Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Свойства и регуляционные функции карбоксикатепсина (ангиотензин-превращающего фермента)

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Свойства и регуляционные функции карбоксикатепсина (ангиотензин-превращающего фермента)"

¡¿и^к^ы 'йня г'%/£</о*

/34-Г

зьт

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ПО НАРОДНОМУ ОБРАЗОВАНИЮ

ОРДЕНА ДРУЖБЫ НАРОДОВ УНИВЕРСИТЕТ ДРУЖБЫ НАРОДОВ имени ПАТРИСА ЛУМУМБЫ

СВОЙСТВА И РЕГУЛЯТОРНЫЕ ФУНКЦИИ КАРБОКСИКАТЕПСИНА (АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА)

(03.00.04 — биохимия)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

На правах рукописи

ЕЛИСЕЕВА Юлия Евгеньевна

УДК 612.46.015.1 : 577.152.34

Москва — 1990

Работа выполнена в Институте биологической и медицинской химии АМН СССР.

Официальные оппоненты:

академик АМН СССР, доктор биологических наук, профессор А. П. Ашмарин,

доктор биологических наук, профессор Г, А. Яровая, доктор биологических наук Н. Н. Чернов.

Ведущая организация — I Московский медицинский институт им. И. М. Сеченова.

Защита диссертации состоится « » 1990 г.

в часов на заседании специализированного совета Д 053.22.02 при Университете дружбы народов им. Пат-риса Лумумбы по адресу: 117198 ГСП, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8, медицинский факультет.

Автореферат разослан « » 1990 г.

Ученый секретарь специализированного совета

В. Э. ТОРБЕК

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы.В связи с широкой распространенностью" сердечно-сосудистых заболеваний выяснение молекулярных механизмов регуляции общего и регионарного щзовоофсиценпя приобретает первостепенное значение.Регуляция артериального давления (АД), как и многие другие процессы в организме, осуществляется при участии биологически активных веществ противоположно направленного действия. Изучение прессор!шх и дспрессорннх систем организма, выяснение их взаимоотношений п регуляции их деятельности ваяно как для понима-1ил сути процесса, тше и для целенаправленного воздействия па но-го. Такие исследования закладывают основа для разработки эффектов- • них мер терапии п профилактики.

Регуляция АД, поддержание кровообращения, включая мшфоццртсу-лявдю, на определенном уровне в постепенно меняющихся условиях внешней среды и в зависимости от состояния организма представляет собой комплексный процесс, обеспечивающий необходимый уровень кровоснабжения тканей. По современным представлениям, основным биохимическим механизмом, посредством которого осуществляется постоянная регуляция АД и микроциркуляции, является решш-ангпотензгаго-вая система (РАС).контролирущая сосудистый тонус и водно-солевой баланс - оба фактора, определяющие уровень АД. Она функционирует п тесной взаимосвязи с центральной и симпатической нервной системой: ( Слtt et ni. » 1904), влияние которых на АД, как и целого ряда зн-догешшх веществ, реализуется в большой мере при участии РАС (leurn et ai. 1980). Антагонистом РАС по действию на АД являетоя калликреин-кшшновоя система (ККС), уравновеияващая о какой-то степени прессорное действие РАС. Обе оти системы в:шкают каскады реакций ограниченного протеолдза, приводящих к образовоюгю вазоактишых пептидов акгиотензпна П (А П) и брадгашша (Ек), отличадагосся противоположным действием на гемодинамику я водно-солевой обмен. Ферменты, участвующие в образовании и яиоктлвиш этих пептидов, являвдиеся регуляторами iex концентрация а крови з тканях, могут определять в конечном итого их эффект я ергашшо*

Конечный этап офазования активного прессорного пептида А П катализирует агггнотензкн-пре^ащакешй фермент (карбекеккатшегт, хинвиаза П, дштептадии-карбоксипептидаза А, Ш 3.4.15.1). Этот, фермент привлекает внимание исследователей во всем ?даре, и тгтерос к иецу продолжает расти, в особенности со стфоны фармакологов.я хшишцистов.Это связано о его ратью в рехулящш кровсюфащеигш а

с тем, что он является центральным звеном, воздействием на которое uobuo целенаправленно влиять на уровень АД и кровоснабжение орта-¡юн. Торможение его активности введением специфичных ингибиторов (каптопрал, аналапрал, рамаприл), отличавдася высокой избиратель-ноегьа, приводит к сшикошно повышенного АД почти яра всех формах, гкпергензивних состояний, в том числе и при гипертониях, не поддающихся лечению традиционными средствами С Davies et &i. , 198-1; Heel et al. , 1980). Ингибитор! оказывают хороший лечебный £®citr, обусловленный улучшением кровоснабжения, при сердечно-сосудистой недостаточности ( Romniiewicz et al. , 1983), инфаркте миокарда <Ertl et al. , 1982), токах различного происхождения (Freeman et ь1., 1984). :

Цель и основные задачи исследования. Целью работы являлось изучение свойств и биологической функции протеолитического ферлен-?а, обнаруженного наг,а в кора почек бака и названного карбонсикато-шлшом (Кк),

В основные задачи работы шдодо: I) Разработка метода шдело-ншi и получение гомогешюго препарата Кк, 2) Изучение фазико-хими-чзсках свойств и специфичности действия Кк на пептида, а таккэ топ-поеонкя его активности различными ингибиторами, 3) Выяснение физио-Аогаческой роли Кк. Разработка метода определения его активности в оиЕоротке крови и выяснение ее уровня у ладей в норме. Исследование гсканошй активности Кк при некоторая патологических сосгошшк у; дздаЗ. и гзшотхохх, 4) Полем эндогенных модуляторов фермента, 5) II,j-ие синтеткчесис: шоокоакяшшг иорорлтгышх кктлбгаоров Ка, ока-еиваазах ацтикшертенвиЕНое действие,

Научяля нод-лз.'т.О'бнацуухш про-кюлгш'чеоь;:« $йрг,;еыг Кк, огллчз-ко споца^ачаоохй доЕспми or азьосашх протекказ Мчянай, , Внервке бив рааработап кзгод пщзтшк Кк и шзрвие получек васокоочк^ешщн формант.

ВсолодоЕагшо особонвозтоВ дсЁстеук Кк пи сшж»гкчесш> ванпь-ХД иоагшяло офорудлроыи- ооноьиио 'зробог-ангя fap.-ош'г к огру»:ту-|;Э йош!доа, шкяаад. mmim долвчпше i-рршдрокж на скорость nil р;:лдеи и&юцф фетимигса» тырить сиооиС:шо\ъ Цзрнгыя рлоц-луззп tl^yngo а девешентид^,

пог&сво, ир;й1СКн21й.ч» Л 1 ь L П г. pypynamui Ik VJi'i,.Qvi-zhxz&i о&и. ;t Иг» сита.йа;,;: ьроьодец!-::!:; лос;;идов>

iV'l" п ii&iF.zur-vs .pusyrjA'atos праащешял--

) «л» fc^.osj&'caro с. Qyuawi Vs. » оргаяльмг. Еа«ха1<г?з концов

цил его клотевой роли в регуляции концентрации вяэоактивппх гтопгп-1 дов-антагонистов А П и Бк в крови и гг-чях.

Обнаружено присутствие Кк в синодальной жидкости, полученной из воспаленных суставов больннх артритами различной этиологии.

Обнаружены природные интабиторы Кк в сыворотке и лейкоцитах (нейтрофилах и мононуклепрах) человека и быка, в синовиальной злщ-. кости большие артритами,. .в легких и почках быка, а такта в лдо'зьюй офы и кобры.

Обнарукен эндогенный активатор Кк в нейтрофилах и в крови человека.

Показана в экспериментах на собаках возможность применения ингибиторов Кк с целью повышения выживаемости и снижения осложнений п постреанимационном периоде.

Практическая значимость. Ванное теоретическое и практическое значение и'.-евг исследования, которые привел! к обнаружению ключевой роли Кк. Они создали основу для понимания взаимосвязи ренпн-аптао-' тензиновой и каллнкреин-кининовой систем - двух физиологических систем, участвуют* в регуляции АД и считавшее я до этого ко спязанпя-».»:« меяду собой. Это привело к новому уровню понимания механизма рзЦ гулянии кровообрашнпл в организме. На основе ингибиторов Кн балп созданы шеокооффектишне антигипертензивные препараты, оказывающее положительный терапевтический эффект при различиях фортках гипертонии, при сердечно-сосудистой недостаточности и других нарушениях кровообращения.

Исследования, посвященные поиску ношх синтетических ингибиторов Кк, актишплс при пероральном применении, позволили предложить новое соединение, отличающееся шеокой янтигипертензивной активностью в опытах на крысах с различными формами гипертонии.

Применение специфичного ингибитора Кк тепротида на ранних стадиях реанимации, вызывая улучшение кровоснабжения органов, окозпез-яо защитное терапевтическое действие, шракавкеося п сшжзшти ослой-поилЗ со стороны 13Ш и позже пин выживаемости. Полученные результата представляют существенный интерес, т.п. гкуяюпэннос воссгапопяаппо ' ФункшЗ ЦНС является основной цэлыо при оютвленпи организма поолэ тергтанального состояния.

Обнаружение п изучение прародних ■стийяторов'в активаторов Кк,' находящихся в кропя и лейкопятзх человека, в перспектива гегс? пригрета к выяснешш механизма регуляции Кк в организме, Кроко того, это могат псслугить основой для создания попа торзпоягзчеоглх

... а

средств, а также может оказать помощь в ранней диагностике ряда заболеваний, включая гипертонию, различные воспалительные процессы, i заболевания, сопровождающиеся нарушениями системы комплемента. ,

Обнаружение ингибиторов Кк в лейкоцитах тлеет теоретическое л практическое значение душ понимания участия Кк в эоспалошш. . Эти данные позволили предложить гипотезу механизма влияния лейкоцитов на проницаемость сосудов при воспалешш.

Предложенный нами метод определения активности Кк в сыворотке был передан в ряд клиник страны (Ленинград, Харьков, Ашхабад, Хабаровск, Рита).

Апробация работы. Основные положения работы доложены u обсуждены на I, П, Ш и У Всесоюзных биохимических оъездах (Ленинград, ! 1964; Ташкент, 1969; Рига, 1974; Киев, 1986), на сессиях Отделения ывдоко-биолотических наук АМН СССР (Москва, 1976; Ереван, 1902; Ыо~ оква, 1983), Советско-итальянском биохимическом симпозиуме (Москва, 1977), 17-м.съезде терапевтов (Москва, 1974), Ш Всероссийском съезде кардиологов (Свердловск, 1985), Симпозиуме по биологически активным пептидам и белкам (Баку, 1980), 4 Всесоюзном симпозиуме по медицинской энзимолотии (Алма-Ата, 1983), У1 Международном биахимичо-^ оком конгрессе (Ньв-Порк, 1964), 1У Конгрессе ревматологов латип- ; OKJix стран (Льеж, Бельгия, 1980).

Положения, внносимые на задмту.

1. Обнаружение нового протеолитичеокого фермента, карбоксика-эепсина, отщеплявшего дапептида с карбоксильного копир различных'по строения пептидов; его физико-химические и онзиматическко свойство.

2. Идентификация кэрбоксикатепсина о двумя разными ферментами, огаюашшш как шт>геази1ьпревращавд1й фермент и киншюаа П, и до-касательство ого ключевой роли в функционировании раниы-ангиотснзя-ноьоё и квлликродш-кштновой систем, контролирующих кровяное давло-¡шо.

3. Результату исследований активности Кк в сыворотке больных ; роно-ваокулярной гипертонией а гипертонической болезньв и у собак » окотренольтпс состояниях, овадотольотададае в польву его участия м. ог«И£ШйК ко;.и1снсатори:х реакциях органа«.», направддшга на восста-соьазшо нормального ировоойращошя,

Odaapysonas оидогснаах шгогбатороа Здрбоагошюкешиша • в Jtpcj-

5 ХОЕКОЮТСЗЕ 5! СинОЕИаЛТ.КОП ХЗДВССТЛ ЧЗЯОВЗКа 'к ЕКЕ1К350ра(ОВ) l| 5ДОЗ а пь&чрсфхсх ^влоЕакв? их фзамоаигкчоояоо ооачаше.

S, Bús^oraocri. торапемичзокого првгашикш ошкекгазскшг иеп> - éiyopoB .«орбоксааиоисвЕа пра рицвааает.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит но вводсшй, обзора литературы, методической части, трех глав собственных иссло-доезнпй , обсуждения результатов, заключения и шводов. Днссертацлц кзлокена из страницах мошнописното текста, содержит 48 pncyib ков и 36 таблиц. CtracoK литература включает наименований.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЭДЕШЕ

На^! был обнаружен в коре почек быка протеолитическиА фермент, отличавпшйся от известных протеиноз тканеП, и назван карбокешште-псиноч (Кк) (Елисеева, Орсхович, 1963). В "Номенклатуру ферментов" (1972 г.) он бил внесен под названием пептидпл-дипептидайа (КФ 3.4Л5Л), которое позднее было заменено на дипептидил-карбок-еппептидаза А. (В литературе в последнее врет наиболее широко применяется название "ангиотензин-превращающий фермент").

Проведенные нами исследования бшш первуки в области изучения его физико-химических п энзиматическнх свойств и вменения фпзяоло-пнескоЗ ролл. Ош нашли подтверждений и получили дальнейзоо раагя-гзо в работах многих исследователей ( Згайя , 1979, 1986; Cuahrcsn %

eni*tti , I9B0). х.Вчдолосто я пзушгао свойств глриоксппатспсггл^

Получетае шеокоочитенних препаратов Кк из кода почек п лягкзх

бмкп, Еил разработан метод очистки Кк, вклвчакшй следувдио стадия (табл.1):

1) Экстракция гомогепата ткани 0,01 М фосфатным буфером рН 7,65, содераапщм 0,25 М сахарозу. ¡

2) Инкубация с трипсином в течете часа при 4°С. ;

3) Фракционирование на КМ-сефадексо С-25 в 0,005 М фосфзтнсп, буфере pfí 6,5. В этих условиях Кк не связывается с понооймвщшкегл, но удается освободиться от ряда белков, когорао долго сопутствует' ему при других вариантах метода. И, кроме того, па отоЗ стадии. отделяется ингибиторы Кк.

4) Фракционирование на ДЗАЭ-сефадексе А-БО проводилось в доз . отапа. 11а первом этапе (0,075 М фосфатный буфор рН 7,65) удгшипюь балластные белки, когорте прочно связываются с попооСглэпеттаз; Кг: в этих условиях с ним по связывается. Это дпет возмокпоегь nta фракционировании на ДЭАЭ-грзллхигозе jjyisocTEaimo увеличить со orntocr* по отношению к Кк.

На втором этапе спитанием кояцзптрацза буфера до 0,025 Ц создавали услоиая для связывания Кк. Посла перепесошш ссфздокся о колонку Кп алгаровалл 0,075 ?J фосфаттм буферов, содорглиз? 0,1 I! n.nct. 5

2-2СЗ

5) Фракционирование на колонке с ДЭАЭ-деллюлозой в 0,03 H фосфатном буфере рН 7,65 с 0,01 I.Î КчС1. Адсорбированный на ионообме^-нико Кк элюкровали, создавая линейный градиент концентрации î/aCi ■'

0,01 - 0,11 Î.I в том ïs буфере. Фермент десорблровэлся при концентрации NnCl 0,03 - О,0G M.

6) Фракционирование на гидроксклапатите в 0,015 M фосфатном буфере pli 6,8. Фор;.;енг б этих условиях остается в растворе.

7) Гель-фильтрация на сефадексе Г-200 в 0,025 M медшюловом буфере рН 7,4, содержащем 0,2 M Касг ,

Таблица I

Очистка карбоксикатепсина из коры почек быка

Фракции

! Общий ! белок, ____ ! мг

Экстракт (39300

" +тркпсин!21050

КЫ-сефодекс • ¡19900

ДЗАЭ-сефадекс i 1870

ДЭАЭ-целл.(трал); 201 .

37,7

3,6

! Общая 'актива. ! ед.

I 825 i 1074

Уд ./¡к т., ! Ешрд

i

f

! ед/мг ! белка

Гидроксилаиатих! Сефадекс Г-200 j

1258 925 462 388 109

0,021 0,051 0,063 0,494 2,300 10,300 30,000

100 130 152 112 56 47 13

Степень очистки

2,4 3,0 23,8 110,0 490,0 1429,0

С поыоцью этого метода были получеш гомогенные, по дашшм | диск-олектрофореза в полиакрила:.ыдасм голз, препарата Кк по кори.1 почек и из легких быка. Обхшруякьаеиая в срезах теля активность Кк соответствовала полосе белка. Б результате очистки окяшаоахь Кк ; по сравнению с экстрактом увеличивалась в I400-£iGÖ рас в вашсыю-ств от уровня активноеiH в скстракте. i

£изкко-хп?,г:;чосу;ш свойства. По исследовавши свойствам (габл, 2), кривил актикщап Кк ионамл хлора и торетгензя его ЭДЫ в зависимости о г коиц&отращш откх воадотв, а таюте по отепеш! ггорлоглшя его активности поагадиглз шгаСйгора^: в здаш аызй (е$и и ко бри) фо|«.;оиты ks почек и легких нэ отличалась друг от друга.

.Свойства дшрбокоакатешшш почек в лоизк ' £а0л?Ц2' ®

——~—I

0КГ.С4Г'! ДоДоТГЩ \ ,

ЗДсжвадсясекая хочет Устойчивость ~ • Ащ'дхуг.-ор: Ci

tfl 7,2 ~ 160 iíS

¡•и 4,5 ; pi 6 - о

Ногш er*

7,4

Со*"1, Vn*

Активация ионами хлора является характерны?/ свойством Кк, отля-чоюютл его от многих протепз. В среде, не содеряаввей ионов хлора,1 паблвдался незначительный (1-2% от максимальной скорости) гидролиз' s-rhe-iri«-J>u . С увеличением концентрации u^ci активность ¡to увенчивалась и достигала максимальной величины при 0,2 М.

Специфичность. Исследование субстратной специфичности Кк," проведенное но более СО пептидах различного строения, позволило н/ягкгть ряд особенностей, представленных па следующей схеме:

Kit отщепляет дипептиды с карбоксильного конца пептидной цепи субстрата, гидро-лкзуя последовательно какцую вторую пептидную связь. Фермент отличается широкой специфичностью действия, гидролизу-ет пептиды различного строения, если ош !У!еит свободную С-концзйти карбоксильную группу, Амиды и офнрн субстратов Кя не расцепяявтся. Кк из гидролиаует ; пептиды, содержащие остаток пролива т» ' пологснии Pj. Это особенность доГстгая Кк представляет особый интерес, т.к. она имеет существенное зггачегпо при тадролпго физиологических субстратов. Препятствием для гэдролт-за сдугпт и наличие дополнительной отрицательно яаряглНной трушш в боковой цэпи С-коипзвого остатка. Гидролизу пептида, но не сеязнгл-# 1Ш) ого с ферментом мешает и близость к рассзшихемой схшзп свобод-; поО гг-копцевоЗ аминогруппы. Тртшептнды с незайрщонноЗ ^-ямипогруп-пой но гидродпзуется. Но тстрзпептпда о блокированной и свободной ' амшгогруяпоЗ рйссзшгготся о одинаковой скоростью (табл.3). <

Кк отличается строгой стереоспвцяфячностю по отношения к остаткам гмзнокпсло?, образуют.! рзскоплясчутз пгптпднуэ овязь. Пэптадп, содержа в-изомера аминокислот, но гидролизу®?ся. Поптпдо O D'J , изомером з нолохашга сегшывэвтся с форгангов з отлтгпа от попгг-' дов ой-явомвром'П пологенип Pj. . |

Исследование загасгаосгп. скорости гидролиза от строения я - ; конце во Я блокирующей группировки, провздонноо пс?,я пз тртопгтглх ' (синтезирована - Позднего Вй»), отличавшихся строоппса раз-

кала урзгакогоЗ группировка (табл.З), гшпло пекоторыз закономерности, сглдетельстцрвпе о влагаптп степени гядрофобностк радявс-лз не россззплешю пептидов. Пептида с оякпльвем рэдпкалсч портального строения расвдшшлиоь гадяонпее, чем пептпдц, пмзгсга бггопдг»-

7

Pi р2

- n3 A - 1Ц-С00Н

- П3 - Rg - i^-CO-X

- a3 - пг - в^соон

- n A « - v

n3 "2 Bf-C00H

- n3 A ГЦ-С00Н ПгП-П3 - Яг - 1Ц-С00Н

- I!3 - Pro - П1-С00Н

- Pro A R2 - 1Ц-С00Н

шА остаток, но tíuo-трее пептидов с разветвленными группировками. Степень снижения гидролиза зависела от длины углеродной цепи: ь-энь-шей она била у соединений с пропил- и бутилокснкарбошльнши Í ( loe ) группаш. Вероятно, эхо объясняется тем, что расстояние ь «Ш3)3 примерно соответствует протяженности одного субстрат-свози-ваащзто участка на молекуле фермента. При разветвленной цепи алки-льного остатка, включающего 3-4 утлеродиих атома, скорость гидролиза пептида снижалась с увеличением степени разветвленности и с пра-бдакаиием разветвления к расщепляемой связи. Замена разветвленной группы на даклогексил, отличающийся большей компактностью и большей гидрофобноотъю, приводила к значительному уволичешш шдроли-зуемости субстрата. Характеризующаяся наибольшей рззЕетвленностьв ■í-Boo группа мешала связыванию пептида с ферментом, Он почти не расщеплялся Кк и не тормозил гидролиз z-Phe-Hie-reu . Обнаруженные особенности взаимодействия пептидов с ферментом, по-видимому, от-; рожают специфику строения активного центра Кк. Разьотвлешш алгляъ-кого радикала не влияло на тидролиз пептидов ^-хиыотрнпениом, который расщеплял ту Жв СВЯЗЬ В t-Boo-Pho-HiB-Ieu и Z~Fhe~HiB~Leu -с одинаковой скоростью; Таблица 3

Относительная скорость твдролиза пептидов типа RDCO-X- Phs-Hin-LouOH карбовсиквтепсинои

С3Н5~СЕ>~ си3-

с2и5-

eíolo-GgHjj- | Í-СдНд— j

l~CgEy !

ff

!о6н;Гон2с(сн3)2-

' t-C4Hg-

t-c4H9-, t-C^I^-1кг4нг

_____

- ! 1

Pho I j-fht |

i S-IMO1 I

ft-alr.

J

^-ÍMB* f

Vía!

0,36 0,16 0,05 1,0 1,0 1.0 1,35 1,43

" скорость гидролиза Е-гьв-зио-Хвч j v¿> - скорость гидролиза осотезтотауэдего пептида.

.* Амзоиапроиошя кколота^ 2 ¿.мгна'лтл^чал глслота.

■ Ст£.о»152е р^кЫщзвой йлошр/к^зА вдршрешш» окзаива^о еу~ юзяш» га слврзсть рошшегц «хоиосадов, по<шг да 1 na эддеш» .Ьвйз.З). Zto яашгвэа* ш озиоЦ

C2?ajaso züÚokúzoü шад учаогка % исщущохо ь

о •

сглпнг.шшс субстрата. i

Сшпхмше скорости гидролиза пептидов с увеличением кх длин», . гоомо"яо, обусловлено л какоП-то гторз присутствием остатка протона. Во полком случае, пептид», содергяагю вместо пролила фотдашппш или другие аминокислоты {табл.3 и 4), гидролпзовалпсь с Toii те скоростью, что и трппептид 7,-rhe-nin-i.ou . Хотя Л I гпдролизустся примерно з 10 раз медленное, -его (48 ш<М) была близка гидролиза

Известно, что миотие про-теолитические ферменты проявляют остеразпую активность. Для выяснения действия Кк на вфирную связь попользовали пептиды (синтезировали Поздневдм В.Ф.), содержащие ?Ье(ког). О степени гас гидролиза судили по освобоадению z-nie-{ ко?), количество которого регистрировали по поглощению при длине волга! 306308 пм. Введение яитрогруп-па ко изменяло гидролиза пептида {табл.5), но сникало примерно на 30д относительную скорость его гидролиза по сравнению с аналогом, но содержащим эту группу.

Поскольку синтезированные пептпда, за исключением 2-Phe(H02)-Hie-ipu , ранее псследованы но были, мы изучали их спектри, пН-оптпмум пх гидролиза Кк и кинетические константа.

Увеличение оптической плотности проб при инкубации Кк о допси-пептидсм 8-Php(50-)-0Aia.-Giy указывало па расщзплениа офирной связи. Специфичный ингибитор Кк топротпд при разисс когщзнтрзщгязс (1*КГ®-1*10~9 М) тормозил рзскэплент.е депсипепткда в такой гзз ото-пепи, как п пептидных субстратов. Эти дошшз ехздотельотцпат, что слошо-оТярная связь гпяролпзуется Кк п что яопоппептид связнтот-ся с !|ар"«гаптсм опаяогзчво пэптяеея». Дополпитольпиз докавагальотгз идентичности связывающего и язтплпглчсскогс г*сшлшмоп прл гидролиз Мирной п пептидной связи бит получены Хптв <3"*« -'Ь , 18Е0, одаоврзкепко с пета сообщшот;« о раедмшнш r^itpnofl евгоп Ktu Вводоипо 8$»ряоП связи в субстрт л гаств рчедашзш'л ого Кк угэ-

ого С-концевого трипептида (5? мкМ).

Таблица 4

Гидролиз С-концевыя фрагментов ангиотензшш I

Дептади

V7i!

I I

1 i I 0,4 |

i { j 0,13 ;

I 0.1

\ I

t-Boo-Oly-jUAla-Phe-Hia-I^u j 1,15 |

Phe-Hl.i-Leu Z-Php-Hln-tpu Pro-Fhe-r!lr-I,<?u "-Гго-rhP-Hi я-Lou S—Tal-Hiя-Гго-ГЬе-Н1a-Leu

Ангяотоизян I t-Boo-ftro-rhe-Hiя-Leu

дичивало Ку и у макс ферментативной реакции (табл.5).

Таблица 5

Гидролиз пептидов, содержащих нитрогруппу

Пептида

рН ¡Длина опт. }волны i нМ

Ш) !"

M / iV }

мМ

» V

j макс

Z-Phe(iro2)-0Ala-Cly 2-Phe(H02)-Ala-Gly Z-Phe(Н02)-А1а-Рго 2-Phe( ffOg )-Hi a-Ieu 2-Phe-His-Leu

7,0 7,0 7,4 7,4

7,4

306 306 308 306

960 1000 816 1080

1,75

0,177

0,077

0,065

0,057

} 0,25

0,025

Гидролиз физиологических пептидов антотензииа I и брадпкпнп-ши Кк, отщепляя С-концеше дапептида от А I и Бк, превращает физиологически неактивный А I в А П, оказывающий сильное прэссорноо действие, и разрушает Бк, являющийся антагонисток А П по действии на АД. Идентификация продуктов реакции с псмощез хроматографии в танком слое силикагеля КСК и на пластинах "Силуфол ит -254" показала, что в Л I Кк расщепляет одну пептидную слазь. В результате освобождается дапептид His-beu и образуется А П (рнс.1), коториЕ не подвергается'дальнейшему гидролизу Kit. Такая особенность действия Кк обусловлена структурой шггаотензипа и каталитическая свойствами фермента и свидетельствует в пользу его биологической роли » образовании А П. Образование прессориого к П было подтверждено-в биологических исследованиях по новхпешпо АД у крае (сош. с Гур-товенко В.М.). При блокировании действии lût добавлением ?ДТА (5 t..M) образования А П и Hia-beu не наблнцалось.

Ооиошваясь на специфичности дейожшя Кк на пептида, a таккз на инетелхся в литературе сведениях относительно сугдзствошшш в крови (iang, Eràtfs , 1967) и почках (Brdôa, Jang , 1267) форманта, шшкткшрувдого Бк путем отщзшвзная С«концзвого двпепэдп The-ii'H » предположил;! вожлохаюсть участия Ш: в раоруеошш Бк. Кал feo показано пр.: блологкчзских ао&шдоьшшпе на Евоялровэпиом ро~ го катка Kjsicu (оош, о Егоровой Т.П.), Кк хлшвлот виахкжщао ; Ва. Сгеиош. mактлшшш Бк варцогша о увзлачашеи колачоотга fepU хзтчг аяя вродЬяжжт&пооад. шкт&деш, llooro впав^шахет Кг: кагрг~ ^ ьзписа Т.Х: в ЩГЛ рзуругз::эд Es sa сзйсззхоаь« Пр^соь

¡Юфбохоив^тцшз i « щд'сто Соглсшл, ^зрукдауго ЕЙ, £3Si>t У«к. ого . nip-з^в; ез рзсадшшяся ишадвкза пр^-

10

порогом Кк дако при длительной инкубации. :

Хроматографнческио исследования показали, что от Бк (двумерная хроматография на пластинах "Сидуфол uv-254") п от его С-концевого аентапептида (одномерная хроматография) под действием lût происходит последовательное отщепление двух дипептядов.

. i

Продукты распада.

Рйс.1. Схема действия карбоксккатепсина на ангиотензин и брадиккшш.

Таким образом, вперше бшго показано, что эта две биологически южше реакции осуществляются одним ферментом. Физиологически его действие направлено на повшекие АД. Образуя гипертензивный А.П и кмзктквируя гипотензивный Бк, Кк моает регулировать их концентрации з крови и тканях. Соотношение же этих вазоактлвных пептидов, отличающихся противоположным действием на стенку сосудов и водно-солевой обмен, во многом определяет состояние сосудистого тонуса и уровень АД. ¡ До навах исследований превращение À I в А П п разрушение R? ; рассматривались как функции индивидуальных ферментов (апгпоТепзан-превравдюаего фермента (АЛО) и кигаяазн П (К П)), относящихся к рзв-1Шг.1 системам - прэссорной РАС п депрессорноЗ ККС, кепосредствопво \ мезлу собоЗ по сютшткм.

Сопоставление аолучешшх нага зкеперзленталышх дапнах с тсмл немногочисленными сведениями, что имелись в ллтзрзтурз о своГзтва^ ■ Ферментов, описанных как АЛ? ( Skegga et al , IS5S; Bakhlo, I0GS) п К Л ( jan«, Krdüo, I2S7) привело'пае к ваклгсзпдэ, что в оргапзз-т существует не два разгалс специфичных фермента, а одпп, соелоцзэ-ея Я в себе их функции (образование А П я ппактявацив Бк). G отот $ег«ент является одновременно компонентом РАС н ККС. Следовательно, бнло виявлепо связуюзее зеопо ивзду Двутп фззполопгее^шя спотемз-

. II

ми, участвующими в регуляции кровообращения. Участие Кк в ыетабо-лш-о,..е вазоактивных пептидов А Пи Бк, оказывающих противоположное действие на гемодинамику, позволило выдвинуть принципиально новое представление о его ключевой роли в функционировании этих систем. Обнаружение второго связукцето эти системы звена - калликреина ( Зеа1у et а1. , 1978) не противоречило вццвицутому наш положению. Калликреин, выполняя индукторную роль, активирует обе системы (рис,2). Суть ключевой роли Кк состоит в том, что уровень ето активности определяет конечный эффект. Так-, при повышении его активности преобладает действие РАС, при снижении - действие ККС.

ГШШ-ШИОТЕНЗШЮВАЯ КАЛЖЖРИШ-ШШОВАЯ' _СИСТЕМА ■ . С11СТША____

Peo,2. Схема реяин-анвиотензиновой и ка&вшраин-кашшоьоВ систем и их взаимосвязь.

Наш данные о том, что один и тот so фориоат участвует в об-р-льогшпга Д П а разрушения Ее, бшш подтвзрэдэнн рэдоы исследоьа-тс ли Л; в наоеоящзо врэмз она является общзпразпаншша ( soffer • ISVG, 1981J Erú{Jo, 1986; Ondotti, СиаЬмш , IS3S', Воиазков, Трз-, поспакоъа, ID78; Ввзрц, 1981), В 2970 г» пратагчеокя одиоврвмопно! о пойкм (Бхиоеовд к др.» 2970) йояезлооь арегдкфлтеяьпоа оообгшшв г.з aatiüpavojsa Эрдоаа ( ¿гзшц ét sil. • 1070), чхо чаохичао очат^шай (и 200 рлв) щшарет Е II ш пгагая «pota чалокшо праврзгдя А 1 в А И, арзкара? фарезвга, хжязяув йотсшй czorm es

Хм

достоверностью показать, что он проявляет не только кининазную, но и антаотензин-прсвращаюцую активность, они получили позднее ( Igi'o et ni. , 1972). В лаборатории Скеггса, обнаружившего ЛШ в 1956 г., частичная (в 70 раз)очистка фермента била проведена только в 1970 г. ( Bor^r et al. , 1970), а высокоочищенный препарат его получен в 1972 г. ( Dorer et ai. , 1972). О действии же его на Бк огш сообщили ешо позже (Dorer*et al. , 1974).

Окончательное подтверждение, что обе эти реакции и в организме осуществляются одним ферментом и что этот фермент выполняет существенную роль в контроле содержания А П и Бк и уровня АД, было получено при введении в организм высокоспецифнчных ингибиторов.этого фермента ( Iplo et al, , 1972; Miller et al. , 1973; Heel et »1« , I9PÛ; Antonaeclo, Cuahm.m , 1981; Ovorlack et al. , 1981). .

Согласно нашим данным, подтвержденным другими исследователя-ют ( Dorer et ni. , 1974; BUnnlrig et al. , 1983), Бк отличается бо-льаим сродством к Кк, чем А I. При эквимолярной концентрадаи (0,05 ?i.i) он подавлял отщеплете Hia-beu от А I на 94£ (табл.7) (по данным Chlu et al. - на 95?). Учитывая, что концентрация Бк в плазме выше концентрация А I примерно в 30 и более раз, можно предполагать, что Бк, как конкурентный субстрат, может оказывать влияние на образование А П. По имеющимся данным, практически весь А П, находящийся в плазме, образуется при участии. Кк ('OndettÎ , Cuahaan t 1986). При тормокемт его активности большими дозами ингибиторов содержание А П в плазме не поддавалось определения (Ора-riî et ni. , 1979; Onger et al. , 1986; Canpfeoll, 1987).

Что касается инактивации Бк, то хотя в этом прошссо и оргшш-зие участвуют несколько протеолитичесютх ферментов, болвшяя часть (около 70-80*) образунцегося в организме Бк раэрушется Кк (îîrdsn, ; 1376; softer. 1976; skegg3 et al. , 1981). • •

В пользу существопноП роли фермента в регуляцгш АЛ с гидам ль-стцует п характер его распределения в организма. В сосудах он njn-сутстдует з двух фор.-ах: свободной, циркулирую^ а крогл, it ксгн. бранно-связанной, распологеипоЯ па обрапдппоЗ пгтутрш сооудз гтогэ'р-хпостп епдотелиалышх клеток (i?j-an et al. , IS7S), п?о сбзсяачпгз» от ему тесный контакт о еоцосгвакаг иаходяспмисл в крога. Kpcr.ta ! того, он обнарутан ка поверхности сгштслаадьтк кгпок, рзспс.то-гзпнше в пестах интенсивного всасывания тдкоста п con, а гокггэ ряда других (BrâOs , 1986$ пкей ot ni. , 1977; raferiini et ей. , 1983),

4-203 • Ш

Торможение активности кя.рбоксп;ттепенна. Анализ результатов торможения активности Kit неспоцифтеескяиа ингибиторами paö—

■ ной природы (табл.6) дал основание отпасти ого к группа моталйЬ-формеитов. Проведенная сорил экспериментов по веяснонию влияний ионов различите металлов на активность натпвного Kit н его пеаг.--

■ тпвиого апоформента, полученного поело обработки ЭДТА, позволь. ла предположить присутствие в активном центре цинка или кобал!«-

.' та. Позднее рядом исследователей било установлено, что в ого йх-тдвиом центра содержится атом цинка (las 1975; Fcrnlcy,I97?).

' ' Таблица 6, Торможение активности карбоксакатопсина почек неспецяфячоскими ингибиторами

Ингибитор Концентр. (мМ) , 1w■ Ингибитор К^нц^нтр То gj*.

ЗДГА' 0,0005 48 ИХМБ 0,1 0

n 0,005 . 100 %С12 . I 100

1,10-фонрнтролин I 100 0uS04 0,1 70 •

Цитрат натрия 10 34 I 100

и . 25 100 CdClg I . 60

Ци стоил • 10 100 Мочевина 600 . 50

im ■'..•' I 0 и 2000 97

При исследовании торможения активности Кк различными пептидами (часть из них представлена на гсбл.7) бшш внявлет? некоторые закрноморности. Для связываная интпбяторов, 1шк и субстрата, требуется свободная концевая карбоксажьиая группа. Зтл данный иолучшы нодтворвдешш в работая СиьЫ&и, Ondeiti, (13Ш) Достаточно 8ф$актявшш шшабиторага оказалась шаяогв еубев-pätü со свободной Б-ющ0ВоЙ «аногрумвой й 0 1>-нт:ароа

сложного остатка в пололоиие Pj (но пэ Pj)> из кщрййззо». ьгийаоая Кк, Вшивши уодаосгояш» агпшюехз Iis Kozyv а яшэодо» ди со сшободаьгш коецовкх! гр/шс:л,

ОЗрсцео* ко себл пшшздо« ^vo ©ее шлзду, содордадо о ироушш» и нало^ошй Pj, »оргтвла сйтаззяоть Кк„ CtoSoiso шгог шгг» фзаясштачоеггез ошнзкгго, казао-

з&ц? к «сета iu>pnm~i ©вносят ебрсззЕ^озя в сдаодлззд £ П, А G ( йос-дв^-А В), краток? Er. Зог-гге-здз ,а яагхэ ваа-Uavo^i Üu» «Фищгшшж: в ед-з сгзВ С ОкйвШ et ai. t 23?lS.

езашш»» eso&as. «оржзгдя ргакша А 1

а А S баш ?сзет csc ttss с пэдяшгза es©

iiö vpuJuaÄi» UiäjJCS к&икзз ca

1С

гидролиз этих субстратов оказшэал и Бк (табл.7).

Таблица 7. Тормояонпо активности кзрбоксякотопсипа почок и легких пэптядамп и ядами зг/.эй

" Плптпгш :лоншнт:торможони0 в Т~

: шсЛ : карбокспкдтопстщ __ , . . :_; почек : легких

01у-Рго-Рго 190 65 61 .

01у-Рго-А1а 200 54 43

С1у-Рго-й1у 200 57 45

С1у-Рго-С1у-01у-Ргс~С1у 200 49 47

г-С1у-Рго-01у-01у-Рго-0Ху-ОСП^ 100 0 0

РИе-П1с-ЬвТ1 50 - 65

1—Вое—РЬв-П1о-Ьеи 100 0 «Ь

3-13-РЬв-Н1 а- 1а и 50 45 44

я 100 90

^Воо-В-РИв-т о-1ди 100 0 -

&-РЬв-1)-Н1о-1.ви 100 0 и»

Лдгаотонзап П 10 24х 24х

в 10 «■» 20

а 50 63 43

Брадикятш 0,5 - 60

я I 72 71

а 10 96 ' 96 *.

23 " 29 50. 92х 94х

01у-РЬв-РНв-Тут-Т11Г~Рго-Ьу в II ■» 50

(фрапопт Б-цэга ппсулппа) 8Х 50 тДп 81 : 92

Эфа (ВоЫв саг1пв1;ип) 2,5 ! 51 35

5,0 | 60 46- '

25 1 64 02*

50 | • 100

Кобру (Ва$а ог1 сша В1оЬтяга13) 25 I 69 . 72

50 \ 87 85 ,

600 ! 97 96

Гадакп (Т1рвга игв1п1 гвпаг41) 500 \ 30 38

1000 ! 50 47

П*зтотардняка САгИв^одоп Ьа1иа) ! 1СОО 1 28 30

^Торшхтогсш гидролиза Л 1(50 Во всох остальных опхгеах ; еубстратой служил г-рьв-Шз-Ьеп (50 мгш. '.

Кк продзарзтольно ппкубароваяз а точоппо 20 шп. о поптпдо пи пли 30 он. с лде?д .Бй добавляли одиоврогтзпко о 'субстрате:.!«

Е>

При исследовании действия на Кк ядов некоторых змей, обитающих в Средней Азии, было обнаружено, что в яде кобры и афы содержатся ингибиторы Кк (табл.7).Из яда эфы в результате "частичной очистки были получены фракции ингибиторов примерно в 200 раз более активнее, чем цельный яд. Это низкомолекулярные ; соединения (молекулярная масса около ЮОО-ЗООО Д) пептидной природы.

Взаимосвязь структуры и действия пептидных ингибиторов на Кк исследовали, используя серив новых аналогов пептидов зсг- . 30475 ( р&11д~1уз-Тгр-А1а-Рго ) и тепротида ( рСЯи-^гр-Рго : Лгй-Гго-01п~11с-Рго~?го ) с замена!.!!! аминокислотных остатков в к- и С-концевой части пептидов (синтезированы Равдель Г.А., Крит Н.А,, Филатовой М.П.), а также апологов Бк, в которых остатки проляна были замещены на его 4-х членный аналог -езетидин-2-карбоновую кислоту ( аое2-Бк, азо2,3-Бг», йао^-аао^-Бк), синтезированных на кафедре биохимии Римского университета. Было определено, что тецротид - конкурентный ингибитор; К1-14 нМ, 150-10 кМ, Для 30-20475 характерен смазанный тип торможения, ^ -140 Ш, 15д-300 вМ, Бее изменения в ;' 'структуре исследованных пептидов (кроме аналогов Бк с замокай ■ во п 3-м положениях, тормозивших Кк сильное, чем Бк) право-дили к повшеня» Наиболее сильное с5Щеошзо тормозящей " _ ткеностд пептидов отмечалось у аналогов с зеленели на обоих концах, Изменения яа клавши конце яонапептидов тапротпда п Б»: оказда&та существенное влияние на их тормозящее .действие, ' 13 более слабое, чем изменения на С-концо. •.. -

Полученные результаты указывает па то4 что остатка с.»;по-;кислот, достаточно удаленные (на расстояние 5-6 остатков) ов • расщепляеготй связи, вносят значительный вклад з .сбе-зв -евлзше- -гко гаптадо. Это согласуется о выдвинутым Нагг1о & висса (1963) ' представлением о протяженности субстрат~сщзьш1вт.цэго участка 'сктявного центра, на которой мел от расположиться Ю-чяезхкнй

?П5ПТЙД. . , .. ,

\ II, Изшкошя активности карбокейкатекегша в крот;::

-:;31вдоб а- кивэткых'* ;. - _____ „ - ••

■ '.Ргеф^ЗотЕА гэтопа опг>?яздопяя г^тттооуп.Кп г- уяюооят».

■ "; Метода.оирйдалошзя' тявностк Ек в «ияя?»., а езчело 70-:; гг, ка'гадалзсь дач' ощадолоядя его' ютавпосга и еггорэтко» Скогчтро1оте;;отячас;ше кзтеда, еэ гоьорл укт о &зо~ (ГаШл ц 1974)» оюшчовзса шдостеточвэ шезглй

В

чувствительностью. Высокочувствительные раономотрическио методы были довольно сложны, требовали большой затраты времени и вследствие этого были непригодны для серийных определений.

Основываясь на работах Сгедогтап (1967) и quilloud et ai, (1970) мц разработали условия определения активности Кк в сыворотка крови человека, В качество субстрата использовали к-замешенный С-концовой трипептвд A I г-rho-His-Leu. Метод основан на свойство гястидина', имеющего свободную аминогруппу, реагировать в щелочкой сроде с о-фталевым диальдегидом с образованием флюоресцирующего продукта, Б условиях опыта лра инкубации субстрата с сывороткой в ном расщеплялась только одна связь -Phe-His- н освобождался дипептид His-Lcu. об этом свидетельствовали данныо хроматографии на бумага и в -он-ком слое и спектры флюоресценции. Дальнейшего гидролиза образовавшегося дипептида не наблюдалось. Зависимость этого процес-' са от ионов хлора и полиоо тормояешю в присутствии ЭДТА (20 ма<0 свидетельствовало о том, что рзлкция отщепления ills-Leu , осуцасгвляотся только Kit, без участия другая протеолятичоскях • •формантов» находясдася в сыворотке. . ..

Била проведены исследования зависимости скорости гидролиза субстрата от рЛ, времена инкубация {от 30 ьан, до 4-х пес,)» количества сыворотки (0,75-7,5 шел) и 1со1щонтрецяи субстрата в пробе (2,5-60 мкЧ), л установлены оптимально условия опрадоло-шзя активности Кк. В этих условиях нпзкоколэкуляр^шо сослана-ппя CHBopoTJtH, содеряащзе свободные аминогруппы, т влияла на уяворосцондаю проб, что, очошдио, объясняется малпл содержанием шзоротка в пробе, Количество обнарулявсо?:ого щ.а-1еи соо~ ■ яазлядз 93-97^, "'К-

В рэзультато бил додаозев простой спсцвф-тчпн5- л-'высоко-^ чзвотазгаяьвнй мотая, шашяяазй оцрадшдоь пктавпость Кк з 3 кал скворотяа. Это? катод йспользоваля зда, глпппл < стран:; * Бяязнзй .t «ему коход бш црэлзши иослрлысо шэднеэ. frlcdiend а зтв?з%в*п». 1975)« Различию г,адп$п1шцяя 'oioro фладрипгтп^о-; озеогэ г.шода аеп&лъэуитоя я а пссхолгза. эрс.гля'зесдодоветолягл; ет зсая 8Гфэ0 ' ^ у .'■.. \v,;.

. щ оозшзйзз ясвггавойаяйя езвддокЗ 97 яопороз-ir охаглох"«. '•яегзЯ o0ptxtaas соятэдшка дашшх йщ-йегшяйкз грозега. ,ar;V| ззвноехз Кгг у тшаэка в кор::э5 ггЬйэй '

Активность кпрбоксякатепсинд .прв гипертонии. При исследовании активности Кк в сыворотка (рис,3) больных рено-васкзн лярной гипертонией и гипертонической болезнь» (совместно с Рат-пэр H.A., Герасимовой E.H., Некрасовой А;А., Институт кардиологии АМН СССР) было обнаружено, что в группах больных с более высоким уровнем АД (рено-васкулярноя гипертония - 130/^0-270/ 150 им рт.ст, и гипортоничоская болезнь со стабильным течением (П Б стадия) - I3L/90 - 220/150 т рт.ст.) наблюдалась более низкая активность Кк, причем самые плзкяо значения активности отыэчшшсь у больных о налболов высоким уровнемАД. У больных о лебильньш форигш гипертонической болезни в более низким АД (стадии I Б -110/90 - 150/100 ш рт.ст, в П А - 135/75 - 170/ 100 tös рт.ст) средняя активность Кк бала близка к нормальной. В группе больных о пограничной формой гппартоничоской болезш (обследованы сошэстно с Соколовой I.A., Ленинградский ыадацес-скпй институт), у которых АД находилось на верхней границе вориы, по отличалось очоиь высокой лабильностью, уровень шгеса-

Рсс.З. Активность кярбоксякагвпсина сыворотка.

I - доноры (97 чал.); 2 - рвно-васкулярная гвпертоння (32 челн 3-5 - гипертоническая болезнь: ,3-1 Б стадия (17 чел), 4-П А стадия (10 чел.)} 5-11Б стадия (15 чел)} б - пограничная форма гипертонии (45 чел).

Прз исследовании у большое разных групп (исключая погра-иячпую форгау) вляяная фзэетеской нагрузка алп фуросеипдо обпо-ругалось, что во воох группах чоа устойчивое уровень АД, теа копэо Еыразена колебпнвя активности Кк«, Про отсутствия взиэпс-пай со сторона АД уровапь активности такко остазадся без кэпсС. по коияяся в у больных групп I Б о П А с уроваса АД близкой к пормальнсыу, 18

Получению результат» даля осиовопяо предполагать, что сняжоняо активности Kjc алзороткп у большее гзпортонлой колют являться компенсаторной реакцией организма в отвот на повызо-ияе АД, Еозмолшо, что Кк сыворотки в какой-то моро отражает (Velletri & Bean, 1232; Ungar et aL,I985) лзмэнония, происходящие с момбрашю-связашшм ферментом, которому отводится оо-ПОВНОЯ роль В рогуляшя АД (Unger et al, 1901 ; Waebor et aL,1<3B0).

В пользу предположения od участии Кк сиьоротки в адапта-цаогашх процессах свидетельствуют результат», полученные в дальнейшем при клинических исследованиях (совм. с Соколовой Л.А.) я з зксяерамэите но лдвотных (совм. с Шварцем Г.Я., ВН10МИ; Молчановой Л.В., Лаборатория общей реаниматологии AÎ.3I СССР). Так, в поря од становления у крыс роналыюй гапертон'-т/ развивающейся поело оперативного вмешательства, постепенное повышение АД сопровождалось шетоиешшм снижением активности Кк. При тормоленяи Кк введением его специфичного синтетического ингибитора каптоярила у больных с пограничной формой гипертонии я у крнс гяпвртонзивннх (ренальнвя гдпортоняя) я нормо-. тенэнвнкх, находившихся на нязкосоловой доэто, на фоно снияо--ния АД набладалось увеличение содержания Кк в крови. У собак при экстремальных состояниях, когда наблюдаются рззгшо коле(5а~ кпл АД на протяжении короткого промежутка времени (3-6 часов), отмечалась. противоположно шшравлошшэ изкоиония активности Its я АД.

рдкзшшц. . активности, кдрбрксякатйпо.пна, длазик х, собаку рдс^оарнпмапиогого'^^пирд^« Опытн проводились па трех группах собак, у которпх создавалась разныз голода торта натьиоуо состояния, впззоилого различные воздойств'ля?.'.-! на организм, о последует:?.: о"хивлопяом глвотпого» В пзрзод клянпчзской счертя а в 00раио паси «оеотшговиталышго пэрюдл у irai рэметрирстп-¿а уровот» АД я чороя опрадвяошпга промеяутгеч -вроггзст оерэда-ляди активность Кк ®мзш <rnce4),

Позучвтш» рээужадти пэкязлля, что аа врзпвз-

шазьтпп рахпчгЛ я пртчпяат, тезэттк сасгеяг*© 1Ю2даго«г03

СГОрП .«„VI TO^Kft OVrjOTOfTî» !Я8ХЧ1, 5»ряй«эр CCOmSSRSS 5£Я>»

r.:-vt ЗД а аготривотл Фи ojpmcwsrci тч еозл grpss гдешта: sr> гоглгп. ГС fis кпггякт rîcvt, па яэторзч щтовтстая *щяя?>» ЛУ-ЭДЬШГЭ ПГГЭКЮТЯ Ш Я ЯТтайСбСТЗ ?Л SCfüra»0£S!f3 я

гг-гюЛ типпи oiwroa» »"vj эг'ч ъяякгтпгз юотаггэ

Ï0

Рис»4. Изменения АД и активности Кк ъ гшпзмо крови собак при терминальных состояниях и в гшрпмо часы восстановительного периода.

А - компрессионная асюмия мозга длительностью - 20 мин; Б - гипо-тензия в течение 2 чао., вызванная кровопоторей с последующим острым кровопусканием, приводящим к смерти (длит. - 2 мин); Б - электротравмА, клиническая смерть длительностью 10'мин; АД - , мм рг,

ст; активность Кк -----, нмоля освободившегося И1п-1ли»мг"1«чао"1.

деется отрицательная корреляция. Ток например, период клинической сморти организма характеризовался повшошзеы активности фермента, что должно вести к увеличена» образования А Л, б налрпшоно на восстлновлвнир сосудистого тонуса, KoyunouoRlu (1984) наблюдал существенное увеличение активности Фермента в легких крис при геморрагическом я других вадах шока, с Traahte (1978) - резкое увеличение {в 12 раз) содерканая А П в плазггз кошак пра геморрагическом шоке.

Ш. Фактор« рягуляшш актйвноста карбоксякатепсшш в организме.

Б организме постоянная ронляшш активности формантов осуществляется во многом благодаря взалкодойстшт Ферментов о ks &кдого!oíыми ингибитордая йди актяваторгш. О механизмах, участпуседх в контроле активности Кк в оргакаэиэ, до пастол-z,oto вро&ш йрактачоска начого но известно.

Нила бшш обнарукони я ига бк тори Кк и крова л лоПкоютЕг (пеЛтрофплах в шноядорньрс) человека в бика, & свповдшапоП еедкости больных артрпте:.®( a yais:e в почкг.х и л&гкпх бш»в Ото пазкоиолекулярниа сооданоиня паптидноП прзради. Дыдаз о посателаю прясугспкя шотабвторов в езчкаг п легкпк бээдвсз бшк водтсорздоад ЫоЪегвдп & Cuatro (1903), поторио гягх* села, ч%й вш'йбйтору Фэрсаиюс содержатся ь етпх с ьо raoras другая «иадях человека, Пр»су*ствае швюйэлояуяпртк шасба-горэа £ Прок. tíüíO оздтфздоно nact.to ot til. (I98S),

Ингибиторы, находящиеся в кропи, легко могут контактировать как с растворенным, так и с мембранно-связанным ^ормонтом, расположеьнам на поверхности эндотелия, и влиять на тонус сосудов и уровень АД. Известен ряд состояния, сопровождающихся сниманием активности обоих форм Юс, как например, при гипоксии ( Davidson A Staloup, 1984; Szldon et al., 1980), при воспалительных процессах В легких ( Fourrier et ai.,1986) и др, В пользу предположения, что в ряде случаев снижение активности 1С« может быть обусловлено взаимодействием ого с образующимися в организме ингибиторами, говорят полученные нами данные. У больных с респираторным дастрасо-синдромом (характеризующимся скоплением нейтрофилов в легких), у которых активность Кк находилась на низком уровне (1,2-4,4 нмолой Hls-teu 'wr^-fiif*) содержание ингибиторов в крови было существенно вшо, чем у здоровых доноров.

На основании хорошо известных данных о повшеняа содержания Бк в очаге воспаления я об активном участии различных.видов лейкоцитов в развитии я поддержании воспалительного продео-са возникло предположение о возможности присутствия в этих клетках ингибиторов Кк. Поскольку в организме Kit является основным ферментом, янактивирувдшл Бк, торможение его активности моаот быть одним из механизмов, обеспечивающая увеличено кон-цонтрацаи Бк.

Пра исследовании лазатов нейтрофилов я моноядеринх лейкоцитов,- 1юлученных из крови доноров, было обнаружено, что они тормозят активность Кк почек, Лизатн нойтрофялов тормозили Кп примерно в два раза слабее, чем лдзатьг мрнонуклеаров, Было по-' яазано, что наблюдаемое сняяешо активности Kit ш является следствие» его разрупеяпя протоолитачоскимя ферментам лвйко-%.^ цптов, В условиях о me а но происходило инактивация Кк или рас(> рувопяя субстрата ( s-Phe-His-baa ) дли продукта гидролиза (HlB-latt )лаэота?.«л обоих видов лэйкоцитов или их ультрсфальо-рата?,ш, прошодапма чорээ гшброну JÎÎ-3 ("/шкон")* Ингибиторт?» содорятэдся з пЗйтрофплате п гопоядораня лоЯкоцптах, двлжлоя Topi'o— н îfflcjîOîoyoïoïïra'Bs.a пппкототлзкуляриюлз оооддисюшма еэтадпоа арзрэда» ' Ппаубоцзд о трзпояио?.! яла жячртежеи щцаотао к суоогозипкд? шзога (на 75^50^ п <15--*С5;?5- сзэ" rcïCiJ3SH:io) nz пнгйбярупдэЯ агшвиосп прл oanonpçttonncrt яр-роем еклзоьзота? нрпчетз ояжокп'о тор^хзяцого дзЗотт^й гж:0г>

Й.Т

торов из нойтро^илов било выражено слабее.

Полученные данные позволяют предполагать участие Кк в воспалительных реакциях оргшшзма. Зто согласуется с мнением ШКог.г. ег п1., (1985), которые рассматривает вызываемое глю-кокортикоидямл увеличение бносянтеза 10; кок один из механизмов, обеспечивающих их противовоспааятельное доЯстшо,

Е качество примера образующейся при воспалении жидкости, в которой отмечает л повышенное содер-шше Бк (Ееромеешсо, ' 1977) была яеслицомна (совместно с Дяакомелло А., Салерно К., кас{е?фа биохимии Римского университете) синовиальная жидкость (СХ), аолучонноя из суставов (локтевого и коленного) больных различными ^ормлмл ертрптов; находящиеся в ней клетка удагяля ___ центрифугированием. Слезет отметить, что в СЖ всех Ильных ба-. ли обнаружош но только ингибиторы Кк, по и сам Формант. Присутствие в ной Кк (о чем ко било известно ранее) било подтворэде-но в опытах с использованием ого специфичного ингибитора тепротида, полно стьи тормозившего гидролиз субстрата. Источником Кк, находящегося в С" могут бы п. я моноциты а ыакрофпгя, которые способны сннтопироветь »тот Вермонт в выделять его в окрука»-ИЦй Ър&ЩГ <?г1вй1ппа 1978; УуНг<;и181; ot а!., 1983>0

О особенности В присутствий ЛИМФОЦИТОВ ( 1лиЗе1ч1п1е & йоЬгЪаоЬ, ЗЙ66). На возможность такого происхождения Кк указывав? о нааи данные} клетки, полученные из СЕ содержали Кк. Однако, не исюкь чается возможность попадания его из плазмы, тем более, что прл воспалении проницаемость сосудов повышается. Тормозенио актав-иостп Кк почок ультргфттратоы (мо^рана РЫ-30, "Ашкон") разведенной СЕ на 40-501 указывало на относительно высокоо содержание в ней ингибиторов. Можно полагать, что присутствие Кк в ого ингибиторов характерно но только для СЯ, Мы, обнаружила оба компонента к в бронхиальной жидкости, полученной прл бронхоско-гш больных с респираторным дястресо-синдромом.

Присутствие ингибиторов в кидкостях, обраэукахсл в результате воспалительных процессов, также дает основание предполагать ях определенную роль при воспалении. Они могут освобождаться пз нейтрофплов плп вследствие секреции аятивироватига юготкеш кле/и » результате ех гвбедп, а таяяо из коллагена соошштолькоК ткани, усиление распада которое наблюдается пр;; воснйяошш, ОпМка «г <197^>) показали, что пептиды, продукты рйсп&да кешагеновкх ткокоЗ, ?ор.\соэят актпгность Кг;. •

Обнаружение ингибиторов Кк в uolt?po<taax ладо нал основание предложить гипотезу, позволяющую объяснить механизм влияния нейтро<£ш1ов на проницаемость сосудом при воспалении, До настоящего времени, насмотри на многочисленнее исследования и рад предположений (Lewis & Granger, I98C; Огдоблииа, ХЭШ), остается нолснитл какао именно вещества ответственна за воздействие иейтрофилов на эвдотелиальнио клеткя, приводящее к пролонгированию действия Бк и простаглаидинов, расширению сосудов и увеличения проницаемости. Предлагаемая гипотеза модот, по крайней мере частично, восполнить этот пробел, Косвенным подтверждением еа правильности слуяат дагашо ряда исследователей ( Llndgren et al, 1987} Нояеа at al., 1980} Inoekuta et ra,I983j DiRoaa ot al., 1985; Snyder ct al., 1985).

Тормояоныо активности Кк,очевидно, но единственной путь пролонгирования офумста Бк.Такая лязненновакнал реакция организма, как завдтная, должна включать ряд взаимно траярзвдаашгдхся механизмов ответа, обеспачиваодх эту реакцию, Нэ шшконие разрушения Бк вследствие юрмоления Kit эадотолиальннх клеток ингл-. бяторемл, выделяющимся из находящихся поблизости неИтроХалов, - это наиболее продуктивний нута местного увеличения концентрация Бк, необходимого для развитая воспаления, том более, -iro Бк такао .макет освобождаться у эндотелия (Nolly- et al., IOCS).

В процесса исследования сеоеих нзйтрофалов человека било обнаружено, что она выделяют в окружамцув среду фактор, визн-вешпй активацию Кк, Степень актльецап загасала or концентрации клеток в суспензии, наибольшая активация (на 100,?) наблюдалась при 5,10® кле?ск/ил. При блокировании 1Ск топротядом гидролиза субстрата но наблюдалось. Проведение ¿ада равддчшк вариантов эксперимента гокзпапо, что ми имела дала с истинной тавашой фермента л нсблюдагч ее мшесямалышй зйфзкт» Фактор t отлпчегтея тормсгуо;ой''Ш2ас'гьо, ого г.'олокудпрпая масса около Si) кД». ' . .

Обнаружение активатора Ite л пвйтрофплох во противоречит .; ДбПВШ ОТШХШУОЯ&Ю ЯрчиуТСТЕПЯ в imz ого яигябпторов. Bf>-H3J>" T;:tx, азвоотзо, что 'пойтро&ьтн кохл цродуезровать ЙбПЭОТВУ пр>-.'raBOjio.aorxitoro дэйскпя. Во-вторнх, агтгарустй It's сектор «Зш> руянвгяся я растгорях» вдраига лэ сусяояззп, содор^г.г:зЛ . . 3«IC5~ 5»I0'J ллоток/m, llpn ковцонзрахрп клзюv/m ojysi** с а.. жзглцза но нЕблщ-гюсь, Для .получопзя .тлза-га, окггэпзег;:*>-

го максимальное тормогснае Кк, кснользов&лп суспоизн*) с копцак-уршамИ !1о11трс4.и.ног1 7,6-10^ кд«ток/мя; уъолвчсшго дошентрмм апогоя приводило к ашкепйю яигнбвроняшш тлучттт растворсчл. Эта особенность но находила объяснения, пока но бнл обнаружен активатор,

Подтнорздоние присууетшя активатора в организме било получено при йсслодогшши бозОелковшс цантрУЗугатов сивороткн боль-них с наслодсгмнииЛ недостаточностью С1-инактиватора системы компломонта, у которнх в крови постоянно происходят актпвацпя каПгрофилов, наблюдается повшонндя проницаемость капилляров п развитие отоков. Поименно (или увеличение содержания) активатора в кровп таких больных, по-видимому, таюзд мохшо рассматривать как защитную реакцию организма, Определенно активности Кк в си-воротке этих больню: (32 чад.) показало, что она несколько сне-сона 9,9-*3,2 нмолей Шп-Ьеи .мтГ*).

Совокупность получению данннх позволяет предполагать существование системы эндогошшх ккгкбигоров и активаторов Кк, контроля ругхцэх ого активность при различных фязпологкчоекдх л патологических состояниях. Измоненло содорианпя этих вещсств в отдельном участка для в циркулирую®)!! крови может отражать, ко крайней море, два процесса: нарушало, саособстиугхзоо развития зеболованпя или, напротив, актинизлцяю адаптапаонннх раакгезП организма, стремящихся скомпенсировать возняизее нарушение.

1«, Влияние торможония активности кпрбоксикатопсяна в ршшем постреашмационном периоде на восстановлению функций организма.

В начальном периоде реанимации нобллдьэгея глубокае рао-отройства кровообращения, со про возд ммдп о сл спазмом сосудов с ЬУорачиоЁ гипоксией, что кокет приводить к гибелш тканей. Сче-■ш1, что торможение активности Кк будот виз тать рашйрзипо сосудов й улучаоилв крогослабяонпя органоь о, в частности, мозга, ку врадлсашш о полью ослабления клп продотврашоняя осяохаюняй, рьашшаздхен » розультато гипоксии тканей, использовать шшз-бйУОр Кк тонрогиц, Йойкольку топратпд вытаивает понняонпо АД, о пзрзщттйя, лро»одяш$ в поряод сшзвлекая* иаправлонн вначале по нойгашипе АЛ, п йатои на поддоркагао ого на определенном уроглкч, й йаяачу иссяйдоеанпй рходкло подобрать усягишя йео-джпн ^оироуяцл, при которых улучпазтея про??»снпбяо1шо органов, но во происходит снр.?;с!Шп АД.

агл ^j.'zfrüM,*

»Ci iJ

nycca n»

Fno.5» Влияние прододаитадъ-иостл введения тепротзда: А- в течение 6-7 май; Б- I час; Б - 3 часа, АД г

--j активность йк---г-

ихола His-Leu 'ШГ^.чао .

В экспериментах (совместно о Молчановой Л.В., НоводерхшюЙ ' И,С.) на собаках, поронесиих 17-ти минутку» клиническую смерть, внзвтшую электротривмой, топро-тид (синтезирован Крит Н.А..Филатовой М.П.) вводили (внутравой-но) на 4-5 минуте восстановительного периода. Продолжительность вводе кия варьировали от 5 мин. до 3-х часов. При одпоиоттнои введении наблюдалось резкое падение АД, которое с трудом '/далось стабилизировать ПОВТОрИМ«! введена®.«! адреналина я норадрз-иалина (рис. 5 А). С увеличением времени введения тепротлда происходило сглоливашю кривше АД а активности Кк шшзиы. Капельное введет! о тепротида в сочетания с реополиглпкянсм (для компенсации расширения сосудов дополна-тельннм обкомом .тадкостп) в точение 3-х часов, но сказываясь па общем АД (рлс,5В), визивало увеличение скорости кровотока п 2-2,5 раза и улучшение кровоо-

найтчоная органов. Это приводило к улучяэншо конечных результатов реанпмацац. Все гшвотнне» получавшие тепрзтид и реополя-,... глюкан, вюиля, я у них отмечалось полное вадзмоа восотапов-т1* нив неврологических функций. В контрольной группе собак, но получают* лечения, все яаиоишэ погибла, В группе яивотиах, яояучавачх только рзоиодигдтаиш, втгшло 7DES» ко у кях отдача-; лось зддохпапюсГ я вояолноа восстеповлоиар фуитщй ESW,

, зжшш

РЕГ)рСбОТШЕП.?Л ИГ.Г1 ГПТОДОЧ Т!П!3|)Т!?,*3 dura ПОДУЧСЯП ят5П5Кзгя пЫ5тратйня ярзташто, обмяртоязм iiixrrt а-гочк.тг"; 0нкз п наззепагл порбокегшатоггеппэм, ihynotwo $чэ"1г0-*пглч<&«* idx з аазшлкпаоках свойств дозволяло ыатчъ ого sopoxTocrnr} oc6dmnoc*r:i л лэЗоэтяо ла (Тязмологачяокзо поптвдн А I и Б.ч.

' . . 23

Впорвш tí ил о показ tum вопреки сущоствопанаему предо т&длегаху, что один ii тот ко Формант образует проссорний поптид А П и инактивируо* Aónpüccopsíuii пептид Бк, На основе анализе собственных и латоратуриих данных ьццвпнуго принципиально новое положение о взаимосвязи poiUiH-anrnoToimüHotoü и калликрошж-кппа-повой сиñrof.í s регуляции дд и о 1усочовоС род;: Кк в {¿ушщлонлрс-eskui; агих еисуом, оказываздях противоположное дэйстгно па АД» Иродетгилошю о клычоьой роли форнонта в дальнеПшом послугЕло отправной точкой для соз.иашш высокоэффективных ентиглпортон-оимй» средств, ааящзхбя его ингибиторами По датшы ряда ко слзййЬМ'слоЙ, i) ùpràiïijauù Кк явлнзтся основным Фср.\:оп?о;4, обрг-À ïlj рмруаав*- бсиааую часть эидоготого Бк с наполняв? ЙСЙЩ'0 роль ii регуляции АД.

Праддо^йтшй и или яли клинических «садодовшшй простой OKHlPtyPiituS» ö шеогчочувстшп'олышй tatos, определения акткв-lîoôfi! Г* ïs ÛUHôpôSKù аш1й позволил установить продели долсбÍP* G3ft ого yptmvi ь йориа а провоста вобдодевшш сто активности ода различных йагодогйче&чдх соошашях. Поаучапнио результата

осиовшшо сдолать иывод об учаеяаа Its: и адгштацаогапа росг,-iüwiX öprtawaua, направленных на воесгсаовлошо «овального кро-вообргтагши Кромз тох-о, im основами г&дучоиних данных возшя> ло представлению, что Kit нрпшшаот учестао с и сложном ¡»угисп-С0 рзакшШ, составддйздх зстатную воспагип&зслзуй рэйкцаа opr¿-шгзма.

■ » Вэсзиаюйотвнв форздптов о es mssanropexs «даются одк:: es «yïefî $о*уляцаи ах ективностп в оршезыа, в «оик> продпалс-т&хъ, Что оОнйру^огйшо üísri энцогошшо сг.глбатэрн б йэтпвотор(и) iCa eusaï ^ыййологачошзо значение. Вцявлошю вадогошшх модуля-vopo'B сдута* основой fein сияспокнл Опохйшчоскях «Ханкала рсг~ гуляши йКУйвиоота формантов в оргапязмо в способов воздзйстеэд ïia гшх,

"fojKùssiœo Кк раос^атрапйзтсл на совршлонно»! отадз как одзл на кагболбз йорспактсвгаа одтой лачвися пшзртензивнш: ooosoííkííI» В рзаудьтйа cöraocriffis о ЕШ'йКЛ ясйзодовшгЁ, поо-вдонних аалшл изрорадыпхх nnrcdcropaa Кг., бит; предложен оф-црапарет а качоотвэ потенциального ыш!гапартсиз2БНо-го ср0ДС1ва, Ираитячйскай ьнторос яродстгашот и результаты прдконоия внгяботора 'Кк прл разгаширз.

БШЗОДЫ

1. Изучение обнаруженного наш в ¡topo попок бш« протоо-литдчоского Вермонта карбоксикатоисина, который нносоп в "Номенклатуру ферментов" под названием дцпептидчлкарбоксипептида-заА (КФ 3,/1,15.1),приволо к расплфронко ого физиологической рода. Установлено, что он ката/шнрует дае биологически' пшнно реакции: образование прассорного пептида А П л разрушение ден-рэссорного поптяда Бк, т.о-, является одновременно компонентом ропин-ангаотонэиповой а калликрепн-мшиновой састом. Выдвинута концепция о его югочовой роли в функционировании этих систем,

в регуляции в крови и тканях котшнтрации А П л Бк, определяю- -ипх состояние сосудистого toiryca и yponeitb АД,

2. Разработан метод выделения високоочшцотюго препарата Юс из почек и легких бнка и иесдодомнм физико-хямачеекио,и зк-зиматические свойства обоях ферментов, Формонт» из почек и лог-кях идентичны.

3. Изучение специфичности действия Кк на синтптическио .пептида показало, что он а) отщепляет дипонтидн о С-конца субстрата, имеющего свободную концовую ¿¿-карбоксильную группу;

б) характеризуется широкой специфичностью: гядролазуот пептида различного строения? ч) ряс^опляят вложио-яфярную связь; г) тто глдроллзуот связь, образованную иманпгруппой проляна, 06-пардезоян и. другие особенности действия Кк на пояткдм.

4. Изученио гидролиза физиологических пептидов показало, что Кк, отлеплял С-иопцовоЯ дапзптяд от физиологически на активного доиапопгада А I, провраяаот ого в повстгаяай АД А П, кото-'риЗ но подвергеется дпльнойао?® рашпиошпо и тормозит активность Ф>ор?янта. В то ло прею Кк вмэмвао? инактивация • антагониста А П - Бк, отдогияя от пего последовательно два дипептидл; 13 образование А П г р?зруиогао Бк подтзорядопо биологическ»:^ гэгодгаа» Получончио дагагао шелушили основой в рас«яфровко ого роли в организме.

5. Исследование тормсглния активности Кк пептидами различного строения"показало, что я) для взаимодействия ингибитор ра {как л субстрат^ с.£эр?«штом ветш• свободная.С-псящовая дацй01'.силшяя .группа; ¡i) цзптлда, содержат .остаток пролила • :з лояэзояял ?р яалшгед нпгябяторп???; в) поитядл,- содерха^о (Золго 5-6 остатков, пгл-^пдпиэгог, сяязнвсзтся по двуп участкам.

G.. Разработала умогля хщ опродеяокпя активности Хз в сц-вороткэ крова члясвсяа вчсодочувствятгльшгд ^тюортнэтричосгсям

; 27

иотодом. Установлен уровень ого активности у лэдэй в норма. Исследована активность ÏCk у больных рено-васкулярной гипертонией к ГипортоничоекоЛ болознью, а так&о у собак при вкстромалынос собгоя»шях и ирис г процесса становления вкспериментальной рз-ндльной гипертонии. Получотше данные, а также изменения содержания Кк в крови человека и крыс в ответ на торможенио ого активности каптоприлом позволяли придти к заключению об участии Кк сшороткя в защ,. :тос компенсаторных реакциях организма.

7.0бнарухоим эндогенные ннзкомолокулярныв ингибиторы Кк гиптадной прароды в крови л лейкоцитах (höйтрофклах и мононук-лаарах) человека и быка, ь синовиальной гидкости больных арт-ратммя, a таюхо в почках « легких быка, Предлоаона гапотеза, позводяидая объяснить механизм влияния нейтрофилов на прокздзд-иооть сосудов при воспалении,

С. Обнаружен активатор Кк, выделноыый нейтрофнлаыз человека в окру«аедус среду. Показано его присутствие в крова.

9. Исолодопашзо торгисашная активности Кк у собак в ракиагл кар:; о до реанлмацпя показало, что каделадоо введение ого янте-бптора топротида в сочетании с роогкишглюканои вызываат cyeicr-вонпое улучаонио кровоснсбаонкя н приводив к иовьаонаы шга;вао-мостн животных и снижению построаникацпокных осложнений. Эта данные открывают порспактиви использования ингибиторов Кк прз роышыащш.

СПИСОК РАБОТ, ОПУШКОКАШШХ ПО ТШЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Елисеева С,Е,,Ореховач В.Н. Выделение в изучение спз-цлфлчнооти корбоксякйтопспно,// Докл.АН СССР.-I963.-T.153» £4, -С «954-956,

2. Евтпхпна 3,©.,Классово Ю.Е.,Леляит Я.И.,Ореховпч В.Н,, Слрфорова К.О, Виполеняо, свойства в специфичность действия ткановых прототт.// 1-й Всесоюзный биохимический съезд,-1Ш.-В.1 - С.84,

3. Silösesvn ïu.E. ,OrokhoYloh V.II. Charftct«rlr.fttlon впй epsölfioity of eotion ot onrboxyonthepaln. // YIth Internationel CofiKT.MtioVvco., Afcntrtotn. Не* York,-1954.-V.4-127.-F.

4. Елясаовп D.E. Протепназа почек - карбоксакатопсан.// 2-fi Всосокшый <Зиохяьачсскяй съезд. Тезасы секционных coo6ï;o-пяй,-1969 ,-С .В.

8. Елисеева С,Е,,0роховзч В.Н.,Павляхппе Л.Р.,Алексоенко Л.П. Карбоксвкатопсвк - клвчевой <}ср|«шт двух систем, рпгул^о-щах кровян ое доля тгз//Вопр. м ед. хвпта. -1970. -Т. I в, £6. ■. б 46-6 49, 28

■ s. silaseevu Yu.E.,Orekhovioh V.H., Pavlikhina L.V., Ale-xaanko 1.Г. Carboxyoathepoin - a key regulatorу component of tno phyoioloRloal ayateno Involved in regulation of blooi pressure.// Clin. Chim. Aota.~1971 .-V.31—P.M3-ii19.

7. Елисеева Ю.Е,.Паилихина Л.В.»Орохошч В.Н. Вццелонно карбокемютепеша (лептид1ш-дипептлдази КФ 3.4.I5.I) из почек бшт.//Докл. АН С ССР.-1974.-Т.217, М,- C.953-95G.

8. Орехович В.Н..Злясеела Ю.Е,, Паалгсоша Л.В. Роль нейт-ралышх протепназ в регуляции сосудистого тонуса.// 3-Л Всесоюзный биохимический съезд, Теэцсн сшнозиалышх докдадоа, -1974. - С.305.

9. Орехович В.Н,.Елисеева Ю,Е.,Шишшша Л.В. Значение тканевых протеолитичеекпх ферментов а регуляция ряда фушсц"Ч организма.// 17-й Всесоюзный съезд терапеатоз. - 1974. Тезиса.-

1974.- ГЛ. - С.69-70.

10. Павдихина Л.Б., Елисеева D.E., Позднов В,О., Орехович В.Н. Определенно активности карбсксякатепсииа (яептядил-дилоп-твдаэы) в крова человека,// Воцр.мед.химии. - 1375,- T.2I, J5I.-

,',0.54-60.

11.- Орехович В.Н.,Елисеева Ю.Б.,Па1шшша Л»3..Негозскяй В.А., Молчанова Л.З. Ферментативные основу регуляция соеудасто-го тонуса при экстремальных состояниях.// Физиология человека,-

1975.-Т.I, С.310-316.

12. Елисеева Ю.Е..Орехович В.Н.,Пашигхвна Л.В, Свойства

л специфичность дейстпая карбоаошяепезиа (нептидал-дтшизда-сц) почек бшг.а.// Вопр.мед.хишш,- I97G.~Т.22...01-С2.

13. Егорова Т.П..Елисеева Ю.Е. Действие карбоксикатепснна на биологическую активность брадякишша.// Вспр.мед.химии.-

1976.- 1,22, СЛ19-Г22.

14. Елисеева Ю.Е.,Орехович В,И. .Паплихпна Л.В. Карбокси--катепеш (пеятядшг-дилептадаза) легких: ввделеинз и свойства» // Ьюхгги:^.--1976.- Т.41, С.006-5х2. _...... ..................

15,Орехович В.Н. ,Елисеева Ю.Е. .Шишкина Л.В.Эцзнмологи-чоезиэ фютррц рбгудяцаи сосудистого товуса,//Веотн.АШ иОСК-£Э73;< J59«' -0,42-4^; ' . ' ' ' ' Г ' '

; 16. Памншша ХВ» .¿¡лвозола й;3.,Поздпез B.Q.»Ррохолич В.Н, ^увотмкгольинй ^гахгрметряпзезий метод определения аддрвеи'/ овшатгсзка (поптядал-яшелтядаш) а еищротйо ig>onx чзяоиска « по тряпштяду шгкотонзкгт I.// Со^-рзизгш-з tsotmt я йзохтя»-1U ,1977.-0.147-1 Si.

....... . яэ

17. Паплихина Л.В. .Елисеева Ю.Е. Молекулярные форш попте-дкя-дипептидази - фермента, превралишцего онгиотензин I в ангко-тензин II.//4-й Всесоюзна!! биохимический съезд. Тезиси научных сообщений.-1978.-T.I.-С.241.

18. Орсхович В.Н..Елисеева Ю.Е..Паалихила Л.В..Неговский

B.А.,Новодррслсгага И.О..Молчанова Л.Б. Действие sq-20881, ингибитора j cap б ок сшся т cri с iï и а (ангиотепзш I превращающего фермента) на периферические !фовообращение в раннем постреанимацион-пом периоде.// Докл. All С0СР.~ 1980,- Т.250. Ш.- С.253-256.

19. Елисеева Ю.Е..ПовлиХниа Л,В..Поэднев В.Ф..Ореховнч-В.Н. Эстершнпл активность карбоксикатепсина (дяпептидил-карбокск-пепткдазы, КФ 3.4.15.1)// Докл.АН CCCP.-I980.-T.254,}&,C.I476-1478.

20. Ciaooanllo A., Salerno С., Faeella F., Elieseftvs PavllVhlna L.lf. Attivitd dell' ensyran dl converoione nei llq«i-fit elnovlall Infî/inaiatory. // IV Confirms Latin fle Ehuamtologie., Liege (Belgique). CoftMunloRtion НЪгвв. - 1980. - У.12.

21. Blinaeeva Yu.B., PavllKhinn L.V., Orekhovleh V.K., Oie-ooomllo A., Snlerno C., Fonelln Г. Evidence for the Jirenenoo of dipnptldyl-ortrboxyppptidnno and ita Inhibitors in inflammatory uynovinl fluidn.//pioohie,Diophjrn.Aetn.-19ai,-У.65П.-Г.165-168.

22.Шварц Г.Я..Пасхина T.C..Егорова Т.П.,Шшишша Л.В.. Елисеева Ю.Е. Влияние унитиода, а-пенициллашша и цистекиа на биологические вффехтн брадикикииа ц активности карбоксшептЕ-дьэи к й пептидкд-дяпептидаэы.// Х1шнко-фарыац.2.-1981.- £0,-

C.18-23.

23. Орехович В.Н.,Елисеева Ю.Е.,Па1шшша Л.Б. Роль пепти-даз в регуляций сосудистого тонуса.// Вестник AMI! СССР.- 1982.-№.- С.34-38.

24. Поздней В.Ф..Елисеева Ю.Е. .Паалкхши Л.В..Ореховлч В.Н. Влияние отроо!Шл алкилыюго радикала урстановой бдокирущеИ группировки на рпсщеплоиле карбоксккатепсииш три- в тетра-пеп-ÏKKIDXX субстратов.// Егооргаиич.химия.-1983.- Т.9.£2.-0.232-236

£5. Елисеева Ю.Е.,Павлихяна Л.В..Козлова Н.И.,Барсукова U.C. .Срохоакч В.Н. Об штгкбиторах карбокснкатепскна (онгпотен-сш I «рзвршцавдаго фермента). содерхецкхся в биологических зкед-г.оотях в леСкоцзтах человека.// 4-& Всеооганий скадпозцуи по ьо-дшсшокой окзелологпи, Алма-Ата, œa. 1903.- 1983.- Тезка; С.90-93.

26. Орехович В.Н,.Елгсеова Ю.Е, .Павлихша Л,В.,Крит H.A., Филатова М.Л. Пептпда-шгглблторц карбоксикатепспна (иептидпл-днпсптвдазц А) я за значено для клинической недацшш,// Вопр. мед.химии,- 1981.- Т.30, C.5I-5G.

27. Орехович В.Н.,Локшша JI,А..Елисеева Ю.Е,.Павлихкна Л.В. Роль протеолнтических ферментов в регуляции физиологических процессов.//Вестник АМН СССР. ~ 1981.3-10.

. 20. Яхонтов Л.Н»,МпстРфанова Л,И..Евстрлтог-а М.И.,Шварц Г.Я, МшлковскиЯ М.Д.Уурчин 1С.Ф,.Елисеева Ю.Е,.Лаплихлна Л.В.,Ку~ гаовская Е.В..Орехович В.Н. Синтез и .изучение ингибиторов ддпеп-тпдил-карбоксипептвдазц з-керкапто ащшфоввшшх земещешшх 2-щтериданкарбоновнх кислот,// Злмико-ффмац.я,- 1904.-ТЛ8, ЛЮ.-С. II05-II90.

29. Филатова М,П.,Кр.чт H.A..Басчастиая Н.В..БЛохина A.B., Козлова H.H..Павчихяна Л,В..Елисеева Ю.Е..Орехович В.Н,,Ройс-сман 3..Пнгелоу И. Синтез л биологическач активность аналогов иоиодектгцщого ингибитора пептидга~дипептндаз!1,// Биосрганлч, t'jui, - 1985,- T.II, Ж.-0,21-30,

30, Еллсееяа Ю.Е« ,Павл?шят Л.В..Орехович В.Н. Рол:. рсики-аигкотензгаювой сзстсмч а нор.',-с я при ггпартошиаоаой бачетга. // 3-й Всероссийский съезд кардиологов. Свердловск,nafl 1985,Те-с.чси докладов. -1985.- С.43.

31.. Лаотихина Л,В, ,Елисеева Ю.13, .Орехович В.Н. Игггибчгора ключевого фактора ренпн-англотенэинолой С1ГЗТ6(Д1; ГДрбОКСПТ'ЛТЗП-" окна новнЛ класс гшотензявнлх средств.// там де. C,5GQ--5B9. '

32. Орехович В.Н..Елисеева П.Е.,Пчвл1Ш1на Л.В. Регулятрршп функции :сярбокояна?еп«Уи«г (шштотензтт-вре.про;'^щвго фермента)

л ергйгьчзме.// 5-Я БсесоязшгЯ бпохимггаокяа съезд, Те^псч опята-знальшх докладов; - ISG5,1- T.I.- О.СЗ-Ш. .

33.Влксоевя Ю.В, »Пчютдаиа Л,В, ,Орохошгч ВЛ1. .Салерно-К. ;ч Дгшшрлло А, Карбоксмсптппспц к его попйпторл з скаояяояьяоЛ'-Л'ДКООТ:! Прц '¡р'гр'ГГПХ.// тг.ч 2», Тавят стендовцх соойчотт1},« Т. 2,-С. 26 <5-265.

Ol; Шварц ГЛ, .I^aurt П.Г, ДСаГ-гаткапо, 0,11, ,"даоса А;М,, Псковский М.Д.,й1пссе!п Э,В,.Павлнхпна Л,В.,Орехогт В,И.

П~( сС-г:прбоксл)-,,.-:!сряг!Кго--зт™,?гг г.тио-чп^'рол.'-гдлл'!j - тгпгфятгг'н

// к^тчпь rnoipciDnaS.-lSSo.- "23Ö -Амч-рсшо ед^еггтаг,?:--* Д ТС1ЕП7Э О? 19.12.ГЗ.

35. Шварц Г.Я. .Евстратова М.И. .Кйхстафанова Л.1U .Елисеева В.К.,Паал]шша Л.В..Орехоалч В.!!..Кугаевскал Е.В. Д'ашковский М.Д., Яхонтов Л.11. Ц1!0-1--(3-ацет1игг)юпрош10!П!л)-6ч<ет1и1-шше-колиновлл кислота, обладающая алтцгилертензтшой актнвносты\ и способ со получения.// Авторское свидетельство & II64239 от O.OT.fip.

CG. Ороховпч В.11.,Елисеева Ю.Я. .Иаплихина Л.В. -Химическио регуляторы даю с нач.. 7 ¡'лука в СССР. - 1907.- )№.- С.2-9.

37. j1':isccuhü Ю.Е.,!1апл1Шши Л.В. .Орехович В.Н. Биохимические мемишш регуляции артеряачьного давления.// Клиническая медлциип.- 1987,- К5.- С.9-19.

38. Кугасвския Е.В.,Елисеева Ю.К. .Ппшихлпа JI.B..Орехонпч В.Н. .Оасрмарк Н.Ф.,Шварц Г.Я. Индукция карбоксикптопсина (ангиотензин I про вредящего фермента) плазмы крови нормотенаивных и гипортсизшшых ]фцс в ответ на однократное введение коп-топрплп// FrmcTOitL экспер.биол.мед.- 1987.- Й1.-С.48-60.

39. Гранин В.Г. (111впрц Г.Я. ^Гризик С.И. ,Tyryiaena Н.З. ,Фаср-марк И.Ф..Кутаивская Е.В..Елисеева D.E.»Навлихина Л.В..Ореховкч

B.Н. »МатовскиЛ М.Д. Синтез и биологическое дсЛствие ошшшо-ыеркалтокислот в родствсншх соединений.//Х1с,ишо-4арг<1адсвтич.Е. -1987,- Ш.-С.1428-ШЗ.

40. Козлова Н.И..Павлихина Л.В.,Елисеева Ю.Е.,Орехович В.Н. Эндогенные ингибиторы карбоксикатопсцна (ангиотензин I превращающего фермента) сыворотки крови быка.// Докл.АН СССГ.-1988,-Т.298, «5.- С.1481-1485.

41. Елисеева Ю.Е.,Барсукова I1.C.,Ореховкч В.Н. Обнаружение ингибиторов карбоксшсатопсииа (пдгнотеизни-преврацащего форыен-та) в лсИкоцдтвх человека.// Докл.АН СССР.- 1988.- Т.Э02.-Л4.-

C.992-995.

42. Алексоенко Л,П..Елисеева К.Е. .Пашпхяна Л.В..Позднев

B.®.,Орехоппч В.Н. Действие щздипо-мерк: .токислот на ш:тпп-кость проллчондопептидазы и карбоксмкатеисина (ангиотспзни-преврвщапцого фермента).// Докл» АЛ СССР.- 1989.- Т.306, К64-

C.I4B6-I483.

Кк - карбокешеатепенн; АПФ - ангиотензин-преврадапаиЯ фермент} К П - шшназа П; РАС - ранин-ангпотензпковал система; ККС -кал-ЛЕКраин-тишновая систкла; А I - ангиотензин I; А II - ангиотензки ГЦ Ек - фадтсишш; АД - артериальное давление; ДФО - днвзопропил фторфоофат«, 1ШБ - перахлориеркурнбензоат. -3