Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярные механизмы цитолитического действия лимфоцитов человека и животных в противоопухолевом иммунитете

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярные механизмы цитолитического действия лимфоцитов человека и животных в противоопухолевом иммунитете"

и и - ^

у />\

РОССИЙСКАЯ АКПДЕЫНЯ ШК Институт молекулярной биологии ии. В.А. Знгельгардта

На правах рукописи

РЕДЧЕННО ИРИНА ВЛАДИСЛАВОВНА

адк 512. 01?. 13

ШЕШЯРННЕ НЕХЙНИЗИа • иИТОЛИТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ЛИМФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА И 1ИВ0Т1ШХ В ПРОТИВООШОЛЕВОИ ИН1ШИТЕТЕ.

03.00.03 - молекулярная биология оз,со,£5~-метоцноя Ыояогия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени • кандидата биологических наук

Москва 1992

Работа выполнена в лаборатории биосинтеза нуклеиновых кислот и лаборатории инструментальных методов анализа Института молекулярной биологии им. В.й. Энгельгардта РАН и лаборатории молекулярной генетики рака Института биологии гена РАН.

Научные руководители:

доктор биологических нацк Луканидин Е.М.

кандидат биологических наук Саиенко Л.П.

Офицаальние оппоненты:

,доктор биологических наук Сидорова Е.В.

кандидиат химических наук Габибов А.Г.

Ведузая организация: Онкологический Центр PfiMH

Завита состоится •■ t-L •■ ujüj i992г. в ¿0 часов на заседании специализированного совета Д.002.79.01, при Институте молекулярной биологии иы. В.А. Энгельгардта РЙН по адресу: 117984, Москва, ул.Вавилова, 32.

С диссертацией мовно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им.В.й. Энгельгардта РАН. Автореферат разослан "(£." ¿¡¿'/м/и 1992г.

Учений секретарь специализированного совета ^

кандидат химических нацк / Крицын

■■■-я > f

I

k i 1

¡ссзртацил t

ОБИЯ ХАРАКТЕРИСТИКИ PflEOTII Актуальность проблемы.'

В деструкции опухолевых клеток участвует иакрофаги,-полиморфноядернне лейкоциты.тромбоциты. Т- и В-лимфоцитк. естественные киллерние клетки (ЕНК). До недавнего времени ведукая роль в этом процессе отводилась ЕНК. Открытие в 1302 годи влияния интерлейкина-2 С ИЛ—2 J на цитотоксический потенциал лимфоцитов периферической крови стало ванной вехой в истории противоопухолевого иииунитета. Первие результаты по предотвращении и лечешш метастазов методом адоптивной иммунотерапии "лиифокин-актнвированныии кнллерными" (ЛАК) клетками били получена на ннииной нодельяоП системе. Далс-кейиие клинические испытания. проведение S.Rosenberg i1982) и другими исследователями на больных, показали, что терапия ЛАК-клеткэми является достаточно эффективной в борьбе с кетастазаии при различиях гистологических фермах рака. Введение больным ИЛ-2 и ЛПК-плеток вызывало регрессии опухолевого роста у 15-47% пациентов с прогрессирукшей формой рака.

К настоящему времени накоплен обширный материал по биологии ЛАК-клеток: охарактеризован их фенотип, предлонени некотрне иодела лизиса опухолевых клеток, описан ряд белков, потенциальна участвуищих в цитолизе. Однако, несмотря. на болыоз число экспериментальных данных, многие вопроси остаются открятыии. "Так. например". неясно,каким -. образом происходит цитолиз клетон-шшеней (КЙ). если цитотоксичзский секрет гранул но освобовдаегся; с -какими белкаки связана цитотоксическая активность ЛАК. Поэтому изучите молекулярных кеханизиос цктзтоксического действия ЛАК является перспективный направлением в современной онкоимнунологии. разработка которого позволит пркизннть полученные теоретические знания в практической медицине. ' *

Цель работа. В настоящей работе била поставлена задача характеризацг:;! популяции эффзкторних клеток, объединенных

понятиен ЛАК, изучения возмокных механизмов ^политического, действия ЛйК-клеток и их цитотоксических белков на опухолевые клетки и получения перевиваемой линии ЛйК-клеток человека.

Научная новизна исследований. Впервые были получены данные об изменении фенотипа популяции эффектозных клеток, опосредующих . МК-феномеи, в зависимости от времени стимуляции М-2. Доказано, что ЛйИ-нлетии - это гетерогенная популяция лимфоцитов; на ранних стадиях стимуляции ИЛ-2 лизис КМ обусловлен ЕКК, а при длительной стимуляции И/1-2 цитотоксическое действие ЛйК-клеток на КК опосредовано цитотоксическиыи Т-лимфоцнтани (ЦТЛ), Было продемонстрировано, что не только ЛйК-клетки, но и их супернатанты с СИ j обладают цитотсксической активностью в отношении опухолевых клеток. и установлено, какими именно цитотоксическиыи белками определяется цитолитическое действие СН ЛйК-клеток. Показано, что ЕКК и ЦТЛ секретирувт различные цитотоксические белки. При изучении возшшнх механизмов цитолитического действия flflK-клеток била установлена роль мембранных цитотоксических белков в ЛЙК-опосредованном цитолизе. Определены молекулярные нассы цитотоксических белков.супернатанта и мембран ЛйК-клеток. Впервые, бала получена перевиваемая линия ЛйК-клеток человека, обладавших цитологической активностью, характерной для нативных ЛйК-клеток.

Научногпрактическаа ценность работа. Учитывая ту роль, которув играют Ш-клетки в противовопухолевом иммунитете, мо«но счита*ь, что полученные данные об изменении цитотоксической активности.и Фенотипа ЛйК-клеток под влиянием ИЯ-2 представляет не только теоретический, но и практический интерес. Определение цитотоксических белков, опосредующих цитолитическую активность ЛАК-клеток. открывает перспективу получения рекомбинантных белков, обладавших противоопухолевой активность», и применения их в качестве фармакологического препарата в клинической практике.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на Iii ВсесопзнОй конференции "Макромолекулы клетки" (1989), Всесоюзном симпозиуме по молекулярной и клеточной онкобиологии (1990), Всесоюзном симпозиуме по химии белка (1990), на конкурсе молодых ученых Института проблей онкологии им. P.E. Кавецкого ЙН Украина (19Э1).

Публикации. Ло материалам диссертации опубликовано 3 печатных работи. 2 приняты к печати. Список публикаций приведен в конце автореферата.

Об]>ем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав (обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуядение), выводов и списка цитированной литературы (194

ссылки). Работа изложена на _ страницах мавинописного текста,

содержит 24 рисунка.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТУ

Материалы и методы.

ЛЯК-клетки получали из спленоцитов интактных мышей по методу Henkart (1986) и лимфоцитов' периферической крови человека по методу Podack ( 1988). Источником ЕКК слуиили селезенки беглимдсиих ныв ей nu/nu разводки • вивария'0Ш1 РАИН, клетки выделали ло метода Tinonen (1982). ЦТЛ получали в скеванной Kgnbtype лимфоцитов по методу Cerrotinl (1974).

Цитатоксическую активность зффекторных клеток и их супернатантов определяли в цитотоксическон тесте in vitro по окраске трипановым синим. Соотноаение зффекторных клеток и клеток-мишеней составляло 20:1. Нивеняаи слуили клетки линий К—562 и L-929.

Фракцию ненбран получали по методу Young (1989).

Электрофорез белков препарата СИ вели по методу Laeaali (1970) в 12Х полиакриламидном геле, содерванем додецилсульфат натрия. '

Хроматографическое разделение белков препарата СН проводили на колонке DEflE-Toyopearl 1650 s (1*4 см ). уравновешенной в 10 ил Трис-НС1. рН 8,0. белки злюировали в линейном градиенте концентрации НаС1 от 0 до 0.05М.

Для определения поверхностннх иаркеров клеток применяли иетод лазерной проточной цитофлуориметрии с использованием моноклональных антител (мкАТ), меченных флуоре$цешшзотно-цианатом.

Перевиваемую линии /ШК-клеток человека получали путем трансформации вирусом Эпютейна-Барр.

Электрофорез, хронатографическое разделение белков суперн^танта зффекторных клеток и определение поверхностных маркеров клеток проводились в Институте биоорганической химии

им. Н.И. Шемякина РАН.

Результаты исследования.

1. Изучение цнтотоксического действия ЛПК-клеток на клетки-миышш и определение Фенотипа популяции зффекториих клеток в зависимости от времени стимуляции И/1-2.

В нашей работе было показано, что при стимуляции лимфоцитов периферической крови человека Ш-2 в течение 8 сут их цитолитическая * активность в отношении опухолевых К1! изменялась определенным образом. Как видно из рис. 1(1) ЛАК эффективно лнзнруют К-562 в течении первых 4 суг стимуляции лимфоцитов ¡(/1-2. Максимум цитотоксичностн ЛйК (802 мертвых клеток) наблидаетса на 2-3 сут, на 5. сут цитотоксичность ЛАК спивается до 40£, а после 5 сут сксва наблндагтея рост цитотоксичностн Л11К с иашшцкои (70И) на 6-? сут. Из рис.2(1), на котором представлс:;а динамика циготоксической активности ЛйК в отноиешш 1,-929, видно, что кривая зависимости цитотоксической активности ЛПИ от срока стимуляции ИЛ—2 имеет тот же характер - два пика цитотоксичностн (на 2-3 и 6-7 сут), но высота этих пинов для 1-929 пиве - 40'/. и 30% мертвых клеток соответственно. Таким образом, цитотоксическое действие Л(Ш на Кй характеризуется двумя наксиыунами активности, но К-562 является более чувствительными нишеняни для ЛАК, чем 1-929.

Цитотоксическое действие ЛПК опосредовано секрецией цитотоксическнх белков в зону контакта с КМ, поэтому на исследовали цитотоксическуа активность инкубационной среды ПАК, или супернатанта ЛПК, на К-562 и Ь-929 в зависимости от вреиени инкубации ЛЙК с ИП-2. Оказалось,что СИ ЛПК, как и ЛАК-клетки. обладает цитотоксической активностьи в отношении КН. Нак видно из рис.1(2), цитотоксическое действие СН ЛПК на К-562 тоне характеризуется двумя иаксимунаил цитотоксичностн - на 3 и ко 7 сут инкубации ЛЙК с ЙЛ-2. но цитотоксическаа актизность СН ЛЙК на К-562 суаестБенно пике цитотоксической активности ЛЙК на эти К!-. Интерес представляет тот Факт, что цитотоксическое

Яг 80

X

о

о -

5 60

о

5

ч -

Рис

40

20

0

СУТКИ

,1.Зависимость цитотоксическсй активности (ШК-кяетой человека и супернатанта ЛАК-клеток в отношении КИ К-562 ШК:КН=40:1) от времени стимуляции ИЛ-2:

1-цитотоксическая активность ЛАК-клеток

2-цитотоксическая активность супернатанта ЛАК-клеток в присутствии 5пН СаС1

3-цитотоксическая активность супернатанта ЛАК-клеток при Физиологической концентрации ионов Са

80

о

о

60

40

20

и 1' 2 ' 3' 4' 5' 6' Г

Рис.2.Зависимость цитотокси.ческой активности ЛАК-клеток

человека и сипернатанта ЛАК-клеток в отношении КМ .1-929 '(ЛАК:КМ=20.м ) от времени стимуляции ИЛ-2:

1-цитотоксическая активность ЛАК-клеток

2-иитогоксическая активность супеонатанта ЛАК-клеток

действие СН ЛЙН на К-562 обнарузиваетса только в том случае, если концентрация Са в инкубационной среде составляет 5 иМ. При физиологической концентрации Са (2,5 вН)

цнтотоксический зффекг не обнаруживается. Цитотоксическая активность СИ ЛАК в отновении L-929 характеризуется кривой подобного профиля (рис.2(2>). но СИ ЛАК активен в отношении L-929 при физиологической концентрации Са в среде. Этот факт мовно объяснить, предполовив. что ЛАК лизируют различные НИ путей разных механизмов или (и) различные КМ по-разному реагируют на цитотокеическуя атаку в зависимости от экспрессии на их поверхности рецепторов узнавания-связывания. Зти гипотеза нувдаются в экспериментальном подтверядении.

Исследование цитотоксической , активности ЛАК с использованием мышиных лимфоцитов в качестве

зффекгермая клеток -. тояе показало наличие двух пиков цитотоксической активности СН в отноыений 1-929.

Наличие двух пиков цитотоксической активности ЛАК и их СИ на протявении 8 сут инкубации ЛАК с ИЛ-2, а такве довольно противоречивые литературные данные о фенотипе ЛАК привели , к вопросу о том, не изменяется ли феиотипически популяция ЛАК в зависимости от времени инкубации зффекторнцх клеток с ИЛ-2. Изучение фенотипа ЛАК в течение 8 сут инкубации с ИЛ-2 привело к следцивдм результатам (рис.3): на 2-4 сут инкубации с ИЛ-2 около 4С£ клеток зкспрессировало антигенный маркер CD8 и такое ае количество клеток зкспрессировало CD1В¡наличие СВЗ-антигена обнарувивалось У Ш ЛАК. По литературным данным таким Фенотипов харак*еризувтся ЕКК - CD16+CD8+CD3-. На 5 сут количество клеток, экспрессирувиих CD8 и CD 16. падает до 102, а количество клеток, экспрессирунжих CD3, возрастает до 20Z. На § сут количество клеток, несущих CD3. достигает 60%, количество клеток, зкспрессируюцих CD8, тояе растет и достигает 50Х, а количество CD1S+ клеток остается на низком уровне - 13%. Согласно данным различных авторов, фенотип CD3+CD8-tCD16- характерен для.ЦТЛ, т.е. на 6 суг инкубации с ИЛ-2 популяция ЛАК представлена ЦГЛ. Изучение экспрессии поверхностных маркеров эффекторных клеток, опосредующих ЛйК-феномен, позволяет сделать вывод, что на ранних стадиях стимуляции ЛАК ИЛ-2 за ПАК-Феноиен ответственны ЕКК, а при более длительных сроках стимуляции эти клетки

о ж

Й э

а- с_

СП к

о е-

т

60

40

20

0

8Г СЛТ^

Рис.3.Изменение экспрессии антигенных паркеров /Ш-клеток человека в зависимости от времени стимуляции ИЛ-2: 1 -СО 16

г-со з ■

З-СВ 8

81

о

41

20

Д-1

;П эП 7 бТ ё1 в1 суАИ

Рис.4.Зависимость цитотоксической активности ДйК-клеток

человека в отношении КМ К-562 СЛАК:КМ=20:1) от времени стиичляции ИЛ-2:

1-при физиологической концентрации ионов Са

2-в отсутствие ионов Са

дифференцируются в драгой клеточный тип - ЦТЛ, или не новый тип клеток развивается из небольшого количества предаественников. изначально присутствовавших в гетерогенной популяции ЛЙК.

Таким образом, ыокно заклвчить, что как ЛАК. так и и>: СИ обладает цитотоксичностъю в отношении К-562 и Ь-929; цитотоксичность ЛЙК и ОН ЛАК проявляет одинаковую зависимость от времени стимуляции ЛАК ИЯ-2, характеризуясь двумя максимумами цитотоксичности - на 2-3 и 6-7 сут. К-562 являются лучшшн нииеняыи для ЛАК. чей 1-929, но худииаи, по сравнений с 1-929, для СИ ЛИК. Лизис К-562 под действием СИ ЛЙК - это Са-зависимый процесс, в отличие от лизиса 1-929. Клетки, осунествляюцие /ШК-феноыен> являются гетерогенной популяцией лимфоцитов, и в зависимости от срока инкубации с ИЯ-2 цитотоксическая активность ЛАК мовет бить обусловлена ЕКК или ЦТЛ. входящими в популяцию ЛАК-клеток. Нозно считать, что на ранних стадиях активации ИЯ-2 ЛЙК-феноиен опосредован ЕКК, а на более поздних стадиях активации ИЛ-2 цитотоксичность ЛАК связана с ЦТЛ.

2. Изучение мембранного механизма цитотоксического действия МК на клетки-мишеяя.

В литературе приводились факты, что ЛАК способны визировать КК о тон случае, когда секрет цитотоксических гранул не освобовдается, но причины этого явления не получили, на наа взгляд, удовлетворительного объяснения. Поэтому им. в свои очередь, поставили эксперимент, чтобы подтвердить или опровергнуть эти результаты. Для этого мы исследовали цитотокснческую активность ЛАК в отношении КИ К-562 л Ь-929 в течение 8 сут в присутствии ЕЭТА в инкубационной среде. Таким образом, весь Са, присутствовавший в инкубационной среде, бил связан, что делало невозмокнмы секрецив гранул (1ЛК.

Как видно из рис.4. в течение первых 5 сут присутствие ЕБ'ГА в инкубационной среде лшаь незначительно снизало цитогокснческуи активность ЛЛК в отноиении К-562 - 80/! -вертвих клеток в присутствии Са и 70'/. в случае связанного Са. :После 5 сут картина менялась: Е6ТА сниаал циготоксическус

активность ЛАК до 182 по сравнении с ?07. мертвых клеток при наличии Са в среде. Цитотоксичность ЛАК в отковении L-929 в случае связанного Са характеризовалась кривой подобного профиля.

Осйовываясь на этих данных, иовно лредполовить. ' что на ранних стадиях активации ЛАК И/1-2 зффекгорные клетки ногут осуществлять цитогоксическую функцию преимущественно без участия механизма секреции гранул, а на более поздней стадии лизис КИ опосредован в основном цитотоксичесиини факторами, присутствувщими в гранулах ЛАК.

Таким образои, нави результаты токе подтверядают возаоаность Са-независимого лизиса КМ посредством ЛПК. Каким не образом происходит в этой случае гибель КН? Ми предполоашш, что Са-независимнй механизм киллинга опухолевых КН связан с экспрессией иа мембранв ЛйН цитотоксических молекул. Чтобы проверить эту гипотезу, ш получили фракция мембран ЛАК и" определяли их цйтотоксичоскуп активность в отношении К-562 и L-929. Фракшш иеиврая получали на 3 и б сут инкубации ЛАК с 11Л-2. так как наибольвая цнтотоксическая активность ЛАК проявлялась именно в это время:

Как видно из рис.5, меибрзны ЛАК проявляют цитотоксическуп активность в отновении К-562. В процессе инкубации нембран с К-562 их цитотоксичность росла, достигая максимума через 4 часа. Но если максимальная цитотоксичность кеибран 3 сут составляла 307. мертвых клеток, то для мембран 6 сут вто значение в 1,5 раза hhis - 20%. Такин образои. иенбрани ЯЙК

действительно обладапт цитотоксичностьв в отновении K-S62, но активность мембран 3 сут заметно вапе.

Мембрана ЛАК обладали цитотоксачностьа й а откозенич 1-929. причем иембрани ЛАК 3 сут тове оказались D 1,3 раза активнее мембран ЛАК В сут. Надо отметить, что K-5D2 оказались более чувствительными кивенями для неибрзн ilfiK, чей 1-929 (через 4 часа инкубации количество нертвих клеток К-562 составляло 30Z, a L-929 - 20/0.

На рнс.б представлена шотоксичоскад активность мембран 3 и 6 сут в отновении K-S32 в зависимости от концентрации менбранного белка, te видно из графика, для выхода кривой цитатоксичности кекбран 3 cat на йлаго требуется концентрация мембранного белка 32 йкг/мл, а для достизения

Рис.5.Зависимость цитотоксической активности мембранной Фракции

ПЙК-клеток человека в отноиенни КИ К-562 от времени инкубации мембран с КМ (концентрация мембранных белков - 32 ыкг):

1-Ш-клетки после 3 сут стимуляции И/1-2

2-ЛЙК-клетки после 0 сут стимуляции ИЛ-2 40 ~~~

ё Ш ■

о

о га

го §

20

"вГ

■Ж

"згТ 641

КОНЦЕНТРАЦИЯ (мкг/мд)

Рис.6.Зависимость цитотоксической активности мембранной фракции ЛАК-клеток человека в отношении КМ К-562 от концентрации мембранных белков через 2 часа инкубации КМ с мембранами

1-ЛАК-клегкн после 3 сут стимуляции ИЛ-2

2-ЛАК-клетки после" 6 сут стимуляции ИЛ-2

подобного цитотоксического эффекта мембранани 6 сут концентрацию мембранного белка надо увеличить а 2 раза. Цитотоксическая активность мембран ЛАК в отношении L-929 оставалась низкой даае при увеличении концентрации мембранных белков до 150 мкг/мл: - 16Z мертвых клеток при инкубации с мембранами ЛАК 3 сут и 77. - с мембранами ЛРК 8 сут.

Полученные данные о цитотоксической активности мембран ЛАК 3 и 6 сут позволили предположить, что, по-видимому, после 5 сут снижается экспрессия цитотоксических мембранных белков.

Электрофорез препарата мембраннных белков с последующим определением их цитотоксической активности показал, что на 3 сут цитотоксическая активность мембран ЛАК связана с белками, имеющими м.м. 20-22, 30-35 и 38-48 кДа, а на 6 сут - с белками, имеющими м.м. 20-22 и 35-39 кДа, т.е. в зависимости от срока стимуляции И/1-2 зкспрессируются различные мембранные цитотоксические белки.

Итак, наряду с Са-зависимым секреторным механизмом существует другой механизм цитотоксического действия ЛАК на КМ - мембранный. Возможно, действием мембранного цитотоксического белка определяется высокая цитотоксическая активность ЛАК на ранних этапах стимуляции ИЛ-2. При длительном культивировании ЛАК большее значение в цитолизе приобретает секреторный механизм, что может бить связано с уменьшением экспрессии цитотоксического мембранного белка. K-5S2 являются более чувствительными КМ для ЛАК, чем L-929. Больиая чувствительность К—562 по сравнению с L-929 обусловлена, по-видимому, большей чувствительностью К—562 н действие цитотоксического мембранного белка.

3. Определение цитотоксических белков, опосредующих цитотоксическуи активность супернатанта ЛАК-клеток.

Полученные нами результаты о цитотоксической активности СН ЛАК поставили вопрос о природе цитотоксических белков, секретируемых ЛАК. Для ответа на этот вопрос СН ЛАК человека подвергли хроматографическому разделении на ионообменной колонке и после разделения полученные белковые фракции тестировали на наличие цитотоксической активности в отношении опухолевых КМ. Так как лизис К-562 - зто сложный

Са-зависикый процесс, требуиаий участий других белков-активаторов, для тестирования Фракций использовали *L-929. Оказалось, что цитотоксичность» обладали две Фракции белков -tti и »2, отличающиеся по своей способности сорбироваться на колонке (рис.?). Фракция tl не взаимодействовала с сорбентом, а Фракция «2 связывалась и элюировалась с колонки 0,05 И НаС]. Фракционирование СИ ЛАК нншей на хроматографической колонке в условиях, аналогичных использованным при хроматографии СН JlfiK человека, и тестирование полученных белковых фракций на L-929 показало,, чтот цитотоксичность СН ЛАК нывей обусловлена теми se белкаии. что и цитотоксичность СН ЛАК человека - цитотоксическиыи оказались белки фракций «1 и «2. Таким образом, mojho говорить о присутствии в СИ ЛАК, по крайней мере, двух различных цитотоксических белков, вызываицих лизис L-929,

Поскольку зависимость цитотоксической

активности ЛАК и их СН от времени стимуляции ИЛ-2 имеет два максимума, возник вопрос: а как они соотносятся с секрецией тех или иных цитотоксических белков. Для разревения этого вопроса мы проводили в идентичннх условиях хроматографическое разделение СН ЛйК человека, полученных на 1-8 сут инкубации с ИЛ-2 с последувчим определением цитотоксической активности Фракций *1 и »3. На рис,8 показана динамика цитотоксической активности фракций «1 и «2 в зависимости от времени инкубации ЛАК с ИЛ-2. Оказалось, что цитотоксическая активность Фракций «1 и «2 проявлялась в различные периоды стимуляции ЛйК ИЛ-2 -наибольшая цитотоксическая активность белков фракции «1 проявлялась на 6-7 сут инкубации с ИЛ-2. а белков фракции т на 2-3 сут, что коррелирует с проявлением цитотоксической активности суммарных белков, секретируеыых ЛЙК на протявении 8 сут инкубации с ИЛ-2. Другими словами, за цитотоксичность ЛйК на ранних стадиях инкубации с ИЛ-2 ответственны белки Фракции #2. а найсяее поздних - белки фракции «1. Обобщив этот вывод с данными по изменении Фенотипа ЛАК человека, mosho сказать, что на ранних стадиях развития ЛйК их цитотоксичность обусловлена ЕКК, секретирриими белки Фракции «2. а на более поздних стадиях - ЦТ Л, свйретярртими белки фракции «1.

Изучение динамики цитотоксической активности белков фракций »1 и »2 в зависимости от срока инкубации ЛйК нывей с ИЛ-2 тове показало, что с 1 по 5 и с 5 по 7 сут'секретируатся

Л(280) 0.05

0.026

90(мл)

Рис.7.Хромагографичеокое разделение еупернатанта JIAK-клетак человека с"последующим определением шитогоксической активности белковых фракций

1-цитотоксическая активность в отношении КМ L-929

2-А 280

3-концентрация MaCI

s

о

CQ

100

75

50

25

О

(сут)

Рис.8.Изменение цитотоксической активности белкових фракций #1 и !?2 в 'Зависимости от времени стимуляции ЛАК-клеток Ш-2 <КМ- 1-92Э)

1-цитотохсическая активность Фракции №1

2-цитотоксическая активность фракции ¥2

.различные белки: в течение первых 4 сут за лизис КМ ответственны белки фракции й2, на 5 сут секреция' белков Фракции «2 прекращается и, начиная с 5 сут, наблюдается секреция белков фракции «1. Для подтверждения сделанного нами ранее вывода для ЛПК человека о том, что белки Фракции с] секретирувтся ЦТЛ, а белки Фракции »2 - ЕКК. для ЛАК мышей мы использовали другой методический подход в связи с отсутствием мкАТ к поверхностным маркерам лимфоцитов мышей. Ны провели Фракционирование на хроматографической колонке СН типичных ЕКК и типичных ЦТЛ с последующим тестированием цитотоксической активности полученных белковых фракций. , Хроматографическое разделение СН ЕКК и ЦТЛ показало, что белки, ответственные за цитотоксическув активность ЕКК. связываются с сорбентом и элвируются с колонки при той ке молярности НаС1. что и фракция «2 цитотоксических белков ЛАК. Основная масса цитотоксических белков СН ЦТЛ не связывается с ионообменником аналогично Фракции «I СН ЛАК. Таким образом, цитотоксические белки ЛАК мыюей (Фракции <1 и »2) по хроматографическим свойствам не отличатся от цитотоксических белков типичных ЕКК и ЦТЛ.

Для определения молекулярных масс цитотоксических белков СН ЛАК был проведен электрофорез в ПййГ Фракций «1 и я2 с электропереносом на мембрану 1«шоЫ1оп и последующим определение* активности элюированных белков. Мы установили, что Фракция «I представлена белком с м.м. 30 кДа после восстановления (рис.9), фракция »2 - белками с м.м. 22-25, 38-40 и 70-80 кДа после восстановления (рис.10).

Таким образом, СН ЛЙК человека и мыией содеряит две Фракции цитотоксических белков, отличаюцихся по своим хроматографическим свойствам. Цитотоксический эффект ' этих белков четко проявляется в отноиении Ь-929. Белки Фракции »2 секретирувтся на ранних стадиях развития ЛАК, когда популяция ЛАК представлена ЕКК: белки фракции «1 секретируются при более длительной инкубации ЛАК с ИП-2, когда популяция ЛАК представлена'преимувественно ЦТЛ. Н.м. белка фракции «1 -ЗОкДа; м.м. белков Фракции »2 - 22-25. 38-40 и 70-80 кйа.

Обобщив полученные данные, мояно построить гипотетическую модель лизиса КМ посредством ЛАК. На ранних стадиях стимуляции ИЛ-2 популяция ЛАК представлена в основном ЕКК. ЕКК характеризуются высокой экспрессией мембранного цитотоксического белка, и К-562 являются

601

94К

67 К -

I *

I

а к-Ш~

ЗОК-в»

5 2

э о о ч о в

10 &

Ч я о К

-15

20

& Я

ц о

3 30

£1

о

я

15

5 10 15

Номер полоски-

20

О

Рис.9.Электрофорез фракции «1 сцпернатанта ЛАК-клеток с последующим переносом белков на мембрану 1шшоЫ1оп и определением цитотоксической активности элвированных белков (стрелки дказмвают положение маркеров молекулярных масс).'

9АК

гО

20.Ж-

ил К»

I

а

ч о в

л »2 - о 15 «

20

А5-

л ы о о я

V

о К О

О

30

15-

10 15

Ноиер полоски

20

Рис.10.Электрофорез фракции я2 супернатанта ЛЙК-клеток с последующий переносом белков на мембрану 1вшоМ1оп и определением цитотоксической активности элпированных белков С стрелки указнвашт половение маркеров молекулярных масс).

высокочузствителышми мишенями для этого белка. Возиояно, что существующее деление КМ на ЕКК-чувствителыше и ЕКК-резистентные обусловлено различной чувствительностью разных К!.! именно к действию мембранного цитотокснческого белка, т.е. мембранный белок определяет специфичность ЕКК. L-929 считавтся ЕКК-резистентными КН. и активность цитотокснческого мембранного белка в отноеенни L-929 в 2 раза нике. Гранулярное циготоксические белки ЕКК (условно названные нами фракцией «2) эффективно лнзируит L-929: для проявления их цитотокснческого действия в отношении К—562 необходимо участие дополнительных факторов (например. ионов Са). Это г Факт нонет быть связан с отсутствием или низкой экспрессией рецепторов для цитотоксических белков на К—562. В процессе культивирования с Я/1-2 в популяции ЛАК начинают преобладать ЦТЛ. Удельный вес мембранного цитотокснческого белка в суммарной цитотоксичности ЦТЛ существенно мейьше. Для ЦТЛ характерен другой состав гранулярных цитотоксических белков (фракция я1). Цитотоксические белки ЦТЛ обладают несколько меньшей активностью в отноиеиии L-929. но суиественно эффективнее, чем белки ЕКК.лизирузт К-562, хотя и в этом случае необходимо участие дополнительных факторов (ионы Са). Таким образом, ЛПК лизирувт КН при участии двух механизмов -мембранного и секреторного, и вклад каждого из механизмов в цитолиз варьирует для разных КМ и зависит от стадии развития ЛАК.

4-. Получение перевиваемой куль тури ЛАК человека и изучение ее цитотоксичесиой активности.

Поскольку наличие удобной модели In vitro значительно облегчает задачи изучения механизма цитотоксичесиой активности ЛЙК, кы поставили перед собой цель получить перевиваемую культуру. ЛПК человека. Ранее нами было установлено, что цитотоксическая активность ЛПК достигала максимума на 5 сут и снижалась к 3 сут, поэтому для трансформации вирусом Эпштейна-Барр была выбрана трехсуточная ' культура как обладающая наибольшей активностью.

Полученная трансформированная линия ЛЙК била названа Ниаап Leukenia - 69 (HL-89). Эта культура

растет на пластике в форме монослоя на питательной среде ОМЕИ с 102 FBS в атмосфере, содерващей 57, С02. при 3? 'С. Клетки имеют характерную звездчатую форму, растут с низкой плотностью - 2*Ю*1 клеток на смг , плотность достигает максимума на 3-4 сут культивирования. Вреня удвоения числа клеток в культуре в логарифмической фазе роста составляет 12 часов. Культура перевивается в соотношении 1:5; выдервивает заморавивание в стандартных условиях (криопротектор - ДМСО), после размораживания сохраняет иитотоксическуп активность.

¡¡ля определения фенотипа клеток HL-89 была установлена их способность связываться с ыкАТ к антигенам CD3, CD8, CD16. Оказалось, что Ш-антиген экспрессируется на 47. клеток, CD8 - на 66,5?;. CD16 - на 63,т.е. фенотип клеток HL-89 ыовно охарактеризовать как CD3-CD8+CD16+. По литературным данным, подобный Фенотип характерен для ЕКК. Таким образом, моано сказать, что полученная нами перевиваемая культура имеет фенотип, присущий ЕКК.

Поскольку полученная культура представляет практический интерес для дальнейших исследований при условии сохранения ею цитотоксичности, далее было проверено, обладают ли клетки HL-89 цитотоксичностьп в отноиении KM K-S62 и L-929. Было установлено, что цитотоксическая активность HL-89 в отноиении К-562 достигала максимума через 4 часа инкубации с КМ (74У. мертвых клеток). В отношении L-929 цитотоксическая активность развивалась медленнее, достигая максимума через 24 часа с момента инкубации, но тоже имела высокое значение (5CZ).

Изучение цитотоксической активности СИ HL-89 в отноиении КМ показало, что лизис К-562 происходит только в присутствии 5тН Са. и количество мертвых клеток после 24 часов инкубации достигало 422, В отноиении L-929 СН HL-89 обладал более низкой активностью - 152 мертвых клеток через, 24 часа и 307, - через 48 часов, но КИ лизировались при физиологической концентрации Са в среде. Следовательно, культура HL-89 характеризуется такой яе. цитотоксической активностью в отноиении КН. как и исходные ЛЙК.

Электрофорез препарата Сй клеток линии Н1-89 показал присутствие цитотоксических белков, ранее обнаруженных в СН ЛАК человека и мыши.

Таким образом, нами была получена перевиваемая линия клеток человека, обладавших ЛПК-подобной актнвиостыо. Зта линия клеток зкспрессировала антигепние детерминанты, характерные для ЕКК, обладала высокой цитотоксичностьи в отношении КМ К-562 и 1.-929 и секретироваяа цнтотошгаские белки, ранее описанные как цнтотоксические факторы ЛАК-клеток.

Выводы.

1. ЛАК - это "гетерогенная популяция лимфоцитов; на ранних стадиях активации ИЛ-2 эффекторными клеткани, ответственными за лизис опухолевых КМ. являются ЕКН, а при более длительной культивировании с ИЛ-2 цитогоксичность ЛАК опосредована ЦТЛ.

2. ЛАК и их СИ обладают•цитотоксичностью в отношении КМ К-532 и 1-Э2Э. Цитотоксическая активность ЛАК и их СН зависит от времени стимуляции ЛАК ИЛ-2 и на протяяении 8 сут стимуляции характеризуется двумя максимумами - на 2-3 и 6-7 сут. К-562 являются более чувствительными

КН для мембранного цитотоксического белка, чем Ь-929.

3. СН ЛАК содернит две фракции цитотоксических белков, отличавшихся по своим хроматографическим свойствам. Фракция «1 содераит белок с м.н. 30 кДа после восстановления, фракция «2 - белки с ы.м. 22-25, 38-40 и 40-45 кДа после восстановления. Белки ■ фракции к1 секретируптся при длительной стимуляции ЛАК. ИЛ-2, т.е. присущи ЦТЛ, а белки фракции »2 секретируптся на ранней стадии развития ЛАК, т.е. характерны для ЕКК.

4. ЛАК осуществляют цитолитическув функцию не только путем.секреции гранулярных цитотоксических белков, но и при участии мембранного цитотоксического белка, Активность мембранного цитотоксического белка наиболее высока на ранних стадиях стимуляции ЛАК ИЛ-2. т.е присуща ЕКК. ' 1

5. Полученная нами перевиваемая культура 1И-89 ЛйК-клеток . человека экспрессировала антигенные детерминанты, характерные для ЕКК; обладала высокой цитотоксичностью в отношении КИ К-562 и 4 Ь-929 и секретировала цито.токсические белки, описанные нами как цитотоксические факторы ЛАК-клето«.

По материалам диссертации опубликованы следующие

работы:

1. Блнщенко Е.Ю.. Чертов О.Ю., Саценко Л.П., Гнучев Н.В., .Лукьянова Г.И.. Редченко И.В., Кабанова О.Д.,. Петрова М.Й.. Луканидин Е.И. - Цитотоксические белки лимфокин-активированных киллеров. - Тезисы Всесоюзного симпозиума по химии белка, Тбилиси, 1990. с.б,

2. Редченко И.В.. Саценко Л.П., Гнучев II.В., Лукьянова Т.Н.. Кабанова О.Д., Хайдуков С.В., Луканидин Е.Н. -Некоторые свойства перевиваемой линии клеток человека, обладающих активностью ЕКК. - Экспериментальная онкология, 1991, т.13, N4. с.35-39/ - '

3. Sashchenko L.P.. Enuchev H.U., Lukianova T.I., Kabanova O.D., Redchenko I.U., Blishchenko E.U.. Chertow O.U., Lukanidln E.H. - fl novel funcnion of fetuin, - 8th Conference of young scientists on organic and bioorganic chemistry. Riga, 1991, p.12.

'4. Саценко Л.П,, Гнучев H.B.. Кабанова О.Д.. Лукьянова Т.Н.. Редченко И.В., Савцова 3,Д,, Блнщенко Е.8., Чертов 0,Ю., Луканидин EJ. - Функциональные изменения лиыфокин-активированннх лимфоцитов в зависимости от времени инкубации с ИЛ-2. - Доклада Рйй. 1992, т.ЯУ. № . с. в печати.

5. Саценко fi.il,. Гнучев Н.В\, Лукьянова Т.Н.. Кабанова О.Й.. Редченко И.В., Блиценко Е.В., Сатпаев Д.И,, Хайдуков С.В.; Чертов О.Й., Луканидин Е.Н. - Влияние ИЛ-2 на цитолитическуи активность, экспрессио поверхностных маркеров и секрецию цитотоксических белков Ш-клетками. -Экспериментальная онкология. 1992, т^^. Н5" , с.S'tSS, в печати.