Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Моноклональные антитела против ангиотензинпревращающего фермента для направленной доставки изотопов и генетического материала в эндотелий легких

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Моноклональные антитела против ангиотензинпревращающего фермента для направленной доставки изотопов и генетического материала в эндотелий легких"

На правах рукописи

РГБ ОД

2 2 №ДЙ 2000

гаврилкж Виталий Дмитриевич

МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА ПРОТИВ АНГИОТЕНЗИН-

ПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА ДЛЯ НАПРАВЛЕННОЙ ДОСТАВКИ ИЗОТОПОВ И ГЕНЕТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА В ЭНДОТЕЛИЙ ЛЕГКИХ

03.00.04-Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2000

Работа выполнена в лаборатории Молекулярной и Клеточной Кардиологии Института Экспериментальной Кардиологии РКНПК и в Исследовательском Центре Анестезиологии Университета Иллинойс в Чикаго, США.

Научный руководитель - Доктор биологических наук

Данилов С М.

Официальные оппоненты - Кандидат биологических наук

Домогатский С П

Доктор медицинских наук Медведев О С.

Ведущее учреждение - Институт Биологической и Медицинской Химии РАМН

Защита состоится " У " tt£<>ficJ? 2000 г. в j/ часов на заседании специализированного совета К001.22 02 в Иституте Экспериментальной Кардиологии РКНПК (121552, г Москва, 3-я Черепковская ул, д 15А)

Автореферат разослан

2000 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

Венгерова Т.Н.

о ?

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы исследования. Абсолютное большинство используемых в клинической практике лекарственных препаратов не являются специфичными к "месту" болезни или патологического процесса Обычно, получаемый лекарственный препарат распределяется достаточно равномерно по всему организму, что, в свою очередь, требует повышения дозы препарата для достижения терапевтического эффекта в требуемом органе Увеличение дозы лекарственного вещества часто приводит к возникновению нежелательных побочных эффектов. Самым приемлемым решением этой проблемы является так называемый направленный транспорт лекарств, т е. способность лекарственного вещества селективно накапливаться в органе (клетке)-мишенн независимо от пути введения в организм.

Ранее, было показано, что моноклональные антитела (МоАт) против ангиотензин-превращающего фермента (АПФ) специфически накапливаются в легких экспериментальных животных после системного введения (ОапПоу е( а1 , 1988; 1991) Были исследованы фармакокинетические свойства этих антител и показана возможность использования этого феномена для визуализации сосудистого русла легких (ОапПоу е( а1., 1989) и для диагностики легочных повреждений (АюсЫпа е1 а1., 1992; МигукапЮу е! а1 , 1991)

Серия работ, проведенных В. Музыкантовым в сотрудничестве с нашей лабораторией, показала возможность эффективной доставки в легкие терапевтических ферментов - супероксиддисмутазы, каталазы и активаторов плазминогена, конъюгированных с антителами против АПФ (9В9) (МигукаШоу е! а!, 1994; 1996; АЮсЫпа е1 а1 , 1998).

Следующим логическим шагом в развитии АПФ-зависимого направленного транспорта лекарственных веществ к легким должна быть доставка генетического материала, конъюгнрованного с этим же вектором (МоАт против АПФ). Учитывая, что наиболее эффективными векторами для генной экспреспи являются вирусы, естественным было бы получение специфического конъюгата антител 9В9 с вирусным вектором, позволяющим эффективно доставлять генетический материал к клеткам-мишеням (в данном случае к эндотелию легких)

Цель и задачи исследования Основной задачей данного исследования является получение модификаций моноклональных антител 9В9 и использование полученных модификаций и конъюгатов для направленного транспорта лекарств и генетического материала к эндотелию легких. Выполнение этой работы связано с решением следующих задач:

1 Определение оптимальных условий модифицирования (конъюгирования) моноклональных антител против ангиотензин-превращающего фермента и определение фармакокинетики полученных модификаций. 2. Сравнение антител к разным эндотелиальным антигенам с целью получения наиболее селективного вектора для направленного транспорта веществ к легочному эндотелию. 3 Создание клеточной модели АПФ-зависимого направленного

транспорта веществ к эндотелию легких in vitro. 4. Изучение возможности доставки генетического материала к эндотелию

легких с помощью аденовируса, конъюгированного с антителами 9В9. Новизна результатов В результате данной работы получены конъюгаты моноклональных антител-векторов для направленного транспорта лекарств к легочному эндотелию и показана реальная возможность перенаправления аденовирусных векторов и селективной экспрессии генного материала в органе-мишени (легком) in vivo.

Практическая ценность работы Полученные результаты позволяют предложить использование конъюгатов антител против АПФ (9В9) в клинической практике для доставки генетического материала к легочному эндотелию с целью лечения гипертонии легочного генеза, опухолей легких и метастазов.

Апробация работы Результаты работы были представлены на Международных конгрессах ATS/ALA (American Thoracic Society/American Lung Association) в 1994 (Boston, USA), 1998 (Chicago, USA) и 1999 (San-Diego, USA) rr, на конгрессе Генной терапии в1999 г (Washington, USA). Публикации По материалам диссертации опубликовано 6 статей и 8 тезисных сообщений

Структура ч объем работы Дисертация состоит из разделов Введение, Обзор литературы. Результаты и обсуждение, Выводы и список литературы. Работа

изложена на 114 страницах машинописного текста, включающих 3D рисунков, 5 таблиц Список литературы содержит 113 ссылок

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Моноклональные антитела против ангиотензпн-превращаютего фермента и их конъюгаты метили радиоактивными изотопами 12<1, '"in, даТс Биотинилирование моноклональных антител и конъюгатов проводили согласно Muzykantov et al., 1986. Биспецифические антитела получали с помощью бифункционального реагента SPDP (Л'-сукцпннмидил-З-^-пиридплдитиол) пропионат).

Изучение бнораспределения моноклональных антител, их конъюгатов и модификаций в организме животных проводили согласно Danilov et al , 1989 Эксперименты на перфузированных легких проводил» согласно протоколу описанному Fisher et al, 1991. Иммуноферментное окрашивание препаратов было выполнено модифицированным методом АПААП (АРААР: alkaline phosphatase -antibody against alkaline phosphatase, Metzger et al, 1999).

Для получения экспрессионных плазмид с кДНК АПФ в работе были использованы стандартные методы молекулярной биологии (Sainbrook et al, 1989) Анализ препаратов антител и нуклеиновых кислот проводили при помощи стандартных электрофоретических методов с использованием полпакриламиднох и агарозных гелей. Секвенирование ДНК последовательностей проводили методом дидиоксн-терминации (Sanger et al, 1977) на автоматических секвенаторах Molecular Dynamics с использованием флюоресцентно меченых нуклеотидов Трансфекцию СНО клеток проводили с помощью липофектина Определение активности ангиотензнн-превращающего фермента (АПФ) проводили спектрофлюориметрически (Friedland and Silverstein, 1976)

Определение активности люциферазы в препаратах клеток и тканей определяли стандартным методом согласно протоколу компании Promega, 1996 Манипуляции с аденовирусными препаратами проводили согласно действующим правилам безопасности Анализ нуклеотидных последовательностей, а также, статистический и графический анализ выполняли с помощью пакетов программ OMIGA, Systat и Adobe Photoshop

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Модификация антител

Радиомечение антител Мы проверили влияние меченкя МоАт 9В9 изотопом ,251 на антигенсвязывающую способность этих антител, а также биораспределение модифицированных антител в организме животных. Как оказалось, наиболее простым и эффективным методом иодирования МоАт 9В9 является радиомечение анител с помощью иодогена Иодированные в оптимальных условиях антитела практически не изменяют свои антигенсвязывающие свойства и эффективно накапливаются в легких экспериментальных животных. Мы проверили также влияние мечения МоАт другими радоактивными изотопами на накопление этих антител в легких крыс (Рисунок 1)

Рисунок I. Накопление радиоактивно меченных моноклональных антител 9В9 в легких и крови. Данные по распределению меченных моноклональных антител в организме крысы пол> чены через 1.5 часа после введения 1 мкг меченых разными изотопами моноклональных антител ')В9 в .хвостовую вену крысы (п=3) (представленные данные - из публикации Hicmisch ctal.. 1993).

Как показано на Рисунке 1, все препараты меченных антител 9В9 накапливаются в легких экспериментальных животных, однако максимальную эффективность показывают антитела, меченные изотопом 1.

Таким образом, радиоактивно меченные в оптимальных условиях антитела 9В9 специфически связываются с АПФ, и сохраняют способность накапливаться в легких экспериментальных животных. Такие антитела можно успешно использовать для визуализации сосудистого русла легких и для диагностики некоторых патологических процессов (Danilov et al., 1989; Muzykantov and Danilov, 1995)

Биотинилирование антител. Эффективным методом конъюгирования является использование биотин-авидиновой (стрептавидиновой) системы из-за высокой специфичности и силы связывания этих веществ (константа связывания биотин-стрептавидин превышает 1x10" М'1). Из-за достаточной простоты процедуры биотинилирования система стрептавидин-биотин получила широкое применение в экспериментальной работе и медицинской диагностике (Wilchek and Bayer, 1988) Основным и очень важным критерием биотинилирования моноклональных антител является сохранение антиген-связываюшей способности антителами. Мы проверили эффект биотинилирования на свойства моноклональных антител 9В9 и возможность применения биотиншшрованых антител 9В9 как векторов для направленного транспорта веществ к эндотелию легких.

Интенсивное биотинилирование приводит к частичной (или полной) денатурации белковой молекулы. Непрямым доказательством изменения структуры молекулы антител служит уменьшение выхода белка после очистки (гель-фильтрация) и увеличение эффективности радиомечения биотинилированных антител. Биотинилирование антител при высоком молярном соотношении биотин/белок приводит к потере антителами антигенсвязывающей способности и к ухудшению узнавания последних анти-мышиными иммуноглобулинами. Мы показали, что биотинилирование моноклональных антител 9В9 при молярном соотношении биотин/IgG равном 6-20 является наиболее оптимальным, так как антитела сохраняют свои иммунологические свойства. При таком соотношении почти не изменяется структура и антигенсвязывающая способность антител. Биотинилированые 9В9 могут служить специфическим и высокоафинным вектором для направленного транспорта лекарств к легочному эндотелию. Результаты этой работы открыли возможность для направленной доставки в легкие антиоксидазных ферментов, активаторов плазминогена и антикоагулянтов, используя пару авидин-биотин. При этом все доставляемые вещества сохраняют свою функциональную активность (Muzykantov et al, 1994; 1996; Atochina et al., 1998), что позволяет применение полученных конъюгатов для лечения таких патологических процессов как повреждение в результате ишемии, гипероксии и воспалительных реакций в легких, а также в случае легочного эмболизма или диссеминированного отложения фибрина.

Получение биспеиифических антител. Биспецифические антитела - это антитела, содержащие две разные специфичности в одной молекуле.

Изначально предполагалось получение и использование биспецифических антител для противоопухолевой терапии. При этом один из компонентов должен был быть направлен против опухолевого антигена, а другой - против какого-либо клеточного токсина (Cao and Suresh, 1998). Несколько позже биспецифические антитела стали применять в других областях, - в иммуноцитохимии, радиоиммуносорбции, для активации лизиса, вызываемого цитотоксическими клетками (Klein et al., 1997) и для доставки различных лекарственных веществ к опухолевым антигенам (Cao and Suresh, 1998).

Мы получили несколько видов биспецифических конъюгатов 9В9 с другими антителами или Fab-фрагментами антител против кноб-белка аденовируса с целью изучения возможности доставки аденовирусных векторов к легочному эндотелию. На рисунке 2 показано распределение этих конъюгатов в организме крысы после внутривенного введения препаратов.

Как видно, биспецифические 9B9-aHTH-FLAG антитела селективно накапливаются в легких. Кроме того, конъюгат быстрее выводится из организма и усиленно захватывается клетками печени. Однако абсолютное накопление конъюгата в легких остается невысоким - не более 4% от введенной дозы. Другой вид конъюгирования - по Linx технологии - показывает почти двукратное падение накопления антител в легких (15.88% дозы/г ткани для интактных антител и 7.62% дозы/г для конъюгата 9B9-Fab), тогда как взаимодействие конъюгата с АПФ, иммобилизованным на пластике уменьшается незначительно (рис. 2(E)). Тем не менее, этот конъюгат сохраняет способность накапливаться в легких, хотя и с меньшей специфичностью, чем интактные антитела. Конъюгат 9В9 с Fab фрагментом антител против кноб-белка аденовируса специфически накапливается в легких крыс (Рисунок 2(B)). Как и интактные, так и конъюгированные антитела 9В9 выводятся из кровотока с одинаковой эффективностью. Распределение интактных антител и конъюгата по другим органам, кроме печени, практически не отличается. Увеличение накопления конъюгата в печени может быть связано с увеличением размера комплекса (9B9+Fab) по сравнению с интактными антителами 9В9 или изменением структуры антител (накопление в печени для 9В9 0.63±0.03 % дозы/г ткани, для конъюгата - 1.14±0.17). Таким образом, наиболее

специфичным in vivo является конъюгат антител 9В9 с Fab фрагментами антител против кноб-белка аденовируса.

Рисунок 2. Бнораспределение 1г51-меченных моноклоияльных антител 9В9 и их конъюгатов в организме крысы после внутривенного введения. А -

Конъюгат 9B9-aHTH-FLAG М2 антитела: Б - конъюгат 9В9-анти-кноб Fab (Linx lcclinolog\). В - конъюгат 9ВУ-анти-кноб Fab (SPDP). Данные по биораслрсдслснию конъюгатов пол\чсны через 2 часа после внутривенного введения (1 мкг, 300.ООО срт).

В 1996 г были получены моноклональные антитела (1D6 14), направленные против кноб-белка аденовируса Эти антитела (Fab-фрагменты), взаимодействуя с кнобои аденовируса, предотвращают связывание вируса с клеточной поверхностью, но вирус сохраняет свойство экспрессировать свои гены при попадании внутрь клетки (Curiel et al. 1996). Таким образом, получив аффинный вектор, связанный с антителами против кноб-белка аденовируса, можно специфически направлять полученный конъюгат к определенному типу клеток и тканей. Как показывают результаты исследований, мы получили конъюгат антител 9В9-анти-кноб Fab, который эффективно накапливается в легких крысы и может служить вектором для направленной доставки аденовируса к легочному эндотелию

2. Сравнение разных анти-эндотелиальных антител в качестве вектора для

направленного транспорта к эндотелию легких.

В последние годы получено несколько новых антител

взаимодействующих с эндотелиальными антигенами. Моноклональные антитела против АПФ (Danilov et al , 1991), тромбомодулина (Kennel et al. 1989), межклеточной молекулы адгезии-1 (ICAM-1, Panes et al. 1995) и пока не идентифицированного кавеолярного антигена (Schnitzer, 1997) узнают эндотелиальные клетки in vivo и могут, таким образом, служить векторами для направленного транспорта веществ к эндотелию сосудов.

Для проверки распределения эндотелиальных антигенов в сосудистом русле крысы моноклональные антитела против РЕСАМ-1 (CD31), ICAM-1 (CD54), крысиного ОХ-43 антигена, Thy-1.1 (CD90.1) и АПФ (CD143) были проинкубированы с замороженными срезами разных органов крысы и выявлены иммуноферментным окрашиванием (АПААП). Все антитела взаимодействуют с эндотелиальными клетками сосудов, однако иммунореактивность эндотелия меняется на протяжении кровеносного русла. Thy-1.1 антиген встречается преимущественно в капиллярах, хотя и распределен неравномерно на протяжении капиллярного русла одного и того же органа. АПФ хорошо экспрессирован в артериолах и почти не встречается в капиллярах разных органов Наиболее гомогенное распределение в сосудистом русле показывают антигены ICAM-1 и РЕСАМ-1 Некоторые из антител взаимодействуют с антигенами неэндотелиальных клеток Так, в селезенке Thy-1.1 антиген выявляется на поверхности лимфоцитов, а РЕСАМ-1 - на тромбоцитах и макрофагах. Так как капилляры представляют самую большую часть сосудистого русла, мы проверили распределение эндотелиальных антигенов в капиллярах разных органов). Таблица 1. Распределение антнген-позитивных капилляров в

системном кровотоке крысы

Ан un en Anuncia Jlei кис Печень Почка Ce. leieiika Сердце Кишечник

Unknown MRC OX-43 100 +■ 20 ++ 100 +++ 7 7 100 +++ 60 +

РЕСАМ-1 164 1 100 100 100 25 100 100

(CD 31) + + ++ + + +

Thy 1.1 (CD90.1) OX-7 80 + 0 50 ++ 30 + 50 ++ 80 +++

ICAM-I 1А2У 100? 100 100 50 10 20

(CD 54) + ■> ++ + ++ ++ +

ACE 9ВУ 100 0 0 20 10 5

(CD143) -+++ - - + + +

Количество имм}норсактивных эндотелиальных клеток выражено в процентах. Экспрессия антигенов в капиллярах оценивалась от - (нет экспрессии) до +++ - сильная экспрессия (представленные данные - ш тбликации Оа\п1уик е! а!., 1999).

Из таблицы видно, что наиболее селективно распределен АПФ - от 5 до 20% капилляров в разных органах экспрессируют АПФ, тогда как в легких моноклональные антитела окрашивают 100% капилляров Хотя антитела против ICAM-1, РЕСАМ-1, Thy-11 и MRC ОХ-43 взаимодействуют с эндотелием капилляров, легочную специфичность показывают только антитела 9В9

Результаты экспериментов по биораспределенню меченных анти-эндотелиальных антител представлены в таблице 2 Через 2 часа после системного введения анти-эндотелиальные моноклональные антитела MRC ОХ-43 показывают высокое накопление в селезенке и практически не накапливаются в других органах. Также статистически достоверная разница с контрольными антителами показана для сердца. Из всех проверенных анпгтел наиболее специфически в легких животных накапливаются антитела 9В9 - 15 65% введенной дозы/г ткани выявляется в легких через 2 часа после системного введения Очень сильное накопление в селезенке показали антитела ОХ-7, что, вероятно, связано с высокой экспрессией антигена CD-90.1 в созревающих Т- и В-лимфоцитах Около 2% от введенной дозы/ г ткани этих антител оказалось в почках и 3 73±1 10 % дозы/г ткани - в легких. Слабое накопление в печени заметно для антител IА29 (ICAM-1) и 164.1 (РЕСАМ-1). В легких накопление для 1А29 было равным 5 52±1 99 % дозы/г ткани, для антител 164.1 - 3.55±0.78 % дозы/г ткани Ни одно из антиэндотелиальных антител не задерживается в кишечнике, несмотря на развитую капиллярную сеть

Таблица 2. Распределение "I-антн-эндотелнальных антител в организме крысы.

Ан гш сн Unknown РЕСАМ-1 (CD31) THY-1.1 (CD-90.1) ICAM-1 (CD54) АСЕ (CD143) 5 F1

Антитело MRC ОХ-43 164.1 ОХ-7 1А29 9В9 Control

Кровь 1.12±0.3 0 27±0 05 0.77±0.25 0 34=Ш 02 1 67i() 62 .i. 70 1 0J(>

Легкие 0.47±0.12 3.55±<1.78 3.73±1.Ш 5.52±1.99 15.65±5.4 0.Х7 UI.21

Печень 0.69±0.22 2.93±0.49 1.73±0.33 2.79±(».44 (1 65±0 IS 0.94 I 0.20

Почка 0.93±0.35 1.47±0.38 1.57±0.27 0 8()±() 06 (1 47±0!4 1.04И).()7

Ce.ieiciih.-a 6.67±2.09 1.74±0.26 18.13±4.0 3.22±0.60 0 4S10 16 0.46 Ю. П

Сердце 1.89i0.42 1.3(»±0.59 0.14±0 03 0,49±0.14 0 45±0 13 0.7Н1 O.OV

Кишечник- <).62±0.10 0 21 ±0 03 0.09±0.04 0 32±() 04 0 44±0 14 0.51 1 0.05

Меченные антитела (300.000 срт. 1 мкг) вводили в хвостовую вену животных Через два часа после инъекции животных забивали и измеряли радоактивность внутренних органов Данные представлены как среднее ± стандартное отелонсние (п=3) (представленные данные - из пу бликации СаупКик с! а!.. 1999).

Для того чтобы исключить возможное влияние кровотока на распределение эндотелиальных антител мы сравнили накопление этих антител на изолированных перфузнруемых легких и при системном введении (Рисунок 3).

ACE 1САМ-1 Thy-1.1 РЕСАМ1

CD 143 CD54 CD90.1 CD 31

9В9 1А29 MRCOX4 ОХ-7 164 1 Контрольные

Ан гигси/Аш те. ю

Рисунок 3. Накопление и*1-меченых антиэндотелиальных антител в изолированных перфушруемых легких н после системного введения. 1 мкг

(300 ООО ерт) антител добавляли в перфузат или вводили в хвостовую вену крыс. Накопление в легких оценивалось через два часа после инъекции или перфузии и выражалось в % от введенной дозы (представленные данные - из публикации Gavrilyuk et al., 1999)

Из рисунка видно, что анти-ICAM-l, анти-АПФ и антнэндотелиальные антитела MRC ОХ-43 демонстрируют близкое накопление в перфузируемых легких - 20-25% введенной дозы Однако при системном введении накопление анти-АПФ антител уменьшается незначительно (22% от введенной дозы), тогда как происходит почти пятикратное падение накопления в легких для антител 1САМ-1. Антитела MPC ОХ-43 почти не обнаруживаются в легких при системном введении. Очень высокое накопление наблюдается для антител ОХ-7 (анти-Thy-1.1 ) - 45% введенной дозы, тогда как только 2 % анти-РЕСАМ-1 антител остаются в легких. Контрольные иммуноглобулины не накапливаются в легких, что подтверждает специфичность легочного накопления анти-эндотелиальных антител.

Таким образом, из всех проверенных антител наиболее специфическими для легочного эндотелия in vivo оказались антитела 9В9 (до 25-30% введенной дозы накапливается в легких, Danilov et al , 1988; 1989; 1991). Антитела 9В9 направлены против ангиотензин превращающего фермента, который локализован на люминальной поверхности сосудов. АПФ распределен неравномерно на протяжении кровеносного русла человека - небольшие артерии и артериолы сильно экспрессируют АПФ, тогда как в аорте, крупных артериях и венах АПФ почти не встречается. Особенностью фермента является высокий уровень экспрессии в капиллярах легких - почти 100 % капилляров легких показывают сильную иммунореактивность на АПФ, в то время как только 10-20% капилляров других органов экспрессируют АПФ (Franke et al., 1997) Соответственно этому и происходит распределение в организме антител 9В9.

Важным является и то, что накопления антител 9В9 в легких крысы происходит независимо от пути введения (внутривенно, интраартериально или перитонеально). И в перфузируемых легких, и in vivo 9В9 накапливаются одинаково, что исключает влияние кровотока на распределение и накопление антител. Так как эндотелиальные антитела 9В9 интернализуются клетками эндотелия (Muzykantov et al., 1996), то возможно использование этих антител для внутриклеточной доставки лекарств

Таким образом, мы показали: 1) хотя несколько анти-эндотелиальных антител могут быть потенциальными векторами для направленного транспорта веществ к эндотелию легких, антитела против АПФ являются наиболее специфичными и эффективными для направленной доставки веществ к легочному эндотелию in vivo, 2) накопление антител в органе-мишени зависит не только от локализации и уровня экспрессии антигена в органе, но и от доступности этого антигена для антител.

3. Создание клеточной модели АПФ-зависимого направленного транспорта лекарств в сосуды легких.

Хотя изолированные перфузированные легкие являются хорошей

экспериментальной моделью для изучения направленной доставки лекарств к легким, изучение механизмов интернализации, внутриклеточного транспорта и катаболизма конъюгатов требует наличие клеточной модели, близкой по свойствам к капиллярному эндотелию легких. Оптимальной клеточной моделью была бы культура клеток капиллярного эндотелия легких. Однако показано, что эндотелиальные клетки из разных органов при длительном пассировании теряют часть мембранно-ассоциированных антигенов и меняют свои фенотипические свойства (Chesterman et al., 1983, Rosen et al., 1985; Balyasnikova et al., 1998) К сожалению, создание стабильной клеточной культуры обладающей всеми свойствами первичной ткани (культуры) является сложной, а подчас и невыполнимой задачей. Однако создание клеточной модели близкой по определенным параметрам к первичной культуре вполне возможно.

Для создания адекватной клеточной модели с высоким уровнем экспрессии ангиотензин-превращающего фермента вначале необходимо было получить кДНК АПФ. 5'-фланкирующую АПФ последовательность (-624+147) получили амплификацией геномной ДНК человека Промежуточный участок кДНК АПФ (63-1047) получили реакцией обратной транскрипции на мРНК из легких человека. Фрагмент кДНК АПФ (690-4024) был предоставлен Dr. F. Soubrier (Paris,

France; Soubrier et al., 1988) В результате нескольких последовательных

клонирований была получена полная кодирующая последовательность гена АПФ (-24-4024 нт). Эту последовательность затем клонировали в экспрессионный вектор pcDNA3.1 (Invitrogen, USA), содержащий промотор цитомегаловируса (CMV) и ген устойчивости к аналогу неомицина антибиотику G418.(Рисунок 4).

Рисунок 4. Схема экспрессионного вектора рАСЕ-neo. Вектор содержит полною кодирующую АПФ последовательность под промотором цитомегаловируса и последовательность, кодируют}то устойчивость к нсомицину.

После трансфекции СНО клеток смешанную стабнльную популяцию проклонировали методом лимитирующих разведений и отобрали 10 клонов, экспрессирующих АПФ в наибольшей степени Отобранные клоны были проверены на наличие активности АПФ в культуральной среде и в клеточных лизатах. Для подтверждения гомогенности клеточной популяции, полученные индивидуальные клоны и исходная культура клеток СНО были проверены на экспрессию мембранного белка (Рисунок 5).

Рисунок 5. Иммунофлюоресцентное окрашивание СНО клеток, экспрессирующих АПФ (Б) и исходной культуры (А). Панель А (слева) показывает отсутствие АПФ позитивных клеток, панель б (справа) показывает сильное гомогенное иммунофлюоресцентное окрашивание АПФ, экспреесированного на клеточной мембране. Для окрашивания использовали антитела 9В9 и иммунофлюоресиснтный кит. полученный от Vector Lab., Inc. (Представленные данные из публикации Baly asnikova et al. 1999)

Как видно из рисунка 5, все 100% клеток экспрессируют АПФ Это говорит о том, что получена действительно гомогенная стабильная линия клеток, экспрессирующих ангиотензин-превращающий фермент.

Таким образом, для систематического исследования АПФ-зависимого направленного транспорта лекарств, генетического материала и других приложений, мы получили стабильную линию клеток, экспрессирующую высокий уровень АПФ. Взаимодействие панели антител против АПФ с клетками 2С2 аналогично взаимодействию с клетками HUVEC, что подтверждает возможность использования полученной линии как модель эндотелия легочных капилляров в контексте исследований по направленной доставке лекарств к легочному эндотелию через АПФ-зависимый путь.

4. АПФ зависимый направленный транспорт генетического материала к легочному эндотелию.

За последние годы предложено множество векторных систем для успешной доставки генов к органу-мишени Однако большинство систем успешно выполняют свою функцию на уровне клеточной культуры и оказываются малоэффективными в организме человека и животных. Причина заключена в основном в трансдукции in situ, те. в неспособности этих векторов эффективно активировать или изменить процессы, происходящие в клетке и, соответственно, в тканях и органах (Weiss et al., 1977).

Эффективными "трансдукционными векторами" являются вирусы. Наиболее изученный и широко применяемый вирусный вектор - это аденовирус. Аденовирус (серотип Ad2 и Ad5) легко получить в лабораторных условиях; этот вирус относительно безопасен для человека; на основе этого вируса легко получить новые индукционные системы (т.е. экспрессию, регулируемую, например, тетрациклином) и этот вирус достаточно легко конъюгировать с разными лигандами (Wilson, 1996). Таким образом, получение конъюгата, доставляющего аденовирус к определенным органам или тканям является существенным шагом в исследовании возможности направленного транспорта генетического материала.

Мы получили коньюгат антител, направленных против кноб-белка аденовируса с антителами 9В9 (см. выше). Были подобраны оптимальные условия доставки вируса к клеткам, экспрессирующим АПФ. Для этого культуру клеток проинкубировали с аденовирусным вектором при разном соотношением конъюгат/вирус и определили экспрессию (активность) люциферазы в лизатах культуры клеток (рисунок 6) Как видно из рисунка наиболее высокая экспрессия люциферазы получена при добавлении избытка конъюгата, причем оптимальным является достаточно узкий участок - добавление приблизительно 1 нг конъюгата 9В9-анти кноб Fab при данном количестве вирусных частиц (108).

3 £

20 -

я 1! О. и

■е-

s я

2 и

4 л

ъ

о

5 ' m s н z

< _

о —

Ad+inO Ad+1(> Ad+1 Ad+0.1 Ad+fl.Ol Ad+0.001 Вирус + ng/лунку Fab-9B9

Рисунок 6. Взаимодействие разных соотношений аденовирус/конъюгят 9B9-Fab с клетками 2С2. В 96 луночную плашку с клетками юбавляпи смесь (10" частиц) и разного количества конъюгата и инкубировали 24 часа при !7°С. Затем клетки лизировали и определяли активность люцифсразы в лизатах Представленные данные из статьи Reynolds et al.. 1999).

Таким образом, мы определили оптимальные концентрации вирусных истиц и конъюгата моноклональных антител 9В9 с Fab фрагментом анти-кноб штител для доставки и экспрессии модельного гена к клеткам, экспрессирующим \ПФ.

Чтобы оценить экспрессию модельного гена (Р-галактозидазы) в клетках 1С2 (клетки, экспрессирующим АПФ), полученный конъюгат 9В9-анти-кноб-РаЬ :мешали с аденовирусным вектором AdCMVlacZ в оптимальной пропорции и добавили к клеточной культуре. Через 24 часа после инфицирования была гроверена р-галактозидазная активность клеток (Рисунок 7). Как при добавлении зируса с конъюгатом 9B9-Fab, так и одного аденовирусного вектора, СНО клетки ie экспрессируют р-галактозидазу, так как в норме вирус практически не шфииирует СНО клетки. Однако при добавлении этих же конъюгатов к СНО слеткам, экспрессирующим АПФ существенная галактозидазная активность «блюдается в случае присутствия конъюгата и не наблюдается при добавлении только одного вируса. Этот результат показывает, что I) конъюгат лоноклональных антител 9В9 с Fab фрагментом антител против кноб-белка щеновируса эффективно взаимодействует как с антигеном на клеточной мембране

(АПФ) так и с аденовирусным вектором (через вирусный кноб); 2) конъюгат с аденовирусом эффективно интернализуется клетками, что позволяет вирусу попасть внутрь клетка и активировать транскрипцию вирусной ДНК; 3) попадаемое внутрь клетки количество вируса достаточно для эффективной экспрессии доставляемых генов.

Л<К\ЧУ1..ц1.-У.-9Н9 Г ¡ib

е. " •

«

Рисунок 7. Экспрессия X-Gal в 2С2 клетках. Конъюгат 9В9-анти-кноб-ГаЬ и аденовирусный вектор AdCMVLacZ добавили к клеткам 2С2 (клетки, экспрессир>ющие АПФ). Через 1 час клетки отмыли от несвязавшегося конъюгата и аденовируса, и добавили свежую среду. Через 24 часа клетки фиксировали 2% глютаральдегидом м добвляли субстрат (X-Gal/IPTG) для выявления (З-глюкозидазной активности.

Таким образом, полученная система может быть успешно использована для доставки и экспрессии генов к АПФ-позитивным клеткам.

Чтобы проверить способность конъюгата 9В9-анти-кноб Fab перенаправить аденовирусный вектор к легочному эндотелию in vivo комплекс конъгат-AdCMVLuc-BeKTOp (аденовирусный вектор, содержащий ген люциферазы) ввели в хвостовую вену крыс. Через 72 часа животных забили и определили люциферазную активность в гомогенатах органов (Рисунок 8).

Как видно, из-за повышенной тропности аденовирусного вектора к гепатоцитам, максимальная экспрессия люциферазы, доставляемой аденовирусным вектором, наблюдается в печени. Экспрессия люциферазы в других органах очень незначительная При добавлении конъюгата 9В9-антикноб-РаЬ происходит перенаправление аденовирусного вируса к легким. При этом экспрессия люциферазы в легких увеличивается в 22.7 раза. Соответственно, в других органах происходит падение экспрессии люциферазы. Таким образом, экспрессия люциферазы в печени падает на 83%, уменьшение экспрессии в селезенке и почках менее заметно, и составляет 54% и 57%.

Легкие Печень Селезенка Почка Сердце Органы

Рисунок 8. Экспрессия люциферазы в разных органах крысы чере) 24 часа после внутрнвенного введения. В хвостовую вену крысы вводили с.мссь конъюгата 9B9-Fab и аденовирусного вектора (или только аденовирус). Через 72 часа животных забивати, органы гомогенизировали и определяли активность люциферазы в го.могентах (Представленные данные - из п)бликации Reynolds et al., 1999)

Чтобы показать, что увеличение экспресии люциферазы в легких связано с увеличением количества вирусной ДНК в органе был выполнен полуколичественный анализ на присутствие специфической вирусной ДНК с использованием полимеразной цепной реакции. Как показали результаты,

количество вирусной ДНК доставленной антителами 9В9 увеличилось в легких в 20 раз по сравнению с контролем (просто аденовирус). Количество вирусной ДНК в печени практически не изменилось, разница между экспериментальной и контрольной группой составила 4%.

Таким образом, мы показали, что конъюгат моноклональных антител против ангиотензин превращающего фермента с Fab фрагментом анти-кноб антител позволяет перенаправлять аденовирусный вектор к эндотелию легких in vivo. Также показано, что доставляемый вирусный вектор попадает внутрь эндотелиальных клеток и сохраняет способность экспрессировать модельный ген в легких.

Негативными последствиями использования вирусных векторов для направленной доставки лекарств является возникновение иммунного ответа Так как антитела или их конъюгаты позволяют эффективно перенаправить аденовирус к органу-мишени, то терапевтическая доза вводимого в организм вирусного вектора может быть уменьшена Тем не менее, необходимая терапевтическая доза препарата в органе-мишени сохранится Такой подход может уменьшить или существенно задержать возникновение иммунного ответа. На сегодняшний день аденовнрусные вектора могут нести до 4-6 кБп чужеродной кДНК (Weiss et al., 1977) У большинства генов человека кодирующая последовательность не превышает этого размера, что позволит доставлять и экспрессировать большинство "терапевтических" генов к легочному эндотелию.

Результаты нашей работы позволяют надеяться, что эффективная и специфическая доставка генного материала через АПФ-зависимый путь может применяться для лечения заболеваний легких, таких как гипертензия легочного генеза (путем доставки в легкие генов NO-синтазы и простагландин-синтазы), легочных опухолей и метастазов (путем доставки и экспрессии генов, продукты которых усиливают противоопухолевой иммунитет - интерлейкина-1 и фактора ингибирования миграции макрофагов).

Эта работа является первой в мире, показывающей возможность перенаправления аденовирусных векторов и экспрессии генного материала в органе-мишени при системном введении in vivo

выводы

Выполненная работа позволяет сделать следующие выводы:

1. Подобраны оптимальные условия для бнотинилирования, введения радиоактивной метки и конъюгирования с другими антителами моноклональных антител против АПФ (9В9). Модифицированные, радиоактивно меченные и конъюгированные с разными веществами моноклональные антитела 9В9 сохраняют антиген-связывающую способность и селективно накапливаются в легких крысы после внутривенного введения. Это позволяет использование этих антител как векторов для АПФ-зависимого транспорта веществ к легочному эндотелию.

2. Проведен сравнительный анализ нескольких анти-эндотелиальных антител с целью получения эффективных векторов для направленного транспорта лекарств к эндотелию легких. Показано, что наиболее эффективным и специфическим вектором являются моноклональные антитела против АПФ - 9В9.

3. Получена клеточная линия, экспрессирующая АПФ Эта линия может служить моделью капилляров легких in vitro, в контексте изучения возможности АПФ-зависимого транспорта лекарственных веществ к эндотелию легких.

4. Показано, что конъюгат антител 9В9 с Fab фрагментом анти-кноб антител перенаправляет аденовирусный вектор к эндотелию легких при системном введении в кровоток При этом экспрессия модельного гена в легких экспериментальных животных увеличивается в 20 раз и значительно уменьшается в других органах.

5. Полученные результаты позволяют предложить использование конъюгатов антител против АПФ (9В9) в клинической практике для доставки генетического материала к легочному эндотелию с целью лечения гипертонии легочного генеза, опухолей легких и метастазов.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

I. Статьи

1. Hiemisch Н., Gavrilyuk V., Danilov S., Atochina E, Slinkin M., Torchilin V., Muzykantov V. Purification of radiolabeled monoclonal antibodies to angiotensin-converting enzyme significantly improves specificity and efficacy of its targeting into the lung. Nuc. Med. Biol. 1993, 20: 435-441

2. Muzykantov V., Atochina E., Gavrilyuk V., Danilov S. and Fisher A. Immunotargeting of streptavidin to the pulmonary endothelium. J. Nuc Med. 1994, 35: 1358-1365

3. Muzykantov V., Gavrilyuk V., Reinecke A , Atochina E., Kuo A, Bamathan E., Fisher A. The functional effects of biotinylation of anti-angiotensin-converting enzyme monoclonal antibody in terms of targeting in vivo Analytical Biochem. 1995,226: 279-287.

4. Balyasnikova I., Gavrilyuk V., McDonald T, Berkowitz R., Miletich D., Danilov S. In vitro model using a cell line expressing angiotensin-converting enzyme Tumor. Target. 1999, 4: 1-14

5. Reynolds P., Zinn К , Gavrilyuk V., Balyasnikova I, , Rogers В., Buchsbaum D., Wang M., Miletich D., Douglas J., Danilov S. and David T. Curiel. A targetable, injectable adenoviral vector for selective gene delivery to pulmonary endothelium in vivo. Nature Biotech. (In press)

6. Gavrilyuk V, Muzykantov V, Franke F, Pauls K, Visintine D, Harshaw W, Miletich D, and Danilov S. Antibody-mediated lung endothelium targeting: surface endothelial antigens as targets for drug/gene delivery for the pulmonary vasculature. Am J. Physiol. (Submitted)

II. Тезисы докладов.

1. Muzykantov V., Atochina E, Gavrilyuk V., Danilov S., Fisher A. Development of an universal systemfor drug targeting to the pulmonary endothelium in vivo. Am J. Resp. Crit. Care Med. (Suppl) 1994; 149: A297 (American Lung Association/American Thoracic Society (ALA/ATS) International Conference 1994).

2. Balyasnikova I, Gavrilyuk V, McDonald T, Berkowitz R, Miletich D and Danilov S. In vitro model of lung endothelium targeting using a cell line expressing angiotensin-converting enzyme Am J. Resp. Crit Care Med.(Suppl) 1998; 105: A566 (ALA/ATS, 1998)

3. Gavriluk V, Franke F, Harshaw W, Vogel S, Muzykantov V, Granger D, Miletich D, and Danilov S. Antibodies to endothelial antigens: potential carriers for drug/gene delivery to the pulmonary vasculature. Am J. Resp. Crit Care Med. (Suppl) 1998, 105: A205 (ALA/ATS, 1998)

4. Danilov S, Atochina E, Gavriluk V, Reisher S, Feinstein S, An Jaffe H, Fisher A, Muzykantov V. ACE directed immunotargeting of DNA to the pulmonary vasculature Am J. Resp. Crit. Care Med. 1999: (ALA/ATS, 1999)

5. Balyasnikova I, Gavrilyuk V, Miletich D and Danilov S In vitro model of lung endothelium targeting: 1. Comparison of mAbs to different epitopes of ACE as a carriers. Am J. Resp. Crit. Care Med.(Suppl) 1999, 159: A348. (ALA/ATS, 1999).

6 Balyasnikova I, Francois J-C, Gavrilyuk V, Miletich D and Danilov S. In vitro model of lung endothelium targeting: 2. Delivery of antisence oligonucletides into cell using anti-ACE mAbs as a carrier. Am J. Resp. Crit Care Meil.(Suppl) 1999; 159. A350 (ALA/ATS, 1999).

7. Reynolds P, Balyasnikova 1, Gavrilyuk V, Miletich D, Danilov S and Curriel D. Targeting gene delivery to angiotensin-converting enzyme. (American Society for Gene Therapy International Conference, Washington, 1999)

8. Reynolds P., Zinn R., Douglas J., Balyasnikova I, Gavrilyuk V., Rogers B , Buchbaum D., Miletich D, Danilov S and Curriel D. In vivo targeting of adenoviral gene delivery to the pulmonary endothelium via angiotensin-converting enzyme. Am J. Resp. Crit Care Med. (Suppl) 1999; 159: A434. (ALA/ATS, 1999).