Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение и характеристика гемокоагулирующих ферментов из яда змей и использование их в медицинской диагностике

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Выделение и характеристика гемокоагулирующих ферментов из яда змей и использование их в медицинской диагностике"

АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНЫ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ ии. А. Л. ПАЛЛАДИНА

На правах рукописи

СОЛОВЬЕВ Дмитрий Александрович

ВЫДЕЛЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ГЕМОКОАГУЛИРУЮЩИХ ФЕРМЕНТОВ ИЗ ЯДА ЗМЕЙ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ИХ В МЕДИЦИНСКОЙ ДИАГНОСТИКЕ

03.00,04 - биохимия

Абтореферат Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

КИЕВ 1992

Работа выполнена в Институте биохимии им. Л.В.Лаллалниа АН Украины

Научный руководитель: доктор биологических наук

МЕДВЕДЬ Л. В. Официальные оппоненты: доктор биологических наук

старший научный сотрудник ВАРЕЦКАЯ Т. В.

доктор биологических наук старший научный сотрудник СТАРОДУБ И. Ф.

Ведущая организация: Киевский 1 осупиверапет

йм. Т.Г. Шевченко

Защита состоится^ 1992 г. в 1У часов на заседании Специализированного сонета К 016.07.01 в Инсппу гс биохимии им. А.В.Палладнна АН Украины (252030,г.Киев, ул Леоитовича,9)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института.

Автореферат^азослан февраля 1992 г.

Ученый секретарь , ^

Специализированного совета /<■ /■' КИРСЕНКО О.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Свертывание кропи представляет собой защитную реакцию организма, иалрапленую на прекращение кровотечения при повреждении сосудов. Многие внутренние заболевания сопровождаются нарушениями различных звеньев системы свертывания крови. Новым и перспективным направлением в диагностике н терапии подобных заболеваний является диагностическое и терапевтическое применение препаратов гемокоагулирующих ферментов из ядов змей. В змеиных ядах содержатся ферменты влияющие на различные звенья системы гемостаза: активирующие фибриноген, протромбин, факторы свертывания VIII, X, XII, XIII, Протеин С, индуцирующие фнбршюлнэ и агрегацию тромбоцитов. Подобные ферменты часто обладают специфичностью, отличной ог специфичности факторов спергываиия, в результате чего активация системы свертывания происходит необычным путем. При этом образуются производные, не встречающиеся при активации естественными актива юрами, ч то делает такие фермен ты чрезвычайно ценным инструментом для исследовательской работы и медицинской диагностики. Например, только при помощи гемокоаг улирующих ферментов из ядов змей можно получить такие производные, как фибршт-дезВВ, Мезотромбин, ПретромбНн 1 и др. В настоящее время ряд зарубежных фирм выпускает диагностические и лекарственные препараты на основе гемокоагулирующих ферментов из яда некоторых тропических видов змей под различными коммерческими названиями: "Арвгш", "Атроксин", "Рептилаза", "Дефнбраза", "Экарин", "Сгелвен" и др. В пашей <-ф иг: подобные препараты не производятся, а широкий импорт, несмотря па большую потребность, невозможен, ввиду ограниченности валютных средств. К тому же, аналогичные ферменты могут содержатся к в ядах отечественных зИей, однако они изучены недостаточно.

В связи с вышеиЗложеним и возникла необходимость в разработке диагностических и лекарственных препаратов на основе гемокоагулирующих ферментов йз яда Змей отечественной фауны для исследовательских и медицинских целей.

Целью данной работы являлось исследование гемокоагулирующих ферментов из ядов отечественных видов змей, а именно, п-специфичных тромбипоподобных ферментов (а-ТИФ) и ферментов - активаторов протромбина. Были поставлены следующие задачи:

- исследовать яды некоторых отечественных видов змей для тою, чгойы определить лучший источник для выделения коагулирующих ферменте» я препаративных количествах:

- выделить эти ферменты, охарактеризовать их и сравнить с уже существующими коммерческими препаратами;

- разработать па основе выделенных ферментов ряд иопих диагностических тестов.

Научна^ новизна.

- Исследованы яды 4-х видов змей рода Щитомордник (ЛдкШго(1оп). В ядах щитомордников Обыкновенного (А.Ка!у« 1т1ув ), Каменистого (А. «ахаШи ) и Водяного (А.ркскютз р^Ыисиш ) обнаружены ранее не описание а-специфичные тромбиноподобные ферменты (ТПФ), а в яде щитомордника Восточного [АЛ-ВЬтНоЦИ), кроме известного ранее,по не охарактеризовано! о а-специфичиого ТПФ, обнаружен также ранее не описаны!) р-слецифичный ТПФ.

- Разработан метод выделения ТЙФ Из яда змей рода АдШэиойоп путем аффинной хроматографии На агарозе с иммобилизованным красителем цибакрон голубой КЗОА и выделены В гомогенной состоянии а-специфичные ТПФ из ядов щитомордников обыкновенного (ЛА/га1уз) И восточного (А,Н.В1огг&ю£[И\ названые нами Анцисгрон-Н и А/щлстрон-В, соответственно. Из яда среднеазиатской эфы песчаной или многочешуйчатой (Ес/ай саННаШв тлШлциата^ ) выделен ранее не описаний фермент - активатор протромбина, названный нами Экамулином

• Исследованы физико-химические и биологические свойства выделенных ферментов, изучены особенности Их строения, субстратная специфичность и кинетика ферментативной активности.

- Проведение сравнение выделенных ферментов с известными препаратами гемокоагулирующнх ферментов из яда тропических видов змей. Показано, что Анцистрои-Н является аналогом Арвина (Анкрода) - ТПФ из яда малайского щитомордника, применяющегося за рубежом для дефибриннрующей терапии. Лпцнстрон-В является аналогом Рептилазы (Атроксина) - диагностического препарата па основе ТПФ из яда южного мокассинового щитомордника ВоНхгорэ а!гох. Экамулин, обладал сходным действием па протромбин с Экарипом -активатором протромбина из яда афро-азиатской пилочешуйчатой эфы (Е.еаЯпаГиБ ), резко отличается от него Но ряду физико-химических свойств.

- На основе выделенных ТПФ разработан новый диагностический тест для определения уровня фибриногена в Гепаринизнровапной плазме крови. На основе Экамулина создан коагуляционний диагностический тест для определения общего уровня протромбина.

Теоретическое и практическое значение работы. Получение результаты расширяют представления о биохимии змеиных ядов. Выделенные и охарактеризованные гемокоагулирующис ферменты могут быть использованы для создания препаратов для диагностики и коррекции нарушении системы свертывания крови. Данные препараты могут применятся как в стандартных диагностических к терапевтических методиках, разработанных для зарубежных препаратов, так и в новых, предложенных м настоящей работе.

Апробация рабо.тм. Материалы диссертации были доложены на Всесоюзно!! конференции "Методы получения к анализа биохимических реактивов" (Рига, 1987) и па конкурсе Совета молодых ученых Института биохимии им. А.В.Палладина АН Украины (Киев, 1990).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 печатных работы.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 136 страницах машинописною текста и состоит из введения, 4 глав обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, изложенных в трех главах, заключения, выводов н списка основной использованной литера iypu (263 источника). Работа Иллюстрирована 21 рисунком и 9 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Кристаллический и свежевзятый яды эфы мпогочешуйчатой (Ecfiís carinatus muUisqiiamatus) и щитомордника восточного (Agklstroclon lialys Blomhojyii), кристаллические яды щитомордников обыкновенного (/\.h.fmlys), каменистого (A.saxatills) и водяного (A.piscívoras pisciuoms) были получены в лаборатории экспериментальной герпетологии Трипольского биохимического завода и серпентариях зоокомбинатов гг. Алма-Аты, Ташкента и Еревана. Лиофнлизированпый яд эфы пнлочешуйчатоИ (E.carínatus, африканский подвид) любезно предоставлен проф. Кориаликом (отдел патофизиологии Каролинского университета, Прага,ЧСФР).

Протромбин получали из бычьей плазмы крови, используя ионообменную хроматографию на ДЕАЕ-Сефадексе А-50бариевого преципитат плазмы крови по методике(Bajaj eta), J973).

Фибриноген получали из плазмы человеческой крови путем фракииоиною высаливания сульфатом натрия, с последующим отделением криофибрииогепа по методике Варецкой (I960). Для очистки от возможных примесей профомбина и плазмииогена полученный фибриноген дополнительно очищали на лнзин-агарозе и обрабатывали сульфатом бария. В Конечном препарате содержание белка, свертываемого тромбином, составляло 96-98%.

Субстратную специфичность к амнлазиую активность выделенных ферментов проверяли по субстратам тромбина Chromozym TU (Tos-Gly-Pro-Arg-pNA) HS2160 (Bz-Phe-Val-Arg-pNA). фактора Xa - S2222 (llc-Clu-Gly-Arg-pNA). гландулярного - S226G (H-D-Vai-Ley-Arg-pNA) и плазменного - S2302 (II-D-Pro-Phe-Arg pNA) калликреиноп, активированною Протеина С (BOC-Lcu-Scr-Thr-Arg-pNA). плазмнна S2251 (Bz-Val-Leii-Lys-pNa) и субстрате трнпешюполобпмх ферментов BApNA (Bz-Arg-pNA).

Эстеразиую активность проверяли по ВЛЕЕ. ПАМЕ. TAME иTLME.

К о агул и руклцу.к)_актт iniincibT ромбиноподобнык ферментов оценивали.

добавляя к 0,4 ил 0,2% раствора фибриногена 0,1 мл разбавленного раствора фермента И определяли Время образования сгустка фибрина при 37°С с момента внесения исследуемого коагулянта. Аналогично проверяли действие активированного Экамулнном Мезотромбииа на фибриноген. Активность тромбиноподобНых ферментов выражали в единицах NIH. Для рассчета активности использовали калибровочный график, построенный для разных разведений тромбина с извес+ной активностью и в тех же условиях.

Активность Экамулина определяли,свертывая 0,2 ил стандартной нитратной человеческой плазмы добавлением 0,1 МЛ раствора активатора при 37°С и рассчитывая активность tío соответствующему калибровочному графику. Активность выражали либо в единицах NtH через активность образующегося в плазме под действие»! Экамулина мезотромбииа,. либо п экариновЫх единицах (Kornalik, 1985) Экспериментально Выло установление, что 1 Э.Ё. = 6,1 единиц NIH.

Амидазпую и эстерйзную активность на синтетические субстраты определяли спектрофоюметрически замеряя увеличение Поглощения При длине волны 405 им для xpoMoretmux субс-^ратов (Huitbn, 1987) и при 253 им в случае эфиров аминокислот (Hummel, 1959) при помоЩЙ спектрофотометра Specord М-40 (Karl Zeiss. Jena). Активность Подсчитывали, определяя количество Ьысвободнвшегося под действием ферментов П-ИИгроанНлииа (pNA) по методу Эрлангера, принимая коэффициент поглощения 1М раствора pNA при 405 им равным 10500 (Erlanger, 1966). Кинетические константы расчитывали по графическому методу Лануивера -Берка а двойных обратных координатах.

Аминокислотный состав определяли при помощи автоматического анализатора аминокислот "ААА-881" (ЧСФР) После гидролиза нагреванием раствора белков в 10 M HCl в запаянных ампулах до 120°С в течении 4 часов.

Содержание и coctaB ионов Металлов g белке определяли в Украинской сельско-хозяиствепной Академии по методике СпикерМана с сотр. (1973), замеряя содержание металла в диализате препарата фермента При помощи атомио-адсорбцнонного спектрометра AAS-l 12 (ЧСФР).

В качестве стандартов мол. Массы при ЭРВ-эЛектроФорезе (маркеров) использовали: фосфорнлазу b Т94 кДа), бычий альбумин (68 кДа), овальбумин (45 кДа), угольную аигидразу (30 кДа), химогрипеннох еп (25 кДа), соевый ингибитор трипсина (20,1 кДа). лактальбумин (14,4 хДа). РНКазу (12,2 кДа)._.

В работе использовались следующие сокращения: BIS - барбиталовая буферная систе'ма (20 мМ барбиТал-Hc!, pH 7,4, содержащий 0,15 M NaCl), M (в подписях пол фотографиями) - маркерные белки, М.М. - молекулярная масса, ПДФ - продукты деградации фибриногена, ИААГ - полиакриламидный гель, SDS -додецнлеульфат натрия, TBS - трисовая буферная система (50 мМ трис-HCI), ТИФ - тромбшюподобиыИ <(>срмс111, фп - фибринопеп |ид.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. ВЫДЕЛЕНИЕ ТРОМБИНОПОДОБНЫХ ФЕРМЕНТОВ.

Так как из различных классов гемокоагулирующих ферментов наиболее широкое применение в неднцннскoíl практике находят тромбиноподобиые ферменты (ТГ1Ф), они и были первым объектом наших исследований. В отличие от тромбина, который отщепляет от молекулы фибриногена два типа фибринопеитндоп (фп) - фпА и фпВ, при этом скорость отщепления фпА на порядок выше скорости отщепления фпВ, ТПФ отщепляют только один какой-нибудь тип фг1: а-ТПФ отщепляют только фпА, a р-ТПФ - предпочтительно фпВ. В медицине нетользуюгея только а-ТПФ. Фибрнн-дезАА, образовавшийся под действием подобных ферментов, образует неполноценные, легко лизирующиеся плазмином сГусткн, поэтому, действуя Iri uiíro как коагулянт, In viva они оказывают аитикоагулянтиое действие. Эго свойство используется в медицине для дефибрнпнрования крови. ТПФ обнаружены в ядах только ямкоголовых змей (сем. Crotatldae). Из змей этого семейства в отечественной фауне имеется несколько видов Щитомордника. Наиболее распостранениыми из них являются щитомордники Восточный, Обыкновенный, Каменистый и Водяной. ТПФ Восточного щитомордника был выделен ранее, ш> не охарактеризован, ТПФ Остальных видов в Литературе не описаны.

Известные тромбИноподобнЫе ферменты. Несмотря на Их сходство в биолог ической активности на фибриноген. Несколько различаются по физико-химическим свойствам, поэтому для каждою фермента разработана своя система выделейня. Ранее (Угарова и др., 1983), для оЧнсткй ТПФ из Яда восточного щитомордника применялась трехступенчатая схема выделения, включающая последовательную хроматографию белков яда на ДЕАЕ-Сефадексе, Сефадексе G-75 и Гепарнн-агарозе. Однако, подобное выделение весьма продолжительно, трудоемко, на каждом этапе очистки увеличиьаются потери актипного материала. Поскольку перед 1ШМЙ стояла задача Не только изучения тромбнноподобных ферментов, Но И создание на их основе препаратов, пригодных для использования в практической медицине, Необходимо было разрабо+а1ъ простые И эффективные мет-одй их выделения. В качестве аффинного сорбента была использована цибакрон-агароза (голубая агаром) - хроматографнческий постель, содержащий иммобнлизмроаанний красн+ель Цибакрон голубой F3GA (2 рМ цнбакрона на I ил набухшего геля). Данный краситель дешев, сшггез сорбентов на его основе очень прост, а емкость такого сорбента на порядок выше, чем у любых других аффинных сорбентоН. как было обнаружение ранее, нибакрон-агароза способна связывать некоторые факторы свертывзння: ФХ. протромбин и тромбин (Svrart ti

al, 1970,1973). Поэтому было сделанмо предположение, что н тромбииоподобпые ферменты будут сорбироваться па нем.

Условия фракционирования на цнбакрон-агарозе ядов всех исследованых нами видов змей были аналогичны. 200 мг кристаллического яда растворили в 5 мл BIS (0,02 М барбитал-HCI, рП 7,4, содержащий 0,13 М NaCI и i О"3 М азида натрия) и, после центрифугиропаиия для удаления нсрастворившихся частиц, наносили на колонку с цибакрон-агарозой (U8 См), уравновешенную тем же буфером. Скорость нанесения - 0,5 мл/мин. При разделении белков яда A.halys с сорбентом связалось около 10-12% от нанесенного количества белков. В белковом материале, не связавшимся с носителем коагулирующей активности практически не было. После промывки колонки от несвязавшегося материала буфером BIS, сорбировавшиеся белки элюировали линейным градиентом концентрации 0-2 М NaCl в BIS, объем градиента - 50 мл, скорость элюции 0,5 мл/мин. Профиль элюции представлен на Рис.1. Сорбировавшиеся белки злюнровалнсь с колонки двумя пиками. Коагулирующей активностью обладали фракции 2-го пика. Электрофоретический анализ в ПААГ в присутствии SDS фракций пиков I и II показал, что во 2-м пике элюируется практически чистый белок, имеющий мол.массу 33-34 кДа. Анализ сгустков фибрина, образовавшегося под действием активных фракций 2-го пика показал, что образующийся фибрин является формой фибрина-дезАА и, следовательно, выделенные фракции содержат а-ТЛФ. Этот фермент был назвал нами

68 к Да 45 кДа и*"4. 30 кДа

20 кДа

I , ~

14,4 кДа

г М

Рис. 1 Фракционирование яда Л. haltjs halys на цибакрон-аг арозе. (—о-. поглощение при 280 им, -»-- - коагулирующая активность фракций).

Впервые тромбиноподобмый (фермент из яда A.OlomhoJTU был выделен в 1985 г (Угарова и др) путем трехста/шНпой хрома rot рафичсской очистки. Однако, как уже упоминалось такой метод весьма трудоемок, поэтому для выделения

этого фериепта мы прибегли, как и в предыдущем случае, к аффинной хроматографии на цнбакрон-агарозе. В нашем распоряжении, кроме кристаллического яда A.Blomhojyil, был и срежевзчтый, поэтому основные исследования проводили именно па нем. Яд от трех змей (108 мг) перед нанесением был лнофилизирован, а затем растворен в 5 мд BIS. С носителем связалось приблизительно 8% от количества нанесенного материала. В несвязавшемся с колонкой материале коагулирующая активность обнаружена не была. Сорбировавшиеся белки выходили с колонки двумя основными пиками. Коагулирующую активность на фибриноген имели фракции как первого, так и второго пиков. Профиль элюции показан па Рис. 2. г-

Б 280 ran л А зм NaCl

\у' 1

Э ■

'''¡Ч 2 .

.--''г i Г / rfh / / ЧЛ 4 V. lml ■

«ям* 68 кДа I.; ,i 45 кДа М ЗОкДа

• л* 20 кДа

10 20 30 40 50 60 1 3

4

0

Рис.2 Фракционирование яда A.h.Blomhoffil на цнбакрон-агарозе. ( -о-- поглощение при 280 им, —коагулирующая активность фракций).

При электрофоретическом анализе сгустков фибрина, образовавшегося из фибриногена под действием активных фракций обеих пиков, било обпаруженно, что фермент, элюирующийся в первом пике, образует фибрин дезААВВ. Фибрин же, образовавшийся под действием фракций второго пйка, представлял собой фибрин дезАА. Дополнительное фракционирование образцов первого пика при помощи Ионообменной хроматаграфин на "Mono Q" позволило выделить р-специфнчньШ ТПФ. Анализ показал, что он представляет собой одпоислочечпып глйкопротеин с молекулярной массой 27-28 кДа, отщепляющий от молекулы фибриногена Предпочтительно фпВ и родственный ферментам из яла Л. contort rt* contortrix (Herclg et al,1970) И A. halys Paltas (Mm Yan et al.1984). Очевидно, подобные ферменты встречаются только в ядах змей, принадлежащих роду Щитомордник (Agktstrodon), т.к. в ядах богропсов и гремучих змея (Crotalus) аналогичных ферментов не обпаруженно. Однако, в задачи данного исследования характернзация р-спецнфичных ТПФ не. входила, и об эюм ферменте им упомянули только для полноты картины.

При фракционировании па голубой-агарозе кристалического яда А. В1от1\о$11 профиль элюцип напоминал профиль элюцин яда А. Ьа!уз„ однако, (3-специфнчцая тромбиноподобпая активность практически отсутствовала, хотя в некоторых фракциях восходящей ветви первого пика ее еще можно обнаружить. По-видимому, при сушке яда для получения кристаллов этот белок сильно денатурирует. Суммарная й-спсцифичпая коагулирующая активность почти не пострадала (потеря не больше 5% всей активности). Элеклрофоретичсский анализ сгустков фибрина, полученных после продолжит ельной инкубации фибриногена с фракциями, содержащими а-ТПФ показал, что а-цепь после отщепления фпА довольно быстро разрушается. Поскольку профиль коагулирующей активности фракций не полностью совпадает со 2-м пиком профиля элюцни, а приходится в основном на «исходящую ветвь этого пика, было выдвинуто предположение, что в восходящей части этого пика элюирустся какой-то сильный фибринолнгичсскнй фермент, который и разрушает Аа-цепь фибриногена. Для отделения ТПФ от этой примеси нисходящая часть 2-м пика элгоции была рехроматографирована на цнбакрон-агарозе. Белки элюировались с колонки двумя пиками, при этом вся коагулирующая активность была сосредоточена во И пике, где элюировался, по данным БОБ-электрофорсза практически чистый белок, имеющий мол.массу 29-30 кДа, аналогичный выделенному ранее (Угарова и др, 1985). Этот ТПФ получил название, аналогично Андистрону-И - Анцистрон-В (от видового названия змеи Л.ШоткоДИ ).

Для того чтобы выяснить, какой вид змей мог бы стать источником промышленного выделения тромбииоподобных ферментов при помощи разработанного нами метода с использованием цибакрон-агарозы, а также узнать, яд какого вида змей, распострапспиых в отечественных серпентариях, содержит наибольшее количество ТПФ мы провели анализ ядов ряда змей рода ЛдкЫгос^п (Щитомордник). Как уже, упоминалось выше, в нашем распоряжении были кристаллические сухие яды щитомордников Каменистого (А. ватННя) и Водяного (А. ркс/иогиэ ркс/иогиз), в отношении которых не было известно, содержат ли они в своем составе коагулирующие ферметы. Цельные яды А. хагсШИэ и А. р. ркс/тги.? обладали лишь слабой коагулирующей активностью на фибриноген, однако полная активность могла быть замаскирована другими протеазами, обладающими антикоагулян гной активностью.

Профиль элюцин белков яда Л.БсигаИНз показан на Рис.3. С сорбентом связалось около 6% от количества нанесенного яда. Все сорбировавшиеся белки элюировались одним размытым пиком. Увеличение объема градиента не улучшало разрешения, а только приводило к еще большему размыванию пика. Собранные фракции были объединены в четыре пула. Наиболее высокую коагулирующую активность па фибриноген,показывали фракции пула 3 (фракции 21-26). По данным БОБ-электрофорсза основным компонентом этого пула является белок, с

мол.массой (M.M.) 29-31 кДа, содержащий примеси белков с М.М. 100, 40 и 24 кДа. Рсхроматография пула активных фракций па цибакроп-агарозе привела к удалению белка с М.М. 24 кДа, однако, or остальных примесей таким путем избавится не удалось. Необходимо также отметить, что элюирусмая фракция обладала очень низкой koîu улирующей активностью. У частично очищенного таким образом белка удельная активность была не более 10 - 30 NIH ед/мг, что для цельного яда составляет около 100 - 120 NIH ед./l грамм. При инкубации с очищенным фибриногеном'выделенный белок отщеплял только фп А. Однако, ввиду малого содержания активности и необходимости дополнительных операций по очистке, дальнейшие исследования ТПФ из яда A. saxalilis мы lie проводили.

Е 280 пш _ ч

(И '''''''' ■г, S м

1 Л 1 *

1 пГ -

s?! i

г'* а / U

V, 1ml

68 к Да 45 к Да

25 кДа

ТгХкДа

эо

50

A M

Рис. 3 Фракционирование яда A. saxatilli на цибакрои-агарозе. (-«- - поглощение при 280 им, ■-»- - коагулирующая активность фракций).

E280nm S Л О « и Я м

У \ х'' L Т *

w -

-J* ylVv

/ й -—--1 /ill \ ^Vte -,-1——г—"-

эо

scv.iml во

fJSff *

0-Х '

п

- •• 45 кДа . "25~кДа' . 12,2 кДа"

dl <12 M

I о

Рис. 4 Фракционирование яда A. p'-sciix>nis pfscfroms на цибакрон-агарозе. ( —о- - поглощение при 280 им.—"- - коагулирующая активность фракций). Стрелками отмечены фраккшш взягые для члектрофоретическог о анализа.

to

Профиль элюциИ белков яда A.p.plscívorus с Цибакроп-агарозы приведен на Рис.4. На матрице сорбировалось Ьколо 10% от нанесенного материала. Белки элюировались с колонки четырмя пиками. Коагулирующей активностью обладали фракции, элюнрующиеся в нисходящей ьетВи 3-го пика (пул d). По данным SDS-элсктрофореза здесь элюируется смесь tío меньшей мере 7-8 белков, имеющих йол.массу в диапазоне Í2-150 кДа. Дополнительная очистка на "Mono S" или рехроматография на ЦИбакрон-аГарозе Не помогла выделить коагулирующий фермент в гомогенном виде. Этот фермент также является «-специфичным ТПФ, Ьднако содержание erb b яде Невелико (около 3 мг/г), а удельная коагулирующая активность мала (lie более 20-25 NtH ед./мг).

Таким образом, Нами были исследованы яды 4 видов змей рода Щитомордник (Agktstrodón) отечественной фауны, содержащихся В большинстве серпентариев. Из яда 2 видов змей, а именно, щитомордников Обыкновенного и Восточного, tipil помощи простого одностадийного метода были выделены в гомогенном виде два тромбиноподобпих фермента: АнцисТроИ-Н и Анцистрои-В. При этом, Анцистро11-В всходит в гомогенном виде После дополнительной рехроматографии на Голубой-агароЗе. Основные Данные по Иследованным ядам приведены в Табл. 1. Подсчитать Точное исходное количество фермента в яде, выход активного материала и степень очистки затруднительно, tak как в цельном яде активность ФромбипоподобйУх ферментов В значительной степени маскируется другими Нротеазайи. Указание в таблице Величины содержания ТПФ в яде показываю^ только tö количество фермента, которое удаеТся выделить в гомогенном виде, tipil тестировании цельных ядов коагулирующая активность яда A. halys лишь ileMHoro ВЫШЕ свертывающей активности яда A. BlomhoJfU, однако, после выделения суммарная активность Аицистрона-Н, полученного из i г яда (2500 NIH ед.) почти В 4,5 раза выше, Чем суммарная активность Анцистрона-В в 1 г яда (565 NIM ед.}. Вероятно, яд А. halys содержит йитикоагуЛянтные и (или) фибриногенолитические ферменты, замедляйщие время сверт-ывания.

Таблица 1 Содержание тромбиноподоби ых ферментов в ядах 4 видов змей рода Agklstrodoii.

A.lthalys A.blomhqfßt A.saxalllís A.p.plscívorus

Специфичность "ТПФ a-ТПФ ' a-ТПФ a-ТПФ a-ТПФ

1 ß-ТПФ

Содержание ТПФ 2500 a: 565 12Ö 70

(N1H ед./г яда) ß: 30

Количество этапов 1 2 >3 >3

выделения ТПФ

Очистка па последнем 188 194.7 250 357,1

этапе, приближенно

Следовательно, наиболее удобиыми источниками ТПФ для производства ферментативных препаратов являются яды o6bfkito6fcititoro и восточного щитомордников (A.h.hatys» A.h.BlomhoJJÎt, соответственно). Шми был разработан лабораторный регламент производства АйЦмстроИа-Н И Аицистрона-В.

2. ВЫДЕЛЕНИЕ АКТИВАТОРА ПРОТРОМБИНА.

Поскольку из яда эфы Пилочешуйчатой (fe.carlnafus), обитающей на территории Северной Африки >1 Ближнего Востока, был выделен активатор протромбина - Экарии, можно было бЖйДа+ь» <Ш> И в яде эфц Песчаной или многочешуйчатой XB.c.mUtttscjuatriatus), яйлякйцейся среДИеазна+ским подвидом этой змеи, также содержится аналогичный ферме lt+. Для выделения активатора в чистом виде мы применили следующую Методику. 200 Mr кристаллического яда эфы растворили в 10 Мл буфера 0,05 M трйс-HCl, рН 9,0 (ТЙЗ) И, после центрифугирования нанесли на колонку "Mono Q" 1ÎR 10/10» уравновешенную тем же буфером. Сорбировавшиеся белкй элЮировалй ЛИиеЙНыМ градиентом концентрации от 0 до 0,3 M NaCl в TBS. Активные фракции объединили в один пул (Рис.5 а, пул А), разбавили в 5 раз ТВЗ, рН 7,0. Затем образец Нанесли на колонку "Mono S" H/R 5/5. уравновешенную тем же буфером. Йспользование такой операции вместо диализа для смены буфера обязательно ввиду высокой лабильности активатора, особенно в слабо-ЩеЛочиих буферах ма pattimx этапах выделения. Сорбировавшиеся на иоиообмениике белки разделяли при помощи лииейного градиента концентрации NaCl от 0 до 0,25 М( объем градиента - 40 мл. Коагулирующей активностью обладали фракции, элюирующйеся во втором и третьем пиках (фракции S2 и S3) (Рис.5 b). tlo данным БЬЗ-электрофореза в каждом пике содержалось tlo два компонента, имеющих мол.массу 67 и 27 кДа. Идентичность состава этих фракций позволила предположить, что подобно Экарину из яда Е. cartrtatus (Dyr et al,1983), активатор протромбина из яда Е. с mu!tlsquamatus, существует й двух изоформах, различающихся ПО заряду. Для удобства, эти два изофермепта назвали изоформа 32 M Йзоформа S3, по порядковому номеру пиков, в которых ОИЙ эЛЮй^уютсЯ. Хотя электрофореграммы активатора показывают, Что oit практически гомогенен, добиться полной гомогенности удалось толькс) Ий третьем этаНе очистки, используя иоиообмеииую хроматографию lia колонке "Morto S" при рН 4,8, Активные фракции разбавляли в 5 раз буфером 50 ММ Ма-ацетат, рН 4,8, и наносили на колонку "Mono S" l!R 5/5. Сорбировавшиеся белки разделяли при помощи линейного градиента концентраций Ыа-ацетаттюго буфера от 0,05 M до I М, объем градиента - 30 мл (Рис.5 с). Таким образом удалось добиться очистхи в 62,8 раз с выходом активного материала 5Т%. Повысить степень очистки на

1.2 t.O 0.8 0.8 0.4

0.2

b) o.o

0.60.5

0.4 0.3 0.2

0.1

c) o.o

Е280|ш1 у 0.25 М NaCl

Р? "'#1

/ ¥ '''"л 1

■Ш / 1

831 Nft 1ml

I a

-10

10

Ё0

30

40

E280hm А у' 1M NaAc

fl 1 Г ''

i 1 I'l

f*L ''Т Г

lr%'''' / I

(f 8

/Vй Vs3 \\ Nfr 0.5 ml

40

50 60

A M

94 кДа 68 кДа

45 к Да 30 к Да

68 кДа

457Да 30 кДа

20 кДа

S2 S3 М

а

¡№«¡4 94 кДа

68 кДа

_______

.¿«'I 45 к Да

fcitfj 30 кДа'

J 20кДа

S2 S3 М

Рис 5. Этапы выделения Экамулина.

a) Ионообменная хроматография цельного яда Эфы па "Mono Q".

b) Хроматография активного пула фракций А на "Mono S" при рН 7,0

c) Хроматография смеси S2 и ЭЗ-форм на "Mono S" при рН 4,8

(-о- - поглощение при 280 им, -»- - коагулирующая активность фракций).

о

10 20

последующих этапах исследовании не удалось, что Может свидетельствовать о практической гомогенности полученного препарата. При рехроматографии S2 и S3-форм каждая изоформа элюировалась отдельным пиком, при той же ионной силе и с roll же удельной активностью, что и исходный образец. В гомогенном виде активность ЭЗ-формы была в 2 раза вЫШе активности 32-формы. Выделенный активатор бил назван Экамулнном. Использование вместо колонок "Mono 0" и "Mono S" соответствующих ни сорбентов типа "g-Sepharose Fast flow" и "S-Sepharose Fast flow" позволяет Практически неограниченно увеличивать масштаб выделения для промышленного выпуска Препарата. Диагностическое использование фермента возможно уже после пторой стадии выделения.

Таблица 2. Фракционирование яда Е.muUtsqucmatua

по1Лои<епие количество активность акТипносН. выход очистка

Этап очистки ПрИ Е280 им белка обща« удельна*

(о. е.) (мг) (N1H сд) (NIH ед/мг) (ЗД (в п раз)

Цельный яд

200 мг 208 150 1222. 8,1 100 -

МопоО,

пул А 23,1 21,0 1169 55,7 93,7 6,9

МопоЗ,рН7,0

52+БЗ 10,0 9,54 889 93,2 72.8 11,5

В том числе

Б2 5,1 4,91 111 28,7 9,1 3.5

В том числе

ЭЗ 4,9 4,62 778 169 63,1 20,9

МопоЭ рН4,8

Бг+эз 1,52 1,50 693 509 56, i 62,8

В том числе

Б2 0,35 0,34 85 250 7,0 30,9

В том числе

БЗ 1,17 1,16 608 524 49,8 64,7

3. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВЫДЕЛЕННЫХ ФЕРМЕНТОВ.

Так как в качестве основного источника для получения ТПФ были выбраны яды щитомордников Обыкновенного И Восточного, как яды, содержащие наибольшее количество тромбиноподобной активности, детальное исследование свойств выделенных тромбинойодобных ферментов ММ проводили только на Анцисзронс-Н и Анцистроне-В. Основные физико-химические свойства этих

и

ферментов приведены щ Т^бц. 3- Цзчэ^ектрр^окурировацие показало, что, » отлитие от Анцистрокэ-Н, Дицистрпи-В гетерогеиен по заряду: были обиаружеипы Три формы с изоточкамн В пределах 6,2-6,4. Все три формы содержатся в исходном препарате приблизительно в равных количествах. При гель-фнлырации на Сефадексах » TPS, рН 7»4, содержащем 0Д5 М NaCl часть материала этого фермента сорбируется на колонке , что характерно для лектииоя или родственных ии белко», Анннстрон-Н прокрашивается реактивом Шиффа Значительно сильнее, цен Днннетраи-В, Очевидно, он содержит больше углеводных остатка?, ||к у одного из выделенных белков в аминокислотном Составе не содержится цистецн, а иет^онин содержится р небольшом количестве Только у Аицистроца-Р, тогда как, например, у акутина (ТПФ из яда A.,acuíus) Цистеин - одна из основных аминокислот (Oiyang et эМ97 J).

При в]Эб-зпвктроф0рвзе высокоочнщепмы!} препарат Экамулина Показывает нмнчие двух компонентов, имеющих чол.массу 67 - 68 кДа и 27 кДа (Рис. 5 с). Тяжелый юмронент несколько легче у S2-формы. При КецснтомегрированиИ алектрофореграмм препаратов активатора, обладающих Наиболее Высокой удедьнРЧ активностью было установление, что интенсивность окраски компонентов 67 И 2? кДа относится друг к другу, как 1:1. При Проведении SDS-электрофореза очищены* препаратов Экамулина в присутствии ДТТ или р-меркаптоэтанола было выяснение, что компонент с мол.массой 67 к Да содержи г только одну йолчнентидную цепь, а компонент с мол.массой 27 кДа содержит две полщтептидные цепи, имеющие мол. массу {3 и 14 кДа. Оба компонента при электрофорезе цативных образцов в иеденатурирующих условиях Ь отсутствие ДТТ двигались 6 ПААГ одной медленно мигрирующей полосой, Однако, после добавления В образцы ДТТ образуются две более подвижные Полосы. При гель-фильтрации активатор даже В присутствии 8 М мочевины элюируется одним пиком. Эти данные позволили предположить, что молекула Экамулина имеет субъедйничную структуру - состоит из тяжелой субъединицы с молекулярной массой 68 кДа, содержащей одну полипептидную цепь и.легкой Субьедшшцы с мол. массой 27 кДа, состоящей из двух цепей 13 и 14 кДа. Взаимодействие между субъединицами, по-видимому, не имеет характера Гидрофобного, гидрофильного или электростатического взаимодействия, т.к. разделить их при помощи различных методов афинной, гидрофобной, гидрофильной или адсорбционной хроматографии не удается. Разделить >их удалось только при гель-фильтрации в присутствии ДТТ. Послеудалеция .ДТТ,и совместной ренатурации смеси всех трех цепей активность частично восстанавливается.

• Аминокислотный состав обоих Нзоформ сходен между собой. Основные отличия заключаются в содержании С.)у И Clu, а также Ala «Leu. Так, у S3-

«

1 5

формы Glu в 4 раза больше, чем у Б2-формы и соответственно в 4 раза меньше Gly. Ala у БЗ-формы меньше в 1,6 раз, но во столько же больше Leu.

Экамулин - металлопротеаза, По данный атомНо-адсорбционной спектрометрии в одном моле Экамулина содержится 1 моль Zn. Углеводный компонент содержит остатки Л-ацетил-а-О-глюкозамина и локализован в тяжелой цепи фермента, т.к. только она прокрашивается реактивом Шиффа. Основные физико-химические особенности выделенных ферментов показаны в Табл.3

Таблица 3 Основные физико-химические свойства выделеных ферментов.

АицИстрбн - H АнЦистроИ - В

Содержание в яде (мг/г) С одержанне в яде (Ш1/г) М.М. по эл.форезу (кДа) М.М. по гель-фильтрации Количество п/п цепей Углеводный компонент

КНг-концевая амипок-та Изоэлектрическая точка Е280"м раствора Удельная коагулирующая активность (№Н ед./мг) Стабильность: в растворе (рН 7,4) при +21°С при +4°С при -20°С ' лиофилы го-высушеного при +4°С

5,3 2500 34 36 1

N-ацетил -a-D-глюкоз- и галактозамины Val 6,6 10,6 470

72 часа более 6 мес более 1 года

5,1 565 29 31 1

И-ацетил-a-D--глюкозамнн

Val 6,2 - 6,4 11,2 110

24 часа более 1 мес более б Мес

более 3 лет более 1 года

Экамулин S2 S3 ~3 -10,2 6110 68+27 93 3

И-ацетил-a-D--глюкозамин

he опред. 4,4 - 4,6 10,2 250 524

12 часов (рНб,2) 48 часов (рН6,2) 1 мес (pH 6,2)

б мес

4. БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И ФЕРМЕНТАТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ ВЫДЕЛЕННЫХ ФЕРМЕНТОВ.

При инкубации с фибриногеном Анцистрон-Н и Аицистрои-В быстро отщепляют фпА, не затрагивая фпВ. При продолжительной инкубации они, подобно большинству ТПФ. слегка деградируют Аа-цепь, по-видимому с СООН-

конца, не затрагивав Bfl- и y-neneft. Анализ NHa-коицевых аминокислот ашшстроцового фибрина показал, Что полученной нами фермент разрывает только одну связь в молекуле фибриногена, а именно связь Argi6-01yi7 » Аа-цепи с освобождением фпЛ. Кроме того, изучение пептидов, отщепляющихся под действием Анцистрона-Н от молекулы фибриногена методами HPLC показало их идентичность пептидам, отщепляемым от фибриногена аикродом и фпА, образовавшемуся под действием тромбина (Результаты получении Т.Угаровой и Я.Диром в Пражском институте гематологии и переливания крови МЗ ЧСФР). Обработка Ащшстрона-Н иейрамшшдазой, расщепляющей углеводный компонент, практически полностью редуцирует ерертывающую активность и следовательно, углеродный компонент Необходим для проявления активности. Обработка нейрамииидазой Анцисгрсша-В Только несколько (на 10%) снижает коагулирующую активность. Свертывающая активность не ингибируется АПН и гирудином, хотя ферменты связываются с мммобилизироваииым гепарином.

ФибриполишческоИ активностью оба фермента не обладают, казеииолити-ческая активность весьма умеренная - 3,5 каз.ед./мг белка у Анцистрона-Н и 8,9 каз.ед./МГ белка у Акцистрона-В. Оий не активируют фактор ХШ - сгустки аицис-тронового фибрина даже после длительной инкубации легко растворяются в 1% уксусной кисдЬте или 3 M Мочевине. Хотя в образцах такого фибрина, анализируемых иеТоДоМ ЁОЗ-эЛеМрофореза Присутствует незначительииое количество у-Т днмера, а-а ДиМерЫ likkot-да lie были обнаружены. Оба фермента m активируют также Протеид С, фйк+йр к, ПЛазМиноген й протромбин - после инкубации с АицисТроиом этй бйЛкЙ M НроявдялИ активность На специфичные для них субстраты.

Эти ферменты показывал!! вЫсдкую аргииинзстеразную активность ho ЙАЁЕ и ВАМЁ, более iithkyto rto tAME и совсем Не обладали активностью на ТШЕ. По синтетическим пептидным хромогепиым субстратам специфичность Апцистрона-fl шире, Нежели у АНЦисфоиа-Н (ТабД. 5).

Ашшзиая akttlàlwcti обоих ферментов На субстрат 82Í60 (прк концентрации ферментей 1НШ ед/МЛ и SalBo - 5 рМ) полностью ийгибйровались 2РСК, ТРСК, S mM PMSF, SBI (ICO ед/мл); 1 тМ люпегтШ иигибировал около 70% активности, 10 mM DPP около 60%, 5 тМ EDtA - 22-25%, 20 m M бензамндиИ - 10-15%, Hotiu Cti2+, Со2*, Cd2* в концентрации 10 mM - 10%. Не ингнбировали активность Petite, hettcra+йн A, траснлол, гйрудин, гепарин, EGTA. Йодацстамнд, ионы Са2+. Mg2+. Mn2t. Zh*+. Cd2+, Co2+ и Cu2+. Нагреванием До 60°C АнцистроН-В нийктивировался за 10 Мин, тогда как Анцистрон-11 за это время терял только 60% активности. Оптимум ptl амидазпой активности Находится в пределах 8,1 - 8,3.

Механизм активации протромбина пол действием Экарипа - специфичного активатора из яда Ecartnams. изучен достаточно подробно, было показано, что

Экарин активирует протромбин через стадию Мезотромбина, расщепляя только одну связь, а именно Arg323 - Иез24 между Цейямй А И В (Mieft & Kosov, 1978). Поэтому, при изучении механизма активации протромбина Экамулииом мы сравнивали полученные производные протромбина с аналогичными производными, полученными под действием ЭкарИий. При инкубацйй Протромбина с Экамулнном, в отсутствие ингибиторов тромбнновой активности а системе быстрЬ Накапливались производные протромбина, идентифицированные Как мезотромбин, мезотромбнп 1 и претромбин 1 н только позже появляется а-Тромбии (Рис. б). В присутствии гирудина и DFP, иш йбнрующйх автокатализ тромбина, единственное производное, обнаруженное В смеси - ЭТО мезотромбин. В наших Исследованиях производные протромбина, полученные под Действием актйватора из яда E.carinatus показывали точно такую же электрофорстичсскук) картину, как дериваты протромбина, получение йод Действием Экамулииа. ttpn сравнении нарастания коагулирующем активности В НрвЦессе ийкубацин а системах протромбин - Экарин и протромбин - ЭкамуЛШ!, - йолученые результаты были идентичны. Все это позволяет НреДйЬлажйТЬ, <1то механизм активации протромбина ЭкамулипоМ сходен с TakoBbiM АЛЯ Экарййа it, следовательно, Экамулин расщепляет в молекуле протромбина ТОЛЬКО Ьдйу связь Между А И В цепями про тромбина с образованием мезотромбина.

Экамулин не обладает эстеразной активностью на ВАЁЕ, ЙАМЕ. TAME и TLME, не гидролизнрует субстраты тромбина, фактора Ха, РСа И плазмнна, однако, в отличие от Экарнна, Экамулин обладает доВо Льне высокой активностью на субстрат калликренна плазмы. Оптимум рН амидазйой активности 7,8. После инкубации Экамулииа с разбавленной Нлазмой в присутствии гирудина, амНдазная активность такой плазмы на субстрат фактора Ха 52222 значительно выше в присутствии ионов Са2+, чем в отсутствии Са2+ или с Добавлением Са2\ Но без предварительной обработки гирудиновой плазмы Экамулнном, Очевидно, это говорит о том, что фермент способен активировать также И ранние этапы внутреннего механизма свертывания Кроьй, Вероятнее всего фактор Xtl, учитывая активность по субстратам каллйкрейНа, т.6. ЛйЛйеТся также и калникреиноподобным ферментом. ИнгИВйторЫ ЭкамуДийа сходны с ннгибнторами Экарина. АмидазНая активность падавЛябТсЯ некоторыми хелатирующими веществами: EDTA, а-фе!(ШггралйнОМ, ttii lib EGTA. При ингибировании о-фенантролиноМ добаВ/ieinte ИоИов ZHî+ вЬсстаийпливает активность фермента, EDTA ингИбируСТ НеобаТИМо. Ак+НВность также подавляется веществами, содержащими свободные сульфгидрилыше группы: DTT, р-меркаптоэтанолом, гЛуТатиЬНоМ и ЦйстейНом, Некоторыми твухвалентными нонами-20 мМ Ca2VCo2+. Cd2+. CU2t й Mil2+. 20 WM M g7-* и Zn2* те оказывали влияния на активность фермента. Не ННГнбиропалась активность также такими шн иГлпорами ссриновых прогеаз.как DFP, PMSF, SB1, ZlfJK, П.СК.

Ш'

MZT 1

а-ТНЯ

F1 F2

Т;

тШ

<т

ртн \

PRE1; F1.2.A

В F1 F2.A П

68 45

25

■И 14,4

1 2 3

ми 45

Ml 25

ДО 14,4 5 М

Ъ)

Рис.6 SDS-электрофорез в отсутствие (а) и в присутствии ДТТ (Ь) образцов протромбина (1), и производных протромбина, образовавшихся под действием Экамулина (0,1 NIH еД./мл) после 30 мин (2), одного (3), трех (4) и пяти часов (5) инкубации.

Производные и фрагменты молекулы протромбина обозначены : РТН - протромбин; MZT - мезотромбин; MZT1 - мезотромбин 1; a-THR - a-тромбин; PRE 1 - претромбин 1; F1.2.A - фрагмент молекулы протромбина, включающий фрагменты 1, 2 и А-цепь: F1.2 - фрагмент молекулы протромбина, включающий фрагменты 1, 2; F1 - фрагмент 1; F2 - фрагмент 2; В - В-цепь тромбина; А - А-цепь Тромбина.

1 9

бензамидипом, гирудином и АПН в присутствии гепарина. Не эффективны также ингибиторы цнстеиновых и кислых протеаэ - РСМВ, ЙодацеТамид, пепстатин А и люпептин. Фермент не обладает казеинолнтической И фибринолитической активностью, но обладает слабой фибриногенолитической активностью т.к. при длительной инкубации деградирует Аа-цепЬ Молекулы фибрнноГеЦа.

Таблица 5. Активность выделенных ферментов иа пепТидные субстраты.

Анцистрон-Н Аицистрон-В Экамулин

БЗ вз

Км Кка( Км К|и1 Км Кка( Км Кка1

(М) (сек"') (М) (сек-1) (М) (сёк*) (М) (сек-1)

СгошТН 2,5x10-3 12,8 1.2x10-3 10,6 - - • -

82160 2,2x10-3 15,5 1,2x10-3 9,2 - - - -

Э2222 . 1,8x10-3 0,8 - - ■ -

82302 - 1,2х10-2 2,4 1,4x10-4 2,4 1,2x10-4 8,8

32266 2,8x10-* 2,4 1,8x10-2 2,1 2,1x10-1 0,6 2,1x1^2 0,8

в2251 - - - - - - - -

РСа - - 3x10-2 0,8 - - - -

BЛpNA 2,8x10-2 6,3 2,6x10-2 6,1 не опр не опр не опр не опр

Черточка обозначает, что активность на этот субстрат отсутствует, "не опр" -обозначает, что активность на данный субстрат не определялась.

5. ПРИМЕНЕНИЕ ВЫДЕЛЕННЫХ ФЕРМЕНТОВ.

Выделенные препараты Анцистрон-Н и Анцистрои-В по своим физико-химическим и биологическим свойствам аналогичны коммерческим препаратами тромбиноподобных ферментов. При этом следует отметить, что по ряду своих параметров Аицнстрон-Н ближе к Анкроду (Арвину) - ТПФ из яда Малайского щитомордника (А. гИос/озГота), наиболее Широко применяющегося в качестве препарата дефибринирующего действия в клинической Практике, тогда как Анцистрон-В ближе к Батроксобинам - ТПФ из яда разных подвидов ПоШгорз сНгохэ, а именно Рептилазе (из яда В. а. аврег), основная область применения которых - медицинская диагностика.

В медицинской диагностике наиболее Широкое применение тромбипоподоб-ные ферменты находят при определении уровня фибриногена плазмы крови при гепаринотсрапии или на фоне гипергепарйиемии. Выделенные ТПФ можно применять во всех известных диагностических тестах, разработанных па основе тромбиноподобных (}>срмептов из яда змей. Кроме того Нами была разработана методика определения уровня фибриногена В геПаринНзированпоН плазме кропи.

позволяющая существенно повысить точность определения. Метод базируется па специальном расчете количества коагулянта, необходимого для определения и на подборке оптимальных условий для проведения теста.

Аицистрон-Н. являющиеся аналогом Арвииа, может быть также применен и для клттческцх целей- В опытах на кроликах проверялась возможность использовать его in vivo в качестве агента дефибршшрующего действия (Глазунова и Угарова, 1988). Мы также проверяли возможность использования Анцист-рона-Н для аналогичных целей в опытах по изучению влияния снижения уровня фибриногена на метастазирование карциномы Льюиса у мышей (Петик н Соловьев, 1991). Оказалось, что парентеральное введение мышам Анцистрона-Н в дозе 2,5 N1H ед./кг веса животного, что вызывает снижение уровня фибриногена до 30% от нормы, уменьшает метастазирование в 2,7-3 раза, а когда в комплексе с Апцчстрачом ъвацнпи для ускорения лизиса образующихся микросгустков тканевый активатор шшмицогена, то метастазирование снижалось уже в 3,2-3,8 раза. Все это показывает, что выделенные нами ТПФ имеют широкие перспективы и в клинической Медицине И применение их в этой области заслуживает дальнейшего изучения.

В зарубежной клинической практике препараты Экарина применяют в основном для определения общего уровня протромбина при ворфарино- и гепарннотерапни В диагностических тестах с Использованием хромоге/шых субстратов, а также для диагностики ранних стадий ДВС-заболеваний. Последний тест основан на том, что ЭкарИН способен активировать образующийся при ДВС-сипдромах претромбин 1, обнаружить который другими методами чрезвычайно сложно. Однако, как правило, коагуляциопные тесты для определения протромбина плазмы с Использованием Экарииа употребляются редко, Основной причиной является то, что В этих тестах измерение образовавшегося мезотромбина (тромбина) производится Не непосредственно, а через свертывание образовавшегося под его действием фибрина. На эту реакцию, в свою очередь, влияет много различных посторонних факторов: наличие ПДФ, различия в коицеш рации фибриноген^ в Плазме и т. h. Нами было предложено измерять экамулин-индуцированное время свертывания не только цельной плазмы, но и плазмы разбавлено!! 0,3% раствором фибриногена В соотношении 1:1,1:2, 1:4,1:8 и 1:16. По получении данным строится график зависимости времени свертывания разбавленной плазмы от Степени разбавлениия И сравнивается с ( рафиком этой зависимости, построении для разных разбавлений контрольной (стандартной) плазмы. Данный тест представляется весьма информативным, т.к. по взаиморасположению этих двух графиков можно не только найти уровень протромбина в плазме крови с высокой степенью точности, но и определить наличие ь плазме ПДФ и обнаружить некоторые другие нарушения гемостаза.

ВЫВОДЫ

1. Исследованы яды четырех видов змей рода Щитомордник, а именно, Agkistrodon hahjs Blomhojfll, A. h,halys, A., saxatlllst и A. plsclvotus plsctvorus, содержащиеся в большинстве отечественных серпентариев. В ядах всех четырех видов обнаружены а-специфичиые тромбИиоНодобные ферменты, при этом тромбипоподобные ферменты из яда трех последних видов змей ранее не были описаны в литературе. Кроме того, в яде Восточного щитомордника (Л. h. Blomhoffit) найден также и новый р-слецифичный тромбиноподобный фермент.

2. Разработан простой одностадийный меТод выделения тромбиноподобных ферментов из яда змей вида A. H. hatys И двуст^дНйнЫЙ, Включающий рсхроматографию препарата - из яда A. h. filornftoffil. Данный метод пригоден для выделения тромбиноподобных ферментой ni ядй эТих йидоП змей в больших количествах.

3. а-Спепифичпые тромбипоподобные ферменты из ядов A. h. hatys и A. h Blomhqffil (Aimncipon-H и Анцистроп-В, соответственно) выделены в гомогенном виде и охарактеризованы. Изучены их физйко-химические и биологические свойства, определена субстратная специфичности, исследована кинетика их ферментативной активности и проведено сравнение выделенных ферментов с наиболее распосграненными коммерческими препаратами ТИФ, выпускаемыми рядом зарубежных фирм.

4. На основе выделенных тромбиноподобных ферментой - Ашщстроиа-Н и Анпистрона-В, создан диагностический коагуляциониый тест для определения уровня фибриногена в гепарннизированной плазме крови.

5. Из яда змей вида Эфа песчаная или многочешуйчатая (Echls carinatus гnultisquamatus), обитающих на территории Средней Азии, выделен Экамулнн -фермент - активатор протромбина, И создана методика, пригодная для производст ва Экамулина в больших количествах.

6. Исследованы физико-химические И биологические сбойства Экамулина, тределена субстратная специфичность, особенности его ферментативной 1КТИВИОСТИ и проведено сравнение выделенного фермента с Экарином -1ктиватором протромбина, выделенным ранее из яда эфы НйЛочешуйчатой B.carinatus ), оби гающей на территории Северной Африки й Ближнего Востока.

7. Разрабо1ап диагностический коагуляциопиый Tect lia основе Экамулина ел я определения уровня протромбина В ПЛаЗИе кровй На фоне варфарииовой и еиаринотерапин, который может быть ИсНолЬзоваН также и для диагностик» юкоюрых друшх нарушений системы сверТываНИЯ крови.

Выражаю глубокую благодарность сотрудникам отдела структуры и функций белка Института биохимии им. A.B. Палладина к.б.н. Угаровой Т.П. и к.б.п. Платоновой Т-Н., оказавшим большую помощь при проведении работы, сотруднику Украинской селькохозяйствеиной Академии Дубовой Т.В., оказавшей содействие при проведении атомно-адсорбциошюго анализа, а также другим сотрудникам Института биохимии АН Украины за помощь и поддержку при здг.олнешш данной работы.

\. Угарова Т.П..Соловьев ДА.¿Золотухин C.B. и др. Выделение тромбиноподоб-пых ферментов из яда змей рода Agklstrodon II Тезисы доклада конференции "Методы получения и анализа биохимических реактивов" - октябрь 1987 г, Рига, - С. 122.

2. Угарова Т.П.,Платонова Т.Н..Соловьев Д.А. Активатор протромбина из яда Эфы песчаной (Behls multlsquamatus) // Докл.АН УССР - 1989 - т.6 - С.75-79.

3. Угарова Т.П., Соловьев Д.А., Медведь Л.В.Золотухин C.B. Способ получения ферментов, обладакНцйх коагулнрукэщей активностью из яда змей рода Agklstrodon. // Авторское свидетельство № 1476649 (СССР), 1988.

4. Петик А.В.,Шмалъко Ю.П.,Соловъеб Д.А. Влияние снижения уровня фибриногена в крови мышей при йеТастазировапии карциномы Льюис // Эксп. Онкология - 1991 - т.! 3 - № 5 - С.68-69.

Нодп. в г.сч. 05.02.92. Формат 60x01/16. Ivt.mri тип. Cfc. печать. Уо.л.г,1,39. Усл.кр.-отт. 1,39. Уч.-изд.л. 1,0. Тираж 100 экз. Угк. . Гег.плптно.__________

Стпечтгпно ? Институте математики АН Укрпшш. î::-ccoi Кг<л) :, iuji, ул. гишт, ?

Основные положения диссертации опубликовании в работах: