Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние экзогенных и эндогенных эффекторов на конформацию ангиотензин-превращающего фермента человека

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние экзогенных и эндогенных эффекторов на конформацию ангиотензин-превращающего фермента человека"

9 15-2/84

На правах рукописи

ПЕТРОВ МАКСИМ НИКОЛАЕВИЧ

ВЛИЯНИЕ ЭКЗОГЕННЫХ И ЭНДОГЕННЫХ ЭФФЕКТОРОВ НА КОНФОРМАЦИЮ АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА ЧЕЛОВЕКА

03.01.04 - биохимия 0.1.01.06 - биотехнология (в том числе бионапотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации па соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2015

Работа выполнена на кафедре химической этимологии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Научные руководители:

кандидат химических наук, ведущий научный сотрудник Кост Ольга Алексеевна

доктор биологических наук Дапилоп Сергей Михаилович

Официальные оппоненты:

Ротянопа Татьяна Васильевна

доктор химических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории химии протеолитических ферментов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и ТО.А. Овчинникова РАН

Мягкова Марина Александровна

доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией иммунохимии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологически активных веществ РАН

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное научное учреждение Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича

Защита диссертации состоится « 27 » октября 2015 года в 15 часов на заседании Совета Д 501.001.59 по защите докторских и кандидатских диссертаций по химическим паукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д. I, стр.11, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова и на сайте Химического факультета МГУ (www.chem.msu.ni).

Автореферат разослан « 2. 5" » сентября 2015 года. Ученый секретарь

диссертационного совета Д 501.001.59,

кандидат химических наук

Сакодынская И.К.

Актуальность темы. Ангиотензин-превращающий ферм1 - гп-зависимая пептидилдипептидаза, является одним из кровяного давления, влияет на в метаболизм нейропептидов, передачу сигнала внутрь клетки, иммунную и репродуктивную функции.

Ингибиторы АПФ являются первым средством при терапии заболеваний сердечно-сосудистой системы. Недавно с помощью моноклональных антител (мАт) было показано, что связывание таких коммерческих ингибиторов АПФ, как каптоприл, лизиноприл и эналаприлат (синтетические аналоги ди- и трипептидов) изменяет участок поверхности фермента, на котором располагаются эпитопы связывания двух мАт. Не исключено, что изменения конформации затрагивают и другие участки поверхности фермента. В настоящее время определены эпитопы связывания 9 мАт к Ы-домену и 8 мАт к С-домену на разных участках поверхности АПФ, что открывает новые возможности для исследования изменений конформации АПФ под влиянием различных лигандов, в том числе ингибиторов.

Следует отметить, что АПФ - это молекула сложной структуры, состоящая из двух доменов в составе одной полипептидной цепи, каждый из которых несет в своем составе активный центр. При этом механизм взаимодействия активных центров зависит от структуры лиганда и предполагает некое взаимодействие доменов в составе АПФ. Так, при связывании ди- и трипептидов наблюдается ярко выраженная отрицательная кооперативность между доменами АПФ, но при связывании нона- и декапептидов домены в составе АПФ функционируют независимо. Это, в свою очередь, позволяет предположить, что связывание ингибиторов различной структуры может приводить к различным конформационным изменениям молекулы фермента, что, возможно, является базой наблюдаемых отличий в механизме функционирования активных центров АПФ.

С помощью мАт возможно контролировать изменение конформации фермента

не только при связывании ингибиторов АПФ, но и при продуцировании фермента

различными тканями, а также при химической модификации молекулы АПФ. В

частности, с помощью мАт было показано, что при развитии болезни Гоше и

саркоидоза в крови больных присутствует АПФ, продуцируемый из видоизмененных

макрофагов (клеток Гоше) и саркоидных гранулем и имеющий топологию

поверхности, отличную от нормы. Не исключено, что при развитии других патологий

на конформацию АПФ могут оказывать влияние также эндогенные соединения,

3

присутствующие в крови. Среди заболеваний, характеризующихся содержанием в крови массы различных токсических соединений, следует выделить уремию. При развитии уремии в крови, в частности, повышается концентрация глютатиона, восстанавливающего дисульфидные связи. Исследование АПФ в составе крови этих больных и возможное выявление конформационно измененного АПФ позволит надеяться получить информацию о характеристиках АПФ при развитии уремии и получить фундаментальные данные, которые могут послужить основой для развития молекулярной медицины в будущем.

Цели работы. Выявление изменений связывания мАт к различным эпитопам на поверхности АПФ, которые характеризуют изменения конформации фермента на определенных участках поверхности белковой глобулы под действием ингибиторов АПФ; выявление различий в конформационных изменениях белка при связывании ингибиторов различной структуры; определение влияния восстановления дисульфидных связей на конформацию фермента; анализ образцов плазмы больных уремией для выявления конформационно измененного АПФ в крови этих больных и его характеристика по активности и эффективности ингибирования.

Научная новизна и практическая значимость. Впервые определено влияние коммерческих ингибиторов АПФ лизиноприла и эналаприлата (аналоги трипептидов) на конформацию АПФ. С помощью панели из 17 мАт показано, что в присутствии этих ингибиторов изменяется связывание 5 мАт, специфичных к двум неперекрывающимся областям на поверхности М-домена и 4 мАт, специфичных к двум неперекрывающимся областям на поверхности С-домена АПФ.

Впервые показано, что связывание нонапептида тепротида приводит к

изменению связывания тех же 4 мАт, специфичных к двум неперекрывающимся

областям на поверхности Ы-домена и тех же 2 мАт, специфичных к двум

неперекрывающимся областям на поверхности С-домена АПФ, связывание которых

менялось под влиянием лизиноприла и эналаприлата. При этом влияние тепротида на

конформацию АПФ принципиально отличается от влияния эналаприлата и

лизиноприла. Наиболее ярким отличием является то, что связывание трех мАт (Ю12,

6А12 и ¡2Н5) к сильно перекрывающимся эпитопам связывания на Ы-домене АПФ

значительно увеличивается под действием эналаприлата и лизиноприла, в то время как

под действием тепротида связывание этих трех мАт, наоборот, резко падает.

Полученные данные свидетельствуют, что связывание в активных центрах АПФ 4

ингибиторов различной структуры приводит к различным изменениям конформации АГТФ, что может служить основой наблюдаемых различий функционирования активных центров фермента при связывании лигандов различной структуры.

Сравнение экспериментальных данных по зависимости эффективности связывания мАт 1G12 (к N-домену) и 3F11 (к С-домену) с АПФ от концентрации ингибитора с соответствующими теоретическими кривыми связывания ингибиторов в активных центрах АПФ показывает, что связывание тепротида на N-домене АПФ влечет за собой изменение конформации не только этого, но и соседнего С-домена.

С помощью мАт показано, что разрыв дисульфидных мостиков в глобуле АПФ посредством восстанавливающих агентов глютатиона (GSH) и дитиотреитола (DTT) приводит к существенному изменению конформации АПФ. При этом модифицированный таким образом АПФ почти не претерпевает дальнейших изменений конформации под действием эналаприлата, а под действием тепротида изменяется конформация только С-домена в составе двухдоменного АПФ. Показано, что при гемолизе эритроцитов происходят изменения конформации фермента, схожие с изменениями конформации, вызванными действием глютатиона и дитиотреитола.

Выявлены 4 из 20 пациентов (20%), больных уремией, в крови которых выявлен конформационно измененный АПФ. Эти изменения конформации затрагивают области связывания мАт 1ВЗ (на С-домене) и мАт 1G12 (на N-домене). Этот конформационно измененный АПФ характеризуется повышенной активностью по отношению к природному субстрату ангиотензину-1 и пониженной чувствительностью к ингибирующему действию специфических ингибиторов - эналаприлата и тепротида. Показано, что в крови этих пациентов изменение конформации поверхности АПФ под действием ингибиторов (как эналаприлата, так и тепротида) менее выражено по сравнению с нормой. Таким пациентам может быть рекомендовано переходить на другой класс антигипертензивных средств.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на VI симпозиуме по химии протеолитических ферментов (Москва, 2007); международной конференции "Biocatalysis-2009: Fundamentals & Applications" (Архангельск, 2009); XVII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2010» (Москва, 2010); XVII Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 2010); XVIII Российском национальном конгрессе

"Человек и лекарство" (Москва, 20II); международной конференции "Biocatalysis-2013: fundamentals and applications" (Москва, 2013).

Печатные работы. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных

работ.

Структура. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (главы 1-3), экспериментальной части (глава 4), описывающей материалы и методы исследования, результатов и их обсуждения (главы S-7), выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 142 страницах, содержит 8 таблиц и 46 рисунков. Список литературы включает 212 ссылок.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

Предварительно были определены условия, при которых проводились все дальнейшие эксперименты. Для оценки связывания мАт с АПФ был выбран метод иммуносорбции, за образованием комплексов мАт-АПФ следили по активности фермента, связанного с мАт, сорбированными на планшете через поликлональные антитела козла против иммуноглобулинов мыши. В работе использовали АПФ, выделенный и очищенный из семенной жидкости человека, и АПФ в составе биологических жидкостей (плазмы крови и семенной жидкости) человека. Также использовали рекомбинантные формы соматического, тестикулярного (С-домен) и N-домена АПФ человека, экспрессированные в СНО-клетках китайских хомячков. Моноклональные антитела и рекомбинантные формы АПФ были любезно предоставлены д.б.н. Даниловым С.М. из университета Иллинойса, Чикаго. Образцы плазмы крови пациентов с уремией, а также донорскую плазму любезно предоставил к.м.н. Шило В.Ю. из Московского Государственного Медико-стоматологического университета. Семенную жидкость любезно предоставил проф. Евдокимов В.В. из НИИ Урологии, Москва.

1. Определение влияния связывания ингибиторов различной структуры на эффективность связывания моноклональных антител с ангиотензин-превращающим ферментом

В данной работе был выполнен систематический анализ влияния эналаприлата,

лизиноприла (аналоги трипептидов) и тепротида (нонапептид) на связывание панели

мАт (9 мАт к N-домену и 8 мАт к С-домену АПФ) с АПФ. 6

Определено влияние указанных ингибиторов на эффективность связывания панели мАт как с двудоменным рекомбинантным АПФ, так и с рекомбинантными однодоменными формами фермента. Показано, что связывание этих ингибиторов в активных центрах АПФ вызывает изменения конформации как двудоменной, так и однодоменных форм фермента (рис. 1).

Эффект эналаприлата (100 нМ)

Рекомбинантный

соматический

АПФ

Эффект тепротида (1 мкМ)

Рекомбинантный

тестикулярный

АПФ

Рекомбинантный

тестикулярный

АПФ

/Л^^ууу ^УУУ^У, У^уу^у,

Ы-домен

С-домен

N-дoмeн

С-домен

Моноклональные антитела

Рис. 1. Эффект эналаприлата (А, В, С) и тепротида Ф, Е, Р) на связывание панели мАт с двудоменной и однодоменными растворимыми рекомбинантными формами АПФ человека. Ингибиторы использовали в концентрации, превышающей константу ингибироваиия АПФ на два порядка. Красным цветом отмечены мАт, связывание которых в присутствии ингибиторов возрастало на 20% и более, желтым - мАт, связывание которых понижалось на 20% и более.

Из рис. I А-С видно, что под действием эналаприлата связывание мАт изменяется качественно одинаково как с соматическим АПФ, так и с отдельными доменами. Эффект лизиноприла на связывание мАт с АПФ полностью совпадал с эффектом эналаприлата. Аналогично, под действием тепротида связывание мАт как с соматическим АПФ, так и с отдельными доменами изменяется одинаково (рис. I О-Р). Наблюдаемые эффекты ингибиторов (как аналогов трипептидов, так и нонапептида тепротида) сохраняются при переходе и на другие источники ферментов.

Количественно цифры могут варьироваться, но качественно эффект тот же. Так, эффект эналаприлата различается для рекомбинантного АПФ (рис. 1 А) и для АПФ в составе плазмы крови (рис. 2 А) и семенной жидкости (рис. 2 В). Эффект тепротида на связывание мАт с АПФ также зависит от источника фермента (рис. I О, рис. 2 С, Э).

Эффект эналаприлата (100 нМ) Эффект тепротида (1 мкМ)

500 А 500 С

1.11ш11"111пл11п 100° 1|||1Плп1"|11л11Г11

ос

§ 400 I 400

I зоо I Плазма крови зоо Плазма крови

° 200 I 200

^ |||01И1

га О-

0

£ 500 В 500 Р

£ 400 „ 400

1 300 Семенная жидкость ^ Семенная жидкость & 200

111111 1||||||

1 1|||||Ц|| ПИНН ™

^У^^оУ^ ^УУУ^У

Ы-домен С-домен Ы-домен С-домен

Моноклональные антитела

Рис. 2. Эффект эналаприлата (А, В) и тепротида (С, Э) на связывание панели мАт с АПФ в составе плазмы крови и семенной жидкости. Красным цветом отмечены мАт, связывание которых в присутствии ингибиторов возрастало на 20% и более, желтым -мАт, связывание которых понижалось на 20% и более.

Такая разница может объясняться, например, разным гликозилированием ферментов из разных источников, а также вероятным влиянием различных компонентов в составе биологических жидкостей.

Сопоставление данных по влиянию эналаприлата и тепротида на связывание панели мАт как с двудоменным АПФ, так и с отдельными 1М- и С-доменами АПФ (рис. 1, 2) выявило значительные различия между эффектом эналаприлата и тепротида. Наиболее наглядно эта разница наблюдается для мАт ¡2Н5, 6А12 и Ю12 к 1М-домену (их эпитопы перекрываются) и мАт 3Р11 к С-домену АПФ. Так, под действием эналаприлата эффективность связывания этих 4 мАт с АПФ повышается, а под действием тепротида, наоборот, понижается, что указывает на принципиально различные структурные изменения при связывании ингибиторов разной структуры.

Исследование влияния эналаприлата и тепротида на связывание панели мАт с АПФ в составе плазмы крови в широком интервале концентраций ингибиторов показало, что при высоких концентрациях ингибиторов практически все кривые выходят на плато, что свидетельствует о том, что в этих условиях достигнуты максимально возможные конформационные изменения фермента. На рис. 3 в качестве примера представлены данные для некоторых мАт.

Концентрация эналаприлата, М Концентрация тепротида, М

Рис. 3. Зависимость эффективности связывания мАт с АПФ в составе плазмы крови от концентрации ингибитора.

Таким образом, при связывании в активных центрах АПФ ингибиторов разной структуры значительная часть мАт изменяет эффективность связывания с ферментом. При этом наблюдаемые изменения конформации поверхности АПФ зависят от структуры используемого ингибитора.

1.1. Сопоставление конформационнмх изменений ангнотензин-пренращающего фермента со степенью заполнения его активных центров ингибитором

Для того, чтобы сопоставить наблюдаемые изменения эффективности связывания мАт с АПФ при связывании эналаприлата и тепротида с насыщаемостью активных центров фермента молекулами ингибитора, с помощью программы \1athematica 6 были построены теоретические кривые, характеризующие степень заполнения активных центров АПФ ингибиторами (лизиноприлом и тепротидом) в зависимости от концентрации ингибитора в системе. Фактически рассчитывали теоретические зависимости доли свободных активных центров фермента от концентрации ингибитора в активных центрах АПФ. При этом учитывали ранее

обнаруженный факт, что при связывании лизиноприла на любом из доменов константа связывания его на втором домене ухудшается в 20 раз (так называемое явление отрицательной кооперативности), а при связывании тепротида с АПФ явление отрицательной кооперативности отсутствует. Поскольку константы ингибирования N1-и С-доменов АПФ лизиноприлом достаточно близки (1,2*10"9М и 3,0*10"'°М соответственно), то очевидно, что такой ингибитор не будет проявлять доменной специфичности. Кривые, представленные на рис. 4 и 5, отражают рассчитанную зависимость количества оставшихся свободных активных центров АПФ от количества

120

со о о.

I-

(1) =г

-О I

ш

Б

го

X

х §

ю о т о ее с о

сг

80

60

40

20

• о Теоретическая кривая 1 Теоретическая кривая 2 эффективность связывания мАт 1С12 (к №домену) эффективность связывания мАт ЗП1 (к С-домену)

Ч—__

\

\

\ \

\ К

\ \

\

\ 2В\

\ 1\

\о X

\ \ \

10-ю 10-э Ю8 Ю-7 Концентрация лизиноприла, М

ю-(

Рис. 4. Сопоставление экспериментальных данных (точки) по влиянию лизиноприла на эффективность связывания мАт Ю12 (к Ы-домену) и ЗР11 (к С-домену) с очищенным АПФ из семенной жидкости с теоретическими зависимостями, описывающими связывание лизиноприла в активных центрах АПФ от концентрации ингибитора в системе (кривые). Кривая I рассчитана исходя из предположения, что лизиноприл связывается сначала с Ы-доменом, а затем с худшей константой с С-доменом АПФ. Кривая 2 рассчитана исходя из предположения, что лизиноприл связывается сначала с С-доменом, а затем с худшей константой с Ы-доменом АПФ. Для того, чтобы сопоставить имеющиеся экспериментальные данные по связыванию мАт с АПФ с полученными теоретическими зависимостями, представили экспериментальные данные в следующем виде: за 100% (или отсутствие конформационных изменений) приняли значение эффективности связывания мАт в отсутствие ингибиторов, за 0% (максимум конформационных изменений) приняли значение эффективности связывания мАт в присутствии максимальной концентрации ингибиторов, используемой в эксперименте.

ингибитора в системе. Нам не удалось учесть в расчетах случайный порядок связывания лизиноприла с Ы- и С-доменами в составе АПФ. поэтому мы построили две теоретические кривые, представляющие собой предельные случаи связывания лизиноприла с Ы- и С-доменами в составе АПФ (рис. 4). При этом считали, что в одном случае лизиноприл связывается сначала с Н-доменом, а затем с худшей константой с С-доменом АПФ, а в другом - сначала с С-доменом, а затем с худшей константой с Ы-доменом АПФ.

Видно, что экспериментальные точки, характеризующие изменение связывания мАт Ш12 и 3И11 с АПФ в зависимости от концентрации лизиноприла, лежат между предельными теоретическими кривыми, описывающими связывание лизиноприла в активных центрах АПФ с учетом ранее продемонстрированной отрицательной кооперативное™ между доменами фермента (рис. 4). Такое расположение экспериментальных точек ожидаемо, поскольку лизиноприл не проявляет доменной специфичности. Из полученной информации, однако, нельзя сделать вывод о том, влияют ли друг на друга домены в составе АПФ при связывании ингибитора.

На рис. 5 представлено сравнение экспериментальных данных по зависимости эффективности связывания мАт Ю12 и ЗИ11 с АПФ в зависимости от концентрации тепротида с теоретической кривой связывания тепротида в активных центрах АПФ.

Теоретическая кривая

эффективность связывания мАт ЗЯП (к С-домену) эффективность связывания мАт 1С12 (к Ы-домену)

Рис. 5. Сравнение экспериментальных данных по влиянию тепротида на эффективность связывания мАт 1С 12 и ЗИП с АПФ в составе плазмы крови с теоретической зависимостью связывания тепротида в активных центрах АПФ от концентрации ингибитора в -10-ю ю-9 10-в ю-? ю-6 ю-5 ю-4 системе.

Концентрация тепротида, М

Поскольку для тепротида константы ингибирования N1- и С-доменов АПФ

человека значительно отличаются (2,5*10'7М и 4,4*1()''М, соответственно), можно

утверждать, что этот ингибитор обладает специфичностью к С-домену. Изменение

эффективности связывания мАт 3F11 к С-домену начинается уже при низких концентрациях тепротида, что соответствует преимущественному связыванию тепротида на С-домене АПФ, и продолжается вплоть до полного насыщения обоих активных центров тепротидом. То есть связывание тепротида на N-домене приводит к изменению эффективности связывания мАт 3FI1 к С-домену, и, соответственно, к изменению конформации С-домена. При низких концентрациях тепротида (т.е. в тех условиях, когда тепротид связывается преимущественно с С-доменом АПФ) наблюдается небольшое, но статистически достоверное повышение связывания мАт 1G12 (к N-домену) на 15%. При увеличении концентрации тепротида и, соответственно, связывании тепротида на N-домене наблюдается резкое снижение связывания мАт 1G12 вплоть до полной отмены при максимальной концентрации ингибитора. То есть связывание тепротида на С-домене АПФ приводит к изменению конформации соседнего N-домена. Таким образом, связывание тепротида на любом из доменов АПФ приводит к изменению конформации не только этого, но и соседнего домена.

1.2. Определение влияния S-S восстанавливающих агентов на связывание панели моноклональных антител с ангиотензин-превращающим ферментом

в составе плазмы крови

Поскольку применение мАт позволило выявить изменения конформации АПФ

при связывании ингибиторов в активных центрах фермента, мы предположили, что

мАт могут быть полезны при определении возможных конформационных изменений

АПФ в крови при патологиях, сопровождающихся накоплением различных

токсических соединений. Известно, в частности, что при развитии уремии в крови

повышается концентрация многих токсических соединений, в том числе глютатиона

(GSH), который способен восстанавливать дисульфидные связи в молекуле белка.

Молекула АПФ содержит 6 парных цистеиновых остатков, образующих

цистеиновые мостики: Cysl28-Cysl36, Cys330-Cys348 и Cys516-Cys528 в составе N-

домена, а также Cys728-Cys734, Cys928-Cys946 и Cysl 114-Cysl 126 в составе С-

домена. Кроме того, в составе каждого домена имеется неспаренный остаток цистеина:

Cys474 в N-домене и Cysl072 в С-домене.

Для того, чтобы проверить, каким образом влияют восстанавливающие агенты

на эффективность связывания мАт с АПФ, мы провели ряд экспериментов, 12

включающих в себя восстановление дисульфидных связей как глютатионом, так и дитиотреитолом (ОТТ).

Восстановление 8-8 мостиков с помощью как С8Н, так и ОТТ (рис. 6 А, В) в выбранных условиях привело к качественно одинаковым изменениям связывания ряда мАт с АПФ в составе плазмы крови и к снижению активности фермента на 40%. Наиболее выраженное изменение эффективности связывания наблюдалось для мАт Ю12 и ¡2Н5 к Ы-домену АПФ (их связывание под влиянием вБН и ОТТ возрастало на 50-300%). Эпитопы связывания этих мАт имеют в своем составе дисульфидный мостик Суэ516-Суя528, следовательно, можно заключить, что восстановление именно этого мостика приводит к наблюдаемому эффекту.

я» 1 А вэн (5 мМ)

N-домен С-домен

Моноклональные антитела

Рис. 6. Изменение связывания мАт с АПФ крови под влиянием глютатиона (А), дитиотреитола(В) и вследствие гемолиза (С).

Для того чтобы попытаться определить возможные конформационные последствия разрыва дисульфидных связей в молекуле АПФ, с помощью программы Insight II (Accelrys Inc., San Diego, CA) мы заменили S-S мостики в составе N-домена на пространственно разделенные S-H группы. АПФ в закрытой конформации представлен в базе данных белков (PDB: Р2С6). Модель АПФ в открытой конформации построена по гомологии с АПФ2 (РОВ: IR42). Моделирование разрыва

дисульфидных мостиков проводили в рамках совместной работы с к.ф-м.н., с.н.с. Упоровым И.В. В структуре Ы-домена путем замены Б-Б связи на две пространственно разделенные 8Н-группы принудительно размыкали дисульфидный мостик Сув516-Суз528, расположенный в перекрывающихся эпитопах связывания мАт Ю12, 6А12 и ¡2Н5, а также дисульфидный мостик Су5330-Суэ348.

Молекулярная динамика структуры Ы-домена АПФ в закрытой конформации как с интактными, так и с модифицированными дисульфидными связями не привела к видимым изменениям конформации фермента. При работе со структурой Ы-домена АПФ в открытой конформации оказалось, что если все дисульфидные мостики замкнуты, то в процессе молекулярной динамики происходит «схлопывание» структуры, т.е ее переход из открытой конформации в закрытую. Если в структуре разомкнут цистеиновый мостик Су8330-Су8348 или Су5516-Су8528, либо оба одновременно, то структура не переходит в закрытую конформацию, а застывает в полузакрытом положении после первых 200 из 500 выполненных шагов молекулярной динамики. Кроме того, в процессе молекулярной динамики структуры с разомкнутым дисульфидным мостиком Суз516-Су8528 заметно изменение положения петли, расположенной рядом с этим мостиком в эпитопе связывания мАт Ю12, что может объяснять изменение связывания этого мАт при восстановлении этого 8-8 мостика.

Для того, чтобы уточнить полученную картину, воспользовались программным комплексом ОупОогп (http://fizz.cmp.uea.ac.uk/dvndorn/). который показывает максимально возможную пространственную разницу между движущимися частями фермента при переходе из закрытой конформации в открытую. В модели Ы-домена со всеми интактными дисульфидными мостиками (рис. 7 А, В) наблюдается явное наличие движения открывания-закрывания щели активного центра. В случае, когда был разомкнут один или оба цистеиновых мостика, движение открывания-закрывания щели активного центра ограничено. На рис. 7 (С, Э) показана модель Ы-домена с разомкнутым мостиком СуБ516-Су8528.

Таким образом, разрыв одного или нескольких дисульфидных мостиков в составе однодоменного фермента приводит к нарушению движения открывания-закрывания щели активного центра АПФ, что может объяснять некоторое падение (-40%) активности фермента под влиянием 8-8 восстанавливающих агентов.

пм*(и10.р<1Ь

С Рис. 7. Влияние восстановления дисульфидных мостиков на движение открывания-закрывания щели активного центра на примере Ы-домена АПФ с интактными Б-Б связями (А, В) и с разорванной связью О Су8516-Суя528 (С, Э). А, С - модели фермента в открытой

конформации; В, О -модели фермента в закрытой конформации.

Известно, что при гемолизе эритроцитов происходит высвобождение внутриклеточного С8Н в плазму, что в значительной степени увеличивает концентрацию глютатиона в крови. Мы смоделировали реальную ситуацию, имеющую место при гемолизе эритроцитов в крови. Для этого с помощью резкого встряхивания в присутствии воды произвели осмотический шок эритроцитов в составе крови. Клетки крови отделили центрифугированием и сравнили связывание панели мАт с полученной плазмой и с нормальной плазмой крови. Данные представлены на рис. 6 С. Оказалось, что вследствие гемолиза значительно увеличивается связывание мАт Ю12 и ¡2Н5 к Ы-домену АПФ (аналогично эффекту 08Н и ОТТ). Кроме того, увеличилась эффективность связывания мАт 6А12, эпитоп связывания которого сильно перекрывается с эпитопами связывания мАт Ю12 и ¡2Н5 и также содержит в своем составе дисульфидный мостик Су8516-Суя528.

Таким образом, мы подтвердили, что соединения, присутствующие в крови (по крайней мере, глютатион), могут непосредственно влиять на конформацию АПФ в составе плазмы крови.

1.3. Определение влиянии ингибиторов на изменение конформации ангиотензин-нренращающего фермента с восстановленными дисульфидными связями

Поскольку мы показали, что конформация АПФ в крови может быть изменена вследствие восстановления дисульфидных связей, то представляло интерес

проанализировать, каким образом у такого фермента будет меняться топография поверхности при связывании ингибиторов (эналаприлата и тепротида).

На рис. 8 представлены для сравнения эффекты глютатиона на интактный фермент (А), эналаприлата на интактный фермент (В) и эналаприлата на фермент с восстановленными дисульфидными связями (С) в составе плазмы крови, а также разница эффектов С-А (рис. 8 О). Видно, что такие совершенно разные эффекторы, как ингибитор, связывающийся в активном центре АПФ, и глютатион. восстанавливающий дисульфидные связи в белковой глобуле фермента, приводят к одинаковым изменениям связывания практически одних и тех же мАт. То есть при действии на АПФ как эналаприлата, так и глютатиона изменяется топография тех же участков поверхности фермента. При последовательном действии глютатиона и затем эналаприлата эффект последнего на связывание панели мАт с АПФ уже незначителен.

GSH (5 мМ)

itnlillifi" Irt illfl

ЭналалрилатПОО нМ)

liitllh GSH+эналаприлат

1 ШшИв

GSH+iHananpwiar/GSH

N-дбмён Одомен

Моноклональные антитела

400 300 200

ra

t 100 0

| 400 В

£ 300 | 200 £ К 100

o 5

°

SI ™ С a o

с ií зоо ш t

200 100 0

200 D

150 100 50 0

lili

GSH (5 мМ)

ilniilhilitniiti

Тепротид(1 мкМ)

ninñn

ПппЯ lililí

GSH+твпротид

I'

i с

<v

H

5

,ll

1 ln 1111 lltltnllnl

GSH+TenpoTMfl/GSH

Sí 150

lili lil ilí i llillllll llllll l

N-домен С-домен

Моноклональные антитела

Рис. 8. Изменение связывания панели мАт Рис. 9. Изменение связывания панели

под раздельным и последовательным мАт под раздельным и

влиянием глютатиона (5 мМ) и последовательным влиянием глютатиона

эналаприлата (100 нМ). (5 мМ) и тепротида (1 мкМ).

Эти данные свидетельствуют о том, что разрыв дисульфидных связей ведет к существенным конформационным изменениям фермента, при этом конформация АПФ меняется таким образом, что дальнейшее изменение конформации под влиянием эналаприлата становится невозможным.

Аналогичные эксперименты были проведены с тепротидом (рис. 9). Видно, что при действии тепротида на фермент с восстановленными дисульфидными связями не происходит изменения связывания мАт к Ы-домену АПФ. Однако изменяется связывание мАт к С-домену фермента с восстановленными дисульфидными связями (рис. 9 В, Э). То есть тепротид, в отличие от эналаприлата, способен изменять конформацию С-домена (но не Ы-домена) АПФ, модифицированного глютатионом.

2. Иммунохимическая характеристика ангиотензин-превращающего фермента в

норме и при развитии уремии

2.1. Поиск конформационно измененного ангиотензин-превращающего фермента в крови больных уремией

Уремия является патологическим заболеванием, характеризующимся высоким содержанием в крови токсических соединений вследствие недостаточной очистки крови в почках. Из литературы известно, что уровень глютатиона в крови значительно повышен у пациентов в конечной стадии развития почечной недостаточности и у пациентов на гемодиализе. Для выявления вероятного присутствия в крови конформационно измененного АПФ была отобрана кровь пациентов в конечной стадии почечной недостаточности с диагнозом уремия до процедуры диализа. Выполнен анализ АПФ в крови каждого из 20 пациентов с диагнозом уремии и, для сравнения, ряда здоровых доноров.

Сравнивали образцы плазмы больных уремией и здоровых доноров по следующим показателям: 1) активность; 2) содержание АПФ в крови, определяемое по уровню связывания мАт 9В9, эффективность связывания которого с АПФ не зависит от присутствия всех используемых в работе эффекторов; 3) показатель гРНЬ/ННЬ (соотношение скоростей гидролиза двух синтетических субстратов СЬг-РИе-Шз-Ьеи и ЬНр-Нш-Ьеи, соответственно), повышение которого свидетельствует о присутствии в крови экзогенных ингибиторов, применяемых в качестве лекарственных средств при гипертонии; 4) показатель Ю12/9В9 (соотношение эффективностей связывания двух

мАт), который, как ранее было показано, повышается в присутствии экзогенных ингибиторов; 5) определение эффективности связывания всей панели мАт с АИФ больных уремией и здоровых доноров.

Проверка активности выявила у 5 из 20 пациентов повышенный уровень активности АПФ (рис. 10 А), что согласуется с литературными данными. На рис. 10 В представлено соотношение скоростей гидролиза двух синтетических субстратов 2РНЬ/ННЬ под действием АПФ в составе плазмы крови здоровых доноров и больных уремией. Видно, что соотношение гРНиННЬ сильно повышено у 4 из 20 пациентов (номера 2, 4, 12 и 15), что может указывать на присутствие в крови этих пациентов экзогенных ингибиторов АПФ.

300 -1

г** 200 -

.0.

е N с 100-

<

£ о J

250

И 200 -

150 ■

С х

< К ^ N 100

50 4

я "> 9 ш Р- О) Ей

25

800 600 400 200

< <м

т

л ш 3

т

о:

Я ел О со

о

2000 1500 1000 500

МШ

; с , Н 111|

О

400 300 200 100

Е

шшж

Ыш!

в

г1д1даошш1|пп1ш,ш.

8101213141616 ср»Д 12 3 4 5 6 7 8 8 1011121314151617181920 Здоровы. Образцы плазмы Больны, уремией

Рис. 10. Анализ плазмы крови здоровых доноров и больных уремией.

Соотношение Ю12/9В9 (рис. 10 С) повышено в плазме крови тех же 4 пациентов, у которых было повышено соотношение гРНЬ/ННЬ (номера 2, 4, 12 и 15), что подтверждает наличие в их крови экзогенных ингибиторов АПФ. Этот же анализ позволил выявить 4 других пациента с уремией (номера 7, 11, 13 и 16), у которых соотношение Ю12/9В9 повышено, но при этом соотношение гРНЬ/ННЬ абсолютно нормальное (рис. 10 В и С в рамке). Это позволило заключить, что, по крайней мере, у этих четырех пациентов может быть изменена локальная конформация эпитопа связывания мАт Ю12 вследствие влияния токсических соединений, присутствующих в крови больных уремией.

Для того, чтобы определить, какие еще эпитопы связывания мАт на поверхности АПФ, помимо эпитопа мАт Ю12, могут быть изменены в крови этих четырех пациентов (номера 7, 11, 13 и 16), мы протестировали эффективность связывания всей панели мАт с АПФ в составе плазмы крови этих четырех пациентов по сравнению со связыванием этой же панели мАт с АПФ в составе плазмы крови здоровых доноров. Оказалось, что, кроме уже упомянутого повышенного связывания мАт Ю12 к домену, в крови тестируемых пациентов повышено также связывание мАт 1ВЗ к С-домену АПФ. Одной из причин такого увеличения связывания мАт может быть влияние токсических соединений, находящихся в крови больных уремией, на дисульфидный мостик Су8516-Сув528 в эпитопе связывания мАт Ю12 в >4-домене АПФ и на дисульфидный мостик Су5728-Суз734, расположенный вблизи эпитопа связывания мАт 1ВЗ в С-домене АПФ, а также на свободный Сув1072 в эпитопе мАт 1ВЗ.

Таким образом, показано, что, действительно, в крови больных уремией может присутствовать конформационно измененный АПФ.

2.2. Характеристика конформационно измененного ангиотенэин-превращаюшего фермента в крови больных уремией

Как было показано выше, модифицированный глютатионом АПФ практически лишается способности изменять поверхностную структуру М-домена при связывании как эналаприлата, так и тепротида (рис. 8 и 9). Поэтому мы проверили, каким образом связывание ингибиторов с конформационно измененным АПФ в составе крови больных уремией может влиять на конформацию его поверхности.

Поскольку очевидно, что некоторые пациенты принимали ингибиторы АПФ в качестве лекарственных средств, добавление ингибиторов, естественно, не приводило к дальнейшим конформационным изменениям фермента в плазме крови таких пациентов (рис. 11, номера 2 и 12). Вместе с тем, у выявленных пациентов (рис. 11, номера 7, 13 и 16) с конформационно измененным АПФ в крови, не принимавших ингибиторы АПФ, изменение связывания мАт Ю12 с АПФ под действием ингибиторов тоже практически отсутствовало (как и у АПФ с восстановленными дисульфидными связями). Изменение связывания мАт Ю12 с АПФ в крови остальных пациентов, больных уремией (номера 1, 3, 9, 14, 17 и 18) не отличалось от нормы (красные столбики).

Эффект тепротида на эффективность связывания мАт с АПФ больных уремией (рис. 11 С, О) оказался более индивидуальным, чем эффект эналаприлата, поскольку в группах уремических больных с нормальным (номера 1, 3, 9, 14, 17 и 18) и повышенным (номера 7, 13 и 16) исходным соотношением Ш12/9В9 оказались как пациенты, связывание мАт с АПФ которых под действием тепротида изменялось слабо, так и те, изменение связывания мАт с АПФ которых было таким же, как в норме.

Контроль

Эналаприлат (100 нМ)

lililí III II

2100 8

- 50

Е

» 1 О

Эналаприлат (ZPHL)

пл. .п.п.

Эналаприлат (ангиотвнзин-1)

1 9 14 17 18 7 13 16 2 12 Пациенты с уремией Пациентыс Пациентыс (нормальное Ю12/9В9) уремией (высокое уремией Ю12/9В9) (ингибиторы АПФ)

Здороаые доноры

14 20 11 13

Па1#|еитысуремиеи Патенты с уремией 1нормальиоеЮ12/9В9| (аысо*оеЮ12/9В9|

Рис. 12. Ингибирование активности АПФ из крови пациентов с уремией по двум субстратам - 2РН1_ и ангиотензину-1. А-0 - остаточная активность; Е - отношение

Рис. 11. Эффект эналаприлата и тепротида на связывание мАт Ю12 с АПФ в составе крови больных уремией.

A, С - соотношение Ю12/9В9 в присутствии и в отсутствие ингибиторов; активностей по двум субстратам.

B, Э эффект ингибиторов на соотношение Ю12/9В9.

Важные результаты были получены в результате экспериментов по

ингибированию эналаприлатом и тепротидом активности АПФ в составе плазмы крови больных уремией в сравнении со здоровыми донорами. В качестве субстратов использовали природный субстрат декапептид ангиотензин-1 и синтетический субстрат гРНЬ. Результаты представлены на рис. 12. Оказалось, что по сравнению с нормой конформационно измененный АПФ в составе крови больных уремией хуже

поддавался ингибированию эналаприлатом в реакции гидролиза 2РНЬ (рис. 12 А) и практически не ингибировался тепротидом в этой же реакции (рис. 12 С).

При замене синтетического субстрата 2РНЬ на природный ангиотензин-1 выяснилось, что и эналаприлат, и тепротид оказались не способны ингибировать реакцию гидролиза ангиотензина-1 конформационно измененным АПФ в составе крови больных уремией (рис. 12 В, О). Кроме того, АПФ в составе крови одного из двух протестированных больных уремией с нормальным соотношением Ю12/9В9 также оказался менее чувствителен к ингибированию гидролиза ангиотензина-1 как эналаприлатом, так и тепротидом. Важно, что активность АПФ из крови этих пациентов по ангиотензину-1 была в несколько раз выше нормы (до 4 раз), в то время как их активность по ZPHL была такой же, как у здоровых доноров (рис. 12 Е). Это относится в первую очередь к пациентам с конформационно измененным АПФ.

Мы также провели анализ широкой выборки здоровых доноров и больных без диагноза уремии по ряду параметров: активность АПФ, соотношение гРНЬ/ННЬ и Ю12/9В9. Оказалось, что в обоих выборках были найдены пациенты с конформационно измененным АПФ, но среди здоровых доноров было найдено 3 из 48 (т.е. -6%) таких пациентов, а среди прочих пациентов (без диагноза уремии) - 5 из 63 (т.е. -8%) сравнению с 4 из 20 (т.е. 20%) среди пациентов с диагнозом уремия, у которых изменена конформация эпитопа связывания мАт Ю12. Таким образом, при уремии встречаемость пациентов с конформационно измененным АПФ в крови существенно выше, чем у здоровых доноров и людей с другими заболеваниями.

Важно отметить, что существует заметная и близкая к статистически достоверной (р < 0,05) разница в артериальном давлении у больных уремией с конформационно измененным АПФ (давление измеряли до диализа) и у прочих пациентов. Систолическое артериальное давление у больных уремией с конформационно измененным АПФ составило в среднем 145,3 ± 13,9 мм.рт.ст. против 123,9 ± 27,8 мм.рт.ст. у прочих пациентов (р = 0,069), в то время как диастолическое артериальное давление составило в среднем 78,0 ± 9,1 мм.рт.ст. против 66,2 ± 12,1 мм.рт.ст. соответственно (р = 0,078).

Таким образом, можно заключить, что увеличение значения соотношения Ю12/9В9 при нормальном значении соотношения 7РН1УНН[_ свидетельствует о наличии в крови пациента конформационно измененного АПФ. В процессе выполнения данной работы сформирован научный подход, заключающийся в одновременном контроле соотношений Ю12/9В9 и гРНЬ/ННЬ в плазме (сыворотке) крови пациента. Этот подход может служить базой для разработки стандартной методики, направленной на выявление пациентов, которые могут быть менее восприимчивы к терапии ингибиторами АПФ. Таким пациентам, вероятно, следует назначать более интенсивную терапию ингибиторами АПФ, либо заменять ингибиторы АПФ на другой класс антигипертензивных препаратов.

выводы

1. Связывание ингибиторов в активных центрах АПФ изменяет эффективность связывания ряда мАт к N- и С-доменам фермента, то есть индуцирует конформационные изменения поверхности белковой глобулы. Ингибиторы разной структуры (аналоги трипептидов и нонапептид) могут вызывать разные конформационные изменения АПФ.

2. Сравнение экспериментальных данных по связыванию мАт с АПФ в присутствии ингибиторов с теоретическим моделированием степени связывания ингибиторов в активных центрах фермента позволило установить, что связывание нонапептида тепротида в активном центре, расположенном в любом из доменов АПФ, влияет на конформацию определенного участка поверхности не только на этом же, но и на соседнем домене фермента.

3. Восстановление дисульфидных связей в молекуле АПФ приводит к изменению конформации фермента: такой фермент практически не способен к дальнейшему изменению конформации как N-, так и С-домена под действием коммерческого ингибитора АПФ эналаприлата, но изменяет конформацию С-домена под действием нонапептида тепротида. Компьютерное моделирование с использованием программных комплексов Insight II и DynDom показало, что разрыв одного или нескольких дисульфидных мостиков в составе однодоменного фермента приводит к нарушению движения открывания-закрывания щели активного центра АПФ, что объясняет некоторое падение активности фермента под влиянием S-S восстанавливающих агентов.

4. При развитии уремии в крови присутствует конформационно измененный АПФ (связывание мАт 1G12 к N-домену и 1ВЗ к С-домену достоверно повышено в 2-4 раза и 1,5 раза соответственно). Определена частота встречаемости таких случаев в крови больных уремией (20%), прочих пациентов (-8%) и здоровых доноров (-6%).

5. Конформационно измененный АПФ в крови больных уремией значительно менее восприимчив к действию ингибиторов (с точки зрения изменения конформации и ингибирования активности АПФ). Показано, что активность АПФ в крови таких больных по отношению к ангиотензину-I повышена по сравнению с нормой.

6. Разработан метод фенотипирования АПФ индивидуальных пациентов, заключающийся в одновременном контроле соотношений 1G12/9B9 и ZPHL/HHL в плазме (сыворотке) крови. Этот подход позволяет выявлять пациентов, которые могут быть менее восприимчивы к терапии ингибиторами АПФ.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Наперова И.А., Балясникова И.В., Петров М.Н., Вахитова А.В., Евдокимов В.В., Данилов С.М., Кост О.А. Характеристика связывания моноклональных антител с С-доменом ангиотензинпревращающего фермента человека. Биоорганическая химия, 2008, 34, 3, 358-364.

2. Petrov M.N., Shilo V.Y., Tarasov A.V., Schwartz D.E., Garcia J.G.N., Kost O.A., Danilov S.M. Conformational changes of blood ACE in chronic uremia. PLoS ONE, 2012, 7(11), e49290.

3. Petrov M.N., Naperova I.A., Uporov I.V., Danilov S.M., Kost O.A. Putative conformational changes in angiotensin-converting enzyme (ACE) induced by ACE inhibitors and revealed by monoclonal antibodies. International conference Biocatalysis-2009: fundamentals and applications, Arkhangelsk, 2009, p. 81-82.

4. Наперова И.А., Петров M.H., Вахитова A.B., Кост О.А., Данилов С.М. Структурный анализ С-домена ангиотензин-превращающего фермента с помощью моноклональных антител. Материалы VI Симпозиума по химии протеолитических ферментов, Москва, 2007, с.94.

5. Петров М.Н., Наперова И.А., Кост О.А., Данилов С.М. Изменение связывания моноклональных антител как свидетельство конформационных изменений ангиотензин-превращающего фермента человека при связывании ингибиторов. Материалы XVII Российского национального конгресса "Человек и лекарство" Москва, 2010, с. 698.

6. Петров М.Н., Наперова И.А., Кост О.А., Данилов С.М. Применение моноклональных антител для определения конформационных изменений ангиотензин-превращающего фермента человека при развитии патологии и при связывании ингибиторов. XVII Международная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов», Москва, 2010, с. 31.

7. Петров М.Н., Данилов С.М., Кост О.А. Восстановление S-S связи в эпитопе мАт 1G12 на АПФ как фактор, определяющий ответ фермента на связывание ингибитора. Материалы XVIII Российского национального конгресса "Человек и лекарство" Москва, 2011, с. 625.

8. Karlov D.S., Binevski P.V., Petrov M.N., Tikhomirova V.E., Kost O.A. Conformational changes in ACE domains upon binding the ligands of different structure. Abstracts of International Conference "Biocatalysis-2013: fundamentals and applications", 2013, P. 102-103.

Подписано в печать 24.08.2015 Формат 60x90 1/16 Бумага офсетная. Печать цифровая. Объём: усл. печ. л. 1,75 Тираж 120 экз. Заказ №3018. Отдел полиграфии Научной библиотеки МГУ имени М.В. Ломоносов 119192 Москва, Ломоносовский проспект 27.

2015674588

2015674588