Эпитопное картирование С-концевого домена ангиотензин-превращающего фермента человека

Наперова, Ирина Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Эпитопное картирование С-концевого домена ангиотензин-превращающего фермента человека
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Эпитопное картирование С-концевого домена ангиотензин-превращающего фермента человека"

003492593

На правах рукописи

НАПЕРОВА ИРИНА АЛЕКСАНДРОВНА

ЭПИТОПНОЕ КАРТИРОВАНИЕ С-КОНЦЕВОГО ДОМЕНА АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА ЧЕЛОВЕКА

03.00.23 - биотехнология 03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2009

003492593

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова

Научные руководители:

кандидат химических наук, ведущий научный сотрудник Кост O.A. доктор биологических наук Данилов С.М.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Румш Л.Д. доктор биологических наук, профессор Мягкова М.А.

Защита состоится «22» декабря 2009 года в 1600 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан « » ноября 2009 года И. о. ученого секретаря

Ведущая организация:

Институт биохимии им. А. Н. Баха РАН

диссертационного совета д.х.н., проф.

A.B. Гусаков

Актуальность темы. Моноклональные антитела (мАт) благодаря их селективности и чувствительности являются чрезвычайно важным инструментом при исследовании структурно-функциональных особенностей белков. В фундаментальных исследованиях мАт используются для идентификации и локализации белков, для дифференциации клеток различных типов, для очистки белка или для исследования экспрессии белков. Эпитопное картирование - определение областей на поверхности белковой глобулы, к которым специфичны различные мАт - является важным шагом для характеристики взаимодействия антиген-антитело. Картирование важно для определения специфичности антител, для предсказания перекрестной реактивности, при разработке вакцин и дизайне лекарственных средств, для понимания фундаментальных аспектов белок-белковых взаимодействий.

Ангиотензин-превращающий фермент (АПФ, КФ 3.4.15.1) - 2п-зависимая пешидил-дипептидаза, состоящая из двух доменов (И- и С-) в составе одной полипептидной цепи, является одним из главных регуляторов кровяного давления, вовлечен в метаболизм нейропептидов, иммунную и репродуктивную функции. В связи с этим новое знание свойств и особенностей этого фермента может иметь терапевтическое будущее.

Показано, что в крови людей содержатся в низких концентрациях аутоантитела практически ко всем группам эндогенных антигенов. При развитии таких патологий, как системный склероз, красная волчанка, в крови увеличивается уровень аутоантител к АПФ [Станислав и др., 2001; Ва1уазшкоуа е( а!., 2002]. Таким образом, данные антитела могут служить индикатором развития патологии. Поэтому картирование эпитопов мАт, специфичных к разным областям на поверхности молекулы фермента, возможно, даст шанс понять развитие данных заболеваний на молекулярном уровне, а также применить полученные знания для диагностики этих патологий.

Ранее была получена панель из 8 мАт к М-домену АПФ и идентифицированы их эпитопы связывания на поверхности белка. Работы по эпитопному картированию Ы-домена продемонстрировали важный исследовательский, диагностический и даже терапевтический потенциал данных антител: мАт были успешно использованы для количественного определения АПФ в растворе методом Е1Л8А и на поверхности клеток жидкостной цитометрией [Т)аш1оу е! а!., 2003], для исследования структуры и функций АПФ [Бк^еНо е1 а]., 2006; Ва1уазшкоуа е1 а1., 2007], для доставки ферментов к легочному эндотелию, как метод диагностики легочно-сосудистых заболеваний р5аш1оу й а1., 1989]. С помощью иммунопреципитации клеток мАт ВВ9 к М-домену АПФ было показано, что АПФ экспрессируется гематопоэтическими клетками на всех стадиях гематопоэза [Датз11а\у е1 а1., 2001]. Таким образом, возможно, АПФ участвует в физиологической регуляции гематопоэза.

В то же время С-домен АПФ остается практически не изученным с иммунохимической точки зрения.

Целью работы явилось эпитопное картирование С-домена АПФ с помощью панели из 8 мАт, специфичных к С-домену фермента; определение областей на поверхности С-домена, пространственно сближенных с N-доменом, и построение на основе этих данных модели двудоменного АПФ; иммунохимическая характеристика АПФ в норме и при развитии ряда системных заболеваний.

Научная новизна и практическая значимость. Определена конкурентность связывания панели из 8 мАт, специфичных к С-домену АПФ, с тестикулярным АПФ (тАПФ), представляющим собой С-домен, содержащий уникальную N-концевую 36-аминокислотную последовательность. Выявлены три пары мАт, эпитопы связывания которых перекрываются друг с другом на поверхности С-домена фермента в значительной степени. На основе полученных данных построена диаграмма, показывающая конкурентный и неконкурентный характер связывания мАт с С-доменом АПФ.

Выявлены три пары мАт, которые, связываясь с АПФ человека, не связываются с АПФ шимпанзе, С-домен которого отличается от С-домена человека двумя заменами аминокислотных остатков. Проведен анализ связывания мАт с пятью химерами АПФ, одна из которых содержала N-домен и 125 аминокислотных остатков из С-домена, остальные четыре представляли собой С-домен, в котором ряд аминокислотных остатков заменен на гомологичные из N-домена, и пятью мутантами тАПФ, один из которых содержал замену Asp616Leu, остальные - замены остатков Asn некоторых потенциальных сайтов гликозилирования на остатки Gin.

На основе полученных данных предложено расположение эпитопов связывания 8 мАт на поверхности С-домена фермента.

Выявлены мАт 4ЕЗ, ингибирующие активность тестикулярного АПФ. Для ряда мАт определены константы диссоциации комплексов АПФ-мАт.

Выявлены мАт 1Е10, эпитоп связывания которых на поверхности С-домена прикрыт N-доменом в составе полноразмерного фермента. На основе конкуренции мАт, специфичных к разным доменам фермента, за связывание с соматическим АПФ (сАПФ), выявлены участки на поверхности N- и С-доменов АПФ, пространственно сближенные друг по отношению к другу в составе полноразмерного фермента.

На основе экспериментальных данных впервые предложена модель двудоменного фермента.

Анализ образцов АПФ из почек, легких и семенной жидкости MALDI-TOF спектрометрией показал, что в АПФ из почек и легких гликозилирован потенциальный сайт гликозилирования Asn685, входящий в эпитопы связывания мАт 3F11 и 2Н9, а в АПФ из семенной жидкости гликозилирован потенциальный сайт гликозилирования Asn666, располагающийся в эпитопах связывания мАт 1Е10 и 4ЕЗ.

Впервые показано различное связывание мАт с соматическим АПФ из различных тканей и биологических жидкостей: почек, легких, сыворотки и семенной жидкости. Более того, показано, что связывание некоторых мАт с АПФ плазмы крови в норме (АПФ продуцируют эндотелиальные клетки) и при развитии патологии - саркоидоза и болезни Гоше (дополнительным источником АПФ в кровь являются саркоидные гранулемы и макрофаги) - различается. Таким образом, показана возможность применения мАт для выявления АПФ, продуцируемого другими клетками (не эндотелием, как в норме) в крови, полученные данные, возможно, в будущем могут быть использованы для упрощения диагностики саркоидоза и болезни Гоше.

Мутанты и химеры АПФ были любезно предоставлены профессором Е. Sturrock из Университета Кейптауна, ЮАР; моделирование углеводной цепи, а также открытой конформации С-домена проводили в рамках совместной работы с к.ф.н., с.н.с. Упоровым И.В., плазма крови пациентов с саркоидозом и хроническим обструктивным бронхитом, а также донорская плазма были предоставлены Институтом Фтизиопульмонологии ММА им. Сеченова, плазма крови пациентов с болезнью Гоше - Медико-генетическим научным центром РАМН; статистический анализ результатов проводили в рамках совместной работы с к.ф.-м.н., доц. Яровой Е.Б. (Мех.-мат. ф-т, МГУ).

Апробация работы. Основные результаты работы представлены на Международной конференции молодых ученых по фундаментальным наукам «ЛОМОНОСОВ - 2006» (Москва, 2006); Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2007); VI Симпозиуме по химии протеолитических ферментов (Москва, 2007); IV Московском международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2007); American Thoracic Society International Conference (Toronto, 2008); Всероссийской школе-семинаре "Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы" (Белгород, 2008); V Московском международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2009); International Conference "Biocatalysis-2009: Fundamentals & Applications" (Arkhangelsk, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ.

Объём и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (Главы 1-3), экспериментальной части (Глава 4), описывающей материалы и методы исследования, результатов и их обсуждения (Главы 5-10), выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 151 страницах, содержит 4 таблицы и 51 рисунок. Список литературы включает 178 ссылок.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭПИТОПОВ СВЯЗЫВАНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ НА ПОВЕРХНОСТИ С-ДОМЕНА АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА

Для характеристики связывания мАт с АПФ был выбран метод иммуносорбции, за образованием комплексов фермент-антитело следили по активности фермента, связанного с мАт, сорбированных на планшете. Для этого в лунках полистиролового планшета сорбировали антивидовые антитела — иммуноглобулины козла против иммуноглобулинов мыши, затем мАт (мышиные иммуноглобулины) и, наконец, АПФ. При этом была выбрана насыщающая концентрация иммуноглобулинов козла 10 мкг/мл, которой, как показано ранее, достаточно, чтобы достичь насыщения лунок планшета, концентрации мАт и тАПФ варьировали. В качестве субстрата при определении активности АПФ использовали Ир-Шэ-Ьеи или Z-Phe-His-Leu, дающие при гидролизе продукт Шв-Ьеи, накопление которого наблюдали флюорометрически. В результате подбора условий иммуносорбции нами были выбраны следующие концентрации: 3 мкг/мл мАт и 1-6 нМ фермента.

Анализ связывания мАт с рекомбинантным тАПФ показал, что связывание различных мАт с тАПФ отличается в 5 раз (рис. 1).

5 3

а>

2. ч

о ® 2 ^

4 8. -815

3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0

1ВЗ 1В8 ЗРЮ 1Е10 4ЕЗ 2Н9 ЗР11 2В11 Моноклональные антитела

Рис. 1. Связывание мАт с рекомбинантным тАПФ.

Относительно низкий сигнал флюоресценции при связывании тАПФ с мАт, например, 1ВЗ, 1Е10, 4ЕЗ и 3¥ 11 мог быть вызван как худшими константами связывания этих мАт с тАПФ, так и подавлением активности тАПФ антителами. В последнем случае сигнал флюоресценции не будет пропорционален истинному числу комплексов фермент-антитело, поскольку мы оценивали связывание фермента с мАт по активности фермента, измеряемой на планшетах.

При определении активности еАПФ при связывании с мАт с использованием двух субстратов Шр-Шв-Ьеи и 2-Р11е-ЬП5-Ьеи было показано, что отношение активностей тАПФ, связанного с мАт 1Е10 и 4ЕЗ, по этим двум субстратам (2-РЬе-Н13-Ьеи/Н1р-Н1$-Ьеи) составляет около 1,5 (рис. 2), в то время как для других мАт это отношение составляет 1.

1ВЗ 1В8 3F10 1E10 4E3 2Н9 3F11 2В11 Моноклональные антитела

Рис. 2. Отношение активности тАПФ, связанного с мАт, по субстрату 2-Н1р-ЬПз-Ьеи к активности по субстрату Ир-Мэ-Ьеи.

Поскольку известно, что 2-РЬе-Ш8-Ьеи/Н1р-Н15-Ьеи для сАПФ равно 1, для тАПФ - 0,7, а для >}-домена - 4,5 [Г>аш1оу е! а]., 2008], то, возможно, мАт 1Е10 и 4ЕЗ ингибируют частично активность С-домена АПФ. Данные мАт, а также мАт 1ВЗ и ЗП1 нами были проверены на наличие ингибирующей активности в растворе и выявлено одно мАт - мАт 4ЕЗ, которые ингибировали активность тАПФ на 40%. Таким образом, мАт 1ВЗ и ЗН1 не оказывали ингибирующего действия на активность тАПФ, мАт 4ЕЗ инигибировали активность фермента как в растворе, так и на планшете, в то время как мАт 1Е10 подавляли активность С-домена АПФ только на поверхности планшета.

Для ряда мАт нами были определены константы диссоциации комплексов фермент-антитело для тестикулярного нативного и рекомбинантного АПФ методом иммуносорбции, описанным выше (табл. 1).

АПФ мАт Кдисс., нМ

тАПФ нат.* 1В8 4,1±0,5

2Н9 1,6±0,3

1ВЗ 1,9±0,2

3F11 4,3±0,5

тАПФ рек.* 1В8 3,1±0,б

2Н9 2,8±0,5

сАПФ** 1В8 5,4±0,3

Табл. 1. Константы диссоциации комплексов фермент-антитело, определенные методом иммуносорбции * и методом плазмонного резонанса **.

Для мАт 1В8 также была определена константа диссоциации комплексов с сАПФ методом плазменного резонанса. В этом случае на поверхности чипа фиксировали поликлональные антитела козла против иммуноглобулинов мыши, затем связывали мАт 1В8 с поликлональными антителами и, наконец, сАПФ из семенной жидкости. Следует отметить, что константы диссоциации комплексов АПФ-мАт, определенные в условиях, когда лиганд (мАт) иммобилизован (на поверхности планшета или чипа), могут отличаться от констант диссоциации, определенных в растворе.

Для определения количества антигенных областей на поверхности фермента нами была проанализирована способность мАт конкурировать друг с другом за связывание с рекомбинантным тАПФ. Для этого на поверхности полистиролового планшета сорбировали мАт (тестируемые мАт), отдельно в растворе инкубировали тАПФ с избытком мАт (конкурирующие мАт) и выявляли связывание комплексов тАПФ-конкурирующее мАт с тестируемыми мАт. Если комплексы тАПФ-конкурирующее мАт связывались с тестируемыми мАт так же, как и свободный фермент, то мы считали, что эпитопы связывания тестируемых и конкурирующих антител не перекрываются. В том случае, если комплексы тАПФ-конкурирующее мАт не связывались с тестируемыми мАт, то можно утверждать, что эпитопы связывания этих антител в значительной степени перекрываются. Если происходило лишь ухудшение связывания комплексов тАПФ-конкурирующее мАт с тестируемыми мАт, то можно заключить, что эпитопы связывания двух мАт перекрываются частично. На практике мы считали, что эпитопы связывания двух мАт практически полностью перекрываются, если наблюдается ингибирование связывания комплексов "тАПФ-конкурирующее антитело" более чем на 75%, т.е. степень перекрывания эпитопов связывания двух антител была больше 75%. Степень ингибирования связывания менее чем на 25% свидетельствовала о слабой конкуренции двух мАт. Если степень ингибирования связывания была меньше 10%, мы считали, что это значение входит в ошибку эксперимента и мАт не конкурируют за связывание с тАПФ. Для каждой пары мАт была определена способность конкурировать друг с другом за связывание с тАПФ, при этом оба мАт из каждой пары использовали и как конкурирующие, и как тестируемые.

Полученные результаты представлены на рис. 3, где показана степень ингибирования конкурирующими мАт связывания тестируемых мАт с ферментом.

Рассмотрим, например, тестируемые мАт 2Н9: мАт 3F11 блокируют связывание мАт 2Н9 с тАПФ (рис. 3), мАт 1Е10 и 4ЕЗ ухудшают связывание мАт 2Н9 с тАПФ, мАт 2В11 также ухудшают связывание мАт 2Н9 с тАПФ, но в меньшей степени, а остальные антитела не влияют на связывание мАт 2Н9 с тАПФ. Таким образом, для каждой пары мАт была определена способность конкурировать друг с другом за связывание с тАПФ. Важно, что при этом оба мАт из каждой пары использовали и как конкурирующие, и как тестируемые.

о 100

я ш 50

ц 0

о 100

н со

X ш 50

н X 4t

® т- 100

т-U. 50

X л ГО 0

5 о> 100

X X 50

о см

§ 0

о т- 100

X о т- DQ 50

5 ем 0

а 1В8 100

и г 50

о> 0

>. 100

о. о

5 н т- U. 50

о 0) 00 0

1- 100

со

ш 50

т- 0

ж.

П п

1Д

т- ЮО-1

5 "

CM n J—

П г~1

Рис. 3. Ингибирование конкурирующими мАт связывания тАПФ с тестируемыми мАт. Черным цветом отмечены те мАт, которые конкурировали друг с другом за связывание с тАПФ более чем на 75%.

1 ЕЮ 4ЕЗ 3F11 2Н9 2В11 1В8 3F10 1ВЗ Конкурирующие моноклонапьные антитела

В результате проведенных экспериментов были выявлены три пары мАт - 1В8 и 3F10, 1Е10 и 4ЕЗ, 2Н9 и 3F11 - которые значительно конкурировали за связывание с тАПФ, с другой стороны пары мАт 1ВЗ и 2Н9, 3F10 и 3F11, 1В8 и 2В11 не конкурировали друг с другом за связывание с тАПФ.

На основании полученных данных была построена диаграмма, показывающая конкурентный и неконкурентный характер связывания мАт с тАПФ (рис. 4).

4ЕЗ

1Е10

2Н9

1В8

Рис. 4. Диаграмма, показывающая конкурентный и неконкурентный характер связывания мАт с тАПФ.

3F10

Диаграмма отражает то, что эпитопы связывания пяти мАт (1Е10, 2В11, 2Н9, 4ЕЗ и 3F11) находятся в одной области на поверхности С-домена АПФ, эпитопы связывания мАт 1В8 и 3F10 в другой области на поверхности АПФ, причем мАт 1Е10 и 4ЕЗ, 2Н9 и 3F11, 1В8 и 3F10 конкурируют друг с другом за связывание с тАПФ в значительной степени, и эпитоп связывания мАт 1ВЗ практически не перекрывается с эпитопами связывания остальных антител.

Чтобы привязать полученную диаграмму к реальной поверхности С-домена АПФ, прежде всего, мы сравнили первичные аминокислотные последовательности человека и других животных. Оказалось, что С-домены человека и шимпанзе отличаются друг от друга наименьшим количеством аминокислотных остатков: Lys677 в С-домене человека заменен на Arg в С-домене шимпанзе, а Рго730 - на Thr (рис. 5).

человек шимпанзе

671 681 691

YGTQARKFDV NQLQNTTIKR IIKKVQDLER YGTQARKFDV NQLQNTTIKR IIKKVQDLER

701 711 721

AALPAQELEE YNKILLDMET TYSVATVCHi1 AALPAQELEE YNKILLDMET TYSVATVCHT

Рис. 5. Сравнение аминокислотных последовательностей С-доменов АПФ человека и шимпанзе.

710.

Эти остатки располагаются на поверхности С-домена АПФ на противоположных концах белковой глобулы (рис. 6). Анализ связывания мАт с АПФ сыворотки крови человека и шимпанзе показал, что три мАт - 1В8, 3F10 и 1Е10, связываясь с АПФ человека, не узнают АПФ шимпанзе. Так как эпитопы связывания мАт 1В8 и 3F10 перекрываются

значительно, а мАт 1Е10 не конкурируют с мАт 1В8 и 3F10 за связывание с ферментом, можно предположить, что один из остатков, отличающихся у С-доменов АПФ человека и шимпанзе, входит в эпитоп мАт 1Е10, а другой-в эпитопы мАт 1В8 h3F10

¥ ^ YW

Рис. 6. Структура С-домена АПФ (PDB 108А [Natesh et а!. 2003]).

1.4

1.2 -1.0 0.8 ~ 0.6

I 0.4 о

0.2

0.0

д.

Чтобы определить, какая аминокислота отвечает за связывание каких мАт, мы использовали мутант С-домена, содержащий замену Asp616Gly, и сравнили связывание мАт с этим мутантом со связыванием этих мАт с рекомбинантным тАПФ. Следует отметить, что остаток Asp616 располагается рядом с остатком Lys677 на поверхности С-домена АПФ (рис. 6). Полученные данные (рис. 7) позволили показать, что эта замена оказывает решающую роль при связывании мАт 1Е10 и частично ухудшает связывание мАт 2Н9 с тАПФ, но практически не влияет на связывание других мАт с тАПФ.

Таким образом,

можно полагать, что Asp616 входит в эпитопы связывания мАт 1Е10 и 2Н9, не играя, однако, решающей роли при связывании мАт 2Н9. Так как Asp616 на поверхности

С-домена АПФ располагается рядом с Lys677, то можно заключить, что в эпитоп связывания мАт 1Е10 входит именно Lys677, а не Рго730.

Значит, Рго730 участвует в формировании эпитопов связывания мАт 1В8 и 3F10. Для уточнения эпитопов связывания мАт был проведен анализ связывания всех мАт с химерами (рис. 8) и гликомутантами (рис. 9) АПФ:

• С1-163 Ndom - С-домен, у которого остатки 1-163 замещены на первый 141 аминокислотный остаток N-домена;

• С417-579 Ndom (остатки 993-1155 в нумерации по сАПФ) - С-домен, у которого остатки 993-1155 замещены на гомологичные из N-домена;

• С229-258 Ndom (остатки 805-834 в нумерации по сАПФ) - С-домен, у которого остатки 805-834 замещены на гомологичные из N-домена;

• Nfrl-737 - конструкция, состоящая из N-домена и 125 аминокислотных остатков С-домена;

• мутант тАПФ, у которого остатки 837AQH замещены на DRY;

• tACEA36-gl234 - тАПФ, у которого остаток Asn пятого (Asn913) и шестого (Asnll62) потенциальных сайтов гликозилирования замещены на остатки Gin;

• tACEA36-gl23 - тАПФ, у которого остаток Asn четвертого (Asn731), пятого (Asn913) и

1ВЗ 1В8 3F10 1Е10 4ЕЗ 2Н9 3F11 2В11 Монокпональные антитела

Рис. 7. Отношение связывания мАт с тАПФ Asp616Leu к связыванию мАт с тАПФ. F - сигнал флюоресценции.

• tACEA36-gl3 - тАПФ, у которого остатки Asn второго (Asn666), четвертого (Asn731), пятого (Asn913) и шестого (Asnll62) потенциальных сайтов гликозилирования замещены на остатки Gin;

• tACEA36-gl2 - тАПФ, у которого остатки Asn третьего (Asn685), четвертого (Asn731), пятого (Asn913) и шестого (Asnll62) потенциальных сайтов гликозилирования замещены на остатки Gin.

2.0

В 1.5

с < 1.0

0 5

та 0.0

2.0 -]

5 1.5

Ь 1.0

а. о 0.5 J

ь s 0.0

< 2.0 1

к 1 К

X го 1.0 -

ш 0.5

м « 0.0 -

га

I 2.0

а 1.5

о 1 0

О 0.5

0.0

01-163 Ndom /tACE

_ —.

"П

С225-227 Ndom / tACE

C229-258 Ndom/tACE

C417-579 Ndom/tACE

1B3 1B8 3F10 1E10 4E3 2H9 3F11 2B11

3.0 2.0 1.0 0.0

3.0 i 2.0 1.0 -0.0

g123/g1234

lil

g12/g123

g13 / g123

g1234/tACE?36

1B3 1B8 3F10 1E10 4E3 2H9 3F112B11

Моноклональные антитела

Рис. 8. Сравнение связывания мАт с различными химерами АПФ.

Рис. 9. Сравнение связывания мАт с гликомутантами АПФ.

Так, например, мАт 1Е10 являются единственными антителами, которые узнавали конструкцию Nfrl-737 и не узнавали химеру Cl-163 Ndom, что свидетельствует о том, что остатки, критичные для связывания данных мАт, располагаются на N-конце С-домена. Анализ связывания данных мАт с гликомутантами тАПФ показал, что замена остатков Asn потенциальных сайтов гликозилирования Asn666 и Asn685 на остатки Gin приводит к

значительному ухудшению связывания мАт 1Е10, что может говорить о том, что данные потенциальные сайты гликозилирования либо участвуют в формировании эпитопа мАт, либо находятся в непосредственной близости от него.

Другой пример - мАт 1В8 не связывались с Nfrl-737, что свидетельствует о том, что первые 125 аминокислотных остатков не входят в эпитоп связывания данных мАт. Связывание этих мАт ухудшалось с химерой С229-258 Ndom (восьмая а-спираль) по сравнению с тАЛФ, таким образом, возможно, некоторые остатки восьмой «-спирали участвуют в формировании эпитопов связывания мАт 1В8. Замена остатков AQH в С225-227 Ndom (остатки 827-839 в нумерации по соматическому АПФ) на DRY приводила к значительному снижению связывания мАт 1В8, а также замена Asn731, являющегося потенциальным сайтом гликозилирования, на Gin практически полностью отменяла связывание данных мАт. Таким образом, можно предположить, что некоторые из остатков восьмой tt-спирали, остатки 837-839, а также Asn731 формируют эпитоп связывания мАт 1В8.

На основании анализа совокупности данных по связыванию мАт с различными химерами и гликомутантами тАПФ мы уточнили расположение эпитопов связывания мАт и предложили конечный вариант расположения эпитопов связывания моноклональных антител на поверхности С-домена АПФ (рис. 10).

Рис. 10. Расположение эпитопов связывания моноклональных антител на поверхности С-домена АПФ. Зеленым отмечены потенциальные сайты гликозилирования.

2. МОДЕЛИРОВАНИЕ «ОТКРЫТОЙ» КОНФОРМАЦИИ С-ДОМЕНА АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА

Исследование трехмерной структуры недавно открытого структурного гомолога АПФ -фермента АПФ2 - показало, что при связывании лиганда в активном центре этот фермент претерпевает изменение конформации, называемое «hinge-bending movement», т.е. «открывание-закрывание» [Towler et al., 2004]. Кроме того, такой же механизм «открывания-закрывания» наблюдается и в случае других структурных гомологов АПФ и АПФ2: нейролизина [Brown et al., 2001] и тримет-олигопептидазы человека [Ray et al., 2004]. Ранее было высказано предположение о том, что для N-домена также характерно движение «открывания-закрывания» активного центра, чем было объяснено ингибирующее действие двух мАт - ЗА5 и i2H5 [Skirgello et al., 2006].

Как было отмечено выше, мАт 4ЕЗ обладают ингибирующим действием по отношению к тАПФ. Эпитоп связывания мАт 4ЕЗ располагается далеко от входов в туннель, в котором располагается активный центр С-домена. Для того чтобы проверить, не входят ли в эпитоп связывания мАт 4ЕЗ участки молекулы, которые являются подвижными при движении «открывания-закрывания» щели активного центра, чем может объясняться ингибирующее действие данных мАт, мы смоделировали «открытую» конформацию С-домена АПФ.

Модель «открытого» С-домена АПФ была построена с помощью программы Insight II (Accelrys Inc., San Diego, CA) на основе открытой конформации АПФ2 (PDB 1R42). В процессе построения модели проводилась энергетическая минимизация и молекулярная динамика полученной структуры. Поскольку «открытая» структура С-домена АПФ в безводной среде энергетически менее выгодная, чем «закрытая», то энергетическая минимизация со временем приводила к «закрыванию» полученной структуры. Поэтому для сохранения «открытой» конформации было выбрано время минимизации Inc.

Анализ расположения эпитопов связывания мАт на поверхности открытой конформации С-домена АПФ показал, что эпитоп связывания мАт 4ЕЗ располагается в области открывания щели активного центра (рис. 11), таким образом, мАт 4ЕЗ, связываясь с С-доменом в одной конформации, могут препятствовать движению «открывания-закрывания» молекулы и, соответственно, переходу белка в другую конформацию.

Следует отметить, что эпитопы мАт 1В8 и 3F10 располагаются в области одной из створок щели активного центра (рис. 11), но, видимо, конформационные изменения, происходящие в процессе связывания лиганда в активном центре фермента, не оказывают влияния на эпитопы связывания данных мАт.

Сравнение «открытой» и «закрытой» конформаций С-доменов, проведенное с помощью

программы DynDom по расчёту движения белковых молекул, позволило выявить участки молекулы, движущиеся при движении «открывания-закрывания» щели активного центра С-домена: 674-677, 692-693, 870-885, 989-990, 993-994, 1016-1017, 1106-1107, 1109-1110, 11261127, 1161-1162. Анализ расположения эпитопов мАт по отношению к подвижным участками молекулы показал, что подвижные участки принимают участие в формировании эпитопов mAtIEIO и частично мАт 4ЕЗ - остатки 674-677, мАт 3F11 и 2В11 - остатки 1161-1162 и мАт 1В8 и 3F10 - остатки 870-885. Так как эти мАт не обладают ингибирующим действием по отношению к С-домену АПФ, то, можно предположить, что данные остатки не критичны для связывания этих мАт.

Рис. 11. Эпитопы связывания моноклональных антител на поверхности: А. закрытой (РОВ Ю8А) и Б. открытой (построенной по гомологии с АПФ2) конформаций С-домена. Темным цветом отмечены остатки аминокислот, являющиеся подвижными при движении «открывания-закрывания» щели активного центра молекулы фермента.

3. ПРЕДСКАЗАНИЕ СТРУКТУРЫ ДВУДОМЕННОГО АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА

Структуры отдельных К- и С-доменов были расшифрованы [СоггасН гЬ а!., 2006; Ка1езЬ ^ а1., 2003], в то время как структура полноразмерной формы АПФ остается неизвестной. Нами была предпринята попытка предсказать структуру двудоменного фермента на основе анализа связывания мАт с однодоменными и двудоменной формами АПФ, а также конкуренции мАт к разным доменам фермента за связывание с двудоменным АПФ. В кристаллической структуре Ы-домена известно расположение 612-ого аминокислотного остатка, известная кристаллическая структура С-домена расшифрована с 616-ого аминокислотного остатка, таким образом, известно, в каких областях домены должны быть связаны друг с другом в составе полноразмерного фермента. При построении модели сАПФ мы соблюдали условие - между последним остатком М-домена (612) и первым С-домена (616) в расшифрованных структурах расстояние должно составлять не более 20 А. Кроме того, на основании существования отрицательной кооперативности и С-доменов в составе полноразмерного фермента мы предполагали, что домены в составе полноразмерного АПФ пространственно сближены. Необходимо было выявить участки на поверхности отдельных доменов АПФ, пространственно сближенных друг по отношению к другу.

Ранее было показано, что мАт Ш12, специфичные к Ы-домену АПФ, связываются с отдельным Ы-доменом гораздо лучше, чем с полноразмерной формой АПФ, на основе чего авторы предположили, что эпитоп связывания данного мАт располагается в той области на поверхности М-домена, в которой Ы-домен экранирован С-доменом в составе двудоменного АПФ [Ва1уазшкоуа й а1., 2007]. Мы попытались выявить аналогичные мАт, специфичные к С-домену.

В результате сравнения связывания мАт, специфичных к С-домену АПФ, с однодоменным тАПФ и двудоменным сАПФ были выявлены мАт 1Е10, которые связывались с отдельным С-доменом гораздо лучше, чем с двудоменным АПФ. Эпитоп мАт 1Е10 располагается в области >1-конца С-домена (рис. 10). Таким образом, можно заключить, что эпитоп мАт 1Е10 располагается в той области на поверхности С-домена АПФ, в которой С-домен экранируется Ы-доменом в составе полноразмерного фермента.

Для того чтобы выявить области па поверхности отдельных доменов, пространственно сближенные друг по отношению к другу в составе полноразмерного фермента, мы определяли конкуренцию мАт, специфичных к разным доменам фермента, за связывание с двудоменньм АПФ. При этом, когда в качестве тестируемых использовали мАт к С-домену, в качестве конкурирующих использовали мАт к Ы-домену и наоборот. Оказалось, что пары мАт 1Е10 (к С-домену) и Ш12 (к И-домену), ЗИП (к С-домену) и 9В9 (к И-домену)

достаточно сильно конкурировали друг с другом - степень подавления связывания тестируемых мАт с сАПФ конкурирующими мАт - более 50%. мАт 3F11 и ЗА5 конкурировали друг с другом за связывание с тАПФ меньше, но, тем не менее, степень ингибирования связывания была значительна и составила около 40%. Такие пары мАт, как 1G12 и 2В11, 2Н9 и 9В9, 1Е10 и ЗА5 не конкурировали друг с другом за связывание с сАПФ, поэтому мы считали, что эпитопы связывания данных мАт располагаются достаточно далеко на поверхности доменов АПФ в составе полноразмерного фермента.

На основании полученных данных по конкуренции мАт за связывание с сАПФ с помощью программы Discovery Studio ViewerPro была построена модель двудоменного АПФ (рис. 12), при этом при построении модели соблюдались следующие условия: расстояние между 612 аминокислотным остатком в N-домене и 616 аминокислотным остатком в С-домене не превышало 20 А, между остатком 531 в N-домене, располагающимся в центре эпитопа мАт 1G12, и остатком 678 в С-домене, располагающимся в центре эпитопа связывания мАт 1Е10, а также между остатком 339 в N-домене, находящимся в центре эпитопа связывания мАт 9В9, и остатком 1150 в С-домене, располагающимся в центре эпитопа связывания мАт 3F11, - не более 40 А.

Рис. 12. Модель двудоменного АПФ, учитывающая расположение эпитопов связывания мАт на поверхности N- и С-доменов АПФ.

С-домен

N-домен

4. ИММУНОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА В НОРМЕ И ПРИ РАЗВИТИИ ПАТОЛОГИИ

В гликопротеинах в состав антигенных детерминант может входить не только белковая, но и углеводная часть молекул. АПФ из любой ткани сильно гликозилирован, причем содержание и состав углеводов в АПФ сильно варьируется в зависимости от источника получения фермента. В рекомбинантном тАПФ N-гликаны являются, главным образом, биантенными фукозилированными цепями комплексного типа [Yu et al., 1997]. Однако в состав N-гликанов АПФ из других источников могут входить и высокоманнозные цепи [Ripka et al., 1993]. Степень сиалирования цепей комплексного типа также может сильно различаться у АПФ из разных тканей.

сАПФ содержит 17 потенциальных сайтов гликозилирования. Ранее было показано, что в сАПФ из почек 6 сайтов гликозилированы (Asn9, Asn25, Asn82, Asnll7, Asn480 на N-домене и Asn913 на С-домене) и один сайт не гликозилирован (Asnl 196 на С-домене) [Yu et al., 1997]. В данной работе с помощью MALDI-TOF спектрометрии в образцах АПФ из почек и легких были выявлены два гликозилированных сайта - Asn9, располагающийся на N-домене АПФ, и Asn685 на С-домене фермента. В АПФ из семенной жидкости были выявлены три гликозилированных сайта - тот же Asn9, а также Asn480 на N-домспс и Asn666 на С-домене фермента.

Потенциальные сайты гликозилирования входят в состав эпитопов связывания всех использованных нами мАт (рис. 9). Мы оценили площадь, которую может занимать углевод на поверхности белковой глобулы. Для этого был смоделирован сиалированный биантенный олигосахарид комплексного типа и с помощью молекулярного редактора программы Insight II ковалентно присоединен к каждому из потенциальных сайтов N-гликозилирования, находящемуся на поверхности С-домена АПФ (PDB 108А), после чего с помощью метода молекулярной динамики проводили моделирование движения гликана и окружающих его аминокислотных остатков белка, расположенных на расстоянии не более 15 Л от соответствующего остатка Asn. Оказалось, что углеводная цепь чаще всего контактирует с остатками Pro, Lys, Glu, Asn и Thr, реже с остатками Arg, Val, Leu, Gin.

При расчете площади контакта гликана с поверхностью белка, учитывали только те остатки аминокислот, от которых олигосахарид находился на расстоянии не более 5 À, этого расстояния достаточно только для того, чтобы между атомами могла поместиться молекула воды. Рассчитанная площадь контакта при фиксированном положении олигосахаридной цепи составила от 200 до 400 Â. Так как средняя площадь эпитопа связывания мАт на поверхности белка составляет около 800 Â2, можно заключить, что олигосахаридные цепи могут занимать значительную часть эпитопа связывания мАт.

1 1.5 ю

1-0

я 0.5 -

сыворотка/семенная жидкость

* 0.0 л

5.0 4.0

- 2.0 Н

5 10

5 0.0 к

S 3.0

о 2.0 й>

s 1.0

сыворотка/легкие

Так как АПФ из различных тканей и биологических жидкостей может быть по-разному гликозилирован, то можно ожидать различное связывание мАт с АПФ из различных источников.

На рис. 13 представлено связывание мАт с соматическим АПФ из различных тканей и биологических жидкостей. Видно, что с АПФ из разных органов мАт связываются по-разному, что, скорее всего, может объясняться именно различным гликозилированием сАПФ

(отсутствием или присутствием легкие/почки олигосахарида в сайтах гликозилирования, входящих в эпитопы связывания этих мАт, или различным составом углеводных цепей).

Так, например, мАт 1В8 связываются одинаково с АПФ из сыворотки, семенной жидкости и почек, но с АПФ из легких связываются гораздо хуже. Возможно, Asn731, входящий в эпитоп связывания мАт 1В8, одинаково гликозилирован в АПФ из сыворотки, семенной жидкости и почек, а в АПФ из легких гликозилирован иначе.

В нормальных условиях АПФ в плазме крови продуцируют эндотелиальные клетки. У здоровых доноров уровень АПФ в крови довольно стабилен, в то время как при развитии гранулематозных

заболеваний (например,

саркоидоза) или болезни Гоше наблюдается значительное

повышение уровня АПФ [Lieberman J., 1975]. Определение активности АПФ в крови сейчас является дополнительным методом для диагностики и мониторинга клинического протекания саркоидоза.

т А - лт л Т

■ ■ в ■ 1ЁЭ 111

семенная жидкость/почки

0.0

1ВЗ 1В8 3F10 1Е10 4ЕЗ 2Н9 3F11 2В11 Моноклональные антитела

Рис. 13. Связывание мАт с АПФ из различных тканей и биологических жидкостей

Саркоидоз и болезнь Гоше являются системньми заболеваниями, которые достаточно тяжело диагностировать. Считается, что дополнительным источником АПФ в крови при развитии болезни Гоше являются макрофаги, а при саркоидозе - саркоидные гранулемы. Таким образом, можно ожидать, что гликозилирование АПФ в крови при развитии этих болезней будет отличаться от гликозилирования АПФ в норме. В данной части работы мы предприняли попытку выявить изменения в топографии АПФ в крови в норме и при развитии саркоидоза и болезни Гоше в сравнении с хроническим обструктивным бронхитом (ХОБ), при котором уровень АПФ в крови не изменяется.

Прежде всего, мы определили активность в образцах плазмы больных саркоидозом, болезнью Гоше и ХОБ. Активность АПФ во всех образцах плазмы пациентов с болезнью Гоше (всего 6 образцов) была значительно повышена по сравнению с активностью АПФ в плазмах здоровых доноров. Среди больных саркоидозом (всего 12 образцов) были выявлены 4 образца плазмы с повышенной активностью фермента, активность АПФ в остальных образцах была такой же, как и в норме. Активность АПФ в образцах плазмы больных ХОБ не отличалась от активности АПФ в плазме здоровых доноров. С помощью пакета статистических программ SPSS 14.0 был проведен статистический анализ полученных результатов. При сравнении групп здоровых доноров и пациентов с саркоидозом и болезнью Гоше по основным показателям активности АПФ использовался непараметрический U критерий Манна-Уитни. Данный критерий используется для выявления различий в распределении показателей в том случае, когда тип распределения сложно восстановить по малым выборкам или распределение существенно отклоняется от нормы. В ходе исследования было выявлено достоверное повышение уровня активности АПФ в плазме пациентов с саркоидозом и болезнью Гоше (уровень значимости составил 0,019 и 0,000014, соответственно).

Для анализа связывания мАт с АПФ в норме и при развитии патологии использовали 8 мАт, специфичных к N-домену, и 8 мАт, специфичных к С-домену АПФ. В случае саркоидоза отдельно проводили сравнение связывания мАт с АПФ из плазмы крови пациентов с саркоидозом с повышенной активностью со связыванием мАт с АПФ из плазмы крови здоровых доноров и связывание мАт с АПФ из плазмы крови пациентов с саркоидозом с нормальной активностью АПФ со связыванием мАт с АПФ из плазмы крови здоровых доноров. Данные представлены на рис. 14.

Оказалось, связывание мАт 3G8, специфичных к N-домену АПФ, с АПФ плазмы крови достоверно увеличивалось при развитии болезни Гоше (уровень значимости составил 0,041).

В случае саркоидоза с повышенной активностью фермента связывание нескольких мАт - 3G8, 1G12, 6А12, специфичных к N-домену АПФ, и мАт 1ВЗ и 1Е10, специфичных к С-домену - с АПФ при развитии патологии отличалось от связывания с АПФ в норме. В то же

1.4

1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0

время, связывание лишь одного мАт к Ы-домену фермента - 308 - отличается с АПФ из плазмы крови больных саркоидозом с нормальной активностью фермента и АПФ из плазмы крови здоровых доноров. Таким образом, значительное изменение связывания АПФ с мАт при саркоидозе, по-видимому, характерно лишь для форм саркоидоза с высокой активностью АПФ.

Для определения

связывания мАт с АПФ из плазмы крови больных ХОБ и здоровых доноров были выбраны несколько мАт, связывание которых

отличалось с АПФ при развитии саркоидоза с повышенной активностью фермента и

Болезнь Гоше / норма

с: <

11?

п <

и О.

Саркоидоз, повышенная активность АПФ / норма

Саркоидоз, нормальная активность АПФ I норма

О X ~

" а о <

Моноклональные антитела

Рис. 14. Сравнение связывания мАт с АПФ в норме и при развитии болезни Гоше и саркоидоза. Р - сигнал флюоресценции.

норме. Изменения связывания мАт в случае развития ХОБ не наблюдалось. Таким образом, можно полагать, что при развитии ХОБ, не происходит выработка в кровь конформационно измененного АПФ.

Следует отметить, что эпитоп связывания мАт 308 содержит два потенциальных сайта гликозилирования — Аэп25 и Азп82, эпитопы связывания мАт Ю12 и 6А12 — потенциальный сайт гликозилирования Азп416, мАт 1ВЗ - Азп1196, мАт 1Е10 - Азпббб. Возможно, различное связывание мАт с АПФ в норме и при развитии болезни Гоше и саркоидоза объясняется различным гликозилированием АПФ в крови в норме н при развитии этих патологий.

Таким образом, нами показана возможность применения мАт для выявления АПФ в плазме крови пациентов с болезнью Гоше и саркоидозом, продуцируемого не эндотелием сосудов и легких (как у здоровых доноров), а макрофагами в случае болезни Гоше и саркоидными гранулемами при саркоидозе. Полученные данные в будущем могут быть использованы для упрощения диагностики саркоидоза и болезни Гоше.

выводы

1. Определено связывание 8 моноклональных антител с тестикулярным АПФ, выявлены антитела 4ЕЗ, ингибирующие активность тАПФ, определены константы диссоциации комплексов мАт 1ВЗ, 1В8, 2Н9 и 3F11 с нативным тАПФ, мАт 1В8 и 2Н9 с рекомбинантньм тАПФ и мАт 1В8 с С-доменом в составе соматического АПФ.

2. Определено расположение эпитопов связывания 8-ми моноклональных антител на поверхности С-домена ангиотензин-превращающего фермента человека на основе конкуренции антител к С-домену АПФ человека за связывание с тестикулярным АПФ, сравнения аминокислотных последовательностей С-доменов АПФ из различных организмов и анализа связывания антител с АПФ из различных организмов, а также анализа связывания моноклональных антител с различными химерами и мутантами фермента.

3. Проведен анализ связывания моноклональных антител с С-доменом и двудоменным АПФ, выявлены мАт 1Е10, эпитоп связывания которых на поверхности С-домена экранирован N-доменом в составе полноразмерного фермента, выявлены мАт, эпитопы которых на разных доменах АПФ пространственно сближены друг по отношению к другу в составе полноразмерного фермента. Предложена модель двудоменного АПФ.

4. Показаны различия в связывании моноклональных антител с нативным и рекомбинантным тестикулярным АПФ, а также с АПФ из различных тканей и биологических жидкостей человека.

5. Выявлены различия в связывании моноклональных антител с АПФ из сыворотки крови в норме и при развитии саркоидоза и болезни Гоше.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Наперова И.А., Балясникова И.В., Петров М.Н., Вахитова А.В., Евдокимов В В., Данилов С.М., Кост О.А. Характеристика связывания моноклональных антител с С-доменом ангиотензинпревращающего фермента человека. Биоорганическая химия, 2008,34, 3,358-364.

2. Naperova LA., Balyasnikova I.V., Schwartz D.E., Watcrmeyer J., Sturrock E.D., Kost O.A., Danilov S.M. Mapping of conformational mAb epitopes to the С domain of human angiotensin 1-converting enzyme (ACE). J. Proteome Res., 2008,7,3396-3411.

3. Наперова И.А., Кост O A., Данилов С М. Эпитопное картирование С-домена ангиотензинпревращающего фермента. Материалы Международной конференции молодых ученых по фундаментальным наукам «ЛОМОНОСОВ - 2006», Москва, 2006, том 2, с. 35.

4. Наперова И.А., Кост О.А., Данилов С М. Эпитопное картирование ангиотензин-превращающего фермента с помощью моноклональных антител. Материалы XIV Российского национального конгресса «Человек и лекарство», Москва, 2007, с. 854.

5. Наперова И.А., Петров М.Н., Вахитова А.В., Кост О.А., Данилов С.М. Структурный анализ С-домена ангиотензин-превращающего фермента с помощью моноклональных антител. Материалы VI Симпозиума по химии протеолитических ферментов, Москва, 2007, с.94.

6. Наперова И.А. Эпитопное картирование С-домена ангиотензин-превращающего фермента. Материалы IV Московского международного конгресса "Биотехнология: состояние и перспективы развития", Москва, 2007, часть 2, с. 296-297.

7. Naperova I.A., Arablinskaya N.E., Borisov S.E., Schwartz D.E., Kost OA, Danilov S.M. Conformational Fingerprinting of Blood ACE in Sarcoidosis. ATS International Conference, Toronto, 2008, p. A351.

8. Наперова И.А. Изменение нанотопографии ангиотензин-превращающего фермента как индикатора развития патологии. Материалы Всероссийской школы-семинара "Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы", Белгород, 2008, с. 108-110.

9. Наперова И.А., Букина Т.М., Яровая Е.Б., Данилов СМ., Кост О.А. Конформационная характеристика ангиотензин-превращающего фермента крови в норме и при болезни Гоше. Материалы V Московского международного конгресса "Биотехнология: состояние и перспективы развития", Москва, 2009, часть 1, с. 181-182.

10. Naperova I.A., Baskin I.I., Palyulin V.A., Danilov S.M., Kost О.А. Epitope mapping of monoclonal antibodies to angiotensin-converting enzyme (ACE) as a tool for somatic ACE modeling. International conference Biocatalysis-2009: fundamentals and applications, Arkhangelsk, 2009, c. 80.

о) О

Подписано в печать:

16.11.2009

Заказ № 3067 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Наперова, Ирина Александровна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1. МЕТОДЫ ЭПИТОПНОГО КАРТИРОВАНИЯ.

1.1. Общая характеристика антител и антигенов.

1.2. Определение эпитопов связывания мопоклональных антител методами PEP SCAN, Domain Scan, Matrix Scan.

1.3. Использование фаговых библиотек.

1.4. Определение антигенных детерминант с помощью масс-спектрометрии.

1.5. Сайт-направленный мутагенез.

1.6. Определение кристаллической структуры комплексов антиген-антитело

2. АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩИЙ ФЕРМЕНТ.

2.1. Физиологическая значимость ангиотензин-превращающего фермента.

2.2. Структура ангиотензин-превращающего фермента.

2.3. Гликозилирование ангиотензин-превращающего фермента.

2.4. Трехмерная структура доменов ангиотензин-превращающего фермента

3. ЭПИТОПНОЕ КАРТИРОВАНИЕ МОЛЕКУЛЫ АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА.

3.1. Предсказание эпитопов связывания моноклональных антител на поверхности доменов АПФ с помощью метода PEPSCAN.

3.2. Выявление антигенных детерминант на поверхности ангиотензин-превращающего фермента.

3.3. Локализация эпитопов связывания моноклональных антител, специфичных к N-домепу ангиотензин-превращающего фермента.

3.3.1. Локализация эпитопа связывания м Ат 3 А5.

3.3.2. Локализация эпитопа связывания мАт 9В9.

3.3.3. Локализация эпитопов связывания мАт 3G8.

3.3.4. Локализация эпитопов связывания мАт i2H5, 1G12 и 6А12.

3.3.5. Локализация эпитопа связывания мАт 5F1.

3.4. Использование моноклональных антител к N-домену при изучении структуры и функционирования ангиотензин-превращающего фермента

3.4.1. Исследование возможной связи между димеризацией и шеддингом ангиотензин-превращающего фермента с поверхности клеточных мембран.

3.4.2. Изучения каталитической активности N-домена ангиотензин-превращающего фермента.

3.4.3. Изучение конформационных изменений соматического ангиотензин-превращающего фермента при взаимодействии с ингибитором.

3.5. Картирование эпитопа связывания моноклональных антител 1ВЗ.

3.5.1. Локализация эпитопов связывания моноклональных антител 1ВЗ

3.5.2. Использование моноклональных антител 1ВЗ.

3.6. Эпитопное картирование денатурированного тАПФ.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

4.1. Материалы.

4.2. Методы.

4.2.1. Выделение и очистка соматического ангиотензин-превращающего фермента.

4.2.2. Выделение и очистка тестикулярного ангиотензин-превращающего фермента.

4.2.3. Фазовое разделение ангиотензин-превращающего фермента в присутствии тритона Х-114.

4.2.4. Определение активности ангиотензин-превращающего фермента

4.2.5. Определение концентрации активных центров ангиотензин-превращающего фермента.

4.2.6. Модификация ангиотензин-превращающего фермента.

4.2.7. Подбор оптимальных концентраций фермента и моноклональных антител для иммуносорбции.

4.2.8. Характеристика связывания моноклональных антител с разными формами ангиотензин-превращающего фермента.

4.2.9. Определение констант связывания моноклональных антител с тестикулярным ангиотензин-превращающим ферментом.

4.2.10. Выявление моноклональных антител, обладающих ингибирующей активностью по отношению к тестикулярному ангиотензин-превращающему ферменту.

4.2.11. Определение конкуренции моноклональных антител за связывание с ангиотензин-превращающим ферментом.

4.2.12. Эпитопное картирование поверхности С-домена АПФ.

4.2.13. Оценка площади поверхности фермента, покрываемой олигосахаридом.

4.2.14. Моделирование открытой конформации С-домена ангиотензин-превращающего фермента.

4.2.15. MALDI-TOF.

4.2.16. Построение модели двудоменного ангиогензин-превращающего фермента.

4.2.17. Статистическая обработка результатов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНКУРЕНЦИИ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ЗА СВЯЗЫВАНИЕ С С-ДОМЕНОМ АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА ЧЕЛОВЕКА.

5.1. Подбор оптимальных условий для иммуносорбции.

5.2. Определение связывания панели моноклональных антител с тестикулярным ангиотензин-превращающим ферментом.

5.3. Определение констант диссоциации комплексов моноклональных антител с тестикулярным ангиотензин-превращающим ферментом.

5.4. Определение конкуренции моноклональных антител за связывание с тестикулярным ангиотензин-превращающим ферментом.

6. ЭПИТОПНОЕ КАРТИРОВАНИЕ С-ДОМЕНА АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА.

6.1. Сравнение связывания моноклональных антител с ангиотензин-превращающим ферментом из различных организмов.

6.2. Сравнение связывания моноклональных антител с химерами и мутантами ангиотензин-прсвращающего фермента.

7. МОДЕЛИРОВАНИЕ ОТКРЫТОЙ КОНФОРМАЦИИ С-ДОМЕНА АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА.

8. ПРЕДСКАЗАНИЕ СТРУКТУРЫ ДВУДОМЕННОГО АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА.

9. ВЛИЯНИЕ ГЛИКОЗИЛИРОВАНИЯ НА СВЯЗЫВАНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ С АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩИМ ФЕРМЕНТОМ.

9.1. Моделирование углеводных остатков на поверхности молекулы ангиотензин-превращающего фермента.

9.2. Определение связывания моноклональных антител с ангиотензин-превращающим ферментом из различных тканей и биологических жидкостей.

9.3. Десиалирование и дегликозилирование ангиотензин-превращающего. фермента.

9.4. Выявление сайтов гликозилирования ангиотензин-превращающего фермента с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии.

10. СВЯЗЫВАНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ С АНГИОТЕНЗИН

ПРЕВРАЩАЮЩИМ ФЕРМЕНТОМ ПРИ РАЗВИТИИ ПАТОЛОГИИ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Эпитопное картирование С-концевого домена ангиотензин-превращающего фермента человека"

Моноклональные антитела благодаря их селективности и чувствительности являются чрезвычайно важным инструментом при исследовании структурно-функциональных особенностей белков. В фундаментальных исследованиях моноклональные антитела используются для идентификации и локализации белков, для дифференциации клеток различных типов, для очистки белка или для исследования экспрессии белков [1]. На практике моноклональные антитела находят применение как биохимические и клеточные маркеры, в диагностике и терапии [2]. Эпитопное картирование — определение областей на поверхности белковой глобулы, к которым специфичны различные моноклональные антитела - является важным шагом для характеристики взаимодействия антигеп-антитело. Картирование важно для определения специфичности антител [3, 4], для предсказания перекрестной реактивности [5], при разработке вакцин и дизайне лекарственных средств [6-8], а также для понимания фундаментальных аспектов белок-белковых взаимодействий [911].

Объектом исследования в настоящей работе является ангиотензин-превращающий фермент. Ангиотензин-превращающий фермент (АПФ, пептидил-дипептидаза А, КФ 3.4.15.1) - Zn2+-3aBHCHMaa пептидаза, состоящая из одной полипептидной цепи, которая содержит два домена (N- и С-домены), при этом каждый домен содержит каталитически активный центр [12]. АПФ является одним из главных регуляторов кровяного давления и содержания вазоактивных пептидов в организме [13, 14]. Также АПФ вовлечен в метаболизм нейропептидов, иммунную и репродуктивную функции [15, 16]. В настоящее время установлены структуры отдельных доменов АПФ [17, 18], но структура полноразмерного фермента пока неизвестна.

Ранее была получена панель из 8 моноклональных антител к N-домепу АПФ и идентифицированы эпитопы связывания этих антител на поверхности белка [19-22]. Работы по эпигопному картированию N-домена продемонстрировали важный исследовательский, диагностический и даже терапевтический потенциал данных антител. Моноклональные антитела были успешно использованы для количественного определения АПФ в растворе методом ELISA [23] и на поверхности клеток жидкостной цитометрией [24], для исследования структуры и функций АПФ [19, 22], для доставки ферментов к легочному эндотелию, как метод диагностики лсгочно-сосудистых заболеваний [25, 26]. С помощью иммунопреципитации клеток моноклональными антителами ВВ9 было показано [27], что АПФ экспрессируется гематопоэтическими клетками на всех стадиях гематопоэза. Таким образом, возможно, АПФ участвует в физиологической регуляции гематопоэза.

Известно, что в крови людей содержатся в низких концентрациях антитела практически ко всем группам эндогенных антигенов. Эти антитела являются естественными антителами. При повышении уровня белка происходит индукция иммунологических механизмов, что может приводить к повышению уровня естественных антител к этому белку. Известно, что при развитии некоторых патологий в крови увеличивается уровень естественных антител к АПФ [28-31]. Таким образом, данные антитела являются индикатором развития патологии. С помощью эпитопного картирования моноклональных антител можно очертить области на поверхности фермента, в которых расположены эпитопы естественных антител. Не исключено, что при развитии разных патологий изменяется уровень естественных антител, специфичных к разным частям молекулы фермента, что, возможно, даст шанс понять развитие данных заболеваний на молекулярном уровне, а также применить полученные знания для диагностики этих патологий.

Данная работа является продолжением изучения иммунологических свойств фермента. Целью работы явилось эпитопное картирование С-домена ангиотензин-превращающего фермента с помощью панели из 8 моноклональных антител.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Наперова, Ирина Александровна

выводы

1. Определено связывание 8 моноклональных антител с тестикулярным АПФ, выявлены антитела 4ЕЗ, ингибирующие активность тАПФ, определены константы диссоциации комплексов мАт 1ВЗ, 1В8, 2Н9 и 3F11 с нативным тАПФ, мАт 1В8 и 2Н9 с рекомбинантным тАПФ и мАт 1В8 с С-домепом в составе соматического АПФ.

2. Определено расположение эпитопов связывания 8-ми моноклональных антител на поверхности С-домена ангиотензин-превращающего фермента человека па основе конкуренции антител к С-домену АПФ человека за связывание с тестикулярным АПФ, сравнения аминокислотных последовательностей С-доменов АПФ из различных организмов и анализа связывания антител с АПФ из различных организмов, а также анализа связывания моноклональных антител с различными химерами и мутантами фермента.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Наперова, Ирина Александровна, Москва

1. Zola, Н. Monoclonal antibodies (2000) Springer-Verlag, New York, 1-10.

2. Irving, M.B., Pan, O., Scott, J.K. Random-peptide libraries and antigen-fragment libraries for epitope mapping and the development of vaccines and diagnostics (2001) Curr. Opin. Chem. Biol., 5, 314-324.

3. Staindl, В., Berger, P., Kofler, R., Wick, G. Monoclonal antibodies against human, bovine and rat prolactin: epitope mapping of human prolactin and development of a two-site immunoradiometric assay (1987) J. Endocrinol., 114, 311-318.

4. Castric, P.A., Cassels, F.J. Peptide epitope mapping in vaccine development: introduction (1997) J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 19, 56-57.

5. Mullen, L.M., Nair, S.P., Ward, J.M., Rycroft, A.N., Henderson, B. Phage display in the study of infectious diseases (2006) Trends Microbiol., 14, 141-147.

6. Chao, G., Cochran, J.R., Wittrup, K.D. Fine epitope mapping of anti-epidermal growth factor receptor antibodies through random mutagenesis and yeast surface display (2004) J. Mol. Biol., 342, 539-550.

7. Davies, D.R., Cohen, G.FI. Interactions of protein antigens with antibodies (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 7-12.

8. Soubrier, F., Alhenc-Gelas, F., Hubert, C., Allegrini, J., John, M., Tregear, G., Corvol, P. Two putative active centers in human angiotensin I-converting enzyme revealed by molecular cloning (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 9386-9390.

9. Erdos, E.G., Skidgel, R.A. The angiotensin I-converting enzyme (1987) Lab. Invest., 56, 345-348.

10. Soffer, R.L., El-Dorry, H.A. Angiotensin-converting enzyme: immunologic, structural, and developmental aspects (1983) Fed. Proc., 42, 2735-2739.

11. Suzuki, Y., Ruiz-Ortega, M., Lorenzo, O., Ruperez, M., Esteban, V., Egido, J. Inflammation and angiotensin 7/(2003) Int. J. Biochem. Cell Biol., 35, 881-900.

12. Corradi, H.R., Schwager, S.L.U., Nchinda, A.T., Sturrock, E.D., Acharya, K.R. Crystal structure of the N domain of human angiotensin I-converting enzyme providesa structural basis for domain-specific inhibitor design (2006) J. Mol. Biol., 357, 964974.

13. Natesh, R., Schwager, S.L.U., Sturrock, E.D., Acharya, K.R. Crystal structure of the human angiotensin-converting enzyme-lisinopril complex (2003) Nature, 421, 551554.

14. Danilov, S.M., Savoie, F., Lenoir, В., Jeunemaitre, X., Azizi, M., Tamow, L., Alhenc-Gelas, F. Development of enzyme-linked immunoassays for human angiotensin I converting enzyme suitable for large-scale studies (1996) J. Hypertens., 14, 719-727.

15. Muzykantov, V.R., Danilov, S.M. Targeting of radiolabeled monoclonal antibody against angiotensin-converting enzyme to the pulmonary vasculature (1995) In Handbook of targeting delivery of imaging agents,

16. Егоров, A.M., Осипов, А.П., Дзантиев, Б.Б., Гаврилова, E.M. Теория и практикаиммуноферментного анализа (1991) Высшая школа, Москва, 9-33.

17. Ройт, А., Бростофф, Д., Мейл, Д. Иммунология (2000) Мир, Москва, 100-105.

18. Галактионов, В.Г. Иммунология (2004) Академия, Москва, 63-73.

19. Бутеренко, Р.Г., Гусев, М.В., Киркин, А.Ф. Биотехнология. Клеточнаяинженерия (1987) Высшая школа, Москва, 96-119.

20. Geysen, Н.М., Meloen, R.H., Barteling, S.J. Use of peptide synthesis to probe viral antigens for epitopes to a resolution of a single amino acid (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 3998-4002.

21. Carter, J.M. Epitope mapping of a protein using the Geysen (PEPSCAN) procedure (1994) Methods Mol. Biol., 36, 207-223.

22. Bodjo, S.C., Kwiatek, O., Diallo, A., Albina, E., Libeau, G. Mapping and structural analysis of B-cell epitopes on the morbillivirus nucleoprotein amino terminus (2007) J. Gen. Virol., 88, 1231-1242.

23. Smith, G.P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface (1985) Science, 228, 1315-1317.

24. Щелкунов, C.H. Генетическая инэ/сенерия (2004) Сибирское университетское издательство, Новосибирск, 196-204.

25. An, T.Q., Zhou, Y.J., Qiu, H.J., Tong, G.Z., Wang, Y.F., Liu, J.X., Yang, J.Y. Identification of a novel В cell epitope on the nucleocapsid protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus by phage display (2005) Virus Genes, 31,81-87.

26. Schwyzer, M., Weil, R., Frank, G., Zuber, H. Amino acid sequence analysis of fragments generated by partial proteolysis from large simian virus 40 tumor antigen (1980) J. Biol. Chem., 255, 5627-5634.

27. Sheshberadaran, H., Payne, L.G. Protein antigen-monoclonal antibody contact sites investigated by limited proteolysis of monoclonal antibody-bound antigen: protein "footprinting" (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 1-5.

28. Suckau, D., Kohl, J., Karwath, G., Schneider, K., Casaretto, M., Bitter-Suermann, D., Przybylski, M. Molecular epitope identification by limited proteolysis of an50,51.52,53,54,55,56

Информация о работе

Наперова, Ирина Александровна
кандидата химических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.23

Диссертация

Эпитопное картирование С-концевого домена ангиотензин-превращающего фермента человека - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы