Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Моноклональные антитела в противоопухолевых препаратах направленного действия

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Егорова, Светлана Григорьевна

Молекулярные, биохимические, генетические различия между нормальными и опухолевыми клетками, особенности метаболизма опухолевых тканей создают теоретические предпосылки для разработки методов направленной доставки лекарственных препаратов, радиоизотопов, фотосенсибилизаторов, цитотоксинов непосредственно в опухоль. Вектором в таких конъюгатах могут служить моноклональные антитела, а в качестве цитотоксического агента чаще всего используют растительные, бактериальные токсины и фотосенсибилизаторы.

Не все моноклональные антитела могут быть использованы как векторы в составе иммуноконъюгатод. Для этого они должны обладать высоким уровнем специфичности, аффинности, антиген, выявляемый ими, должен хорошо экспрессироваться на опухолевых клетках, а комплекс антигена с антителом интернализоваться в цитоплазму клетки.

Во многих случаях крайне трудно определить специфические маркеры на поверхности опухолевых клеток. (Абелев Г.И., 1962, Ten et al., 1985, Urban J.L., Shraiber, 1992). Поэтому в диагностике и иммунотерапии рака используют антигены, ассоциированные с различными опухолями. За последнее десятилетие изучено значительное количество таких антигенов. По происхождению, специфичности и характеру распределения » —------------------------------------антигены фичные) и „,с. : й в этом

КНИГА ИМЕЕТ к » 3 ор 5 ? * о В перспл. един, соедин. выл. S. я н- Н С* £ ■. ч ' S ■ о * at • * 1 5 > 1 cL ,е» С А ч " азивных и тью. Она £ al, 1985). грованных f <Ш? антигенов, что делает использование иммуноковьюгатов для терарии меланомы весьма перспективными.

Для синтеза иммунотоксинов наиболее часто используют растительные рибосом-инактивирующие белки П типа (РИБ П). По своему строению РИБ II представляют димерные А - В токсины, где А-субъединица является ферментативной и обуславливает остановку синтеза белка в клетке, а В-субъединица связывающей. К таким белкам относятся рицин, агглютинин рицина и вискумин, каталитические субъединицы которых являются специфическими N-гликозидазами, модифицирующими 28S РНК 60S субъединицы эукариотических рибосом. Одной молекулы А-субъединицы попавшей в цитопазму достаточно для гибели клетки. Именно поэтому РИБ П наиболее часто используют в составе иммунотоксинов для элиминации опухолевых клеток.

Лечение солидных опухолей различной локализации требует в каждом случае особых подходов. В 60-тые годы появились работы (Lipson et al, 1961, 1966), которые положили начало использованию фотосенсибшшзаторов, в частности порфиринов и их производных, в терапии рака. Тропность фотосенсибилизаторов к опухолям определяется длительной их задержкой в опухоли и болеее быстрым выведением из окружающей нормальной ткани. Эффективность фотодинамического повреждения биологической ткани зависит от уровня накопления фотосенсибилизатора, его локализации в клетке и фотохимической активности (квантовым выходом генерации синглетного кислорода при поглощении света определенной длины волны). В настоящее время разрабатываются новые сенсибилизаторы для фотодинамической терапии опухолей (Лукьянец, 1998; Миронов, 1998) . Однако, основной проблемой при лечении рака по-прежнему остается проблема токсичности используемых препаратов из-за применения высоких терапевтических доз. Их снижение может быть достигнуто при более точном попадании противоопухолевых препаратов в раковые клетки, в наиболее уязвимые ее компартменты. Поэтому подбор наиболее подходящих моноклональных антител, как транспортных средств, для точного попадания цитотоксических агентов в опухоль и создание на их основе эффективных препаратов направленного действия остается актуальной задачей.

Цели и задачи. Целью работы было получение моноклональных антител к антигенам различных солидных опухолей и создание на их основе эффективных иммунотерапевтическях препаратов направленного действия. Дня достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Получить моноклональные антитела к антигенам различных солидных опухолей

2. Изучить их специфичность и свойства выявляемых ими антигенов.

3. Синтезировать иммуноконьюгаты на основе полученных антител и других векторных молекул с различными цитотоксическими агентами.

4. Изучить специфичность и цитотоксическую активность иммуноконыогатов in vitro на модели перевиваемых клеточных культур. Определить возможности и способы усиления эффекгавносте действия созданных препаратов.

Научная новизна и практическая значимость работы. Получены оригинальные моноклональные антитела (МкАТ) к антигенам клеток рака молочной железы (РМЖ), аденокарциномы легкого и меланомы. Антиген ЕЗ (АГЕЗ), относится к ранее не изученным антигенам молочной железы. При трансформации эпителия молочной железы он сохраняется в инвазивном протоковом раке и отсутствует в других гистологических типах РМЖ, что позволяет использовать его для цитодифференцировки различных форм РМЖ и уточнения их классификации. Возможно он будет полезен для иммунодиагностики рака толстой кишки, так как АГЕЗ отсутствует в нормальных тканях этого органа, но обнаружен в эмбриональной толстой кишке и раках толстого кишечника.

Изученный нами антиген A2F4 является новым маркером аденокарциномы легкого. Он может быть использован в уточняющей иммуногистологической диагностике микромегасгазов и первичного очага, и особенно при цитодифференцировке различных гистологических типов рака легкого, что является важным прогностическим фактором (Франк Г. А. и др., 1992) . При комбинированном использовании МкАТ A2F4 с МкАТ к РЭА увеличивается процент выявления аденокарциномы легкого человека ( Пугачев К.К. и др., 1990 ). МкАТ A2F4 использовались в патоморфолошческом отделении МНИОИ им. П. А. Герцена для уточнения гистологического типа рака легкого, а в Центральном НИИ туберкулеза при дифференциальной диагностике туберкулеза и рака легкого.

Выявленный нами новый антигенный маркер на клетках аденокарциномы легкого может служить мишенью для элиминации этих клеток с помощью впервые синтезированных в России фотоиммунотоксинов. Фотоиммунотоксины на основе МкАТ A2F4 и карбоксильных порфиринов оказались в 100 раз активнее, чем свободные порфирины. Мы надеемся, что это позволит снизить терапевтическую дозу вводимых иммуноконьгатов и использовать их в дальнейшем в клинике.

В результате проведенных исследований получена также гибридома B3F7, продуцирующая моноклональные антитела IgGl изотипа, реагирующие с клеточными линиями меланомы кожи человека, с клетками меланомы, выделенными из операционного материала и не реагирующие с клетками крови. Показано, что МкАт B3F7 выявляют новую антигенную детерминанту, не описанную ранее в известной нам литературе. Более подробное изучение их специфичности возможно позволит использовать МкАТ B3F7 в диагностике и терапии этого новообразования.

Впервые получены конъюгаты МкАТ B3F7 с А-цепью растительного циготоксина рицина (PTA/B3F7) и с А-цепью агглютинина рицина (ArPTA/B3F7). В предложенной нами модельной системе, состоящей из клеток-мишеней и конъюгатов моноклональных антител и разных каталитических субъединиц показано, что PTA/B3F7 обладает более высокой циготоксичносгью, чем ArPTA/B3F7.

В рамках совместного Российско-Американского гранта (CRDF,. RN1-403) от профессора Солдано Ферроне были получены МкАТ к высокомолекулярному меланомо-ассоциированному антигену (HMW-MAA). Этот антиген экспрессируется почти на всех меланомах (90%), имеет ограниченное распространение в нормальных тканях ( Natali P.G., et. al, 1984 ) и в сыворотках больных присутствует в минимальных количествах (Giacomini P. et al, 1984 ). Данные свойства HMW-MAA привлекательны для использования его в клинической практике, а МкАТ к HMW-MAA являются перспективными векторными молекулами для доставки терапевтических агентов к опухоли. Полученные ранее иммунотоксины на основе анти- HMW-MAA антител (Spliter L.E. et al, 1987), обладали низкой эффективностью и вызывали различные побочные эффекты. Нами были синтезированы 4 новых иммунотоксина на основе предоставленных Солдано Ферроне МкАТ к HMW-MAA, (763.74 и 225.28) и А-цепей рицина и вискумина. Иммунотоксины на основе А-цепи вискумина оказались более специфичными и активными для элиминации клеток меланомы по сравнению с изученными нами ИТ на основе А-цепи рицина и агглютинина рицина (B3F7/ArRTA, B3F7/RTA, 763.74/RTA, 225.28/RTA). Эффективность действия этих ИТ усиливалась при обработке лизосомотрошшми агентами моненсином и гидрохлоридом аммония. Цитотоксическая активность ИТ 763.74/MLA находилась в области от 10"и М до Ю"10 М, что позволяет использовать его в клинике.

В результате проведенного этапа исследований в дальнейшем мы планируем приготовить рекомбинангные иммунотоксины, где векторной частью будут служить одноцепочечные антитела 763.74 к HMW-MAA, а цитотоксической - рекомбинантная цепь вискумина. Рекомбинангные ИТ, благодаря маленькому размеру молекулы, дегликозилированию и быстрому выведению из организма, уменьшают риск возникновения различных побочных эффектов при использовании их в клинике ( Pastan I., etal, 1995).

Результаты работы использовались в курсах лекций и практикумах для студентов биологического ф-та МГУ, вошли в главу «Гибридомная технология» книги «Практическая иммунология. Учебное пособие». Москва, 2000 г.

Апробация работы. В данной работе представлены результаты собственных исследований автора, выполненных в 1981-1999гт. в лаборатории экспериментальной терапии и диагностики опухолей МНИОИ им. ПАГерцена (зав. лаб. д.б.н. Г.И.Авдеев) и на кафедре клеточной физиологии и иммунологии биологического ф-та МГУ ( зав. каф. профессор М.ВГусев)

Материалы работы были доложены на Всесоюзных, Российских и международных съездах и симпозиумах: Всесоюзное совещание по культивированию клеток животного и человека ( Пущино, 1985 ), 3 и 4 Всесоюзные съезды онкологов (Ростов-на-Дону, 1985, Ленинград, 1986), 1 Всесоюзный съезд иммунологов ( Сочи, 1989 ), 18 конференция ISOBM ( Москва, 1990 ), 1 съезд иммунологов России (Новосибирск, 1992 ), 12 европейская конференция иммунологов ( Барселона, 1994), 9 международный конгресс иммунологов (Калифорния, 1995 ), 3 международный симпозиум ( Черновцы, 1995 ), европейский симпозиум по биотехнологии (Турция, 1995 ), 5 международная конференция по человеческим антителам и габридомам (Израиль, 1996 ), европейская научная конференция «Экзоцитоз» ( Франция, 1998 ), 3 научная конференция х международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 99» ( Санкт-Петербург, 1999 ).

Материалы и методы исследования. Для иммунизации и получения МкАТ в работе использовали мышей линии Balb/C из питомника «Столбовая». Слияние иммунных селезеночных лимфоцитов и миеломы P3-X63-.Ag8-653 проводили согласно методу (Davidson,Gerald,1977) с некоторыми модификациями (Егорова и др., 1989). Специфичность МкАТ изучали на срезах различных нормальных, фетальных и опухолевых тканях, фиксированных забуференным формалином и заключенных в парафин. Для этой цели использовали постоянные, перевиваемые клеточные линии, любезно предоставленные: ВАМатвеевой (ВОНЦ РАМН), Е.А. Тимофеевской (МНЙОИ им. П.А.Герцена), А,Ф.Киркиным (Датское онкологическое общество), д-ром Бартеком (Институт клинической и экспериментальной онкологии, г. Брно), лабораторией клеточных культур Института вирусологии им. Д.И.Ивановского и Солдано Ферроне (Нью-Йоркский медицинский колледж). Клетки меланомы выделяли также из операционного материала, предоставленного отделением общей онкологии ГКБ N40 (зав.отд. д.б.н. И.Л.Могилевский) методом ферментативной деградации (Егорова и др., 1983).

Исследование экспрессии антигенов, их физико-химических свойств проводили с помощью иммунодиффузионого, иммунофлуоресцентного, иммуноферментного анализа, иммуноцитофлуорометрии, электрофореза и иммуноблотинга. В работе использовали также ионнообменную хроматографию и гельфильтрацию препаратов антигенов, антител, токсинов и порфиринов.

2,4-di(a-dimethoxyethyl)deuteroporphyrin IX (DMDP), coprophorfirin I (CP) и tetra(p-suiphophenil)porphirin (TPPS) были синтезированы в Инстшуте биофизики МЗ России. Конъюгаты порфиринов с МкАТ A2F4 были получены карбодиимидным методом (Савицкий и др., 1989). Хроматографическая очистка реакционной смеси от несвязавщегося порфирина была проведена на колонке PD-10 (Pharmacia, Sweden). Концентрацию конъюгатов определяли по методу Савицкого и др., 1989. Абсорбционные спектры порфиринов и их конъюгатов были изучены на спектрофотометре Hitacbi-557 с длиной волны 650-240 nm. Измерение квантового выхода фотогенерации синглетного кислорода, основаного на детекции люминисценции синглетного кислорода, определяли по методу Красновского и др., 1988. Фотодинамическое действие порфиринов и их конъюгатов с антителами определяли по окраске клеток трипановым синим.

Иммунотоксины на основе МкАТ и растительных токсинов получали с помощью бифунционального реагента СПДП(Ы-сукцинимидил-3 (2 шридилдитио) пропионатом). Конъюгат отделяли от непрореагировавпшх молекул антител и А-субъединиц токсинов с помощью гель-фильтрации на колонке Spherogel TSK 3000SW в системе HPLC. Иммунологическая активность антител и конъюгатов контролировалась в твердофазном иммуноферментном тесте (Engvall,1980). Цитотоксическое действие иммунотоксинов определяли по выживаемости клеток, используя МТТ-метод (Mosmann,1983). Для сравнения активности иммунотоксинов определяли их концентрацию, вызывающую гибель 50% клеток (ЛД50). Использованные в работе среды, сыворотки и реактивы были получены от фирм Sigma, Gibco, Calbiochem (США), Serva (Германия), Pharmacia (Швеция), Toyo-Soda (Япония), Reanal (Венгрия).

Более подробные характеристики объектов и методов исследования даны в статьях, приведенных в списке литературы.

Результаты исследования и их обсуждение Моноклональные антитела к клеткам рака молочной железы. Из 15 гибридом, полученных при иммунизации мышей Balb/C живыми клетками РМЖ была отобрана гибридома ЕЗ, стабильно продуцирующая МкАТ класса IgG. Для определения специфичности антигена, выявляемого МкАТ ЕЗ, было изучено 20 различных нормальных органов и тканей, 23 препарата РМЖ различной гистологии, 10 метастазов РМЖ в региональных лимфоузлах и яичниках и некоторые другие опухоли . Установлено, что АГЕЗ содержится главным образом в нормальной молочной железе и ее дисплазиях, встречается в пшцеводе, кардиаяьной части желудка, слюнной железе, эмбриональной толстой кишке и меконии толстой кишки. (Таблица 1).

В РМЖ он сохраняется только при инвазивном протоковом раке и его метастазах. АГЕЗ появляется также в опухолях толстой кишки и яичниках. Он не обнаружен в 15 из 20 изученных нормальных органов, фиброаденоме молочной железы и в некоторых опухолях неэпителиального происхождения: меланоме, лимфогранулематозе, лейкозе К-562. (Таблица 2).

Табл. 1 Распределение АГ-ЕЗ в нормальных тканях

Ткань Число наблюдений (в скобках - положительные случаи) Интенсивность реакции

Молочная железа 5(5) +++

Пищевод 2(2) ++

Желудок 3(1) +

Слюнная железа Ю) +++

Другие ткани1 3(0)

Д исплазия молочной железы 11(8) +++

Фиброаденома молочной железы 2(0)

Гинекомастия 1(0)

Головной мозг, мозжечек, язык, миндалины, аппендикс, бронхи, легкое, печень, поджелудочная железа, яичник, матка, простата, мочевой пузырь, селезенка, лимфоузлы.

Табл.2 Распределение АГ-ЕЗ в опухолевых тканях

Ткань Число наблюдений (в скобках - положительные случаи) Интенсивность реакции

Молочная железа: 23(7) ++ а) инвазивный протоковый 15(7) ++ б) инвазивный дольковый 5(0) в) медуллярный, тубулярный, персгневидноклегочный 3(0)

Толстая кишка 6(3) от + до ++

Яичник 2(2) ++

Легкое 4(0)

Щитовидная железа 2(0)

Желудок 1(0)

Меланома 2(0)

Лимфогрануломатоз 2(0)

Лимфосаркома 1(0)

В нормальной молочной железе и ее дисплазиях АГЕЗ локализуется в апикальной части эпителия, выстилающего ацинусы и протоки (рис. 1). В пищеводе он выявляется в цитоплазме эпителия желез подслизисгого слоя, в желудке - также в цитоплазме эпителия желез кардиальной части, а в подчелюстной слюнной железе - по апикальному краю эпителия отдельных ацинусов. АГЕЗ присутствует также в отдельных эпителиальных клетках крипт толстой кишки и меконии зародышей человека 16-28 недель (рис. 2). При малигнизации АГЕЗ сохраняется в ивазивном протоковом РМЖ, в основном в цитоплазме опухолевых клеток внутрипротоковых структур. В участках инвазиввдго роста окрашиваются единичные, крупные, полиморфные, имеющие светлую цитоплазму клетки (рис. 3 )

1 « r ,«J >4 KM

Рис. 1. Срезы нормально» молочном >К1'Ле:)Ы п молочной железы с днс-нлазией, инкубированные с моноклинальными антителами ПЗ а — нм.чунофлуоресцен-цня, 6 — иммуминерок-еидазнаа реакция. Увел.

Рис. 2. Срез эмбриональной толстой кшлкп, им-мунофлуорсснсшшя Увел.

V 'Л шж

Рис. 3. Срез пнвазивного протокового рака момппой железы а—нммунофлуоресценция, б—иммунопероксидазная реакция. У пел.

4 . J

Рис. 4. Клетки постоянной линии РМЖ MCF-7. Иммуиолероксндазиая реакция.

Увел.

Рис. 5. Срез адеиокаршшомы толстой кишки. Иммуиофлуоресцсиция. Увел.

Участки скирра, солидно-альвеолярные и тубулярные структуры негативны. Интересно, что АГЕЗ не был обнаружен ни в препаратах долькового рака, ни в предсуществующих структурах. Возможно это свидетельствует о том, что дольковый и инвазивный протоковый раки имеют разное происхождение.

В метастазах в региональные лимфоузлы и в яичники сохраняется тот же характер окрашивания, что и в первичных опухолях. АГЕЗ обнаруживается в цитоплазме клеток культуральной линии MCF-7, которая получена из плеврального выпота инвазивного протокового РМЖ (рис.4). В опухолях толстой кишки (рис.5) и яичника антиген локализовался по апикальному краю эпителия, обращенному в просвет железистоподобных структур.

Для сравнения АГЕЗ с уже известными антигенами РМЖ определяли молекулярную массу этого антигена. В предварительных опытах методом иммунофиксации на нитроцеллюлезе испытывали различные антигенные фракции: водно-солевые и полученные обработкой 1% SDS при 90°С в течение 10 мин. Источником антигена служили срезы замороженной молочной железы, РМЖ, клетки MCF-7 и меконий толстой кишки плода. В меконии плода антиген обнаруживался в значительном количестве. Оказалось, что его антигенная детерминанта термолабильна и инакгавируется при температуре выше 60°С. Поэтому перед постановкой иммуноблотинга антиген обрабатывали 1% SDS при 30°С в течение 1 часа. МкАТ ЕЗ в иммуяоблотинге мекония, хранившегося при -20°С проявили три полосы, которые соответствовали 175,160 и 140 kD (рис.6). Наличие трех полос может свидетельствовать либо о микрогетерогенности антигена, либо о расщеплении протеолитическими ферментами. Второе предположение более вероятно, так как в кишечнике содержатся эндогенные и экзогенные протеазы. В последующем был взят свежий меконий и добавлен ингибитор протеаз диизопропил-флюорофосфат (ДФФ). В этом случае МкАТ ЕЗ проявили одну полосу на входе в 5%-ный концентрирующий гель. В 5%-ный гель могут входить и застревать белки с мол. массой более 2*106 Д. Это было подтверждено гельфильтрацией мекония на сефарозе 4В, где антиген был обнаружен в свободном объеме.

Мрх 10'3 Ej МЕН '

Рис. 6. SDS-электрофорез маркерных белков («Sigma», США) {1, 4), экстракта мекопия без ДФФ (3) и в присутствии ДФФ (6) Окраска Кумасси 0,025%. Иммуноблоттинг АГ-ЕЗ в мекоиии без ДФФ (а) и в присутствии ДФФ (б). Каждая проба (40 мл) содержит 200 мг белка. Все пробы (2, 3, 5, 6} нагревались в 1% SDS буфере 1 ч при ЗГ

По характеру распределения в нормальных и опухолевых тканях, а также по мол. массе АГЕЗ не идентичен EMA (epithelium membrain antigen, Heyderman et.al.,1979), SEMA-70 (secretory epithelium membrain antigen, Imam,Tokes, 1982), MTGP (mammory tumor glycoprotein, Sunblad.Edington, 1983), TAG-72 (tumor- associated glycoprotein, Thor et.al., 1986)/. Он не является раковоэмбриональным антигеном, лакгоферрином, АО и АГ4 (Авдеев и др., 1983).

Таким образом, АГЕЗ относится к неизученным ранее антигенам молочной железы, а также некоторых типов железистого эпителия пищевода, желудка, слюнной железы и эмбриональной толстой кишки. При трансформации он сохраняется только в инвазивном протоковом раке. Его нет в инвазивном дольковом раке, медуллярном, перстневидноклеточном и тубулярном раке. Более тщательное изучение распределения АГЕЗ в различных гистологических структурах РМЖ может помочь в анализе цитодифференцировки различных форм РМЖ и уточнения их кассификации. Это очень важно, так как гистология опухоли является одним из факторов прогноза при РМЖ . (Франк, Волченко, 1985).

Моноклональные антитела к клеткам аденокарциномы легкого.

Моноклональные антитела к клеткам аденокарциномы легкого человека (АКЛ) были получены трехкратной иммунизацией мышей Balb/C клетками постоянной культуральной линии АКЛ. В результате гибридизации с миеломой P3-X63-Ag8-653, было получено 103 гибридомы, 9 из которых в реакции иммунофлуоресценции реагировали с АКЛ. 5 гибридом (A2F4, А5С8, В1В5, В6С2, Н5С7) трижды клонировали и более подробно изучали их специфичность непрямой иммунопероксидазной реакцией на депарафинизировавых срезах различных нормальных, фегальных и опухолевых тканях. При иммуногистологическом изучении пята МкАТ было показано, что ни одно из них не является специфическим для опухолей легкого, поскольку все они реагировали с довольно широким кругом нормальных тканей и опухолей различной локализации.

МкАТ A2F4 более избирательно реагировали с аденокарциномой легкого. Распределение по псаням и локализация антигена A2F4 (AT A2F4) были изучены более подробно. Методом непрямой иммунопероксидазной реакции были исследованы 62 образца нормальных человеческих тканей и 173 случая различных злокачественных опухолей.

Результаты, характеризующие распределение AT A2F4 в различных нормальных тканях и опухолях представлены в Таблице 3.

Табл. 3 . Распределение антигена A2F4 в различных нормальных тканях и опухолях.

Органы Нормальные ткани Опухоли

Общее кол-во Кол-во поло- Общее кол-во Кол-во полообследованных жительных реакций обследованных жительных реакций

ЛЕГКОЕ 11 5 55 10*

МОЛОЧНАЯ ЖЕЛЕЗА 12 6 59 21**

ЖЕЛУДОК

КИШКА

МАТКА

ДРУГИЕ ОРГАНЫ*** 2-3 0 -

САРКОМЫ - - "

ЛИМФОМЫ -

Метастазы аденокарциномы легкого в лимфоузлы ** Метастазы рака молочной железы в лимфоузлы Слюнная и щитовидная железы, почка, яичник, печень, сосуды, сердце, мышцы

Было показано, что исследуемый антиген экспрессируется в тканях нормального легкого, желудка и молочной железы. Он локализуется исключительно в клетках железистого эпителия, выстилающего трахеи, бронхи, бронхиальные железы легкого, ацинусы и протоки молочной железы, железы желудка во всех его отделах. Клеточная локализация антигена наблюдалась преимущественно на мембране апикальной части клеток и в незначительной степени в цитоплазме,

В окружающих неэпигелиальных тканях антиген отсутствовал. В нормальных тканях других органов (кишки, почки, матки, слюнных желез и др.) ашиген не был обнаружен. При иммуногистологическом изучении опухолей антиген A2F4 был обнаружен в 60% случаев рака молочной железы, 53% случаев аденокарциномы легкого и 30% случаев рака желудка. Кроме того антиген выявлялся при раке толстой кишки и в некоторых образцах рака шейки матки.

Таким образом, антиген A2F4 может быть охарактеризован как тканеспецифический маркер железистого эпителия легкого, желудка и молочной железы, который сохраняется в злокачественных новообразованиях этих органов.

При изучении экспрессии антигена A2F4 на клетках различных линий и клетках, выделенных из операционного материала методом непрямой ммунофлуоресцентной реакции, было показано, что антиген A2F4 не экспрессируегся на клетках 1фови (эритроцитах, лимфоцитах, нейтрофилах, гранулоцитах и гистиоцитах), а также на клетках лимфобластоидноЁ линии DAUDI. Антиген не был обнаружен также на клетках опухолевых линий рака гортани НЕР-2, рака шейки матки HELA, меланомы кожи MEWO, FM55.

Более подробно было изучено распределение антигена в опухолях легкого различного гистогенеза. Было установлено, что антиген экспрессируегся преимущественно в железистом (аденокарцинома) и железисто-плоскоклеточном (диморфном) раке легкого, в то время как в мелкоклеточном и плоскоклеточном типах антиген не обнаружен. При изучении опухолевых клеток легкого различного гистогенеза, выделенных из операционного материала, антиген был также выявлен только на клетках высокодифференцированной аденокарциномы легкого (Таблица 4, S). Табл. 4 Распределение антигена A2F4 в опухолях различного гистологического типа.

Тип опухоли Количество Количество исследованных антигенпозитиных больных опухолей

Аденокарцинома

Железясго-плоскоклеточный рак

Плоскоклеточный рак

Мелкоклеточный рак

Крупноклеточный рак

Недифференцированный рак

Карциноид

При иммуношстологическом изучении метастазов опухолей легкого и молочной железы было показано, что антиген сохраняется во всех случаях метастазирования первичных очагов опухолей, экспрессирукицих этот маркер (Табл. 3). Т.е. он может быть полезен для уточняющей иммунодиагностики микрометастазов рака молочной железы и аденокарциномы легкого, при цитодифференцировке различных гистологических типов легкого, что является важным прогностическим фактором (Франк Г.А. и др., 1992). При комбинированном использовании МкАТ A2F4 с МкАТ к РЭА увеличивается процент выявления аденокарцином легкого человека (Пугачев К.К. и др., 1990).

Табл. .5 Распределение антигена A2F4 на поверхности клеток рака легкого различного гистогенеза.*

Диагноз Количество Количество исследованных положительных больных реакций

Параганглиома

Плоскоклеточный рак II

Плоскоклеточный ороговевающий

Мелкоклеточный

Высокодифференцированный карциноид

Железисто-плоскоклеточный

Высокодифференцированная аденохарцинома

Суспензии клеток были получены из операционного материала.

Большой интерес представляет обнаружение антигена в некоторых случаях рака толстой кишки, так как в нормальных тканях этого органа данный маркер не обнаружен, т.е. имеет место его эктопическая экспрессия.

Заслуживает внимания и тот факт, что антиген сохраняет активность при стандартной фиксации тканевых срезов формалином и заключением их в парафин. Следовательно он может быть использован в патоморфологаческих лабораториях онкологических больниц и клиник.

Определение молекулярной массы антигена A2F4. Методом точечного иммуноблотинга было показано, что антиген A2F4 экстрагируется из клеток AKJI и фетального легкого детергентом Nonidet-P40. Эти экстракты были использованы в дальнейшем для определения молекулярной массы антигена методом электрофореза в градиенте ПААГ в нативных условиях с последующим иммуноблотингом. В иммуноблотах была выявлена специфически окрашенная полоса общая для экстрактов с мол. массой примерно 400 kD (рисунок 7). Для уточнения результатов, а также в целях получения очищенного антигена была проведена гель-хроматография экстракта фетального легкого. Была получена электрофорегачески чистая хроматографическая фракция, содержащая антиген A2F4 . Молекулярная масса антигена, определенная по калибровочному графику, составила 370 Ша. В целях более подробной характеристики антигена был проведен электрофорез очищенной фракции в денатурирующих условиях по методу Лэммли и последующий иммуноблотинг. При электрофорезе образца в

Рисунок 7. Электрофорез в градиенте ПААГ и иммуноблоттинг экстрактов фатального легкого и клеток аденокарциномы легкого (в нативных условиях)

12 з *

Электрофорез: 1-маркеры (ферритин - 440 kDa, каталаза - 240 Ша, амилаза -200 kDa, БСА - 66 kDa); 2- экстракт фегального легкого; 4- экстракт аденокарциномы легкого

Иммуноблоттинг: 3- экстракт фегального легкого; 5- экстракт аденокарциномы легкого присутствии додецилсульфата натрия и меркаптоэтанола, восстанавливающего дисульфидные связи, была выявлена одна полоса в области 70 kDa. В иммуноблоте дельного экстракта АКЛ и очищенного антигена специфическая окраска наблюдалась в области 80 kDa (рисунок 8).

Полученные данные позволяют предполагать о сложном строении антигена A2F4. В нативных условиях он, по-видимому, входит в состав высокомолекулярного комплекса массой около 400 kDa, состоящего из нескольких субъединиц. Субъединицы имеют массу 70 или 80 kDa, причем иммунологическую активность в денатурирующих условиях сохраняет субъединица массой 80 kDa.

Отсутствие этой субъединицы в ввде четко различимой полосы на электрофореграммах объясняется, по-видимому, тем, что она является минорным компонентом комплекса и чувствительность метода окраски Кумасси недостаточна для идентификации этой субъединицы.

Физико-химические свойства антигена. Антиген A2F4 является термолабильным, так как прогревание его при 90-100°С в течение 5-10 мин. полностью инакгавируег специфические детерминанты. Инактивация антигена наблюдалась также при обработке его додецилсульфатом натрия в концентрации 0.5% и выше, а также протеолитическими ферментами проназой, пепсином и трипсином. В то же время инкубация антигена с нейроминидазой, гиалуронидазой и периодатом натрия не оказывала существенного влияния на его активность. Эти данные позволяют сделать вывод, о белковой структуре специфической антигенной детерминанты и отсутствии углеводных компонентов в ее составе. Для ответа на вопрос входят ли углеводы в состав антигена, и является ли он гликопротеином, необходимы дополнительные исследования.

Большинство описанных в литературе антигенных маркеров опухолей легкого, молочной железы и желудочно-кишечного тракта отличаются от изученного антигена по своим физико-химическим характеристикам и распределению в опухолях и нормальных тканях. Наиболее существенным отличием антигена A2F4 является его высокая тканевая и органная специфичность. По ряду физико-химических характеристик, таких как молекулярная масса, хроматографическая подвижность, склонность к агрегированию в растворах, изученный антиген имеет большое сходство с муцинами, которые также

Рисунок 8. Иммуноблоттинг антигена A2F .400 >

•66 •

1-иммуноблоттинг антигена в неденатурирующнх условиях (экстракт фегального легкого)

Иммуноблоттинг, проведенный после электрофореза в денатурирующих (с Ds-Na и меркаптоэтанолом) и частично денатурирующих (только с Ds-Na) условиях:

2-очшценный антиген(с Ds-Na и меркаптоэтанолом); 3- очищенный антиген(с Ds-Na); 4-экстракт клеток AKJI (с Ds-Na); 5- экстракт клеток AKJI (с Ds-Na и меркаптоэтанолом) являются маркерами железистого эпителия ( Kenemans Р., 1992, Вага J., 1993). Эти сложные молекулы, имеющие большое количество различных антигенных детерминант как белковой так и углеводной природы. Весьма вероятно, что антиген A2F4 также относится к классу муцинов. Однако изученная нами специфическая детерминанта антигена не имеет аналогов в известных нам литературных источниках.

АГБЗ и AT A2F4 являются высокомолекулярными маркерами железистого эпителия. Они имеют сходное распределение в нормальных и опухолевых тканях. МкАТ ЕЗ и МкАТ A2F4 возможно выявляют два эпитопа одного антигена, относящегося к классу муцинов. Однако это предположение требует более подробного исследования.

Приготовление коныогатов МкАТ A2F4 с порфиринами. Убедившись в относительной специфичности МкАТ A2F4 для аденокарциномы легкого мы решили приготовить на их основе конъюгаты с различными порфиринами и изучить их фотодинамическую активность на клетках AKJ1. Порфирины являются эффективными фотогенераторами синглетного кислорода (Blum and Grossweiner 1985, Krasnovskii 1979, Mailard et al 1980), который, как предполагают, является главным агентом в фотодеструкции биологических тканей (Foot 1982, Kessel 1984, Dougherty 1987). Благодаря способности порфиринов избирательно аккумулироваться в опухолевых тканях они были использованы для фотодинамической терапии некоторых опухолей (Dougherty et al 1978, 1984; Moan et al 1982; Kessel and Choi 1983; Dougherty 1987). Применение порфиринов в этих целях имело существенные ограничения. Во-первых, их накопление в опухолевых тканях лишь в 10 раз выше, чем в нормальных тканях (Dougherty et al 1978,1984) и, кроме того, они связываются с сывороточными белками (Moan et al 1985). Терапевтические девы порфиринов были высокими, что вело к побочным эффектам, таким как токсичность, фотодеструкция нормальных тканей и необходимость длительной реабилитации после лечения (Dougherty 1985; Spikes 1986). Новая концепция фотодинамической терапии основана на использовании конъюгатов подходящих фотосенсибелизаторов с моноклональными антителами к маркерам опухолей (Mew et al 1983,1985; Oseroffet al 1987). Такие фотоиммунотоксины соединяют в себе направленный транспорт и локализацию в опухоли. В нашей работе для конъгации с МкАТ A2F4 были использованы дериват гематопорфирина DMDP и копропорфирины CP и ССР. DMDP селективно локализуется в опухолевых тканях и используется в фотодинамической терапии (Пономарев и др. 1989). CP, который высокогидрофилен и отрицательно заряжен, не проникает через мембрану клетки и не локализуется в тканях (Kessel 1983). ССР не изучался в этом отношении, но он очень похож на СР. СРР имеет необычный абсорбционный спектр в видимой области, отличаясь от большинства нормальных порфиринов, тем, что он имеет первое абсорбционное связывание при 600-620 nm. Это свойство существенно для фототерапии in vivo, так как спеюр в районе 600-800 nm является оптимальным для этой цели (Dougherty 1987),

Фотостабильность сенсибелизаторов важный фактор в фототерапии. Среди карбоксильных порфиринов CP известен как относительно фотостабильный (Eales 1979). Дериваты гематопорфирина IX, в том числе DMDP, фотохимически нестабильны и быстро белеют при интенсивном свете (Grossweiner et al 1985). Фотостабильность ССР близка к СР. Тем не менее, все эти порфирины эффективно генерируют синглетный кислород.

Характеристика конъюгатов МкАТ A2F4 с порфиринами. При ковалентной сшивке порфиринов с антителами на одну молекулу иммуноглобулина вводили три- пять молекул порфиринов. После интенсивного диализа и повторной хроматографии коньюгаты не содержали свободных порфиринов. Конъюгация антител с порфиринами не уменьшала их иммунологической активности и способности связываться с клетками AKJI. Нативные антитела и коньюгаты имели одинаковые титры в иммуноферментном тесте. В опытах с фототоксическим десгвием на суспензию живых клеток AKJI в

Рисунок 9. Кинетика фоторазрушения клеток контроль " 6,5 мкМ

А— 32,5 мкМ -*-162,5 мкМ

-*- 812,5 мкМ отсутствии антител и фотодинамических агентов заметного уменьшения процента живых клеток не наблюдалось (рис.9, верхняя кривая). Нативные антитела не оказывали циготоксического или фототоксического действия на клетки АКЛ в концентрации ниже 150 мкг/мл (1.6 мМ). При более высоких концентрациях наблюдалась агглютинация клеток, что предотвращало изучение фототоксичности. Свободный DMDP был фототоксичен для клеток АКЛ в концентрации 4мкг/мл (6.5 шМ) и выше. Кинетическая кривая фотодеструкции опухолевых клеток показана на рис.9.

При концентрации DMDP свыше 100 мкг/мл после облучения красным светом все клетки убивались менее, чем за 30 мин. Коньюгыты DMDP с моноклональными антителами были фототоксичны при концентрации 5-100 мкг/мл (5-1 OOriM) (рис.10), соответственно при концентрации порфирина 10-310 пг/мл (15-500пМ). Цитотоксической действие свободных копропорфиринов и их конъюгатов с МкАТ A2F4 показаны на рис. 11.

Рисунок 10. Кинетика фоторазрушения клеток АКЛ различными концентрациями конъюгата A2F4/DMDP

0 10 20 30 40 50 Время облучения клеток

-5аМ •

-25пМ •

•ЮОвМ

Рисунок 11. Кинетика фоторазрушения клеток АКЛ копропорфиринами и их производными

0 10 20 30 40 50 Время облучения клеток

-CP 240 мкрМ -ССР 240 мкрМ -CP/A2F4 100 пМ CCP/AZF'1100 дМ

Свободные копропорфирины не обладали заметным фототоксическим действием на клетки АКЛ даже в концентрации 150 мкг/мл, в то время как их коньюгаты оказывали выраженное фототоксическое действие.

Таким образом, мы показали, что DMDP обладает выраженным фототоксическим действием на клетки АКЛ, в то время как CP и ССР даже в высоких концентрациях не разрушали эти клетки. Конъюгаты DMDP с МкАТ A2F4 оказывали такое же сильной фототоксическое действие как и свободный DMDP, но в концентрации в 100 раз меньшей. Конъюгаты МкАТ с CP и ССР оказывали сильное фототоксическое действие на клеиси АКЛ, в то время как свободные CP и ССР этим свойством не обладали. Очевидно, что фототоксическое действие коньюгатов обусловлено иммуннохимическим взаимодействием с опухолевым антигеном, локализованном на клеточной мембране. Это взаимодействие приближает фото сенсибилизатор на расстояние диаметра молекулы антитела (35А; Frimel and Brock 1986) и увеличивает возможность повреждения мишени активным синглетным кислородом. Для коньюгатов CP и ССР с МкАТ A2F4 высокая эффективность фотогенерации синглетного кислорода коррелирует с их высокой фототоксичностью.

Должно быть отмечено, что механизм фототоксического действия свободных порфиринов и их коньюгатов могут отличаться. Для того чтобы убить клетку свободным фотосенсибилизаторам необходимо взаимодействие с клеточной мембраной и проникновение в цитоплазму или клеточные органеллы, такие как митохондрии (Kessel 1986). Для иммунофототоксинов главная мишень возможно клеточная мембрана.

Моноклональные антитела к клеткам меланомы. Моноклональные антитела к клеткам меланомы были получены в результате трехкратной иммунизации мышей Balb/C клетками постоянных культуральных линий меланомы BRO, MEWO и опухолевыми клетками, выделенными из операционного материала. После скрининга и клонирования был отобран клон B3F7, стабильно продуцирующий МкАТ изотипа IgGl. Антитела B3F7 в непрямой иммунофлуоресцентной и иммунопероксидазной реакциях положительно реагировали с меланомными клеточными линиями MeWo, Bro, Ms, FM55m, FM55p, FM2, с клетками меланомы, выделенными из операционного материала, со срезами пигментной и метастазирующей меланомы. С нормальными тканями плода и взрослого человека, с лимфоцитами перефирической крови реакция не наблюдалась. Антиген, узнаваемый антителами B3F7, имел мембранную локализацию (рис.12), не обнаружен на человеческой плазмоцигоме U266, Т-лимфоме человека линии Yurcat, на мононуклеарных клетках крови человека, на макрофагальных клетках линий U937 и Daudi, на клеточной линии аденокарциномы лёгкого человека, а также на мышиных фибробластах линии А9. Важно отметить, что МкАТ реагировали с клетками, выделенными го первичных опухолей и их метастазов в регионарные лимфоузлы и не реагировали с аутологичными мононуклеарными клетками крови.

При иммуноблотганге экстракта клеток меланомы человека МкАТ B3F7 реагировали с компонентом экстракта, имеющим молекулярную массу приблизительно 35 kDa (рис. 13). С экстрактами, приготовленными из антигеннегативных клеток линий А9, AKJI, U266, U937 реакция не обнаружена.

Из известных меланомоассоциированных антигенов антиген, узнаваемый моноклональными антителами JSI имеет сходную молекулярную массу (Wong et al.,1990). Антиген бьш изолирован методом аффинной хроматографии и при электрофорезе давал отдельную полосу в области примерно 35 kDa. Он не экспрессировался на клетках кожи и лёгкого, и кроме меланомы бьш обнаружен на некоторых карциномах и capicoMax(Wong et al, 1991). Этот антиген с термолабильной детерминангой, чувствительной к действию протеаз, присутствует в виде иммунных комплексов в сыворотке больных меланомой. Антигенная детерминанта B3F7 является термосгабильной, т.к. после термической обработки (100°С, 5 мин) антигенная активность сохранялась. Не исключено, однако, что антитела B3F7 могут узнавать другую детерминанту, присутствующую на антигене JSI.

Иммунотоксины на основе МкАТ B3F7. Следующим этапом нашей работы было получение иммунотоксинов на основе МкАТ B3F7 и изучение их цититоксических свойств на модели клеточных культур in vitro. Для получения иммунотосинов (ИТ) МкАТ обрабатывали бифункциональным реагентом СПДП. На одну молекулу иммуноглобулина вводили 3-4 группы СПДП. После активации МкАТ А-субъединицы токсинов были добавлены к антителам и смесь инкубировалась в течении 12 ч. Полученные конъюгаты очищали от свободных антител и А-субъединиц с помощью гельфильтрации. На рис.14 представлен электофорез гель фильтрационного разделения ИТ на основе МкАТ B3F7 и А-субъединицы рицина (RTA).

Для дальнейшей работы были использованны иммунотоксины с одной и двумя А-субьединицами, представляющие основную фракцию при гель-фильтрации. Подобные результаты были получены и с коньюгатами А-цепи агглютинина с МкАТ. Изучение цитотоксичности нативных токсинов - рицина и агглютинина рицина показало, что их

Рисунок 14 Электрофорез в ПААГ с Ds-Na основных фракций гельфильтрационной очистки иммунопгоксииа RTA/B3F

1-ИТ с одной и двумя А-субъединицами рицина;

2- ИТ с одной А-субъединицей рицина;;

3-ATB3F

Справа указана молекулярная масса белков активности различаются более чем в 100 раз (рис. 15). ЛД50 на клетках линии MeWo и А9 для рицина составляла Ю'ПМ, а для агглютинина lff'M; В тоже время, цитотокическая активность каталитических субъединиц этих токсинов была примерно равной как на клетках-мишенях, так и на контрольной линии А9 (ЛД50 RTA = 2*10"7М, ЛД50 ArRTA = 8*10~*М). Исследования аминокислотной поледовательности RTA и AGA показали высокую степень их гомологии - 93% (Roberts L. et al., 1985). Аминокислотные замены в структуре Аг РТА, по-видимому, не затрагивают активный центр этой N- гликозидазы (Robertas J., 1988; Bradley, 1990). По-видимому, значительное различие в цитотоксичности между рицином и агглютинином рицина связано с эффективностью трансмембранного переноса А-субъединиц этих токсинов. Молекула агглютинина представляет собой теграмерную структуру, в которой димеры А-В связаны между собой не только за счет гидрофобного взаимодействия, но и дисульфидкым мостиком [E.Sweeney, персональное сообщение] между остатками цистеина (Cis81 или Cisl56) А-субъединицы, которые отсутствуют в RTA. Возможно, что при такой структуре каталитические субъединицы агглютинина менее эффективно, чем А-цепь рицина транслоцируются в цитоплазму клетки. Кроме того, 18 аминокислотных замен в А-цепи агглютинина могут влиять на ее гидрофобные характеристики, незначительное изменение которых может привести к снижению эффективности транслокации и интоксикации рибосом.

Цитотоксическое действие конъюгатов B3F7/RTA и B3F7/ArRTA на контрольные антигеннегативные клетки линии АКЛ и А9 не отличалось от действия изолированных А-субъединиц. В культуре клеток-мишеней MeWo полученные коньюгаты проявляли устойчивую цититоксическую активность. На рисунке 16 представлено действие конъюгата А-цепи рицина с моноклональными антителами B3F7 в сравнении с действием изолированной А-субъединицей рицина. Видно, что активность конъюгата приблизительно на 2 порядка выше активности изолированной цепи. ЛД50 для данного иммунотохсина составляла 2*10'9М. Третья кривая отражает действие моноклон&пьных антител на клетки MeWo. Видно, что антитела не оказывают влияния на рост клеток. На рисунке 16 представлено также действие конъюгата моноклональных антител с А-субъединицей агглютинина рицина в сравнении с действием изолированной субъединицы. Видно, что конъюгат обладает более высокой цитотоксичностью. Однако, ЛД50 для данного конъюгата составляет 3*10"8М, что более чем на порядок ниже ДЛ50 для

Рисунок IS. Цитотоксическое действие рицина, агглютинина рицина, вискумина и их изолированных субьединиц на клетки меланомы человека. е & 2 £

В чв ^ *

12 11 10 9 8 Концентрации белков (-LgM)

-R60 -»-RTA

-•-ML1 -e-MLA

-±-AgR60 -A-AgRTA

Рисунок 16. Цитотоксическое действие B3F7/RTA и B3F7/AgRTA на клетки-мишени, влияние моненсина и хлорида аммния.

2 н а о

12 11 10 9 8 Концентрации белков (-LgM)

B3F7/RTA

B3F7/AgRTA

B3F7/RTA+NH4CL

B3F7/RTA+MOHeHCMH

B3F7/AgRTA+NH4CI

B3F7/AgRTA+MOH6HCMH конъюгата с А-цепью рицина. Таким образом, из полученных коньюгатов, иммунотоксин на основе А-цепи рицина обладает специфичностью действия и сравнительно высокой цитотоксической активностью.

Иммунотоксины на основе МкАТ анти-HMW-MAA. Было приготовлено 4 иммунотоксина (ИТ ) на основе двух анти-HMW-MAA антител (763.74 и 225.28) и А-цепи рицина и вискумина (RTA и MLA). Антитела отличались по изотипу (225.28 - IgG2a, 763.74 - IgGl) и направлены к разным эпитопам HMW-MAA (Temponi, 1992). Как известно из литературы свойства антител (изогни, аффинность, иш тернализуемость ) влияют на циготоксическую активность ИТ. Токсическая часть также важна для создания эффективного ИТ. Рицин и вискумин близкородственные токсины, которые имеют большую гомологию по структуре и ферментативной специфичности. Однако особенности их внутриклеточного транспорта изучены еще недостаточно. Коныогирование А-цепей рицина и вискумина с МкАТ проводили с помощью СПДП сшивки, практически неденатурирующей антитела. Конъюгаты очищали от непрореагироваших компонентов в системе HPLC и для дальнейшей работы отбирали фракции ИТ, содержащие 1 или 2 молекулы RTA или MLA на молекулу антитела.

Методом иммунофлюоресценции изучали специфичность связывания антител и ИТ на их основе с меланомными клеточными линиями Melur, Colo 38, F-01, FM-3 и с ангигеннегативными клетками HL60 (рис.17). Мембрана почти всех меланомных клеток равномерно окрашивалась, реакция с клетками HL60 не наблюдалась. Изучали также способность к интернализации анти- HMW-MAA антител, используя непрямую иммунофлюоресцентную реакцию (рис.18). Когда клетки меланомы FM3 инкубировали с антителами в течение 30 мин при 4°С, окрашивалась мембрана клеток (рис. 18а). Внутриклеточное окрашивание наблюдалось при инкубации в течение 1 часа при температуре 37°С (рис.18 б,в). Эти данные свидетельствовали о способности анти- HMW-MAA к интернализации, что существенно для приготовления эффективных ИТ.

Количественную оценку связывающей активности четырех ИТ определяли с помощью клеточного иммуноферменгного анализа (рис. 19 ). Из рисунка видно, что при конъюгации сродство ИТ к клеткам меланомы Melur в особенности с антителами 225.28 уменьшается. Возможно, происходит частичная денатурация антител в процессе химического конъюгирования. В меньшей степени понижалось сродство коньюгатов с j*" V

ШжшЙ» s5 |ЙЙ

J. ~ - Г

Гаи?" >

Рис.17 Специфичность связывания AT 763.74 и ИТ 763.74/MLA с меланомой F

Взаимодействие с клетками-мишенями AT 763.74(а, б), ИТ 763.74/MLA (в, г), и антигеннегативными клетками линии HL60 д, е -AT; ж, з - ИТ. а,в,д,ж - фазовый контраст, б,г,е,з - иммунофлуоресценция; увеличение 250х

Рисунок 18 Интернализация анти-HMW-MAA МкАт на клетках FM3 Непрямая иммунофлуоресценция; увеличение 500х ^инкубация 30 мин. При 4°С; в, в-инкубация 1 час при 37°С г-контролъ антителами 763.74 по сравнению со свободными антителами. Возможно это определяется бивалентностью 763.74 антител в отличие от моновалентных 225.28 антител (Temponi, 1992). Цитотоксическая активность каждого ИТ сравнивалась со свободными антителами, свободной А-цепыо и смесью между антителами и А-цепью (рис. 20, 21). ИТ 225.28/RTA обладал низкой циготоксической активностью на меланомных клетках и сравнительно высокой на контрольных клетках. Разница между активностью конъюгата и смеси антител 225.28 и RTA незначительна, что говорит не в пользу химического коныогирования данных антител. ИТ 763.74/RTA на порядок эффективнее ИТ на основе 225.28 антител, но действие его сравнимо с действием смеси RTA и 763.74 свободных антител. Наиболее специфичным и эффективным был ИГ 763.74/MLA.

0,5 - Л MS*

О - HI н^ I iwiii I шиш I 11 mill 0 0,01 0,1 1 10 Концентрация агентов, мкг/мл

О 0,01 0,1 1 10 Концентрация агентов, мкг/мл

Рисунок 19. Связывающая активность коньюгированных и неконъюгированиых антител против HMW-MAA по отношению к клеткам Melur: 1-неконъюгированные, антитела, 2-конъюгат с MLA, 3-конъюгат с RTA

Рисунок 20. Цитотоксическое действие конъюгатов на основе А-цепи вискумина на клетки-мишени

Концентрации белков (-LgM) —♦—763.74 225.

-»-MLA -A-763.74/MLA —±—225.28/MLA -»-ML

Рисунок 20а. Цитотоксическое действие конъюгатов на основе А-цепи вискумина на контрольные клетки

V Л 100 II

§ В 60' 0 > 12 11 10 9 8 Концентрации белков (-LgM)

-♦—763.74 —♦—225.28 —•—MLA —A-763.74/MLA -*-225.28/MLA -•-ML

Рисунок 21. Цитотоксическое действие конъюгатов на основе А-цепи рицина на клетки-мишени

Рисунок 21а. Цитотоксическое действие конъюгатов на основе А-цепи рицина на контрольные клетки

12 11 10 9 8 Концентрации белков (-LgM)

-763.74 -0-225.28 -RTA —&-763.74/RTA ■225.28/RTA -»-R

Концентрации белков (-LgM)

-♦—763.74 —♦—225.28 -*-RTA -A-763.74/RTA 225.28/RTA -*-R

Неспецифическая цитотоксичность этого ИТ превышает 10"8М, активность смеси находиться на этом же уровне. LD50 ИТ 763.74/MLA на различных клеточных линиях меланомы колебалось от 10"11 до Ю"10М (Таблица 6).

Табл 6. Цитотоксическая активность синтезированных коиьюгатов (LDS0) на различных клетках-мишенях.

Коньюгаты Клетки-мишени Контроль

FM3D Melur Со1о38 F-01 HL

225.28/RTA контроль* >10-® 10* >10"8 1.8х10"9 7x10"'° 10'8 <10'

225.28/MLA контроль* 2х10'9 10* 7x10"8 6x10'' ЗхЮ"10 1.5х10'9 8х10"

763.74/RTA контроль* 9x10"' ЗхЮ-9 5x10"'° 6х10"и ЗхЮ'10 10'* >10'

763.74/MLA контроль* ЗхЮ"11 9х10'п ЯО"8 10-ш 10"1и >10' контроль - смесь антител с А- цепями токсинов.

Этот факт очень важен, так как только ИТ, которые имеют LD50 10"10М или меньше пригодны для использования в клинике.

На рис.22 приведены сравнительные данные о цитотоксичности конъюгатов, синтезированных на основе рицина, агглютинина рицина, вискумина.

Рисунок.22 Сравнение цитотоксической активности полученных иммунотоксинов.

12 11 10 9 Концентрации белков (-LgM)

- 763.74/RTA -763.74/MLA -B3F7/RTA -B3F7/AgRTA

Эти данные подтверждают, что наименьшей активностью обладал ИТ B3F7/AgRTA, схожей активностью обладали ИТ B3F7/RTA и 763.74/RTA, наиболее эффективным был ИТ 763.74/MLA. Наши данные согласуются с результатами, полученными Тоневитским и др. ( 1995 ), что каталитическая субъединица виску мина в составе ИТ более активна, чем каталитическая субъединица рицина.

Способы увеличения цитотоксической активности иммунотоксинов. Испытывали различные способы, чтобы увеличить циготоксическую активность ИТ (комбинация различных ИТ, вторые антитела к мышиному IgG, очистка на аффинной колонке с анти-идиотипическими антителами, NHjCL, моненсин). Хорошо известно, что лизосомотропные агенты, такие как NEUCL, моненсин, повышая рН во внутриклеточных компартментах, способствуют частичной инактивации кислых протеологических ферментов и уменьшают деградацию ИТ (Wu, 1997). Инкубация NH»CL и моненсина с ИТ B3F7/RTA, B3F7/AgRTА усиливала цитотоксичность ИТ на порядок (рис. 16)

Комбинации различных ИТ, также как и использование вторых антител для сшивки поверхностных рецепторов в целях лучшей интернализации комплекса в наших условиях не приводило к усилению цитотоксического действия ИТ (данные не приведены). Была сделана попытка очистить ИТ 225.28/RTA на аффинной колонке с анти-идиотипическими МкАТ MF-11, направленными против антигенсвязывающего центра 225.28 антител.

Возможно при химической конъюгации А-субъединиц токсинов с антителами часть ИТ могли оказаться с испорченными антигенсвязывающими центрами. После очистки на колонке цитотоксическая активность коньюгата не изменилась, (рис. 23) По-видимому низкая эффекгивнось ИТ 225.28-RTA определяется свойствами самих антител. Известно, что только 10-20% МкАТ удовлетворяют необходимым критериям и способны создавать эффективные иммунотоксины ( Ghetie, 1994 ).

Выводы

1. Получены оригинальные моноклональные антитела к антигенам клеток рака молочной железы, аденокарциномы легкого и меланомы человека.

2. МкАТ к клеткам РМЖ выявляют ранее не изученный тканеспецифический антиген железистого эпителия молочной железы, слюнной железы и пищевода с мол. массой более 2* 106 Д. При трансформации АГЕЗ сохраняется только в инвазивном лротоковом РМЖ и в раке яичника и толстой кишки.

3. Более тщательное изучение распределения АГЕЗ в различных гистологических структурах РМЖ может помочь в анализе цигодифференцировки различных форм РМЖ и уточнении их классификации. Возможно АГЕЗ будет полезен для иммунодиагностики рака толстой кишки.

4. МкАТ к клеткам аденокарциномы легкого выявляют новую белковую детерминанту тканеспецифического антигена железистого эпителия легкого, молочной железы и желудка с мол. массой около 400 кДа. При злокачественной трансформации AT A2F4 сохраняется в опухолях этого же генеза и экспрессируется в раке толстой кишки.

5. Антиген A2F4 выявляется в более, чем 50% случаев аденокарциномы легкого и сохраняется при ее мегастазировании в лимфоузлы, но не обнаружен в опухолях легкого другого гистогенеза. Таким образом, изученный антиген является маркером аденокарциномы легкого и может быть использован во вспомогательной иммуногистологической диагностике первичного очага опухоли и для уточнения происхождения метастазов в лимфоузлы и другие органы.

6. Впервые синтезированы конъюгаты МкАТ A2F4 с гематогорфирином и копропорфиринами. Они оказывали выраженное фототоксическое действие на клетки АКЛ в концентрации на 2 порядка ниже, чем свободные порфирины.

7. Моноклональные антитела к клеткам меланомы B3F7 выявляли ранее не изученный антиген с молекулярной массой 35fcDa, который экспрессировался на мембране всех изученных нами клетках меланомы и не экспрессировался на аутологичных клетках крови больных меланомой.

8. Впервые синтезированы конъюгаты А-цепи рицина и агглютинина рицина с МкАТ B3F7. Избирательное циготоксическое действие на клетки меланомы иммунотоксина на основе А-цепи рицина в 10 раз выше, чем у конъюгата с А-цепью агглютинина рицина.

9. Синтезировали 4 иммунотоксина на основе анти-HMW-MAA антител и А-цепей рицина и вискумина. Иммунотоксин на основе 763.74 антител и А-цепи вискумина был наиболее эффективным по сравнению с изученными нами иммунотоксинами B3F7/AgRTA, B3F7/RTA, 225.28/RTA, 225.28/MLA, 763.74/RTA.

10. Цитотоксическая активность B3F7/AgRTA, B3F7/RTA и 763.74/MLA усиливалась под воздействием моненсина и NHUCL.