Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Кининобразующее и кининпотенцирующее действие ядов центральноазиатских змей

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Кининобразующее и кининпотенцирующее действие ядов центральноазиатских змей"

^ ^ АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН ^ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ

На правах рукописи УДК 577.11.112:547.993

СУЛТАНАЛИЕВА Надира Мурадовна

КИНИНОБРАЗУЮЩЕЕ И КИНИНПОТЕНДИРУЮЩЕЕ Д ЯДОВ ЦЕНТРАЛЬНОАЗИАТС/

03. 00. 04 — биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ташкент — 1997

Работа выполнена в лаборатории энзимологии Института биохимии АН РУз.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Л. Я. ЮКЕЛЬСОН

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Р. Г. СУЛТАНОВ,

кандидат биологических наук 3. М. ГОЛУБЕНКО

Ведущая организация: Ташкентский Государственный

Университет

Защита состоится « $ ч> 1997 года

в -¿4 часов на заседании Специализированного Совета Д 015.16. 01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Институте биохимии АН РУз по адресу: 700143, Ташкент, пр. X. Абдуллаева, 56.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии АН РУз.

у

Автореферат разослан 1997 г.

'Ученый секретарь Специализированного

Совета, доктор биологических наук ^/у/7 П. МИРХАМИДОВА

Актуальность проблемы, выяснение физико-химических основ регуляции относится к центральным проблемам современной биологии и медицины. Исследования в этой области способствуют прогрессу фундаментального знания и одновременно создают научную базу Для направленной коррекции регулируемых процессов, что позволяет эффективно решать практические задачи биотехнологии, медицины н сельского хозяйства. В совокупности это свидетельствует об актуальности биохимических исследований регуляции на современном.этапе и позволяет прогнозировать их актуальность в будущем (Кошлэнд Д.Е.,1987).

Калликреин-кинааовая система (ККС) обеспечивает один из фундаментальных' механизмов физиологической регуляции, а её действующее начало - кинииы определяют, как паракринные гормоны (Carretero О. Ж Scicli A.G., 1989¡. Из-за тесной связи с другими регуляторными системами нарушения ККС ведут к многочисленным патологическим проявлениям (Дзизинский А.А. и Тоназхов О,А.,1976; Пасхина Т.е.,1980),среди которых наиболее широкую известность получили изменения давления крови (Fitzgibbon W.R. et al.,1993¡ Nishlmura K.,1992). ККС - саморегулирующаяся система и необходимый уровень кининов поддерживает с помощью двух принципиальных протеолитических реакций! освобождения кининов из предшественников и их разрушения. Поэтому, помимо взаимодействий на уровне рецепторов, эффекты кининов потенцирует подавление их разрушения специфическими энзимами, известными как хинийазы..используемые в ККС принципиальные реакции протеолЯза характеризуются особенностями, зависящими от свойств катализирующих эта реакции ферментов« кининогеназ (каллнкреинов) и кннНМаэ.

кинины найдены в свободном состояний в некоторых ядах, например, Муравьёв, пауков, перепончатокрылых а ящериц (Львов В.М. и др., 1989; Соснийа Я.Д., 1990; Мукаыецов И.Ф.,1991; Piek Т., 1991; TU А.Т., 1991). В отличие от них змеиные яды Не содержат свободных кининов, но влияют на их уровень и эффекта благодаря кишШ(оген)атакующим энзимам: калликреИнам и кинйназам; кроме того, в ядах змей есть компоненты, модифицирующие активность названных энзимов, и потому влияющие на уровень и эффекты кининов опосредованно (Rothschild А.М. & Rothschild Z., 1979). Таким образом, яды моделируют некоторые реакции,'имеющие место в ККС, поэтому их исследования способ. 1

ствуют выяснению функционирования этой регуляторной системы. Помимо этого, изучение хинин-освобождающего и хинин-потенци-рующего действия расширяет представления о составе и свойствах отдельных ядов и рекомендуют их компоненты как "инструменты" исследования и лекарства непосредственно ипи в качестве шаблонов для конструирования новых соединений такого же назначения (Би^оп М.Л.,1993). Всё вышеизложенное определяет прикладные аспекты и доказывает актуальность настоящей работы, посвященной анализу кпнйноеьооожяающего и киншшотенцнрующего эффектов ядов центральноазнатских змей.

Цель п задачи воследзвавия. Целью настоящей работы является исследование кининоподобного действия ядов центрально-азиатских змей на основе анализа их кинин-образующей и -потенцирующей активностей. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи!

1.инвентаризация протеолитнческах энзимов, содержащихся в ядах 6 центральноазнатских змей, принадлежащих к семействам гадюковых, гремучих и элатшдов, и сравнительная оценка их кинин-образующего и -потенцирующего действия;

2.разделение и характеристика кшшн -образующих и -разрушающих энзимов ядов обыкновенного щитомордника Ад. Ьа1ув Ьа1уе Р. и центральноез:ттской эфы Е.тц1Л15диап\а(:ив О»,-

3.разде ение и характеристика брадикининпотенцирующих компонентов ядов кобры 1).ох1апа Е1сЬу.и центральноазиатской эфы Е.тиЗ^хвдиатаЪиэ СЬ.

Научная новизна а практическая ценность работы. В ядах 6 центральноазнатских змей из семейств гадюковых, гремучих и элапидов протеолнтичаские энзимы впервые инвентаризованы по ■ гидролизу нативных и модифицированных белков, а также эфирных и пара-нитроанилидных производных аминокислот и олигопепти-дов. Протеазы- ядов дифференцированы как металло- и серин-за-висимые энзимы, последние характеризует высокая специфичность к связям аргинина. Способность-ядов освобождать кинины и потенцировать их эффекты подвергнута анализу в условиях интерференции одно- и противоположно направленных реакций. Установлено, что яд щитомордника освобождает кинины благодаря действию обладающих калликреиновой активностью тромбиноподоб-ного фермента и бета-фибрнногеназы. Кининосвобоядавщнй энзим яда эфы отделен от кининазы и брадикининпотенцирующих пептидов (БПП) и на основании данных о субстратной специфичности

отнесен к кининогеназам. Охарактеризованы пептидный состав и молекулярные размеры брадикинннпотенцируюцих компонентов ядой эфы и хобры, среди них идентифицированы пептидные ингибиторы карбокснпептндил-дипептидаэ¿ Полученные данные, способствуют лучшему пониманию механизма калпикренн-кининовой регуляций у высших животных, характеризуют компоненты ядов, задействованные в патогенезе интоксикации (Ismail К. et al.,1992), tt открывают возможность применения ядов и их компонентов в качестве ценных инструментов исследования, зондов (диагностаку-mod> или корригирующих факторов (лекарств) для направленного Воздействия на ККС и родственные регулятор.ные системы. Фракции БПП из ядов'кобры и эфы,подавляющие активность АСЕ и других карбоксипептидаз, рекомендованы для структурного изучения в целях создания шаблонов, необходимых при конструировании новых лекарств (Dufton M.J.,1993).

Аппробацня работы. Результаты работы докладывались на 1-ои Всемирном конгрессе по герпетологии (11-19 сёитября 1989' г., кантерберри,Великобритания); 8-ом и 9-ом Европ. симп. по животным, растительным и микробным токсинам (24-27 сентября 1989.г., Порек, Югославия п 23-26 сентября 1990 г., Лохусал-лу, Эстония), 1-ой конференции СССР по проблемам теор. и прикл. токсикологии (октябрь 1991 г., Ашхабад, Туркменистан), .5-ой конф. биохимиков республик Средней; Азии и Казахстана (12-15 ноября 1991 г., Ташкент, Узбекистан), Международных конференциях "Кинин 91" (8-14 сентябре 1991 г., Мюнхен,Германия) и "Кинин 93"(1993 г., сан-Пауло, Бразилия).

Структура диссертация. Работа изложена на Í20 страницах машинописи и включает разделы Введение, две главы Обзора литературы, Собственные исследования, включающие описание использованных в работе материалов и методов исследования (одна глава)', три главы с изложением н обсуждением полученных результатов, Заключение, Выводы и Список цитированной литературы из 186 источников на русском п иностранных языках. В работе содержится 10 таблиц и 15 рисунков.

Материалы и методы исследования.

Исследованию подвергнуты яды б центральноазпатских змей! гюрзы V.lebetina turanica С. п степной гадюки v.ursini renardl Ch. (сем. гадюковых, род Vipera), песчаной эфы E.carinatug Sehn, п центральноазиатсхой эфы Е. rcultisquamatus Ch. (сем. гадюковых, род Echis) обыкновенного ци1-люрдгги?:а

jyg.lialye halys. P.(сем.гремучих, роя .Agkistrodon) и цен-тральноазнатск'ой хобры N. oxiaria Eichw. (сем. элапипов, род Naja). Использованы 'высушенные в эксикаторе яды коплекции 1989-1990 гг., приобретенные в Уззоокомбинате или НЗИП АН РУз. ПротеопитлЧЕ.схую активность исследовали, применения дативные и модифицированные белки и пептиды, часть из которых готовили самостоятельно, а также на модельных субстратах -зфнрных и пара-ннтроаиилпдных производных аминокислот и олигап&ихнгоа, конмарчес кие препаратк которых приобретены у фирм ReanaJ. (Венгрия),Serva и Boheringer Mannheim GmbH (4>РГ), Sigma (США) и Kabi Diagnostica (Швеция). Препарат ангиотензин -конвертирующего фермента очищали из почех крупного рогатого окота, г«нпурнл-1-аргинин любезно предоставили Т.С.Пасхпна (Институт биологической и медицинской хишши АМН СССР, Моек- -ва), а танинаэу ц яда каракурта - А.А.Ахунов и 3.МЛ'ояубенко (Институт бноорганической химии АН ТУз, Ташкент).

Ферментативную активность определяли в единицах, соответствующих количеству расщеплённого субстрата или произведенного продукта, и относили её к количеству белка в пробе (Kocholatu W.F.,1966; Алексеенко Л.П.,1968;Кринская A.B. и Пасхвна Т.С., 1977; Lin Y. et al.,1969; Son К.S. & Chan K.E., 1974; Трапезникова С.С. и др.,1977; leng Ch.-H. et al., 1989). Содержание белка измеряли спектрофотометрически по поглощенно при 280 им или методом Лоурн (Lowry О.Н. et al., 1951). Брадикннин-потенциругощую активность исследовали по усилакию ыиотропного действия стандартной (пороговой) дозы брадикчннка (БК) в присутствии тестируемого материала - яда пли фракций (Kato H. & Suzuki T.,1971) и оценивали в единицах, соответствующих количеству(концентрации) материала, вызывающего удвоение коитрактильной активности стандартной дозы БК в условиях, когда ответная реакция мышечного препарата не зависит от концентрации самого БК.

Шотропную (контрактильную) активность исследовали на мьшечнык препаратах рога матки крысы (uterus), подвздошной кишки (Ileum) морской свинки и сегмента стенки аорты, используя рекомендации Дзязинского A.A. и Гомазкова O.A. (1976) и Ю.П. Ведерникова и др.(1988). Этим же методом регистрировали уровень БК (мкг-экв/мг) при изучении киннногеназного и кпни-вазного действия ядов и фракций(Евсееева П.Ф. и Энршсес О.Б., 1969).

фракционирование осуществляли' в условиях кидкостцой хро-' матографпп на .молекулярных ситах и ионообмённнквх-с ¡¡елольэо-ванием носителей фирм Pharmacia (Швеция)'и Signa (США). Для разделения пептидов применяли электрофорез с реагентами фирмм Eiorad (С2Л), пластинки силикагеля (СПофа, Чехословакия) и хроматогрзфическую бумагу FN 16 (VEB Specialfabrik, ФРГ) и Whatman ЗММ (Whatman, Англия).

Приведенные в работе результаты собственных иссладовайИй представляют собой средний не менее 6 измерений. Все они подвергнуты статистической обработке с расчётом.Хритериев достоверности (Беленький Б.Л.,1963)..• АНАЛИЗ ПРОТЕОЛИТ'ЦЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ЯДОВ ЦЯПТРАЛ5НОАЭНАТСЯ51Я 31 ей В СВЯЗИ с ИХ КИНИНОБРАЗУКЩКМ и ккшндеструятйвным ДЕЙСТВИЕМ.

Результаты наших исследований протеолнтической активности ядов б центральноазнатских змей на рутинных белковых субстратах (казеин, гемоглобин), взятых в иамодйфицированном состоянии, в целом согласуются с литературными данными (Тура-кулов Я.Х. и Морозова Р.Ф., 1964; Сахибов Д.Н. 11 др-;,1372). Вместе с тем, ны установили, что они демонстрируют только часть протеаз, содержащихся в этих ядах,'так как ЭДТА полностью подавляет гидролиз рутинных белков, тогда'как активность ядов в отношении эфирных и пара-нитроанилидныХ пронаводных в присутствии ЭДТА сохраняется, но подавляется дфф н ФМСФ. Таким образом, в ядах :гмей удаётся дифференцированно обнаружить протеолнтическне ферменты из двух разных групт металлопротеаз и серииовых энзимов типа I (Baynolj R.J. s Bond J.S.,1990). При этом сравнение ь^фектнвностн гидролитического действия на эфирные; производные размах аминокислот выявляет выраженную специфичность змеиных ядов в отнойении пептидных связей арг::чина. Применение мод ифйци£юва ИНЫХ белковых субстратов - метилированных производных казеиаа и киннно- . гена позволяет обнаружить и оценить эффективность- проч)аолиза, чувствительного к ингибиторам металл»- и сериязависимых яро- ' теаз. И всё же суммарная оценка гидролиза пептидных связей в метилированном кининогене не характеризует калл.икреиновую активность, представляющуюся более специфичным признакам.

Наиболее адекватным приёмом для характеристики кинин -освобождающей активности ядов, конечно, является регистрация накопления киншгав как продуктов реакции» ¡о р-'йны открывают

• 5 - ' . •

по их сократительному действию на мышечные препараты/ которое свойственно также многим другим компонентам змеиных ядов,Это например, доказывают результаты наших собственных исследований контрактильнай активности ядов змей Центральной- Азии на препаратах гпадких мышц рога матки крысы, подвздошной кивки ': морской свинки и сегмента станки аорты- Чтобы эту трудность преодолеть. Предлагается оценивать кагОжреиноэую активность по гидролизу БАЭЭ или специфических хромогениых субстратов (1»апада 3. & ЗигикХ Т. ,1373) Тепд СЬ.-М. еЬ а1., 1989,1992).'■ Мы сопоставили все эти три приёма» Полученные данные, характеризующие кининосвобождающее действие ядов змей Центральной Азии, приведены в таблице X. Суммируя три ипольаован-ных подхода, можно заключить, что все исследованные яды, исключая характеризующийся чрезвычайно низким содержанием протеаз яд кобры, обладают способностью освобождать кйнинЫ; • ыиотропную активность, прямо Иллюстрирующую их эту способность, яды демонстрировали в концентрациях, намного {2-3 по- , ряДха) меньших, чем требуется для проявлена их собственной контрактильной активности. ЭДТА даже в предельно высоких концентрациях (10 ЫМ) не блокировал ни одной из поименованных ' выше активностей, тогда как ингибиторы сериновых протеаз (ДФ4> и меньше ФМСФ) оказалась Эффективными бпокаторами. На этой основании кишшосвобокдающее Действие ядов можно связывать с сериновыми протеазами. однако обращает внимание неполная корреляция результатов оценки кйнаносвобождающей активности исследуемых ядов тремя независимыми приёмами! сложный состав ядов, т.е. наличие большего числа БАЭЭ-эстераз или амидаз/ чем специфически освобождающих кинины энзимов, равно как и интерференция компонентов ядов с противоположным действием могут быть причиной такой несогласованности. Действительно, сопоставление .'расщепления БАЭЭ цельными ядами змей и извле-чёными из них фракциями калликреинов (Пасхйна Т.е. и Кринская А.В.,1977), показало, что гидролиз БАЭЭ характеризует всю каллихреиновую активность только ядов змей рода ЕсЫб, а БАЭЭ-эстеразы других ядов характеризуются более пнрокой специфичностью. Другой оад интерференции представлен реакцией . разруаения хининов, протекающей параллельно с процессом их освобождения из предшественника. Вызывающие разрушение кини-иов энзима. -кинииазы имеют разную позиционную специфичность» они отлепляют С-концевой остаток или дипеятид и атакуют

Таблица 1.

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЕАЗЭ-ЭСТКРАЗНОЙ, АМИДОЛИТИЧЕСКОЙ И КИНИНОСВОБОЖДАЮЩЕЙ АКТИВНОСТЕЙ

ядоа ЦЕНТР АЛЬНОФЗИАТСКШС ЗМЕЙ. (согсрацааня:У1,Т-У.1еЬе^па Гигапхса С. ;Уик-'^.игзхэп! гепегс11 С(1. ;ЕС-Е_саг1па£иэ ЗсЬп. ;ЕМ-Е-пиЯ^здиатагиз СЬ.;АдНН-Ад.Ьа1уз Ьа1уэ Р.;Ш-Ы.оххапа Е^сЬм.;БАЭЭ-этилобый эфир Я-бензоил-1-аргинина;БК-брадикинин;32302-хромогенный субстрат; А-ахтявность,ед; ОА-оста точная активность после преинкубации с феиилметилсульфонипфторкдом [ФМСФ*] или днизопропилфторфосфатом 1ДФФ**])

яда АКТИВНОСТЬ (ад/кг баяка яда) ПРИ ДЕЙСТВИИ НА СУБСТРАТЫ

ВАЭЭ • ( 62302 ХРОМОЗИМ РК КИНИЗОГЕН ( в икг БХ/мня) -экз

А»ед ОД* в А,вД ОД* А,вд ОА* А,вд ОА*

\ял 17.75 ' ед 0.80 % 4.5 20.70 ед 6.10 ' % 29.4 7.50 ед 2.8 % 37.3 ед 0.0076 0.0003 8 0.0022 0.0001 л . % 5.0

7.80 0.30 3.8 0.73 0.22 30.1 1.44 0.4 27.7 4.5

ЕС 2.40 0.С5 2.0 1.50 0.52 34.6 • 3.75 1.4 37.3 и 0.0042 0.0001 л 3.3

ЕМ 3.40 0.14 4.1 9.15 3.20 34.9 в.90 . 2.7 30.3 ■ 4 0.0066 0.0002 3.4

АдНН 5.46 0.02 0.3 7.96 2.80 3.51 5.45 1.4 25.6 0.0066 0.0002 1 отс 3.2

N0 сл сл СП

внутримолекулярные пептидные связи как эндопепгидазы, причём в ядах змей обнаруживают, главным образом, последние (Suzuki Т. & Iwanaga S.,1970). Кнниназную активность ядов цеатрапьно-азнатскнх змей мы исследовали по гидролизу специфического субстрата хининазы I гиппурнл-1-аргинина и по инактивации брадикинина (табл.2).

Таблица 2.

КИНИВРАЗРУШАЮЩЕЕ (КИШНАЗНОЕ) ДЕЙСТВИЕ ЯДОВ ЦЕНТРАЛЪНОАЗИАТСКИХ 3KEÜ (coKpaneHHfliVLT-V.lebetir.a turanica С.; VUR-V.ursini renardi Ch.j EC-E.carinatus Sehn.;EM-E.multisquamatus Ch.;AgHH-Ag. ' halys halys F.; NO-H.oxiana Eichw.; А-активность, 0A-остаточная активность, ЭП-эффект потенцирования)

ЯДЫ ФЕРМЕНТАТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ (А,ОД/иг балка яда) ПРИ

ЗМЕЙ ДЕЙСТВИИ НД

гвппурпл-Х-аргавпн "гоздвкипнн*

А, од + ЗДТА (10 кМ) А +ЭДТА (10 ИИ)

OA, ед OA, ОД ОА,%

VLT 0.29 0.02 .6.8 0.01340 0.00108 8.0

VUR 0.20 0.01 " 5.0 0.01120 0.00085 7.5

ЕС 0.1Г 0.01 5.5 - эп

ЕМ 0.27 0.01 3.7 эп

AgHH 0.56 0.03 5.3 0.0089 0.00060 6.7

N0 0.55 0.02 3.7 ЭП

*содеряание брадикинина рассчитывали по миотропной активности преию убированного с ядом БК в сравнении со стандартным синтетическим БК.

Полученные результаты обнаруживают аргинин-специфичную карбоксипептидазную активность во всех исследованных нами ядах центральноазиатских змей.Однако прямо оценить разрушение БК по уменьшению миотропной активности удаётся не во всех ядах! измерена кининазная активность ядов гадюк рода Vípera.и щитомордника, но количественной оценке кининразрушающего действия остальных ядов мешает их брадикининпотенцирующая активность. Известно, что один из механизмов потенцирования БК заключается в подавлении его разрушения. Таким образом, на основании наших даных нельзя исключать возможность существо-

ванпя и соответственно интереференции кшшногеназ и кишшаз в ядах змей рода Echis; менее вероятна такая иитереференция в яде кобр, но БПП-активность этого яда также представляет существенный интерес. Ниже представлены результаты наших исследований по более чёткой дефиниции интерферирующих активностей.

ИССЛЕДОВАНИЕ КНВПН - ОСВОБОЖДАЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ЯДОВ ОБЫКНОВЕННОГО ЩИТОМОРДНИКА AGKISTRODON HALV3 HAX.YB Р. И ЦЕНТРАЛЬНОАЗИАТСХОЙ ЭФЫ ECHIS KULTISQUAMATUS СП.

Яды эфы и щитомордника разнятся по браднкшшн -потенцирующей активности и спосйбности инактивировать брадикинин. Эти отличия обнаруживает также анализ динамики гидролитического действия обоих ядов на кининоген с регистрацией количества освобожаемого БК в ходе реакции (рис.1). Яд эфы демонстрирует стандартную кинетику реакции первого порядка с выходом на константное "плато" по достижении максимального (100%) эффекта. "Ниспадающее" плечо на кинетической кривой яда щитомордника демонстрирует разрушение продукта реакции. Хотя оба яда по истечении 15 минут инкубации характеризуются одинаковой кининогеназной активностью 0.0066 мкг-экв БК/мин/ мг белка яда (табл.1), динамика освобождения кннннов ядом щитомордника обнаруживает отставание скорости реакции, что может быть обусловлено параллельно идущим процессом разрушения продукта. При этом реакцию разрушения обеспечивает другой энзим, так как введение в среду ЭДТА "исправляет" кинетику освобождения канонов ядом щитомордника, устраняя ниспадающую ветвь кинетической кривой (рис.2). Такой эффект ЭДТА доказывает, что разрушение новообразованного продукта никак не связано ни с кишшосвобождающей активностью яда, ни с какой-либо другой протеазой яда такого же типа, а скорее принадлежит кншшазам, которые, как известно (Francis В. & Kaiser I.X., 1993) являются металлопротеазами. Для более точной дефиниций кининосвобождающих энзимов этих ядов мы исследовали фракции, полученные в нашей лаборатории при выделении тромбино-подоб-ного фермента (ТПФ) и антикоагуляитных фибриногеназ из яда щитомордника (Барабанщикова H.A.,198) и активатора протромбина и геморрагических протеаз из яда эфы (Пейгерман С.М.,198в; Аюбова Н.С.,1989).

БАЭЭ-эстераза' и хининосвобождакидая активность яда щитомордника распределялись между его коагуляйтн^.,. и анти. 9

Чреда,мин.

Кшшносвобождающее действие ядов щитомордника (АдНН) и эфы (ЕМ)

Рвс.1 ■■ ..'•'•••.■

Вракз, юн.

Кнниносвобождающее действие яда щитомордника, взятого отдельно (АдНН).и с 10 мН ЭДТА(+ЭДТА) Рва.г

коагупянтной частями. Коагулянтная часть яда, содержавшая более однородный протеолитический материал - множественные формы ТПФ,освобождала кинины в отсутствие их разрушения,имела соответствующую кинетику и этим отличалась от антикоагулянт-ной части. На калликренновом субстрате (2302) большей гидролитической активностью характеризовались также коагулянтная часть яда и индивидуальный ТПФ, однако этот же субстрат, хоть и в меньшей степени, атаковали компоненты антикоагулянтной части. Фракционируя последнюю на сефадексе, разделяли гндро-лиэующую казеин протеазу и БАЭЭ-эстеразу, а освобождение БК вызывала ДФФ- и ФМСФ-чувствительная эстераза. Испытания на фибриногене выявляют бета-фибриногеназную активность этой фракции (Л.Я.К)кельсон н Э.С.Садыкой, неопубп. данние). Таким образом, оба установленных нами в яде щитомордника энзима с хининосвобождающим действием -' индивидуальный ТПФ и бета-фибриногеназа атакуют, помимо кининогена, другие белки, например, фибриноген.. Поэтому правильнее определять их как калликреин-подобные энзимы, связывая с ннми кининосвобождаю-щее действие цельного яда.

При ионообменной хроматографии яда эфы кинин- освобождающая активность концентрируется в одной фракции с активатором протромбина я геморрагическими протеазамй, являющимися, как известно (Rosing J. & Tans G., 19.92) Bjarnaaon J.В. et al.,1983),. иеталлозависиммми энзимами, однако присутствие в этой фракции также сериновых протеаэ потверждается её БАЭЭ-эстеразной и амидолитической активностями, чувствительными к действию ДФФ и ФМСФ. В ходе дальнейшей очистки кининосвобо-ждающая активность отделяется от активатора "К" в составе фракции 6i последняя не атакует протромбин и другие использованные нами бэлки, но сохраняет БАЭЭ-эстеразиув активность и эффективно гидролизует каликреиновые субстраты 2302 н 2236 (рис. 3). Отделение активатора протромбина доказывает также низкая активность фракции 6 на субстрате 2337. Гидролиз тромбинового субстрата (2238) демонстрирует общую, калликреиновую активность этой фракции, которая,как известно, свойственна тромбину и тромбиноподобныи ферментам. Однако, С другой стороны, фракция б не вызывает свёртывания фибриногена И расщепления его ,епей н следовательно отличается от этих . энзимов. Отсутствйе гидролитического эффекта фракции на других ясдользоаанных nami белках позволило кзт> е тредвари-

тельную дефиницию киннногеназы. таким образам кншш-освобо-ждающее действие ядов щитомордника и эфы имеет принципиальные отличия* в яде щитомордника его обеспечивают калликреинподоб-ныа ферменты, фунционирующие параллельно с разрушением продукта реакции, а в яде эфы процесс освобождения хининов представляется однонаправленным и обеспечивается более специфической киннногеназой. Эти отличия дополняет свойственная яду эфы брадикннншгатепцнрующая активность.

330 мо

г» гоо

150 100 50

о

D ЕМ о Fr.e а

j=fil

АМВДОПИТНЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ (юА/мип/мкг балка)ЯДА ЭФЫ (ЕМ) И КИЫИНОСВОЕОЖДАЮЩЕЙ ФРАКЦИИ С (ГГ.6) Рио.3

ИССЛЕДОВАНИЕ БРАДйКЩШНПОТЕНЦИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ ЯДОВ КОВРЫ NAJA OXIANA EICHW. И ЭФЫ ECHIS MULTISQUMATUS СН.

Способность потенцировать эффекты браднкинина, найденная нами в яде кобры и эфы, представляет ещё специальный интерес в связи с созданием новых лекарств, воздействующих на ККС я связанные с ней другие регуляторные системы (Dufton M.J., 1993). Предполагая потенцирующую ропь пептидных компонентов (Ferreira L.A. et al.,1992), мы получили пизкомолекулярные фракции ядов кобры и эфы с помощью гепьфапьтрацна на сефадек-се G-75. отсутствие самостоятельного сократительного действия и брадпкининпотенцирующая активность этих фракций была прямо продемонстрирована на мышечных препаратах рога матхн крысы и подвздоиной кишки морской свинки. Потенцирующее действие было специфичным в отношении БК, так не проявлялось в комбинации с ацетилхоланом и биогенными аминами; его действительно обеспечивали пептиды, так как потенцирующий эффект подавляют неспе-цнфическое разрушение соляной кислотой и более специфический гидролиз компонентов фракции трнпснн-химотрипсиновой смесью.

Электрофоразы и ТСХ в пептидной фракции яда кобры найдены 8 компонентов с разной величиной Rf (табл.3) и молекулярной массой в пределах 1.0-2.5 kD.

Таблица 3.

Пептидный состав фракции сз яда кобрн

ПЕПТИДЫ (воля"ина Rf) ПРП ХРОМАТОГРАФИИ НА свликагалэ в системе бумаге FN-1G в система

растворнтолай растворителей

1 2 1 2

0.025 - 0.05 Q.02

0.175 - 0.15 0.10

0.325 - 0.28 0.16

0.500 - 0.37 0.20

0.650 - 0.47 0.22

0.32 0.44 0.43'

Низкомолекулярную фракцию яда эфы удаётся разделить на две части (Illa и Illb) уже в процессе гельфильтрации цельного яда. Обе фракции обладала брадикииинпотенцирующей активностью и подавляли АСЕ из почек быка с эффективностью (IC50), равной 2.5 и 4.0 х 10 М. В этих расчётах исходили из данных электрофореза,устанавливающих во фракции компоненты с молекулярной массой 0.8 - 1.0 kD. Подробнее пептидный состав фракции III исследован хроматографией на колонке с TSK HW-40 (рис.4)1 помимо высокомолекулярной примеси (а) во фракции найдены также Э пептидов, из которых 4 обладали брадикинин-потенцируюп(ей активностью.

Хотя механизм потенцирования может быть реализован на уровне взаимодействия брадикинина с рецепторами на мембране, связь потенцирования с подавлением энзимов,инактивирующих БК, представляется несомненной. Это прямо доказывают наши данные об ингибирующем действии пептидной фракции яда эфы на АСЕ и кнниназу II яда каракурта, оказавшуюся, как и АСЕ, карбокси-пептидил-дипетидазой (Макевнина Л.Г. и др.,1990). Вместе с тем, после отделения низкомолэкулярной фракции прослеживаются изменения в кшшносвобоидаюцем действии яда эфа. Соответствующая активност установлена нами в двух высокомолекулярных фракциях этого яда (1а и Ib), но фракция Ib сохраняет свойственную цельному яду кпнетиху, тогда как фракции 1а, на-

ряду с освобождением свойственны разрушение новообразованных кининов ( рис. 5 ). Не исключено, что эта новая тенденция проявляется из-за отделения пептидов, среди которых, помимо найденных нами специфических ивгибиторов карбоксипептидил-дипептидазы, могут быть блокаторы карбоксипептидаз (кининазы II) и метаплопротеаз с эндопептидаэным действием. Во всяком случае реконструкция путём смешивания фракций 1а и III восстанавливает свойственную цельному яду динамику освобождения кининов из кининогена, делая её похожей на кинетическую кривую фракции lb (рис.5).

ЗАКЛЮЧЕНИЙ

Проведенные нами исследования обнаруживают в ядах центральноазиатскнх змей высокую протеоЛитнческую активность, которуй обеспечивают энзимы,принадлежащие к мег алло- и серин-эависимым протеазам. вызываемое некоторыми ядами освобождение кининов протекает на фоне разрушения новообразованного продукта) с другой стороны в отдельных ядах прослеживаются энзимы с меньшей специфичностью или не прямо ваяющие на уровень кинавов в ореде. Собственная контрихтильная активность ядов затрудняет оценку их кнниносвобождающего действия по накоплению продукта реакции. Тем ие менее сравнительный анализ про-теолнтцческой аткавности и динамика освобождения кининов во времени позволяет дифференцировать кининосвобождагощие энзимы как сериновке аргининспецпфнчные протеазы, а кининраэрутающие - как метаплопротеазы. Потенцирование ядами брадикинина получало объяснение! оказалось, чт один из механизмов потенцирования связан со способностью ннгнбнровать разрушение кининов. При этом соответствующие компоненты ядов кобры и эфы идеи- ифицированы как пептиды, а среда них найдены ингибиторы карбоксипептидил- дйпептидаз. с учётом дефиниции в качества карбокенпептидна-дипептидазы ангитензинконвертирующего фермента наши результаты, обнаруживающие пептидные ингибиторы АСЕ в яде, представляют специальный интерес как объекты структурно-функционального анализа с целью использования в качестве шаблонов при создании лекарств, например, для гипертонии (Stocker K.,1990a;Dufton M.J.,1993). В этой связи уместно заметить, что по эффективности подавления ACE (IC50) даже суммарные, пептидные фракции ядов эфы и кобры не уступают известным препаратам-блокаторам АСЕ (каптоприлу, эналаприлу).

Графах разделения- фракции XII яда эфа на ко-' лонхе TSK-KW 40: (а)-примесь высокомолекулярного компонента; 1-8 -пептидные фракции Рас. 4

А,*

Рраимса.

Квнитсвобоядающеа действие высокомолекулярной фракции 1а яда эфы взятой отдельно (1а) в в смеси с низхомолекулярныыя компонентами фракции III (Ia+III) того же яда."

3?ис.5

выводы

1.Протеопитическая активность ядов б видов центрально-азиатских омой, примаДпежацих к семействам гадюковых, грэму-чих и элапидов, исследована по гидролизу нативных н модифицированных белковых субстратов, а также эфирных и пара-нитро-онилндных производных аДОНОКИСЛОТ и олнгопептидов. Няни установлено!

а)в сравнении с ядами элапидов (кобры) иди гадюконых и гремучих змей независимо от их родовой принадлежности характеризуются высокой эстеро-, амидо- п протеолитической лхтпв-ностями, что доказывает более разнообразны!"! спектр и большее содержание В них протеопитПчесхнх фзрментов;

б (гидролиз рутинных белков в нативиои состоянии демонстрирует активность метаплопротеаз змеиных яцои, тогда как расщепление эфирных а пара-нитроанилидных производных и большей Мере Присуще сериновым энзимам; на модифицированных белковых субстратах выявляются протеазы из обоих групп;

В)срР-\и серШгавых протеаз змеиных ядов преобладают энзимы со специфичностью в отношении пептидных связей аргинина (Т.е. трипенноподобные).

2.По накоплению брадикиннна и гидролизу эфирных и иара-НЯтроанилндиых Производных аргинина во всех ядах центрально-цэиатсКих змей, кроме кобры, установлена активность кшшнос-еобождавшего энзима и показана его принадлежность к сериновым про±еазам.

3.По гидролизу модельного (гиппурнл-1-аргкшш) и пептидного (брпрнктшн) субстратов в ядах гадюк рода \fipern и щитомордника из рода Ацк1в1;го<5оп (гремучие) найдена киннназа, отнесённая в соответствии с результатами пнгнбиторного анализа к метаплопротёазаы. Яды гадюковых рода Ес1из п кобры N. ох!а-Ьа е1сьу. обладают мяотропной и брадикикин-потенцирующей активностями, что препятствует обнаружению киннназ.

4.В яде^обыкновенного щитомордника АдкАэ^оЗоп Ьа1ув Ьа1ув Р. диференцнроваиы и выделены в очищенном состоянии два кнНиносЁобоядающих, энзима I один из них отождествлён с ТромбиноподобпЫм ферментом этого яда, а другой идентифицирован в качестве аитшеоагулятной бета-фибршюгеназк. По широкой специфичности в отношении белковых и модельных субстратов и Чувствительности к сериимодифиццрующим агентам оба энзима Квалифицированы как сериновые калликреннподобнке протеазы.

5. Кшшносвобождающая протеаза, очишениии из яда цеи-тралыгоазнатской эфы Echis multisqunniatuo ch., характеризуется узкой специфичностью в отношении модельных н белкового субстратов,что обосновывает её квалификацию как хцниногенаэц.

6.Брадикннпипотеицирующиа компоненты яда кобры отделены от высокомолекулярных фрахцнП и получены в очищенном состоянии. Показана пептидная природа брадшшнишютенцнрурщнх компонентов. Установлена молекулярная масса <2.5 kD и ,нцхе) п по величине Rf охарактеризован состав (В отдельных пептидо») брадихниинпотенцирующей фракции яда кобры.

7.Брад11кининпотенцнруюи)ие компоненты яда эфы отделены в низкомолекулярных фракциях этого яда, содержащих пептиды с мол.м. 1.0 - 2.5 ко. В составе фракций установлено содержание не менее 8 различных пептидов, среди которых идентифицированы ингибиторы кзрбоксипептидил-дипептидазы, представленной . ангиотензин-конвертирующим энзимом из почки бмка и кншшазой яда каракурта.

В.Похаэано» что отделение ниэхоыолехулярных компонентов проявляет киш1наз|1ую активность яда эфы, локализованную среди высокомолекулярных компонентов яда.

РАБОТЫ,ОПУБЛИКОВАННЫЕ 30 ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.Biochemical study of Echis raultiaquamatuo venom/ YuXelson L.Ya., Ajubova U.S., Leigerman S.M., Sultanalieva' N.// ltli World Congress of Herpetology .Abstracts.-1989«-p.347.

2.Isolation and biochemical characterization of procoagulant enzyme and other compounds of F.chia multisquamatus Venom./ Yukelson L.Ya., Leigerman S.M., -Ajubova H.s.,Sultanalieva N. //8th European Бугф.оп Animal,Plant an I Microbial Toxins. Abstracts.1ST.-1989.-p.53

3.structure-function relationships in cardlotoxic polypeptides from Naja oxiana Eichwald venom./ Shkirtev A.V., Toli V.Ya., sultanalieva N., Yukelson L.Ya.// 9th European Syrap.on Animal,Plant and Microbial Toxins. Abstracts.1ST.t Tallinn.-1990.-p.48.

4.Султаналиева U.K., Львов B.M., Вкеяьсон Я.Я. Характеристика хшшнобразующих и кянииразругаавцих энзимов а ядах централыгаазв^тскнх змей.// Тезися 1-ой Тс-.сияологической конф. СССР по проблемам теоретической н прикладной • токсикологии.-ЛияабздвИлпм.,1991.-сс.37-38.

5.Султаналиева H.H., Львов В.М.; Юкэльсон П.Я. Киники, энзимы каллнкреин-кнниновой системы и родственные паптидв в ядах центральноаэиатскнх змей.// Тезисы 5-ой конф. биохимиков республик Средней Азии и Казахстана.Ташкент!ФАН,1991.-с.98.

6.The kallikrein, kinináse and related peptides activities la Central Asia Snake Venoms./ Yukelson L.Ta., b'vov v.M., Bhkínev A.v., sultanalieva N.//Toward Understanding the molecular basis of kinin action. Munich,1991.-p.339.

7.юкельсон Л.Я., Львов В.М., Султаналиева U.M. Кссла-дование каллнкреинов, кийаназ и родственных пептидов в яда* среднеазиатских змей.//Хин.природн.соед.-1992.-N 2.-сс.257-261.

в.The kallikrein, kininase and related peptides i activities ih Central Asia Snake Venoms./ Yukelson L.Ta., b'vov V.M.» Shkinev A.V., Sultanalieva N.M.// Recent progress In Kinin a (H.Fritz e.a. eda.) .Birkhauser Verlag»Basel B.&.,1992.-p|).430-440.

i g.l'vov V.M., Sultanalieva lit.li., Yukelson L.Ya. isolation o£ bradykinic-potentiating peptides from snake Echis jnultiaquaöatiis verion.// Rihin-93. Abstracts.Session A. San^-Paulo (Brazil),1993.-p.1.01.

Узбекнстон Фаилзр Ахадемиясл Биохимия Институт» СУЛТОНАПИЕЕА НОДНРА МУРОДОВНА Биология фанларн номзоди нлмий дара^асннн олиа учун зушоя 1у1лишга тавсия этнлган Нарказпй Ос?;!1 плсилорп эа^арларнпиаг вшап 15аспл цалувчп ва клпнн гитовцяяловчп твызирпарп Кора план, чиннирох, илон ва эпаШщлар оиласнгп мансуб 6 хил Марказий Осиё ипонпарининг кишшаяратувЧн ва кининпотен-цнлловчн тагснри бу захарларнннг протеолитик хомплекслар . тахлнли доираснда тадхн* этилди. Протеолитик эффектнн анча тупик, аннцлаш учун за^арлар куп сонли одатдаГи ва ^згарган ощсиллар, иуннндек моделли субстратларн» аыинохислоталарнинг эфирлн ва паранитроанилидли Носипалари ва протеззаларга нисбатан гуру-члн ва индивидуал олигопептидлар параллал . . тестлаштирнлдн. КоипопНейтлар комплакслари тархиби сифатида металл- йа серинга боглик булган протеазапар ^амда уларнинг ннгибиторлари ташкнл этйлди. Кобра ва эфадан таш^арн, барча бош^а илонлар захарларида кнншшар ахралиши уларнинг парчала-ниши билан параллел з^олда руй берадп! кинннлар з^оснл булнши ва пар чалашиянни юзага келтирувчи Протеолнтик фериентлар ' аргинин богларига нисбатан уэига ^ос серинлп знзимлар ва иетаплопротеазалар деб фар^ланади. ^алконтуиаух; ипони эахар-ининг тозаланган киншюгенаэалари фибриногенга гидролитик таъснри туфайпа калпикреинсимон деб ном опдц. Эфа ипони зах,аршшнг тозаланган кининогеназа фермекти анча тор й^налиип билай характерланадц. Кобра ва эфа нлонларининг тозаланган >;олда олннган брадикинннпотенцилловчи пептидлари тархиби Хакнда маълумотлар берилган, улар орасида кининаз таъсир (карбоксипептидил-днлептндаз) ннгибиторлари мавяудлиги анн^ланган. .

Institute of Biochemistry of the Uzbek Academy of Sciences SULTANALIEVA NADIRA HURADOVNA KIHIH-RELEASING AND KININ-POTENTIATING ACTION OF THE CENTRAL ASIA SNAKE VENOMS ETO4MAHÏ

Kinin-releasing and kinin-potentiating effects of the six venoms of' the Central Asia snakes from the vipers (Vipe-ridae fam.).rattlesnakes (Crotalidae fam.) and cobra (Elapi-dae fan.) have been studied in the frames of analysis of the proteolytic complex of these venoms. To measure thé proteolytic effect vith more efficacy the venoms were subjected to a parallel test on a great number of general and modified proteins as well as on model substrates, ether and para-nitro-anilide derivatives of aminp acid and oligopeptides of group and individual protease specificity among them. Metal- and serine-dependent proteases and their inhibitors have been identified as the components of the complexes, in all venoms, except the venoms of E.multisquamatus Ch. and N. oxiana Eichw., the release of kinins turned out under way along with their destruction. Proteolytic enzymes causing formation and destruction of kinins have been differentiated as the serine ones arginin specific enzymes and mstalloprot"as, . Due to

their hydrolytic effect oft fibrinogen Jcininogeiiases purified from thB venom o£ Ag .halya halys have been defined as kalli-krein-like ones, kininogenaae of E.imiltisquamatus venom is posseaing narrover orientation. There reported are the dai-a on composition of bradykinin-potentiating peptides purified from the venoms of E.multisguamatus ch. and N.oxiana Eichw., the presence of inhibitors of ki.ninase, Buch as carboxypep-tidyl-dipsptidass, having been established among them.

P. ITo^nncmio K neiaTii f /2 96z.

3qk.~UI: SGZ-pTupaftt -/OO VM6'r.0&1nt OTne'iniaiio a AtT TIliC

Taiuueirr, Hasoii, 30.