Биологические эффекты экзогенных бактериальных рибонуклеаз

Ильинская, Ольга Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биологические эффекты экзогенных бактериальных рибонуклеаз
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Биологические эффекты экзогенных бактериальных рибонуклеаз"

УДК 579.22, 577.29:615 На правах рукописи

ИЛЬИНСКАЯ Ольга Николаевна

БИОЛОГИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ ЭКЗОГЕННЫХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ РИБОНУКЛЕАЗ

03.00.07 - микробиология и 03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

КАЗАНЬ-1998

Г Г Б ОД ' 7 ОКТ 1998

Работа выполнена в Казанском ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени государственном университете

Научный консультант:

доктор биологических наук, академик АН Республики Татарстан, профессор И.Б.Лещинская

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

старший научный сотрудник В.Г.Истратов;

доктор медицинских наук,

профессор О.К.Поздеев;

доктор биологических наук,

старший научный сотрудник Г.И.Эль-Регистан

Ведущее учреждение:

Защита состоится

Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова, г. Москва

^_1998 г. в

часов на заседании диссертационного Совета Д 074.05.10 в Московской Медицинской академии им. И.М.Сеченова по адресу: 119881 Москва, Б. Пироговская ул., 2-6

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова по адресу 119042 Москва, Зубовский бульвар, 37/1

Автореферат разослан «_

1998г.

Ученый секретарь диссертационного совета к.м.н., доцент

А.Ю.Миронов

Актуальность проблемы. Биологически активные вещества эндогенного и экзогенного происхождения, не вовлекаясь непосредственно в основной метаболизм клеток, могут оказывать разнообразное влияние на функции клеток, тканей и целого организма. Изучение действия эффекторов на организмы различного эволюционного уровня является классической задачей биологии.

К настоящему времени обнаружено огромное количество факторов, которые подразделяют на активирующие биологические процессы и ингибирующие их, исходя из типа установленного эффекта. Знаменитое высказывание Парацельса "доза разграничивает яд и лекарство" датируют началом XVI века. Однако биологически активные вещества в сегодняшней практике применяют в области конкретного эффекта, не всегда учитывая последствия их альтернативного действия. Противоположная область эффектов и регуляция переключения клеточного ответа с одного типа на другой остаются малоизученными. Тем не менее накоплена масса данных о разнонаправленном действии ряда факторов в зависимости от концентрации: стимулирующем влиянии малых доз мутагенов [Раппопорте соавт., 1980], афлатоксина [Halt, Sutic, 1989], озона [Мельникова с соавт., 1989]; мутагенной активности стимуляторов роста растений [Конобеева, 1987]; активирующем и ингибирующем рост действии нуклеаз [Folkman, Klagsbrun, 1987; Куприянова-Ашина, 1989, 1992; Nitta et al., 1996], продуктов жизнедеятельности микроорганизмов [Филимонова, 1985], ан-тиоксидантов [Горбатенко, 1997].

за проявление условных положительных и отрицательных эффектов. Вместе с тем отрицательный с позиций отдельного организма эффект на уровне популяции может быть рассмотрен как благоприятный, способствующий ее выживанию и адаптации. Вышеизложенное обусловливает актуальность исследования биохимических механизмов проявления того или иного типа клеточного ответа под действием биологически активных соединений, каковыми являются бактериальные рибонуклеазы*

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы явилось установление биохимических механизмов разнообразия клеточных ответов под действием экзогенного эффектора - бактериальной рибонуклеазы - на организмах различного эволюционного уровня.

В соответствии с заданной целью были поставлены следующие задачи.

1. Выявить спектр условно положительных эффектов микроконцентраций и охарактеризовать комплекс условно отрицательных эффектов макроконцентраций рибонуклеазы по отношению к грамположительной и грамотрицательной прокариоти-ческой клетке.

2. Оценить закономерности проявляемых биназой воздействий на клетках низших эукариот - дрожжей и микромицетов.

3. Изучить действие широкого диапазона концентраций РНКазы in vivo на многоклеточных организмах различного эволюционного уровня (насекомые, млекопитающие).

4. Охарактеризовать биологическую активность рибонуклеаз in vitro в системе изолированных органов (почка грызунов).

5. Сравнить влияние экзогенной рибонуклеазы на культуры нормальных и трансформированных онкогенами клеток животных.

6. Исследовать влияние экзогенной биназы на первичную (лимфоциты) и перевиваемую (эпителиальноподобные клетки карциномы легких) культуру клеток человека.

7. Используя мутантные производные бактериальной рибонуклеазы, полученные методом сайт-специфического мутагенеза, оценить вклад специфического и неспецифического взаимодействия эффектора с клеткой в регистрируемый эффект.

* В работе использованы общепринятые тривиальные названия гомологичных РНКаз Bacillus intermedius (биназа) и Bacillus amyloliquefaciens (барназа).

8. Установить ключевые этапы взаимодействия рибонукпеазы с клеткой, необходимые и достаточные для проявления определенного типа клеточного ответа, и провести сравнительный анализ их вовлеченности в универсальную цепь передачи сигналов.

Научная новизна. С позиций системного эволюционного подхода исследован широкий спектр разнонаправленных биологических эффектов, вызываемых экзогенной бактериальной рибонуклеаэой при действии ее на клетки прокариот, низших эу-кариот и многоклеточных животных, включая человека. Получен ряд приоритетных данных, пополняющих фундаментальные знания о регуляторных системах живой клетки. Впервые проведена широкомасштабная работа с полным валидным набором тестерных систем различного эволюционного уровня, с оригинальным применением нового уникального инструментария - нативного и ряда мутантных ферментов с направленно измененной каталитической активностью - для оценки вклада специфических и неспецифических взаимодействий эффектора с клеткой. Это позволило выявить общие закономерности функционирования клеток различной архитектоники и уровня организации в ответ на действие эффектора, влияющего на нуклеиновые кислоты, и сформулировать гипотезу общности в проявлении клеточного ответа. В результате проведенных исследований, на защиту выносятся следующие научные положения, отражающие новизну проделанной работы.

Основные защищаемые положения диссертации

□ Малые концентрации РНКазы в среде культивирования (10"7 - 1СГ4 мг/мл) обладают стимулирующим рост и деление действием по отношению к клеткам бактерий и эукариот, причем стимулирующее действие сопряжено с активацией процессов дыхания целых клеток и изолированных митохондрий, а также с повышением активности ключевых ферментов, в частности, сукцинатдегидрогеназы. Дестабилизация мембран поверхностно-активным веществом приводит к увеличению стимулирующего эффекта РНКаз. В области стимулирующих доз (10"5 - 10"3 мг/мл) биназа обладает также антимутагенным действием, активируя работу репарациионных систем клетки.

□ Высокие концентрации биназы (0.1 -10 мг/мл) обладают токсическим и гено-токсическим действием по отношению к микроорганизмам и высшим животным, а также в системе изолированных органов и в культурах клеток животных и человека. Между активирующими и подавляющими концентрациями лежит интервал

"нейтральных" доз, характеризующийся сбалансированной настройкой стимулирующих и ингибирующих сигнальных путей, приводящих к отсутствию стенотипического эффекта.

■ Основной вклад в стимуляцию жизнедеятельности микроорганизмов, так же, как и в проявление токсических и генотоксических эффектов на всех тестерных системах клеток и организмов различного эволюционного уровня, вносит каталитическая активность рибонуклеаз. Обнаруженная тенденция к проявлению стимулирующего эффекта малоактивными рибонуклеазами связана с наличием независимых от каталитической функции аффинных взаимодействий фермента с клеточной поверхностью.

■ Цитоплазматическая мембрана является ключевым звеном в эффекторном пути, активируемом рибонуклеазой. Каталитически активные ферменты воздействуют на мембраносвязанную РНК, вызывая увеличение содержания нуклеотидов в среде инкубации. Проявление тонкой специфики действия биназы, а именно изменение секреции ферментов целлюлазного комплекса, блокирование Са2+-зависимого калиевого тока ионных каналов ras-трансформированных клеток, увеличение выхода из клеток микроорганизмов ионов электролитов, - обусловлено изменением свойств клеточных мембран.

■ Повреждения ДНК, вызываемые в клетках под влиянием каталитически активной РНКазы, являются следствием нарушения внутриклеточного гомеостаза при индуцированном изменении свойств мембраны и запуске ряда эндогенных процессов, в частности, активации белка RecA у низших организмов и Са2+-зависимых эн-донуклеаз у высших, приводящих к индукции мутаций в ходе ошибочной репарации и фрагментации ядерной ДНК соответственно.

Теоретическая и практическая значимость. Создана принципиальная теоретическая схема универсального переключения типа клеточного ответа под действием экзогенного белкового эффектора, обладающего ферментативной активностью, на модельных системах про- и эукариотических клеток. Выявлены фундаментальные закономерности включения сигнальных систем живой клетки при их активации экзогенной рибонуклеазой в широком диапазоне концентраций. Определен вклад аффинных взаимодействий и специфическая роль собственно рибонуклеолитиче-ской активности в реализацию индуцируемых эффектором функций клетки. Проведенное теоретическое обоснование механизмов действия РНКазы in vitro и in vivo

позволяет выработать корректные рекомендации для практического применения фермента в биотехнологии и медицине.

Практическое использование фермента в малых дозах возможно не только в качестве стимулятора роста, но и для направленного увеличения выхода определенных биологически активных веществ, что несомненно важно учитывать при разработке новых промышленных биотехнологий. Выявленное антимутагенное действие биназы предполагает новый аспект ее применения в качестве репарационного био-антимутагена. Дальнейшее углубленное изучение тонких аспектов проблемы апоп-тических изменений клеток и блокирования биназой Са2+-зависимого калиевого тока ионных каналов, специфичных для онкотрансформированных клеток, может стать основой создания противоопухолевых препаратов нового поколения. Несомненную практическую значимость имеет полная и всесторонняя оценка генотоксических свойств биназы в макродозах, необходимая для любого практического использования фермента. Выделение, характеристика и разработанный способ культивирования целлюлолитического микромицета, защищенные двумя патентами РФ, найдут применение в промышленном получении ферментов целлюлазного комплекса.

Связь работы с базовыми научными программами. Работа в течение 19881998гг. проводится в соответствии с планом НИР Казанского государственного университета (№ госрегистрации 01910049994). Исследования в рамках тематики работы были поддержаны грантами Санкт-Петербургского университета (1992-1993гг., № 2-101-30-53, направление "Биология: молекулярные механизмы стабильности живых систем"; 1997г., "Исследования в области фундаментального естествознания" № 970-10.190), грантом Академии Наук Республики Татарстан (1997г.); финансировались как составная часть программы "Университеты России" (1992-1996гг., проект "Ферменты микроорганизмов"; 1997г., №532 "Фундаментальные исследования"), В 1992-1993г. инициативный исследовательский проект получал поддержку фонда Восточной Европы Объединенной высшей технической школы и университета Цюриха (Швейцария), а 1993-1994гг„ 199бг, 1997г. - поддержку Немецкой Службы Академических Обменов (ФРГ). Автор использовал опыт анализа представленного материала для активного персонального участия в разработке государственной программы "Генетическая безопасность населения Республики Татарстан", получившей одобрение Кабинета Министров РТ в 1998г.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на Международных конференциях, школах, симпозиумах: школе-семинаре "Молекулярные механизмы мутагенеза и канцерогенеза" (Хаддинг, Швеция, 1994), симпозиуме "К столетию Бейеринка" (Гаага, Нидерланды, 1995), 7-ом европейском конгрессе по биотехнологии (Ницца, Франция, 1995), 14-ом съезде "Технологии животных клеток: от вакцин до генетической медицины" (Алгавре, Португалия, 1996), 4-ой конференции "Рибонуклеазы: химия, биология, биотехнология" (Гронинген, Нидерланды, 1996), ежегодном съезде Общества Токсикологов (Рестон, США, 1998), Форуме прикладной биотехнологии (Брюгге, Бельгия, 1998). Основные положения работы были представлены также на конференциях "Биосинтез ферментов микроорганизмами" (Москва, 1993), "Нуклеазы микроорганизмов" (Рига, 1989; Казань, 1989, 1991, 1998) и вошли в отчетные доклады по темам полученных грантов и НИР КГУ.

Публикации. Основной материал диссертационной работы нашел отражение в 42 печатных работах, из которых 21 статья в ведущих отечественных и зарубежных журналах, 2 патента РФ, 19 тезисов и материалов докладов на Российских и Международных конференциях. Методические разработки и некоторые теоретические аспекты диссертации вошли в 2 учебно-методических пособия для студентов, обучающихся по специальности 2041 -"микробиология".

Место выполнения работы. Основные экспериментальные данные получены автором за время работы на кафедре микробиологи Казанского государственного университета в период с 1988 по 1998гг. Исследования были начаты в кафедральной лаборатории генетической токсикологии КГУ под руководством к.б.н. И.Е.Черепневой и д.б.н. И.Б.Лещинской. Работа по определению биомассы микро-мицетов на нерастворимых субстратах выполнена в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН (г.Пущино) при участии к.б.н. Н.Б.Горкиной. Промышленное испытание способа культивирования целлюлолитического гриба проведено на химическом заводе под руководством нач.цеха Ф.К.Бадгиева (г.Менделеевск). Мутагенные и антимутагенные свойства биназы в бактериальных тест-системах исследованы в рамках кандидатских работ аспирантов, к.б.н. О.Б.Иванченко и к.б.н. Н.С.Карамовой, выполненных под руководством О.Н.Ильинской. Выделение и очистка мутантных рибонуклеаз, полученных методом сайт-специфического мутагенеза, проведена аспирантом автора к.б.н. Л.В.Кипенской в лаборатории д.х.н. Г.И.Яковлева (Институт молекулярной биологии, г.Москва). Исследования в тесте

SMART с дрозофилой выполнены автором в Институте токсикологии в лаборатории проф. Ф.Вюрглера под руководством др-а Х.Фрая (гг.Шверценбах-Цюрих, Швейцария). Анализ двойных разрывов ДНК методом гель-электрофореза в пульсирующем поле и эксперименты в системе изолированно перфузированной почки автор осуществил в Институте токсикологии (г.Вюрцбург, ФРГ) в научной группе др-а Э.Вок и др-а С.Вамвакаса. Измерения мембранного тока клеток и отдельных каналов проведены автором совместно с немецкими коллегами в Институте фармакологии г.Гиссена (директор проф. Ф.Драйер). Электрофоретическую подвижность клеток автор исследовал в Казанском технологическом университете при участии к.х.н. Ю.Л.Ишханяна, электропроводность клеточных суспензий - на кафедре физиологии растений КГУ при участии к.б.н. А..И.Колпакова и к.б.н. Е.В.Асафовой.

Автор выражает искреннюю благодарность названным сотрудникам и коллективам. Оссбо автор благодарит ученых, работа под руководством которых сформировала его научное мировоззрение - чл.-корр. РАН, д.б.н., профессора И.С.Кулаева и профессора Дитриха Хеншпера.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 213 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 3 глав собственных результатов, обсуждения полученных данных и выводов. Текст иллюстрирован 47 рисунками и 16 таблицами. Список литературы содержит 292 наименования, из них 87 работ отечественных авторов и 205 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследований Материалы. В работе использованы нативная и мутантные рибонукпеазы семейства микробных гуанилспецифичных РНКаз, катализирующих эндонуклеолитиче-ское расщепление одноцепочечной РНК в двустадийной реакции, включающей трансэтерификацию с образованием 2'3'-циклофосфата и его последующий гидролиз с образованием З'-фосфата. Нативные ферменты, их мутантные производные, полученные методом сайт-специфического мутагенеза, а также химически инактиви-рованные формы микробных РНКаз представлены в таблице 1.

Методы определения жизнеспособности и функциональной активности. Параметры роста микроорганизмов определяли стандартными методами микробиологии. Скорость дыхания клеток дрожжей Candida valida BKMY-2328 и митохондрий

Таблица 1

Использованные в работе рибонуклеазы и их каталитическая активность по отношению к высокополимерной дрожжевой РНК

№ Рибонуклеаза Источник получения Активность к РНК, 10бед/мг (%)*

1 Нативная бациллярная B.intermedius 7Р 14.0 (100)

биназа

2 Нативная рекомбинантная E.coli JM1107 с плазмидой 13.5(96)

биназа pML163**

3 Lys26Ala-6nHa3a E.coli JM1107 с плазмидой 4.0 (28)

PML164

4 Arg5SLys-6nHa3a E.coiiJMf 107 с плазмидой 14.0 (100)

PML165

5 Агд61в1п-биназа E.coli JM1107 с плазмидой 1.4(10)

PML166

6 His101Glu-6nHa3a E.coli JM1107 с плазмидой 0.36 (2.5)

PML703

7 Нативная рекомбинантная E.coli JM1107 с плазмидой 11.0 (79)

барназа рМТ416

8 His102Glu-6apHa3a E.coli JMI 107 с плазмидой 0.2 (1.4)

рМТ702

9 Фотоокисленная биназа Реакция in vitro 0.01 (0.07)

10 Инактивированная бар- Реакция iri vitro 0.0 (0)

старом (белковый ингиби-

тор) биназа

* за 100% принята активность нативной бациллярной биназы

"Плазмиды рМТ любезно предоставлены доктором Р.Хартли (Национальный институт здоровья, Бетесда, США), плазмиды pML - доктором Е.Чернокальской (Университет Охайо, США).

целлюлолитического гриба Aspergillus fumigatus - F316 измеряли на полярографе LP-7 (Чехия) с кислородной ячейкой объемом 85мл и платиновым электродом Кларка.

Цитотоксичность в культуре клеток определяли с применением коммерческого реагента WST-1 (Boehringer Mannheim, FRG), либо с сопью тетразолия в МТТ-тесте [Borenfreund et al„ 1988]. Использованы три различных типа клеточных культур: (I) -нормальные фибробласты мыши NIH3T3, /^-трансформированные NIH3T3, фиб-робласты линии D-17, инфецированые src- онкогеном вируса саркомы Рауса, и фиб-

робласты линии В-13, трансформированные v-/ms; (II) - культура фибробластов куриного эмбриона CEF и RSV-трансформированные CEF; (III) - культура эпителиаль-ноподобных клеток карциномы легких человека А549.

Нефротоксичность в системе изолированно перфузированной почки крыс выявляли по уменьшению абсорбции глюкозы из перфузионной среды, повышению количества белка и активности маркерных ферментов - щелочной фосфатазы и у-глутамилтранспептидазы в образцах мочи [Lock, 1993]. Хирургическая процедура проведена согласно Ньютону и Хуку [Newton, Hook 1981].

Методы определения генотсксичности. Использовали тест на повреаедение ДНК, основанный на избирательной ингибиции роста штаммов E.coli, дефектных по определенным генам, участвующим в репарации, по сравнению с ростом штамма дикого типа [McCarol et al., 1981]. Тест Эймса по регистрации частоты реверсий аук-сотрофных по гистидину штаммов Salmonella typhimuríum к прототрофности осуществляли в чашечной модификации со штаммами Salmonella ТА1538, ТА98, ТА1535, ТА100 [Marón, Ames, 1983]. Ara-тест, фиксирующий увеличение частоты мутаций Aras -> AraR под действием мутагена, проводили с использованием штамма Salmonella typhimuríum ВА13 по стандартной методике [Dorado, Pueyo, 1988]. Тест на фагоиндукцию под действием повреждающих генетический материал агентов [Heinemann, 1971] был поставлен в системе штаммов Bacillus subtilis (лизогенный по фагу (pl05(üi /Индикаторный штамм 168), и со штаммами Streptomyces lavendulae (7, индикаторный /3, лизогенный по фагу 3311). Выявление индукции SOS-функций клетки проводили по измерению активности фермента ß-гапактозидазы, чей оперон в индикаторном штамме E.coli PQ37 введен под контроль гена sfiA, входящего в состав SOS-регулона [Quillardet, Hofnung, 1985]. Тест на соматические мутации и рекомбинацию у Drosophila (SMART) с обработкой трансгетерозиготных личинок в хроническом опыте и последующим подсчетом клонов мутантных волосков на крыльях осуществляли согласно Графу с соавт. [Graf et al., 1984]. Количество образованных микроядер в нормально безъядерных эритроцитах как следствие кластогенного действия генотоксикантов in vivo [Hayashi et al., 1994] оценивали через 72ч после однократного введения РНКазы (25мг/кг) мышам линии СВАхС5713 L/G. Внеплановый синтез ДНК в лимфоцитах человека оценивали авторадиографически по включению 3Н-тимидина (в исходную суспензию добавляли 6цС1/мл), подсчитывая число гранул

в окрашенном краской Giemsa препарате [Madie et al., 1994]. Выявление двойных разрывов ДНК под действием генотоксикантов методом электрофореза в пульсирующем поле (PFGE) было проведено с клетками карциномы легких человека А549 из коллекции культур АТСС, Rockville, Maryland, США. Электрофорез проводили с использованием системы Biorad CHEF-DR III с программированной сменой блоков [Elia et al., 1994]. В качестве маркеров использовали фрагменты ДНК Saccharomyces cerevisiae (от 0,24 до 2,2Mbp), Schizosaccharomyces pombe (3,5; 4,68 и 5,7Mbp) и фага X (145,5; 97; и 48,5 КЬр).

Аналитические методы. Определение содержания белка в растворах проводили колориметрически с использованием Bio-Rad-реагента (Bio-Rad Laboratories, Gmbh, Мюнхен. ФРГ)- Концентрацию глюкозы в образцах измеряли с помощью коммерческого диагностического набора (Sigma, Deinsenhofen, ФРГ). Также с помощью коммерческих наборов определяли активности ^-глутамилтранспептидазы и щелочной фосфатазы. Общую активность целлюлаз определяли по гидролизу фильтровальной бумаги активность целлобиазы - по гидролизу целлобиозы с последующим измерением образовавшейся глюкозы глкжозооксидазной реакцией, как описано у Клесова с соавт. [1980]. Активность /З-галактозидазы определяли методом Миллера [Miller, 1972]. Активность РНКаз измеряли по образованию кислоторастворимых продуктов гидролиза из высокополимерной дрожжевой РНК (Sigma, ФРГ) [Anfinsen 1954]. Активность сукцинатдегидрогеназы измеряли по снижению оптической плотности (бООнм) 2,6-дихлорфенолиндофенола, восстанавливающегося в присутствии феназинметасульфата при ферментативном окислении сукцината до фумарата [Кривченкова, 1987], активность протеазы - по гидолитическому расщеплению казеина, спектрофотометрически (280нм) фиксируя неосажденные трихпоруксусной кислотой продукты гидролиза [Каверзнева, 1971].

Выход нуклеотидов из клеток бактерий фиксировали по изменению поглощения модифицированной реакционной смеси для рибонуклеазной реакции (без РНК) при 260нм.

Измерение электрофоретичес-кой подвижности клеток дрожжей Candida valida BKMY-2328 осуществляли в ручном режиме работы на приборе Parmoquant-2 (Carl Zeiss, Йена, ФГР), измеряя под микроскопом скорость движения в электрическом поле для 30 отдельных клеток в каждом варианте.

Об изменении ионной проницаемости мембран бактерий судили по изменению электропроводности клеточных суспензий бактериальных клеток экспоненциальной фазы в бидистилпяте, измеряя с помощью реохордного моста ВМ 401Е (Tesla,Чехия) сопротивление клеточных суспензий при экзоосмосе электролитов. Эффект РНКаз оценивали по изменению электропроводности раствора, вычисленной в % от убыли сопротивления в контрольном варианте без РНКазы, учитывая дополнительно вклад самого фермента в измеряемую величину.

Мембранный ток целой клетки и отдельных ионных каналов (метод "patch clamp") замеряли для фибробластов с использованием регистрирующей микропипетки (боросиликатный стеклянный капилляр с внешним диаметром 1.5мм и толщиной стекла 0.3мм), замеряющей амплитуду мембранного тока на амплификаторе ЕРС-7 (List Electronics, Дармштадт, ФРГ) в ответ на малые деполяризующие импульсы (20mV, ЮОмс). Техника измерения тока отдельных ионных каналов включала получение фиксированного на отверстии регистрирующей микропипетки кусочка клеточной мембраны и последующие аналогичные измерения [Dreyer at al., 1990; Draheim at al., 1995].

Математическая обработка результатов. Статистический анализ проводили с использованием стандартных математических методов в программе Microsoft Excel: расчета среднеквадратичного отклонения внутри группы, t-теста Стьюдента и вычисления коэффициента корреляции двух групп данных. Результат в отдельной группе данных считали достоверным при отклонении внутри группы ст<15%, а критерий вероятности Р<0,05 принимали достаточным для достоверной разницы групп данных. С помощью специально созданных компьютерных программ анализировали результаты теста SMART (программа математической обработки [Frei, Wiirgler, 1988]) и осуществляли количественный расчет двойных разрывов ДНК (авторский шаблон E.Vock, Wûrzburg, ФРГ).

Результаты экспериментальной работы

I. БИОЛОГИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ МАЛЫХ ДОЗ РНКаз

1. Активирующее процессы жизнедеятельности влияние рибонуклеаз

1.1. Бактериальная РНКаза как стимулятор роста зукариотических микроорганизмов. Установлено, что микродобавки экзогенной РНКазы стимулировали митоти-

ческую активность дрожжей Candida valida на минеральной среде с 1% этанолом в качестве источника углерода и прирост биомассы гриба Aspergillus fumigatus на среде с 5г/л глюкозы. Констатирован дозозависимый эффект. Внесение в среду наряду с биназой микроконцентраций неионогенного поверхностно-активного вещества -синтанола, приводящего к частичной дестабилизации мембраны, увеличивало величину стимулирующего эффекта РНКазы (рис.1). Дыхательная активность целых клеток дрожжей и изолированных митохондрий гриба с сукцинатом (20мМ) в качестве субстрата возрастала (максимально до 30%) под действием стимулирующих рост микродоз РНКазы, так же, как и активность ключевого фермента дыхательного цикла - сукцинатдегидрогеназы (максимально вдвое).

180 160 + 140 120 100 -80 -60

ьМ

f S

^ 180

ё о 160 -

Рн 140 -

120 -

100 -

80 -

60 -1

lx,I

РНКаза

ffl

РНКаза+ синтанол

Рис.1 Влияние мифодоз биологически активных веществ на биомассу дрожжей С.уа/йа (А) и гриба ААит'щаШэ (В). Добавки, мг/мл: а -10'7, Ь -10"5, с -10"6, <1-10"", е-10'3, ЫО"2, д - контроль без добавок

1.2. Действие биназы на ряд секретируемых Ферментов низших эукариот. Изменение секреции белка, зафиксированное для ААит'щаШ и достигшее 150% от контрольного (при концентрации биназы 10"5 мг/мл), вероятно, связано с общей актива-

цией биосинтетических процессов. Секретируемая протеолитическая активность гриба, выращенного в присутствии стимулирующих доз РНКазы, оказалась на 50% больше контрольной. По сравнению с ростом на глюкозе прирост биомассы гриба на целлюлозе был выражен слабее (соответственно 30% и 15% при 10'5 мг/л биназы). Однако активация ключевых метаболических процессов не проявилась на уровне удельной активности секретируемой целлюлазы: напротив, целлюлолитическая активность на среде с фильтровальной бумагой в присутствии биназы уменьшилась. Определение активности целлобиазы во временных точках с одинаковой общей целлюлолитической активностью показало, что уровень секретируемой целлобиазы уменьшился в 7 раз, с 44.6% до 6.7%, в то время как внутриклеточный уровень по сравнению с контрольным увеличился с 55.4% до 93.3% от суммарного уровня активности целлобиазы. Следовательно, биназа изменяет транспортные функции клеточной мембраны для определенных секретируемых белков.

1.3. Ростостимулирующее действие нативной и мутантных РНКаз по отношению к прокариотам. Проверка ростостимулирующего действия РНКаз на штамме Е.соН \ZVP2 не выявила стимулирующего эффекта неактивных ферментов. Расчеты максимальной удельной скорости роста и времени удвоения позволили заключить, что только ферменты с высокой каталитической активностью могут стимулировать рост грамотрицательных бактерий (табл.2). На штамме В.зиЫШз 168 наблюдали некоторое увеличение числа клеток не только под действием активных ферментов, но и в присутствии микродоз мутантных РНКаз с пониженной каталитической активностью, хотя стимулирующее действие последних выражено весьма незначительно.

Таблица 2

Удельная скорость роста (ц) и время удвоения (У Е.соН IЫР2 в присутствии

стимулирующей рост концентрации РНКаз (10"4 мг/мл)

РНКаза ц, % и мин

Без РНКазы 4.42 + 0.21 100 94

Биназа бациллярная 6.92 ±0.13 158 60

Биназа из рекомбинантного 6.81 ±0.09 154 61

штамма

Биназа с заменой 1.у525А1а 4.21 ±0.19 95 99

Биназа с заменой Н1з101С1и 4.01 ±0.22 91 104

1.4 Выход нуклеотидов под действием ферментов из клеток грамотрицательных и грамположительных бактерий. Содержание нуклеотидов в среде инкубации под действием активной биназы возрастает. Мутантные ферменты с пониженной каталитической активностью вызывают меньший выход нуклеотидов в среду (рис.2).

| 5? 60 -я

I §40

2 ь 20 -

в ч % а .

О б.виЬШ ОЕ.соП

ШзЮЮ1и-

биназа

Ьуз26А1а-биназа

Фермент, 0.1мг/мл

Биназа

Рис.2 Увеличение выхода свободных нуклеотидов за 0.5ч из клеток В.зиЫШз 168 и Е.соН У/Р2 под действием 0.1мг/мл РНКаз. 0% - увеличение содержания нуклеотидов в среде, содержащей клетки без РНКазы

Для клеток грамположительных микроорганизмов количественные показатели выхода нуклеотидов в среду были несколько меньше, чем для грамотрицательных. Примерный расчет количества вышедшего из клеток нуклеотидного материала показывает, что максимальное количество гидролизованой РНКазой РНК составляет не более 1-2% от общего количества клеточной РНК. Вероятно, даже при высоком содержании фермента в среде и длительном времени инкубации количество доступной для ферментативного гидролиза клеточной РНК ограничено.

Данные вышеописанных экспериментов позволяют заключить следующее:

В малые концентрации РНКазы в среде культивирования (10"6 - 10^ мг/мл) обладают стимулирующим рост и деление действием по отношению к клеткам бактерий и низших эукариот;

■ ростостимулирующее действие сопряжено с активацией процессов дыхания целых клеток и изолированных митохондрий, а также с повышением активности ключевых ферментов метаболизма, в частности, сукцинатдегидрогеназы;

■ биназа избирательно меняет функции мембран в отношении ряда секрети-руемых ферментов, а именно протеазы, экзоглкжозидазы С1 и целлобиазы;

п дестабилизация мембран поверхностно-активным веществом (синтанолом) приводит к увеличению стимулирующего эффекта РНКаз;

н основной вклад в эффект стимуляции жизнедеятельности микроорганизмов вносит каталитическая активность рибонукпеаз;

о каталитически активные рибонуклеазы воздействуют на свой субстрат - РНК -в составе целых клеток микроорганизмов, вызывая увеличение содержания нуклео-тидов в среде инкубации, причем динамика выхода нуклеотидов у грамположитель-ных бактерий характеризуется более медленной скоростью, чем у грамотрицатель-ных;

а обнаруженная тенденция к проявлению незначительного стимулирующего эффекта малоактивными рибонукпеазами предполагает наличие независимых от каталитической функции аффинных взаимодействий фермента с клеточной поверхностью.

2. Антимутагенное действие РНКазы

Предварительная инкубация тестерных штаммов с биназой оказалась эффективной в плане обнаружения антимутагенных свойств биназы в тесте Эймса. Наиболее высокая протекторная активность (снижение активности стандартного мутагена на 65-75%) получена на штамме ТА98, на штаммах ТА1535 и ТА1538 также наблюдалась защитная активность фермента.

Й 2+ 1 я -в-

¿г о

1 1-2 П.П-П

5.2

3.6

2 3 4

Вариант

Рис.3 Антимутагенный эффект биназы в БОЗ-хромотесте. М- негативный контроль без вещества, 1 - РНКаза, 10чмг/мл; 2 - РНКаза, 10"3мг/мл; 3 - НГ(3[1Г/мл)+РНКаза(10~3мг/мл); 4 - НГ(Зцг/мл)+РНКаза(10"4 мг/мл); Р -позитивный контроль, НГ (Зцг/мл)

Данные, представленные на рис.3, свидетельствуют об уменьшении фактора индукции нитрозогуанидина в SOS-хромотесте для клеток, предварительно обработанных малыми дозами биназы, не вызывающими собственного SOS-индуцирующего эффекта.

ш В двух различных бактериальных тестах с использованием пяти различных тестерных штаммов биназа в малых дозах (порядка 10"5-10'3 мг/мл) снижала на 3075% мутагенность известных супермутагенов - нитрозометилмочевины, нитрозогуанидина, нитрофлуорена. Антимутагенный эффект четко проявлялся после предварительной обработки клеток тестерных штаммов в течение 1ч малыми концентрациями биназы. Биназа, таким образом, обладала протекторным действием. В основе биоантимутагенности бактериальной РНКазы, вероятно, лежит ее способность активировать работу индуцибельной системы безошибочной репарации.

3. Изменение электрофизиологических характеристик микробных клеток

3.1. Влияние биназы на электрофоретическую подвижность (ЭФП) дрожжевых клеток. Электрокинетический потенциал поверхности определяемый величиной и экранирующим действием двойного электрического слоя, образуемого ионами электролита, прямо связан с ЭФП клеток. Измеряя ЭФП, можно судить об изменении поверхностного заряда клетки под действием различных внешних факторов. Присутствие различных концентрации биназы в среде вызывало изменение ЭФП клеток Candida valida: стимулирующие рост концентрации биназы увеличивали ЭФП в среднем на 16%, а более высокие концентрации (0.01-0.1мг/мл) снижали величину ЭФП. Хотя есть отдельные работы, характеризующие Ç-потенциал растущих клеток как постоянный [Thonart et al., 1982], гораздо больше аргументов получено в пользу того, что ЭФП клеток в лаг-фазе и начале логарифмической фазы снижена, в по мере дальнейшего роста возрастает [Krekler et al., 1989; Иванов, Фомченков, 1989]. Также известно, что стимулирующие дозы экзогенной биназы сокращают длительность лаг-фазы роста дрожжей Candida tropicalis на 30-50% [Колпаков, 1993]. Следовательно, результаты вышеописанных экспериментов можно интерпретировать так, что РНКаза в ростостимулирующих концентрациях, активируя ключевые метаболические процессы, имитирует ускоренный переход культуры в позднюю экспоненциальную фазу.

3.2. Влияние биназы на выход ионов из клеток микроорганизмов. Изменение ионного гомеостаза клетки выполняет регуляторную роль в активации того или иного механизма клеточного ответа на действие внешних факторов. Многие биологически активные вещества способны изменять ионный гомеостаз клетки. Для проверки такой способности РНКазы измеряли изменение электропроводности суспензии бактерий, обработанных биназой, в бидистилляте. После установления постоянного сопротивления клеточной суспензии в электрометрическую ячейку добавляли РНКазу в концентрации, стимулирующей рост микроорганизмов. Показано, что добавление активной биназы к клеткам уменьшает сопротивление суспензии, что возможно при условии выхода из клеток дополнительных электролитов. Неактивный фермент аналогичного эффекта не вызывает.

п Микробная клетка реагирует на экзогенную РНКазу изменением зарядовых свойств поверхности, причем стимулирующие дозы усиливают поглощение протонов клеткой и выход из клеток ионов калия. Высокие концентрации биназы уменьшали электрофоретическую подвижность клеток вследствие нейтрализации отрицательно заряженных групп клеточной поверхности при сорбции поликатионных молекул РНКазы.

II. ТОКСИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ ВЫСОКИХ ДОЗ РИБОНУКЛЕАЗ

1. Нефротоксические эффекты бактериальных рибонуклеаз. Для определения влияния биназы и барназы на ренальные функции, изолированно перфузиро-ванная почка была обработана РНКазами в двух различных концентрациях, 0.015мг/мл и 0.15мг/мл, в течение 60 мин. Каталитически активные биназа и барназа вызывали дозозависимый токсический эффект, не наблюдавшийся при перфузии с фотоокисленной биназой и мутантной неактивной барназой с заменой His102 Glu в активном центре (рис.4). В здоровой почке низкомолекулярные белки, такие, как биназа, фильтруются в гломерулах и реабсорбируются путем эндоцитоза. Это может приводить к аккумуляции фермента в проксимальных канальцах и токсичности, опосредованной деградацией РНК. Более того, экскреция с мочой ферментов у-глутамилтрансферазы (ГТ) и щелочной фосфатазы (ЩФ), связанных с мембранами клеток проксимальных канальцев, свидетельствует о повреждении этой части неф-рона и часто используется как маркер его нарушения у экспериментальных животных и человека [Lock, 1993]. Спустя 1ч и 6ч после внутрибрюшинного введения кры-

сам 50мг/кг активной биназы регистрировали функции изолированной почки в пер-фузионной системе без добавления РНКаз. Оказалось, что у обработанных биназой в течение 6ч крыс период стабилизации системы перфузии почки превышал контрольный (5-7мин по сравнению с 1-Змин). Было зарегистрировано увеличение экскреции белка, активности ГТ в моче и снижение количества поглощаемой глюкозы экспонированной 6ч почкой. Почка, экспонированная in vivo 1ч, выделяла мочу так же, как контрольная. Аналогичная обработка животных фотоинактивированной биназой не изменяла контролируемых параметров перфузии.

600

500

| 400 в

£ 300 «

| 200 В

100 о

Рис.4 Влияние РНКаз (мг/мл) на параметры мочи изолированной почки: А - перфузия без РНКазы, В - 0.015 (также 0.15) неактивной биназы, С - 0.015 (0.15) неактивной барназы, D - 0.015 активной биназы, Е - 0.015 активной барназы, F - 0.15 активной биназы, G - 0.15 активной барназы. * - достоверная разница с контролем, в Установленная нефротоксичность высоких концентраций каталитически активных РНКаз in vitro и in vivo свидетельствует о возможности интернализации бактериальной РНКазы и последующего ее разрушающего клеточную и ядерную РНК действия, приводящего к изменению экспрессии генов и смерти клетки. Отсутствие эффектов неактивных РНКаз подтверждает, что расщепление РНК клеток почечных канальцев, следующее за интернализацией рибонуклеаз, является наиболее вероятным механизмом токсичности.

Вариант

2. Цитотоксичность биназы в культуре клеток животных и человека. Одним из важных свойств рибонуклеаз как возможных лекарственных препаратов является проявляемая ими цитотоксичность. Специфичность действия будет определяться как индивидуальными физико-химическими и каталитическими свойствами РНКазы, так и количеством доступного субстрата, мембранотропными эффектами и степенью интернализации экзогенного фермента различными типами клеток. В связи с этим в настоящее время рибонуклеазы служат объектом тщательного изучения как класс новых цитотоксических агентов [Уои1е е1 а1., 1993]. Выявление цитотоксических свойств биназы проводили в культурах клеток животных и человека. Эксперименты с тремя типами трансформированных онкогенами фибробластов мыши в сравнении с нормальными фибробластами показали, что линии В13 и й17, так же, как и нормальные фибробласты, мало подвержены токсическому действию биназы в исследованном диапазоне концентраций, и сохраняют ростовые параметры практически на уровне 100%, за которые принят рост в отсутствии биназы в среде культивирования. В то же время гая-трансформированные фибробласты оказались значительно более чувствительными к действию биназы, чем нормальные (рис.5).

N14313 В13 017 га э-313

Культура фибробластов

Рис.5 Выживаемость различных клеточных линий фибробластов мыши через 24, 48 и 72 ч экспозиции с биназой (О.Змг/мл). Плотность посева -105кл/мл. За 100% принят рост без биназы.

Изучение действия биназы на культуру эпителиальноподобных клеток человека показало, что концентрации свыше 0.1мг/мл являются токсичными для данного типа клеток, причем величина токсического эффекта увеличивается с течением времени даже при небольшой начальной плотности клеток. Мутантная форма рибонуклеазы

1_у826А1а оказывала гораздо меньшее влияние на рост клеточной линии А549, что дает возможность связывать механизм токсического действия фермента прежде всего с его каталитической активностью.

■ Обнаружение преимущественного угнетения роста газ-трансфор-мированных фибробластов по сравнению с нормальными представляется довольно важным фактом, открывающим перспективу разработки направленного использования активной рибонуклеазы в качестве терапевтического средства именно для опухолей с экспрессией газ-онкогена. Возможно, что использованная в работе линяя опухолевых клеток легких человека оказалась чувствительной к биназе по причине экспрессии онкогена гаэ в данном типе клеток.

3. Изменение мембранного тока под действием биназы в нормальных и трансформированных фибробластах. Нормальные фибробласты мыши не обладают выходящим током К*, а содержат два типа Саг+ - каналов, проводящих зависимый от напряжения и времени входящий в клетки ток. Тем не менее после газ-трансформации в различных линиях мышиных фибробластов появляется независимый от напряжения ток Кса, а их кальциевый ток ингибируется. В эге-трансформированных фибробластах мыши также происходит активация Кса тока, но без параллельной ингибиции Са2+- тока ргаИет е! а1„ 1995]. Возможные ингибиторы клеточного деления, блокирующие передачу сигналов в измененном онкогенами сигнальном пути, по всей вероятности, должны ингибировать Кса ток. Нормальные МНЗТЗ фибробласты, обработанные биназой, не изменяют характеристических параметров мембранного тока. Поскольку биназа оказывала выраженное угнетающее действие на культуру клеток фибробластов Ы1НЗТЗ, трансформированных у-На-газ-онкогеном, представлялось важным выявить, связана ли цитотоксичность биназы с блокированием Кса тока, который активен в этих клетках без стимуляции митогеном и регистрируется в ответ на проникновение микропипетки внутрь отдельной клетки [ОгаЬет е1 а1„ 1995].

Измерение этого тока в контрольных и обработанных биназой гав-трансформированных клетках позволило выявить некоторую разницу в амплитуде данного типа тока у клеток, обработанных биназой в течение 48ч, по сравнению с контрольными. До этого времени различия Кса тока между ними были недостоверными (рис.6). Таким образом можно считать, что избирательное угнетение биназой роста газ-трансформированных фибробластов по сравнению с нормальными связа-

но с блокированием характерного для них калиевого тока в зависимых от напряжения Ca2* - активируемых каналах.

2000

< 1500 с.

g 1000 н

* 500 0

Рис.6 Действие биназы (О.Змг/мл) на амплитуду калиевого тока в зависимых от напряжения Са2*- активируемых каналах ras-трансформированных фибробластов. Приведены средние значения для 4-х отдельных клеток. * - достоверно отличается от контроля.

п Каталитически активная биназа в цитотоксической концентрации при длительном времени инкубации с ras-трансформированных мышиными фибробластами вызывает уменьшение мембранного Са2+ - зависимого калиевого тока, характерного для ряда опухолевых и стимулированных митогеном клеток, примерно в 3 раза.

III. ГЕНОТОКСИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БАКТЕРИАЛЬНЫХ РНКаз

1. Эффект биназы в бактериальных тест-системах. В тестах по индукции обратных мутаций к прототрофности по гистидину (тест Эймса) и прямых мутаций устойчивости к арабинозе (Ага-тест) был обнаружен слабый мутагенный эффект высоких концентраций биназы. Метаболическая активация in vitro микросомными фракциями животных (печень крыс и кур), растений (луковицы тюльпана) и человека (плацента) приводила к исчезновению мутагенного действия высоких концентраций биназы. Оценка ДНК-повреждающего действия экзогенной биназы показала, что высокие концентрации фермента достоверно угнетали рост штаммов E.coli, дефектных по некоторым путям репарации. В частности, штаммы ро1А~ и uvrA' были более чувствительны к ингибирующему рост действию биназы, чем штамм дикого типа WP2.

Проверка ответа лизогенных штаммов на воздействие рибонуклеазы показала, что биназа индуцировала выход фага из лизогенных штаммов B.subtilis и

Время инкубации, ч

S.lavendulae, причем эффект был дозозависимым и проявлялся уже при 0.01 мг/мл РНКазы (рис.7).

50 у 40

S и

| | 30 -w О « £ 5 | 20 + •е- * £-» 10 +

□ В. subtil is (А)

□ S.lavendulae (В)

г^та I I.

0,001 0,01 Биназа, мг/мл

0,1

Рис.7 Индукция выхода фаговых частиц из лизогенных штаммов B.subtilis и S.lavendulae под действием биназы. Титр фага для УФ-индуцированного выхода составлял А: 200±35х107; В: 2Ю±28хЮ10.

Ген гесА является основным регулятором SOS-функций клетки, включающем SOS-систему и разрешающим синтез на поврежденной матрице ДНК [Devoret, 1992]. Индукция фага под влиянием бациллярной РНКазы означает, что ее действие приводило к активации белка RecA. Мутагенез, вызванный биназой в штаммах Salmonella, может также отчасти быть гесА-опосредованным, поскольку он зависит от включения генов SOS-системы и генов umuCD, аналоги которых, гены тисАВ, введены в тестерные штаммы с плазмидой рКМ101 [Walker, 1984; Русина с соавт., 1997].

■ В четырех различных тестах с использованием бактерий было установлено ДНК-повреждающее, мутагенное и индуцирующее выход профага из лизогенных штаммов действие каталитически активной биназы в высоких концентрациях. Метаболическая активация микросомными фракциями животных и растений снимала ге-нотоксический эффект биназы. Анализ полученных данных позволяет сделать вывод об индукции Ree А - зависимых функций клетки при воздействии экзогенной бактериальной рибонукпеазы.

2. БОБ-индуцирующая активность экзогенных рибонуклеаз. Бациллярные рибонуклеазы - биназа и барназа, а также их мутантные производные были исследованы в БОБ-хромотесте как возможные индукторы вОв-функций клетки.

2 2

ее

С.

« е

Е?

Белки, 1мг/мл

Рис.8 БОЭ-индуцирующая способность гомологичных РНКаз с различной каталитической активностью. *<т<15%, "ст<10%, ***а<5%

Было установлено, что оба нативных фермента проявляли дозозависимое действие, при этом для биназы максимальная величина фактора индукции (№) составила 2.8 (концентрация фермента 1мг/мл реакционной смеси). При концентрациях фермента менее 0.1мг/мл 1Р был менее, чем 1.5, что позволило сделать вывод об отсутствии БОБ-индуцирующего действия низких концентраций фермента. Значение |р при 1мг/мл барназы составило величину 2.7. Незначительные различия наблюдали в величине |р между нативными ферментами дикого типа, выделенными из природного продуцента - ВМегтесИиэ, и ферментами из рекомбинантного штамма Е.соН. Для мутантных ферментов, чья каталитическая активность была меньше, чем

30% от активности дикого типа фермента, индукции SOS-ответа клеток зарегистрировано не было. В качестве фонового контроля был также рассчитан IF для барста-ра: оказалось, что сам барстар не индуцирует SOS-функций тестерного штамма, а инактивированная им биназа не вызывает SOS-ответа (рис.8). Коэффициент корреляции между IF и активностью к РНК составил величину 0.84, что позволяет сделать однозначное заключение.

■ Бактериальные рибонуклеазы в высоких концентрациях индуцируют SOS - ответ клетки. Эта способность ферментов находится в прямой зависимости от его каталитической активности.

3. Влияние РНКазы на геном дрозофилы . Подсчет мутантных клонов волосков на крыльях Drosophila проводили у выживших мух, собранных в каждом из опытных вариантов. Параллельно оценивали токсическое действие различных концентраций биназы по регистрации процентного содержания живых мух и погибших на исходной стадии, либо на стадии куколки личинок. Токсическое действие фермента проявляется при концентрации более 1 мг/мл среды. Отмечено, что чем больше концентрация фермента в среде, тем больше процент гибели особей на исходной стадии личинки.

Биназа вызывает достоверное увеличение числа пятен одного типа (фенотип mwh) по сравнению с контролем (Н20). Расчет частоты появления мутантных пятен, индуцированных РНКазой, выявил наибольшее превышение их частоты для клонов минимального размера, состоящих из 1-2 клеток (рис.9).

Токсическое действие биназы на обрабатываемые личинки привело к появлению морфозов у взрослых насекомых, выражавшихся в лизисе мембран фасеток глаза, причем интенсивность поражения фасеток находилась в прямой зависимости от концентрации фермента в среде. Ранее в бактериальных тест-системах было показано, что метаболическая активация ферментами микросом печени млекопитающих приводила к исчезновению мутагенного эффекта. Тем не менее на уровне организма Drosophila melanogaster метаболические превращения тестируемого фермента не приводят к потере им мутагенных свойств. Учитывая выраженное токсическое действие высоких концентраций фермента, можно предположить, что нарушения в генетическом материале происходят вследствие первичных цитотоксических изменений.

I 0.4 т

Ся

а а

5 о.з1

0.2 -

я н о

й «

гг

0.1

□ Контроль, 96 крыльев П 5мт/мл РНКазы, 48 крыльев

со

00 ю

ю аз

Размер одиночных пятен (число клеток)

Рис.9 Частота мутантных одиночных пятен разного размера на крыльях ОгозорШа после обработки личинок 5мг/мл РНКазы в течение 48 ч. Контрольный вариант с НгО без РНКазы

□ В соматических клетках дрозофилы биназа в высоких концентрациях, обладавших токсическим действием, индуцировала генные мутации. Токсичность фермента была зарегистрирована по снижению жизнеспособности на уровне личинок, куколок и целых насекомых, а также по индукции морфозов, выражавшихся в лизисе части глазных фасеток мух.

4. Действие биназы на генетический материал клеток крови млекопитающих. Повреждение генетического материала клетки ведет обычно к включению ферментативных систем репарации, призванных исправить повреждение. Этот процесс может быть детектирован по усилению синтеза ДНК по сравнению с уровнем синтеза в нормальных клетках без индуцированных повреждений. Действие РНКазы на внеплановый синтез ДНК (ВСД) в первичной культуре лимфоцитов человека было дозозависимым и показало усиление ВСД на 30% при максимальной из исследованных концентраций (1мг/мл), что позволяет сделать вывод об индукции повреждений генетического материала высокими дозами фермента.

На уровне целого организма появление эритроцитов, содержащих микроядра, после однократной инъекции биназы также свидетельствует о нарушениях организации генетического материала. Кластогенный эффект в эритроцитах периферической крови мышей вызывала примерно в 20 раз меньшая (25мг/кг), чем Ш50, концен-

трация биназы. Учитывая величину кластогенного эффекта, вызванного РНКазой (повышение содержания полихромных эритроцитов с мифоядрами на 40% по сравнению с контролем), вряд ли можно говорить о значительных повреждениях генома, ею вызываемых.

5. Индукция биназой двойных разрывов ДНК в культуре клеток человека.

Двойные разрывы ДНК (ДРД) появляются вследствие прямого взаимодействия гено-токсических веществ с ДНК, либо опосредованно, вследствие цитотоксичности [Vamvakas, et al., 1997]. Установленное в предыдущих экспериментах цитотоксиче-ское и генотоксическое действие высоких концентраций биназы по отношению к клеткам и организмам разного эволюционного уровня ставит вопрос о возможной индукции ДРД экзогенной рибонуклеазой. Это предположение было проверено на культуре клеток эпителия легких человека А549. Прежде всего было установлено, что экспозиция клеток с биназой в нетоксичном диапазоне концентраций до 0.3 мг/мл не индуцирует ДРД даже в течение 72ч. За 24ч биназа не вызывала индукции ДРД и в диапазоне токсичных концентраций свыше 0.5 мг/мл, а экспонирование клеток с высокими концентрациями биназы в течение 72ч привело к некоторому увеличению степени фрагментации ДНК по сравнению с контрольными клетками без обработки. Подсчет включения изотопной метки в ДНК по фракциям подтвердил, что пик радиоактивности приходится на область фрагментов ДНК размером 150 - 20kbp, причем данные фрагменты составляют не более 6% от общей ДНК клетки (рис.10).

в в я

х «

С.

■ел

2 -1.5 1 + 0.5 0 + -0.5

-ы-

-4-Ы I i ! I I I

(OtOCDCOeOtOOCMlO NNNNNNNo^; N (D lO ij П N ^ О

Размер фрагментов, Mbp

Рис.10. Распределение изотопной метки по фракциям ДНК клеток, экспонированных 72ч с 0.5 мг/мл биназы.

и Каталитически активная бактериальная РНКаза в концентрациях свыше 0.5 мг/мл спустя 72ч инкубации индуцирует в эпителиапьноподобных клетках карциномы легких человека двойные разрывы ДНК, приводящие к образованию фрагментов размером 20-150 kbp, что является ранним маркером апоптических изменений.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

1. Молекулярно-биохимические механизмы активационных эффектов экзогенных бактериальных РНКаз. Результаты проведенных экспериментов позволили установить, что бактериальная РНКаза в низких концентрациях (10"6 - 10"4 мг/мл) обладает рядом эффектов активационного типа.

Необходимо обозначить ряд наших данных как подтверждающие связь между изменениями функций клеточной мембраны и процессом проявления ответа клетки на действие экзогенных РНКаз: это усиление ростостимупирующего эффекта при частичной дестабилизации мембраны, изменение секреции ферментов, увеличение выхода нуклеотидов из клеток бактерий, активация процесса дыхания и увеличение выхода электролитов. Известно, что выход электролитов из клеток можно рассматривать как неспецифическую реакцию на стресс, когда повышение пассивной проницаемости мембраны сопровождается выводом ионов К^Лукаткин с соавт., 1993]. Снижение сопротивления суспензии дрожжевых клеток под воздействием биназы за счет выхода из клеток дополнительных ионов было показано Куприяновой-Ашиной с соавт. [1992]. При действии бациллярной РНКазы на клетки саркомы 37 было зафиксировано увеличение выхода ионов К* [Куриненко с соавт., 1989(6)].

К+/Н+" антипорт является электронейтральным механизмом, он работает без затрат энергии и обусловлен истечением ионов К*' из клетки по градиенту концентрации [Booth, Kroll, 1983]. Электрогенная Н+-АТФаза грибов, растений и большинства бактерий выкачивает из клетки протоны, приводя к зарядке мембраны [Опритов с соавт., 1991]. Активация пассивного выхода электролитов под действием на клетки микроорганизмов стимулирующих доз РНКазы. сопряжена с электронейтральным поглощением протонов в обмен на К*. Если при этом Н+-АТФаза не работает, то внутриклеточная среда закисляется, что ведет к замедлению и прекращению деления клеток. Работа Н+-АТФазы приводит к повышению внутреннего pH, активации синтеза ДНК и, соответственно, деления клеток [Скулачев, 1989]. Поскольку нами была зафиксирована стимуляция клеточного роста и деления, можно предполагать,

что поступление протонов внутрь клетки под действием РНКазы активировало работу Н*-АТФазы. Расход АТФ привел, в свою очередь, к компенсаторной активации митохондриальной биоэнергетики, что регистрировалось нами по увеличению скорости дыхания.

Эффекты такого рода описаны для многих экзогенных веществ различной природы: вызывали стимуляцию регенерации и онтогенеза растений микродозы антиок-сиданта феноксана, фузикокцина, аскорбиновой кислоты [Горбатенко, 1997], активировало рост дрожжей Saccharomyces присутствие мелкодисперсного железа (0.005%) в среде культивирования [Чеботарев, Нуштаева, 1990], интенсифицировал дыхание дрожжей Candida и их репродуктивную функцию озон в концентрации порядка 2(107 - 108) молекул на клетку [Мельникова с соавт., 1989]. Авторы склонны считать пусковым механизмом активации индуцированные эффектором перестройки цитоплазматической мембраны. Конев [1985] рассматривает увеличение проницаемости мембран для нуклеотидов при концентрации РНКазы 0.08мг/мл и дальнейшее ингибирование дыхания дрожжевых клеток (на 40%) как неспецифическую реакцию нековалентного взаимодействия внешней мембраны и экзогенного белка. Показано, что значение pi белка не коррелирует с мембранотропной активностью, а выход нуклеотидов регулируется изменениями pH. Наши результаты не противоречат этому, поскольку экзогенная рибонуклеаза, по всей вероятности, действительно вызывает изменения внутриклеточного pH, однако мы склонны считать, что специфическое воздействие фермента на свой субстрат вносит определенный вклад в регистрируемый тип клеточного ответа. Действительно, имеются данные, что синтетическая бислойная липидная мембрана, ограничивающая содержащий РНК раствор, увеличивает электропроводность при добавлении РНКазы с противоположной стороны [Куриненко, Чертищев, 1989].

Нами установлено, что при увеличении концентрации эффектора активационный ответ клетки нивелируется. РНКаза в концентрации 10"3 -10'1 мг/мл не вызывала изменений в приросте биомассы по сравнению с контролем, увеличение концентрации фермента до 1мг/мл и выше угнетало рост микроорганизмов. Вероятно, ингибирование дыхания и блокирование работы Н+-АТФазы вызвало падение внутриклеточного pH, а это, как известно, препятствует репликации ДНК и делению клеток как про-, так и эукариот [Booth, Kroll, 1983; Скулачев, 1989]. Следствием является гибель клетки.

В табл.3 отражены некоторые различия в функциональной активности клеток, подвергшихся воздействию низких и высоких доз рибонуклеаз.

Таблица 3.

Изменение некоторых функций клетки под влиянием низких и высоких концен-

траций РНКаз по сравнению с контрольными необработанными клетками

Функция Микродозы РНКазы Макродозы РНКазы

Поверхностный заряд (-) Выход электролитов (К*) Выход нукпеотидов Функция Н-АТФазы* Компенсаторная биоэнергетика* Дыхание Внутриклеточный рН* Рост и деление клеток Слабо возрастает Возрастает Незначителен Активируется Активируется Активируется Слабощелочной Активируется Резко снижается Возрастает Резко возрастает Ингибируется Ингибируется Ингибируется Кислый Ингибируется

*- поданным литературы при воздействии различных эффекторов

Таким образом, этапы действия рибонуклеаз в малых концентрациях можно подразделить на специфические и неспецифические.

Первый этап - взаимодействие молекулы экзогенного фермента с клеточной поверхностью - специфичен настолько, насколько он зависит от конкретной структуры белка, его конформации и зарядовых свойств. Этот этап может иметь результатом сорбцию по типу электростатического взаимодействия и(или) узконаправленную связь с каким-либо рецептором. В зависимости от этого варьирует возможность его классификации как неспецифичного или достаточно специфичного. Отметим, что определенную специфику в этот этап вносят аффинные взаимодействия РНКаз с доступным субстратом. Второй этап - активация элетронейтрального переноса К*/Н+' - является неспецифическим ответом на экзогенный стимул, наблюдаемый практически при любом виде стрессовых воздействий, и ведет к собственно актива-ционным реакциям (интенсификация дыхания, деления и пр.). Третий этап строго связан со спецификой эффектора - в данном случае с его каталитической активностью, и приводит к образованию некоторого количества олиго- и мононуклеотидов из РНК, входящей в состав ДНК-мембранного комплекса, в котором ее доля составляет до 40% всего материала [Яг^Иет, 1989]. Результаты третьего этапа будут обусловлены подключением дополнительных эффекторов - продуктов деградации РНК.

Четвертый этап, который, вероятно, реализуется не всегда, предполагает проникновение (интернализацию) эффектора, что может вызвать каскад токсических реакций, инициированных расщеплением внутриклеточной РНК.

2. Переключение типа клеточного ответа при повышении концентрации экзогенных РНКаз. Нами выявлено, что стимулирующие дозы РНКаз (в том числе и дозы, на порядок превышающие стимулирующие, 10'5 - 10"2 мг/мл) вызывали адаптацию бактериальных клеток к последующему действию мутагенов. Вероятно, антимутагенный эффект связан с активацией систем репарации повреждений ДНК, что обычно обнаруживается при предобработке клеток биоантимутагенами репарационного типа действия. К таковым относятся, например, лейкоцитарный и рекомбинант-ный интерферон [Засухина, 1983], кофе и кофеин-содержащие продукты, ванилин, хлорид кобальта, эллаговая кислота [Порошенко, Абилев, 1988]. Возникновение первичных повреждений ДНК приводит к активации системы репарации, в случае безошибочной работы которой все возникшие дефекты устраняются и целостность ДНК восстанавливается. Вероятно, репарационные антимутагены сами могут инициировать минимально необходимое для активации репарационных систем количество повреждений ДНК, причем не обязательно непосредственно.

В частности, установлено, что внутриклеточный рН - величина достаточно постоянная, равная 7.6 у нейтрофильных организмов. Незначительный сдвиг этой величины дальше в щелочную сторону ведет к активации SOS-функций клетки [Padan, Schuldiner, 1987]. В то же время показано, что сигналом инициации SOS-ответа клетки служит образование одноцепочечных фрагментов ДНК [Sommer et al., 1991]. В эукариотических клетках внутриклеточная концентрация Са2+ поддерживается на низком уровне (=100нМ), и ее возрастание является сигналом индукции Са2+ - эндо-нуклеаз, которые могут осуществлять частичное расщепление ДНК [Vamvakas et al., 1997]. Повышение внутриклеточной концентрации Са2+ под действием РНКаз в микродозах было показано Колпаковым [1993]. Это означает, что инициирующие репарацию незначительные повреждения ДНК могут опосредованно появляться при воздействии на клетку микроконцентраций РНКаз. Известно, что экспрессия генов, входящих в SOS-регулон, не одномоментна и происходит поэтапно [Порошенко, Абилев, 1988]. Репаративными белками, уровень которых возрастает в первую очередь, являются белки, работавшие и до индукции - это UvrA, UvrB, UvrC, UvrD, т.е. ферменты безошибочной эксцизионной репарации. При большей мутагенной силе ин-

дуктора включаются гены, ответственные за SOS-репарацию, сопряженную с возникновением мутаций. Действительно, при увеличении концентраций РНКазы мы регистрировали включение индуцибельных SOS-функций: уже при 10~2 мг/мл отмечен выход профага из лизогенных штаммов бактерий и актиномицетов, при дальнейшем увеличении концентраций эффект фиксировали в SOS-хромотесте. Именно в области переходных концентраций (10'2 - 10'1 мг/мл), по всей видимости, клетка еще сохраняет резервные возможности, обеспечивающие нормальный рост. Однако не проявляемые фенотипически процессы, как показано нами, уже могут быть идентифицированы в тестах на индукцию SOS-ответа. Переход к мутагенности, вероятно, облегчают и появляющееся в достаточных количествах продукты деградации РНК. Известно, что дисбаланс пула нуклеотидов приводит к мутациям [Hopkins, Goodman, 1980; Kunz, 1982]. Переключение активационного типа ответа на токсический, будет, вероятно, осуществляться в зависимости от количества и вида повреждений ДНК, возникающих под влиянием РНКазы в различных концентрациях. Существование триггерного механизма, чувствительного к повреждениям ДНК, предполагается во всех типах клеток [Brown, McCarthy, 1997]. Улавливающий повреждения ДНК аппарат будет триггером ряда эффекторных путей, приводящих к репарации ДНК, остановке роста или клеточной смерти (у многоклеточных животных к апоптозу).

На рис.11 отражена зависимость типа биологических эффектов от концентраций экзогенной РНКазы. Следует отметить, что границы различных областей достаточно условны и могут смещаться в зависимости от типа клеток, однако тенденция представленного распределения принципиально не меняется.

! Стимуляция роста I I ! Токсичность

III! SOS-ответ I

! Антимутагенность , I I !

! I I ! ! Генотоксичность

! I ! Нормальный рост 1 ! 1 1 1-1-1-1 1 1 1 1 1 1 1 1

ю" ! Ю'5 I юч I ю-3 I ю-2 I ю-1 ! 1 ¡10

Концентрация РНКазы в среде, мг/мл Отсутствие эффектов Отсутствие

(нормальный рост) выживаемости

<- ->

Рис. 11 Установленные биологические эффекты экзогенной рибонуклеазы и характерные для их проявления области концентраций

На рис.12 схематично представлена взаимосвязь различных клеточных функций, подверженных влиянию эффектора - экзогенной рибонукпеазы. Опираясь на полученные нами данные, можно сделать вывод, что переход активационных эффектов в ингибирующие чувствителен к влиянию повышающихся концентраций РНКазы благодаря наличию каталитической активности фермента, опосредующей возникновение повреждений ДНК.

РНКаза

Изменение поверхностного заряда клетки ("слабое депротонирование / снижение общего отрицательного заряда)

I I

Изменение проницаемости мембраны

(выход К+. вход Н*. усиление выхода нуклеотидов. входа Са2-Ь)

1 ; 4 4-

Активация / ингибирование Н^-АТФазы

^Повышение /пониснсение внутриклеточного £Н4-

4 4- 4-

Расход АТФ1 4- 4- 4-

4- 4- 4- 1 4-

Активация / ингибирование дыхания 1

и компенсаторной биоэнергетики ;

; 4- 1

Стимуляция / ингибирование

синтеза ДНК, белка, деления клеток ^ Активация

1 Са2+ -

4- 4- 4- зависимых

эндонукпеаз

4- Активация 4 1 4

4 систем репарации <—<—<— Повреждения ДНК Смерть <— Токсичность 4-4-4-

Т 1*4- 4- Генотоксичность 4-

Мутагенез <— Включение индуцибельных БС^-функций

Рис.12 Схема взаимосвязи клеточных функций, подверженных влиянию экзогенной РНКазы. Курсивом изображены функциональные состояния, характерные только для высоких доз РНКазы.

3. Некоторые аспекты практического применения рибонуклеаз. Результаты проведенных нами исследований подтверждают широкие возможности использования рибонуклеаз в практике.

Стимуляция. В малых дозах бактериальная рибонуклеаза находит применение в биотехнологии для ускорения наращивания биомассы микроорганизмов и усиления ряда требуемых свойств, например, адгезивной способности лактобацилл и их про-теолитической активности [Колпаков с соавт., 1996]. Результаты настоящей работы дают новую информацию о перспективах дальнейшего применения рибонуклеаз. Эффекты активационного типа в основном относятся к неспецифическим и могут быть вызваны широким спектром веществ. Показанная нами незначительная стимулирующая способность неактивной РНКазы №з101С1и свидетельствует о принципиальной возможности экзогенных белков вызывать клеточный ответ активационного типа. Данное обстоятельство необходимо учитывать при разработке и внедрении биостимуляторов. Несомненные положительные стороны использования в данном качестве рибонуклеаз состоят в том, что чужеродный белок не накапливается в клетках, не циркулирует в организме постоянно, а так или иначе подвергается деструкции, что обеспечивает отсутствие непредсказуемых последствий применения стимулятора. Кроме того, антимутагенные свойства РНКаз проявляются в том же интервале доз, что и стимулирующие, поэтому полученная в присутствии экзогенной РНКазы биомасса лактобацилл, например, вследствие наличия остаточных количеств РНКазы приобретает дополнительные полезные свойства, повышающие качество пробиотических препаратов.

Антимутагенность. Антимутагенное действие бактериальной РНКазы может стать самостоятельным основанием для применения малых доз фермента в качестве протектора. В целях стабилизации генома в условиях растущей мутагенной нагрузки на биосферу не только мероприятия по ограничению поступления мутагенных факторов в среду обитания, но и мобилизация внутренних защитных резервов организма является мерой сохранения генофонда. Важно, что антимутагенный эффект РНКазы, изученный нами в тестах с использованием микроорганизмов, проявляется и на уровне человека как активация репарационного синтеза ДНК в лимфоцитах периферической крови. Вопрос количественных характеристик репаративного синтеза ДНК как процесса, позволяющего клетке адаптироваться к последующему действию мутагенов, и как процесса, включение которого отражает собственно мутагенность

соединения, не решается однозначно. Вероятно, что концентрации, позволяющие зафиксировать увеличение репаративного синтеза в эксперименте, уже являются мутагенными, а эффективные протекторные дозы лежат в области более низких концентраций. Одним из наиболее значимых для практики качеством антимутагенов-репарогенов (в частности, РНКазы), препятствующих реализации первичных повреждений ДНК в мутации, является уникальная возможность применения их непосредственно после мутагенного воздействия, тогда как другие антимутагены должны применяться одновременно с повреждающим фактором. Это свойство РНКазы как репарогена усиливается тем фактом, что метаболически модифицированные продукты ферментативного гидролиза РНК, пуриновые рибозиды (гуанозин, аденозин), также обладают антимутагенными свойствами [Дурнев, Середенин, 1994].

Мутагенность. Что касается мутагенных свойств фермента, то они проявляются только в при использовании РНКаз в высоких концентрациях (свыше 0.1мг/мл) и обусловлены серией внутриклеточных реакций, начинающихся с ферментативного расщепления РНК. Принято считать, что фактор мутагенности нежелателен для терапевтических препаратов широкого спектра действия, однако представленный нами механизм последовательного перехода одного типа эффектов в другой служит надежным ориентиром направленного применения РНКаз, тем более что геноток-сичность средств противоопухолевой терапии - нормальное явление. Для эндонук-леазы Serratia marcescens была установлена способность индуцировать хромосомные аберрации в клетках яичника сирийского хомячка [Johannes, Obe, 1994]. В этом случае, учитывая возможную прямую деградацию ДНК ферментом, проникновение которого в клетку было усилено гипертоничным раствором глицерина, наличие мутагенности вполне объяснимо. В случае мутагенности РНКаз действие фермента на ДНК может проявляться только опосредованно. Имеются данные об образовании хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей под действием препаратов двуспиральной РНК - индукторов интерферона [Дубатолова с соавт., 1989]. Вероятно, продукты ферментативной деградации дсРНК клеточными РНКазами приводили к изменению баланса нукпеотидов, что является мутагенным фактором [Kunz, 1982], либо действие было связано с еще неизвестными регуляторными функциями олиго-нуклеотидов - продуктов деградации РНК. Не подлежит сомнению роль РНКаз в регуляции активности генов [Плутахин с соавт., 1990]. Кроме того, обнаружение регулирующих развитие консервативных РНК-связывающих белков подразумевает соб-

ственную регуляторную роль РНК во многих клеточных процессах [Bandziulis et al., 1989].

Противоопухолевое действие. Перспективы терапевтического использования рибонуклеаз сегодня достаточно широки. Особенно детально проработан вопрос противоопухолевого действия онконазы, пиримидин-специфичной эндорибонуклеа-зы ооцитов лягушки. Этот ферментный препарат прошел I и II фазы клинических испытаний как самостоятельный терапевтический агент для пациентов с различными солидными опухолями [Mikulski et al., 1995; Boque, Wlodawer, 1996]. Несомненным преимуществом действия онконазы является ее нечувствительность к клеточному белковому ингибитору РНКаз [Saxena et al., 1991, 1996]. Это же свойство присуще и бактериальным рибонуклеазам - биназе и ее ближайшему гомологу барназе. Противоопухолевое действие биназы установлено в отношении асцитной формы карциномы Эрлиха и лимфолейкоза NKLy [Куриненко с соавт., 1988]. Результаты наших исследований не только подтверждают возможность аналогичного использования биназы, но и предоставляют новые сведения о биохимических механизмах, лежащих в основе ее противоопухолевого действия.

Нами установлено, что РНКаза B.intermedius блокирует Са2*' - зависимый ток калия (Кса ток) из клеток трансформированных онкогенами фибробластов. Закономерности, установленные пока для ограниченного числа линий трансформированных клеток, указывают на определенную маркерную роль Кса тока, который активен в этих клетках без стимуляции митогеном, а в нормальных клетках индуцируется после митогенной стимуляции [Draheim et al., 1995]. Можно допустить, что блокирование процесса онкогенной трансформации должно быть связано с редукцией Кса тока. Биназа в высоких концентрациях действительно оказывает ингибирующее действие на Кса ток, сопряженное с подавлением роста культуры клеток. Особенно привлекает внимание избирательная цитотоксичность фермента: как было установлено нами, по сравнению с нормальными фибробластами мышей ras-трансформированная культура была наиболее чувствительна к токсическому действию биназы. Блокирование Кса тока в этих клетках проявлялось спустя 48ч роста клеток в присутствии биназы в концентрации свыше О.Змг/мл. Довольно продолжительный интервал времени до проявления эффекта требуется клеткам для накопления метаболических изменений, вызванных РНКазой, и связан, вероятно, с трудностью протекания процесса интернализации фермента.

Индукция апоптоза. Также продолжительное время необходимо для того, чтобы биназа могла индуцировать двойные разрывы ДНК, регистрируемые с помощью гель-электрофореза в пульсирующем поле в виде фрагментов ДНК. На наш взгляд, фрагментация ДНК связана с активацией клеточных эндонуклеаз, вызванной серией опосредованных РНКазой реакций, в частности, повышением содержания ионов Са2+ в цитозоле. Заметим, что и активация калиевого тока при митогенной стимуляции или онкогенной трансформации клеток также зависит от повышения внутриклеточной концентрации Са2+. Образование короткоцепочечных фрагментов ДНК размером 20-150 kbp, выявленное нами при воздействии биназы на эпителиальнопо-добные клетки саркомы легких человека, является характерным ранним маркером апоптоза [loannou, Chen, 1996].

Полученные данные вызывают интерес к специализированному медико-биологическому исследованию фермента, поскольку нами обоснован ряд перспективных с точки зрения противоопухолевой терапии положений: это способность биназы индуцировать апоптоз эпителиальноподобных клеток карциномы легких человека; селективно ингибировать рост фибробластов, экспрессирующих ras-онкоген, и блокировать в них Са2+ -зависимый ток калия, характерный для ряда трансформированных и стимулированных митогенами клеток.

Нефротоксичность. В организме после внутрибрюшинного введения бациллярная РНКаза быстро всасывается в системный кровоток, ее максимальная концентрация в сыворотке крови наблюдается через 15мин. В основных экскретирующих органах, печени и почках, доля детектированного в органах и тканях фермента составляет 47.6%. Было установлено, что введенная в организм грызунов бациллярная РНКаза примерно через 1ч концентрируется в почках в 2-4 раза по сравнению с исходной дозой [Куприянов-Ашин с соавт., 1988]. Принимая во внимание факты преимущественного накопления бактериальной РНКазы в почках, мы провели исследование нефротоксичности фермента в системе изолированно перфузированной почки крыс. Оказалось, что нефротоксичность проявляют только каталитически активные бактериальные РНКазы в дозах порядка 10'1 - 10"2 мг/мл в перфузионной среде и 50мг/кг при внутрибрюшинном введении. Сопоставив наши данные по характеристике изолированной почки спустя 6ч после инъекции биназы, и почки спустя 6ч после инъекции 40мг/кг известного нефротоксиканта S-(1,2-дихлорвинил)-1.-цистеина, мы обнаружили, что нефротоксичность исследованных соединений сопоставима.

Биназа вызывала увеличение выделения белка с мочой до 120-150мг/ч (70-90мг/ч в контрольной перфузии), а цистеиновый коньюгат дихлорвинила - до 200мг/ч. Соответственно активность у-глутамилтрансферазы, фермента, определяемого как маркер нарушения целостности мембран проксимальных канальцев нефрона [Lock, 1993], возрастала до 280ед/мл и 110ед/мл (контрольное значение 110ед/мл), что говорит о более сильном мембраноповреждающем действии РНКазы. Возможно, этот факт связан с доступностью субстрата - РНК в клетках проксимальных канальцев.

4. Секретируемая РНКаза бацилл как природный регулятор состояния микробного биоценоза. Поскольку РНКаза представляет собой небольшой глобулярный белок, довольно устойчивый к протеолизу и нагреванию [Голубенко с соавт., 1979; Balaban et al., 1989; Лещинская с соавт., 1991], она способна некоторое время сохраняться вне клетки продуцента. Основной функцией секретируемой рибонук-леазы является, как можно представить, защита клетки-хозяина от бактериофагов и образование строительных блоков для "своих" клеток из "чужих" макромолекул рибонуклеиновых кислот. Наличие наряду с бациллами в микробиоценозе почвы других бактерий и микромицетов делает последних подверженными стимулирующему влиянию малых доз секретируемого фермента. Развитие почвенной микрофлоры, в том числе дрожжей [Колпаков, 1993], олиготрофных микроорганизмов [Егоров с соавт., 1994], азотфиксаторов [Наумова с соавт., 1996] и др. приводит к обогащению почвы доступным органическим веществом. Косвенное воздействие РНКазы, вероятно, реализуется посредством активированного ею выхода физиологически активных веществ из клеток других бактерий, что теоретически может привести к вытеснению из биоценоза мицелиальных грибов. В пользу этого предположения свидетельствуют данные по усилению антагонистических свойств ризобий по отношению к мицелиальным грибам [Наумова с соавт., 1996], а также наши результаты по подавлению целлюлазной активности представителя рода Aspergillus. В то же время действие малых доз РНКазы на клетки микроорганизмов связано, как показано нами, с адаптацией их к последующему действию химических мутагенов. Таким образом упрощенно можно представить, как внеклеточная РНКаза способствует созданию и развитию определенного стабильного природного сообщества микроорганизмов.

При активном размножении бацилл и секреции ими РНКаз в биоценоз естественным путем будет вводиться фактор дестабилизации генома микроорганизмов - членов ценоза. Действительно, нами установлено ДНК-повреждающее действие РНКа-

зы, а также индукция под ее влиянием выхода фагов из лизогенных культур бактерий и акгиномицетов. Включение SOS-функций клетки является предусмотренным природой механизмом, ведущим к генетическому разнообразию одноклеточных, а секре-тируемая РНКаза бацилл, как свидетельствуют результаты наших экспериментов, является индуктором этих функций. Образование мутантных форм расширяет спектр утилизируемых субстратов и делает возможным освоение микроорганизмами новых мест обитания. При этом сами продуцирующие РНКазу бациллы ограждены от вытеснения другими видами токсическим влиянием высоких концентраций фермента как антагонистического фактора.

Учитывая эволюционную роль РНК как молекулы, хранящей генетическую информацию, и в то же время предшественника каталитически активных белков-ферментов, а также значительную консервативность РНКаз [Beintema et al„ 1988; Beaudry, Joyce, 1992], вполне вероятно, что секретируемые РНКазы являются древнейшими регуляторными молекулами, контролирующими количественный и качественный состав микробных популяций. Эта функция рибонуклеаз особенно важна в условиях отсутствия антропогенных факторов, которые, естественно, подавляют роль многих природных регуляторов.

ВЫВОДЫ

1. Экзогенная рибонуклеаза в малых дозах порядка 10"6 - 10"4 мг/мл вызывает стимуляцию процессов жизнедеятельности грамотрицательных и грамположитель-ных микроорганизмов, а также низших эукариот, проявляющуюся в увеличении количества клеточной биомассы, скорости роста, процесса дыхания целых клеток и изолированных митохондрий, а также активности сукцинатдегидрогеназы.

2. Рибонуклеаза в микроконцентрациях обладает свойствами репарационного биоантимутагена в бактериальных тест-ситемах, снижая число индуцированных ре-вертантов Salmonella thyphimurium в тесте Эймса и уменьшая величину фактора индукции стандартного мутагена в SOS-хромотесте после предварительной инкубации клеток тестерных штаммов с рибонуклеазой.

3. РНКаза изменяет свойства клеточной поверхности, в стимулирующих дозах повышая электрофоретическую подвижность микроорганизмов, индуцируя выход из клеток ионов электролитов, изменяя секрецию протеолитических ферментов и ферментов целлюлазного комплекса.

4. Основной вклад в активацию жизнедеятельности микробных клеток вносит каталитическая активность экзогенных РНКаз, связанная с расщеплением мембра-ноассоциированного субстрата - РНК - и освобождением продуктов гидролиза - оли-гонуклеотидов, выполняющих регуляторную функцию.

5. В области высоких концентраций (0.1 -10 мг/мл) бактериальная рибонукпеаза проявляет токсическое действие, угнетая рост микроорганизмов, уменьшая выживаемость и вызывая морфологические изменения глаз плодовой мушки дрозофилы, ингибируя рост культур клеток фибробластов мыши, куриного эмбриона и эпители-альноподобных клеток карциномы легких человека. РНКаза демонстрирует возможность избирательного подавления роста клеточных культур, экспрессирующих газ-онкоген, за счет блокирования специфического Са2+-зависимого калиевого тока. В системе изолированно перфузированной почки крыс РНКаза обладает нефротокси-ческим эффектом.

6. Рибонуклеаза в высоких концентрациях является мутагеном, инициирующим повре>едения ДНК, включение БОБ-ответа и повышение числа ревертантов в тестах с использованием микроорганизмов. На уровне эукариотического организма рибонуклеаза вызывает индукцию генных мутаций у Ого$орЫ1а, образование микроядер в эритроцитах периферической крови мышей, усиление репаративного синтеза ДНК в лимфоцитах крови человека. В культуре клеток человека РНКаза продуцирует характерную микрофрагментацию ДНК, являющуюся ранним маркером апоптоза.

7. Токсические и генотоксические свойства РНКазы прямо коррелируют с величиной каталитической активности фермента.

8. Механизмы полифункциональных эффектов экзогенной бактериальной рибо-нуклеазы нашли отражение в принципиальной схеме, включающей следующие ключевые этапы: ассоциация экзогенной РНКазы с условным рецепторным участком клеточной поверхности; образование регуляторных метаболитов - продуктов ферментативного гидролиза мембраноассоциированной РНК; активация стимулирующего сигнала к изменению экспрессии генов; клеточный ответ. Переключение клеточного ответа с активационного на ингибиторный обусловлено триггерным механизмом, чувствительным к повреждению ДНК.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи

1. Иванченко О.Б., Ильинская О.Н., Карамова Н.С., Черепнева И.Е. Оценка гено-токсичности ферментного препарата "биназа" // Молекул, генет., микрсбиол. и виру-сол., 1991,- №11.-С.22-25

2. Иванченко О.Б., Ильинская О.Н., Фаттахова А.Н., Скипина И.М., Черепнева И.Е. Оценка генотоксичности неионогенных поверхностно-активных веществ II Биол. науки, 1991.-№1.-С.75-80

3. Иванченко О.Б., Ильинская О.Н., Карамова Н.С., Черепнева И.Е. Механизмы проявления генотоксических эффектов биназы//Биол. науки, 1992.-№2.-С.108-112

4. Иванченко О.Б., Ильинская О.Н, Карамова Н.С. Генотоксичность препарата "биназа" в тестах на Salmonella: тест Эймса и Ara-тест// Цитология и генетика, 1992,-Т.26,№3.-0.52-56

5. Ильинская О.Н., Крылова Н.И. Действие экзогенной РНКазы на клетку низших эукариот// Приклад, биохим. и микробиол., 1993.-Т.20,№.2.-С.280-285

6. Поцелуева Л.О., Купрюнов-Ашин Е.Г., Перцев I.M., Гунько В.Г., Баранова А.О., 1лынська O.I., Мочалова Н.К., Лещиньска 1.Б. Вивличення впливу природи мазево! основи на вившьнення бактер1альн1 рибонуклеази з мазей ¡ оцЫка ix míkpo6ho¡ чисто-ти // Фармацевтичний ж-л, 1993.-№1.-С.79-81

7. Карамова Н.С., Ильинская О.Н., Иванченко О.Б. Мутагенная активность 2,4,6-тринитротолуола: роль метаболизирующих ферментов // Генетика, 1994.-Т.30,№7,-С.898-902

8. Ilinskaya O.N., Ivanchenko О.В., Karamova N.S. Bacterial ribonuclease: mutagenic effect in microbial test-systems // Mutagenesis, 1995.-V.10,№3.-P.165-170

9. Иванченко О.Б., Ильинская О.H., Карамова Н.С. Антимутагенная активность ферментного препарата "биназа" в микробных тест-системах // Микробиология, 1995.-Т.64,№2.-С.234-238

10.Leschinskaya I.B., Kupriyanova F.G., Yakovlev G.I., Kipenskaya L.V., Ilinskaya O.N. Molecular mechanisms of growth stimulating effects of Bacillus intermedius RNase // Karadeniz Journal of Medical Sciences, 1995. - V.8, N4. - P..218-219

11.Карамова H.С., Мынина И.И., Гараева Г.Г., Иванченко О.Б., Ильинская О.Н. 2,4,6-тринитротолуол и 2,4-диамино-6-нитротолуол: отсутствие гес<А-зависимого мутагенеза? // Генетика, 1995.-Т.31,№5.-С.617-621

12.Ильинская О.Н., Иванченко О.Б., Карамова Н.С., Ремизов А.Б., Скворцов А.И., Фишман А.И. Зависимость величины индуцированного 2,4,6-тринитротолуолом мута-

генеза от физиологического состояния тестерных штаммов Salmonella thyphimurium //Микробиология, 1996. -Т.65, №1, - С.84-88

13.llinskaya O.N., Vamvakas S. Alterations of renal function in the isolated perfused rat kidney system after in vivo and in vitro application of S-(1,2-dichlorovinyl)-L-cysteine and S-(2,2-dichlorovinyl)-L-cysteine//Archives of Toxicology, 1996. -V.70. - P.224-229

14.0lga N. Ilinskaya, Olga B. Ivanchenko, Nazira S. Karamova, Lora V. Kipenskaya. SOS-inducing ability of native and mutant microbial ribonucleases // Mutation Research, 1996. - V.354. - P.203-209

15.Иванченко О.Б., Ильинская О.Н., Кипенская Л.В., Лещинская И.Б. Индукция SOS-ответа РНКазой Bacillus intermedius И Микробиология, 1997. - Т.66,№4. - С.444-448

16.0lga N. Ilinskaya, Spiros Vamvakas. Nephrotoxic effects of bacterial ribonucleases in the isolated perfused rat kidney//Toxicology, 1997. - V.120. - P.55-63

17.lvanchenko O.B., Karamova N.S., Ilinskaya O.N. Genotoxosity of bacterial ribonuclease in mammalian cells after its application in vivo and in vitro. In: M.G.T.Carrondo et al. (eds) "Animal cell technology". Kluwer Academic Publishers, Netherlands, 1997,-P.127-132

18.Карамова H.C., Ильинская O.H., Иванченко ОБ., Ермолаев А.И., Гильмутди-нов Г.З., Гершанов Ф.Б., Хамитов Б.Г. Исследование генотоксических эффектов то-нзрола II Генетика, 1997. -Т.33,№9. - С.1310-1312

19.0.Н.Ильинская. Цитотоксичность биназы в культуре клеток животных и человека. В сбор. "Ферменты микроорганизмов" (н.ред. И.Б.Лещинская), Казань, 1998. -С. 182-190

20.Колпаков А.И., Ильинская О.Н., Кипенская Л.В., Яковлев Г.И., Куприянова-Ашина Ф.Г. Изменение функций плазматической мембраны под действием рибонук-леазы Bacillus intermedius. В сбор. "Ферменты микроорганизмов" (н.ред. И.Б.Лещинская), Казань, 1998. - С.201-210

21.Кипенская Л.В., Куприянова-Ашина Ф.Г., Ильинская О.Н., Колпаков А.И., Лещинская И.Б. Влияние РНКазы Bacillus intermedius с разной каталитической активностью на размножение Escherichia coli и Bacillus subtilis II Микробиология, 1998. -Т.67,№2. - С.165-168

Тезисы докладов и материалы конференций

22.Иванченко О.Б., Ильинская О.Н. Исследование генетической активности ри-бонуклеазы в бактериальных тест-системах / Тез. докл. X конф. мол. учен. "Синтез и исслед. биол. акгивн. соединений", Рига, 1989.-С.122

23.Иванченко О.Б., Ильинская О.Н., Черепнева И.Е., Мабенджиева Е.В. Генетическая токсичность бактериальной рибонуклеазы / Тез. докл. межреспубл. конф. "Нуклеазы микроорганизмов и их практическое использование", Рига, 29нояб.-1дек. 1989.-1989,-С.25

24.Поцелуева J1.J1., Куприянов-Ашин Э.Г., Заиконникова И.Б.,Ильинская О.Н., Мустафин P.P. Экспериментальное обоснование необходимости стерилизации и де-пирогенизации лекарственных форм бактериальной рибонуклеазы / Матер, итоговой науч. конф. КГУ, естествен, науки за 1988г., - Казань, 1990.-С.46-50

25.Ильинская О.Н., Иванченко О.Б. Черепнева И.Е., Лещинская И.Б. Мутагенные и антимутагенные эффекты препарата "биназа" / Докл. секции генетич. аспектов проблемы "Человек и биосфера", Самарканд, 10-13 окт.1990. - С.82-83

26.Иванченко О.Б., Ильинская О.Н., Карамова Н.С., Черепнева И.Е. Оценка генетической активности бактериальной рибонуклеазы Яез. докл. 9-ой конф. межвуз. (межотраслев.) проекта "Ферменты микроорганизмов" (Нуклеазы).-20-24 мая 1991г., Казань,1991.-С.36-38

27.Ильинская О.Н., Иванченко О.Б., Карамова Н.С. Микробная рибонуклеаза B.intermedius: антимутагенные свойства фермента / Тезисы докл. конф. "Биосинтез ферментов микроорганизмами", Москва, 26-27 окт.1993г.-С.73

28.lvanchenko О.В., Ilinskaya O.N., Karamova N.S. Bacterial ribonuclease mutagenic effect / Poster abstr. "Molecular Mechanisms of Environmental Mutagenesis and Cancer", Hudding, August 20-25,1994. - P.10

29.Kipenskaya L.V., Ilinskaya O.N., Leshchinskaya I.В.. Growth stimulating action of exogenously applied RNase and its mutants / Book of Abstracts, Beijerinck Centennial, 10-14 December, 1995, The Hague, The Netherlands. -1995. - P.536-537

30.Karamova N.S., Ilinskaya O.N., Ivanchenko O.B. 2,4,6-Trinitrotoluene: genotoxicity on E.coli PQ 37 (SOS chromotest) / Book of Abstracts, Beijerinck Centennial, 10-14 December, 1995, The Hague, The Netherlands. -1995. - P.538-539

31 .Ilinskaya O.N., Karamova N.S., Ivanchenko O.B. 2,4,6-trinitrotoluene: mutagenicity and metabolism in Salmonella / Abstracts of the 1995 International Co-Conference on ICEP'95-ICONE'95, 17-24 July 1995, St.Petersburg, Russia. 1995,- P.18

32.Ilinskaya O.N., Karamova N.S., Ivanchenko O.B. Metabolism and mutagenicity of 2,4,6-TNT in Salmonella /Abstracts of 7th Eur. Congr. on Biotechnology., Nice, Feb.19-23, 1995.-Vol.4.-P.97

33.L.V. Kipenskaya, O.N. Ilinskaya, I.B. Leschinskaya. Investigation of biochemical properties of mutant derivatives of bacterial RNases I Abstracts of 4th International

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Ильинская, Ольга Николаевна, Казань

/ /

МИНИСТЕРСТВО ОБЩЕГО И ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

КАЗАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

ИЛЬИНСКАЯ Ольга Николаевна

БИОЛОГИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ ЭКЗОГЕННЫХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ РИБОНУКЛЕАЗ

03.00.07- микробиология и 03.00.04 - биохимия

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научный консультант д.б.н., профессор, академик АН РТ И.Б.Лещинская

КАЗАНЬ - 1998

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ....................................................................................................6

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................................16

I. Рецепторные взаимодействия в сигнальной системе живой

клетки........................................................................................................16

1. Рецепторы клеток высших эукариот..................................................17

2. Передача сигналов в клетках прокариот............................................23

И. Современные подходы к оценке генотоксичности соединений . . 30

1. Тестирование на мутагенность в бактериальных тест-системах . . 31

2. Тестирование на генотоксичность in vivo..........................................35

3. Тестирование на генотоксичность в системе клеточных культур. . 38

III. Разнонаправленные эффекты биологически активных веществ . .41

1. Зависимость типа проявляемых эффектов от дозы эффектора .... 41

2. Регуляция функциональной активности клетки низкомолекулярными продуктами деградации естественных полимеров..............................................................................................47

3. Экзогенные рибонуклеазы как модуляторы клеточных функций .. 51

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ............................................................61

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ......................................61

1. Материалы............................................................................................61

2. Методы определения жизнеспособности и функциональной

активности..........................................................................................62

2.1. Параметры роста микроорганизмов............................................62

2.2. Дыхание целых клеток и изолированных митохондрий..........62

2.3. Цитотоксичность в культуре клеток............................................64

2.4. Нефротоксичность в системе изолированно перфузированой

почки............................................................................................65

3. Методы определения генотоксичности..........................................66

3.1. Тест на повреждение ДНК............................................................66

3.2. Тест Эймса......................................................................................66

3.3.Ага-тес т..........................................................................................67

3.4. Тест на индукцию профага..........................................................67

3.5. SOS-хромотест............................................................................68

3.6. Тест на соматические мутации и рекомбинацию у Drosophila. . 68

3.7. Микроядерный тест........................................................................69

3.8. Тест на внеплановый синтез ДНК................................................69

3.9. Выявление двойных разрывов ДНК методом электрофореза в пульсирующем поле (PFGE)..........................................................70

4. Аналитические методы......................................................................72

4.1. Содержание белка...................................................................71

4.2. Содержание глюкозы......................................................................71

4.3. Активность ферментов....................................................................72

4.4. Выход нуклеотидов из клеток бактерий......................................73

4.5. Электрофоретическая подвижность микробных клеток............73

4.6. Электропроводность суспензии микробных клеток..................74

4.7. Мембранный ток целой клетки и отдельных каналов (метод "patch clamp")..................................................................................74

5. Математическая обработка результатов......................................75

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ РАБОТЫ..............................76

I. Биологические эффекты малых доз РНКаз..........................................76

1 .Активирующее процессы жизнедеятельности влияние

рибонуклеаз............................................................................................76

1.1 .Бактериальная РНКаза как стимулятор роста эукариотических

микроорганизмов...................................... 76

1.2. Действие биназы на ряд секретируемых ферментов низших эукариот............................................. 79

1.3.Ростостимулирующее действие нативной и мутантных РНКаз по отношению к прокариотам............................. 81

1.4. Выход нуклеотидов под действием ферментов из клеток грамотрицательных и грамположительных бактерий....... 83

2. Антимутагенное действие РНКазы.......................... 88

3. Изменение электрофизиологических характеристик микробных

клеток.................................................. 94

3.1. Влияние биназы на электрофоретическую подвижность дрожжевых клеток..................................... 94

3.2. Влияние биназы на выход ионов из клеток микроорганизмов...................................... 97

II. Токсическое действие высоких доз РНКаз.................... 100

1. Нефротоксические эффекты бактериальных рибонуклеаз.......100

2. Цитотоксичность биназы в культуре клеток животных и

человека................................................ 109

3. Изменение мембранного тока под действием биназы в нормальных

и трансформированных фибробластах....................... 116

III. Генотоксические свойства бактериальных РНКаз............ 121

1. Эффект биназы в бактериальных тест-системах.............. 121

2. SOS-индуцирующая активность экзогенных рибонуклеаз...... 129

3. Влияние РНКазы на геном дрозофилы..................... 135

4. Действие биназы на генетический материал клеток крови млекопитающих.........................................143

5. Индукция биназой двойных разрывов ДНК в культуре клеток

человека...............................................145

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.................................155

1. Молекулярно-биохимические механизмы активационных эффектов экзогенных бактериальных РНКаз......................... 155

2. Переключение типа клеточного ответа при повышении концентрации экзогенных РНКаз.......................... 164

3. Некоторые аспекты практического применения рибонуклеаз ... 170

4. Секретируемая РНКаза бацилл как природный регулятор состояния микробного биоценоза.......................... 180

ВЫВОДЫ.................................................... 183

Литература................................................... 185

ВВЕДЕНИЕ

К настоящему времени обнаружено огромное количество факторов, которые подразделяют на активирующие биологические процессы и ингибирующие их, исходя из типа установленного эффекта. Знаменитое высказывание Парацельса "доза разграничивает яд и лекарство" датируют началом XVI века. Однако биологически активные вещества в сегодняшней практике применяют в области конкретного эффекта, не всегда учитывая последствия их альтернативного действия. Противоположная область и регуляция переключения клеточного ответа с одного типа на другой остаются неизученными. Тем не менее накоплена масса данных о разнонаправленном действии ряда факторов в зависимости от концентрации: стимулирующем влиянии малых доз мутагенов [Раппопорт с соавт., 1980], афлатоксина [Halt, Sutic, 1989], озона [Мельникова с соавт., 1989], мутагенной активности стимуляторов роста растений [Конобеева, 1987]; интерфероногенной и антимитогенной активности 2'-5' олигоаденилатов [Мацука с соавт., 1998]; активирующем и ингибирующем рост действии нуклеаз [Folkman, Klagsbrun, 1987; Куприянова- Ашина, 1989, 1992; Nitta et al., 1996], продуктов жизнедеятельности микроорганизмов [Филимонова, 1985], фитогормонов [Ковалев, 1983], антиоксидантов [Горбатенко, 1997].

Работами школы микробиологов Казанского университета впервые установлен ряд закономерностей регуляции синтеза нуклеаз бактерий и указано на неоднозначность проявления биологических эффектов экзогенных ферментов [Куприянова-Ашина, 1989, 1992; Лещинская с соавт., 1991]. Поскольку рибонуклеазы, как новый класс цитотоксических агентов, считают, с одной стороны, вызывающими торможение роста опухолей и размножения вирусов [Karpetsky, Levy, 1981; Алексеева с соавт., 1981; Куриненко с соавт., 1988; Youle et al., 1993; Nitta et al., 1996; Prior et al., 1996], а с другой - стимуляторами роста растений и микроорганизмов [Колпаков и Куприянова, 1992; Егоров с соавт., 1994; Наумова с соавт., 1997], возникает насущная необходимость комплексного изучения разнонаправленных биологических эффектов бактериальных РНКаз на объектах различного эволюционного уровня. Известно, что изменение направленности эффекта при переходе от низких доз к высоким, достаточно индивидуальном для конкретного вещества и организма, осуществляется с помощью некого триггерного механизма, ответственного за проявление условных "положительных" и "отрицательных" эффектов. Вместе с тем "отрицательный" с позиций отдельного организма эффект на уровне популяции может быть рассмотрен как благоприятный, способствующий ее выживанию и адаптации. Вышеизложенное обусловливает актуальность исследования биохимических механизмов проявления того или иного типа клеточного ответа под действием биологически активных соединений, каковыми являются бактериальные рибонуклеазы.*

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы явилось установление биохимических механизмов разнообразия клеточных

ответов под действием экзогенного эффектора - бактериальной рибонуклеазы - на организмах различного эволюционного уровня.

В соответствии с заданной целью были поставлены следующие задачи.

6. Исследовать влияние экзогенной биназы на первичную (лимфоциты) и перевиваемую (эпителиальноподобные клетки карциномы легких) культуры клеток человека.

8. Установить ключевые этапы взаимодействия рибонуклеазы с клеткой, необходимые и достаточные для проявления определенного типа клеточного ответа, и провести сравнительный анализ их вовлеченности в универсальную цепь передачи сигналов.

Научная новизна. С позиций системного эволюционного подхода исследован широкий спектр разнонаправленных биологических эффектов, вызываемых экзогенной бактериальной рибонуклеазой при действии ее на клетки прокариот, низших эукариот и многоклеточных животных, включая человека. Получен ряд приоритетных данных, пополняющих фундаментальные знания биологии регуляторных систем живой клетки. Работа такого масштаба, с полным валидным набором тестерных систем различного эволюционного уровня, с оригинальным применением нового уникального инструментария для оценки вклада специфических и неспецифических взаимодействий эффектора с клеткой - нативного и ряда мутантных ферментов с направленно измененной каталитической активностью - проведена впервые. Это позволило выявить общие закономерности функционирования клеток различной архитектоники и уровня организации в ответ на действие ауторегулятора первого эшелона значимости, влияющего на нуклеиновые кислоты, и сформулировать гипотезу общности в проявлении клеточного ответа. В результате проведенных исследований на защиту выносятся следующие научные положения, в полной мере отражающие новизну проделанной работы.

Основные защищаемые положения диссертации

■ Малые концентрации РНКазы в среде культивирования (10"7 -10"4 мг/мл) обладают стимулирующим рост и деление действием по отношению к клеткам бактерий и эукариот, причем стимулирующее действие сопряжено с активацией процессов дыхания целых клеток и изолированных митохондрий, а также с повышением активности ключевых ферментов метаболизма, в частности, сукцинатдегидрогеназы. Дестабилизация мембран поверхностно-активным веществом приводит к увеличению стимулирующего

г о

эффекта РНКаз. В области стимулирующих доз (10° - 10 мг/мл) бииаза обладает также антимутагенным действием, активируя работу репарациионных систем клетки.

■ Высокие концентрации биназы (0.1 - 10 мг/мл) обладают токсическим и генотоксическим действием по отношению к микроорганизмам и высшим животным, а также в системе изолированных органов и в культурах клеток животных и человека. Между активирующими и подавляющими концентрациями лежит интервал "нейтральных" доз, характеризующийся сбалансированной настройкой стимулирующих и ингибирующих сигнальных путей, приводящих к отсутствию фенотипического эффекта.

■ Цитоплазматическая мембрана является ключевым звеном в эффекторном пути, активируемом рибонуклеазой. Каталитически активные ферменты воздействуют на мембраносвязанную РНК, вызывая увеличение содержания нуклеотидов в среде инкубации. Проявление тонкой специфики действия биназы, а именно изменение секреции ферментов целлюлазного комплекса, блокирование Са -зависимого калиевого тока ионных каналов гаБ-трансформированных клеток, увеличение выхода из клеток микроорганизмов ионов электролитов, - обусловлено изменением свойств клеточных мембран.

о i

активации белка RecA у низших организмов и Са -зависимых эндонуклеаз у высших, приводящих к индукции мутаций в ходе ошибочной репарации и фрагментации ядерной ДНК соответственно.

Теоретическая и практическая значимость. Создана принципиальная теоретическая схема универсального переключения типа клеточного ответа под действием экзогенного белкового эффектора, обладающего ферментативной активностью, на модельных системах про-и эукариотических клеток. Выявлены фундаментальные закономерности включения сигнальных систем живой клетки при их активации экзогенной рибонуклеазой в широком диапазоне концентраций. Определен вклад аффинных взаимодействий и специфическая роль собственно рибонуклеолитической активности в реализацию индуцируемых эффектором функций клетки. Проведенное глубокое теоретическое обоснование механизмов действия РНКазы in vitro и in vivo позволяет выработать корректные рекомендации для практического применения фермента в биотехнологии и медицине.

Практическое использование фермента в малых дозах возможно не только в качестве известного стимулятора роста, но и для направленного увеличения выхода определенных ферментов, что несомненно важно учитывать при разработке новых промышленных биотехнологий. Выявленное антимутагенное действие биназы предполагает новый аспект ее применения в качестве репарационного биоантимутагена. Дальнейшее углубленное изучение тонких аспектов проблемы апоптических

изменений клеток и блокирования биназой Са -зависимого калиевого тока ионных каналов, специфичных для онкотрансформированных клеток, может стать основой создания противоопухолевых препаратов нового поколения. Несомненную практическую значимость имеет полная и всесторонняя оценка генотоксических свойств биназы в макродозах, необходимая для любого практического использования фермента. Выделение, характеристика и разработанный способ культивирования целлюлолитического микромицета, защищенные двумя патентами РФ, найдут применение в промышленном получении ферментов целлюлазного комплекса.

Связь работы с базовыми научными программами. Работа в течение 1988-1998гг. проводится в соответствии с планом НИР Казанского государственного университета (№ госрегистрации 01910049994). Исследования в рамках тематики работы были поддержаны грантами Санкт-Петербургского университета (1992-1993гг., № 2-101-30-53, направление "Биология: молекулярные меха�

Информация о работе

Ильинская, Ольга Николаевна
доктора биологических наук
Казань, 1998
ВАК 03.00.07

Диссертация

Биологические эффекты экзогенных бактериальных рибонуклеаз - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Биологические эффекты экзогенных бактериальных рибонуклеаз ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Биологические эффекты экзогенных бактериальных рибонуклеаз"

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Ильинская, Ольга Николаевна, Казань

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биологические эффекты экзогенных бактериальных рибонуклеаз
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология