Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние нативного яда некоторых представителей аспидовых змей на реологические свойства крови

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Савушкин, Андрей Владимирович, Москва

/

/ !

МОСКОВСКИЙ ПЕДАГОГИЧЕСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

САВУШКИН Андрей Владимирович

ВЛИЯНИЕ НАТИВНОГО ЯДА НЕКОТОРЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ АСПИДОВЫХ ЗМЕЙ НА РЕОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА КРОВИ

Специальность 03.00.13 - физиология человека и животных

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Александрова Н.П., доктор медицинских наук Василенко И.А.

Москва -1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ........................................................................................4

ВВЕДЕНИЕ...............................................................................................................5

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ............................................................................11

1.1. ЭКОЛОГИЯ РОДА НАСТОЯЩИХ КОБР (NAJA)................................................11

1.2. ХАРАКТЕРИСТИКА И СОСТАВ ЯДА КОБР........................................................13

1.3. КЛИНИЧЕСКАЯ КАРТИНА ОТРАВЛЕНИЯ.........................................................15

1.4. ВОЗДЕЙСТВИЕ ЯДА И ЕГО КОМПОНЕНТОВ НА КРОВЬ..................................17

1.4.1. Воздействие яда и его компонентов на эритроциты............................17

1.4.2. Действие яда на свёртывающую систему крови...................................22

1.5. ГЕМОРЕОЛОГИЯ И ЕЁ ОСНОВНЫЕ ПОНЯТИЯ...............................................23

1.5.1. Вязкость крови и определяющие её факторы........................................24

1.5.2. Вязкость плазмы.....................................................................................26

1.5.3. Эритроцитарная агрегация......................................................................27

1.5.4. Деформируемость эритроцитов..............................................................31

1.6. РЕОЛОГИЯ И ГЕМОДИНАМИКА.......................................................................39

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ....................................42

2.1. ХАРАКТЕРИСТИКА ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА........................................42

2.2. МЕТОДИКА ПРОВЕДЕНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА...................................................42

2.3. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ..............................................................................48

ГЛАВА 3. ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ НАТИВНОГО ЯДА НА РЕОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА КРОВИ IN VITRO.........................................................................55

3.1. ИЗМЕНЕНИЕ РЕОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ КРОВИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ ПОСЛЕ ЕЁ ИНКУБАЦИИ С НАТИВНЫМ ЯДОМ КОБРЫ...............55

3.2. ИЗМЕНЕНИЕ РЕОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ КРОВИ ПРАКТИЧЕСКИ ЗДОРОВЫХ ЛЮДЕЙ ПОСЛЕ ЕЁ ИНКУБАЦИИ С НАТИВНЫМ ЯДОМ КОБРЫ........................62

ГЛАВА 4. ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ НАТИВНОГО ЯДА НА РЕОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА КРОВИ IN VIVO...........................................................................70

4.1. ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ ЭКСПЕРИМЕНТА НА РЕОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА КРОВИ КРЫС.............................................................................................................70

4.2. ИЗМЕНЕНИЕ РЕОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ КРОВИ У ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ ПОДВЕРГНУТЫХ ВОЗДЕЙСТВИЮ НАТИВНОГО ЯДА КОБРЫ......72

ГЛАВА 5. КОМПЬЮТЕРНАЯ ФАЗОМЕТРИЯ ЭРИТРОЦИТОВ

ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ...........................................................................79

5.1.РАЗРАБОТКА СИСТЕМЫ КРИТЕРИЕВ ОЦЕНКИ МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ ИНТАКТНЫХ ЭРИТРОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА И КРЫСЫ....................79

5.2.ХАРАКТЕРИСТИКА МОРФОМЕТРИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ ФАЗОВО-ИНТЕРФЕРЕНЦИОННЫХ ИЗОБРАЖЕНИЙ ИНТАКТНЫХ ЭРИТРОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА И КРЫС...................................................................................................82

ЗАКЛЮЧЕНИЕ................

ВЫВОДЫ.........................

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

124 126

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ЦНС - центральная нервная система; МАП - мембрано-активные полипептиды; ПЛФ - прямой литический фактор; Ht - гематокрит;

ЭФП - электрофоретическая подвижность;

НЬ - гемоглобин;

АТФ - аденозин-5'-трифосфат;

LD50 - средняя смертельная доза;

КФМ - компьютерный фазовый микроскоп;

Dmax - максимальный диаметр фазового образа клетки;

Per - периметр фазового образа клетки;

Vol - объем фазового образа клетки.

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность проблемы. Ежегодно на земле, по данным Всемирной организации здравоохранения, от змеиных укусов страдает около 1000000 человек из них 50000 погибают, а часть из оставшихся становятся инвалидами [Бердыева А.Т., 1994]. Это определяет необходимость глубокого изучения характера повреждающего действия зоотоксинов на различные системы органов человека для выявления спектра средств и способов специфического и неспецифического воздействия на организм пострадавшего.

Общим является мнение, о том что под влиянием яда кобр развивается комплекс реакций, вызывающих существенные изменения метаболической и функциональной активности клеток красной крови. При этом своеобразие наблюдаемых эффектов зависит главным образом от состояния эритроцитарной мембраны и внутренних эритроцитарных факторов, степень повреждения которых находит объективное отражение в нарушении реологии крови.

Фундаментальные исследования А.М.Чернуха (1975) позволили установить, что реологические свойства крови - вязкость, способность эритроцитов образовывать крупные и устойчивые агрегаты, а также способность эритроцитов к деформации при прохождении через капилляры, диаметр которых меньше их собственного, в значительной мере влияют на состояние микро- и макрогемодинамики. Несмотря на то, что эти показатели во многом определяют интегральную картину отравления, в литературе имеются лишь отдельные, не систематизированные, сведения о гемореоло-гических расстройствах при интоксикации ядами змей [Корнеева Н.В., 1986, Орлов Б.Н., 1987].

В связи с этим проведение широкого круга исследований реологии крови при интоксикации ядами змей продиктовано не только практической необходимостью, но имеет и немаловажное

теоретическое значение. Это объясняется тем, что гемореологи-ческие расстройства, в частности повышение вязкости крови и склонность эритроцитов к образованию агрегатов, лежат в основе нарушения микроциркуляции жизненно важных органов и являются одной из ведущих причин их функциональной недостаточности. Детальное исследование изменений реологических особенностей крови под влиянием природных химических раздражителей, с которыми человек сталкивается в процессе естественных взаимоотношений с природой, поможет полнее установить возможные последствия и определить наиболее эффективные пути их коррекции в условиях действия биотических эколого-химических факторов окружающей среды.

Кроме этого немаловажное значение имеет развитие и расширение арсенала новейших методов исследования, являющихся неотъемлемым условием научного прогресса. Современные требования к аппаратуре подобного рода заключается в высокой чувствительности, точности, простоте, экспрессности и обеспечении автоматизированной оценки полученных результатов.

Достаточно перспективной в этом отношении является компьютерная морфометрия, основанная на комплексном оптико-геометрическом подходе к анализу морфофункциональных характеристик форменных элементов периферической крови, которые во многом определяют её реологические свойства [Жукоцкий А. и др., 1992; Коган Э.М. и др., 1994].

Всё вышеизложенное определяет актуальность выбранного направления исследований, а использование новых более совершенных и высокочувствительных методов анализа позволяет установить неизвестные ранее особенности реакции организма на воздействие зоотоксинов.

Целью настоящего исследования является изучение изменения реологических свойств крови при остром отравлении натив-ным ядом красной кобры (Naja pallida).

В соответствии с этой целью представлялось важным уделить внимание решению следующих конкретных задач:

1.Определить токсичность используемого яда;

2.Изучить изменение основных реологических показателей периферической крови при действии различных доз нативного яда Naja pallida в экспериментах in vitro;

3.Изучить изменение основных реологических показателей периферической крови при действии различных доз нативного яда Naja pallida в экспериментах in vivo;

4.Изучить особенности морфофункционального состояния эритроцитов в норме и при интоксикации с использованием методов сканирующей электронной микроскопии и прижизненной компьютерной фазометрии;

5.Установить наиболее существенные и информативные показатели, определяющие характер ответной реакции эритроцитов, на основе анализа динамики их фазовых изображений;

6.Показать возможность практического использования метода прижизненной компьютерной фазометрии для объективной оценки степени морфофункциональных нарушений эритроцитов в условиях интоксикации, прогнозирования возможных последствий и определения эффективных способов коррекции выявленных нарушений.

Научная новизна работы. Представленная работа выполнена с использованием нативного яда змей Naja pallida.

Впервые проведён сравнительный анализ изменений реологических свойств крови в динамике интоксикации при действии различных доз нативного яда Naja pallida в системах in vitro и in vivo;

Апробирована технология прижизненной компьютерной фазовой морфометрии на основе принципиально нового компьютерного фазово-интерференционного микроскопа "Цитоскан", включающая способ подготовки исследуемых препаратов, алгоритмы анализа изображений эритроцитов, методов статистической обработки данных.

Проведена комплексная оценка морфофункционального статуса эритроцитов периферической крови человека и крыс в норме и при интоксикации на основе многомерного анализа метрических и динамических оптико-геометрических показателей, объективно отражающих состояние клеточного гомеостаза.

Впервые получены прижизненные спектральные характеристики фазовых изображений эритроцитов в норме и при воздействии нативного яда. Установлены конкретные частоты, отражающие степень нарушения метаболической активности клеток красной крови при интоксикации в условиях in vivo и in vitro.

Научно-практическая ценность. Выявлены особенности влияния нативного яда аспидовых змей на реологические свойства крови и установлена зависимость динамики развития гемореоло-гических нарушений от времени и уровня интоксикации.

Полученные результаты расширяют существующие представления об общих механизмах действия яда Naja pallida с учетом клеточного и субклеточного уровней реализации регистрируемых токсических реакций, позволяют оценить роль компенсаторно-

приспособительных возможностей живого организма в условиях прогрессирующей интоксикации.

Метод прижизненной фазовой морфометрии клеток периферической крови может быть использован в практике для проведения цитодиагностики развития токсических состояний, а также при оценке эффективности и адекватности проводимых лечебных мероприятий.

Основные положения выносимые на защиту.

1.В патогенезе токсических состояний при отравлении ядами змей важная роль отводится нарушению гемореологических свойств периферической крови, которые являются объективным показателем тяжести состояния и стадии развития интоксикации у реципиента.

2.Метрические и динамические параметры фазовых изображений эритроцитов периферической крови объективно отражают морфо-функциональное состояние живых цитообъектов и могут служить показателями состояния нормы и степени отклонения от неё.

3.Реакции эритроцитов на времязависимое действие натив-ного яда Naja pallida в системах in vivo и in vitro носит различный характер.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на международном симпозиуме "Биологическая подвижность: Современные методы исследования" (Пущино, 1998); XVI научно-практической конференции «Морфо-метрия в диагностике болезней» (Москва, 1998); семинаре кафедры биофизики МГУ им. М.В. Ломоносова «Фазометрия клеток периферической крови» (1999).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 научных работ.

Объём и структура диссертации. Работа изложена на 143 страницах машинописного текста, иллюстрирована 31 рисунком и 17 таблицами. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов исследования, трёх глав, отражающих результаты собственных исследований и их обсуждение, общего заключения и выводов. Список цитируемой литературы включает 55 отечественных и 121 зарубежных источников.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. ЭКОЛОГИЯ РОДА НАСТОЯЩИХ КОБР (NAJA).

Представители рода Naja обитают исключительно на африканском континенте и в Азии. В Африке было найдено 7 видов, и примерно 8 в Азии. Все представители этого рода являются ядовитыми. Основное место в рационе питания кобр занимают земноводные, пресмыкающиеся, мелкие птицы и грызуны. Человека кобра кусает исключительно с целью самообороны.

Кобры характеризуются тем, что в момент опасности не затаиваются, что свойственно для гадюк, а предупреждает о себе: принимают характерную угрожающую стойку, поднимая переднюю треть туловища, с шипением расправляют капюшон, разводя в стороны несколько пар рёбер в области шеи. Пытаясь отпугнуть противника, эти змеи могут нанести "фальшивый укол", резко выбрасывая вперед часть туловища, совершая удар головой и закрытым ртом. [Бабаянц Г.А., 1982].

Особенностью поведения кобр при укусе является то, что они обычно не делают мгновенного укуса, как, например, гадюки, а вцепляясь в жертву несколько раз с усилием сжимают челюсти на ее теле, чтобы наверняка вонзить короткие ядовитые зубы в поражаемое место и впрыснуть нужную дозу яда [А.Г.Банников, 1985].

В месте инокуляции образуется первичное депо яда, из которого происходит поступление токсинов в лимфатическую и кровеносную систему жертвы, скорость дренирования яда во многом определяет быстроту развития токсического эффекта [Spawls S., 1995].

Четыре африканских вида (Naja katiensis, Naja mossambica, Naja nigricollis, Naja pallida) получили название "плюющая" кобра

за способность выбрызгивать яд в сторону своего противника на расстояние 2-5х метров через отверстие в видоизменённом ядовитом зубе, что достигается резким сокращением мускулатуры, окружающей ядовитую железу. В этом случае змея реагирует на блеск слизистой оболочки глаза и производит выброс яда не отклоняя головы.

Naja pallida (Рис.1.1.), яд которой мы использовали в работе, обитает от северной Ганы, на востоке до Судана и Сомали, на юге до северной Танганьики. Змея окрашена в красно-коричневые, кирпич но-красные или оранжево-красные тона. Капюшон в отличии от других африканских и азиатских представителе этого семейства не ярко выражен. Длина тела примерно 120см, редко 150см. Naja pallida предпочитает равнины, в горах выше 1,5км не встречается, обычна около водоемов. Часто находит убежище в оставленных термитниках, под поваленными деревьями, в дуплах. Потревоженная змея выбрызгивает яд, пытаясь попасть в глаза. Питается мелкими змеями, ящерицами, мелкими птицами и грызунами. Активна преимущественно в сумерках и ночью. Naja pallida относится к смертепьно ядовитым змеям Африки [Spawls S., 1995].

Систематическое положение этого вида змей долгое время было не совсем ясно. Первоначально змея была описана как Naja nigricollis var. pallida (Boulenger,1896). В ходе ревизии 1957 года Naja pallida получила статус подвида Naja nigricollis (Naja nigricollis pallida, Loveridge). В 1968 году В road ley провел

Naja pallida Рис. 1.1.

nigricollis pallida, Loveridge). В 1968 году Broadley провел очередную ревизию, в результате которой Naja pallida стала подвидом Naja mossambica (Naja mossambica pallida). Статус вида Naja pallida получила в результате ревизии Broadley в 1983 году [Wüster W., 1997].

1.2. ХАРАКТЕРИСТИКА И СОСТАВ ЯДА КОБР.

Укусы плюющих и неплюющих кобр сопровождаются различными симптомами, которые определяются токсичностью и видовыми особенностями химического состава яда.

Яд кобр представляет собой густую жидкость желтоватого цвета, без запаха, с затхлым привкусом. Интересно отметить, что найдена определенная зависимость между желтым цветом яда и количеством, присутствующего в нем фермента - оксидазы-L-аминокислот [Zeller Е.А., 1948]. Желтую окраску яда объясняют присутствием в нем флавинадениндинуклеотида (ФАД), являющегося кофактором этого фермента. Из ядовитой железы одной змеи можно получить от 100 до 400 мг жидкого яда, однако при укусе, змеи вводят в организм жертвы не более четверти максимального объема. [Васильев Д.Б. и др., 1997].

Количество выделяемого яда зависит от возраста и величины змеи, ее физиологического состояния (линька, упитанность), промежутка времени прошедшего с момента приема пищи, срока прошедшего с момента последнего взятия яда, времени года [Давля-тов Я.Д., 1972].

В ходе эволюции ядовитый аппарат змей сформировался как орган защиты и нападения, обеспечивающий животному возможность существования. Следовательно, одна из главных функций яда - вызвать токсическое поражение жертвы, как правило, со

смертельным исходом. Этой цели служат содержащиеся в ядах вещества направленного токсического действия, поражающие отдельные жизненно важные органы и системы животных. К ним относится нейротоксин, кардиотоксин, геморрагины [Орлов Б.Н., Вальцева И.А., 1977].

Кроме токсинов в ядах змей обнаружено большое количество разнообразных ферментов, некоторые из которых, не действуя токсически, являются факторами вспомогательного характера, они ускоряют или усиливают токсический эффект. [Suhr S., Kim D.-S., 1996].

К примеру, с действием гиалуронидазы, содержащейся в яде кобр, связывают так называемый "феномен распространения" -стимул