Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Антигенная структура поверхностного гликопротеина вируса клещевого энцефалита

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Антигенная структура поверхностного гликопротеина вируса клещевого энцефалита"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ

НОВОСИБИРСКИЙ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ

На правах рукописи УДК 578.833.27.083.3:578.74

Цехановскгя Наталья Александровна

АНТИГЕННАЯ СТРУКТУРА ПОВЕРХНОСТНОГО ГЛИКОПРОТЕИНА ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА

03.00.04 — Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Новосибирск — 1994 г.

Работа выполнена в Новосибирском институте биоорганическо: химии СО РАН

Научный руководитель - к.б.н. Е.К. Прессман

Официальные оппоненты: д.х.н. Э.К. Малыгин к.б.н. Л.В. Паутова

Ведущая организация: Институт цитологии и генетики СО РАН

Защита состоится

1994 г. в

часов на

заседании Специализированного совета К 003.52.01- в Новосибирском институте биоорганической химии по адресу: 630090, г.Новосибирск, проспект акад. Лаврентьева, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского инсти-' /та биоорганической химии СО РАН.

Автореферат разослан

и

>Л994 Г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат химических наук

О.С. Федорова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Вирус клещевого энцефалита (tbev), представитель семейства Flaviviridae, переносимый клещами рода Ixodes, является возбудителем опасного заболевания центральной нервной системы человека. Актуальность исследований флавивирусов обусловлена их постоянной циркуляцией в природных очагах и периодическими вспышками заболеваний, что вызывает необходимость совершенствования средств вакцянопрофилактики и иммунодиагностики. Поверхностный гликопротеин (белок Е) вириона играет важнуп роль в биологии флавивирусов. Белок Е индуцирует защитный иммунный ответ и удаление вируса из организма. Установление антигенной структуры белка Е TBE? представляет научный и практический интерес в плане исследования молекулярных основ противовирусного иммунного ответа и создания вакцин и диагностикумов на основе пептидов.

Цель настоящей работы состояла в исследовании антигенной структуры белка оболочки вируса клещевого энцефалита при помощи моноклональннх антител и локализации антигенных сайтов вирусной нейтрализации. В работе решались следунцие конкретные задачи: I) установление топографии антигенных детерминант; 2) изучение влияния различных денатурирующих агентов на антигенные свойства белка Е; 3) локализация некоторых антигенных детерминант; 4) сравнение иммунологических свойств нативяого и денатурированного белка Е, а также его фрагментов.

Научная новизна и практическая ценность работы. На первом этапе работы было показано, что очищенный белок Е вируса клещевого энцефалита обладает всеми иммунологическими характеристиками ТВЕ7. Впервые было продемонстрировало, что белок Е в очищенном виде как антиген не идентичен белку Е в составе вириона.

Методом конкурентного анализа с использованием широкого набора монэклональных антител выявлено три антигенных домена белка Е TBEV штамма Софьин и два домена бежа Е TBEV штамма Минск-256, гетерогенных по функциональной активности и конформационной устойчивости. Эпитопы, участвующие в вирусной нейтрализации, образуют один основной антигенный сайт, частично расположенный в районе 375-471 АО белка Е.

Впервые было показано, что самый крупный CNBr-фрагмент белка Е с молекулярной массой (Мг) 14,5 кДа гликозилирован и расположен

в районе 78-176 аминокислотных остатков (АО). Гликопептид 7S-I76 АО взаимодействует с рядом моноклональных антител, четыре эпитопа локализованы вблизи 89 и (или) 116 АО белка Е.

Установлено, что ангисыворотки к денатурированному белку Е и его сывг-фрагментам не обладают вируснейтрализующей активностью, что связано с индукцией антител эпитопами, не совпадающими с нативными.

Публикации и апробации. По материалам диссертации опубликовано 5 статей. Кроме того, материалы работы докладывались на международном симпозиуме "2nd Symp. on Arboviruses in the Mediterranean Countries (Dubrovnic, 1989) и на Всесоюзном симпозиуме "Современные проблемы эпидемиологии, диагностики и вакцинопрофилактики клещевого энцефалита" (Иркутск, 1990 г.).

Структура работы. Работа состоит из настоящего Введения, Обзора литературы по структурно-функциональным исследованиям вирионных антигенов флавивирусов, Экспериментальной части, Результатов и их обсуждения. Работа изложена на 129 страницах, включая 109 страниц текста, 17 рисунков, 7 таблиц и списка лк.эратуры (150 ссылок). '

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Выделение и иммунологические свойства белка Е. Индивидуальный белок Е был получен комбинацией дифференциального и зонального центрифугирования солюбилизироваяного тритоном Х-100 вириона в градиенте плотности счхарозы, не содержащем детергента. Белок Е ТВЕУ участвует во всех типах функциональных серологических реакций с антисыворотками к вирионам (РДПА-реакция диффузной преципитации в агаре, нг-ингибирование гемагглютинации) (Табл.П. Иммунизация этим белком животных (мышей и кроликов) давала вполне полноценные иммунные сыворотки, обладающие вируснейтрализующей активностью (NT), однако перекрестные серологические реакции с сорбированными антисыворогками свидетельствуют о некоторых антигенных различиях белка Е в составе вирионов и в очищенном виде (Табл.1). Антивирусные сыворотки, сорбированные очищенным белком Е, взаимодействуют с вирионом, но анти-Е сыворотки, сорбированные вирионом, не связываются с белком Е, то есть вирион содерамт эпитопы, отсутствующие у очищенного белка Е. По-видимому, эти

отличия связаны с влиянием вирионного бежа М на структуру белка Е, но не с антителами к белку М, поскольку они не обнаруживаются в сыворотках инфицированных позвоночных. Из литературы известно, что белок М усиливает антигенные свойства белка Е. Известно также, что косинтез ргМ и Е требуется для правильного сворачивания, ассоциации с мембраной и пространственной организации белка Е флавивирусов. Полученгше результата привели к выводу, что для адекватной эпитопной модели белка Е в качестве антигена для получения моноклональннх антител и для проведения конкурентного анализа должен быть использован вирион. Локализацию антигенных детерминант и их структурные характеристики изучали с применением очищенного белка Е.

Таблица I. Перекрестные серологические реакции ГБЕ7 штаммов Софьин и 256 и их белка Е.

тигры РДПА титры Н1/ЫТ

антисыворотки антигены ТВЕ Соф ТВЕ 256 Е Соф Е 256 ТВЕ Соф Е Соф ТВЕ 256 Е 256

Анти-ТВЕ-Соф 32 32 32 32 2560 1280 128С

7,3

Анти-Е-Соф 32 32 32 32 1280 _ _

4,4

Анти-ТВЕ-256 32 3?. 32 32 - - 2560 -

Анти-Е-256 32 32 32 32 1280

4,1

Сорбированные антисыворотки

Анти-ГВЕ-Соф + ■ Е-Соф (32Ае! 8 0

Анти-Е-Соф + ТБЕ-Соф (8АЕ) О 0

* - АЕ - антигенная преципитируюцая единица.

Эпитопное картирование белка Е двух антигенных подтипов твеу. Конкурентный анализ с использованием моноклональннх антител (МА)

позволяет установить организацию (топографию) антигеннных детерминант. Выбор персулъкатусного (дальневосточного) штамма Софьин и рицинусного (западноевропейского) штамма Минск-256 TBEV обусловлен тем, что, во-первых, эти два вируса значительно различаются по латогенности, и, во-вторых, антигенная структура белка Е TBEV рицинусного подтипа детально исследована при помощи соответствующих МА. Сравнение антигенных моделей данных вирусов, возможно, выявило бы различия в организации эпитопов, связанные с патогенностью. На рис.1 и в Табл.2 представлены результаты конкурентного связывания МА к белку Е с tbev штамма Софьин и в Табл.3 - с TBEV штамма Минск-256.

Рис.1. Топографическое распределение антигенных детерминант белка Е ТВЕУ штамма Софьин (неполная модель) Эпигопы показаны кружками с обозначенными соответствующими МА.

Белок Е ГВЕУ штамма Софьин образует три антигенных домена: Е1 (эпитопн 1ЕП-15В1, Табл.2 и 5Е6, 5С5, ЗВ7 и 4Р7, перекрывающиеся с 4А6 и 1Н1I, ркс.1), Е2 (эпитопы 2НЗ-14Б2, Табл.2)и ЕЗ (эпитопы 5С10, 2Ы, рис.Г), представленных 12, 9 и 2-мя эпитопами соответственно. Два изолированных эпитопа не входят в домены Е1-ЕЗ (не представлены). Эпитопная карта белка Е вируса ТВЕ штамма 256 (Табл.3) в основном совпадает с эпитопной картой белка Е вируса ТВЕ штемма Софьин. Наибольшее отличие состоит в том, что домены Е1 и Е2 перекрываются через МА 2НЗ и 1306, а

также наблюдаются "перестановки" эпитопов 1А2 и 1Н11, 1405 и 13в6 в доменах Е1 и Е2, соответственно. Домен ЕЗ и изолированные

S

■4F7 -ЗВ7 "1Н11

■2D1 5G1C

1Е11

Таблица 2. Элитопная карта вируса TBE штамма Софьин

(результаты конкурентного связывания МА против белка Е TBEV штамма Софьин).

конкурирушие МА

сорбирован. МА ш « ш « CV W <0 Л1 < X Ш 1Л И X см О 9 ^ СО О 5 J12В 6 18А2 10С2 1402

IKli +++ +++ 44 4

4BS +++ +++ 444 + 4+ 44 4 + 44 ++ 4 + 4 44 + +++ +

7С2 ++ + 4 + 444 444 4 4+ 44 4+ + 4 + + +++ +

4А6 +44 +++ 44+ t + + ++ ++ 44 + 4 + + ++ ++

1А2 +++ + 44 44 ++ + 44 4 + 4+ 44 + 4 44 +++ ++ +++ +++ +

1Н1 1 +++ ++ + 44+ + 4+ 44 + + + 4+ 44 + 4+4 +4 + +++ ++ ++ ++ ++ ++

15В1 444 444 + + 444 4+ +++ 4+ + 4+ +++ +++ + 4 +++ +++ +44

2НЗ 4 +44 ++ + +

14Db 44 +++ + + +

13D6 4 + + 4 +++ +++ + 4

1В1 44 444 444 4 + + ++ + + н + ++ + +

11D1 4 44 44 + + +++ + + + +++

12В6 44 + + + ++ + + + +4+ +++ 4+ +

18А2 44 + 4 + + 4+ + 4 +++ +++ 44 +

10С2 44 + ++ +++ 44 +

1 4В2 ++ +++ +++

+ - 30-50% блокирования; ++ - 50-70$ блокирования; +++ - 70-100% 6локирования; перекрыванциеся япитопы (антигенные сайты) обведены.

эпитспн остались без изменений (в Табл.3 также не указаны). "Перестановка" эпитопов была обнаружена в работах Gold при сравнении антигенной структуры белка Е исходного (Asibi) и вакцинного (I7D) штаммов вируса Желтой лихорадки. Иммунотшшрование с использованием МА к белку Е вируса TBE штаммов Софьин (персулькатускый) и Найдорф (рицинусный, работы Heinz) подтвердило их антигенное различие. Следует, однако, отметить, что в результате иммунотипирования при помощи анти-Софьин МА выявлены различия в иммунореактивности МА 4А6, 5F6, 5С5 и 5Н9 (см. рис.1), не обладающих способностью нейтрализовать вирус, в построенных же нами эгштопных картах "перестановки" (изменение взаимного расположения эпитопов) связаны с эпитопами, индуцирующими образование нейтрализующих антител (МА IHII, ЯНЗ-IBI см. ниже). Таким образом, сравнение иммунореактивности МА выявляет главные отличия штаммов TBEV Софьин и £56 в домене El, однако изменения в организации эпитопов, возможно, связанные с патогенностью TBEV, затрагивают как домен El, так и Е2.

Таблица 3*.Эпитспная карта ТВЕУ штамма Минск-256 (результаты конкурентного связывания МА против белка Е ГЗЕУ штамма Софьин).

конкурирующие МА

сорбирован. ма 1Е11 4В2 тс 2 4А6 1Н11 1А2 15В1 I СО I СУ 13D6 14D5 1В1 о 12В6 18А2 |lOC2 14 D 2

1Ё11 +++ +++ + + + ++ ++ 4 +

4в2 +++ 4 + 4 444 + 4 +++ ++ ++ 44 + 4 +

7с2 +++ 444 444 4 + +++ ++ ++ + 4+ 4 +

4а6 ++ + 444 44+ 4++ +++ ++ ++ + + + 4 4

1Н11 +++ 444 4+ 44 + +++ +++ + 4 + + + + 444 + 44 ++ ++ ++

1а2 +++ 444 4 + 4 + + +++ +++ 44 + + f + + + +++

15в1 +++ 444 4+ 4+ ++ ++ + 4 + + 4 + + + + + + ++ + + ++ + 4 44

2нз ++ 44 +4 ++ + 4 + 44 + 444 + 4

13d6 ++ 444 4+4 ++ 444 ++ 444 44 + 4 + 4 + 4 + ++ + 44 44

14d5 + + 4 + 44 + + + + 44

1в1 44 4 + +++ 4 + + + + 4 + + 44

11d1 + 44 +4 ++ + + + 44 4 + +

12в6 ++ 4 + 444 ++ 4 + +++ + 4 + + + 44 + 44 + +++ + + 4+ + + + + + + + 44 +

18а2 + + + + ++ + + + + 44 + + + + + + +

10с2 + + 4 + + 44 + 44

141)2 + + + + 4 4 + 444

* - обозначения как в Габл.2.

Влияние денатурации на антигенные свойства белка Е. Для исследования конформационной устойчивости эпитопов было изучено влияние денатурации (хлоридом гуанидшшя и мочевиной), а также восстановления s-s-связей с последующим

карбоксиметилированием на антигенные свойства белка Е. Результаты (рис.2) показывает, что антигенные детерминанты обладают различной конформационной стабильностью, не связанной с их доменной организацией. Следует заметить, что наблюдается уменьшение эффективности связывания с МА денатурированных препаратов белка Е по сравнению с нативным белком. Снижение активности МА, возможно, является следствием направленности их к нативным детерминантам, частично ренатурирукшм после удаления денатурирующих агентов.

Пептидное картирование антигенных детерминант. Пептидное картирование широко используется для локализации антигенных детерминант. Мы выбрали картирование при помощи химически расщепленных фрагментов белка Е бромцианом по остаткам метионина. Поскольку остатки Met встречаются в молекулах белков с

Е

®1®1*

•i®L

woe f:

1В1 • 1405 • ЮС 2

iTCJ fcl*Xgl*lr 7С2 Г«Т¥1в|»|0 12Вв 11 ВО 1А2

О в

OJO

•1-51

4В2 14 02

1101 • (Х»у*т о

1°L

• jgtel».

Ео h

I I 1.1 ГТ.

I и I I i-L

CM

Л*ш id

J

|g|»l I l«l»l I

14*1 I

«I®

>l°l I

i_LL

'4°i I

О О

»[о

0|.

ЯЖ

□L

E Ed Ecm

polyAT W«l-I I I I I I I I | I

«АвЫаПХГГП VI I Г

иттггтттг i

«Ft 6Н»

3B7

все

Aft 1E11 1H11 БВ5

, ........... | I

t«»lol I I.I I I I 11 f Г! вГ«1 I I ! I П <1111 "SIT

Ш £

2НЭ (•[_>

_j SGM (go 20-,

rsjmr

-I Г.1 | I |.[ I I LLLLi UJXI i

ТТЧ .in ITT» i i i i i i i im<

ТГТ1ПТП"

) nujjj I n

Рис.2. Взаимодействие MA с нативным карбоксиметилировонным (ЕСм) белком нанесено по 0,2 мм раствора последовательных разведениях (по 4 точки, слева направо; исходная концентрация антигена 150 мкг/мл); слева указаны наименования клонов.

(Е^Б )(денатурированным (Ес) и Е . Вертикальные столбцы -белка Е з трехкратных

небольшой частотой, СЫВг-фратменты белковых молекул достаточно просто локализовать и анализировать их антигенные и иммуногенные свойства. Полное и воспроизводимое СНВг-расщепление белка Е наблюдалось только после предварительной длительной процедуры его восстановления (инкубация при 50°С, 43-7Вчас в 1М датиотреите). В этих условиях восстанавливаются не расщепляемые бромцианом сульфоксиды метионина, образование которых возможно в ходе очистки белка Е. В дальнейшем для исключения артефактов, которые могли бы явиться следствием процедуры восстановления (повреждение участков связывания с моноклинальными антителами), проводилось сопоставление результатов иммунодетекции, полученных для предварительно восстановленного и невосстановленного белка Е. Гель-электрофорез по ЬаеитИ восстановленного и расщепленного под действием сивг белка Е выявляет 7 фрагментов с молекулярными массами (Мр) 14,5; 10: 8,5; 6; 4; 3,5 и 3 кДа (рис.3). Фрагмент с М 10 кДа слабо окрашивается Кумасси 1?-250, однако

денситометрирование гелей указывает на достоверное существование этого фрагмента. 445 ю о 43

kDa " I 2

67-

43,5-.

20-

14,4- , 12 " •

3,5-

-53

—14,5 ,-Ю -8,5

Рис.3.

Электрофореграммы белка е твеу (г) и его СИБг-фрагментов (2) в градиентном ПААГ-экз; слева (сверху вниз) указаны положения белков-маркеров (бычьего сывороточного альбумина, овальбумина, ингибитора трипсина, «-лактальбумина, цитихрсма С и р-цепи инсулина), справа - положение белка е и его фрагментов. Отдельно приведена денситограмма дорожки

Белок Е является гликопротеином с и связывается с конканавалином а (Сол а). Углеводные цепи могут служить удобными внутренними маркерами для локализации пептидов в первичной структуре белков. На рис.4 представлены результаты связывания СЫВг-фрагментов белка Е с Con а. Видно, что единственным продуктом полного CNBr-расщепления белка Е, взаимодействующим с Con А, является гликопептид с Мг 14,5кДа (ГП-14,5). Этот вывод следует и из результатов по накоплению ГП-14,5 при увеличении времени инкубации белка Е с бромцианом. При CNBr-расщеплении невосстановленного белка Е , а также при небольшом времени инкубации с бромцианом восстановленного белка Е образуются дополнительные гликопептида с Мр большей, чем 14,5кДа. По-видимому, они являются предшественниками ГП-14,5. Известно, что аминокислотная последовательность белка Е содержит сайт гликозилирования Asnl 54-Glu-Thr в третьем СШг-пелтиде, начиная с N-конца

(координата 78-Г76, Мг 10,6 кДа). Согласно приведенным данным, ГП-14,5 можно локализовать на линейной карте белка Е (рис.5) как третий пептид с координатами 78-176 и Мг 10,6 кДа. Наличие углеводной цепи объясняет различия Мг наиболее крупного СЫВг-пептида белка Е, выведенной из электрофоретической подвижности (14,5 кДа) и рассчитанной яа основании аминокислотной

' _2 3 4 м>а к0а

1*55

И -32

• "26

-36

ГЭ .14,5 «<"22

Ь -а .14 5

a

Рис.4. Взаимодействие сНЕг-фрагментов белка Е ТВЕУ с Соп А. Электрофорез в 12,5» (а) и 10-30Я (ь) ПААТ-ЗОБ; а: I - исходный белок Е, 2,3,4 - продукты, образующиеся соответственно через 10, 60 мин и 24 ч инкубации восстановленного белка Е с сивг: ь: фрагменты, образующиеся через 24 ч инкубации с СЫВг восстановленного (I) и невосстановленного (2) белка Е.

е д n^tJ п

1 j 2 j з I » | МИ sИ " МП"

Рис.5. Линейная карга белка Е вируса TBE.

Цифрами указаны порядковые номера аминокислотных остатков (снизу) и бромциановых пептидов (сверху), стрелками - точки расщепления бромцианом (положения остатков Met). Звездочкой обозначен потенциальный сайт гликозилирования (остаток Аеп154), скобками -дисульфишые мостики.

последовательности (10,6 кДа). Ряд сывг-фрагмелтов белка Е можно локализовать в первичной структуре в соответствии с их электрофоретической подвижностью: фрагмент 10 кДа - 375-471 АО, 8,5 кДа - 177-252 АО, 6 кДа - 255-293 АО, 4 кДа - 1-41 и 42-77, 3,5 кДа - 329-354, 3 кДа - 307-328 и 556-374 АО. Иг* рис.6, показаны результаты взаимодействия МА с слвг-фрагментами бе к1 а К. Наибольшую иммунохимическую активность проявляет ГП-14,5, взаимо/ействувдий с II МА из 25-ти. В опытах с невосстановленным белком Ь с МА способны реагировать и более крупные фрагменты, которые мо;,^'" считать предшественниками ГП-14,5. Фрагменты с М около 3-4 кДа и 8 кДа, полученные при сивх—расщеплении невосстановленного белка Е, (рис.66) слабо взаимодействуют с МА .ТЕП, 4В2, 4Г7. Принимая во внимание, что фрагмент 8 кДа может включать и пептид- предшественник 2-х смежных пептидов 4 кДа (пептиды I и 2 на линейной карте белка Е, рис..5), а также сопоставляя данные иммунобдоттинга с результатами эпитопного картирования, согласно которым эпитопы для МА 1ЕП-4В2 и 4А7

Рис.6. Иммуноблот смвг-фрагментов восстановленного (а) и невосстановленного (Ь) белка Е (электроперенос с 10-30« ПААГ-ЭШ). Сверху указаны наименования клонов.

НИ"

а

Ь

входят в один антигенный домен EI (часть эпитопоз которого расположены в районе Ш-14,5), можно локализовать эпитопы для МА IEII, 4В2 и 4F7 в районе CNBr-пептидов Г или 2 с координатами I-4I или 42-77 АО, соответственно (рис.5). Четыре эпитопа, локализованные на ГП-14,5, имеют сайты связывания с антителами Еблизи 39 и/или 116 аминокислотных остатков - этот вывод следует из сопоставления аминокислотных последовательностей белка Е TBEV штаммов Софьин и Найдорф и эффективности связывания MA 4А6, 5Г6, 5С5, 5К9 с вирусными антигенами данных подтипов.

Для локализации МА-слецифичных антигенных детерминант был использован и другой подход: - конкурентное с.вязызаше с вирионом ряда МА и TgG-фракши антиснворогок к снвг- фрагментам белка Е. Из 10 исследованных МА, представлявших важнейшие эпитопы всех антигенных сайтов (ГЕН, 4В2, 4А6, 1НП, 2НЗ, I4B5, ■I0C2, 5с,ТО, T7CI I конкуренция (около 50%) наблюдалась лишь между igG к снвг-фрагментам 10, 3-4 кДа и двумя МА: I7CI и I4D5 (рис.7).

1/-Э5

1.0 J

/1435

2 3 32 128

ПС 1

1,0

V— fv

1 8 32 л28

О

Рис.7. Конкурентное связывание с вирионом АТ к смбг~фрагментам и МА. Абсцисса - разведения конкурирующих 15с, к СНВг-фрагментам (исходная концентрация I мг/мл), и ИА (исходная концентрация 100 мкг/мл). Ордината - В/Б0 - доля антигена, связавшегося с МА, сорбированными на планшете (обозначения МА дани на рисунке), где р0 -. от>49г в отсутствии конкурента, Б - опДС)? т. присут'-пчш конкурирующих антител. Обозначения: к пгег-Фрагмелтнм: ° Ю кДа, * ^3-4 кДа; » -гомологичные: антитела.

П

Согласно первичной структуре белка Е ТВЕУ штамма Софьин, смежные фрагменты 3 и 10 кДа расположены в районах 356-374 и 375-471 АО, соответственно (рис.5, пептида 10, II).

Сопоставление функциональной активности антисывороток к нативному (в составе вириона), денатурированному и карбоксиметилированному белку Е и его СШг-фрагментам позволило бы выявить функционально важные иммуногенные участки белка оболочки, устойчивые к денатурации. Результаты функционального тестирования показали полное отсутствии инг-ибируюцей гемагглютинацию и нейтрализующей активности у антисывороток к карбоксиметилированному белку Е, его индивидуальным СЯВг-фрагментам, а также их смеси . Антиснворотка к денатурированному белку Е слабо взаимодействует с вирусом ТВЕ в подавлении гемагглютинации, но не обладает нейтрализущей активностью. Конкурентное связывание с вирионом антител к сгаг-фрагментам белка Е и 10 МА обнаружило наличие только двух перекрывающихся иммуногенных сайтов у нативного бежа Е и его стег-фрагментов. Этот факт может объяснить отсутствие функциональной активности у антител к смвг-фрагментам. Полученные результаты подтверждают гипотезу о конформационно-зависимой природе большинства В-клеточных детерминант. Отсутствие же нейтрализующей активности у антисывороток к денатурированному белку Е свидетельствует о наименьшей устойчивости к денатурирупцим воздействиям эпитопов, участвующих в вирусной инфекционное™.

Структурно-функциональная характеристика антигенных доменов белка Е твет штамма Софьик.

Полученные результаты исследования антигенной структуры поверхностного гликопротеина вируса клеаевогэ энцефалита с использованием моноклональных антител, а также функциональная активность эпигопов представлены в Табл.4. Суммарная таблица позволяет достаточно полно охарактеризовать три антигенных домена белка Е ТВЕУ штамма Софьин.

Домен Е1 включает монофункциональные эпигопы, участвующие либо в гемагглютинации (большинство эпитопов), либо в вирусной нейтрализации, причем соответствующие МА имеют низкую функциональную активность. Эпитопы домена Е1 локализуются в н-концевой части молекулы белка Е(1-176 АО). Они обладают

Таблица 7. Структурно-функциональные характеристики и локализа-

ция антигенных детерминант белка Е tbev штамма Софьин.

МА Домен Титры Денатурация Восста- Взаимодействие

новление с С№г-фраг-

NT HI SDS мочеви- & карбок- ментами (АО

(lg) на+гуа- симетили- остатки)

ни дин-НС 1 рование

I rt 3 4

IEII - 40 +- 4 4 1-41; 42-77

4В2 - - + 4 + 1-41; 42-77

478-176

7С2 - 80 + 4 4 78-176

4А6 - - + 4 - 78-176

5Р6 - - + 4 - 78-176

5С5 EI - 10 + 4 - 78-176

5Н9 - - 4 4 - 78-176

ЗВ7 - - 4 4 - 78-176

4F7 - 10 4- 4 4 1-41; 42-77

IA2 - 20 4- _ _

ГНИ 1,8 - - - - _

I5BI - 20 4- - - -

2НЗ 1.8 - - - - -

I4D5 4,5 5120 4 4 4- 375-471

I3D6 4,5 640 4 4 - -

IBI 3,5 20000 4 4 - -

IIDI Е2 - 5120 - - - -

I2B6 - 160 4- 4 4 78-176

I8A2 - 1280 - - - -

IOC2 - 320 4 4- 4- 78-176

I4D2 - 20000 4 4 4 78-176

5GI0 - 80 - - - -

2DI ЕЗ - 40 - - - -

I7CI - 320 - 4 4 375-471*

IIB6 - 40 - 4 4 78-176

1,4 - результаты иммуноблоттинга; 2,3 - результаты DOT-иммуноанализа;

» - 14П5- и 17С1-специфичные эпитопы локализованы на основании результатов конкурентного анализа против СНВг-фрагмента 375- 471 АО - МА 14»5 и 17С1). "+" - сохранение иммунореактивности, "+-" - значительное снижение иммунореактивности, "-" - потеря иммунореактивности.

различной чувствительностью к действию денатурирующих агентов и содержат: I)устойчивые к денатурации и карбоксиметилированию эпитопы для МА 1Е1-4В2, 4Т7; 2)антигенный участок, представленный МА 4А6-ЗВ7, устойчивый только к денатурации (йШ, хлорид гуанидиния, мочевина) и стабилизированный э-З-мостиками,

четыре апитопа (4А6-5Н9) которого являются подтип-специфичными; 3)конформационно нестабильные эпитопы для МА IA2-I5BI (IHII-срецифичный эпитоп участвует в вирусной нейтрализации). Район I-I76 АО включает такие три эпитопа домена Е2.

Домен Е2, состоит из моно- и полифункциональных эпитопов и соответс.твукщие МА обладают высокой функциональной активностью. Антигенные детерминанты домена Е2, как и домена EI, различаются по «информационной стабильности, причем функционально важные эпигопы наиболее чувствительны к денатурации и CNBr-расщеплению. Эпитопы, участвующие в нейтрализации, (2H3-IBÍ), образуют один антигенный сайт в составе домена Е2, что позволяет рассматривать этот участок белка Е tbev tas сайт нейтрализации вирусной инфекциокнесту. 14В5-специфичный эпитоп данного сайга частично локализуется в районе 375-471. Из стих данных следуют предположение, что сайт нейтрализации инфекционноети ГВЕ7 лерсулькатусного подтипа (штамм Софьин) включает район 375-471 АО белка Е. В этом районе бежа Е локализованы домены нейтрализации флавивирусов: tbev рицинусного подтипа (штамм Найдорф) (384 АО), Японского энцефалита (303-396 АО), энцефалита Долины Мюррей (MVE, 390 АО), Денге (Den, 230-414 АО). Сайты нейтрализации флавивирусов, не перекрывающиеся с вышеуказанными, картированы также и в М-концевой части белка Е: ряд escape-мутантов по 71, 72 АО получен для ТВЕУ и YPY. Прерывистая детерминанта нейтрализации, включающая районы 35-55 и 356-376 АО, локализована для вирусов MVE и DEN-2. Отличительной чертой исследованной в данной работе антигенной структуры белка Е tbev персулькатусного подтипа является перекрывание (или близкое расположение) эпитопов, участвумцих в вирусной нейтрализации. Сайт нейтрализации включает часть антигенного домена Е2, к которому примыкает IHII-специфичный нейтрализующий эпитоп домена EI.

Домен ЕЗ представлен всего двумя эпитопами (5GI0, 2DI), участвующими в реакцими гемэгглютинации и необратимо денатурирующими при воздействии любого из использованных реагентов. Возможно, домен ЕЗ не является отдельным антигенным доменом, а представляет собой "скштые", более глубокие по структуре эпитопы домена Е2, поскольку наблюдается однонаправленное блокирование домена ЕЗ эпитопами нейтрализующего антигенного сайта домена Е2. В зпитопной модели вируса

Киасс.анурс.кой лесной болезни (комплекс TBE) эпитопы для MA 5GIO и 2DI входят в один антигенный сайт с нейтрализующими эпитопами домена Eg.

Два эгштопа (Г7С1- и IIB6- специфичные) являются изолировдашми и не входят ни в один из антигенных доменов.

Полученные нами эпитопные карты имеют ряд отличий от эпитогщой модели белка Е TBEV рицинусного подтипа, предложенной Heinz. Согласно модели Heinz антигенные детерминанты белка Е формируют три неперекрывающихся антигенных домена А (50-125 и 200250 АО), В (300-Я95 АО), С (145-170 АО). Отличия состоят в том, что, во-первых, в наших картах наблюдается более полное перекрывание ипитопов. Эпитопы белка Е TBEV штамма Софьин Формируют два основных антигенных домена El и Е2 (исключая домен ЕЯ, предетянленннй всего двумя эпитопами и не имеющий аналога в модели Heinzi. Домен El соответствует основной части домена А, Е2 - дпмекам В+С+ часть домена А. Эпитопы рицинусного штамма 256 формируют один гетерогенный домен (см. Табл.3 и 4). Во-вторых, в нашей модели шявляется один основной сайт нейтрзлиз; 'дай домена Е2, f. близко примыкающим к нему нейтрализующим эпитопом домена El, в модели же Негпк все три домена содержат нейтрализующие эпитопы. В-третьих, в имей модем и эпитопы, дифференциирукщие рицину сный и персулькату.ннй антигенные подтипы TBEV, локализованы вблизи 89 и IIB АО домена F.T 'домен А в модели Heinz), в модели же Heinz данные подтипы дифференциируются по эпитопам домена С (145-170 АО, путь апитигюы, первичная структура которого у данных подтипов практически идентична (одна несущественная замена Уа11б8 на Не). Возможно, это связано с различиями пространственной организации белка Е TBEV пнрсулысатусного и рицинусного подтипов, а также с вариациями метода получения МА. Монок.лснальние антитела, исполь^вагаме в модели Heinz, получены к очинённому белку Е, при построении нами/} же модели использовали МА, получение к белку Е в составе ьириона. Нади нпятопные карты TBEV в большей степени «■.ответ('.'грунт карте, полученной для вируса энцефалита Сан Луи, в которой г'питоиы образуют один непрерывный домен и согласуются с современными представлениями о молекулярных основах антибелкового иммунного ответа, согласно которым вся поверхность белка является иммуногеном.

1Т

Результаты работы могут быть основой для вариантного анализа вирусов комплекса tbe на эпитопном уровне. Наши данные были использованы для локализации участка белка Е, связанного, с персистенщей tbev (район 76 АО, штамм Васильченко). В качестве пептидного антигена для диагностики tbe и дифференциации рицинусннх и персулькатусных антигенных подтипов ТВЕ7 можно предложить участок 88-117 АО белка Е. Поскольку антисыворотки к денатурированному белку Е и его СЫВг-фрагментам не обладают вируснейтрализующей активностью, наши результаты не позволяют предложить фрагменты белка Е для испытания в качестве пептидных и генно-инженерных вакцин.

Выводы.

1. Показано, что очищенный белок оболочки вируса клещевого энцефалита, обладая серологическими характеристиками вируса (в реакциях KIA, РДПА, HD и индуцируя образование вируснейтрализующих антител, иммунологически не идентичен белку Е в составе вириона.

2. Исследована топография 25 антигенных детерминант TBEV двух антигенных подтипов с использованием моноклональных антител к белку Е. Установлено, что 23 эгштопа белка Е TBEV персулькатусного подтипа (штамм Софыш) формируют три функционально гетерогенных антигенных домена, рицинусного (штамм Минск-256) - два домена, и два эпитопа изолированы от остальных. Эпктопы, участвующие в вирусной нейтрализации, образуют один основной сайт, частично расположенный в районе 375-471 АО белка Е.

3. Локализованы сывг-фрагменты белка Е. Впервые показано, что фрагмент с Мг 14,5 кДа представляет собой гликопептид, расположенный в районе 78-176 АО. Гликопептид 78-178 АО взаимодействует с II MA, четыре эпитопа локализованы вблизи 89 и/или 116 АО.

4. Изучено влияние денатурирующих агентов (хлорида гуанидиния, мочевины, ses) и восстановления с последующим s-карбоксимегилиро-ванием на антигенные свойства белка Е. Обнаружена различная конформационная устойчивость эпитопсв, не коррелирующая с их доменной организацией.

5. Показано, что антисыворотки к денатурированному белку Е и его

СНВг-фрагментам не обладают вируснейтрализувдей активностью, что связано с индукцией антител эпитопами, не совпадающими с нативными.

Основные результаты диссертации опубликованы в следукцих

1. М.П.Чумаков, Ю.Ю.Кусов, С.Г.Рубин, И.В.Семашко, Я.А.Сальников, В.Н.Рейнголд, Е.К.Прессман, Н.А.Цехановская. Субъединичный иммуноген вируса клещевого энцефалита. Сообщение I. Выделение и свойства гликопротеина Е. Вопр. вир.усол., 198-1, т.29, N6, 6Э4-701.

2. М.П.Чумаков,С.Г.Рубин, Ю.Ю.Кусов, И.В.Семашко, Я.А.Сальников, Е.К.Прессман, Н.А.Цехановокая. Субъединичный иммуноген вируса клещевого энцефалита. Сообщение II. Иммунологические характеристики гликопротеинов V3 из двух антигенных типов ВКЭ., Вопр. вирусол., Т98Д, т.29, Мб, 701-706.

3. А.С.Караванов, Л.3.Матвеев, С.Г.Рубин, И.В.Семашко, Н.А. Це-хановская, Е.К.Прессман. Идентификация отдельных антигенных эпитетов бежа ободочки вируса КЭ с применением моноклональных антител. Вопр. вирусол., 1990, т. 35, N2, 140-143.

4. Н.А.Цехановская, Л.Э.Матвеев, И.В.Сафронов, А.Г.Плетнев, С.Г. Рубин, Е.К.Прессман. Локализация антигенного участка белка оболочки вируса клещевого энцефалита с использованием моноклональных антител. Биоорганическая химия, 1991, т.17, ЫЗ, 334-342.

5. n.A.Tsekhanovskaya, L.E.Matveev, S.G.Rubin, а.S.Karavanov

E.К.Pressman. Epitope analysis of tick-Ъогп encephalitis complex viruses using monoclonal antibodies to envelope glycoprotein of TBE virus (persulcatus subtype). Virus Researnh, 1993, v.30, N1, p.I-16.

работах: