Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Факторы роста нервов в филогенезе (выделение, характеристика, компьютерный анализ)

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Факторы роста нервов в филогенезе (выделение, характеристика, компьютерный анализ)"

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН ИНСТИТУТ БИОХИМИИ

Д На правах рукописи

УДК 576.12:575.321 ' :..... ^^

СМГ.'ЗВ РУСТАМХАН САБИРОВИЧ

ФАКТОР РОСТА НЕРВОВ В ФИЛОГЕНЕЗЕ (ВЫДЕЛЕНИЕ, У АКТЕРИСТИКА, КОМПЬЮТЕРНЫЙ АНАЛИЗ)

03.00. 1 - Биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

ТАШКЕНТ - 199 9

Работа выполнена в лаборатории клеточной биологии Института биохимии АН РУз.

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Доктор биологических наук, профессор Доктор биологических наук, профессор

Т.А.Бабаев Ш.С.Азимова П.Б.Усманов

Ведущая организация: Ташкентский Государственный

2000 г, в /У — часов на заседании Специализированного Совета Д.015.16.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Институте биохимии АН РУз по адресу: 700143, Ташкент, пр, X.Абдуллаева, . 56

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии АН РУз

Автореферат разослан « .9 » Усд.Л р А 1999 г.

Ученый секретарь ^

Специализированного Совета

Университет им. Мирзо Улугбека

Защита диссертации

. кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Белковые ростовые факторы играют ключевую роль в процессах развития и функционирования организма. Особое значение среди ростовых факторов имеют белки семейства нейротрофинов, в число которых входит фактор роста нервов (ФРН). Нейро-трофины являются внутриклеточными лигандами, воздействующими на дифференцировку, выживание (ингибируя апоп-тоз) и сохранение функций нейрональных клеток у позвоночных (Götz R., Schart М., 1994). В сферу функциональной компетентности ФРН входят не только периферическая и центральная нервные системы, этот регулятор может оказывать влияние и на другие типы клеток, включая иммунные и раковые клетки (Levi-Montalcini R. 1987; Otten U. et al., 1989). У человека ФРН обнаружен лишь в следовых физиологических количествах, но именно с нарушениями этого белка связывают ряд заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера и Паркинсона, различные нейрофиброматозы (Hellweg R. et al.,1998; Eriksdotter J. et al.,1998). Значение ФРН в развитии и нормальном функционировании ряда систем организма определяет перспективность его использования в медицинской практике. Однако в реализации этой программы существуют трудности, прежде всего связанные со структурными и иммунологическими особенностями ФРН из разных видов животных и человека.

В настоящей работе факторы роста нервов изучались в сравнительном аспекте. Не вызывает сомнения, что расширение спектра выявленных источников (включая региональные виды фауны) и выделение ФРН из них, позволили получить более объективную картину различий и общих черт в строении ФРН в филогенетическом ряду позвоночных. Разработка эффективных методов выделения ФРН, создание высокочувствительных тестов его определения, а также привлечение математических и компьютерных методов явились важными и направляющими для сопоставительного анализа ФРН и создания модели вневидового специфического диагностикума.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы исследование факторов роста нервов в филогенетическом ряду позвоночных: выделение, характеристика, сравнительный анализ структуры и разработка подходов преодоления видовой специфичности.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

-оценка нейроростовой активности в тканях у позвоночных разных таксономических групп, разработка эффективных методов выделения ФРН из разных источников, сравнительный анализ свойств выделенных белков из разных классов животных;

-разработка иммунотеста на основе поликлональных антител, способных распознавать видоспецифические и общие для ФРН антигенные детерминанты;

-компьютерное исследование структуры известных ФРН и создание модели вневидового высокоспецифического диагностикума для ФРН.

Новизна и практическое значение работы. При анализе нейроростовой активности в различных органах и тканях у эндемичных видов рыб, пресмыкающихся и земноводных установлено, что у исследованных видов рыб наибольший уровень нейроростовой активности отмечается в мозге золотой рыбки и карася (Carassius auratus и Cyprinus carpió). У земноводных (Rana ridibunda, Xenopus laevis) высокий уровень нейроростовой активности выявлен в мозге и мышечной ткани. Из более доступной мышечной ткани озерной лягушки разработан способ получения гомогенного белка, охарактеризованного по результатам биотестов на ганглиях куриных эмбрионов и клетках феохромоцитомы РС-12 как ФРН. У пресмыкающихся определен высокий уровень в почках и, особенно, в ядовитых железах среднеазиатских змей (Agkistrodon halus h., Naja oxiana Eichw, Vipera ursini, Vipera lebetina turanica, Echis multisquaraatus) . Эффекты ФРН ядов га-дюковых и ямкоголовых более выражены, чем яда аспидо-вых. Половой диморфизм и возраст особей существенно не отражается на уровне ФРН у рептилий. В слюнных железах неядовитых рептилий ФРН активность выявляется не у всех видов. Так из 8 проверенных видов она обнаружена лишь у трех (Varanus griseus, Elaphe dione и Eremias velox) .

Разработан способ обогащения (A.C. N 1172114) и схемы очистки ФРН из ядов среднеазиатской эфы и кобры. По аминокислотному составу ФРН яда среднеазиатской кобры и известных функциональных аналогов построена математическая модель филогенетического древа семейства ФРН.

Разработан способ получения белковых фракций из сыворотки крови человека, уровень нейроростовой активности в которых соответствует чувствительности биотеста на ганглиях куриных эмбрионов. Установлено, что при

восстановительных процессах и беременности в сыворотке крови увеличивается уровень нейроростовой активности. Хронический алкоголизм и шизофрения сопровождаются некоторым уменьшением уровня ФРН. Предложена схема получения нейроростового белка из абортивной крови.

Разработана высокочувствительная тест-система для определения ФРН на основе антител, полученных оригинальным способом. Данный способ включает двойную аффинную хроматографию антисыворотки барана к мышиному ФРН сначала на колонке с иммобилизованным ФРН мыши, а затем на колонке с ФРН быка. Установлено, что в активном иммунодоменантном центре ФРН содержатся как минимум два зпитопа, один из которых является общим для ФРН млекопитающих и слабо иммуногенным, а второй ви-доспецифичным и высокоиммуногенным. Структура общего эпитопа может служить основой антигена для разработки универсального диагностикума при определении ФРН у всех млекопитающих.

Предложена методология компьютерного анализа аминокислотной последовательности белков, позволяющая выявлять консервативные, в их числе уникальные участки исследуемого белкового семейства, т.е. аминокислотные фрагменты, встречающиеся только у данной группы белков . При сканировании информации с компакт-диска "Атлас белковых и геномных последовательностей", версия 1993, выявлены 4 уникальных аминокислотных фрагмента для семейства ФРН и 7 для нейротрофинов. По включенным в компьютерный анализ данным гидрофильно-сти/ гидрофобности аминокислот построены графики гид-рофильности цельной молекулы ФРН и ее отдельных фрагментов. На их основе осуществлен прогноз поверхностной доступности отдельных уникальных фрагментов ФРН. Выявлено, что уникальные фрагменты ФРН КТТАТС1Кв(-Ьуэ-ТЬг-ТЬг-А1а-ТЬг-Авр-11е-Ьуз-С1у-) и гсСЕМЗВД (-Зег-01у-Суэ-Агд-01у-11е-Азр-) являются наиболее перспективными в качестве матрицы для синтеза пептидов. Использование последних в качестве низкомомолекулярных антигенов позволит выработать антитела и создать на их основе высокоспецифический вневидовой иммунодиагностикум на ФРН.

Практическая ценность работы заключается в разработке методов выделения и очистки ФРН из различных источников, представляющих коммерческую ценность в качестве биопрепаратов в биохимии, нейробиологии, нейрохи-мии и медицинской практике. Предложенный способ двухэтапной очистки поликлональных антител дает воз-

можность получения общих и видоспецифичных антител как основы для диагностикумов. Разработанные нами компьютерные программы позволяют по процентному содержанию аминокислот судить о структурной близости белков. Кроме того, они позволяют по выявленным уникальным участкам классифицировать исследуемые группы белков, а по рассчитанному профилю гидрофильности/гидрофобности уникальных пептидов оценить возможность их использования в качестве матрицы при создании высокоспецифических диагностикумов.

Апробация работы. Представленные результаты работы были доложены и обсуждены на различных республиканских и международных съездах, симпозиумах и конференциях, в том числе: на 2 рабочем совещании "Морфогенетически активные вещества", (Пущино, 1988); на Всесоюзном совещании "Актуальные вопросы клеточной биологии",(Ленинград, 1989); на Х1У Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Ташкент, 1989); на первом Всемирном конгрессе герпетологов (Лондон, 1989); на 20 конференции Федерации европейских биохимических обществ (ФЕБО),(Будапешт, 1990); на 9 Европейском симпозиуме по животным, растительным и микробиологическим токсинам (Лохусалу, 1990); на V Конференции биохимиков республик Средней Азии и Казахстана (Ташкент,1991); на Советско-Финском симпозиуме по биологии развития "Сигнальные молекулы и клеточная диффе-ренцировка", (Суздаль, 1991); на Европейском конгрессе по биологии развития (Иерусалим, 1991); на симпозиуме Содружества Независимых Государств "Организм и среда", (Бухара, 1992); на 2 и 3 Конференции биохимиков Узбекистана (Ташкент, 1993;1996); на Международной конференции "Механизмы развития: онтогенетические и филогенетические аспекты", (Москва, 1994); на Евроазиатском симпозиуме по современным направлениям в биотехнологии, (Анкара, 1995); на международной научной конференции "Влияние физико-химических факторов на метаболические процессы в организме",(Андижан, 1997); на 17 международна^ конференций по биохимии и молекулярной биологии(Сан-Франциско, 1997).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 54 работы, в том числе 2 авторских свидетельства и 1 методическая рекомендация.

Автор выражает глубочайшую благодарность и признательность своему учителю и научному консультанту академику Д.X.Хамидову, а также д.б.н. Л.Я.Юкельсону за неоценимое внимание и помощь при обсуждении планов

и результатов исследований. Искренне признателен моим коллегам к.б.н. М.Б.Хафизовой, к.м.н. И.И.Парилис, Е.Ю.Казанову, к.б.н. Д.Б.Мирходжаеву, к.б.н М.Ш.Акра-мову, к.б.н. Р.Д.Хамидову, к.б.н. Ч.И.Исанбаеву, к.б.н. Г.И .Аллаяровой, А.Мамаджанову и ныне покойному А.В.Лим за содействие в выполнении ряда экспериментов настоящей работы и техническую помощь.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалы и методы исследования Объекты исследования: водные экстракты тканей эндемичных видов рыб, земноводных, рептилий, птиц, яды змей, слюна варана, сыворотка крови человека, аминокислотные составы и первичные структуры нейротрофинов. Активность ФРН определяли биотестом при культивировании сенсорных спинальных и симпатических ганглиев 7-10 дневных зародышей кур, инкубированных при 37°С в течении 18-24 часов в среде, содержащей различные концентрации исследуемых образцов (Levi-Montalcini R.,1968; Оленев С.Н., 1969), а также в культуре клеток крысиной феохромоцитомы РС-12 (Greene L.,1977). О присутствии ФРН судили по появлению нейритного обрамления "нимба" волокон вокруг ганглия, оценивая его густоту по 5 балльной шкале (Fenton Е., 1970). Активность ФРН выражали в биологических единицах (БЕ): одна БЕ соответствовала минимальному количеству белка в 1 мл среды, приводящего к образованию плотного "нимба" волокон . В экспериментах по подавлению активности ФРН антителами, ФРН выдерживали с различными концентрациями антител в культуральной среде в течение 4-5 ч при комнатной температуре перед добавлением к ганглиям. Антитела к ФРН получены из гипериммунной сыворотки барана. Схема иммунизации: 1 мг мышиного 7S ФРН в 0,15М NaCl, эмульгированным в двукратном объеме полного адъюванта Фрейнда подкожно, подхлестывающие инъекции по 1 мг ФРН в неполном адъюванте с 5-недельными интервалами 5 раз в течении б месяцев. В последнюю инъекцию ввели 0,5 мг ß-ФРН. Проверку титров проводили двойной диффузией (Ouchterloni N., 1952) в 1,5% агаровых пластинках. Кровь собирали через 7 дней после последнего введения, отделяли сыворотку центрифугированием и лиофилизирова-ли. Определение количества белка в растворе осуществляли спектрофогометрически по поглощению при 280 нм и методом Лоури (Lowry О. et al., 1954). Гельфильтрацию и ионообменную хроматографию на сефадексах, TSK- гелях

и на КМ-целлюлозе выполняли согласно рекомендациям фирм-изготовителей. Ультрафильтрацию проводили под давлением 4 кг\см2 при использовании фильтров РМ-10 Amicon. Аналитический электрофорез в 7,5% ПААГе рН 8,3 (Маурер Т., 1971) проводили в течение 1,5-2 часов, гели окрашивали 0,1% раствором Кумасси Р-250. ДСН-электрофорез - по методу Леммли (Laemmli U., 1970) в 12% ПААГе, используя трис-глициновый буфер с рН 8,6, содержащий 0,1% ДСН. Определение аминокислотного состава белка осуществляли после гидролиза образца в дважды перегнанной соляной кислоте при температуре 105°С в течение 24 часов на автоматическом аминокислотном анализаторе Biotronic LC 7200 (Германия). Расчет евклидовых расстояний осуществляли с помощью пакета прикладных компьютерных программ "KEY". Определение консервативных фрагментов в аминокислотной последовательности нейротрофинов проводили при использовании компьютерной программы "Protein Adviser".

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследование нейроростовой активности в тканях и секретах у позвоночных разных таксономических групп.

Как правило, ФРН присутствует в тканях в небольших физиологических концентрациях. Однако, у некоторых животных этот регулятор может значительно кумулиро-ваться в каком-то определенном органе. В настоящее время известно, что большие количества ФРН содержат подчелюстные железы мышей самцов и африканского грызуна Mastomys natalensis, яды некоторых змей, предстательная железа морской свинки, семенная плазма быка. В настоящем исследовании осуществлен анализ нейроростовой активности (Таблица 1) в различных органах и тканях у животных, обитающих на территории Средней Азии и относящихся к разным классам животных.

При сопоставлении данных таблицы 1 становится очевидным, что у рыб нейроростовая активность (4 0-60 мкг/БЕ) сосредоточена преимущественно в ткани мозга, глаз и сердца. Содержание нейритстимулирующей активности в мозге карася достигает 200 БЕ/мг белка. Земноводные - озерная Rana ridibunda и шпорцевая Xenopus laevis лягушки характеризуются преимущественным содержанием нейроростовой активности в мышечной ткани, сердце и мозге. У зеленой жабы в тех же тканях отсут-

Таблица 1.

НЕЙРОРОСТОВАЯ АКТИВНОСТЬ В ОРГАНАХ И ТКАНЯХ ПОЗВОНОЧНЫХ СРЕДНЕЙ АЗИИ

голов. серд- пищ. селе- пе- лег- семен - яични- почки мыщ- гла- сыв. пч/с

мозг це органы зенка чень кие ники ки цы за крови железа

Карась + + + - + + - + - н/о - - + - + + - н/о

Золотая рыба + + + - + + - + - IVO - - + - + + - н/о

Зеленая жаба - - - + - - - - - - - - юо

Озерная лягушка + + + - + + + + - - + + + - - н/о

Ксенопус + + + + - + + + + - + - + + + + + + - шо

Щитомордник Н/О + + + + + + - Н/О н/о н/о + + - + + - + +

Эфа - - + + Н/О н/о IVO + - - н/о - + +

Полоз разноцветный Н/О + - + - + - Н/О н/о + - + - + + - н/о - -

Полоз узорчатый + - + - + - + - н/о + - н/о + + - + - - +

Уж водяной + - + - + + - + н/о - - + + - + - -

Желтопузик + - + - + - + - н/о + - н/о н/о НУО + + - -

Быстрая ящурка + + - + + + + Н/О н/о + + шо + + - н/о - +

Степная агама + - - - - н/о + + - н/о + + - -

Сцинковый геккон + + - + - Н/О - н/о н/о н/о н/о - - + - н/о

Кулик краснозобик + + + + + - - + - н/о н/о н/о + + + - + + н/о н/о

Цыпленок 2 дневный + + + + - - + - н/о шо н/о + + + - + + н/о н/о

Домашняя курица + + + + - - + - н/о н/о н/о + + + - + + н/о н/о

Скворец -майна + + + + + - - + - н/о н/о №0 + + + - + + В'0 н/о

Утка широконоска + + + + + - - - roo н/о н/о ' + + + - + + н/о н/о

Речная чайка + + + + + - н/о н/о н/о + + + - + + н/о н/о

"+" и наличие и отсутствие нейроростовой активности соответственно; "+ -" - нейроростовая активность достоверно не выявляется; Н/О - не определялась.

ствует нейроростовой эффект. Несомненное наличие ФРН в ткани мозга выявляется у низших рептилий - ящериц, особенно у наиболее эволюционно древних видов. У змей, находящихся на более высоких ступенях филогенетического древа пресмыкающихся, основным кумулирующим органом ФРН становится слюнная железа, преобразованная у ядовитых видов в ядовитую железу. Во всех изученных ядах 5 эндемичных для Средней Азии видов змей обнаружены высокие уровни нейроростовой активности (Таблица 2). Вместе с тем, наличие ФРН не обязательно связано с присутствием токсинов. Нами обнаружен фактор в слюнных железах некоторых видов неядовитых рептилий (узорчатый полоз Е1ар]ле сИопе и быстрая ящурка Егегп:1аз уе1ох) .

Таблица 2.

Нейроростовая активность ядов среднеазиатских змей и слюны серого варана.

Яды рептилий : Концентрации ядов и слюны, ока

: зы вающих нейритстимулирующий эффект мкг/мл

Щитомордник 0, 04 - 1, 0

Степная гадюка 0, 06 - з, 0

Гюрза 0, 30 - 10, 0

Кобра 0, 04 - 3, 0

Эфа (самец) 0, 02 - 1, 0

Эфа (самка) 0, 03 - 1, 0

Эфа (недельная особь) 0, 02 - 1, 0

Серый варан (самец) 0, 50 - 3, 0

Серый варан (самка) 0, 50 - 3, 0

Серый варан (неполово-

зрелая особь) 1, 00 - 20, 0

Кроме того, нами выявлено высокое содержание ФРН в нетоксичной слюне серого варана Уагапиэ дг1зеиз - 1000 БЕ/мг белка. Практически у всех проверенных видов пресмыкающихся обнаруживается повышенный уровень ФРН в почках.

У птиц также отмечаются высокие уровни ФРН в головном мозге, сердце, почках и в глазах. Анализ обогащенных фракций, полученных из органов и тканей куриных зародышей в процессе эмбриогенеза, показал высокий уровень содержания ФРН в икроножных мышцах.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что у большинства проверенных видов нейро-

ростовая активность выявляется в ткани мозга, особенно это характерно для рыб, низших пресмыкающихся и птиц. Она часто обнаруживается в тканях сердца, почек и глаз.

Установлены новые источники ФРН - головной мозг карася, мышечная ткань озерной лягушки, слюнная железа серого варана.

Общеизвестным источником ФРН являются змеиные яды. Нами показано, что яды среднеазиатских змей -кобры, эфы, гюрзы, степной гадюки и щитомордника содержат значительные количества ФРН. Ядовитые железы являются основным органом-кумулятором ФРН у рептилий, все остальные проверенные органы и ткани пресмыкающихся содержат меньшие количества этого белка. В ядах эфы, степной гадюки и щитомордника активность ФРН выше, чем в ядах гюрзы и кобры.

Известно, что у млекопитающих ФРН может кумулиро-ваться в слюнных или половых органах самцов (Калюнов В.Н., 1984) . Накопление ФРН в них начинается с появлением половых признаков, у новорожденных же животных этот белок почти отсутствует. Нами исследована нейро-ростовая активность ядов половозрелых самцов, самок и новорожденных (1-нсдельного возраста) особей среднеазиатской эфы. Показано, что у среднеазиатской эфы половой диморфизм в содержании ФРН, характерный для млекопитающих, отсутствует. ФРН обнаруживается даже у новорожденных рептилий. Это подтверждается и данными по слюне серого варана.

Разработка методов выделения и характеристика ФРН из разных классов позвоночных животных.

Поиск эффективных методов выделения ФРН из различных источников включал подбор наиболее оптимальных источников для получения очищенных препаратов ФРН, использование традиционных и разработку новых методов очистки и выделения. Новые методы выделения ФРН были ориентированы на специфические свойства данного белка.

Один из подходов основывается на разделении белков по сорбционной способности к стеклу. Известно, что ФРН обладает более выраженной сорбцией к стеклу, чем остальные белки (Реагсе Р. et а1, 1973) . Мы воспользовались этой качественной характеристикой и предложили метод адсорбционной хроматографии, где в качестве носителей на колонках использовали частицы стекла. В результате получены фракции, обогащенные ФРН. Этот метод мы применили при фракционировании различных гомо-генатов и жидкостей, предполагаемых в качестве источ-

ника ФРН. При использовании змеиных ядов и тщательной разработке условий разделения, удалось добиться успешных результатов фракционирования. Данный метод оказался наиболее эффективным в отношении яда эфы {A.C. № 1172114 от 8 апреля 1985г.) (Рис 1).

Рис. 1. График адсорбционной хроматографии раствора яда среднеазиатской эфы на колонке (2,5x35 см) с частицами стекла (0,4-1,2 им). 1 - элюция дист.водой; 2- элюция 0,04 -0,06 М СНзСООН, рН 3,0 - 3,1; 3 -элюция 0,04 - 0,06 Мтрис-(оксиметил)-аминометан, рН 10,0

При фракционировании 44,6 мг яда с суммарной активностью 8 9,2х104 БЕ получены три фракции. 1 фракция - неадсорбированных компонентов по белку составляла 22,9 мг с общей активностью 11,5х104 БЕ. Вторая, вымываемая 0,05 М раствором уксусной кислоты, соответственно 7,3 мг и 36,4х104 БЕ. Третья, получаемая при элюировании 0,05 М раствором Трис-НС1 буфера по массе составляла 1,8 мг, а ее суммарная активность соответствовала 9,0х104 БЕ. Фракции 2 и 3 составляли 20% от массы яда и содержат основную активность ФРН.

Использование предложенного метода при работе с другими источниками ФРН показало, что в зависимости от источника процентное количество обогащенной ФРН фракции к основной массе белка может существенно разниться. При фракционировании такого богатого источника ФРН, как мышцы озерной лягушки, предлагаемый метод оказался наиболее подходящим. Однако, в случае менее богатых источников ФРН (сыворотка крови) происходит существенная потеря белка, несмотря на концентрирован-ность ФРН в получаемой фракции. Поэтому нами, наряду с предлагаемым методом разделения, использовались и классические, а также разработаны другие оригинальные подходы в фракционировании. Степень изученности источников ФРН из разных классов позвоночных зависит от их

обогащенности фактором, количества и доступности. Так, из мышечной ткани 17-суточных эмбрионов кур гельфильт-радией на колонке с TSK - 7 5 HW гелем, с последующей хроматографией второй из пяти фракций на колонке с КМ-целлюлозой получены четыре фракции. Нейроростовой активностью обладала первая электрофоретически гетерогенная фракция с удельной активностью 2х103 БЕ/мг белка. Из яда щитомордника, представителя семейства гре-мучниковых змей, получена фракция ФРН, обладающая основными свойствами и имеющая ММ 30,0-40,0 kD. Источники с наиболее высоким содержанием ФРН - яды среднеазиатской кобры и эфы, а также мышцы озерной лягушки изучены нами в наибольшей степени: тщательно разработаны условия фракционирования и охарактеризованы полученные гомогенные белки. При этом сочетались разработанные и классические методы очистки. Последовательное описание данных результатов представлено ниже.

На основе известной методики фракционирования яда кобры (Сахибов Д.Н. и др., 1974) была разработана схема поэтапного фракционирования цельного яда кобры (Рис. 2). При гельфильтрации на сефадексе G-100 получено б белковых пиков с локализацией нейритстимулирую-щей активности в 4 фракции. Электрофоретический анализ выявил щелочной характер белков этого пика, поэтому дальнейшее фракционирование осуществляли на колонке с КМ-целлюлозой. В результате ионообменной хроматографии получено 13 белковых фракций. Нейроростовая активность сосредоточена преимущественно в 9 фракции и незначительно в 10-11 фракциях. Аналитическое электрофокусирование выявило в 9 фракции несколько белков с величиной pi 6,0-8,5. На заключительном этапе фракционирования использовали препаративное изоэлектрическое фокусирование в тонком слое сефадекса G-7 5 Superfine с применением амфолитов в диапазоне рН 6-8, при этом белки распределялись по трем зонам, а ФРН-активность сосредотачивалась в средней фракции И-2. Выход конечного продукта составил 0,1% к массе яда. Это - простой белок с р1-6,8 и молекулярной массой 13-13,5 kD по данным ДСН - электрофореза и 28 kD по данным гель-фильтрации. Кратная величина молекулярной массы, полученная разными методами, вероятнее всего, обусловлена димерной формой молекулы. Очищенная фракция обладала нейритстимулирующей активностью при концентрации 10 нг/мл, что соответствует 10sБЕ/мг.

Изучен аминокислотный состав исследуемого белка (Таблица 3).

СХЕМА ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ ЦЕЛЬНОГО ЯДА КОБРЫ

Цельный яд Naja oxiana Растворение^ и центрифугирование

Гельфильграция на сефадексе G-100 Колонка 2,6x90 см; элюент 1% раствор уксусной кислоты, скорость элюции 30 мл/час

1 2 3 4 5 6

1

Хроматография фракции 4 на КМ-целлюлозе Колонка 1,8x55 см.

Градиент 1 - 0,05 М ацетат аммония, pH 4,8-6,2; 0,1 М ацетат аммония, pH 6,2;

1

12345678 Градиент 2-0,1-0,5 М

ацетат аммония

I I 1 I I

9 10 11 12 13

I

Препаративное изоэлектрсфокусирование фракции 9 в тонком слое сефадекса 6-7 5 Зире^апе. Интервал рН 6,0-8,0. Мощность 8 ватт. Время 10 час.

1

И-1 И-2 И-3

Рис 2 .

Для получения ФРН из яда эфы разработаны две схемы фракционирования. При первой, с использованием описанного сорбционного метода и препаративного изозлек-трического фокусирования получен ФРН в высокоочищен-ном, но не индивидуальном состоянии. Поэтому параллельно была разработана другая схема очистки с использованием методов гельфильтрации и ионообменной хроматографии (Рис. 3).

Супернатант растворенного яда разделяли на ультрафильтре РМ-10. Высокомолекулярную фракцию хромато-графировали на колонке с ТЭК-гелем НИ-55, при этом получили б фракций. ФРН активность была сосредоточена во

фракциях 5 и б, которые объединяли, концентрировали, обессоливали и адсорбировали на колонке с КМ-целлюло-

Таблица 3.

Аминокислотный состав ФРН из яда среднеазиатской кобры

Аминокислоты Naja ох1апа Аминокислоты Naja ох1апа

асп 19, 1 мет 2, 3

тре 10, 4 иле 4,3

сер 9,3 лей 4,5

глу 13, 6 тир 3, 8

про 5,0 фен 3, 4

гли 3,5 ЛИЗ 5, 6

ала 6,2 гис 5, 9

1/2 цис не опр. арг 3,2

вал 4,7 трп не опр.

Схема очистки ФРН из яда ЕсЫг тиЗ.'Ыздиата-Ьиз

Этапы очистки Биологическая Выход

активность*, нг/мл мг. %

Цельный яд 50 - 100 2000 100

У л ьтрафильтрация на РМ-10 30 - 50 900 45

| Хроматография на ТЭК-геле (Фракции 5+6) 15 - 20 200 10

| Хроматография на КМ-целлюлозе (Фракция 8) 15 30 1,5

Гель-филь трация на сефадексе С-75 (Фракция 2) 10 - 15 5 0,25

Рис. 3.

зой. При элюировании с изменением рН от 4,8 до 6,0 и молярности буфера от 0,05 до 0,3 М бьшо получено 10 фракций. ФРН был обнаружен в 8, 9 и частично в 7 фракциях. Все препараты с нейритстимулирующей активностью проявляли электрофоретическую гетерогенность. Для окончательной очистки собирали фракцию 8 и подвергали гельфильтрации на сефадексе в-75. При этом нами получены две белковых фракции с содержанием ФРН активности

во втором пике. Молекулярная масса полученного препарата по данным гельфильтрации 33-37 kD, а электрофореза в присутствии DS-Na - 13 kD. Значение изоэлектриче-ской точки ФРН яда эфы соответствует 7,0-7,2, Установлена гликопротеиновая природа ФРН, уровень Сахаров в белке составляет 1-2%.

Из мышц озерной лягушки получение индивидуального препарата ФРН достигается при первичной хроматографии водного супернатанта гомогената ткани по разработанной методике сорбционной хроматографии на частицах кварцевого стекла. Сорбированные белки удается элюировать из колонки 0,05 М трис-солянокислым буфером с pH 7,0. Этот материал "Фр-1" подвергался ультрафильтрации на фильтрах Амикон ХМ-10. Нейроростовая активность концентрировалась в высокомолекулярной фракции, которая на следующем этапе подвергалась препаративному электрофорезу в лолиакриламидном геле. Только 2 компонента (ВФ-1 и ВФ-2) из пяти обнаруживали нейритстимулирующую способность, причем основная активность локализовалась в электрофоретически гомогенной ВФ-2 фракции. Из 100 грамм гомогената мышечной ткани с содержанием белка 30% от общей массы и удельной активностью 3 БЕ/мг, был получен гомогенный продукт массой 1,3 мг на 99% состоящий из белка с активностью 6,5х105 БЕ/мг. Такая активация возможно связана с отделением от комплексов ингибиторов роста, сходных с теми, которые обнаружены в нервной ткани (Schwartz М. et al., 1982; Mizrachi Y. et al., 1986) .

Биологический эффект наблюдали не только при действии данного фактора на спинальные ганглии куриных эмбрионов, но и на клетках феохромоцитомы РС-12. Методом гельфильтрации на сефадексах и SDS - электрофорезом определена молекулярная масса равная 110,0 + 5,0 kD, что соответствует полученной ультрацентрифугированием константе седиментации (KS) равной 7,4 S, и рассчитанной на этой основе молекулярной массе белка -106,0 kD. Изоэлектрическим фокусированием установлено pi в пределах 9,2-9,4. Получены результаты по аминокислотному составу. Наличие Сахаров около 1% указывает на возможность гликопротейдной природы фактора. Аналогичные белки обнаружены в фибробластах L 92 9 и культурах миоцитов (Pantazis N. et.al., 1972; Murphy R. et al., 1979) .

Исследование фактора роста нервов в сыворотке крови человека.

Сыворотка крови человека содержит незначительные количества ФРН и поэтому требует использование наиболее чувствительных методов определения фактора. Нами проведено сопоставление чувствительности различных вариантов: биотеста на сенсорных и симпатических ганглиях куриных эмбрионов, двухсайтового и точечного им-муноферментного анализа. Нижний порог чувствительности составил соответственно 2,3 пМ, 0,06 нМ, 2,0 пМ и 0,04 мкМ, т.е. более чувствительными являются биотест на сенсорных ганглиях и двухсайтовый ИФА.

Так как трудности обнаружения ФРН в нативных биологических жидкостях и тканях человека могут быть связаны с присутствием ингибиторов или просто низкой концентрацией фактора, представляется целесообразным и фракционирование цельных образцов. Подбор различных вариантов разделения показал, что успешным является метод, используемый при разделении альбуминов и глобулинов. Он заключается в разбавлении биологической жидкости или супернатанта гомогената ткани дистиллированной водой в соотношении 1:1 или 1:2, отстаивании 30-60 минут и центрифугировании 30 минут при 6000 об/мин. При этом получен осадок, составляющий 0,033-0,035% от общего белка сыворотки (глобулиновая фракция), нейро-ростовая активность которого соответствует 3 БЕ/мг белка. Достаточным количеством сыворотки для выявления ФРН активности биотестом на сенсорных ганглиях является 10-15 мл. Описанный способ позволил провести сравнение нейроростовой активности в доступных тканях и биологических жидкостях человека. Фракционированные образцы сыворотки крови взрослых, а также молоко 2-6 дня лактации стимулируют характерный рост нейритных волокон в концентрации 300 и 100 мкг/мл соответственно. Образцы плаценты, спермы, слюны, синовиальной жидкости и мочи нейроростовой активностью не обладали. Учитывая, что сыворотка крови человека является наиболее доступным объектом исследования, для определения случаев повышенного содержания фактора проведено сравнительное изучение сыворотки крови человека при некоторых физиологических и патологических состояниях человека (Таблица 4). Данные таблицы 4 свидетельствуют, что процессы роста и восстановления в организме сопровождаются повышением сывороточного уровня ФРН. Увеличение нейроростовой активности в период беременности вероятно обуславливается различными причинами, связан-

ными с началом функционирования плаценты, увеличенной секрецией андрогенов и изменением тиреоидного статуса,

Таблица 4.

Содержание ФРН в сыворотке крови при некоторых физиологических и патологических состояниях человека.

Образцы Количество Содержание глоб. Количество

сыворотки проб фракции в % ФРН в БЕ/мл

Донорская /норма/ 18

Абортивная 27

Ретроплацентарная 12 Травматическая

/3 - 7 дн./ 16 Инфарктная

/6 - 14 дн./ 4

Гипертиреоидная 4

Шизофрения 7 Хронический

алкоголизм 9

Инсулинотерапия

/хрон.алкоголизм/ 9

Алкогольный

делирий 4

0, . 033 1, 050 + 0, . 117

0, . 031 3, 413 + 0, . 136

0, 030 3, 291 + 0, 098

0, .034 2, 879 + 0, 109

0, 031 6, 666 + 0, 174

0, .033 1, 320 + 0, 129

0, 032 0, 187 + 0, 112

0, 034 0, 181 + 0, 084

о, 032 0, 750 + 0, 100

0, 030 1, 320 + 0, 078

изменениями в потребностях материнского организма и плода. Измерение сывороточного уровня ФРН в динамике беременности показало сохранение на протяжении всей беременности трехкратно увеличенного уровня, с возрастанием еще в 2 раза на 13-16 неделях развития. Пик активности на четвертом месяце беременности может быть связан с усилением синтеза рецепторов ФРН в нервной системе развивающегося плода, происходящего именно в этот период (Эсагр^п! Е. а1., 1988). Повышенная

нейритстимулирующая активность выявлена в крови у больных после перенесенной травмы (перелом тазобедренного сустава) и инфаркта миокарда. При этих повреждениях активность сывороточного фактора возрастала примерно в 3 раза на 3-7-й день после перелома и в 6 раз на 6-14 дни после инфаркта. Повышение в сыворотке крови нейроростовой активности после перенесенной травмы характерно и для рептилий, механическое повреждение

шеи у эфы привело к увеличению ФРН в крови. Известно, что такие заболевания как шизофрения и алкоголизм характеризуются нарушениями уровня дофамин-р-гидрок-силазы - ключевого фермента, регулирующего синтез но-радреналина и зависимого от ФРН. Нами показано, что при шизофрении уровень нейроростовой активности снижается в 5,5 раза. Исследования крови больных хроническим алкоголизмом до и после лечения показали, что при остром течении болезни наблюдается пятикратное снижение активности сывороточного ФРН, тогда как 45-дневный курс инсулинотерапии приводил к повышению активности регулятора, хотя уровень его не достигает нормы.

Сыворотка абортивной крови была использована как источник для получения очищенных препаратов ФРН человека. Разработана схема очистки, первым этапом которой является описанный ранее метод сорбционной хроматографии на стекле {таблица 5).

Таблица 5.

Схема очистки ФРН из сыворотки абортивной крови.

Этапы очистки количество белка в мг выход в% нейроростовая активность в БЕ/мг

цельная сыворотка 7200 100 -

хроматография на стеклянных

частицах 54 0,75 12

гельфнльтрация на ТвК НДУ-55 31 0,44 12

хроматография на КМ-

целлюлозе 1,5 0,02 200

препаративный электрофорез 0,12 0,001 670

При этом был получен индивидуальный белковый препарат, обладавший активностью 670 БЕ/мг. По профилю элюции на сефадексах определено значение его молекулярной массы - 150-160 кВ, а аналитическим изоэлектрофокусированием р1 в диапозоне 9,1-9,7. Нейроростовая активность его частично блокировалась дважды очищенными антителами к р—ФРН мыши при соотношении 1БЕ ФРН / 1,6 мкг антител. Полного подавления активности препарата достичь не удалось даже при концентрации антител 16 мкг/мл. Обработка восстанавливающими агентами показала, что нейроростовая активность связана с белком ММ 15-30 кБ, ко-

торый находится в комплексе с белком носителем глобу-линовой природы посредством дисульфидной связи.

Разработка высокочувствительной тест-системы для определения ФРН на основе антител к видоспецифичным и 061ДИМ эпитопам молекул ФРН.

В тканях и жидкостях могут содержаться вещества, мимикрирующие действие ФРН в биологических тестах и искажающие результаты. Поэтому наряду с биологическими методами используют иммунологические тест-методы с применением антител к известным ФРН. Поликлональные антитела, применяемые для определения уровня ФРН обладают, за редким исключением, высокой видовой специфичностью. С их помощью можно получить лишь относительные данные по содержанию ФРН у других видов животных и человека. Кроме того, даже при использовании антител только к ФРН мыши разными авторами получены различные данные по ФРН в крови человека. Данный факт связывают с получением антител к различным антигенным детерминантам белковой молекулы. Топографически эти эпитопы могут располагаться как в вариабельных, так и в консервативных участках молекулы антигена, доступных для взаимодействия. Очевидно, что более высокой видоспеци-фичностью отличаются антитела к эпитопам в вариабельных участках молекулы, а меньшей - в консервативных, общих для всех ФРН, участках. Целенаправленное получение антител к эпитопам, расположенным в консервативной части молекул ФРН, представлялось экспериментальной необходимостью для обьективного анализа ФРН в образцах человека и для сравнения содержания ФРН в филогенетическом ряду позвоночных.

Поставленная задача решалась получением поликло-нальных высокоаффинных антител к ФРН одного вида и дальнейшим их фракционированием на колонке с иммобилизованным ФРН из другого вида животных. Использование крупного животного (баран) и длительная схема иммунизации позволили получить значительные количества антисыворотки с высоким титром антител. Для инъекций был применен ФРН мыши в комплексном варианте (7Б), так как активная субъединица ФРН (2,5Б, (5-субъединица) являлась слабым иммуногеном. Сначала антисыворотку фракционировали на аффинной колонке с иммобилизованным (5-ФРН мыши. При промежуточной смывке 0,2М СНзСООНа, рН 4,5 полностью удаляли балластные белки и низкоаффинную фракцию антител. Высокоаффинную фракцию получали смывкой 20 мМ НС1+ 14 0 мМ ИаС1 при рН 1,9. Чистоту последней фракции проверяли аналитической рехроматографией

на колонке свежей ß-ФРН агарозы при той же схеме элю-ции. Отсутствие несвязывающегося белка при промывке колонки стартовым буфером, а также при смывке с pH 4,5 подтверждало иммунохимическую чистоту последнего хро-матографического пика. Полученная высокоаффинная фракция антител, обозначенная как ß-AT, была вновь фракционирована на аффинной колонке, но уже с иммобилизованным ФРН быка, общая схема очистки антител приведена на рис. 4. Качество полученных антител оценивали по подавлению активности ФРН в стандартном биотесте (рис.5.)

ß-AT полностью подавляли максимальный вырост нейритов, вызванный 1 БЕ ß-ФРН (5-10 нг/мл), в концентрации 25-50 нг/мл, то есть при молярном отношении ФРН и антител около 1.

Нейтрализация 1 БЕ бычьего ФРН (2-4 нг/мл) достигалась при концентрации ß-AT 3,2-6,4 мкг/мл.

При исследовании дважды очищенных антител в биотесте установлено, что кривая титрования их нейтрализующей активности по отношению к ß-ФРН оставалась практически идентичной ß-AT, тогда как по отношению к бычьему ФРН была достигнута 8-кратная степень очистки (нейтрализующая концентрация 0,4-0,8 мкг/мл).

Разработанная процедура иммуноаффинной очистки позволила нам впервые получить препарат поликлональных антител к ФРН с максимально возможной нейтрализующей активностью, по данным высокочувствительного (2,3 пМ) биологического тестирования.

Выход антител двойной очистки составлял не более 12% от количества антител однократной очистки, наносимых на иммуносорбент с бычьим ФРН. Такое низкое иммунологическое сходство двух ФРН свидетельствует об их существенных конформационных различиях, несмотря на высокую гомологию в нуклеотидной последовательности ФРН млекопитающих (Ullrich А. et al., 1983), Таким образом, преобладающую часть антител однократной очистки составляют антитела к видоспецифическому эпитопу ß-ФРН, скорее всего к детерминанте, находящейся в непосредственной близости к активному центру.

Антитела двойной очистки специфичны к общим детерминантам мышиного и бычьего ФРН и, предположительно, этот препарат содержит антитела к эволюционно консервативному активному центру ФРН. Действительно, дан-

ов

4 -

3 -

2' -

О 3 6 12 25 50 100 200 400 800 1600 3200 6400

Концентрация антител, нг/мл

Рис.4. Схема очистки антител двойной иммуноаффинной очистки АГ- антиген; АТ - антитело; М - мышь; Б - бык; Ч - человек; о - общая антигенная детерминанта.

Рис.5. Титрование нейтрализующей активности антител к р-ФРН и антител двойной очистки в биотесте на спинальных ганглиях 7-9 дневных куриных эмбрионов в присутствии 1 БЕ р-ФРН (5нг/мл) или бычьего ФРН (2 нг/мл): О - р-ФРН, антитела к р-ФРН; "" - Р-ФРН, антитела двойной очистки; и - бычий ФРН, антитела к Р-ФРН; О -бычий ФРН, антитела двойной очистки. ОВ - оценка выроста нейритов в баллах

ный препарат антител ингибировал при биотестировании нейритогенный эффект ядов нескольких среднеазиатских змей (Vipera lebetina, Echis multisquamatus, Naja oxiana) и слюны варана (Varanus griseus), а также обогащенной фракции ФРН из сыворотки крови здоровых доноров. Можно предположить, что дальнейшее фракционирование на иммуносорбентах со змеиными ФРН позволит в значительной мере отсортировать антитела, направленные к активному центру молекулы.

Таким образом, нами получены высокоаффинные антитела к видоспецифическим и общим эпитопам мышиного и бычьего ФРН, обладающие максимально возможной нейтрализующей активностью по отношению к ß-ФРН и являющиеся ценным зондом для мониторинга уровней фактора в тканях и биологических жидкостях. Сочетание антител двойной очистки с антителами однократной очистки, не связавшимися с бычьим ФРН, позволяет дополнительно увеличить специфичность детекции ß-ФРН в двухсайтовых системах иммуноанализа.

Сравнительный компьютерный анализ структуры ФРН и других нейротрофинов из разных классов животных и создание модели вневидового высокоспецифического диаг-ностикума для ФРН.

Обзор литературы и собственные данные позволяют заключить, что факторы роста нервов вне зависимости от источника выделения проявляют нейритогенный эффект в очень низких (нг/мл) концентрациях, являются белками, простыми или содержащими незначительное количество Сахаров, обладают молекулярной массой активного начала от 13 до 4 0 кДа и имеют нейтральное или щелочное значение pl. Нами установлено, что выделенный ФРН из яда среднеазиатской кобры по значениям молекулярной массы и pl соответствует ФРН из других видов рода Naja, а выделенный ФРН из яда эфы по этим свойствам ближе к белкам из рода Vipera. Однако определить, в какой степени полученные белки сходны или отличаются от других известных ФРН только по этим показателям представляется затруднительным. Данные по составу аминокислот также проблемно сравнить, так как существует значительная разница в общем количестве аминокислотных остатков у ФРН из разных источников. Трудность прежде всего связана с описательным характером сравнения, с элементами субъективизма и приблизительности в описании .

Для более объективного сравнения ФРН из разных

источников нами применен математический метод сравнения и использованы данные по аминокислотному составу в модификации. Математический метод основан на расчете евклидова расстояния, отражающего разницу в процентном содержании аминокислот в составе сравниваемых белков. При этом каждому белку ставится в соответствие точка в дватцатимерном эвклидовом пространстве, координатами которой является процентное содержание каждой из определенной аминокислот. Наиболее близким белкам соответствует минимальное значение евклидова расстояния. В данном варианте анализа становится возможным выявление структурно-функциональной близости и прогнозирование филогенетической близости изофункциональных белков.

В лаборатории разработаны компьютерные программы "KEY" (Парилис И.И., Казанов Е.Ю., Салихов P.C., Юкельсон Л.Я., Хамидов Д.Х., 1991) и "Protein Adviser" (программист - Казанов Е.Ю.), позволяющие провести широкомасштабное исследование по сравнению белков на основе расчета евклидова расстояния. Следует отметить, что по многим нейротрофинам, благодаря методам анализа ДНК, имеется информация об их аминокислотной последовательности, собранная в компакт-диске "Атлас нуклео-тидных и аминокислотных последова'тельностей белков" (издатель National Biomedical Research Foundation, USA). Нами была использована версия "Atlas of Protein and Genomic Seguences" от 31 марта 1993 года. Данная редакция банка содержит 27383 установленных первичных структур. Разработанные программы позволяют извлекать данные с компакт-диска, представлять их в форме, удобной для расчета евклидова расстояния. Однако, необходимым является и модификация полученных нами данных для получения их относительного соответствия к требованиям компьютерных программ.

При расчете евклидовых расстояний в базу данных программы была введена первичная структура модельного (имитированного) ФРН из яда среднеазиатской кобры, в которой отражены результаты аминокислотного анализа и соответствующее количество аминокислотных остатков представлено в виде последовательной цепочки (Рис б).

DDDDDDDDDNNNNNNNNNNTTTTTTTTTTTSSSSSSSSSQQQQQQEEEEEEEPPPPPGGGGG-- GGGAAAAAACCCCCCVVVVVMMIIIIILLLLYYYFFFKKKKKKfflfflHHRWWVVW

Рис 6. Имитированная первичная структура ФРН из яда среднеазиатской кобры.

Корректировка осуществлена по отсутствующим данным относительно цистеина и триптофана, были введены

литературные данные: так как количество цистеинов равное 6 является постоянным не только для ФРН, но и для всех других нейротрофинов (Ebendal Т., 1992), то в модель введено с-б; введенные 3 остатка триптофана соответствуют его количеству в первичной структуре ФРН из яда индийской кобры Naja naja (Hogue-Angeletti R. et al. , 1976) .

Сформированная база данных по 19 нейротрофинам и предшественнику инсулина, имеющего частичное структурное сходство с нейротрофинами, была обработана с помощью указанных компьютерных программ, результаты представлены в таблице 6 в цифровом выражении евклидовых расстояний между белками.

Очевидно, что среди сравниваемых белков наиболее отдаленным от всех является предшественник инсулина, хотя в литературе указывается на некоторое сходство его структуры с нейротрофинами. Нулевые значения евклидовых расстояний, полученные по нейротрофическим факторам мозга, свидетельствуют об их полной идентичности и, соответственно, об отсутствии видовой специфичности. Иная картина наблюдается в отношении ФРН. ФРН из разных видов и классов животных в разной степени отличаются структурно, и по величине евклидова расстояния могут быть отдалены друг от друга почти также, как и от других нейротрофинов. Среди сравниваемых факторов роста нервов ФРН из яда среднеазиатской кобры наиболее близок к ФРН из яда индийской кобры, в некоторой степени ближе к ФРН быка и цыпленка.

На основе данных евклидовых расстояний было построено филогенетическое древо нейротрофинов (рис.7 ). Полученное древо практически полностью воспроизводит филогенетическое древо, построенное Эбендалом (Ebendal Т., 1992) по компьютерной программе, предложенной Фар-рисом (Farris G., 1988), что подтверждает правильность выбранной нами методологической позиции сравнения.

Изучение молекулярных основ описанных иммунологических фактов предполагает прежде всего тщательный анализ первичных структур известных ФРН. Как указывалось выше, логично предположить, что одинаковое биологическое действие и слабоиммуногенный видонеспецифиче-ский домен связаны с общими, консервативными фрагментами в молекулах ФРН. Проведен компьютерный расчет общих для ФРН фрагментов в первичной структуре ФРН на основе информационного массива по аминокислотным последовательностям с компакт-диска. При помощи програм-

Таблица 6.

Евклидовы расстояния между нейротрофинами:

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

1 0.00 0.00 0.00 20.93 7.72 7.19 8.15 8.95 11.29 8.56 10.34 8.57 12.00 5.82 5.82 5.82 5.60 15.2714.82

2 0.00 0.00 20.93 7.72 7.19 8.15 8.95 11.29 8.56 10.34 8.57 12.00 5.82 5.82 5.82 5.60 15.27 14.82

3 0.00 20.93 7.72 7.19 8.15 8.95 11.29 8.56 10.34 8.57 12.00 5.82 5.82 5.82 5.60 15.27 14.82

4 20.93 7.72 7.19 8.15 8.95 11.29 8.56 10.34 8.57 12.00 5.82 5.82 5.82 5.60 15.27 14.82

5 21.82 20.82 22.34 22.84 22.72 22.37 22.94 22.40 20.03 20.49 20.49 20.49 20.41 18.44 17.95

6 3.34 2.05 4.57 8.17 4.25 4.86 2.8910.11 8.41 8.41 8.41 8.2716.31 16.33

7 4.07 4.33 7.63 3.66 4.50 3.0210.52 8.38 8.38 8.38 8.21 15.1915.25

8 4.57 8.98 4.72 4.86 3.34 11.36 8.40 8.40 8.40 8.2916.4216.40

9 8.30 3.12 3.54 2.3611.81 9.25 9.25 9.25 8.6716.5816.60

10 8.26 7.69 7.81 7.75 10.23 10.23 10.23 12.37 20.23 20.40

11 3.91 3.12 11.08 9.49 9.49 9.49 8.3315.7915.93

12 2.88 11.63 10.53 10.53 10.53 10.17 17.24 17.63

13 11.08 9.19 9.19 9.19 8.64 16.38 16.48

14 10.75 10.75 10.75 13.17 19.03 19.18

15 0.00 0.00 7.35 16.01 15.54

16 0.00 7.35 16.01 15.54

17 7.35 16.0115.54

18 14.8614.20

1 9___2М_

1-4 - нейротрофические факторы мозга свииьи (ВОЫБ), мыши, человека, крысы; 5- предшественник инсулина человека; 6-14 - ФРН быка, цыпленка, человека, мыши, индийской кобры, грызуна праомус, морской свинки, крысы и среднеазиатской кобры; 15-17- нейротрофины-3 (ЫТ-3) человека, крысы, мыши; 18 - нейротрофин-4 (№Г-4) шпорцевой лягушки; 19- нейротрофин-5 0ЫТ-5) человека; 20 - нейротрофин-5 (МТ-5) крысы

12 3 4 5 6 7 8 9 ЮН 12 13 14 15 16 17 18 19

20

Рис. 7. Филогенетическое древо нейротрофинов, построенное на основе расчета евклидовых расстояний. ФРН: 1 -9 среднеазиатская кобра, индийская кобра, цыпленок, бык, человек, морская свинка, мышь, крыса, мастомус; NT-5: 10 - человек, 11 - крыса; NT-3: 12 - человек, 13 -крыса, 14 - мышь; NT-4: 15 - шпорцевая лягушка; BDGF: 16-19 свинья, мышь, человек, крыса; 20 - предшественник инсулияа человека

мы "Protein Adviser" было установлено, что в сравниваемых 8 первичных структурах ФРН имеются следующие консервативные участки: SS, HP, GE, SVCDS, WV, KTTATDIKG, VN, QYFFETKC, KQ, ТК, PV, SGCRGID, HWNSYCT, TF, KALT, QA, WRFIRI, TACVCV, AW, FI, DT (Рис. 8). Совокупная длина консервативных участков составляет 78 аминокислотных остатков или 65% от приведенной длины в 120 аминокислот. Из этих 21 пептидов 5 (PV, AW, KQ, SS и DT) не укладываются в линейный консенсус, т.е. в исходных структурах находятся в удаленных позициях.

Среди выявленных фрагментов особый интерес представляли те, которые были не только общими для ФРН, но специфическими только для ФРН, названные нами "уника-

1 2 3 4 5 6

1 0 0 0 ООО

1. ЗЗЗНР1ЕНКСЕГЗУССЗУ5УИУСЕКТТА1П1КСКЕУМУЬСЕУМ1ЫЫЗУЕК2ХРЕЕТКСК0-2.ЗЗЗНРУГНКСЕГЗУС0315УИУС1ЖТТАТС1КСКЕУИУЬСЕУМ1ННЗУГК0УГКЕТКСКБ-

3 . ЗЗТНРУЕНМСЕГЗУСПЗУЗУИУССКТТАПЛКеКЕУТУЬАЕУНХКЯЗУЕКОУРРЕТКСКА-

4 . ЗЗТНРУГНМСЕ?ЗУСПЗУЗСТГ/в0КТ1АТО1КСКЕУТУЬСЕУИ1ЫЫЗУГК{2¥гЕЕТКСКА-

5 . SSTHPVFQMGEГSVCDSVSVWGDKГTAГDIKeNEVTVLGEVN•IЫ^JSVFKQУFFETKCRA-

6 . ЗЗТНРУГНМОЕГЗУСОЗУЗУИУАОКТТАГБИтеКЕУТОЬАЕУНУЫЫОТРКдХГЕЕТКСКВ-

7 . -TAHPVLHRGEFSVC1)SVSMWVGDKTTATDIKGKEVTVLGEVNINNNVFKQУFFETKCRD-

8 . -EDHPVHNLGEHSVCDSVSДW-TKITATDIKGNTVTVMENVNLDNKVYKQYFFETKCKN-

НР йЕ вУСОЗ «V КТТАГОШе СИТЕТКС

9 . Н30РАЯКСЕЪЗУСБ31 ЗЕИУТААОККТАУСМЗаетУТУЬЕКУРУЗКСОЬКОУРУЕТКСНР-

10 . УАЕНКЗНКСЕУЗ\''ССЗЕЗИ7'иТОКЗЗАЮ1КСН0\/'ТУ1СЕ1КТСМЗРУК0УЕУЕТКСКЕА-

11 ,АЗСЗБЗУЗЬЗККСЕЬ8УСОЗУНУИУТ0ККТАУ00К5К1УТУМЗЕ10ТЬТ6РЬК0УГГЕТК-

12. СУЗЕТАРАЗККСЕЬАУСОАУЗСИУТОККТАУОЬКСЯЕУЕУЬСЕУРААССЗРЬКСУЕЕЕТК-

13.СУЗЕТАРАЗКЕСЕЬАУССАУЗСНУТОККТАУПЬКСКЕУЕ7-ЬСЕ¥РААССЗРЬКОУРГЕТК-

1 1 1 6 7 8 9 0 1 2

1 0 О О ООО

1. -РКРУСЗССКО1П5КНШЗГСТТТН1ГУКАЬТМООК0ААИМ'ХК1ПТАСУСУЪЗККАУКИА

2. -1№УПЗССКН1ВАКНИНЗУСТТГНТЕУКАХ.ТМОСКОААИНГ1ЯГВТАСУСУЬЗККТСОКА

3. -ЗНРУЕЗССКОтЗКНИНЗУСТТТНТГУКАЪТТПЕКОААККПЯЮТАСУСУЬЗККАТНКС

4. -РЫРУЕЗОСЕС1ОЗКННКЗУС1ТТНТРЖАЪТТ00К0ААУ7КГ1МБТАСУС7ЪЗККААККС

5. -ШРУЕЗОСКСХОЗКНгаЗУСТТТКТЕУКАЪТТОВНЙААШПЯЮТАСУСТЬТНКАРЮС

7. -РНРУЗЗССЯ51ОАКНШЗУСТТТНТГ¥КАЬТМЕ6КОААтГ1К10ТАСУСУЬЗЕКЗС-КР 8 . -РЫРЕРЗеСКС1ОЗЗтгаЗУСТЕТ0ТПКАЪТМЕСКС2АЗНЫЧЯ1ЕТАСУСУ1ТКК-6Ы--

эсскснэ тетгуст тг КАЫ ОА УЛ^РНИ ТАСУСТ

Э. -МСУТКЕЙСКСЮК1ШтаЗОСЕТГ05УУКАЬТМОЗККК1СИЕГ1Е1ПТ8СУСТЬТ1ККСК

10.-RPVKNGCRGIDDKHWNSQCKTSQTУVRALTSEЫNKLVGWRWIRIDTSCVCALSRKIGRГ

11. -CNPSGSTTRGCRGVDKKQWISECKAKQSYVRALTIDANKLVGWRWIRIDTACVCTLLSRTGRT

12. -CKADNAEEGGPGAGGGGCRGVDRRШVSECKAKQSYVRALTADAQGRVGWRWIRIDTACVCTLLSRTGRA

13.-CKAESAGEGGPGVGGGGCRGVDRRHИLSECKAK^SУVRALTADS^GRVGWRWIRIDTACVCTLLSRTGRA

Рис. 8. Выравненные первичные структуры ФРН(1~8) и других нейротрофинов(9-13) с указанием их консервативных фрагментов (выделены жирным шрифтом).

Первичные структуры факторов роста нервов из:

1 - человека, 2 - быка, 3 - мыши, 4 - крысы, 5 африканского грызуна Ргаотуэ natalensys, 6 - морской свинки, 7 - цыпленка, 8 - индийской кобры.

Пептиды, входящие в линейный консенсус ФРН вынесены ниже 8 строки.

9 - Первичные структуры нейротрофического фактора (ЕШСГ) из мозга свиньи, мыши, человека и крысы представлены одной строкой в связи с идентичностью структур. 10 - Первичные структуры нейротрофинов-3(N1-3)из человека, крысы и мыши также представлены одной строкой в связи с идентичностью первичных структур. 11 - Первичная структура нейротрофина-4 из африканской шпорцевой лягушки (ХЕЫОРОЗ ЬАЕ\713). Первичные структуры нейротрофинов-5(ИТ-5) из : 12 - человека, 13 - крысы.

льными". Это имеет особое значение в перспективе создания высокоспецифического для ФРН диагностикума. Определение уникальности консервативных фрагментов проводилось с помощью программной оболочки банка аминокислотных последовательностей компакт-диска. Каждый из консервативных фрагментов длиной 3 и более аминокислотных остатков (согласно ограничениям программы) задавался в качестве образца для поиска. В результате установлено, что только 4 - KTTATDIKG, SGCRGID, HWNSYCT, TACVCV - являются уникальными для семейства ФРН, т.е. данные сочетания аминокислот встречаются только в первичных структурах ФРН.

Часть консервативных фрагментов ФРН характерна для суперсемейства нейротрофинов. Так, пептид QYFFETKC, кроме ФРН, встречается в структуре нейротро-фина-4, выделенного из яйцеклеток ксенопуса. Фрагмент WRFIRI, являясь консервативным для группы ФРН, входит в состав нейротрофического фактора BDNF из мозга свиньи, мыши, человека и крысы, а пептид SVCDS был идентифицирован практически во всех белках суперсемейства нейротрофинов: в факторах роста нервной ткани, в ней-ротрофинах NT- 3 и NT-4 (но не NT-5) и в нейротрофиче-ских факторах из мозга - BDNF. Так как данный пептид не обнаруживается ни в каких других белках, он является уникальным для суперсемейства нейротрофинов.

Предложенный подход компьютерной обработки информации об аминокислотных последовательностях можно использовать как вариант математического метода классификации белков, в котором основой идентификационного признака служит наличие уникальных для функционально определенного класса белков пептидных фрагментов, одного или совокупности нескольких - пептидные словари.

Согласно рис.8, уникальные пептидные фрагменты ФРН располагаются по всей длине аминокислотной цепочки. Известно, что антигенность белков связана лишь с определенными участками их молекул, преимущественно гидрофильными и располагающимися на поверхности глобулы. Для прогнозирования, какие из уникальных пептидов вероятнее всего включены в общие для ФРН антигенные детерминанты, была проделана следующая работа.

В арсенал программы "Protein Adviser" включены параметры гидрофильности/гидрофобности отдельных аминокислот. По величине этих параметров обычно оценивается перспектива отдельных участков молекулы белка на роль антигенной детерминанты (Норр Т., Woods R.,1981). В результате компьютерной обработки данных ФРН по ука-

занным показателям получены профили гидрофильности/ гидрофобности аминокислотной цепи молекулы [3-ФРН человека (Рис.9). Оценивая полученный профиль можно констатировать, что только два уникальных пептида обладают необходимыми параметрами - это КТТАТБ1КС и БССЯОЮ фрагменты. Вполне вероятно, что выявленный и описанный ранее видонеспецифический слабоиммуногенный домен-, содержит один из этих фрагментов.

Наиболее заманчивой перспективой практического применения полученных и описанных результатов представляется создание вневидового высокоспецифического иммунодиагностикума. В его основе лежит получение по-ликлональных антител к синтезированным пептидам, последовательность аминокислот в которых полностью воспроизводит " уникальный" фрагмент, спрогнозированный в качестве антигенной детерминанты (Рис.10).

ВЫВОДЫ.

1. Осуществлен анализ нейроростовой активности в органах и тканях у 20 видов животных Средней Азии, относящихся к разным классам позвоночных. У рыб, низших пресмыкающихся и птиц нейроростовая активность локализуется преимущественно в ткани мозга, сердца, почек и глаз. Наиболее высокий уровень ФРН отмечен в ядах змей. Новыми источниками ФРН, не описанными в литературе, выявлены головной мозг карася, мышечная ткань озерной лягушки, слюнная железа серого варана.

2. Количественно оценена активность ФРН в ядах змей Средней Азии, принадлежащих к трем семействам ядовитых змей. Показано, что в ядах эфы, степной гадюки и щитомордника активность ФРН выше, чем в ядах гюрзы и кобры. Обнаружено, что ядовитые секреты новорожденных и взрослых рептилий (самок и самцов) имеют одинаковую активность ФРН.

3. Разработаны схемы выделения ФРН из эндемичных видов земноводных и рептилий:

а) Из мышц озерной лягушки на основе предложенного метода сорбционной хроматографии, с последующей ультрафильтрацией и препаративным электрофорезом получен ФРН. Выделенный белок содержит 1% углеводов, имеет значение р1 9,3, его молекулярная масса равна 106 ко. Активность ФРН равна 6,5х105 БЕ/мг белка в культурах спинальных ганглиев куриных эмбрионов и клеток феохро-моцитомы РС-12.

б) Из яда среднеазиатской кобры выделен ФРН с активностью 105БЕ/мг. Белок состоит из двух равных субъ-

Рис. 9. Профиль гидрофильности/'гидрофобности молекулы ФРН человека. Профиль гидрофильности молекулы ФРН человека......Положение уникальных фрагментов

Схема перспектив использования метода выявления уникальных пептидов и пептидного словаря

Теоретические аспекты:

а)Возможность использования уникальных пептидов и пептидного словаря при идентификации и классификации белков;

б)Предсказание уникальных пептидных фрагментов в роли линейных антигенных детерминант, а сочетания консервативных фрагментов (пептидного словаря) или вместе с уникальными участками - как топографических антигенных детерминант.

Практические аспекты на примере сравнительного анализа ФРНов:

Видоспецифические молекулы ФРН

Н е йр о тр о фины

Другие белки

человека

животных

лл] Спя) (гш) И гт! Са ЕЪ

синтетический пептид соответствующий общему фрагменту, уникальному для всех молекул ФРН

Получение антител к пептиду

+

га

Иммунодиагностикумы на основе антител к пептиду

Создание аффинных колонок для получения чистых препаратов ФРН

Определение возможности применения пептида и антител к нему для коррекции и лечения болезней с дефектами ФРН

Оценка содержания ФРН в органах и тканях человека

Сравнительное изучение ФРН в филогенетическом ряду позвоночных и человека

Исследование уровня ФРН в различных экспериментальных моделях животных и экстраполяция данных на человека

РИС. 10.

единиц с молекулярной массой 13-13,5 kD и pi 6.8. Установлен его аминокислотный состав.

в) Из яда эфы многочешуйчатой получен белок с ФРН активностью 6-10х104 БЕ/мг. Он содержит 1-2% Сахаров и имеет молекулярную массу 33 -37 kD по данным гель-фильтрации, 13 kD - ДСН электрофореза, и величину pi (7,1 - 7,2) .

4. разработан способ получения фракции ФРН из сыворотки крови человека. Проведен анализ активности ФРН в некоторых тканях и биологических жидкостях человека. Определено, что в сыворотке крови уровень ФРН кратно увеличивается при беременности и восстановительных процессах в организме. Такие заболевания, как шизофрения и алкоголизм сопровождаются сниженным уровнем ФРН.

5. Из сыворотки абортивной крови по разработанной схеме выделен ФРН, связанный с белком-носителем глобу-линовой природы посредством дисульфидных связей, его нейритстимулирующая активность 2х102 БЕ/мг, молекулярная масса 160 kD и pi 9,1 - 9,7. Нейритогенный эффект

ФРН частично блокируется антителами к (3-ФРН мыши в концентрации 1,6 мкг/мл. Обработка дитиотреитолом приводит к освобождению белка с молекулярной массой 15-30 kD и активностью 6х102 БЕ/мг.

6. Для преодоления видовой специфичности ФРН предложен иммунотест на основе антител, очищенных на последовательных аффинных колонках с иммобилизованными ФРН из разных видов животных (Р~ФРН мыши и ФРН быка) . Антитела двойной очистки ингибировали нейритогенный эффект ядов среднеазиатских змей, слюны варана и обогащенной фракции ФРН из сыворотки крови здоровых доноров. Полученные антитела содержат в активном центре по крайней мере 2 эпитопа, один из которых является общим для ФРН млекопитающих и слабо иммуногенным, а второй видоспецифичным и высокоиммуногенным.

7. Проведен сравнительный попарный анализ аминокислотных составов нейротрофинов с помощью компьютерных программ "KEY" и "Protein Adviser". В результате построена модель филогенетического "древа" нейротрофинов. ФРН из разных видов и классов животных по величине евклидова расстояния могут существенно различаться. Показано, что по особенностям аминокислотного состава ФРН из яда среднеазиатской кобры наиболее близок к ФРН из яда индийской кобры.

8. Предложена методология компьютерного анализа аминокислотной последовательности белков, позволяющая

выявлять консервативные участки исследуемого белкового семейства, а среди них уникальные, т.е. встречающиеся только у данной группы белков пептидные фрагменты. Выявлены 4 уникальных пептидных фрагмента для семейства ФРН и 7 для нейротрофинов. Составлены пептидные словари для группы ростовых факторов.

9. С помощью программы "Protein Adviser" построены графики гидрофильности и поверхностной доступности цельной молекулы ФРН и ее отдельных фрагментов. Осуществлен прогноз относительно уникальных фрагментов ФРН в качестве антигенных детерминант. Выявлено, что уникальные фрагменты KTTATDIKG и SGCRGID являются наиболее перспективным в качестве матрицы для синтеза пептидов. Использование последних в качестве низкомолекулярных антигенов позволит выработать антитела и создать на их основе высокоспецифический вневидовой имму-нодиагностикум на ФРН.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Монографии и научные статьи

1. Салихов P.C., Хафизова М.Г., Юкельсон Л.Я., Хамидов Д.Х. Фактор роста нервов (ФРН) в ядах среднеазиатских змей //Доклады Академии Наук УзССР. - 1982. - N7 - С 49-51.

2. Хамидов Д.Х., Салихов P.C., Хафизова М.Г., Юкельсон Л. Я. Очистка фактора роста нервов из яда среднеазиатской кобры Naja ох1апа//Химия природных соединений. -1985. -N 4. -С. 546-551.

3. Хамидов Д.Х., Акрамов М.Ш., Хафизова М.Г., Ходжаева Н.И., Лим A.B., Салихов P.C. Нейроростовая активность сыворотки крови человека//Узб.биол.журнал. -1987.- N 4.-С.65-66.

4. Хамидов Р.Д., Салихов P.C., Горголюк H.A., Михайлов А.Т. Сравнительное исследование нейроростовой и нейтрализующей активности экстрактов из куриных зародышей/ /Доклады Академии Наук СССР. -1987.-Т.295, N 5.-С. 1233-1235.

5. Хамидов Д.Х., Юкельсон Л.Я., Салихов P.C., Хафизова М.Г., Выделение и характеристика фактора роста нервов из яда среднеазиатской эфы Echis multisguamatus //Биохимия. -1989. -Т.54, вып.6.-С.987-991.

6. Khamidov D.Kh., Yukelson L.Ja., Salikhov R.S., Khafizova M.G. Isolation and characterisation of nerve growth factor from venom of the Central Asian viper Echis//Biokhimya.-1989. -N 6. -P.800-804.

7. Парилис И.И., Салихов P.C., Мирходжаев Д. Б., Казанов Е.Ю., Юкельсон Л.Я., Хамидов Д.Х. Сравнитель-

ный анализ факторов роста нервов (ФРН) с применением компьютерных программ//Доклады Академии Наук УзССР. -1990. -N II. -С.53-55.

8. Салихов P.C., Акрамов М.Ш., Хафизова М.Г., Лим A.B., Хамидов Д.Х. Изменение уровня ФРН в крови женщин при беременности//Доклады Академии Наук УзССР. -1990. -N 12 -С.38-39.

9. Парилис И.И., Казанов Е.Ю., Салихов P.C., Юкельсон Л.Я., Хамидов Д.Х. Пакет прикладных программ для классификации белков по их аминокислотному составу и первичной структуре//Биополимеры и клетка. -1991. -Т.7. N б. -С.107-110.

10. Хамидов Д.Х., Акрамов М.Ш., Салихов P.C., Хафизова М.Г., Ходжаева Н.И., Лим A.B. Исследование уровня ФРН при хроническом алкоголизме и шизофрении //Доклады Академии Наук PY3.-1991.-N 8.-С.43- 45.

11. Хамидов Д.Х., Салихов P.C., Хафизова М.Г., Акрамов М.Ш., Юкельсон Л.Я О нейроростовой активности органов и тканей рептилий//Узбекский биологический журнал. -1991.-N6. -С.3-6.

12. Хамидов Д.Х., Лим A.B., Салихов P.C., Акрамов М.Ш. Иммуноаффинное фракционирование нейтрализующих поликлональных антител к фактору роста нервов //Химия природных соединений.-1991. -N 6.-С.828-833.

13. Хамидов Д.Х., Салихов P.C., Лим A.B., Хафизова М.Г., Акрамов М.Ш., Сахибов А.Д. Сравнительная оценка чувствительности определения фактора роста нервов четырьмя биологическими и иммунохимическими методами// Узбекский биологический журнал.-1992. -N 1. -С.3-5.

14. Салихов P.C., Хамидов Д.Х., Мирходжаев Д.Б., Арипджанов A.A., Парилис И.И., Юкельсон Л.Я., Физико-химический анализ белка с нейроростовой активностью из мышечной ткани RANA RIDIBUNDA //Химия природных соединений .-1992.-N 2.-С 251-257.

15. Юкельсон Л.Я., Барабанщикова H.A., Хафизова М.Г., Салихов P.C., Хамидов Д.Х. Анализ нейроростовой активности белковых фракций ядов AGKISTRODON HALYS HALYS и ECHIS MULTIQUAMATUS//Химия природных соединений . -1992 . -N 2.-С 266-270.

16. Парилис И.И., Казанов Е.Ю., Салихов P.C., Хамидов Д.Х. Компьютерный анализ и сравнение структур нейротоксинов змей и актинии RADIANTHUS MACR0DAC-ТУЬи5//Биоорганическая химия,-1992. -Т. 18, N 5. -С. 618-622 .

17. Хамидов Д.Х., Салихов P.C., Хафизова М.Г., Парилис И.И., Казанов Е.Ю. Фактор роста нервов (биоматематический анализ)//Узбекский биологический журнал.-1993.-N 4.-С.12-18.

18. Хамидов Д.Х., Акрамов М.Ш., Хафизова М.Г., Салихов P.C. Выявление гидролаз в слюне серого варана //Доклады Академии Наук РУз.-1993.-Ы 8.-С.51-52.

19. Салихов P.C., Парилис И.И., Хафизова М.Г., Казанов Е.Ю., Хамидов Д.Х. Определение уникальных пептидных фрагментов для фактора роста нервов// Молекулярная биология. -1994.-Т.28.Вып.1.-С.201-203.

20. Хафизов А.Г., Салихов P.C., Акрамов М.Ш., Казанов Е.Ю., Хамидов Д.Х. Исследование биохимических свойств фракций секрета железы Гейба VARANUS GRISEUS // Химия Природных Соед. - 1995. - N 6.-С. 58-8 61.

21. Хамидов Д.Х., Салихов P.C., Хафизова М.Г. Пептидные словари для ростовых факторов// Химия природных соединений. - 1998. -N 1 -С. 89-93.

II. Авторские свидетельства

22. Хамидов Д.Х., Юкельсон Л.Я., Салихов P.C., Хафизова М.Г. Способ очистки нейроростового фактора яда змей//Авторское свидетельство. N 1172114. 08.04.85 г.

23. Хамидов Д.Х., Юкельсон Л.Я., Салихов P.C., Хафизова М.Г., Мирходжаев Д.Б. Способ выделения нейроростового фактора//Авторское свидетельство. N 1372677.

08.10.87 г.

24. Хамидов Д.Х., Юкельсон Л.Я., Салихов P.C., Хафизова М.Г. Методические рекомендации по способу очистки нейроростового фактора из яда змеи//Ташкент. -1986. -С.1-4.

III. Тезисы

25. Салихов P.C., Хафизова М.Г., Юкельсон Л.Я., Хамидов Д.Х. Фактор роста нервов (ФРН) из ядов среднеазиатских змей//Тезисы докладов VI Всесоюзного симпозиума. Химия белков и пептидов. -Рига,1983. -С.10-11.

26. Khamidov D.Kh., Salikhov R.S., Khafizova M.G., Yukelson L.Ja. Nerve Growth Factor(NGF)is the membrane active compenent of snake venom// III Soviet-Swiss Simpozium. Biological membranes: Structure and function.Abstracts - Tashkent,1983.-P.212.

27. Хамидов Д.Х., Салихов P.C., Хафизова М.Г., Юкельсон Л.Я. Выделение и очистка нейроростового фактора (НРФ) из яда среднеазиатской кобры Naja oxiana Eichw//Te3HCbi докладов 16 конференции Федерации евро-

пейских биохимических обществ (ФЕВО). -М., 1984. С.329. XIV 094.

28. Хамидов Д.Х., Салихов P.C., Хафизова М.Г., Юкельсон Л.Я. Фактор роста нервов (ФРН) из яда среднеазиатской кобры //Тезисы всесоюзного совещания "Актуальные вопросы клеточной биологии" (Ленинград,16-18 октября 1984 г) Цитология. -1984.-Т.26, N 9. -С.1085.

29. Хамидов Д.Х., Салихов P.C., Юкельсон Л.Я., Хафизова И.Г. Сравнительная характеристика фактора роста нервов из ядов среднеазиатских змей кобры и эфы // Мат.1 Рабочего совещания "Морфогенетически активные вещества" (Пущино, 12-14 ноября 1985 г.) Онтогенез. -1985.-Т. 16, N 5. -С.538.

30. Хафизова М.Г., Салихов P.C., Хамидов Д.Х. Сравнительный анализ нейроростовой активности ядов гремучих, аспидовых и гадюковых змей Средней Азии// Шестая Всесоюзная герпетологическая конференция Авторефераты докладов.- Ташкент, 1985. -С.218.

31. Хамидов Д.Х., Салихов P.C., Юкельсон Л.Я., Хафизова М.Г., Мирходжаев Д.В., Уманская Д.В. Сравнительная характеристика фактора роста нервов из ядов среднеазиатских змей, мышц озерной лягушки и мозга золотых рыбок //Тезисы докладов IV Конференции биохимиков республик Средней Азии и Казахстана. Ашхабад. 1986. -С. 204-205.

32. Хамидов Д.Х., Юкельсон Л.Я., Салихов P.C., Хафизова М.Г., Мирходжаев Д.Б. Очистка и сравнительная характеристика фактора роста нервов (ФРН) из ядов среднеазиатских змей, мышц озерной лягушки и плаценты человека//Тезисы стендовых сообщений V Всесоюзного биохимического съезда. -Киев. -1986. -С.134-135.

33. Хамидов Д.Х., Салихов P.C., Хафизова М.Г., Мирходжаев Д.Б., Юкельсон Л.Я. Получение препаратов факторов роста нервов из различных источников и сравнительная характеристика этих препаратов//Тезисы докладов Всесоюзного совещания "Актуальные вопросы клеточной биологии".Ленинград, 17-19 ноября 1987 г. Цитология .-1987 .-Т . 2 9 -N 9. -С.1109.

34. Хамидов Д.Х., Юкельсон Л.Я., Салихов P.C., Хафизова М.Г., Акрамов М.Ш. Фактор роста нервов среднеазиатской кобры и эфы//Мат.VII Всесоюзного симпозиума по химии белков и пептидов, Таллин. -1987. -С.127-128 .

35. Kharaidov D.Kh., Salikhov R.S., Yukelson L.Ja., Khafizova M.G. Comparative physico-chemical analysis of NGFs from snake venom//Abstracts of the

European developmental biology congress. Cell differentiation -1987. -V.20, N12 -P.78S.

36. Салихов P.C., Хамидов Д.Х., Хафизова M. Г., Акрамов M.III., Казанов Е.Ю. Фактор роста нервов в сыворотке крови человека//Тезисы докладов 2 Всесоюзного рабочего совещания по морфогенетическим факторам. Онтогенез.-1988.-Г.19, N 5,- С.551.

37. Хамидов Д.Х., Салихов P.C., Юкельсон Л. Я., Хафизова М.Г., Акрамов М.Ш. Анализ распределения активности фактора роста нервов в органах и тканях пресмыкающихся//Тезисы докладов 2 Всесоюзного рабочего совещания по морфогенетическим факторам. Онтогенез.-1988. -Т.19, N 5. -С.554-555.

38. Хамидов Д.Х., Юкельсон Л.Я., Салихов P.C., Парилис И.И., Хафизова М.Г. Компьютерный анализ фактора роста нервов из разных классов позвоночных// Тез. докл.XIY го Менделеевск. съезда по общей и прикладной химии, Ташкент, сентябрь 1989 г. - 1989. -С.537.

39. Хамидов Д.Х., Юкельсон Л.Я., Салихов P.C., Парилис И.И., Хафизова М.Г., Акрамов М.Ш. Факторы роста нервов у позвоночных//Тезисы докладов Всесоюзного совещания "Актуальные вопросы клеточной биологии Ленинград,17-19 ноября 1989 г. Цитология. -1989. -N 9. -С.1132.

40. Khamidov D.Kh., Akramov M.Sh., Khafizova M.G., Jukelson L.Ja., Tjurin S., Salikhov R.S. The comparative study of nerve growth factor (NGF) in organs and tissues of Central Asian reptiles//Mat. First World Congress of Herpetology, London, September, 1989. -P.1323.

41. Salikhov R.S., Akramov M.Sh., Khafizova M.G., Khamidov D.Kh. Presence of nerve growth factor in cow milk //20th Meeting of FEBS. -Budapest, 1990. -P.304.

42. Salikhov R.S., Khamidov D.Kh., Parilis 1.1., Jukelson L.Ja. Comparative investigation of nerve growth factor structure using computer programs //Abstracts of 9th European symposium on animal, plant and microbial toxins.Lohusala, Estonia 23-26 September, 1990, Toxicon. -1991. Vol.3.- P.295.

43. Акрамов М.Ш., Кадыров А.И., Кирюдчев E.H., Салихов P.C., Хамидов Д.Х. Исследование ФРН-активности в органах и тканях птиц//Тез.докл.V конф.биохимиков республик Средней Азии и Казахстана, 12-15 ноября 1991г. -Ташкент, 1991. -С.13.

44. Салихов P.C., Акрамов М.Ш. , Лим А.В., Хафизова М.Г., Фаттахов А.А., Хамидов Д.Х. Фактор роста

нервов сыворотки крови человека при репаративных про-цессах//Тез. докл. V конф. биохимиков республик Средней Азии и Казахстана, 12-15 ноября 1991г. Ташкент, -1991. -С.325.

45. Akramov M.Sh., Salikhov R.S., Khafizova M.G., Khocijaev A.F., Lim A.V., Khamidov D.Kh. Nerve Growth Factor is present in high concentration in saliva of the grey monitor Varanus griseus//Soviet- Finnish Symposium on Developmental Biology (Suzdal, Sept. 1620, 1992.) Онтогенез.-1991.- Т.22, N 4.-С.412.

46. Khamidov D.Kh., Lim A.V., Salikhov R.S., Akramov M.Sh., Khafizova M.G., Fattahov A.A. On the structure of the active site of Nerve Growth Factor (NGF)//Soviet-Finnish Symposium on Developmental Biology (Suzdal,Sept. 16-20, 1992.) Онтогенез. -1991. -Т.22, N 4.-С.418.

47. Jukelson L.Ja., Mirkhodjaev D.B., Salikhov R.S., Parilis I.I., Khamidov D.Kh. The protein with nerve growth activity from the muscle tissue of the frog RANA RIDIBUNDA and its comparison with other nerve growth factors (NGFs)//European developmental biology congress EDBC-91,Jerusalem, Israel, August 1115, 1991.-P.174.

48. Хамидов Д.Х., Салихов P.С., Акрамов М.Ш., Хафизова М.Г. Сравнительное изучение нейроростовой активности сыворотки крови при некоторых патологиях че-ловека//Тезисы докладов симпозиума Содружества Независимых Государств "Организм и среда", Бухара, 1214 мая 1992 г. -С.127.

49. Хамидов Д.Х., Салихов Р.С., Хафизова М.Г., Парилис И.И., Казанов Е.Ю. Биоматематический анализ белков (на примере ФРН)//Тезисы докладов 2 конференции биохимиков Узбекистана, Ташкент,22-24 ноября 1993 г. -С.88.

50. Khamidov D.Kh., Salikhov R.S., Khafizova M.G., Parilis I.I., Kazanov E.Yu. Research of nerve growth factors in phylogenetic aspects//International conference "Mechanisms of development: ontogenetic and phylogenetic aspects" Онтогенез. -1994.-Т.25, N4.-C.32-33.

51. Kazanov E.Yu., Khafizova M.G., Salikhov R.S., Khamidov D.Kh. Determination of the immynological sites of NGF molecules according to its structural features//Euroasian symposium on current trends in biotechnology: gene diagnostics, gene therapy, and informational immunity. Ankara, 29.10.- 06.11.95.

Karadeniz Yornal of Medical Scinces.- 1995.- V.8, N.4.- P.217-218.

52. Хафизов А.Г., Салихов P.С., Акрамов М.Ш., Xa-мидов Д.Х. О биологической активности ФРН слюны серого варана//Тезисы докладов 3 конференции биохимиков Узбекистана, Ташкент,11-13 ноября 1996г. -С 88.

53. Хамидов Д.Х., Салихов Р.С., Хафизова М.Г.Исследование нейроростовой активности синтетического пептида KTTATDIKGZ/Материалы международной научной конференции "Влияние физико-химических факторов на метаболические процессы в организме", Андижан,16-17 мая 1997,- С. 65.

54. Salikhov R.S., Khafizova M.G., Khamidov D.Kh. The unique peptide fragments in the amino acid sequence of the growth factors//The FASEB JOURNAL. Abstracts 17th International Congress of Biochemistry fnd Molecular Biology, San Francisco, California. August 24-29, 1997,- P.A909 № 304.

P.C. Салиховнинг

Филогенезда асаб толаларини устируачи омилни урганиш (ажратиб олиш, тавсифи, компьютер та^лили) мавзусидаги

диссертациянинг

1?иср;ача иазмуни

Асаб толаларинг устирувчи омил (АТУО)ни филоге-незда урганиш нейротрофинлар - асаб хужайралари ички боип^арувчилари - ^ар;идаги тушунчаларимизни кенгайтира-ди. Ма^аллий фаунанинг турли таксономик гуру^ вакилла-ри аъзо ва ту^ималари скрининги АТУО ажратиб олишни янги манбаларини ани^лаб берди, бойитиш ва фракцияла-нишнинг оригинал услублари уларни тоза ^олда ажратиб олиш имконини очиб берди.

Одам АТУОсини тадцмц ^илиш натижасида бу 01$сил-нинг ми^дори ^омиладорлик ва тикланиш жараёнларида р;он зардобида ошиб кетиш холати к;айд этилди.

АТУОни турга богликлик муаммосини ^ал 1$илиш ма1$-садида АТУОнинг турга богли^ ва умумий эпитопли моле-кулаларига олинган антителаларни тозалаш усули ишлаб чи1$илди.

Лабораторияда ишлаб чиг$илган компьютер дастурлари ^ар хил манбалардан ажратиб олинган АТ^Оларни уларнинг аминокислота таркиби буйича такк;ослаш ва нейротрофин-ларнинг филогенетик дарахтини г^уриш имкониятини яра-тади.

Protein Adviser компьютер дастури ёрдамида АТУОнинг аминокислоталар занжирида консерватив ва улар жумласидан нодир фрагментлар аницланди. Вир бутун АТ^О молекуласи ва унинг алохида фрагментлари гидрофиллик графиги в;урилди. АТУОни нодир фрагментларига нисбатан антиген детерминантлик сифатларини олдиндан айтиб бе-риш амалга оширилди.

Нодир фрагментлар сунъий аналогларидан антиген сифатида фойдаланиш, уларга ^арши зардоб олиш биология ва медицинадаги тадки?$отлар учун АТУОнинг турга боглик булмаган диагностикумини яратиш имкониятини тугдирадм.

SUMMARY

R.S. Salikhov

Nerve growth factors (NGF) in phylogensis (isolation, characterization, computer analysis).

Study on nerve growth factors (NGF) in phylogenesis broadens our understanding of intracellular regulators of nerve cells - neurotrophins. Screening of organs and tissues in representatives of some endemic species from different taxons has revealed novel sources of NGF; elaboration of original methods of enrichment and fractionation enabled us to obtain them in pure form.

Upon studying human NGF was found that the serum level of this protein increase during pregnancy and restoring processes.

To overcome species specificity of NGF a method to purify antibodies to species-specific and common epitopes of NGF molecules has been developed.

Computer programs, created at the laboratory, made it possible to compare NGF from different sources according to their amino acid composition and to construct a phylogenetic tree of neurotrophins.

By means of «protein adviser» program conservative fragments in NGF amino acid sequence and the unique ones among them have been determined. The pattern of hydrophility both of the NGF whole molecule and its separate fragments have been designed. Prognosis of relatively unique NGF fragments as the antigene determinants has been performed.

Synthetic analogues of the unique fragments as the antigenes, as well as obtaining of anti-serum to them would allow to create NGF diagnosticum without species specificity for biological and medical researches .