действия препарата икс? ш решили воссоединить фракцию JS 19 с колонки

2s;c-4000 s'a и фракцию 35 9 с колонки SSAE-fcoyoporl • Г.ак показ;-ко ка pncyms 9 фракция fô 10 обладает перфорирующей актиа-' ностко в присутствии 5Ш CaCbg» Е течЕ!1Ше перзше 20 !.зщут взаимодействия с клетками шшепи до 35$ клеток окрашиваются трипапо-вкм сшим, в то время как цитолитичеш-ая активность далной фракции, за 24 часа в присутствии 5Ш СaCbg арайно низка (7$).

Цитотоксическое действие фракции JS 9 с-колонкам; ШАЕ-toyopea через 24 часа Енкзбаций при 5&й1 CaGi^ проявляется сл?бо, цпто-литическая активность не ирзвапаег.К^ {рис.9). '

При соединении этих деух белковых Фракций (фракции 19 в фракции 9) в одной инкубационной пробе возникает цптолитический аффект, аналогичной действия исходного образца пкср . Как видно на рисунке 9, гибель клеток представляет собой двухаташый процесс. Перзай максимум цитолитичеекой (перфорирующей) активности возникает чирез 20 шнут взаимодействия, второй пик цитолиза формируется лишь через 24 часа инкубации в присутствии 5î>î.i Сай,2 »

Таким образом в составе нкер' содержится белок с молекулярной кассий 62kDc. , no ряду фпзнко-хиыических и функциональных свойств сходы й с гранулярнкм перфорином. Перфориноподобний белок hkoï способен связываться с антителами к перфорину, элю-друется с колошей TSK 4000 sw в том m объеме что и перфорин. Г. сояаленкаэ малое содержание этого белка в образцах екср пе позволяет окончательно решить вопрос о первичной структуре этого

хрмлатографзческого разделения на колонке EEAE-to/operl

О S 10 15 20 вреняСчас)

•ис.9. Моделирование цитолнтического действия нкор • Зависимость от времени инкубации цитолитической активности а) фр. И 19 с колонки tsk-4000 E'.v tí) фр. .'3 9 С КОЛОНКИ DEAE-tOyoperl

в) соединение в одной инкубационной пробе фр. JS 19 (Юмкл) и фр. Я 9 (100 мкл.).

белка и о сходства его с перфорином. Было установлено, что порофоршрующая активность, проявляющаяся через 20 минут взаимодействия нкср о опухолевой клеткой, связана именно о этим белком ккср . Кромг того, обнаружена группа белков нко? , обладающая цитолитпческой активностью чорез 48 часов инкубации в присутствии низкой концентрации поное кальция (1Ш СаД^). Далее была установлена связь между ВЫ'-зстеразной активностью белков икс? и цитолитической активностью, проявляющейся через 48 часов. Следует отметить, что отдельные белковые фракции не проявляют высокой цитотоксичеекой активности чорез 24 часа при концентрации ионов кальция 5Ш. Соединение в одной аш®бационно{ пробе фракций,- обладающих порофоршрупцей активностью, и фрркциг проявляющей кальцийнезависимую активность через 48 часов внку-бапаи, позволило восстановить цитотоксический эффект исходного образца . ' -

Blüiíwl

I. Било проведено наследование белкового состава NKCF _ отановлено, что икр не является готогенншл белком, а предзтав-яет собой (¡догний белковый ког.шлекс, состоящий так пяяпцум, из белков.

2 .• Прп изучепш функциональной роли белков икс? 'било по-азано, что цитотоксическоа действие жср на клеткп-мишьни вачителыю усиливается с повышением концентрации ионов кальция среде. При высокой концентрации ионов кальция нкср-зависп-ий цитолиз представляет собой двухстадпйянй процесс, начинаю-иЗся с образования пор по типу перфорпновыя на клеточной мег.'б-зне. Образование пор не является достаточным условием для ги-зли клетки. Гибель клеток-мивеней наступает через 24 ч. ja прп застпп других белков iikcp .

3. В составе itkcf обнарукен белок, но ряду фязико-хшз-зских и адцкционалымх свойств сходный с нерфорпном яз гранул атолитических лимфоцитов. ПерфориноподобнкЗ бело:: ibccf(S2 ¡hd?,) юсобен взаимодействовать с антителами к перфорииу, а такжз заявлять порообраэувщую активность на первом этапе ккс? -зави-я,того лизиса клеток-мишеней.

4. Лизис опухолевых клеток в присутствии ICI Сав °РеД3 зязан с действием группы минорных белков ггкез? * 3 состав кото-эС входит зьт-эатеразйо Установлена прямая зависимость msse'

вьт-эстеразной активностью и цияотзом под действием при ilí ионов кальция в среде.

5. Соединение в одной инкубационной пробе двух белхсовнх шщий, обладающих перфорирующей 2 цитолнтичесной активность®, )зволяет смоделировать двухстадийный процесс гибели клеток под ¡йствием нкер .

По материалам диссертации опубликованы следующее работа:

1. Сащенко Л.П., Тнучев Н.В., Кириллова ПЛ., Ребизова Т.Е. Лукьянова Т.Н., Лукапидин Е.М. -Влияние ионов кальция на активность цитотоксического фактора естественных киллеров,- Доклады АН СССР, 1987. т.296, й5, стр. 1278-1280.

2. Тпучев Н.В., Сащенко, Л.П., ЛукьяноваТ.И., Ребизова Т.В. Кириллова 1,1.А., Луканвдин Е.М., Ревазова Е.С. - Обнаружение nej> форишподобного белка в составе растворимого цитотоксического фактора натуральных киллеров.- Молекулярная биология, 1987,

т. 21, .'5 4, стр. III7-II23.-

3. Sashchenko 1.Р., Gnuohav L'.V., Kirillova МЛ.., Lukyauova S.X., Rebiaova 2.V., Re-TOii.ova B.S., Lukanidin Е.Ц. £ Separation of pora-forming and cytotoxic activitieB froa natural cell cytotoxic factor •• TSBS letters, 1988. v.226, К 2, р.2б1-2£

4. Kashchenko L.?.f C-nuchev Б.V., Kirillova M.A., Luicyanova T.I., Rebisova T.V., Chertov O.Xu., Lukanidin E.M, -Effect of antibodies to granular perforin and calmodulin on toe activity natural killer cytotoxic factor.- Biomedical Science 1930, v.1, p.291-294. '