Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Селективное накопление в легких моноклональных антител против ангиотензин-превращающего фермента

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Селективное накопление в легких моноклональных антител против ангиотензин-превращающего фермента"

АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СССР Всесоюзный кардиологический научный центр

На правах рукописи

Аточина Елена Николаевна

СЕЛЕКТИВНОЕ НАКОПЛЕНИЕ В ЛЕГКИХ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ПРОТИВ;АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАШАЮШЕГО ФЕРМЕНТА

03. 00. 04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -1990

Работа выполнена в лаборатории молекулярной и клеточной кардиологии Всесоюзного кардиологического научного центра АМН СССР.

Научный руководитель: кандидат медицинских наук, вед, н. сотр. С. П. Данилов

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор - Вшпшцхий Л.И. кандидат химических наук, вед. н. сотр. - Сгшохин Г. П.

Ведущее учреждение: 2-й Московский Ордена Ленина Государственный медицинский институт им. Пирогова.

Защита диссертации состоится ^^ декабря 1990 г. в часов на заседании специализированного ученого совета К 001.'22. 02 во Всесоюзном кардиологическом научном центре АМН СССР по адресу: 121552, Москва, 3-я Черепковская ул., д. 15а.

С диссертацией можно ознакомиться 8 научной библиотеке Всесоюзного кардиологического научного центра АМН СССР.

Автореферат разослан ноября 1990 г.

Ученый секретарь

общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Поиск векторов, специфично связывающихся в организме с клетками, тканями и органами-мишенями, является: необходимым этапом в осуществлении направленного транспорта лекарств (Gregor!adis et al, 1977; Poznansky et al, 1984). Весьма привлекательными кажутся попытки использования в качестве векторов моноклональных антител (МоАт) к антигенам, преимущественно экспрессированных в органе-мишени. Одним из таких антигенов может быть ангиотензин-превращающий фермент (АПФ). 'АПФ - один из ключевых ферментов ренин-ангиотензиновой системы, играет важную роль в регуляции сосудистого тонуса:, переводит Ангиотензин I в мощный прессорный агент Ангиотензин' II и участвует в инактивации активного вазодилятатора - брадикинина. Известно, что концентрация АПФ . резко увеличена в легких (Cushman et al, 1971). Кроме того, АПФ расположен на внешней мембране эндотелиальных клетон сосудов и, следовательно, доступен для веществ, циркулирующих в крови (Ryan et al, 1975). ' В последнее время обнаружено, .что при различных легочных заболеваниях активность- АПФ в легочной ткани, бронхо-альвеолярном лаваже и в сыворотке может меняться (Hollinger et al, 1980). Все эти данные позволяют рассматривать АПФ в качестве маркера повреждения легочного, эндотелия (HolHnger et al, 1983).

В настоящее время все большее.внимание уделяется изучению биораспределения радиоактивномеченных антител в норма и при патологии (Keenan et al, 1985).' Во-первых, эти исследования предоставляют, принципиально новую инфориацию о доступности тех или иных тканевых антигенов для циркулирующих компонентов крови, что важно для. понимания механизмов взаимодействия кровь - стенка

сосуда (I del son et al, 1987).. Во-вторых, они служат основой для разработки новых методов диагностики при помощи иммуно-сцинтиграфии (Anderson étal, 1986). Яркими примерами такого подхода могут служить методы визуализации зоны инфаркта миокарда (Khaw et al, 1987), тромбов (Som et al, 1986) и опухолей (Larson et al, 1985).

В предварительных экспериментах было показано, что при введении в кровоток -меченых моноклональных антител (МоАт)

9В9 против АИФ наблюдается необычайно селективное накопление этих антител в легких. Этот факт, а также то, что в норме АПФ в легких локализован только на внешней поверхности эндртелиальных кдаток сосудов, позволяют предполагать возможность использования моноклональных антител 9В9 для визуализации сосудов легких, а также в качестве вектора для направленного транспорта веществ в легкие. ^ ,, ■

Цель исследования. Изучение биораспределения и накопления в легких моноклональных антител 9В9 против ангиотензин-превращающего фермента. Задачи исследования.

1. Изучение фармакокинетики и накопления в легких МоАт 9В9.

2. Изучение физиологических эффектов введения МоАт 9ВЭ in vivo.

3. Получение Fab* 2 'И Fab фрагментов МоАт 9В9 и сравнение их накопления в легких с целыми молекулами антител.

4. Изучение накопления в легких МоАт 9ВЭ у животных с различными моделями повреждения легких. ■•■■■.■.■■■.■■.

Научная новизна и практическая ценность работы. В работе впервые обнаружен факт необычайно селективного накопления моноклональных антител 9В9 против ангиотензин-превращавдего

фермента при введении этих антител в кровоток. Детально исследовано биораспределенив и кинетика накопления в легких лабораторных животных разных видов МоАт 9В9, меченных разными изотопами. Изучены физиологические эффекты введения МоАт 9В9 i п vivo, которые в отличие от поликлональньк антител к АПФ не вызывают заметного повреадения эндотелия легких. Показано, что селективное накопление в. легких МоАт 9Б9 резко снижается у животных с экспериментальными .моделями повреждения легких. Полученные результаты показывают, что МоАт 9В9 против АПФ могут стать основой для разработки нового подхода для визуализации сосудов легких,, для оценки состояния сосудов при повреждении легких, а так^ке могут быть использованы в качэстве вектора для направленного транспорта веществ к легким. . ,

Апробация работа Диссертация ' апробирована на кеалабораторнои семинаре Института экспериментальной кардиологии ВКНЦ АШ СССР .(Москва, I99Ó). . Материалы диссертации доложены также на: йездународном сиипозимумв по ингибированию АПФ (Лондон, 1989); IV Европейском сишозимуиэ по гипертонии (Милая, 1989); Конгрессах' Европейского общества ядерной медицины (Страсбург, 1989; Амстердам, 1990); XV Всемирном конгрессе шждународаого союза, ангиологов (Рим, 1989); V Всемирном конгрессе ядерной шдицины и биологии (Монреаль, 1990).

Публикации, По штериалаи диссертации опубликовано 8 работ.

Структура к объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, результатов и пх обсуждения, заключения, выводоб и списка цитированной литературы. Работа излогева на 130 страницах машинописного .текста, содержит 22 рисунка и 9 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И ИСТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Определение активности АПФ. Активность АПФ определяли флюориметрически (Friedland et kl, 1976), используя в качестве субстрата Гиппурил-Гистидил-Лейцин (Гип-Гис-Лей). Отщепившейся дипептид (Гис-Лей) определяли с помощью о-фталевого альдегида. Флюоресценцию . продукта регистрировали на флюоресцентном спектрофотометре F-3000 Hitachi (Япония) (возбуждение - 363 нм и флюоресценция - 462 нм). За единицу активности АПФ принимали то количество АПФ, которое гидролизует I мкмоль Гип-Гис-Лей за I минуту при 37^С в стандартных условиях.

Видовую специфичность панели МоАт против АПФ легких человека определяли с помощью метода иммуносорбции (Oanilov et al, 1987). Для этого сыворотки крови и гомогенаты легких исследованных животных инкубировали'с различными МоАт против. АПФ, ковалентно связанных с CNBr-сефарозой. Через сутки инкубации, оценивали активность АПФ, сорбированную на МоАт-сефарозе, по сравнению с активностью АПФ, сорбированной на сефарозе 4Et которую использовали как отрицательный контроль.

Выделение МоАт 9ВЭ против АПФ легких человека. Моноклональные антитела, названные 9В9 (igGj), бьши получены, стандартной гибридомной технологией-, используя в качестве иммуногена ангиотензин-превращаший фермент, выделенный из легких человека (Danilov et al, 1987). Гибридомы, секретиругацие МоАт 9В9, вводили внутрибркшинно . (2x10® клеток) мышам линии BAIB/c. Асцитную жидкость собирали на 20-25 день после "введения "клеток. Иммуноглобулины преципитировали из асцитной жидкости сульфатом натрия. Очистку антител проводили с помощью ионнообменной хроматографии на ДЕАЕ-52 целлюлозе.

Получение Fab'о и fab фрагментов антител 9В9. Фрагменты Fab'2 и fab получали из целых молекул иммуноглобулинов 9В9 с помощью пепсина ("Sigma") и иммобилизованного папаика ("Pierce") соответственно, согласно рекомендациям . производителей. От нерасщепленных молекул иммуноглобулинов и Fe фрагментов, Faь' 2 и Fab фрагменты отделяли, используя последовательно хроматографии на protein-A сефэрозе и гель-фильтрацию на колонке SW ЗООО с гелем TSK для высокоэффективной жидкостной хроматографии. Чистоту выделенных МоАт 9В9 и их Fab'2 и Fab фрагментов определяли при помощи SOS-электрофореза в 7 % и 10 % полиакриламидном геле. Антиген-связывающую способность выделенных МоАт 9В9 и их фрагментов оценивали с помощью метода иммуносорбции (Oanilov et al, 1987).

Мечение МоАт 9ВЭ и их Fab'о и Fab фрагментов радиоактивными изотопами. Мечение проводили с помощью йо до гена (Fracker

and speck, 1978). Для шчения [шт], МоАт 9Б9 и' их фрагменты модифицировали используя в качестве хелатирущзго агента циклический ангидрид .диэтилентриамин-пентауксусяой кислоты (cole et äl, 1987). Мечение антител 9B9 и Fab фрагментов проводили взяв за основу метод описанный Frier et ab (1990). Удельная активность МоАт, меченных изотопами [I25lJ, [Ш1п] и [99fflTc] на мкг бежа, достигала 0,5-1 мкКи, 2-5 мкКи и 2-2,5 мкКи соответственно.

Изучение биораспределения МоАт 9В9 в организме экспериментальных животных проводили следующим образок самцам крыс линии Wlstar, весом 250-300 г вводили через хвостовую вену .1-2 'мкг специфических МоАт 9В9' или их Fab' и Fab фрагментов, меченных [125i], [Inin] или [99mTc] в 0,5 мл забуференкого физиологического раствора (ЗФР) с 0,2 % бычьего сывороточного

альбумина (БСА). Через разные промежутки времени после введения указанных препаратов животных забивали, радиоактивность крови и внутренних органов определяли на гамма-счетчике 1КВ Ыа11ас-Вготта, (Швеция). В опытах с сирийскими хомячками (весом. 100-120 г) радиоактивноыеченные препараты вводили интраорбитально, а в экспериментах с кошками (весом 2-2,5 кг) -через катетер в наружной яремной вене. Для оценки биораспределения использовали следующие параметры I) процент от введенной дозы на грамм ткани, 2) коэффициент локализации (КЛ) - отношение радиоактивности грамма ткани к радиоактивности грамма крови, 3) индекс иммуноспецифичности - отношение КЛ МоАт 9В9 к КЛ неспецифических иммуноглобулинов (Кеепап а1, 1985).

Физиологический эффект введения МоАт 9В9. Животным вводили от 10 мкг до ТОО мг МоАт 9В9 на кг веса. Через разные промежутки времени животных забивали и оценивали следующие параметры; активность АПФ в гошгенатах легких и сыворотках крови, весовой коэффициент легких (отношение веса легких к Еесу крысы х 100), накопление в легких БСА меченного []. Два последних параметра использовались для оценки степени отека легких и проницаемости их сосудов соответственно . ($1е1гпег'еЪ <а1, 1988; ГаггикИ е1 а1, 1987). . ■ . ' ;

Экспериментальные модели повреждения легких. Повреждение легких вызывали с помощью разных повреждающих агентов I) Альфа-. ЕафгшггкошчэвЕну (АНТМ) вводили крысам внутрибршинно в дозе 20 мг/кг веса в 0,5 мл 1«ееп-80. Все дальнейшие препараты крысам вводили внутривенно, через хвостовую вену. 2) Эвдотохснн вводили в дозах до 4 мг/кг веса в 0, 5 мл ЗФР с 0,2 % ■ БСА. 3) «орбо* нириетил ацетат (ФМА) вводили в дозах до 90 мкг/кг веса. 4) вектор агрегации тромбоцитов (ФАТ) вводили в дозах до 40 мкг/кг

веса. После развития повреждения легких: через 2-3 часа после введения крысам АНТМ(Магип ег аГ,- 1986), через 12-15 часов после введения эндотоксина (меугтек еЬ а1,'1986), через 0,5-3 часа после введения ФМА и через 30 минут после введения ФАТ аивотным вводили в 0,5 ил ЗФР с 0,2 % БСА смесь антител против АПФ: МоАт 9В9, меченных [1251 ] и МоАт ЗА5, меченных [1П1п] по 10 имп/мин/кхг белка. Через 0,5-1 час после введения указанных препаратов крыс забивали, радиоактиэность крови и навесок внутренних органов определяли на гамма-счетчике (ив, Wa^ 1 ас-Вготта). Для разделения пиков радиоактивностей обоих изотопов (1255 и Ш1п) 3: одном образца, была использована программа номер 1282 указанного гамма-счетчика. •

Статистическую обработку результатов проводили по г-критерию Стъвдента. .Данные в работе представлены в виде средних значений ± стандартная ошибка среднего.

РЕЗУЛЬТАТЫ II ОЕСОДЕНИВ " .

I. Видовая специфичность панели МоАт против . АПФ легких человека. В лаборатории молекулярной и клеточной кардиологии ВКНЦ АМН СССР была получена панель из 12 клонов гибридом, продуцирундах моноклональные антитела (МоАт) против ангиотензин-превращагацего фермента (АПФ) человека. Выло показано, что по крайней мере 5 из этих 12 антител узнают разные эпитопы (антигенные детерминанты) молекулы АПФ человека (Молдобаева А. К., 1990). Для того, чтобы выяснить,_'как распределяются МоАт против АПФ 'при введении их з кровоток, необходимо было исследовать видовую специфичность .этого набора антител, т.е. проверить, взаимодействуют'-ли'эти антитела с АПФ каких-нибудь лабораторных

животных. Как видно из результатов, представлекных в таблице I, МоАт 9В9 специфически взаимодействуют On vitro) не только с АПФ человека, но также с АПФ обезьяны, кошки, крысы, сирийского хомячка.

Таблица I. Видовая специфичность панели МоАт против АПФ

легких человека.

_ _ объект ! исследов. ! 9В9 ЗА5 1612 3G8 5FI

человек + + + + +

обезьяна + + +

кошка + _ . _ _ _

собака - _ _ - -

коза - - - - -

кролик - + - - ■ +

крыса + — - - -

шшъ - - - - -

сирийский + - но но но

хомячок

Мы произвольно решили считать, что МоАт взаимодействует. с АПФ данного вида животного, если активность АПФ на МоАт-сорбенте превышает активность АПФ на сефарозе 4В больше, .чем в 3 раза, (но) - не определялось. .'

Из животных, с АПФ которых взаимодействуют МоАт 9В9, мы выбрали крысу и сирийского хомячка, ' как наиболее доступных и удобных в обращении лабораторных животных-и поэтому большая часть исследований была проведена на этих животных.

2. Изучение фармакокинетики и накопления в легких МоАт 9В9. Моноклональные антитела 9В9 меченные [1251], при введении их в кровоток крысы селективно накапливаются в легких (рис. I). Это накопление специфично как по отношению к другим органам и тканям, так и по отношению к неспецифическим иммуноглобулинам мыши. Накопление, антител в органах представлено в Виде коэффициента

локализации, который характеризует спешфианасхь накопления антител в органе по сравнению с кровью (т.е. отношение радиоактивности I грамма легких к радиоактивности I г крови).

Рисунок I. Распределение [*251]-меченных МоАт 9ВЭ и

контрольных иммуноглобулинов по органам крысы.

Крысам через хвостовую вену вводили по I мхг (106 имп/шн) МоАт ЭВ9 или контрольных иммуноглобулинов. Через 4 часа после введения указанных препаратов крыс забивали и определяли радиоактивность внутренних органов.и крови на гамма-счетчике.

Максимальная эффективность накопления МоАт 9В9 -(то есть процент от введенной дозы) достигала в наших экспериментах 40 %, а максимальная спещф^чнось (селективность) накопления в легких МоАт 9В9, выраженная в виде коэффициента локализации, достигала 20 по отношению к крови и 40 по отношению к другим органам и тканяя Аналогичный характер накопления ,МоАт 9В9 в легких наблюдался и у сирийского хомячка (не показано).

Накопление меченых МоАт 9В9 в легких крыс и сирийских хомячков резко уменьшалось при введении избытка немеченых МоАт 9В9 (не показано). Эти результаты доказывают насыщаемость антителами антигена в легких (АПФ), а также то, что процедура введения метки [^1] в молекулу антитела 9В9 не' изменяет существенно его антиген-связывающие свойства.

В отдельном эксперименте мы сравнили три различных способа введения монооональных антител 9В9 в. кровоток крысы: через катетер в бедренной вене, через катетер.в бедренной артерии и игольной инъекцией в хвостовую вену. Распределение по тканям, и специфическое накопление МоАт 9В9 в легких во всех трех случаях оказались весьма схоними. Это .означает, что связывание-антител'в легком не'является артефактом перфузии через венозное русло/ при котором первым перфузируемым .органом могут быть -легкие, а обеспечивается за счет специфического сродства МоАт 9В9 к АПФ. -

На рисунке 2 показана кинетика накопления антител 9В9 против АПФ в легких крысы, сирийского, хомячка и выведения их из крови. Из' рисунка видно, что хотя максимальное накопление антител в легких наблюдается через 1-1,5 часа после их введения, максимальная специфичность по отношению к крови достигается через довольно продолжительное время, после выведения из крови большей части циркулирующих антител. Результат этого эксперимента имеет,

Рисунок. 2. Кинетика накопления МоАт 9В9 з легких (А) и

кинетика выведения МоАт 9В9 из крови (В) крысы (I)

и сирийского хомячка (2). '

Крысам через хвостовые вен'к, а сирийским хомячкам5 интраорбитально ' взодлли КЬг.жг и I ккг соответственно I п-меченных МоАт 9БЭ (10° - 10' ямп/мин). Нивотных забивали через указанные прокэгуткя врзгэки и определяли радиоактивность в легких и крови.

как наг! кагет'ся, весьма ваяние следствия. Концентрирование в легких какого-либо действующего агента,, кояыагированного с антителами 9ВЭ, начнется непосредственно после введения (при условии, что коньпгированйэ существенно на изменит аффинные свойства препарата). С другой сторона, визуализацию сосудистого русла легких с пог-ог^э радио'активнокэченных антител, например п]-9ВЭ,. при по*'ог"1 ' гагга-сцинтиграфии целесообразно проводить через насколько часов после введегтя препарата, когда специфичность 'накопления максимальна, поскольку для визуализации

снижение фона циркулируших.. в крови свободных антител более критично, чем достижение больших абсолютных значений связывания метки в органе-мишени (Begent et al, 1985).

Учитывая тот факт, что указанный феномен (селективное накопление МоАт 9В9 в легких) может стать основой нового метода визуализации сосудов легких при помощи гамма-камеры (Danilov et al, 1989), мы решили сравнить эффективность и специфичность накопления в легких крысы МоАт 9В9, меченных разными изотопами: [I25l], [Шш] и [9Чс]. Изотопы [Ш1п] и [9Чс] цспользуиг для ишуносцинтиграфии - метода, позволяющего оценить накопление радиоактивных изотопов 1п vivo, на живом объекте с помощью гамма-камеры. Представленные в таблице 2 результаты по накоплению в легких крысы антител 9В9, меченных разными изотопами, показызаиг, что, несмотря на совершенно различную процедуру шчения, МоАт 9В9, меченные разными изотопами, достаточно эффективно накапливаются в .легких.

.Таблица 2. Накопление в легких крысы МоАт 9В9, меченных разными изотопами: [I25l], [I2:IIn] и [99яТс].

вводимый I % от \ % от введеной дозы 1 коэфс^щент

препарат ! введеной! ——---—!-■-:—-! локали-

! дозы ! / г крови ! / г легких ! задии

CI25i]-9B9 3ft 4 3,7 1,5 ± 0,1 21,2 ± 4,3 14,1 ±3,0

[Ш1п]-9ВЭ 22,3 ± 2,2 1,5 ±0,2 13,5 ±1,7 8,8 ± 1,6

С99гаТс]-9Б9 25,1 ± 2,2' (V9 ± ft l 11,4 ± 1,2 12,7 ±1,9

Крысамечерез хвостовую вену ввалили МоАт 9Ш, меченные Г ] (I ыкг, Жимп/мин), меченных [1ДД1пТ (0,2 мкг, 1СР юш/мив) и меченные [3-тТс](1 мкг, 0,5 1Сг имп/мин). Через 1,5 часа после введения указанных препаратов животных забивали и определяли радиоактивность в легких и крови. .

Селективная аккумуляция антител 9В9 в легких связана с высокой концентрацией АПФ в легких. Мы провели тщательные измерения активности АПФ в разных органах тех видов животных, АПФ которых взаимодействует с МоАт 9Б9. Следует отметить, что у крысы, хомячка и кошки (у которых отмечается очень высокая разница между концентрацией АПФ в легких и крови), наблюдается и большая селективность накопления в легких МоАт [*25i]-9B9 при их введении в кровоток этих животных. Так же следует отметить, что, несмотря на высокую концентрацию АПФ в кишечнике и почках, тем не менее не наблюдается накопления антител 9В9 в этих органах. Это объясняется тем, что АПФ в легких расположен на внешней мембране эндотелиальиых клеток и доступен для циркулирующих антител. АПФ почек локализован в эпителиальных клетках проксимальных канальцев, а АПФ в кишечнике на эпителии краевой пластинки, и таким образом они не доступны для циркулирующие в кровотоке антител. .

3. • Физиологические эффекты введения'МоАт 9В9 in vivo. Рядом исследователей было показано, что введение в кровоток кролика и крысы поликлональных антител против АПФ. приводит к быстрому развитию отека легких и-гибелл большинства животных (Caldwell et aí, Т976; FlcCoraick et-al, 1980). • Авторы показали, что антитела ггрогив АЛФ вызывала фиксацию комплемента на эндотелиальиых -клетках, который, вероятнее всего, и определял повреждение эндотвлшнаных клеток. ' •

Нй в одном случае введения" крькам шноклональных антител 9В9 (дзеэ при введения- 200 мг антител на крысу) не происходило никаких изменений в поведении и жизнеспособности животных, а при вскрытии кы не обнаруживали патологических изменений в легких.

Отсутствие поврездапцего эффекта МоАт 9В9 гокет бьггь связано с.

• ■

тем фактом, что эти антитела не индуцируют комплемент-зависимого повреждения эндотелия (яуап а!, устное сообщение).' МоАт 9В9 не повреадают эндотелиальнке клетки человека в культуре . в присутствии комплемента, хотя шшинная антисызоротка к фактору VIII (использованная как положительный контроль) повреждает эндотелиальиые клетки даже в очень большом разведении комплемента и антисыворотки (0ап1 е1 а1, 1988а).

Высокая спзцифичность к эффективность накопления МоАт 9В9 в легких, отсутствие выраженных патологических кзкзнзний при их введении позволяют предположить возможность использования этих МоАт, меченных радиоактивными изотопами, для . визуализации сосудистого русла легких. Поэтому необходимо било проварить все возможные негативные последствия введения таких антител в организм.

Для более точной оценки' повреждения легких крысы после введения МоАт 9В9 мы использовали два количественных параметра: -I) весовой коэффицент легких, 2) накопление в легких БСА,'

г Т 94 1

каченного 1.1.1. Эти парам&тры иироко используют* для , оценки отека и проницаемости сосудов легких при различных патологиях ( Гаг-гикИ^ а1, 1987; 51еипег е! а!, 1338). '

Как показано в таблице 3, введение МоАт 9В9 в больших дозах не вызывает значительного, увеличения ни одного из отих паракзтров• в сравнении с.введением 5'оАт ЗА5, которьз использовались как контрольные шщуноглобулишх. В качества положительного контроля легочного повреждения использовали . альфа-нафгилтноыочевину (АНТМ), которую ■ ввутрибряЕшто вводили в крыс в дозе 20' иг/кг веса- крысы (ИаШп ег а!, 198о). В этой случае откачено резкое увеличение весового коэффщента легких и увеличение накопления в легких [1251]-БСА.

■'■'и' ■:;■■'-■

Таблица 3. Нёповреждакший характер накопления в легких крысы МоАт 9В9.

! препараты ! вес легких ! ---------х ЮО ! вес тела ! накопление [-^iJ-ECA % дозы / гр. ткани i

9В9 0, 66 ± 0, 02 I, 26 ± 0, 05

ЗА5 0, 64 ± 0, 08 2, 30 + 0, 47

ЗФР 0, 59 ± 0, 07 I, 86 ± 0,16

АНШ I, 21 ± 0, II* 4, 20 ± 0, 3*

* р< О, 01 по сравнению с отрицательным контролем (ЗФР)

Крысам через хвостовую вену в ,0, 5 т ЗФР вводили разные препараты: I) МоАт 9В9 против АПФ (20 мг/кг веса), 2) МоАт ЗА5 против АПФ (20 мг/кг веса), ' ■ 3) ЗФР - использовали как отрицательный контроль, 4) Внутрибршдшно в tween-80 вводили АНТМ (20 мг/кг веса). Через 24 часа после введения антител и через 4 часа послетвведения,-Жга крысам через хвостовую вену вводили БСА, 1Л9Н9ННЫЙ: Гj (10° имп/мш/ккг белка). Через час после введения [ I ]—БСА крыс забивали и определяли параметры легочного повреждения.

. Введение МоАт 9ВЭ, при отсутствии повреждающего эффекта, тем не ' менее вызывает" значительное падение активности АПФ в легких, сопровоздающееся увеличением активности АПФ в сызоротке крови крыс«, (рис. 3)'. Эффект возрастает при повышении дозы р достигает максимума при введении 10. мг ка кг веса тела. Аналогичный эффект вызывает введение 10 кг '¿оДт 9В?-на кг веса тела в организм сирийского хомячка (не показано). .Дальнейшее повышение дозы (до 300 мг/кг веса тела крысы и, до 30 мг/кг веса хомячка) не приводит к увеличению эффекта, возможно, из-за насыщения центров связывания в легком. . . ..

В. настоящее время точный механизм уменьшения активности АПФ В легких и увеличения в крови после введения МоАт 9В9 in vivo не

15' ' . ■ ■■!!/ ■■

■ . Y ; "'.' .'•. I/i \

ясен. Можно предположить, что МоАт 9В9 могут значительно стимулировать "слущивание" антигена с поверхности эндотелия капиляров легких. По крайней мере, эти эффекты наблюдались для МоАт 9В9 в культуре эндотелиальных клеток . крупных сосудов человека (0ап11оу ег а1, 1988а).

N М

(О «

Е»

и \

Ч

<и 1—-

е • с

<3

Ен О О

В

И

а «

01- I

о

дни введения

Рисунок 3. Эффект многократного введения МоАт 9В9 на активность АПФ в гомогенате-легких и сыворотке крови крыса / ~

Крысам через хвостовую вену вводили 10 мг/кг/день МоАт 9В9. Через 24 часа после одного, двух- и трехкратного, введения МоАт 9ВЭ крыс забивали и определяли активность АПФ в гомогенате легких и сыворотке крови флюориметрически.

Таким образом полученные данные свидетельствуют, что введение МоАт 9В9 в организм экспериментальных животных не вызывает существенных повреждений, но вызывает уменьшение активности АПФ в легких и увеличение в крови. Эти данные в совокупности с результатами о неповреждающем действии МоАт 9В9 на эндотелий сосудов in vitro в присутствии комплемента (oanilov et а 1, 1988а), а также данные, полученные в лаборатории лекарственной токсикологии ИЭК БКНЦ АМН СССР, об отсутствии острой токсичности препаратов МоАт 9В9 свидетельствуют о 'возможности использования этих антител в диагностике.

4. Получение Fab'о и ^»ь фрагментов МоАт ЭВ9 и сравнение их накопления в легких с целыми молекулами антител. Приведенные выше, результаты получены с использованием целых молекул антител 9В9, которые являются мышиными- иммуноглобулинами. Однако, введение в кровоток человека мышиных иммуноглобулинов часто вызывает аллергическую реакцию, особенно при повторных введениях. Одним . из. возможных подходов к уменьшению иммунного ответа может быть использование Fab'2 и Fab фрагментов вместо целых молекул иммуноглобулинов, фрагменты лишены Fc части,- которая и определяет в основном степень противовидового иммунного ответа.

Используя очистку на prote<n-А сефзрозе и высокоэффективную жидкостную хроматографию, нам удалось получить чистые препараты МоАт ЭВЭ и их Feb* 2 и Fab' фрагментов. Электрофорэтичэская чистота полученных .фрагментов более 95 %'(не показано). Мы проверили антиген-связывающув активность полученных фрагментов in vitro в тесте иммуносорбшш (рисунок 4). Обращает на себя внимание резкое уменьшение антиген-свяэывагощэй активности Fab фрагментов.

Рисунок 4. Антиген-связываюшая активность Fab* 2 и Fab фрагментов МоАт ' 9В9 In vitro в тесте иммуносорбции. .

Таблица 4. Накопление в легких крыс МоАт 9В9 и их Fab' 2 и

Fab фрагментов, меченнйх изотопом C^l].

1Гвведёш?Г дозы ' Гкоэффйц-нт

вводимый !----------! —------------! --------! локали-

препарат !(на легкое !( /г крови !/г легкого!^ зации

[ 1251 ] -9В9 30. 4±3. 3 1.5±Q I 21. 2±4. 3 14.1±3. О tI25l]-Fab'2 20. 3±1. 6 I.O±ai* 17. 9+3. 3 17. 9±3.8 tI25l]-Fab 4. 2±0l2* 0.73*0.03* ' 3. 0±0.3* 4. I±Q 4*

* р < 0, 05 по сравнению с целыми молекулами МоАт 9В9.

„ ■ ;КЙЕам чеРез хвостоыую вену в 0,5 мл ЗФР с р,т2=%,БСА вводили МоАт 9В9 и их Fab'2 и Fab фрагменты, меченные [ l] по I мкг СЮ иш/мин). через 1,5 часа после введения указанных препаратов, крыс забивали и определяли радиоактивность крови и легких.

г • • Г'

>4

га о I

«3 ;

О

О?

9

га

т §

X

20

10

• р < олэ

' ЕЭ контроль

О АНШ 5Ц

ц • -ь

й

г»г-

ЕЙГ*! ¿5 Ч Й"*! ЙП

и

х

5 1

•

Т

печень сгрдцо леггкс потаг селезсяка

Еохщюпь АНШ

Рисунок .5. Накопление МоАт 9В9 и БСА, меченных [ 1251 ] в легких крыс после введения альфа-нафтилтиошчевины.

Крысам внутрибрюшинно вводили АНТМ (20 мг/кг веса) в С15 мл и^ееп-оО. Через 4 часа после введения АНТМ крысам через хваетовую вену вводили в 0, 5'мл ЗФР МоАт 9В9 или БСА, меча иные I1 н] (I мкг, 10 имп/шн). Через I час после введения указанных препаратов крыс забивали и определяли радиоактивность в легких и крови. • ' -

Аналогичное уменьшение накопления в легких МоАт 9В9 было обнаружено и в других исследованных, моделях легочного повреждения: при введении эндотоксина, форбол шристил ацетата и фактора агрегации тромбоцитов (таб. 5).

Таким образом, проведенные эксперименты показывают, что при всех исследованных моделях повреждения легких отмечается статистически достоверное снижение'накопления в легких МоАт 9В9. В случае повреждения легких эндотоксином это накопление было наиболее чувствительным "маркеров* повреждения, так как в этой модели не изменяется ни весовой коэффицент легких, ни накопление контрольных иммуноглобулинов, а только изменяется накопление в легких МоАт 9В9.

Таблица 5. Накопление МоАт 9В9 в легких крыс с разными моделями повреждения.

! параметры «Гиораспределекия 1.ЪАт 9В9 ! ! (в процентах от контроля) !(

повреж- ! процент от введений дозы ! дающие ! —-------------------! агенты ! /г крови ! /г легких ! коэффициент ! локализации ! 1 ' 1 весовой коэффициент легких

АНТМ (20 мг/кг) П0±6 71±4 65±8** 179±16**

Эндотоксин (4 мг/кг) 89±П 49±П . 55±12* * ■ И2±17

, ФМА ч (90 мкг/кг) 92±9 46±б*** 51±9"» 169±20

■ ФАТ , (40 мкг/кг) 154±31 61±1* 39±5** . И8±14

* р< О, 05 по сравнению с контролем для каждой группы р< 0,01 р< 0,001

Существует насколько возможных причин,объясняющих уменьшение накопления антител 9В9 в легких при " повреждении. Повреждающие агенты могут:' I) .модифицировать на молекуле АПФ эпитопы для МоАт 9ВЭ, 2) изменять синтез и секрецию АПФ эндотелием легких, 3) вызывать гибель и "слущивание" эндотелия легких, 4) "прикрывать" АПФ адгезированными к эндотелию лейкоцитами.

Однако независимо от причин эти результаты указывают, что накопление в легких МоАт 9ВЭ может оказаться очень чувствительным "маркером" повреждения сосудов легких при различных легочных патологиях.

1. Моноклональные антитела против АПФ человека (9В9) избирательнс накапливается в легких при введении «х в кровоток. Эффеыивнасх* накопления этих антител в легких до - 40 % от введенной дозы; свешфиншсхь накопления (концентрация МоАт 9В9 в легких) - в 2040 раз выше, чей в крови и других органах и тканях.

2. Исследована фармакокинетика МоАт 9В9, введенных в кровоток различных видов животных (крысы, сирийского хомячка и кошки) и изучены количественные параметры накопления этих антител в легких.

3. Введение МоАт 9В9 в дозе до 300 мг/кг веса не вызывает повреждения легких в отличие от поликлональных антител; однако, при этом активность АПФ в легких падает на 40-60 %, а в сыворотке крови активность АПФ достоверно, повышается на 50^100%.

4. Эффективность и специфичность накопления фрагментов ЫоАт 9В£ меченных разными изотопами-[ ], и £"яТс], существенно снижается по сравнении с целыми молекулами МоАт 9В9.

5. При всех исследованных иода лях повреждения легких отмечается статистически достоверное снижение накопления в легких МоАт- 9ВЭ.

6. Высокая специфичность и эффективность накопления антител 9ВЭ в легких, отсутствие выраженных патологических изменений при их введении позволяют предполагать возможность использования этих антител для: а) визуализации сосудистого русла легких радиоязотошшш методами с помощью иммуносцинтиграфии, б) дня оценки повреждения сосудов легких ори различных легочных патологиях, в) в качестве вектора для направленной доставки лекарств к легкгаь . . ; ■

Сносок работ, опубликованных по тэш дассвртадшь

Данилове. М., Музыкантов Е Р., Мартынов А. Е , Сахаров НЕ, почина Е К , Молдобаева А. К , Духанина Е А , Литвин Ф. Е , Трахт L Н. Специфическое накопление моноклональных антител против АПФ в югикх крыса //ДАН СССР. -1988. -Т. ЗОГ -К5 4. -С. 1003-1007. !. Danilov S. М., Mol dobaeva А. К., Dzhunkovskaya А. N. , D. Yuilan., itochina E.N., Sakharov I. Yu. .Regulation of ACE activity by peciflc monoclonal antibodies. //The international symposium on tCE Inhibition: Abstracts. - London. - 1989. - * FC62. 1. Danilov S. M., Hoi dobaeva A. K., Dzhunkovshaya A. N., D. Yuilan., Itochina E. N., Sakharov I. Yu. Immunomodul ation of angiotensln-:onverting enzyme activity. ' .// 4^ European meeting of lypertension: Abstracts. -Milano. -r 1989. - № 117. I. Данилов. С. M., Алликметс Е. Е , Сахаров'И. Е, Духанина Е А., ¿олдобаева А. К, Аточина Е Н., Трахт НЕ Штамм гибридных сультивируемых клеток ЗА5 - продуцент мышиных антител против АЛФ. '/ Авторское свидетельство N 1496266. -' 1989.

5. Danilov S., Muzykantov V., K1 ibanov. A., . Atochi na E., Puchnina , Arkhapchev.Yu., SerglenkoV. Pulmonary uptake of radiolabeled monoclonal antibody to ACE for the evalution of lung Hi crovascular endothelium. // Eur. J. of Nuclear Medicine. -[989. - V. 15. -tfi 8. - P. 441.

5. HyzykantovV., Puchnina E., Atochina £., Sakharov.I., Danilov 3. Evaluation" of the lung microvascular . status using radiolabeled monoclonal antibody to ACE. //Advances in vascular Jathology. A. Strano, S. Novo, Eds. Excerpta Medlca, Amsterdam -<Y - Oxford. - 1989. - V. 2. - P. II95-I20Q

7. Danilov S., Atochlna E., Hiemlsch H., Sllnkin M., Andjan A. v Kujykantov V., Oeichman fi. Lung accumulation of radiolabeled monoclonal antibody to ACE decreases upon lung metastasis formation. //Eur. J. of Mucl. Medl cl ne. - 1990. -V. 16. -if. 7. - P. 467.

8. Danilov S., Atochina E., Hlemisch H., Andjan A., Oeichman G., Huzykantov V. Lung vessel Injury: e.valution using radiolabeled monoclonal antibody to ACE. // Eur. J. of Nuclear Medicine. -1990. -V. 16. Suppl. - P. SI49.

2am-¿SYQ T«pa» - itx, OWK Hno «•'«icWHoMowMuin^