Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние новых пептидных ингибиторов на кининазную и ангиотензин I-конвертирующую активности пептидил-дипептидазы А (ангиотензин-превращающего фермента)

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние новых пептидных ингибиторов на кининазную и ангиотензин I-конвертирующую активности пептидил-дипептидазы А (ангиотензин-превращающего фермента)"

„ А Г,

Р Г л и < <

1 '' Ч? '^кЗсСИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК I I и" ПАУЧПО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ

ПЛСТИГУГ БИОМЕ ДИЦИПСКОЙ ХИМИИ

11а правах рукописи УДК 612.821.6 - 615.78-612.8.015

КАЛИНИНА Елена Владимировна

ВЛИЯНИЕ НОВЫХ ПЕПТИДНЫХ ИНГИБИТОРОВ НА КИНИНАЗНУЮ И АНГИОТЕНЗИН1-КОНВЕРТИРУЮЩУЮ АКТИВНОСТИ ПЕПТИДИЛ-ДИПЕПТИДАЗЫ А (АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА)

03.00.04 - биологическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА -1997

Работа выполнена в НИИ биомедицинской химии РАМН

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор биологических наук, профессор О.А. Гомазков

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, профессор Глебов Р.П.

доктор медицинских наук, профессор Петрович ЮЛ.

, ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ:

Московская медицинская академия им. Сеченова

Защита состоится

„гь

шисхр

I Ои 1997 года в 11.00

часов на заседании

Специализированного Ученого Совета Д 001.10.01 при НИИ биомедицинской химии РАМН по адресу: 119832, Москва, ул. Погодинская, д. 10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ биомедицинской химии РАМН

Автореферат разослан

-¿г.. Сре^рсхл 611997 Г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат биологических наук

иЬШШ!С|!1ш к. V

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Гипертоническая болезнь и ишемическая болезнь сердца являются основными видами патологий, определяющими заболеваемость и смертность в мире. В патогенезе данных заболеваний важную роль играет ренин-ангиотензиновая система. Один из ключевых компонентов этой системы - ангиотензин-превращающий фермент (АПФ) - лептидил-дипептидаза А (КФ. 3.4.15.1) (Skeggs et al., 1956). Несмотря на то, что АПФ способен in vitro гидролизовать вещество Р, Met-энке-фапин, нейротензин и люлиберин, его основная функция заключается в гидролизе декапептида ангиотензина I (AI) до пептида прессорного действия ангиотензина П и инактивации брадикинина (БК) (Елисеева, Орехович, 1963; Yang et al., 1970). Современные данные литературы о доменной структуре АПФ, его изоформах и тканевой локализации (Wei et al., 1991; Hooper, 1994; Corvol et al., 1995), а также данные о наличие в молекуле легочного АПФ двух атомов цинка (Baiidin, Mario et al., 1995) могут расцениваться как молекулярное обоснование функциональной "двуликости" фермента. Особенности молекулярной структуры АПФ могут быть основой для проявления различной субстратной специфичности АПФ по отношению к его основным физиологически активным субстратам - брадикинину и AI.

Современная фармакология располагает достаточно большим арсеналом средств, способных менять биосинтез и активность факторов ангиотензиновой и кининовой систем. В настоящее время препараты класса ингибиторов АПФ применяются для лечения артериальной гипертонии, сердечной недостаточности, почечной, церебральной патологии и других заболеваний (Cushman et al., 1987; Beiz et al., 1994; Leonetti et al., 1995). Принято считать, что фармакологическое (и, соответственно, терапевтическое) действие ингибиторов АПФ связано с блокадой образования пептида вазопрессорного действия - ангиотензина П. При этом гораздо меньшее внимание уделяется кинин-деградирующей активности АПФ. Однако исследования последних лет продемонстрировали, что физиологические и терапевтические эффекты ингибиторов АПФ могут быть связаны не только с их воздействием на снижение синтеза ангиотензина II, но и с блокадой кининазной активности АПФ (протекция брадикинина). Предполагают, что ингибиторы АПФ могут оказывать гипотензивное действие, препятствуя катаболизму кининов, являющихся сильными вазодилаторами, и нормализуя функции эндотелия.

Поэтому патогенез ряда заболеваний (ишемическая болезнь сердца, репер-фузионные повреждения миокарда, почечная недостаточность, диабет и др.) рассматривается с учетом возможности тканеспецифической фармакологической коррекции. Использование специфических ингибиторов, действие которых распространялось бы в большей степени лишь на ангиотензиновый или кининовый профиль действия пептид ил-дипегттидазы А, позволяет расширить возможности фармакологической регуляции большого числа заболеваний, связанных с нарушениями сердечно-сосудистой системы. Установлено, что каптоприп, эналаприл обнаруживали избирательность действия в отношении кинин-деградирующей или анги-отензин ¡-конвертирующей активности АПФ (Brooks et al., 1990).

Современные данные указывают на независимое существование АПФ и его субстратов в таких органах как сердце, почки, мозг, легкие (Ganten et al., 1984; Campbell, 1985; Unger et al., 1986). Поэтому в настоящее время разрабатывается идея о локальном фармакологическом воздействии на различного рода заболевания с помощью тканеспецифических ингибиторов АПФ. Однако эта сторона действия ингибиторов АПФ изучена в настоящее время недостаточно. В этой связи исследование влияния ингибиторов АПФ по отношению к кининазной и/или ангиотензин I-конвертирующей активности АПФ в различных тканях представляется весьма актуальным.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы явилось изучение избирательного действия новых ингибиторов пептидил-дипептидазы А (АПФ) по отношению к ангиотензин I-превращающей и кинин-деградирующей активности в различных тканях.

В соответствии с основной целью работы были поставлены следующие задачи;

1. Раздельно исследовать активность ангиотезин I-конвертирущей и кининазной активностей АПФ в различных тканях организма.

2. Определить кинетические характеристики, тип действия новых пептидных ингибиторов АПФ и оценить эффективность их действия по отношению к кининазной и ангиотензин I-ковертирующей активности АПФ в различных тканях.

3. Исследовать изменения гемодинамики (параметров артериального давления) под влиянием новых ингибиторов АПФ у спонтанно-гипертензивных крыс.

Научная новизна и практическая значимость работы

Впервые раздельно исследованы ангиотензин I-конвертирующая и кини-назная активности пептидил-дипептидазы А в различных тканях организма. Выявлены величины энзиматической активности фермента для разных тканей и различные соотношения ангиотензин 1-конвертирующей и кинин-деградирующей активностей для препаратов АПФ из сердца, легких, почек, семенной жидкости и сыворотки крови.

Исследовано влияние новых пептидных ингибиторов АПФ (№'-карбокси-алкилированных дипептидов), синтезированных д.х.н. В.Ф. Поздневым (ИБМХ РАМН), на ангиотензин I-конвертирующую и кинин-деградирущую активности АПФ. Выявлено избирательное действие этих ингибиторов при гидролизе ангиотензин I-подобного (Hip-His-Leu) и брадикинин-подобного (Hip-Phe-Arg) субстратов под действием ферментных препаратов АПФ из различных тканей. Определены константы ингибирования ангиотензин I-конвертирующей и кинин-деградирующей активностей для микросомальных ферментных препаратов из легких, почек, а также для семенной жидкости хряка и высокоочищенного АПФ из легкого свиньи. В опытах ¡n vivo продемонстрировано длительное снижение артериального давления у спонтанно-гипертезивных крыс под действием препарата РР-09.

Препарат РР-09 перспективен для подробных фармакологических исследований.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы были доложены на международной конференции "Тахикинины 95" (Италия, Флоренция, 1995); на межлабораторном семинаре в Институте молекулярной фармакологии (Берлин, Германия, май 1996); на научной конференции по функциональной нейрохимии "Современные тенденции в исследовании регуляторных пептидов" (Пущино, Россия, сентябрь 1996). Апробация диссертации состоялась на совместной научной конференции лабораторий НИИ биомедицинской химии РАМН 24 декабря 1996 года.

По теме диссертации опубликовано 5 работ.

Структура и объем работы

Диссертация изложена на 114 страницах машинописного текста, содержит 12 таблиц и иллюстрирована 19 рисунками. Работа состоит из следующих разделов: "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы исследования", "Результаты", "Обсуждение", "Выводы", "Список литературы" (215 источников).

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материал для исследования активности пептидил-дипептидазы А (АПФ) получен из легких, почек, сердца, гипофиза, полосатого тела мозга и сыворотки крови крыс. Ферментный материал был представлен тканевыми микросомаль-ными фракциями. Использован также препарат АПФ из легких свиньи, полученный в Институте молекулярной фармакологии (Берлин, Германия). Препарат был очищен ионообменной хроматографией и при электрофорезе в присутствии Ds-Na обнаруживал только одну полосу, характерную для АПФ (Siems et al., 1986). Образцы спермы животных получены из Института репродукции животных (Schönow, Германия). Суспензии промытых сперматозоидов приготовлены трехкратной промывкой PBS-буфером (pH 7.3, 290-300 mOs mol/kg) с последующим центрифугированием в течение 30 минут при 12000 д.

Определение активности АПФ проводили с помощью Hip-His-Leu в качестве субстрата по методу Friedland J., Silverstein Е. (1976) в модификации Siems W.-E., Heder G., Komissarowa H. (1985). Исследование кининазной активности АПФ проводили по методу Cushman, Cheung (1970) и по методу Heder, Bottgeret et al. (1994) при помощи ВЭЖХ.

В качестве субстрата для определения кининазной активности АПФ по методу Cushman, Cheung (1970) применялся Hip-Phe-Arg. Энзиматическое расщепление субстрата под влиянием АПФ приводит к образованию гиппуровой кислоты и фенил апанил-аргинина. Гиппуровая кислота количественно экстрагируется зтилацетатом и определяется спеюрофатометрически.

При определении активности АПФ по методу Heder, Bottger et al., (1994) в качестве субстрата применялся брадикинин. При работе с ферментным материалом из спермы хряка были использованы лизиноприл - ингибитор АПФ - и/или фосфорамидон - ингибитор нейтральной эндопептидазы (КФ. 3.4.24.11). При концентрации фосфорамидона 1мкМ достигается 100 % ингибирование активности

НЭП. При использовании комбинации лизиноприла и фосфорамидона в концентрациях 1 мкМ наблюдалось S6 % блокада деградации брадикинина.

Кинетические параметры фермента определяли по методу нелинейной регрессии с использованием компьютерной программы (Davydov et ai, 1994) и в координатах 1/Vot 1/S (Корниш-Боуден, 1979).

Исследования ex vivo проведены на крысах самцах линии Wistar, массой 180 - 200 г. Тестируемые соединения вводили животным i.р. Через 1, 2 и 4 часа крыс декапитировали и активность АПФ определяли в микросомапьных фракциях полосатого тела мозга, гипофиза и в сыворотке крови.

Для опытов на спонтанно-гипертензивных крысах (СГК) были использованы крысы, самцы, массой ок. 300 г; контрольные опыты - на нормотензивных крысах Вистар-Киото того же веса и возраста. Для измерения системного артериального давления (АД) и частоты сердечных сокращений за сутки до опыта крысам под нембуталовым наркозом (40 мг/кг) был имплантирован полиэтиленовый катетер (РЕ-50, внутренний диаметр 0,58 мм) в сонную артерию. В день эксперимента бодрствующую крысу помещали в клетку, где она могла свободно перемещаться, и свободный конец катетера соединялся с датчиком давления. Регистрацию АД осуществляли в течение всего срока эксперимента. Все животные содержались на стандартной виварийной диете.

Экспериментальные результаты обрабатывали с использованием t-критерия Стьюдента и непараметрическими методами. Статистическая обработка кинетических констант осуществлялась с помощью прикладных компьютерных программ.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Л. Регионарная активность и энзимологическая характеристика пептидил-дипептидазы А (ангиотензин-превращающего фермента).

В результате проведенного исследования обнаружено , что наивысшая удельная активность АПФ при использовании Н!р-НЫ-еи и Н|р-РИе-Агд в качестве субстратов обнаружена в легких (35.0 и 40.0 ед/мг, соотв.), где она более чем на порядок превышала удельную активность фермента в других исследованных тканях. Самая низкая активность АПФ (0.6 ед/мг) выявлена в сердце, при использовании субстрата Н1р-№з-1-еи. Удельная активность АПФ в почках и

сыворотке крови была одного порядка и составляла 5.8 и 1.0 ед/мг для Ыр-НИэ-1еи и 2.8 и 2.1 ед/мг для ЬПр-РЬе-Агд.

При сопоставлении ангиотензин 1- и кининаза-подобных удельных активностей АПФ оказалось, что в сердце и сыворотке крови преобладает кининаза-подобная активность, где коэффициенты НРА/НШ составили, соответственно, 6.67, 2.1 (рис. 1). В почках удельная активность АПФ, измеренная при использовании Шр-РЬе-Агд, оказалась ниже по по сравнению с удельной активностью АПФ, измеренной при использовании Нр-НЫ-еи (НРА/НШ - 0.48).

иннГ| | вт ;

Рис. 1. Ангиотензин 1-конвертарующая и кининазная активное™ пептидил-дипеп-тидазы А в тканях крысы: а - почки, б - сердце, в - сыворотка крови, г - легкие. За единицу активности принимается количество фермента, которое гидролизует 1 нмоль субстрата в течение 1 минуты при 37 °С. В качестве субстратов использованы Н|р-Н|5-1.еи (НШ) и Шр-РИе-Агд (НРА). Концентрация белка определялась по методу Лоури (1951).

Таким образом, раздельное исследование ангиотензин 1-конвертирующей и кининазной активностей показало, что удельная кининазная активность АПФ в сердце в 7 раз превышает удельную ангиотензин 1-конвертирующую активность АПФ в данной ткани; в почках в 2 раза выше было значение удельной ангиотензин 1-конвертирующей активности, а в легких эти активности были равными.

2. Исследование влияния новых пептидных ингибиторов на соотношение ангиотензин ^конвертирующей и кинин-деградирующей активностей АПФ.

2.1. Ингибиторы АПФ/НЭП-активности.

На данном этапе работы задача состояла в исследовании ряда новых ингибиторов, впервые синтезированных в НИИ биомедицинской химии РАМН (В.Ф. Позднев). Проанализированы эффекты новых препаратов - Ыа-карбокси-алкилированных дипептидов: РР-05, РР-06, РР-07, РР-08, РР-09, а также соединений PP-30.I, PP-30.ll и РР-31. Соединения РР-05, РР-06, РР-07 представляют собой 1-карбокси-2-(бензиламинокарбонил)-зтил-дипептиды. Соединения РР-30 и РР-31 - дипегттиды, замещенные по а-аминогруппе, но со свободным карбоксилом, РР-30 - Trp-GlyOH; РР-31 - Тф-b-AtaOH. Заместитель у аминогруппы триптофана представляет собой янтарную кислоту, у которой один карбоксил свободен, а другой замещен: (RS) X-CH2CH(C00H)-L-Trp-AA-0H, где АА= Gly или b-Ala; X - карбоксиамидный заместитель.

И следование влияния вышеперечисленных соединений на активность АПФ проводилось с использованием синтетического субстрата гиппурил-гистидил-лей-цина (Hip-His-Leu) с целью отбора наиболее эффективных из ряда новых синтезированных соединений.

При сравнении ингибирующего действия соединений РР-05 - РР-09 на препаратах из сердца, легких и сыворотке крови крысы было обнаружено, что соединения РР-08, РР-09 обладают более сильным ингибирующим действием по отношению к активности АПФ, чем соединения РР-05, РР-06, РР-07. Значения IC5o для соединений РР-08, РР-09 в микросомальной фракции сердца составили 0.07 мкМ, в то время как для РР-05, РР-06, РР-07 - в диапазоне концентраций 5-70 мкМ, что свидетельствует о более низкой ингибирующей способности данных соединений. Для микросомальной фракции легкою и сыворотки крови значения IC50 для соединения РР-09 составили 0.40 и 0.002 мкМ, что на несколько порядков отличается от значений IC50 других тестируемых соединений.

Следующим этапом работы было исследование влияния соединений РР-08, РР-03, РР-30.1, РР-30.2, РР-31 на активность АПФ и нейтральной зндс-пептидазы (НЭП, К.Ф. 3.4.24.11) для доказательства специфичности действия данных соединений по отношению к АПФ. Исследование проводилось с применением двух ферментных препаратов: очищенного АПФ из легкого свиньи и

и

препарата АПФ из спермы хряка. Согласно данным G. Heder, A. Bottger, W.-E. Siems (1994) деградация брадикинина в семенной плазме контролируется, главным образом, двумя пептидазами: АПФ и НЭП. Использование в качестве ферментного препарата семенной жидкости позволило исследовать влияние вышеназванных ингибиторов на активность НЗП с применением нативного субстрата - брадикинина - при помощи ВЭЖХ. При анализе результатов прослеживается следующая картина: соединения РР-30.1, РР-30.2, РР-31 обладают слабым ингибирую-щим действием в отношении активности АПФ по сравнению с ингибиторами РР-08, РР-09. Значения IC50 соединений РР-08 и РР-09 находятся в районе концентраций 0.1-0.01 мкМ, тогда как для ингибиторов РР-30.1, РР-30.2 и РР-31 -около 100 мкМ. При изучении влияния ингибиторов на активность НЭП было показано, что ингибитор РР-08 не оказывает мигрирующего действия на активность НЭП, а ингибитор РР-09 обладает таковым лишь при высоких концентрациях (1С50=1000 мкМ). Соединения PP-30.I, PP-30.II и РР-31 тормозят активность НЭП при концентрациях 10-1000 мкМ. Значения IC50 этих препаратов составляют 200, 50 и 70 мкМ, соответственно. Сравнивая IC50 тестируемых ингибиторов со значением 1С50 "классического" ингибитора активности НЭП - фосфорамидона необходимо отметить, что разница в значениях IC50 между фосфорамидоном и соединениями РР-30.1, РР-30.2, РР-31 составляет четыре порядка.

Полученные данные для очищенного АПФ из легких и препарата семенной жидкости практически совпадают. Это свидетельствует о том, что семенная жидкость в равной степени как и очищенный АПФ может использоваться для оценки эффективности ингибиторов АПФ при использовании фосфорамидона в качестве специфического ингибитора НЭП.

Таким образом, для дальнейших исследований по изучению ангиотензин I-конвертирующей и кинин-деградирующей активностей АПФ были использованы ингибиторы РР-08 и РР-09.

2.2. Влияние соединений РР-08 и РР-09 на ангиотензин 1-конеертирующую и

кинин-деградирующую активности АПФ.

Для исследования влияния соединений РР-08 и РР-09 на ангиотензин I-конвертирующую и кинин-деградирующую активности АПФ были использованы в качестве субстратов Hip-His-Leu (HHL), Híp-Phe-Arg (НРА) и брадикинин (БК). Это

позволило раздельно оценить изменения ангиотензин 1-конвертирующей и кинин-деградирующей активностей АПФ (табл. 2).

В эксперименте использовались микросомальные препараты легких, почек крысы, сыворотка крови крысы, семенная жидкость хряка и очищенный АПФ из легкого свиньи.

Таблица 2.

Влияние соединений РР-08 и РР-09 на ангиотензин I-конвертирующую и кинин-деградирующую активности АПФ в различных органах in vitro

Источник ферм. Ингибитор ICso(HHL), 1С60(НРА), ICso(BK),

препарата мкМ мкМ мкМ

легкие РР-08 0.4 0.2

РР-09 0.04 0.006 -

почки РР-08 0.6 3.0

РР-09 0.09 15.0 -

сыворотка ~.рови РР-08 5.0 100.0

РР-09 0.002 10.0 -

семенная жидк. РР-08 0.8 _ 0.25

РР-09 0.07 - 0.01

очищенный АПФ РР-08 0.5 0.1

РР-09 0.03 - 0.009

Примечание. В качестве субстратов использованы Híp-His-Leu (HHL), Hip-Phe-Arg (НРА) и брадикинин (БК); определение выполнено при использовании методов ВЭЖХ; Cushman, Cheung (1970); Siems, Heder, Komissarowa (1985).

Из результатов следует, что РР-09 обладает гораздо более выраженной ингибиторной активностью как в отношении гидролиза Hip-His-Leu, так и в отношении гидролиза Hip-Phe-Arg. Исключением являются лишь данные для гидролиза Hip-Phe-Arg в почках, где значение ICso(HPA) составило 15.0 мкМ для соединения РР-09 и 3.0 мкМ для соединения РР-08. При сравнении ингиби-рующего действия соединений РР-08 и РР-09 на препаратах АПФ из различных тканей видно, что оба препарата в большей мере тормозят гидролиз брадикинина и Hip-Phe-Arg, нежели гидролиз Hip-His-Leu. Исключение составляют результаты,

полученные для сыворотки крови (оба субстрата) и для микросомальной фракции почек (Hip-Phe-Arg). Важно отметить, что в целом эффективность тормозящего действия ингибитора РР-09 была существенно выше, чем для РР-08.

Таким образом, при сравнении ингибирующего действия РР-09 в отношении гидролиза Hip-His-Leu и Hip-Phe-Arg (БК) выявлены различия для анализируемых тканевых препаратов АПФ. Эти различия наиболее выражены в легких, семенной жидкости и для очищенного АПФ, где преобладает гидролиз Hip-Phe-Arg (БК). В почках и сыворотке крови наоборот преобладает гидролиз Hip-His-Leu.

Эти закономерности подтверждаются при определении №. Величины констант торможения при гидролизе Hip-His-Leu оказались значительно выше для соединения РР-08 и значительно ниже для соединения РР-09. Исключение составляет константа торможения для РР-09 в микросомальной фракции почек при использовании в качестве субстрата Hip-Phe-Arg (4.00 мкМ). Это означает более выраженную специфичность соединения РР-09 как ингибитора ангиотензин I-конвертирующей активности АПФ для ферментного препарата почек.

3. Исследование биохимической и физиологической активности новых пептидных ингибиторов ангиотензин-превращающего фермента.

На основании проведенных ранее экспериментов in vitro был определен рабочий диапазон доз ингибиторов. В серии экспериментов на животных было исследовано влияние соединений РР-08 и РР-09; препараты вводились крысам i.p.. Активность АПФ определялась через 1, 2 и 4 часа после введения ингибиторов (рис. 2).

а Ь с

j ткань

I___ _______________

Рис. 2. Изменение активности АПФ под влиянием РР-09 (20 мг/кг) в процентах от контроля в опытах на крысах ex vivo: а - сыворотка крови; b - гипофиз; с - полосатое тело мозга. п=5, р< 0,05 по сравнению с контролем.

Через 1 час после введения препарата РР-ОЭ в сыворотке крови и означенных тканях обнаружено существенное снижение активности АПФ (до 50 % от контроля). У животных, забитых через 4 часа активность АПФ уже не отличалась от контроля; более того в сыворотке крови ее уровень был выше исходного на 27 %. Полученные данные свидетельствуют о там, что значительная эффективность действия препарата РР-09 достигается уже спустя 1 час после его введения целому животному.

После введения РР-08 в сыворотке крови, гипофизе и полосатом теле мозга значимого изменения активности АПФ через 1 и 2 часа не наблюдалось.

Последующая серия исследований с ингибитором РР-09 была проведена на крысах с наследственно-обусловленной гипертензией. Сравнение с нормотен-зивными крысами линии Вистар-Киото показало, что вводимый им в дозе 20 мг/кг препарат РР-09 не оказывал заметного влияния на показатели АД. Не отмечалось также изменений частоты сердечных сокращений у этих контрольных животных. У спонтанно-гипертензивных крыс, у которых исходное давление составляло 166 мм рт. ст., введение препарата РР-09 уже через 30 минут снижало АД на 30 %. В последующем - через 3 часа - уровень АД снижался на 40 % от исходного, приближаясь к величинам нормотензивных крыс -104-108 мм рт.ст. (рис. 3).

110

50

о

30

60

ео 120 180 240

время, ыкн

Рис. 3. Изменения артериального давления у нормотензивных (НТК) и спонтанно-гипертензивных (СГК) крыс после введения РР-09 в процентах от контроля. п=5, р< 0,05.

Таким образом, в результате проведенных исследований было продемонстрировано: (а) высокая биохимическая и физиологическая активность соединения РР-09 в опытах как in vitro, так и на целом животном; (б) характерное для РР-09, как и для других, "классических" ингибиторов АПФ, снижение АД у СГК при отсутствии такого эффекта у нормотензивных крыс; (в) краткосрочность эффекта ингибитора РР-09 на активность АПФ в органах (при исследовании ех vivo), но много более длительное влияние на снижение АД у СГК.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

При обсуждении полученных результатов следует выделить три аспекта: (а) соотношение ангиотензин 1-конвертирующей и кинин-деградирующей активностей АПФ для ферментных препаратов из различных источников; (б) эффективность ингибирующего действия соединений РР-08 и РР-09 в отношении АПФ из различных тканей; (в) селективность новых ингибиторов АПФ - соединений РР-08 и РР-09 - в отношении различного профиля активности АПФ.

Представленные результаты выявляют не только различные величины эн-зиматической активности пептидил-дипептидазы А для разных тканей и органов, но и различные соотношения ангиотензин I-конвертирующей и кинин-деградирующей активностей АПФ для препаратов из сердца, почек и сыворотки крови. Это означает, что при наличии в тканях in vivo соответствующих субстратов функциональная значимость АПФ, как ключевого фактора образования ангиотензина II или деградации брадикинина, может быть различна.

Использование Brooks и соавторами (1990) в качестве ангиотензин I-подобного и кинин-подобного субстратов Hip-His-Leu и Hip-Phe-Arg, соответственно, позволило рассмотреть вопрос о селективности ингибиторов АПФ в отношении гидролиза данных субстратов. Идея использования Hip-His-Leu и Hip-Phe-Arg для оценки эффективности действия ингибиторов АПФ была применена нами в дальнейших исследованиях.

Приведенные в обзоре литературы данные о доменной структуре АПФ, его изоформах и тканевой локализации, а также данные о наличие в молекуле легочного АПФ двух атомов цинка (Wei et al., 1991; Hooper, 1994; Baudin, Mario et al., 1995) может расцениваться как молекулярное обоснование функциональной "двуликости" фермента. Особенности молекулярной структуры АПФ могут быть, по нашему мнению, основой для проявления различной субстратной специ-

систем. Однако тканевая (органная) селективность таких средств остается еще проблематичной.

Из группы пептидных ингибиторов РР-05, РР-06, РР-07, РР-08, РР-09, РР-30.1, РР-ЗО.И, РР-31 были отобраны соединения РР-08 и РР-09. Оба соединения являются конкурентными ингибиторами АПФ. Полученные значения IC5o соединений РР-08 и РР-09 отличались на несколько порядков для всех тестируемых тканей. Как следует из результатов, оба ингибитора в легких и семенной жидкости проявляют более выраженный эффект в отношении именно кинин-дегра-дирующей функции АПФ: соотношение ICso(HPA, 5K):ICso(HHL) было меньше единицы. В сыворотке крови соотношение этих коэффициентов для ингибиторов РР-08 и РР-09 значительно превышает единицу и свидетельствует, таким образом, о преимущественном торможении ангиотензин I-конвертирующей активности АПФ. При этом соединение РР-09 проявляет значительно большую эффективность торможения гидролиза антотензин-подобного субстрата (HHL) по сравнению с БК-подобным субстратом (НРА): коэффициент селективности - 5000. Для михросомального препарата почек коэффициенты соотношений IC50 для соединений РР-08 и РР-09 оказываются различными. Ингибитор РР-08 более эффективно тормозит гидролиз ВК-подобного субстрата (коэффициент селективности IC5o(HPA):IC5o(HHL) составляет 0.5), а ингибитор РР-09 проявляет большую избирательность действия по отношению к реакции гидролиза ангиотензин I-подобного субстрата (коэффициент IC5o(HPA):IC5o (HHL) составляет 167).

Полученные результаты подтверждают, что а) исследованные ингибиторы проявляют четко выраженную избирательность действия в торможении ангио-тензин-превращающей или кинин-деградирующей активности фермента; б) эффективность избирательной ингибирующей активности препаратов РР-08 и РР-09 - веществ с отличающейся структурой - оказывается различной..

Настоящее исследование позволяет заключить, что регуляция активности АПФ с помощью его ингибиторов может иметь различную выраженность и, соответственно, физиологическую значимость в отношении "бинарной" функции этого фермента, а также в различных тканях и органах в условиях возможного терапевтического использования. Следует отметить высокую эффективность новых пептидных соединений (РР-08 и, особенно, РР-03), впервые апробированных здесь в качестве селективных ингибиторов АПФ.

Полученные нами результаты согласуются с исследованиями Vago Т., Bevilacqua М. и соавт. (1995), которые показали, что исследуемые ими ингибиторы

АПФ - каптоприл, делаприлат, эналаприлат и Ro 31-8472 (аналог цилазаприла) -обладают тканевой селективностью к N- или С-доменам молекулы АП).

Учитывая результаты Wei et al. (1991) по исследованию молекулярной структуры АПФ: наличие активных С- и N-доменов в молекуле АПФ, - которые могут свидетельствовать о различной субстратной специфичности по отношению к брадикинину и ангиотензину I, - следует отметить, что вышеприведенные данные и наши результаты могут быть интерпретированы с точки зрения тонкой фармакологической регуляции активности АПФ.

Данные, описывающие изменения периферических звеньев регуляции артериального давления, позволили впервые обратить внимание на то, что ведущим компонентом развития гипертонической болезни является не столько прогрессирующая активность ангиотензиновой системы, сколько ослабление функции кининовой системы крови, выполняющей функцию своебразного "ограничителя" факторов прессорной регуляции. Эта гипотеза была подробно обоснована в работах U.K. Шхвацабая и А.А. Некрасовой (1977), В.В. Карпицкого (1986), непосредственно исследовавших активность компонентов калликреин-кининовой системы в клинике гипертонической болезни и у экспериментальных животных (см. также Дзизинский, Гомазков, 1976). Особая роль в этих ситуациях принадлежит АПФ, связывающему ренин-ангиотензиновую и калликреин-кининовую системы крови, функция которого направлена в конечном счете на поддержание артериального давления. Наши данные о влиянии ингибиторов АПФ на ангиотензин 1-конвертирующую и кинин-деградирующую активности АПФ могут свидетельствовать о возможной селективной коррекции кининовой активности в различных вариантах сердечнососудистой патологии. Можно предположить, что задачей последующих фармакологических изысканий может быть поиск ингибиторов АПФ с более выраженной активностью в отношении защиты именно кининового звена.

В последнем разделе нашей работы проведены исследования биохимической и физиологической активности соединений РР-08 и РР-09 на крысах -самцах линии Wistar. Задачей наших исследований на данном этапе работы было изучение изменений активности АПФ в гипофизе, сыворотке крови и полосатом теле мозга ex vivo. Исследования, проведенные на целых животных: 1) определение активности АПФ в различных органах после введения ингибиторов РР-08 и РР-09, 2) изменение уровня артериального давления у слонтанно-гипертензивных крыс при введении ингибитора РР-09 показали эффективность новых ингибиторов АПФ для коррекции АД в условиях патологии. Сравнение этих

двух серий экспериментов выявило некоторые различия: снижение активности АПФ в исследованных органах (опыты ex vivo) нивелировалось к 4 часу эксперимента после введения РР-09, в то же время введение той же дозы препарата РР-09 спонтанно-гипертензивным крысам приводило к стойкому снижению АД в течение всего времени эксперимента. У нормотензивных крыс та же доза ингибитора РР-09 не вызывала изменения АД. Этот результат демонстрирует очевидную разницу биохимических и физиологических механизмов регуляции АД, сопряженных с функцией АПФ.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что препарат РР-09 обладает значительной биохимической и физиологической активностью в опытах как in vitro (на ферментных препаратах из различных источников и различной степени очистки), так и на целом животном; новый ингибитор РР-09 вызывает характерное снижение АД у СГК при отсутствии такого эффекта у нормотензивных крыс

ВЫВОДЫ

1. Раздельное исследование ангиотензин I-конвертирующей и кинин-деградирующей активностей пептидил-дипептидазы А (АПФ) с использованием специфических субстратов выявило существенные различия удельной активности в ферментных препаратах легких, почек, сердца и сыворотки крови. Величины удельных активностей были наивысшими для препаратов АПФ легких; для АПФ сердечной ткани величина удельной кининаза-подобной активности в 7 раз превышала удельную ангиотензин I-конвертирующую активность.

2. На микросомальных фракциях АПФ из гипофиза, полосатого тела мозга, сердца, сыворотки крови протестированы новые ингибиторы АПФ из группы NT-карбоксиалшпированных производных энапаприпа. Определены константы торможения и доказан конкурентный характер ингибирующего действия соединений РР-08, РР-09 по отношению к АПФ из различных тканевых источников.

3. Обнаружено избирательное действие ингибиторов РР-08 и РР-09 при

гидролизе ангиотензин I-подобного (Hip-Hls-Leu) и брадикинин-подобного (Hip-

/

Phe-Arg) субстратов. Соединения РР-08 и РР-09 проявляли большую ингиби-рующую активность в отношении гидролиза кинин-подобного субстрата для препаратов АПФ из легких и семенной жидкости. Для ферментных препаратов из

почек и сыворотки крови превалировало торможение гидролиза ангиотензин I-подобного субстрата.

4. Препарат РР-09 обладал высокой эффективностью торможения активности АПФ в тканях ex vivo, а также существенно снижал артериальное давление у спонтанно-гипертензивных крыс.

5. "Бинарная" активность пептидил-дипептидазы А в отношении гидролиза физиологически значимых пептидов (ангиотензина I и брадикинина) обнаруживает тканевую специфичность и селективно тормозится ингибиторами АПФ.

ОПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Pozdnev V., Gomazkov О., Kalinina Е. Novel synthetic peptidase inhibitors for pharmacological analysis of tachykinin activity. //Abstract book. Tachykinins 95, from basic science to clinical applications (Florence, Italy). - 1995. - P. 108.

2. Гомазков O.A. Позднев В.Ф., Калинина E.B., Комиссарова Н.В., Медведева H.A., Нестерова М.А., Петрий О.П. Исследование биохимической и физиологической активности новых пептидных ингибиторов ангиотензин-прев-ращающего фермента. //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -1996. - Т. 122, №9. - С. 279-281.

3. Калинина Е.В., Позднев В.Ф., Комиссарова Н.В., Гомазков O.A. Влияние новых пептидных ингибиторов на соотношение ангиотензин I-конвертирующей v кинин-деградирующей активностей дипептидилкарбоксипептидазы (ангиотензин-превращающего фермета). //Биохимия. - 1997. - Т. 62, №3. - С. 191-195.

4. Калинина Е.В., Гомазков O.A., Позднев В.Ф. Влияние новых селективны) ингибиторов на ангиотензин I-конвертирующую и кинин-деградирующую актив носги ангиотензин-превращающего фермента. //4-й симпозиум "Химия протеоли-тических ферментов". Тез. докл., Москва. - 1997.

5. Гомазков O.A., Калинина Е.В. Ангиотензин-превращающий фермент бинарная функция, ингибиторы и роль кининового звена. //Успехи современнок биологии. -1997. - Т. 118, вып. 2.