Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эколого-биологические особенности ужовых змей (семейство Colubridae) и мембраноактивные свойства их ядов

ВАК РФ 03.00.08, Зоология

Автореферат диссертации по теме "Эколого-биологические особенности ужовых змей (семейство Colubridae) и мембраноактивные свойства их ядов"

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН ИНСТИТУТ ЗООЛОГИИ

На правах рукописи УДК 591.576.42. 577.35

КАМИЛОВА Ширин Ибрагимовна ^ ^ ^ ^ ^

2 8 МАР

ЭКОЛОГО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ УЖОВЫХ ЗМЕЙ (СЕМЕЙСТВО СОЬиВКЮАЕ) И МЕМБРАНОАКТИВНЫЕ СВОЙСТВА ИХ ЯДОВ

(03.00.08.- зоология, 03.00.02 - биофизика)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ташкент - 2000

Работа выполнена в Инсяшуге зоологии Академии наук РУз, в отделе эволюционной морфологии и клеточной биологии

Научные руководители:

член-корр. АН РУз, проф. Д.А. АЗИМОВ,

кандидат биологических наук И.К.КАЗАКОВ

Официальные оппоненты:

доктор биол. наук У.З.МИРХОДЖАЕВ кандидат биол. наук Ю.А.ЧИКИН

Ведущая организация: Национальный Университет Узбекистана

им. Мирзо Улугбека

Защита состоится 2000 г. в ^часов на заседании Спе-

циализированного совета Д.015.10.01 при Институте зоологии АН Республики Узбекистан по адресу: 700095, Ташкент, ул. Ниязова, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института зоологии АН Республики Узбекистан

Автореферат разослан" /#» ОД 2000 г.

Ученый секретарь специализированного совета, д.б.н. Шерназаров

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Семейство ужовых змей объединяет более 1700 видов, а в Узбекистане встречается более 10 их видов (Богданов, 1960; Захидов и др., 1971). Несмотря на многочисленность ужовых змей остается относительно слабо изученным ряд их эколого-биологических особенностей, включая характеристику паразитофауны как фактора, потенциально влияющего на численность популяции, особенности анатомии и морфологии ядовитого аппарата ужовых, биохимического состава и мехшшзма действия цельных ядой и выделенных из них отдельных фракций, а также ряд других вопросов. Такой подход был успешно реализован недавно при описании таких представителей герпетофауны Узбекистана как стрела-змея и разноцветный полоз, относящихся к сем. Colubridae (Абубакирова, 1997).

Следует отметить также, что анализ мембраноактивных свойств яда ужовых змей представляет не только теоретический интерес, но и создает перспективу для решения ряда научно-прикладных задач, включая использование животных ядов и их компонентов в качестве лечебных препаратов. Кроме того, сведения о механизме действия ядов позволяют в ряде случаев успешно решать спорные вопросы таксономической принадлежности тех или иных ядовитых животных.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы - характеристика эколого-биологических особенностей и гельминтофауяы водяного ужа и краснополо-сого полоза (сем.Colubridae), их ядообразуюгцего аппарата, состава и мембраноактивных свойств яда. Для реализации этой цели предусматривалось решение следующих задач:

• охарактеризовать эколого-биологические особенности водяного ужа и красно-полосого полоза, включая характеристику общего энергетического обмена и метаболических показатели крови;

• исследовать биоразнообразие гельминтофауны ужовых змей и охарактеризовать пути циркуляции обнаруженных гельминтов;

• изучить анатомию и морфологию ядовитого аппарата, ядопродуктивность по сезонам года, разработать технологию получения яда;

• определить токсичность яда из желез Дювернуа водяного ужа и краснополосо-го полоза;

• исследовать механизм действия полученных ядовитых секретов ужовых змей и отдельных фракций на свойства биологических и искусственных мембран.

Научная новизна работы. Исследованы эколого-биологические особенности двух видов ужовых змей (сем. Colubridae): водяного ужа Natrix tessellata и краснополосого полоза Coluber rhodorhachis, охарактеризовано современное состояние динамики популяции в зависимости от сезона года, суточной активности, характера питания и размножения в биоценозах Узбекистана.

Проведеннный впервые таксономический анализ гельминтологического материала у рептилий позволил выявить 10 видов паразитов, относящихся к трем классам гельминтов.

Впервые изучены анатомия и морфология ядовитого аппарата (железа Дювернуа) у водяного ужа и краснополосого полоза. Определение токсичности секретов железы Дювернуа на белых мышах и крысах показало, что величина П35о яда водяного ужа соответственно равна 20,23 и 20,53 мг/кг, а доя яда краснополосого полоза - 10,64 и 10,95 мг/кг. Яд ужовых змей обладает фосфолипазной, геморрагической и каналоформерной активностями. В соответствии с характером интоксикации в общем действии яда на животных превалирует нейротоксический эффект.

Путем применения современных физиологических, биофизических и биохимических методов получены новые данные о мембраноактиваых свойствах яда исследованных рептилий. Впервые установлено, что яд водяного ужа (0,50-1,0 мкг/мл) образует на бислойных липидных мембранах (БЛМ) ионные каналы, преимущественно с катионселекгивной проводимостью, разобщает окислительное фосфорилирование изолированных митохондрий. Яд краснополосого полоза снижает скорость дыхания митохондрий в метаболических состояниях 3 и 4, причем в большей степени ингибированию подвергается фосфорилирующее дыхание. В опытах на БЛМ обнаружено, что яд краснополосого полоза в дозе 0,20 мкг/мл вызывает скачкообразное нарастание проводимости бислойных липидных мембран.

При фракционировании на сефадексе в-50 яд водяного ужа разделяется на четыре фракции. В опытах на БЛМ обнаружено, что П фракция цельного яда водяного ужа формирует неустойчивые каналы для одновалентных катионов, а 1П и IV - не обладают каналоформериыми свойствами. Проведенное тестирование различных фракций этого яда, на уровне изолированных митохондрий показало, что наибольшей разобщающей активностью обладают II и IV фракции.

Научно-практическое значение работы. С эколого-биологических позиций проведена оценка численности популяции ужовых змей в биогеоценозах Узбекистана. Изучены суточная активность, характер питания, размножения и гель-минтофауна, что важно для разработки мероприятий по поддержанию биоразнообразия, охране, отлову и содержанию этих рептилий в различных условиях. Полученные сведения о механизме действия ядов ужовых змей на параметры биологических и искусственных мембран создают предпосылки для использования этих ядов и их компонентов в качестве лечебных препаратов и для изготовления антисывороток.

Настоящая работа является частью проводимых исследований в отделе Эволюционной морфологии и клеточной биологии Института Зоологии АН РУз по теме: "Изучение морфо-фушациональных характеристик ядовитых желез заднебо-

роздчатых змей и членистоногих, механизм токсического действия их зоотоксинов на организм животных" (N гос. регистрации 01.970005384 ).

Апробация работы. Результаты диссертации доложены на: Международной конференции по' вопросам экологической физиологии (Фергана, 1997); Международной научно-практ. конференции «Экологические основы изучения проблем Приаралья». КГУ, Нукус, 1999; конференции «Биология ва экология замонавий муаммолари халкаро илмий конференциям» Самарканд, 1999.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения,обзора литературы, описания материалов и методов, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (199сылок).

Работа изложена на_страницах машинописного текста, включая 21 рис. и 13

таблиц.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В обзоре приводятся данные касающиеся особенностей распространения, экологии и биологии ужевых змей (семейства Colubridae), а также гельминтофау-на. Одновременно в обзоре освещены результаты исследований механизма действия нейротоксинов рептилий на мембранно-метаболические процессы.

Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Основные материалы диссертации были собраны в 1996-1999 гг. в биогеоценозах Узбекистана. Стационарные наблюдения проводились в Сурхандарьин-ской и Ташкентской областях.

Сбор материала. За период полевых работ нами было обследовано 180 экз. змей. Сбор материалов по экологии рептилий производился в основном по общепринятой методике (Новиков, 1953), описанной в определителе земноводных и пресмыкающихся (Тереньтев, Чернов, 1949). Анатомия и морфология ядообра-зуещего аппарата, измерение ядовитых зубов (железы Дювернуа) и размер животных проводилось штангенциркулем и сантиметровой линейкой. Питание рептилий изучалось путем анализа содержимого желудков. Сбор и исследование гельминтов проводились общепринятыми методами.

Получение яда и проверка токсичности. Железу Дювернуа водяного ужа после извлечения растирали в ступке в небольшом объеме дистиллированной воды, центрифугировали 5 мин. при 1000 g, надосадочную жидкость лиофилизиро-вали. Полученный материал использовали как препарат цельного яда. Яд в высушенном виде хранили при температуре 4°С. Как показали эксперименты, активность яда в этих условиях сохраняется в течение длительного периода.

В лабораторных экспериментах были использованы также белые лабораторные мыши и крысы, содержавшиеся в условиях вивария и стандартном рационе питания.

Бислойные липидпые мембраны (БЛМ) получали ранее описанным методом (Mueller et al., 1963). Основная часть работы проводилась с мембранами из общих фосфолипидов бычьего мозга, выделенных по Polch et al.(1957) и Нага, Rudin (1970). Токи через одиночные каналы измерялись в режиме фиксации мембранного потенциала электрометрическим вольтметром В7-30 с входным сопротивлением 1012 ом. Запись мембранного тока и потенциала производились при помощи потенциометра КСП-4. Для регистрации тока через одиночные каналы использовали мембраны, полученные на ячейке с малым диаметром (d=0,3 мм).

Митохондрии печени крыс выделяли методом дифференциального центрифугирования. Параметры дыхания митохондрий изучали лолярографически по Чансу и Вильямсу. Среда выделения содержала 0,3 М сахарозы, 10 мМ трис-НС1 (pH 7,5), 2 мМ ЭДТА, 0,2% бычьего сывороточного альбумина. Животных дека-питировали. Все процедуры по выделению митохондрий проводили при 0...+2°С.

В изолированных митохондриях печени полярографически изучали показатели окислительного фосфорилирования, согласно критериям Чанса-Вильямса. Определяли скорость дыхания митохондрий в метаболических состояниях 3 и 4, отношение V3/V4 (дыхательный контроль - ДК) и отношение АДФ/О. Стандартная среда инкубации митохондрий содержала 120 мМ KCl, 10 мМ трис-буфера (pH 7,4), 5 мМ KH2POj, 5 мМ сукцинат; добавка АДФ - 200 нмолей, разобщится ь-про-тонофор - карбонилцнаняд-хлорфенилгидразон (КЦХФГ, или СССР) - до конечной концентрации 1 мкМ, остальные добавки специально оговорены в тексте. Белок определяли по методу Лоури (Lowiy et ai.,1951).

Статистическая обработка полученных результатов проведена по методу Стьюдента-Фишера с вычислением средней величины, средней квадратичной ошибки и выведением достоверности различий.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. ЭКОЛОГИЯ И БИОЛОГИЯ ИССЛЕДУЕМЫХ РЕПТИЛИЙ

В результате проведенных исследований эколого-биологических особенно стей йодяного ужа и краснополосого полоза нами были конкретизированы и скор ректированы, данные о их встречаемости в биогеоценозах Узбекистана; сезонно! и суточной активности, характере питания и размножения.

Наши наблюдения показали, что активный период жизни водяного ужа ) краснополосого полоза продолжается в течение девяти месяцев. Змеи - холодно кровные организмы, поэтому их активность сильно зависит от температуры внеш ней среды. При снижении температуры змеи становятся малоподвижными, впа дают в оцепенение или в состоянии спячки, в условиях которой в сыворотке кров

существенно снижается уровень свободных жирных кислот, глюкозы и лактата, что свидетельствует о значительной перестройке липидного и углеводного обмена. Одновременно в условиях холодового оцепенения отмечается значительное подавление основного обмена.'

Пищей водяного ужа служат мелкие рыбы, лягушки, жабы и головастики, реже - птенцы и мелкие млекопитающие. Краснополосый полоз питается главным образом мелкими позвоночными, грызунами, птицами, ящурками, которых поедает живьем, однако более крупную добычу предварительно умерщвляет с помощью ядовитых зубов.

Среди ужовых змей в фауне Узбекистана нет видов, представляющих потенциальную опасность для человека, что в основном определяется особенностями строения их ядовитого аппарата. Имеются данные (Абубакирова, 1997; Орлов и др., 1981), что секрет их желез достаточно ядовит для теплокровных, поскольку с помощью своего яда ужовые змеи могут убивать или обезвреживать свою добычу. Однако расположение бороздчатых зубов яа заднем конце длинной верхней челюсти создает неблагоприятные условия для нанесения раны именно этими зубами и, следовательно для введения яда в ранку. Кроме того, некоторые из ужовых змей кусают лишь в исключительных случаях. Совокупность этих особенностей делает многих из ужовых змей практически безвредными для человека.

3.2.1. ГЕЛЬМИНТЫ - РЕГУЛЯТОРЫ ЧИСЛЕННОСТИ ПОПУЛЯЦИИ ЗМЕЙ.

К числу факторов, ограничивающих численность популяций различных животных, относятся паразитические организмы, в том числе - гельминты.

Змеи характеризуются широким диапазоном экологических адаптации. Места обитания и их питание чрезвычайно разнообразны. Они освоили как водные, так и наземные биоценозы, где объектом питания служат различные виды насекомых, рыб, амфибий, рептилий, птиц и млекопитающих Следовательно, широкие трофические связи змей в конечном итоге предопределяют состав экто- и эндопаразитов рассматриваемых рептилий.

За период 1997-1998 гг. нами было исследовано более 100 экземпляров водяных ужей Л'сгГга ¡еььеПа/а, отловленных в пойме р.Ангрен. Сбор и исследование гельминтов проводилось по общепринятым методам (Скрябин, 1967; Шарпило, 1958-1976; Марков, Богданов, 1960; Хохлова, 1986;Аннаев, 1992 и др.).

В результате проведенного изучения наличия паразитических червей в органах водяного ужа нами было выявлено 10 видов гельминтов, относящихся к трем классам: цестоды - 1, трематоды - 2, нематоды - 7 (табл. 1). Практически все исследованные змеи были инвазированы гельминтами.

Сильная зараженность исследованных змей гельминтами приводит к различным патологическим процессам: закупорке желудочно кишечного тракта не-

методами и цестодами, перфорации и разрыву тканей органов, перитонитам паразитарной этиологии и многим другим. Все это способствует возникновению различных болезней и гибели молодых и взрослых популяций змей. Наряду с этим в определённой степени гельминты выполняют роль естественных регуляторов численности змей в соответствующих биогеоценозах.

Будучи многочисленным сочленом соответствующих биоценозов и являясь объектом питания хищных млекопитающих и птиц, водяной уж играет значительную роль в распространении гельминтов домашних и диких животных. Основу питания водяного ужа составляют земноводные, рыбы и некоторые беспозвоночные, являющиеся промежуточными или дополнительными хозяевами личиночных фаз многих паразитических червей.

Таблица 1.

Гельмннтофауна водяных ужей Natrix tessellata

Вид Место паразитирования

Ц е с mod ы

1. Ophiotaenia еигораеа (Odening, 1953) Кишечник

Трематоды

2. Telorchisassti!a(Du\ardin, 1845) Кишечник

3. Macrodera longicollis (Abild.gaard, 1788) Легкие

Heмa modы

4. RhabdiasJuscovenosus (Railliet, 1899) Легкие

5. Stronyyloides mirzai (Singh, 1954) Кишечник

6. Opidaskaris najae (Gedoelst, 1916) Желудок и кишечник

7. Amplicaecum schikhobalovi (Mosgovoy, 1950) Желудок и кишечник

8. Spirocerca lupi (Rud.,1819) larvae Пищевод и желудок

9. Ascarops stranyylina (Rudolphi, 1819) larvae Желудок

10. Physocephalus sexalatus (Molin, 1860) larvae Желудок

Таким образом, переход личинок от одних хозяев (беспозвоночные) к другим (водяной уж) происходит на базе трофических связей, что обеспечивает циркуляцию инвазии в водных и наземных экосистемах.

Выяснение путей циркуляции гельминтов относится к приоритетным направлениям экологической паразитологии. Имея определенный материал и на основе анализа литературы мы попытались обрисовать основные пути циркуляции паразитов змей в водных и наземных экосистемах. В целом, для гельминтов змей Центральной Азии установлено 17 путей циркуляции инвазии в природе. Круговорот большинства видов гельминтов происходит на базе пищевых связей между членами биогеоценоза. Незначительное число видов, активно или пассивно проникает в организм дефинитивных хозяев. Это относится к видам паразитов, циклы развитая

которых протекают без участия промежуточных и резервуарных хозяев. В биогеоценозах обширного региона Центральной Азии змеи, как дефинитивные или ре-зервуарные хозяева гельминтов, играют значительную роль в расселении и распространении инвазии и, тем самым, поддерживают динамические процессы в системе паразит-хозяин.

3.4. СТРОЕНИЕ ЯДОВИТОГО АППАРАТА ВОДЯНВОГО УЖА Naírix tessellata (Laurenti, 1768) IIКРАСНОПОЛОСОГО ПОЛОЗА Coluber rhodorhachis (Jan, 1865).

Проведенные нами морфологические исследования показали, что у ужовых змей бороздчатые зубы расположены на задней поверхности верхней челюсти, позади гладких мелких зубов. Длина зубов ужовых змей зависит от размера животного. Так, длина зубов водяного ужа колеблется от 1,9 до 6 мм, а краснополосого полоза - от 2 до 5. мм, коррелируя с массой тела змеи. Железа Дювернуа питает многочисленные альвеолярные дольки, обеспечивающие эффективный биосинтез компонентов яда.

При анализе выхода яда у водяного ужа и краснополосого полоза мы пришли к выводу, что количество яда зависит ог сезона года, размера тела, от упитанности и физиологического состояния рептилий. Выход яда выше в активный период жизни животных, при большей упитанности и большей массе тела.

3.5 - 3.5.1.СОСТАВ II ОСОБЕННОСТИ ТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ЯДА ВОДЯННОГО УЖА Natrii tessellata (Lanreníi, 1768) И КРАСНОПОЛОСОГО ПОЛОЗА Coluber rhodorhachis (Jan, 1865).

Свежеполученный яду различных видов ужовых змей сем. Cohibridae представляет собой вязкую, бесцветную, либо окрашенную в желтоватый или зеленоватый цвет жидкость.

Нашими исследованиями показано, что в яде водяного ужа и краснополосого полоза присутствуют протеаза и фосфолипаза (рис.1). Удельная активность протеазы в яде водяного ужа характеризуется величиной 0,05 мкмоль/мин. на мг белка, а общее содержание белка в секрете составляет 75-80%. У краснополосого полоза эти величины равны соответственно: 0,15 мкмоль/мин.мг и 70-80%. Яду последнего свойственны также более активная фосфолипаза, более высокая токсичность и ингибирующая активность в отношении действия на фосфорилирую-щее дыхание митохондрий, что будет более подробно рассмотрено нами ниже.

□ Фосфолипаза

□ Протеаза

□ 0,5 УЗ

□ Ш50

Рис.1. Характеристика некоторых активностей цельного яда водяного ужа и краснополосого полоза

(Акттганость фосфолипазы и протеазы представлена в мкмоль/мин на 1 мг белка;

0,5 УЗ - концентрация яда, вызывающая торможение дыхания митохондрий на 50%; величина 1Л)И представлена в мг яда/10 г массы животного)

Рассматриваемые нами яды водяного ужа и краснополосого полоза в отношении токсикологии изучены недостаточно. Заслуживает упоминания близкая по направленности работа М.ЭАбубакировой (1997), посвященная определению токсичности и механизма действия яда таких представителей ужовых как стрела-змея и разноцветный полоз.

Токсичность яда водяного ужа и краснополосого полоза определялась нами на мышах и крысах. Животные взвешивались и комплектовались соответствующие группы. Перед началом эксперимента яд разводили в физиологическом растворе и вводили животным микрошприцом внутрибрюшинно. Спустя 24 часа методом пробит-анапиза определяли величину ЫЗбо, используя по 6 животных в каждой группе (мышей и крысят по 6 голов).

Из табл.2 можно видеть, что для яда водяного ужа величина ЬЭ^о составляет около 20 мг/кг, а для краснополосого полоза-10,9 мг/кг, что в 2040 раз ниже токсичности яда кобры (Орлов и др., 1990).

Определение токсичности ядов водяного ужа и краснополосого полоза показало, что она обусловлена, вероятнее всего, наличием в их составе нейротоксинов, так как смерть животных сопровождалась судорожными конвульсиями конечностей. Однако для более корректного заключения о механизме действия яда необходимы детальные исследования на биологических и модельных мембранах.

Таблица 2.

Определение токсичности яда водяного ужа н краснополосого полоза при внутрибргошпнном введении в сравнении с ядами других змей

Лабораторные животные LD50 (мг/кг) LDjoo (мг/кг)

Водяной уж Natrix tessellata

Мыши 20,23 21,44

Крысы 20,53 22,00

Краснополосый полоз Coluber rodorhachis

Мыши 10,64 11,77

Крысы 10,95 12,22

Среднеазиатская кобра Naja oxianá (Eichwald)

Мыши 0,50 (Орлов и др., 1990)

Гюрза Vípera lebetina (turanica Cernov)

Мыши 2,10 (Орлов и др.,1990)

Эфа Ее his carinatus (Schneider)

Мыши 5,40 (Орлов и др.,1990)

3.5.2 - 3.5.4. ВЛИЯНИЕ ЯДА ВОДЯННОГО УЖА Natrix tessellata (Laurenti, 1763) И КРАСНОПОЛОСОГО ПОЛОЗА Coluber rbodorhachis (Jan, 1865) НА МИТОХОНДРПАЛЬНЫЕ И БИСЛОЙНЫЕ ЛШШДНЫЕ МЕМБРАНЫ.

При воздействии 20-мкг/мл яда водяного ужа на изолированные митохондрии наблюдалось частичное, а при больших дозах (1000 мкг/мл) - полное разобщение окислительного фосфорилирования с переходом дыхания в ингибирован-ное состояние (табл.3).

Эти данные судя по направленности эффектов свидетельствуют о наличии в яде ужа мембраноактивных компонентов.

Изучение проводимости модифицированных мембран в режиме фиксации мембранного потенциала, показало, что добавления яда водяного ужа в количестве (0,50 -10 мкг/мл) вызывает скачкообразное нарастание проводимости мембран, однако, при этом не всегда удавалось наблюдать дискретные уровни. Дальнейшее повышение количества яда приводит к уменьшению стабильности мембран, что связано с фосфолипазной активностью яда.

Таблица 3.

Влияние цельного яда водяного ужа на параметры функциольнального состояния митохондрий печени крыс.

(субстрат окисления - сукцичат 5 мМ, п - 9-14)

Доза яда мкг/мл v3 v4 ДК АДФ/О Ураз

Контроль 128,3±6,8 34,6±2,3 3,8 1,84 187,4x6,6

20 128,3±6,8 34,6±2,3 3,2 1,82 156,5± 11,3

100 88,3±4,6 29,7±4,1 3,03 1,65 142,5±8,7

200 72,3±5,4 24,3±2,2 3,0 1,54 130,2±13,б

1000 40,8±3,3 18,6±2,6 2,1 1,16 60,4±5,6

2000 22,6±1,4 18,5±1,7 1,2 0,55 36,3±3,8

Яд краснополосого полоза (50 мкг/мл) при добавлении в поляграфическую ячейку вызывает снижение величины ДК за счет снижения скорости дыхания в состоянии 3 и усиление ее в состоянии 4 митохондрий. При увеличение дозы яда краснополосого полоза (100-200 мкг/мл), наблюдается дальнейшее снижение скоростей дыхания в метаболических состояниях 3 и 4, причем в большой степени ингибированию подвергается фосфорилирующее дыхание.

40п С

Рис.2. Записи тока через каналы, образуемые ядом водяного ужа (0,10 - 0,20 мкг/мл). (Среда: 100 мМ KCl, 5 мМ трис-HCl рН-7,5)

При исследовании дельного яда водяного ужа на проводимость БЛМ было показано, что применение 0,20 мкг/мл яда приводило к скачкообразному изменению проводимости мембран (рис. 2). Дальнейшее увеличение количества яда сопровождалось уменьшением среднего времени жизни мембран, что может обусловлена наличием в яде фосфолипазной активности. Яд краснополосого полоза в дозе 0,20 мкг/мл также вызывает скачкообразное нарушение проводимости бис-лойных липидных мембран.

Приведенные данные показывают, что яд исследованных змей обладает способностью формировать каналы на БЛМ и модифицировать мембранозависимые функции, митохондрий, что сходно с эффектами ряда других зоотоксинов (Ксен-жек и др., 1978; Красильников и др., 1961; Сатхыев, 1971).

3.5.5 - 3.5.6. ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ ЯДОВ ИССЛЕДУЕМЫХ ЗМЕЙ И ИХ МЕМБРАНОАКТИВНЫЕ СВОЙСТВА.

С целью идентификации эффектов отдельных компонентов яд водяного ужа фракционировали на сефадексе (Зг-50. В наших условиях цельный яд-водяного ужа разделялся на 4-фракции, содержащие белковые компоненты следующей молекулярной массы:

•для компонентов фракции I - 90-30 кДа; •для компонентов II - 30-5 кДа; •для компонентов фракции Ш - 5-1 кДа •для компонентов IV - ниже 1 кДа.

При действии первой фракции яда водяного ужа в дозе 100-200 мкг/мл на изолированные митохондрии печени крыс отмечены слабый эффект, однако при использовании дозы 800 мкг/мл эта фракция вызывает резкое ингибирование дыхания митохондрий в состоянии 3 и незначительное повышение скорости дыхания в состоянии 4 (таблица 4).

При изучении второй фракции яда водяного ужа выявлено его большая эффективность и другой характер действий на митохондриальные процессы дыхания и синтеза АТФ, по сравнению с I- фракцией.

В этих экспериментах особое внимание заслуживает разобщающий эффект, т.е. повышение дыхания в состоянии 4, вызванное II- фракцией яда водяного ужа, может быть обусловлено фосфолипазной активностью. Для проверки данной возможности мы исследовали влияние добавки ЭДТА, которые в наших экспериментах снижали эффект П-фракции на митохондриальное дыхание.

Таблица 4.

Влияние разных фракций яда водяного ужа Л'а/га: на функции

митохондрий (субстрат окисления - сукцинат 5 мМ, п = 9-14)

Фракция яда Vi v3 V4 да АДФ/О

Контроль 1-фракция 800 мкг/мл II- фракция 200 мкг /мл III- фракция 200 мкг /мл 31,2±3,43 38,4±4,21 67,2±5,22 71,24±5,61 108,2±5,31 59,8±6,42 76,4±6,32 81,42±5,62 31,4±2,71 39,6±3,41 73,5±4,21 76,46±7,31 3,44 1,51 1,35 1,06 1,81 1,24 1,22

IV- фракция 100 мкг /мл 98,4±4,92 104,3±6,86 (24,2±1,4)* 96,8±5,43 (17,8±2,3)* 1,07 -

Примечание: * - в скобках приведена скорость дыхания после начальной фазы активации; VI, Уз, У4 - скорости дыхания в разных метаболических состояниях, выраженные в нг-ат О/мин на мг белка.

При использовании фракции Ш в дозе 200 мкг/мл нами на митохондриях отмечено, с одной стороны, достаточно четкое разобщение окислительного фос-форилирования, а с другой - ингибирование дыхания митохондрий, усиливающееся с увеличением концентрации этой фракции.

Добавление IV-фракции яда водяного ужа в дозе 100 мкг/мл к митохондриям печени вызывала резкое повышение скорости дыхания в состоянии-4 с его переходом в ингибированное состояние. Полученные экспериментальные результаты относительно IV-фракции позволяют оценить ее как наиболее сильный токсический компонент яда водяного ужа, несмотря на ее довольно низкое содержание в яде.

В опытах на БЛМ обнаружено, что добавление I-фракции яда водяного ужа при меньших дозах не вызывает увеличение их проводимости, а при больших дозах эта фракция оказывает более слабое действие на параметры БЛМ. При изучении П- фракции яда водяного ужа выявлен другой характер действия на БЛМ. П-фракции яда водяного ужа вызывает увеличение интегральной проводимости БЛМ и формирует неустойчивые ионные каналы. 1П- и IV-фракции яда водяного ужа при больших концентрациях не вызывали формирование ионных каналов.

Селективность каналов, образуемых Ii-фракцией, оказалась аналогичной селективности каналов, формируемых цельным ядом водяного ужа, и она может быть представлен следующим рядом: К+> Na+>Li+

На основании полученных нами данных можно сделать вывод, что отсутствие каналоформерной активности III и IV- фракцией, по-видимому, обусловлено наличием в яде токсинов имеющие постсинаптическим характером действия, так

как постсинаптические нейротоксины змей и пауков не обладают каналоформер-ными свойствами (Орлов, Гелашвили, 1985; Каликулов, 1996).

Биохимические исследования показали, что яд водяного ужа и краснополо-сого полоза обладает фосфолйпазной, протеазной и каиалоформерной активностями, причем в характере интоксикации при действии цельного яда на животных превалирует нейротоксический эффект.

Змеи обезвреживают жертву двумя основными способами -путем удушения, сжимая ее кольцами своего тела, и более совершенным способом - с помощью яда. Основываясь на литературных и собственных данных можно считать, что яды ужовых змей обладают рядом специфических ферментативных и мембранотроп-ных активностей, в некоторых случаях сходными с таковыми у ядов гадюковых и аспидовых змей. Вышеприведенный материал свидетельствует о существовании параллелизма в эволюции змей.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные нами исследования позволили оценить нынешнее состояние динамики популяций в зависимости от сезона Ь>да, суточную активность, характер питания и обмена веществ, условия размножения. Отмечено достаточно резкое снижение численности исследованных видов рептилий в местностях с повышенным антропогенным воздействием. Все эти данные представляют очевидный интерес для разработки мероприятий по поддержанию численности исследованных нами и других видов рептилий, рационализации их охраны, отлова и содержания в неволе. В этом плане перспективными являются не только эколого-биологические, но и гельминтофаунистические исследования, представляющие интерес для понимания механизмов, регулирующих численность змей семейства СоЫЬМае.

Новыми в наших исследованиях является изучение морфологии ядовитого, что показало особенности строение ядовитого аппарата исследованных нами змей и показано бороздозубчатый тип строения у данных видов рептилий.

Большое внимание в наших исследованиях было уделено также изучению токсичности ядов данных змей, характеристике их мембранной активности как в цельном яде, так и в изолированных из него фракциях. В составе данных ядов выявлено наличие фосфолйпазной активности и более выраженной нейротоксиче-ской активности на уровне цельных ядов, а также в низкомолекулярных фракциях.

Результаты наших исследований, как нам кажется, являются предпосылкой для дальнейшего детального изучения токсических компонентов яда ужовых змей, тщательной очистки от всех других токсинов каналоформерных компонентов, электрофизиологического изучения их эффектов на механизм синаптической передачи и т.д.

выводы

1. Исследованы эколого-биолошческие особенности двух видов ужовых змей (сем. Colubridae): водяного ужа Natrix tessellata (Laurenti,1768), краснополосого полоза Coluber rhodorhachis (Jan, 1865). Охарактеризованы их суточная активность, условия обитания и размножения.

2. Изучена гельмшггофауна, как один из важных показателей взаимоотношения рептилий с окружающей средой и выявлено 10 видов паразитов, относящихся к трем классам-цестод - 1 вид, трематод - 2 впда и нематод - 7 видов, зарегистрированных впервые на территории исследуемого региона.

3. Выяснены пути циркуляции паразитов у змей в биогеоценозах Узбекистана: для цестод - 5, трематод - 2, акантоцефал - 3 и нематод - 7.

4. Оценена сезонная зависимость метаболических показателей ужовых змей и показано резкое подавление уровня газо-кислородного обмена, снижение содержания компонентов углеводного обмена и накопление продуктов липидного обмена в крови, а также снижение ядолродуктнвности при зимнем оцепенении .

5. Охарактеризованы особенности ядообразуюхцего аппарата ужовых змей, локализации железы Дювернуа и ядовитого зуба, приспособленных к глоточнополост-ному поражению жертвы.

Ядопродуктивность змей зависит от их возраста, размера, упитанности и физиологической активности, возрастающей в теплый период года.

6. Полученный яд из желез Дювернуа ужовых змей действует токсично на мышей и крыс с летальной дозой 20.23 и 10.64 мг/кг,соответственно, для яда водяного ужа и краснополосого полоза. Цельный яд этих рептилий обладает фосфолипаз-ной, протеазной и геморрагической активностью.

7. Яд водяного ужа и краснополосого полоза формирует на БЛМ одиночные каналы с катионселективной проводимостью. Под влиянием яда водяного ужа происходит разобщение окислительного фосфолирования митохондрий, а для яда краснополосого полоза, в отличие от водяного ужа, характерно подавление дыхательной активности митохондрий.

8. Проведенный анализ эффекта различных фракций яда водяного ужа на изолированные митохондрии и на БЛМ показал, что наибольшей мембранной активностью обладают II и IV фракции. Выявлено, что основным каналоформирующим компонентом яда является фракция Б, обладающая фосфолипазной активностью, что может лежать в основе биоповреждающей активности секрета слюнных желез ужовых змей (сем. Colubridae).

Список работ, опубликованнанных по материалам диссертации:

1. Казаков И.К., Камилова Ш.И., Абубакирова М.Э., Азимов Д.А. Действие яда водяного ужа Nalrix lessellata (Laurenti) на бислойные липидные мембраны. Узб. биол. ж. N 4. 1998, с. 59-62.

2. Казаков И.К., Камилова Ш.И., Холматов Р.Ш., Абубакирова М.Э., Азимов Д.А. Некоторые эколого-биологические параметры змей Natrix lessellata (Laurenti). Узб. биол. ж. N5. 1998, с.49-51.

3. Шакарбаев Э.Б., Кучбаев А.Э., Камилова Ш.И., Азимов Д.А. Гельминты Natrix tessellata (Laurenti) - водяного ужа фауны Узбекистана. Узб. биол. ж. N3. 1999, с. 48-51.

4. Казаков И.К., Камилова Ш.И., Ахмеров Р.Н., Азимов.А. Влияние яда водяного ужа Natrix tessellata (Laurenti) на митохондрии печени крыс in vitro. Док. АН. РУз. N4.1999, с. 36-38.

5. Камилова Ш.И. Экология и биология водяного ужа Natrix tessellata. /В мат. Международной научно-практ.конференцин «Экологические основы изучения проблем Приаралья». КГУ, Нукус, 1999. - с. 109-ПО.

6. Камилова Ш.И., Шакарбаев Э.Б., Азимов Д.А., Кучбаев А.Э Гельминты -регуляторы численности популяции уж'овых змей. /В сб. «Биол.ва экол. за-монавий муаммолари халкаро илмий конф.матер.» Самарканд, 1999.- с. 159161.

Кожклова Ширин Ибрсжяновнанкнг "Colubridae охласнга кирулчл ялоиларпнпг околотвк-Ояолотжк ^усусяятяари ва зацаринцг мембрапоаЕтмвллгж" ыавзусидагн диссертация вшхнхвг ^исцача мазмуни

Диссертацияда Calubridae оилаеига мансуб икки тур илон яъни сув илони Na trix t essella ta (Laurenti, 1768) ва чизил й^лли иловлар-нинг Coluber rbodorhachts (Jan, 1865) экологик-биологик з^усусият-лари атрофлича ургаяилди. Уларнинг яшаш шароити, купайиши ва суткалик фаоллигн ва эколотик омиллари ёритилди.

Урганилаётган плонларпинг аа^ар аппарата (Дювернуа безл) анатошгасл ва морфологпяси ^ргаыилгап. За^ар аппаратларинпнг иорфо-функционал тавсифипн тазугал в;илишда ту нарса иаълуи булдиЕи за^арнипт иявдори ва за^арчанлигп ^айвон танасинпш узунлигига, фаслга, туйянгаплигига ва бошца оиилларга боглп!;.

Узбеки от он миптацасида Colubrídaeo оилаеига мансуб илон-ларнинг атроф муграт бнлаз богличлмги ва уларнияг гельмивто-фаунаси урганилди. Текширилган шгояларда биринчн бор уч синфга мансуб булган 10 тур — цестод (1 тур), трематод (2 тур) ва нематод (7 тур) ашщланди.

Бундан тапщари текшприлаётгап илонларнинг цон курсат-кичлари ва уиуиий энергетик' алмапшнувивинг мавсуиий богли^лиги яъни цпшги yñijy ва баз^орги фаол вацтидаги з^олатлари, шунинтдек ^опдаги метаболитик курсаткичларипинг паст з^ароратларда эркин ёг кислоталаришшг ошпши, умумий лнпидлар холистирин, липопроте-идларнинг чисман узгаришн ва диен-кошогатларни ошиши суза-тилдн.

Биринчи бор курилдики, сув илони ва г;изил йулли илонларнинг завари икки ^атлашш лнпид иембраналарда явка тартибдаги катион танланувчан утЕазувчанликка эга булган ион ташувчи канал-лар Х.ОСИЛ ^илади, шгтохондриал мембраналарида эса митохондрия-нинг нафас олпшига сув илон заз^арига нисбатап *;иэил йулдор илон завари купрет; таъсир этиши кузатилдн.

Сув илонн за^арининг фуляциялари ИЛМ-да таъсир эттирга-нииизда фа^ат II- фракция ИЛМ-да якка тартибдаги нон ташувчи каналлар цоспл циллши намоён: брлдк.

Митохондриал иеибраваларда эса энг кучли эффектга IV-фракцпя зга б^лдот.

Олинган иаълумотлардан шундай >улосага келиш иуккинки Colubridae оилаеига кирувчи илонлар захарининг мембрана тизиила-рига таъсир г,илиш з^усусиятлари Eiapidae ва Viperidae оилаеига иан-суб илонлар за^арннияг таъсирига ухшайди.

SUMMARY

of the thesis"ECOLOGICAL AND BIOLOGICAL TRAITS OF COLUBRIDAE SNAKES AND MEMBRANE-ACTIVE FEATURS OF THEIR VENOMS" submitted by Kamilova Shirin for the degree of Candidate of Biology

This work describes ecological and biological traits of two snake species of the family Colubridae: the diced snake (Natrix (essellata) and the cliff racer (Coluber rha-dorhachis). Daily activities, habitation and breeding conditions are described. Considerable attention has been paid to the helminth fauna as one of the most important indices of interrelations of reptiles with the environment. Ten parasite species belonging to three classes — cestodes (1 species), trematodes (2 species), and nematodes (7 species) — have for the first time been reported from the area under study.

An assessment was made of the seasonal dependence of metabolic indices of the Colubridae snakes, and a sharp retardation of metabolism, decrease in the content of the components of carbohydrate exchange and accumulation of products of lipid exchange in the blood, as well as a decrease in the venom production during the winter torpor of snakes were recorded. ,

Peculiarities of the venom producing system of the Colubridae snakes were characterized. The venom obtained from the Duvernua glands of the Colubridae snakes was toxic to laboratory animals causing their death. The venoms shows the phospholipase and protease activities. They form single channels on BLM and causes non-coupling of the mitochondria respiration. The venom of the cliff racer, unlike that of the diced snake, also inhibits the respiratory activity of mitochondria. It was also revealed that the major channel-forming component of the venom is fraction II having the phospholipase activity, which may form the basis of biodamaging activity of the secret of the salivary glands of the Colubridae snakes.

Список сокращений

АДФ (АТФ) - аденозинди(три)фосфат,

ДК - коэффициент дыхательного контроля по Чансу - Вильямсу (V3/V4),

V-p- скорость дыхания в присутствии разобщителя-протонофора,

БСА - бычий сывороточный альбумин,

СЖК - свободные жирные кислоты,

КЦХФГ- карбонидциайид хлорфенил гидразон,

БЛМ - бислойные липидные мембраны,

ВАХ - вольт-амперная характеристика,

Э ДТА - этилендиаминтетраацетат,

ЭГТА - этиленгликольдиаминтетраацетат,

ЛД50 (LD50) - летальная доза вещества, вызывающая гибель 50% подопытных животных.