Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ангиотензин-превращающий фермент

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кугаевская, Елена Владимировна

I. ВВЕДЕНИЕ. 6 И, ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

II.1. АНТИГЕННЫЕ ДЕТЕРМИНАНТЫ БЕЛКОВ,

11.1.1. Общая характеристика антигенных детерминант белковой природы.

11.1.2. Линейные и конформационные антигенные детерминанты.

11.1.3. Структура и физико-химические свойства антигенных детерминант.

11.1.4. Расчетные методы предсказания антигенных детерминант. 15 И.1.5. Общие подходы в определении антигенных детерминант. 17 11.1.6. Метод пептидного сканирования.

11.2. АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩИЙ ФЕРМЕНТ. 22 11.2.1. Распространение ангиотензин-превращающего фермента в организме.

И.2.2. Свойства ангиотензин-превращающего фермента.

И.2.3. Свойства N- и С- доменов ангиотензин-превращающего фермента.

11.3. ИНГИБИТОРЫ АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА. 39 11.3.1. Структура ингибиторов АПФ.

II.3.1. Применение синтетических ингибиторов АПФ в клинике.

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

111.1. Синтез связанных с иглами гексапептидов по методу пиновой технологии.

111.2. Иммуноферментный сорбционный анализ (ELISA) связанных с иглами гексапептидов.

111.3. Получение экстрактов жмыха подсолнечника.

111.4. Гель-фильтрация на сефадексе.

111.5. Получение экстрактов легких крысы.

111.6. Определение содержания белка.

111.7. Флуориметрический метод определения активности ангиотензин-превращающего фермента.

111.8. Определение торможения активности ангиотензин-превращающего фермента.

111.9. Определение активности ангиотензин-превращающего фермента в сыворотке (плазме).

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

IV.I. АНТИГЕННОЕ КАРТИРОВАНИЕ N- И С- ДОМЕНОВ АПФ ЧЕЛОВЕКА.58 IV. 1.1. Предсказание вероятных линейных антигенных детерминант N- и

С- доменов АПФ человека.

IV.I.2. Синтез гексапептидов, соответствующих предсказанным линейным антигенным детерминантам N- и С- доменов АПФ человека.

IV.I.3. Результаты ELISA при сканировании гексапептидами аминокислотной

IV.1.6. Сравнительный анализ расположения зпитопов в первичной структуре

N- и С-доменов человека и других видов млекопитающих.

IV.I.7. Выявление линейных антигенных детерминант N- и С- доменов АПФ человека, распознаваемых моноклональными антителами.

IV.II. ИНГИБИТОРЫ АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА. 99 IV.II. 1. Синтетические ингибиторы АПФ.

IV. II. 1.1.Исследование производных пиперидинкарбоновой и пипеколиновой кислот, амидиномеркаптокислот и родственных соединений. 99 Гу/.11.1.2.Исследование соединенений, относящихся к группе пиридоксил-производных пептидов.

IV.H.1.3. Исследование производных фосфорорганических аналогов аминокислот.

IV. II. 1.4. Исследованние производных Ыа-карбоксиалкилированных дипептидов на основе Ala - Pro и Тгр - Pro.

IV.II.2. Исследование нового природного ингибитора АПФ из жмыха семян подсолнечника.

IV.II.3. Изучение реакции организма на введение ингибиторов АПФ.

V. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Ангиотензин-превращающий фермент"

Ангиотензин-превращающий фермент (АПФ) является ключевым ферментом ренин-ангиотензиновой и калликреин-кининовой систем, контролирующих кровообращение в организме. Он образует сосудосуживающий ангиотензин II и инактивирует сосудорасширяющий пептид брадикинин. Недавно было показано, что АПФ является физиологическим регулятором гематопоэтического пептида - горалатида (Ы-АсЗег-Азр-Ьуэ-Рго или АсБОКР), отрицательного регулятора гемопоэза. Этот пептид тормозит пролиферацию гематопоэтических стволовых клеток, а также участвует в гомеостазе клеточного роста различных типов клеток. АПФ поддерживает концентрацию горалатида на низком уровне. Кроме того, фермент участвует в обмене нейропептидов, в репродуктивных процессах, а также в реализации защитных и иммунных реакций в организме.

Поскольку АПФ регулирует концентрацию вазоакгивных пептидов, он становится центральным звеном при лечении гипертонии и сердечнососудистой недостаточности. В настоящее время ингибиторы АПФ широко применяются в клинике. Более 200 млн. человек принимает их в качестве антигипертензивных препаратов. Кроме того, недавно показан антиатеросклеротический эффект ингибиторов АПФ. В связи с обнаружением нового физиологического субстрата АПФ - горалатида теперь рассматривается и антипролиферативный эффект ингибиторов АПФ, который может быть использован при лечении онкологических заболеваний.

Молекула АПФ представляет собой одну полипептидную цепь с молекулярной массой 170 кДа и содержит два высокогомологичных домена (Ы- и С-). Оба домена АПФ содержат активный центр и ион цинка. Домены каталитически активны, но неравноценны. Они отличаются по скорости гидролиза пептидов, степени торможения ингибиторами и профилю активации ионами хлора. Используемые в клинике ингибиторы тормозят активность обоих доменов, но отличаются по скорости диссоциации фермент-ингибиторного комплекса. Преимущественное взаимодействие ингибиторов АПФ с активным центром одного из доменов может влиять на их биологический эффект при использовании в медицинской практике.

Предполагается, что каждый из доменов имеет физиологическое значение й их различия в какой-то мере обусловлены конформационными особенностями. В пользу физиологической значимости доменов свидетельствует присутствие в организме еще двух молекулярных форм фермента, которые по своей структуре соответствуют Ы- и С- доменам соматического, и обнаружение эндогенных субстратов, гидролизующихся преимущественно Ы-доменом. Однако, несмотря на огромный интерес к этому ферменту, пространственная структура его молекулы до сих пор не известна. Цель и задачи исследования.

Исходя из актуальности проблем изучения как молекулярной структуры АПФ, так и его ингибиторов, целью нашего исследования было:

I. Сравнительное исследование антигенных свойств Ы- и С- доменов АПФ человека: выявление экспонированных на их поверхности участков аминокислотной последовательности - линейных антигенных детерминант (В-эпитопов) методом пептидного сканирования РЕРБСАЫ и анализ расположения найденных антигенных детерминант в Ы- и С- доменах молекулы АПФ.

II. Поиск новых высокоэффективных ингибиторов АПФ среди различных групп синтетических соединений и в природных источниках.

В связи с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:

1) Методом пиновой технологии синтезировать гексапептиды для антигенного картирования Ы- и С- доменов АПФ человека.

2) Посредством иммуноферментного анализа определить способность синтезированных гексапептидов связываться с поликлональной иммунной сывороткой и по этим данным выявить антигенные детерминанты обоих доменов.

3) Выявить расположение линейных антигенных детерминант относительно консервативных и вариабельных участков полипептидной цепи АПФ.

4) Посредством иммуноферментного анализа выявить линейные антигенные детерминанты для моноклональных антител, полученных против АПФ человека.

5) Для выявления новых ингибиторов АПФ провести скрининг среди различных групп синтетических соединений, включающих производные аминокислот, пептидов и другие органические соединения.

6) Исследовать природные ингибиторы АПФ, обнаруженные в семенах подсолнечника.

Научная новизна и практическая значимость исследования.

I. Методом пептидного сканирования впервые были определены линейные антигенные детерминанты (В-эпитопы) N- и С- доменов молекулы АПФ человека. Анализ их расположения позволил выявить отличия в антигенной структуре доменов. Результаты сравнения выявленных антигенных детерминант со структурой доменов некоторых видов млекопитающих могут быть использованы для получения группоспецифических и моноспецифических антипептидных антител для каждого из доменов АПФ. Для АПФ исследования подобного рода ранее не проводились.

II. Переходя к рассмотрению второго направления нашей работы, нужно отметить, что проблема создания эффективных лекарственных средств для лечения сердечно-сосудистых заболеваний продолжает оставаться актуальной, особенно в связи с перспективой создания препаратов, избирательно тормозящих активность одного из двух доменов, что дает возможность варьировать биологические функции фермента. Исследование различных групп синтетических ингибиторов позволило нам выявить ряд соединений с IC50 порядка 10"7 - 10"9 М. Исследован и прошел клинические испытания новый эффективный ингибитор АПФ - метиоприл, получено авторское свидетельство. Обнаружены и исследованы природные ингибиторы в семенах масличных культур (подсолнечника, рапса и льна). Получен очищенный препарат ингибитора АПФ из жмыха семян подсолнечника. Исследовано его взаимодействие с тремя формами АПФ - N-доменом, С-доменом и полноразмерным ферментом. Показано, что ингибитор из семян подсолнечника примерно одинаково тормозил активность всех трех исследованных форм АПФ. В опытах /л vivo продемонстрирован антигипертензивный эффект этого ингибитора.

11. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

И. 1. АНТИГЕННЫЕ ДЕТЕРМИНАНТЫ БЕЛКОВ.