Влияние химической модификации на физико-химические свойства и цитотоксичность рибонуклеазы Bacillus intermedius

Давыдов, Рустам Энверович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние химической модификации на физико-химические свойства и цитотоксичность рибонуклеазы Bacillus intermedius
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние химической модификации на физико-химические свойства и цитотоксичность рибонуклеазы Bacillus intermedius"

. -I

; и

о ~ ü- Ü

Л П \) .">

. ... г"-

П';' ,'v с- ' ' ii-"

на правах рукописи

PR) /3<&•<>/ ЛрсаЮ

ДАВЫДОВ Рустам Энверович УДК 577.152.277: 577.112.4: [577.322.2, 615.275]

ВЛИЯНИЕ ХИМИЧЕСКОЮ МОДИФИКАЦИИ НА ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И ЦИТОТОКСИЧНОСТЬ РИБОНУКЛЕАЗЫ BACILLUS INTERMEDIUS

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань - 2000

Работа выполнена в лаборатории инженерной энзимологии Казанского государственного университета имени В.И.Ульянова-Леннна.

Научный руководитель:

Доктор биологических наук, профессор Б.М.Куриненко

Официальные оппоненты:

Доюгор медицинских наук, профессор, академик АН РГ Д.М. Зубанров

Ведущая организация

Доктор биологических наук, »едущий научный сотрудник ОА. Чернова.

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится " 2000 г. в часов на заседании

диссертационного Совета К 053.29.19 при Казанской государственном университете имени Б,И.Ульянова-Ленина по адресу: 420008, Казань, уп. Кремлевская, 18.

С диссертацией можно ознакомиться б библиотеке Казанского государственного университета.

Автореферат разослан " 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, А кандидат биологических наук оЬ ^

А. Н. Аскарова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. К настоящему времени накоплен обширный материал по влиянию рибонуклеазы Bacillus intermedius на процессы жизнедеятельности клеток про- и эукариот. Показано, что рибонуклеаза [¡.intermedins способна вызывать различные биологические эффекты, как на уровне клетки, так и па уровне организма. Она обладает противовирусным, противоопухолевым и иммуностимулирующим действием - стимулирует гуморальный и клеточный иммунитет, нсспецифичсскне факторы резистентности. Рибонуклеазы вызывают стимуляцию гемопоэза и стимуляцию пролиферация некоторых клеток высших эукариот [Курннеюсо, 1991). В зависимости от концентрации РНКазы могут стимулировать или кягибировать размножение клеток микроорганизмов (Солдатова, Беляева, 1972; Добротииа и др., 1992; Колпаков и др., 1989]. Использование фотоокисленноЙ н инактиаированной методом сайт-специфического мутагенеза рибонуклеазы B.intewiedius позволило установить, что ряд биологических эффектов рибонуклеазы каталитически обусловлен: с наличием ферментативной активности связаны противовирусное действие рибонуклеазы, токсическое н генотожеичеекое действие, циготоксичность рибонуклеазы, ростстимупи-руимцес действие ва микроорганизмы [Куриненко, 1991; Килсяская, 1998; Ильинская, 1998].Известна гипотеза, объясняющая механизм биологического действия нуклеаз комплексным проявлением каталитической функции РНКаз, аффинным и веспсцнфн-ческим взаимодействием с плазматической мембраной клетки [Куриненко, (991]. Очевидно, что степень выраженности биологических эффектов фермента на клеточном /ровне зависит от его способности к контакту с клеткой, который определяется совокупностью свойств плазматической мембраны клетки и физнко-химнчсских свойств фермента. Это предполагает, что нзмеяение любого элемента указанной еовокуп-jocth свойств, например, физнко-химических свойств фермента, может существенным >бразом отразиться на эффективности его взаимодействия с клеткой, и, следователь-JO, на биологической активности фермента.

Одним из основных инструментов изменения физико-химических свойств белка тлястся его хнмячссхая модификация. Данные, полученные при изучении зависимости биологической активности от структуры методами химической модификации ие-юльзуются для развития исследовании на основе сайт-специфического мутагенеза. Химическая модификация интересна и с практической гочкн зрения: применение химической модификации позволило создать пролонгированные ферментные препара-

ты, препараты с измененными имнуногенными и аллергенными свойствами [Ларионова, Торчилин, 1982; Чазов и др., 1985; Максимеико, 1988].

Вес вышеизложенное дасг основание рассчитывать на плодотворность использования методов химической модификации для изменения физико-химических свойств РНКазы Е.Шегт&Ииа и, как следствие, изменения ее биологической активности.

Цепь и задачи исследований. Целью исследования явилось изменение каталитически обусловленной биологической активности гуаиилслецифичной РНКазы В. 'шетЫШ5 методами химической модификации.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Разработать условия модификации препаратов РНКазы ВлтегтеЛ-а глута-ровым альдегидом и диальдегиддекстраном, позволяющие поучать препараты с высоким выходом по белку и высокой ферментативной активностью.

2. Исследовать энзиматические свойства, стабильность, гидрофобность и элек-трофоретическую подвижность препаратов РНКазы ВлШегтеЛиа, модифицированных введением в молекулу фермента различных функционально-активных групп.

3. Изучить каталитически обусловленные цитотоксическне свойства препаратов РНКазы ВМШтеЛш с измененными физико-химическими и эизиматичеекими свойствами.

Научная новизна работы. Впервые показана возможность направленною получении модифицированных ферментов с заданным числом связей фсрыснт-поламерный носитель с использованием носителя с одной степенью активации. Получены гвдро-фобнзированиые препараты РНКаз с высоким уровнем ферментативной активности.

Показано влияние изменения ф изию-м« и чесасих свойств на каталитически обусловленную цитотоксичность модифицированной РНКазы В.1Шегте&и$. Показано, что цитотоксичность РНКазы В.1Шегтесйи$ возрастает при ее гидрофобизации - в большей степени при введении в молекулу фермента алхильных, а ис ароматических радикалов. Увеличение цитотоксичности при гидрофобизации алкиламинами обусловлено не токсичностью последних, а изменением физико-химических свойств модифицированного фермента. Показало, что увеличение суммарного отрицательного заряда РНКазы Влпыгтеа1ш сопровождается снижением цитотоксичности фермента, тогда как увеличение суммарного положительного заряда не оказывает влияния на цитотохсические свойства. Влияния изменения Касс модифицированного фермента с З'-ГМФ на каталитически обусловленную цитотоксичность фермента не выявлено,

Результаты работы подтверждены авторским свидетельством об изобретении.

Практическое значение. Разработан способ получения модифицированных форм рибонуклеазы с разный числом связей фермент - полимерный носитель при использования нося геля с одной и той же степенью активации. Разработан способ увеличения гидрофобности фермента с сохранением высокого уровня ферментативной активности. Способы могут быть использованы для получения новых препаратов, применяемых в медицине и биотехнологии, в практике научных исследований. Полученный фотоокнеленный нетоксичный препарат РНКазы B.Itttermedlvs может быть использован вместо нативног о фермента для стимуляции каталитически независимых биологических эффектов.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были изложены на XV конференции FEBS (Брюссель, 1983); Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии" (Пущино, 1984); I Всесоюзном симпозиуме по инженерной энэимологии (Кобулетн 1985); I международной конференции " Структура и химия рнбонужлеаз" (Москва, 1989); на межреспубликанском совещании "Нуклсазы микроорганизмов и юс практическое использование" (Рига, 1989); Всесоюзной конференции "Методы получения, анализа и применения ферментов" (Рига, 1990); Втором съезде биохимичеосого'общества Российской академии наук (Пущино, 1997); XI Всероснй-скон конференции "Ферменты микроорганизмов" (Казань, 1998).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ, в том числе получено авторское свидетельство об изобретении.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 117 страницах машинописного текста; состоят из обзора литературы, описания материалов и методов исследований, раздела собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа содержит 12 таблиц, 13 рисунков. Список литературы содержит 171 наименование литературных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Объектом исследования служила злектрофоретически гомогенная внеклеточная гуанилепецифичиая рибонуклеаза Bacillus intermedius (РНКаза Bi) [Голубенке, 1979) и ее производные, полученные путем химической модификации.

Диальдегнддехстраи (ДАД) получен периодатным окислением декстрааа (реополиглюкин, М.М. 35000) с помощью йодной кислоты [Хомяков и др., 1965].

В работе использовали препарат глутарового альдегида (ГА) фирмы Sigma. Молекулярная масса препарата, определенная по гель фильтрации составила около 300, что соответствует трнмеру глугарового альдегида.

Число связей фермент-модификатор (ЧТС) определили по разности в числе аминогрупп способных взаимодействовать с трннитробензолсульфокнслотой (TNBS) у иативного н модифицированного фермента [Fields, 197!].

Количество остатке» триптофана определяли с помощью титрования белка N-бромсукциниикдом [Голубснко и др., 1981J.

Рнбонуклеазвую активность препаратов определяли по количеству хнелото-растворнмых продуктов, образовавшихся при ферментативном гидролизе дрожжевой суммарной РНК. За единицу активности принимали количество фермента, которое вызывает пророст оптической плотности при 260 им иа 1 опт.сд. за час инкубации. [Лещннекая и др.,1980]

Для анализа полученных данных использовали понятие относительной ферментативной активности (ОФА): ОФА =(удельная активность модифицированного препарата)/(удсльная активность иативного фериента).

Относительную константу ассоциации модифицированных препаратов с гуа-ннловым нуклеотидом (Касс) определяли относительно константы ассоциации на-тивной рибоиуклеааы с помощью метода гель-фильтрации [Нишше!, Dryer, 1962); константу ассоциации фотоокиеяеняой РНКазы Bi (PHKaoaBiin) с З'-ГМФ рассчитывали из разностных спектров поглощения комплекса белка, с нуклеотидом. [Голубенке. 1982]

Калориметрические измерения проводили на дифференциальном адиабатическом сканирующем иикрохадоримстрс ДАСМ-1М [Privalov, 1980]

Термостабильность модифицированного фермента выражали как остаточную активность в процентах по отношению ж исходной после прогрева препарата при 65°С в течение определенного времени. [Будворд, 1988]

Поверхностное натяжение растворов препаратов РНКазы (о) определяли ста-лагмометрическим способом или методом взвешивания капель [Адам, 1947], концентрация препарата 0,2 мг/ил в 0,14MNaCl, поверхностное натяжение 0,14 MNaCl 72,1 дин/см.

Относительную элекгрофоретнчсскую подвижность модифицированных препаратов (Rf) определяли относительно подвижности нагнвной РНКазы Bi при электрофорезе на нитроцеллюлозиой мембране 'Тасма" N4 [Дэвени, Гергей, 1976].

Фракционный состав РНКазы, модифицированной глутаровын альдегидом, определяли электрофоретическнм разделением препарата белка в 15% полиакрила-мидном геле в присутствии додецнлеульфата натрия [Гуркова и др., 1982]. Гель, после

окрашивания в кумвсси синем R250 и отмывании в 7 % уксусной кислоте, сканировали на спектрофотометре U-40 (Германия). О количественном составе изучаемого препарата судили по площади соответствующих пиков.

Цитотоксвческие свойства препаратов РНКазы in vitro изучали на перевиваемой мояоотойнон кулыуре клеток амниона человека линии FL. Для оценки аато-токсической активности использовали метод витального окрашивания клеток нейтральным красным [Fmter,1969].

Цитотоксические свойства оценивали с помощью двух показателей - удельной цитотоксичностп и относительной аитотохсичкоств. Удельная цитотохсичность характеризует цитотохснчность ферментного белка вне зависимости ог его каталитической активности. Её рассчитывали на 1 нот фермента по формуле:

УЦ =(100 - х) / (количество фермента, мот) усл.ед/мкг фермента, где х - количество нейтрального красного, экстрагированного из клеточного монослоя, выращенного в присутствии фермента, а процентах от контроля.

Относительная цитотоксичность характеризует кратность изменения удельной цнютоксичности фермента вследствие его модификации. Её рассчитывали следующим образом: ОД =(УЦ модифицированного фермента) / (УЦ натнвного фермента)

Отношение ОЦ/ОФА отражает кратность различий в изменении цитотоксич-ности и каталитической активности фермента вследствие его модификации и рассматривается как синоним понятия относительной "каталитической цитотокенч-ности".

Цнготоксические свойства препаратов РНКазы in vivo оценивали в отношении хлетох аецнтиой опухоли NK/Ly [Курияеко и др., 1988]. Токсическое действие препаратов оценивали по торможению роста опухоли н средней продолжительности жизни животных.

Выход ионов калия под действием препаратов рибонуклеаэы измеряли мембранным ионоселектявным калиевым электродом ОР-К-0711Р (Radelkis, Венгрия) на суспензии живых клеток саркомы 37 [Атаулпахлнов и др., 1984].

Б работе вес эксперименты были проведены не менее чем в пяти повторностях. Статистическая значимость различий между экспериментами рассчитывалась по критерию Стьюдента, Статистическая значимость различий соотношения ОЦ/ОФА определялась используя стандартное епкяонеиие определенное по " закону сложения ошибок", чното степеней свободы определялось по формуле Уепча {Вознесенский, 1981]. Все статистические расчеты проводились для уровня значимости 0,05, досто-

верная разница неясцу данными дон модифицированного и натнвного фермента отмечена а таблицах знаком *

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Получение мЬяфшфровашмх рцбовукяеаз я их физике -химические и жтмати-чгские емйешл

Оптимизацию процесса модификации РНКазы Bi дналъдсгиддекстрапом проводили по методу Еохса-Уилеона [Налимов, 1965} с учетом формализованных выходных параметров. Выходной параметр Z определяли дни каждого опыта по формулам:

Z=K, /К2; К! =10* xtm' х1п(100/(100-Ь)); К2 =10"*1в(100/а), где

Ki и Кг при условии, что реакции связывания и инактивации имеют пеевдопер-вый порядок по концентрации рнбонуклеазы, будут пропорциональны константам скоростей связывания и инактивации, соответственно. Выходной параметр Z отражает соотношение параметров К) и Кг; („- продолжительность модификации РНКазы днальдегнддскстраном, ннн; b - выход модифицированной РНКазы за время ta в процентах.; {,- время инкубации нативной РНКазы с нативным декстраном при условиях модификации, мин; а - процент сохранения ферментативной активности нативной РНКазы за время инкубация t¡.

На основе анализа значащих коэффициентов регрессии для линейного приближения функций отклика (таблица 1) проведены опыты для движения в направлении градиента линейного приближения. После последовательной реализации всех этапов оптимизации предложены условия проведения реакция связывания рнбонуклеазы Bi диальдегнддекстраном: рН реакционной смеси несущественен в интервале 7,0 - 8,5, температура модификации 40°С - 45°С, соотношение дежетран/рибонуклеаза S/1, степень активации декстрана 18-20, концентрация рнбонуклеазы 2-3 мг/нл, дополнительное внесение NaCl для увеличения ионной силы не требуется.

Таблица I

Оптимизации процесса модификации РНКазы Bi диальдсгнддскстраном, Коэффи-

Выходной Коэффициенты регрессии

параметр рН степень активация ДАД ДАД /РНКазз с рнкиы, мг/мл Т,"С ионная сила

К( 9,8 57,3 44,5 49,3 95,2 -36,5

& 3,58 - 0,0025 9 0,097 a 2,67 -1,035®

Z -0,57° 4,32 3,28 4,07 6,30 -2,41

' Коэффициент не значим, р<0,05

2 3 4 5 6 Время, чес

Ряс.1, Выходные параметры реакции модификации РНКазы В| дн-альдегидцекстранои в зависимости от времени модификации. 1-выход по белку, 2- выход но активности, 3-доля вступивших в реакцию с ди-альдегидом аминогрупп

200 300

OSbtW. МИЛ

Рис.2. Хроматографический профиль реакционной смеси диальдегиддекстран -РНКаза Bi на колонке с сефадексом G-10O. А-РНКаза Bi-ДАД; В- РНКаза Bi. Продолжительность модификации,час: 1-0,5; 2-1; 3-3; 4-5; 5-6 часов. Свободный обьем колонки, определенный по Blue Dextran 2000 составляет 75 мил

Зависимость числа точек связывания рибонухлеазы с диальдегиддекстраном от времени модификации (рис.1) показывает, что связывание фермента с носителем происходит и после образования комплекса фермент - носитель. Это увеличение числа точек связывания может происходить двумя способами - увеличением числа молекул носителя, связанных с одной молекулой фермента преимущественно одной связью, и, соответственно, увеличением молекулярной массы модифицированного фермента или путем увеличения числа связей между одной молекулой носителя и одной молекулой фермента. При гель-фильтрации реакционной смеси на сефадекее О-100 не наблюдалось изменение объема элюцпп модифицированного фермента при варьировании времени модификации (рис 2). Это свидетельствует о том, что взаимодействие РНКа-зы Bi с днальдегнддскстраном протекает по внутримолекулярному механизму. При увеличении числа связей фермент - носитель происходит увеличение температуры денатурации и уменьшение термостабильности фермента. Модифицированный фермент о большим числом связей характеризуется меньшей удельной активностью.

Разработанную методику получения РНКазы В1-ДАД использовали для получения препаратов РНКазы В! модифицированной диальдегиддекстраном с последующим введением различных функциональных групп. Для введения положительного заряда использовали гндрокенламнн (препарат РНКаза В1-ДАД+), введение отрицательного заряда в диальдегщздекстраяовуго матрицу проводили обработкой бисульфитом натрия (РНКаза В1-ДАД')[Генникова и др., 1980]. Для изменения гидрофоб-ности матрицы использовали диэтилпарафенилевдиамин, фенилбутиламнн и пенти-

ламин (препараты РНКаза Bi-ДАД-ДЭФДА, РНКаза Bi-ДАД-ФБА и РНКаза Bi-ДАД-ПА). Все препараты синтезируются с достаточно высоким выходом по белку (свыше 80%) и сохранением высокой ферментативной активности (15-60%).

Известно, что в бедках фотоокиспеншо могут подвергаться остатки гисянднна, тирозина, мстношша, и цистсина [Means, Feeney, 19711. Серосодержащие аминокислотные остатки в составе молекулы РНКазы Bi отсутствуют [Афаиасенко и др., 1979], а оптимальные условия для окисления остатков гнетидина РНКазы не совпадают с таковыми для окисления остатков тирозина, следовательно, потенциальным побочным объектом фотоохяслсвия в молекуле РНКазы Bi при рН 7,5 могут оказаться лишь остатки триптофана, реакционная способность которых не имеет выраженной рН зависимости [Means, Feeney, 1971],

Фотоокисление РНКазы сопровождается инактивацией фермента, причем процесс инактивации подчиняется кинетике реакции первого порядка. Кинетические параметры инактивации РНКазы практически не изменяются в диапазоне концентраций мстилснового синего 0,002-0,0125%. Кинетика инактивации при этом идентична кинетике накопления ннактнвированного продукта (остаточная активность менее 0,1%) с окисленным остатком гнетидина. Побочное фотоокиетение происходит после достижения 50% глубины инактивации фермента в реакционной смеси (рис 3).

Выделение фотоокислснной РНКазы Bi (РНКазы Впп) из реакционной смеси проводили путем хроматографии последней на фосфоцеллюлозе в условиях использованных для разделения продуктов ацилирования РНКазы [Голубенке и др., 1982]. При этом наряду с отделением фотосеяснбнлнзагора происходит эффективное фракционирование продуктов фотоокисления фермента (рис.4). Симметричность белковых пиков, соответствующих фотоняактивированной и каталитически активной фракциям РНКазы, свидетельствует об юс хроиатографической гомогенности, Хроматографи-ческое поведение фоминакгввированной РНКазы свидетельствует о понижении сродства модифицированного фермента к фосфоцеллзшгозе. Таким образом, очевидно, что фотоокислению подвергается фосфат-связывающий участок активного центра РНКазы Bi (HislOl).

Согласно данным аминокислотного анализа фракций 1 и 3 проведенных Шляпниковым C.B. (Институт молекулярной биологии РАН, Москва), в молекуле фотон-нактивированной РНКазы отсутствует гистидин и увеличивается содержание аспара-гиновой кислоты, содержание остальных остатков ие изменяется. Количественная оценка содержания триптофана показала, что ею уменьшение в обеих фракциях не

100

Тгр.ошиель

о.е

[№с1]. м

0.«

0.2

10 50 30 <0 « Ы> Врьип.имм

Ряс.З. Зависимость остаточной рибо-нуклеазной активности реакционной смеси (А) от времени фотоокислення РНКазы В1 (I) и динамика окисления остатков триптофана(Тгр) (2)

а» 400 т т юоо

Рис.4. Хроматография продуктов фа-тоокислсния РНКазы В) на фосфоцсл-люлоэе Р-11. 1- фотоинактивированная РНКаза В), 2-мстилсновын синий, 3-каталитичееки активная РНКаза В|

превышает 0,10-0,15 остатка, т.е. находится на уровне ошибки определения. Таким образом, различия в аминокислотном составе фогоинактнвнрованного и натнвного фермента минимальны и касаются практически только Иге 101 активного центра, который окисляется до аспарагиновой кислоты.

Одним из критериев сохранения нативной структуры молекулы РНКазы в целом является способность модифицированного но остатку гистидина фермента образовывать комплекс с нуклеотндом, лосколыу взаимодействие Н1а101 с фоефорибо-зшгьным фрагментом З'-ГМФ хотя и увеличивает прочность связывания, однако не является решающим для комплексообразования [Карпейсжий и др., 1981; Голубенко и др., 1982). Разностный УФ-спектр, индуцируемый при образовании комплекса фотои-иактивированной РНКазы с З'-ГМФ, по форме аналогичен спектру, полученному при взаимодействия ли ганда с натнвным ферментом. Из анализа зависимости интенсив. ности поглощения в разностном спектре комплекса фотоинактнвированной РНКазы с З'-ГМФ от концентрации нуклеотида при постоянной концентрации белка следует что фотоинактивированная РНКаза, как и нагивный фермент [Карпейский и др., 1981) имеет один центр связывания, а качественное подобие разностных УФ-спектров, возникающих при комплексообразоваиии препаратов фотоннактквированиой и кативной РНКазы с З'-ГМФ, свидетельствует об отсутствии существенных изменений в структуре молекулы при фотоокислении. Значения константы связывания лиганда с фото-инактивнрованнон РНКазон (Кз 3,8x1®* М'1) примерно в 15 раз ниже, чем константа соответствующего комплекса с иатнвной РНКазой (Кц б^хЮ'М"1).

□ б

0.4

о.о

Весьма незначительные различия в температуре денатурации (Т0) и энтальпии денатурации (ДНгал) для иативного и фотоокиелейного фермента в ацетатном буфере позволяют предположить, что при фотоокисленни гнетндина не происходит существенных изменений в конфориацин белка. Сопоставление температур денатурации иативного и фотоохистенного препаратов в фосфатном и ацетатном буферах (табл. 2), показывает, что хотя стабилизирующее действие фосфата проявляется как для иативного, так н фотоокислснного ферментов, Та значительно увеличивается для иативного фермента (на 8"С). Следовательно, взаимодействие фосфат-иона с гистяди-ном активного центра иативного фермента стабилизирует структуру белка. Разрушение остатка гнетидина в молекуле фотоинактивированной РНКазы приводит к уменьшению стабилизации.

Таблица 2

Калориметрические параметры термоденатурации натнвной и фотоокислеиной РНКазы В]_ _ _ _

Среда Препарат Тд,°С ДН>ал, кгрк/моль

0.05М фосфат рН 4,5 РНКаза В) 60,8 588

РНКаза ВНп 56,0 550

0,05М ацетат рН 4,5 РНКаза В1 52,8 565

РНКаза Вин 52,2 562

Глутаровый альдегид широко применяется как бифункциональный реагент при модификации беякоь [Муронсц, Наградова, 1984]. Мы исследовали влияние иа модификацию РНКазы В1 глугароаым альдегидом следующих факторов : соотношение глутаровый альдегид/фермент, концентрация фермента н продолжительность реакции модификации.

Как следует из таблицы 3, при концентрации белка 0,25 мг/мл обнаружены производные РНКазы (РНКаза В1-ГА) с молекулярной массой 8,7 кДа • меньшей, чем у мономера РНКазы н промежуточной между мономером и димером (около 17 кДа), т.е. накратной молекулярной массе иативного фермента (М.М РНКазы 12,3 кДа). Мы полагаем, что в этих случаях в молекуле РНКазы глутаровый альдегид образует внутримолекулярные сшивки [Казанская и др., 1973], что препятствует разворачиванию белка в ДДС N3. и, вследствие зтого, молекулярная масса этих производных определяется как некратная молекулярной массе иативного фермента, несмотря на то, что эти производные представляют собой мономер и димер РНКазы.

Посте изучения динамики модификации РНКазы Глухаревым альдегидом, на основании проведенных исследований разработана методика модификации и на ее основе получены гидрофобизнрованные мономерные форм фермента, различающихся модифицирующим амином и количеством модифицирующих групп на молекулу фермента: этаноламияом (РНКаза В1-ГА-ЭА), пентнланином (РНКаза Вг-ГА-ПА), фенялбутиламнном (РНКаза В1-ГА-ФБА).

При модификация РНКазы В1" как правило наблюдается уменьшение удельной рибонуклеазной активности получаемых препаратов. Одним из редких исключений из этого правила является препарат РНКазы, модифицированный по карбоксильным группам (РНКаза В1-Эт, получена по методу [ГогсЫНп е! а1, 1978]) удельная активность которого практически не снижалась (98% нативного). Модификация РНКазы по е-аминогруппам лнзнна (РНКаза В1-ГА, РНКаза В1-Сц [ОоЫ51еЬ, 1972], РНКаза В1-ДМСИ (Коо1е1п1 с1,а1., 1979]) вызывала снижение удельной активности препарата до 87 - 60% исходной (табл. 4). Можно предполагать, что одной из причин уменьшения удельной РНКазной активности этих препаратов (модифицированных по лизину) является модификация существенного для проявления активности остатка лизина (1_уг-26). Исходя ю того, что диальдегиддекстряновые производные РНКазы обладают меньшей РНКазной активностью, чей препараты полученные с помощью глутарового альдегида при близком числе связей фермент - носитель (табл. 5), очевидно, что другой причиной снижения каталитической активности РНКазы В) модифицированной

Таблица 3

Зависимость фракционного состава модифицированной глутаровым альдегидом

Концентрация мг/мл Мономер димер гример гетра мер пента мер поли мер

РНКаза ГА 8,7 12.3 17 25 36

постоянное соотношение РНКаза/ГА 1/200 М/М

0,25 0,4 9,2 69,3 1,7 15,8 2,9 1,1

0,5 0,8 56,1 24,1 10,0 5,4 1,2 1,7

1,0 1,6 49,2 27,4 11,9 8,6 2,3 1,8

1,5 2.4 образование осадка

постоянная концентрация ГА

0,25 0,8 2,1 54,6 1,4 21,8 9,7 6,4 1,2 2,6

0,5 0,8 56.1 24,1 10,0 5,4 1Д 1,7

1,0 0,8 49,3 24,5 12,2 9.0 2,2 2,2

1,5 0,8 47.4 25.7 12,1 9.4 2,1 2.5

2,0 0.8 42,7 26.8 10.8 8.3 1,8 2.0

2,5 0,8 образование осадка

Таблица 4

Физико-химические свойства и цитотоксичность in vitro модифицированных мономерных производных РНКзы Bi_ ___

Препарат ОФА Касс RF Тд,°С УЦ ОЦ ОД/ОФА

РНКаза Bi 1,00 1 1 55.2 63,3 1.00 1.0

РНКаза Е i in 0,01 0,09 1,0 55,0 0,6* 0,0095* О„95±0,ОЗ

РНКаза Bi-ГА 0,59 2,4 1,0 - 0,0* 0,0* 0,0±0,4*

РНКаза Bi-Сц 0,75 0,06 -1,15 49,0 12,5» . 0,20* 0,25 ±0,04*

РНКаза Bi-Эт 0,98 2,9 1,15 54.5 63,1 1,00 1.0 ±0,1

РНКаза Bi-ДМСИ 0,87 2,2 1,15 55,3 66,6 1,05 1,2 ±0,2

диалъдегиддекстраном могут являться также стерическис препятствия при взаимодействии РНКазы В1 с РНК. Модификация рибонуклеазы вероятно приводит к нарушению яатнвион структуры белка - частичному разворачиванию белка, что подтверждается уменьшением ДК*ЗП для РНКазы ВьДАД. Введение в окружение модифицированной РНКазы отрицательного заряда (РНКаза ВьДАД")'вызывает дальнейшее снижение ДН1®" вероятио вследствие дальнейшего искажения структуры РНКазы вследствие образования дополнительных нсковалентных связен между носителем и ферментом.

Возникновение дополнительных электростатических связей межцу рнбонуклеа-зой и носителем может объяснить и данные по остаточной активности модифицированных ферментов после их инкубации при 65° С. Модифицированная рибонуклеаза с дополнительными функциональными группами в матрице в начале инкубации более стабильна, чем фермент с немоднфнцнрованнон матрицей. Возможно, это связано с образованием дополнительных электростатических или гидрофобных связей между рибонуклеазой и носителем и (или) стеричсскими препятствиями для денатурации при введення дополнительных функциональных групп, что отражается и на повышении температуры денатурации. Поэтому, введение в матрицу объемного гидрофобного арильного радикала оказывает наибольшее стабилизирующее действие при инкубации афермента при 65° С. Вместе с тем взаимодействие фермента с матрицей при денатурации фермента может фиксировать структуру фермента н при его разворачивании (при денатурации), затрудняя ренатурацию. Вероятно, это и проявляется посяс четырехчасовой инкубации: ферментативная активность заряженных форм становилась существенно ниже нейтрального варианта. Увеличение температуры денатурации модифицированной диальдегиддекстраяом РНКазы В) с увеличением числа связен фермент - носитель также свидетельствует об увеличении заторможенности кон-формационных изменений прн модификации.

Цатотоксгтикть моднфицироеатых препаратов РНКаз

Ранее было показано, что цитотоксичность нативных ферментов РНКазы А и 'РНКазы Bi обусловлена их каталитической активностью [Куринснко, 1991], Это было продемонстрировано сравнением цитотоксичности натнвного фермента н его менее токсичного фотоинактивнрованного производного без учета количественных показателей зависимости цитотоксичности от каталитической активности. В качестве такого показателя мы использовали параметр ОЦ/ОФА, который позволяет оценить отношение кратности изменения удельной цитотоксичности к удельной активности фермента вследствие его модификации. Хорошо совпадающие значения этого параметра для натийной и фогоокнеленной РНКазы (табл.4) свидетельствуют о том, что удельная цитотоксичность фотоокисаеннои РНКазы снижается во столько раз, во сколько раз снижается удельная активность фермента, а незначительная цитотоксичность РНКазы Biin обусловлена ее остаточной активностью. Это свидетельствует о пропорциональности изменения цитотоксичности и каталитической активности фермента вследствие его фотоокисления и о том, что единица ферментативной активности РНКазы Bi и РНКазы Biin обладает одинаковой цитотокеичноетью.

У всех без исключения модифицированных препаратов РНКазы Bi отмечено изменение Касс с гуаниповым нуклеотидом (табл.4)'. Не исключено, что изменение Касс с нуклеотидом может привести к изменению активности РНКазы и изменению предпочтительности к разрываемым фосфодиэфирным связям, образуемым с участием гуанилового нуклеотнда. Из таблицы 4 следует, что Касс не коррелирует с активностью модифицированных препаратов РНКазы и, следовательно, ее нельзя рассматривать как причину уменьшения их активности. Таким образом, изменения Касс не может быть опосредованной (через активность) причиной снижения цитотоксичности модифицированных препаратов фермента. Нельзя исключить, что изменения Касс модифицированных препаратов РНКазы Bi могут отражать особенности их субТаблица 5

Влияние способа введения гидрофобного амина на физико-химические свойства и

цитотоксичность in vitro модифицированных препаратов РНКазы Bi

Препарат ЧТС ОФА о, дин/см УД оц ОЦ/ОФА

РНКаза Bi 0 1,00 70,5 18 ±2,3 1,0±0,]3 1,0±0,13

РНКаза Bi-ДАД 3,0 0,35 71,6 0,02±2,0* о,о±ол* 0,0±0,1*

РНКаза Bi-ДАД-ФБА 2,7 0,40 68,7 0,7±1,5* о,о±од* 0,0±0,1*

РНКаза Bi-ДАД-ПА 2,5 0.44 67,1 14.5J4.2 0,80±0,25 1,8 ±0,52

РНКаза Bi-ГА 3,0 0,60 69,2 0,2±1,2* 0,0±0,1* 0,0±0,1*

РНКаза Bi-ГА-ФБА 2,8 0,64 65,6 78±7,8* 4,3±0,23* б,7±0,73*

РНКаза Bi-ГА-ПА 2,5 0,49 64,2 88±4,4* 4.9±0,24* 10,»±0,67»

стратной специфичности, Изданных таблицы 4 следует, что корреляция между Касс и параметрами, характеризующими цитотоксичесасие свойства препаратов, отсутствуют. Таким образом, естя изменения Касс с нуклеотидои свидетельствуют об изменении субстратной специфичности (изменении предпочтительности к разрываемым фосфодиэфирным связям) фермента, следует признать, что изменения субстратной специфичности не оказывают влияния на токсические свойства РНКазы. Из вышеизложенного следует, что Касс модифицированных препаратов РНКазы В1 с гуанило-вым нуклеотидом независимо от ее возможной связи с субстратной специфичностью фермента незначима для нхцитотоксичсскнх свойств.

Из идентичности макронолекулярной организации РНКазы В1 и РНКазы Вин и их физико-химических свойств, о чем свидетельствуют наши данные и данные иммунологического родства этих ферментов, полученные НехорОшковой и др., [1988], следует, что различия в нх цнтотокспчностн обусловлены различиями в активности (числе оборотов фермента), с чем согласуется корреляция между изменениями показателей удельной цитотоксичности и каталитической активности. Обобщенным свидетельством этой корреляции является совпадение значений параметра ОЦ/ОФА на-тивного и фотоохи сменного ферментов. Следовательно отклонение значении этого параметра у некоторых препаратов фермента с измененными физико-химическими свойствами от аналогичного показателя натнвного фермента, достаточно надежно свидетельствует о влиянии этих изменений на каталитически обусловленную цнто-токсичносгь. Анализ влияния изменении структуры н физико-химических свойств полученных нами препаратов РНКазы ВI на их цитотоксячность позволяет сделать следующие обобщения.

Этаяоламидирование РНКазы или модификация РНКазы диметилсуберимида-том существенно не изменяют удельную цитотоксичиость препаратов. Относительная ферментативная активность в первом случае остается неизменной, во втором - снижается весьма незначительно (табл. 4), относительная каталитическая цитотоксичиость в обеих случаях близка к 1,0. Таким образом, все эти случаи не выходят за ранки представлений о прямой зависимости цитотоксичности от каталитической активности фермента и свидетельствуют либо о незначимости увеличения суммарного положительного заряда РНКазы В| д ля увеличения ее цитотоксичности, либо о недостаточной степени увеличения заряда.

Для препарата РНКаза В1-Сц наблюдается значительное снижение показателя ОЦ/ОФА, несмотря на высокий уровень сохранения ферментативной активности но-

дифицированного препарата фермента. Исходя из незначимости Касс с З'-ГМФ для цитотоксичности модифицированных препаратов РНКаз, следует предположить, что наиболее вероятная причина уменьшения цитотоксичеоотх свойств РНКазы Bi-Сц заключается в том, что для отрицательно заряженного препарата модифицированного фермента мишень, находящаяся на отрицательно заряженной плазматической мембране становится менее доступной в силу электростатического отталкивания фермента от мембраны.

Наиболее вероятной причиной отсутствия цитотоксичности препарата РНКазы Bi-ГА. является то, что вследствие восстановления гдутаральдегидиых тримеров они превращаются в электронейтральные "хвосты", которые подобно диальдегидцекстра-новой матрице создают стерическне препятствия для взаимодействия фермента с плазматической мембраной клетки. В результате молекулярная мишень фермента в плазматической мембране становится недоступной действию препарата РНКаза Bi-ГА подобно препарату РНКаза Bi-ДАД (табл.5). Отсутствие цнтотоксичности в тесте с НКр диальдегиддексграновых производных РНКазы (РНКаза Bi-ДАД-ФБА и РНКаза Bi-ДАД), вероятно, связано с экранированием обьемной декстриновой матрицей структур РНКазы, обеспечивающих взаимодействие фермента с клеткой.

Цитотоксичность диальдегиддекстрановых производных in vivo выше чем in vitro, что может быть следствием опосредованного воздействия РНКазы на опухолевый процесс [Куриненко, 1991 ].

Как следует из таблицы 5 введение в молекулу РНКазы гидрофобных групп -остатков алкиламнна или ариламнна, уменьшает поверхностное натяжение растворов препаратов и приводит к увеличению их цитотоксичности. Для выяснения вопроса не связано ли изменение цитотоксичяосгя этих препаратов с проявлением цито-токсяческого действия пентиламина, исследовалась цитотоксичность гидрофобизи-рованной пентиламииом через глутаровый альдегид нативной и фотоокисленной по HislOi РНКазы Bi. Из таблицы 6 следует, что препарат гидрофобизированной пенти-ламииом нативной РНКазы токсичнее нативяого фермента. Гидрофобизирование фотоокисленной РНКазы «с привело к увеличению (проявлению) токсичности фермента даже при концентрации, превышающей концентрацию нативного фермента в 10 раз и содержащей в 10 раз большее количество моноамина. Следовательно моноамни не вносит заметного вклада в токсичность гидрофобизнрованиой рнбонукпе&зы. Поэтому есть все основания полагать, что увеличение цитотоксичности гидрофобизирован-иых препаратов обусловлено не наличием алкиламнна, а связано с изменением физи-

Таблица 6

Физико-химические свойства и цнтотоксичиость in vitro нативиой и фото-окисленной РНКалы Bi, модифицированных пентиламииом__

Препарат ЧТС |ОФА|о,днн/см| УЦ I ОЦ |ОЦ/ОФА

1 мкг/мл

РНКаза Bi РНКаза Ei-ГА-ПА. 0 и 1,00 0,80 70,5±0,1 65Д±0,2 9,5±2,5 17^1,9* 1±0,2 1,84±0,27* 1±0,26 2,3±0,27*

10 мкг/мл

РНКаза Biia РНКаза Biin-ГА-ПА 0,0 1.8 0,01 0,008 70,6±0,1 65,3±0Д 0Д±0Д4 0,3±0,24 0,01±0Д5 0,03±0.025 1,053±1,4 3,9±3,2

100 мкг/мл

РНКаза Biia РНКаза Biin-ГА-ПА 0,0 1(8 0,01 0,008 70,б±0,1 65,3±0,2 0,085±0,04 0,21^0,06* 0,009±0,004 0,022±0,06* 0,9±0,4 2,8±0,8*

ко-хиыических свойств модифицированной РНКазы, способствующих увеличению эффективности ее взаимодействия с плазматической мембраной клеток.

Близость значений ОЦ/ОФА для гидрофобнзнрованной фотоинактивнрован-ной РНКазы, рассчитанных по данным цитотоксичностн препарата в концентрации 100 нкг/ыл и гидрофобнзированного нативного фермента (определена в концентрации I мкг/мл), также свидетельствует о влиянии гидрофобизации преимущественно на каталитически обусловленную цнтотоксичиость (табл.6),

Гидрофобнзация РНКазы алкиламннами разной длины (этидамнном и пентиламииом) не привела к достоверному различию в цитотоксичностн препаратов, имеющих приблизительно равное количество связей РНКаза - спейсер, хотя различия в их гидрофобности значимы (табл. 7). Вместе с тем наблюдается достоверное увеличение цнтотохеичвости гидрофобизированных препаратов РНКазы с возрастанием количества модифицированных аминогрупп (количества присоединенного алкиламн-на) (табл. 7). Эти данные свидетельствуют о тон, что для проявления цитотоксичностн фермента более важна плотность гидрофобных групп на поверхности белковой

Таблица 7

Влияние количества гидрофобизирующего алкиланина и длины его цепи на физико-химические свойства и цитотоксичность in vitro модифицированных препаратов РНКазы Bi __

Препарат ЧТС ОФА с, дин/см УЦ ОЦ ОЦ /ОФА

РНКаза Bi 0 1,0 70,5±0,1 11>2±3,6 1±0,32 - 1±0,31

РНКаза BiTA-3A-l РНКаза В>-ГА-ЭА-2 РНКаза Bi-ГА-ЭА-З 1,17 2,29 2,44 0,78 0,45 0,40 6i,6±0,2 65,2±0,2 64,9±0,2 20,7±2,3* 29Д±4,6» 33,2±5,5* 1,85±0,2* 2,6±0.4* 2,97±0,5* 2,37±0,27* 5,8±0,96* 7,4±1.22*

РНКаза Bi-TA-nA-l РНКаза В1-ГА-ПА-2 РНКаза Bi-ГА-ПА-З 1,26 1,78 2.04 0,76 0,60 0,43 61,6±0,2 61,3±0,2 59,8±0,2 19,9±4,4* 22,7±2,2* 39,3±5,5* 1,78±0,4* 2,03±0,2* 3,51±0,5* 2,34±0,53* 3,38±0,35* 8,16±1,21*

Таблица 8.

Физико-химические свойства и циготокеичность ¡и VIIго полимерных производных

РНКазы В1

Препарат ОФА Касс М Выход К+ УЦ ОЦ ОЦ/ОФА

РНКаза В1 РНКаза В1-ДМСИ- 1,00 0,32* 1 1,3* 1 0,9* 1.0 2,1" 63.3 77,0" 1.00 1,22* 1.0±0,1 3,7±0,5*

днмер РНКаза В1-ДМСИ- 0,28» >10» 0* 4,4* 83,7« 1,32« 4,6 ±0,5*

полимер

молекулы, а не длина алишьного остатка,

Днмеризация и полимеризация РНКазы £1| так же как и в случае с РНКазой А [Косн.'зйга с1.а1., 1979), сопровождается уменьшением каталитической активности в отношении классического субстрата • одноцепочечной РНК. Показатели характеризующие токсические свойства (УЦ, ОЦ/ОФА, выход из клетки ионов К*) димера и полимера выше, чем у нативного фермента и модифицированных мономерных негидро-фобнзированных производных РНКазы В1 (табл.4 и табл,8). Возможно, эти отличия связаны с различиями механизма цитотоксичности мономерной РНКазы и димер-ных форм РНКаз (РНКазы Вй). Вместе с тем, массивное истечение аз клеток ионов К* в присутствии полимерных производных, которое принято считать следствием нарушения функции мембраны, дает основание предположить, что у полимерных производных РНКазы В1 плазматическая мембрана сохраняет свое значение в качестве мишени при взаимодействии с клеткой. Касс полимера РНКазы на порядок выше Касс димера. Б то же время показатели токсичности днмера и полимера достоверно не различаются. Это свидетельствует о том, что величина Касс полимерных производных фермента, как и в случае с мономерными модифицированными препаратами РНКазы, не существенна для их цитотоксичности

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Данные о возможности изменения цитотоксических" свойств РНКазы В.Шетт&Миа в широком диапазоне показателей с помощью химической модификации фермента свидетельствуют о плодотворности использованного подхода. Этот подход открывает возможность значительно расширить ассортимент препаратов РНКазы для использования их в качестве биологически активных веществ, что позволит ему успешно конкурировать со скринингом ферментов из различных природных источников.

С помощью химической модификации можно успешно дискриминировать одни биологические эффекты с сохранением других. Эта возможность наглядно продемон-

стрирована на примере фогоокнсленнон РНКазы В1 - препарат модифицированного фермента практически не обладает цитотоксичноетью и другими каталитически обусловленными эффектами, но сохранил каталитически независимую биологическую активность [Курнненко, 1991],

Слаботоксичные высокоактивные препараты РНКазы (РНКаза ВЬСц, РНКаза В1-ГА, РНКаза ВьДАД) представляют несомненный интерес как потенциальные противовирусные препараты. Высокий уровень РНКазной активности, который может быть досигнут с помощью высокоактивных малотоксичных препаратов фермента может обеспечить эффективный противовирусный барьер во внутренней среде организма. Такой барьер может существенно ограничить генерализацию инфекции дефектным пострепродуктивным вирусным потомством чувствительным к рибонуютеа-зе, составляющим в зависимости ог вида вируса от 50% до 90% потомства вируса [Максимович, Лисовая, 1969; Максимович ндр., 1969],

Гидрофобизированные производные РНКазы В! требуют более углубленных исследований как аотсяциальные биологически активные вещества. Их использование может оказаться перспективным & медицине и биотехнологии, так как в соответствии со следствиями, вытекающими из правила обратного действия АпкН-ИсЬи^'а {Мейер, Готлнб, 1940] для веществ, обладающих токсическим эффектом, есть основания ожидать, что положительные эффекты фермента у гидрофобязированных производных будут наблюдаться при более низких концентрациях, чем у нативного фермента. Это можно прогнозировать основываясь на том, что увеличение цито-токснчности фермента при гидрофобнзации не связано с токсичностью гидрофобизи-рующих групп.

Наконец расширение спектра модифицированных препаратов фермента и более детальное нсстсдованис их структурных, эвзиматических свойств и биологической активности позволят сформулировать четкие критерии зависимости "структура /энзиматичсскис свойства /биологическая активность".

ВЫВОДЫ

I. Разработан способ модификации рвбонукяеазы В.ШегтесИиз диальдегид-дексгранон, позволяющий оптимизировать условия модификации с помощью обобщенного формализованного параметра, включающего в себя выход модифицированного фермента по белку и стабильность нативного фермента при условиях модификации.

2. Разработан способ селективного фотоокисяения РНКазы 3.Intermedins по HielOI активного центра. Фотоокнсленный фермент является структурным аналогом нативной РНКазы.

3. Цитотоксичеекие свойства РНКазы B.lnlemedius, модифицированной объем-нон дскстрановой матрицей или три мерой глутарового альдегида резко снижаются при сохранении высокой каталитической активности.

4. Изменение физико-химических свойств РНКазы B.intermedius, оказывает влияние на каталитически обусловленную цитотоксичность. Изменение Касс фермента с З'-ГМФ вследствие модификации фермента не существенно для его цитотоксич-ностн.

5. Увеличение суммарного положительного заряда РНКазы В.intermedins не оказывает влияния на цитотоксические свойства фермента, тогда как увеличение суммарного отрицательного заряда сопровождается их снижением.

6. Цитотоксичность РНКазы B.intermedius возрастай при ее гндрофобизацви -в большей степени при введении в молекулу фермента алкшгьных, а не ароматических радикалов. Увеличение цитотокснчностн при гидрофобизации алкиламинами обусловлено не токсичностью последних, а изменением физико-химических свойств модифицированного фермента.

7. Цитотоксичность димеров и полимерных форм РНКазы B.mtermecSas выше цитотокснчности нативвого фд>мента, что позволяет использовать их в качестве аналогов РНКазы BS или искусственно димериэоваинон панкреатической РНКазы в медико-биологических исследованиях.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 JDavyiov R.E. Kiamenko В.М. Ribomichase Вас. intermedins modified by dialdegiddex-tran.// 15th FEBS Meeting Abstracts Bnissel, Belgium.-1983,- P.276 (S-l 1,W.R-100)

2. Фотоокислеиная рибонухлеаза Bacillus intermedins 7P и получение фотоинакти-вированного препарата фермента / Б.М. Курннетсо, И А. Голубснхо, Р.Ш. Булгакова, Р.Э. Давыдов, З.М. Нехорошкова, С'.Ф. Валиуллияа, C.B. Шляпников II Био-орг.химня 1986.-T.12.-N4.-C. 457-466.

3. Agistidinyl -101 KNase B.intermedius 7F production. Conformity of RNaae'a derivative to native enzyme / B.M. Kurinenko, I.A. Golubenko, R.Sh. Buîgakova, RJE. Davidov, Z.M. Nechoroshkova, S.PIl Valiuilina, S.V. Shlyapnikov // in: Proceedings of the First international Meeting Structure and Chemistry of ribonuebaseB (Eds. A. Pavlovsky., K.Polyakov) Moscow.-1989.-p.342-348.

4. Собчук Л.И., Давыдов Р.Э., Булгакова Р.Ш., Карпова С.И. Изучение влияния модификации функциональных групп в рибонуклеазе Вас, intermedius на ее биологическую активность // Тез, Докл. Меясресп. совещания "Нуклсазы микроорганизмов и их практическое использование".-Рига, ЛГУ.-1989,- С.70

5. Влияние производных бактериальной рнбонуклеазы на выход ионов калия из клеток саркомы 37/ Куриненко Б.М., Давыдов Р.Э., Собчук Л.И., Булгакова Р.Ш., Карпова С.И. /Лез. Докл. Межрссп. совещания "Нуклсазы микроорганизмов и их практическое использование".-Рига,ЛГУ.-1989,-С.74

6. A.C.1S92334 (СССР). Агнстидиннл - РНКаза Bac.ùitermcdius 7Р /Б.М. Куриненко, Р.Ш. Булгакова, З.М. Нехорошкова, Л .И. Собчук, Е.В. Сергеева, Р.Э. Давыдов -1990.

7. Куриненко В.М., Давыдов Р.Э. Модификация риборуклеазы Вас. intermedins : диальдегиддскстраном.// Прикладная биохимия и микробиология, 1996, вып 3, С.

303-306

' 8, Куриненко Б.М., Давыдов Р.Э., Булгакова РЛ1. Химическая модификации РНКазы Bac.intermediuE. Влияние на циготоксические свойства фермента. // Анги-• биотики и химиотерапия,-1996,-т.40, N7-8,-С.9-12.

9. Куриненко Б.М., Давыдов Р.Э., Булгакова Р.Ш, Связь энзиматических свойств модифицированных препаратов РНКазы Bi с их цитотоксичностыо.// Тез .докладов Второго съезда биохимического общества РАН, Пущино, ¡991.■ С. 40.

10. Куриненко Б.М., Давыдов Р.Э., Булгакова РШ. Химическая модификация рнбонуклеазы Bacillus mtermediua. Влияние гидрофобизацин на цитотоксичность фермента// Ферменты микроорганизмов. XI Всероссийская конференция. Сборник докладоа.-Каэавь: УНИПРЕСС, -1998. - С.233-238.

11. Kurinenko В.М., Bulgako-va R.Sh., Da^vyiov R.E. Effect of ribonuclease from Bacillus intermedins on human blood lymphocytes. //FEMS Immunology and medical microbiology

, 1998,-v. 21.-p. И 7-122.

< 1

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Давыдов, Рустам Энверович

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Биологическое действие рибонуклеаз.

1.2. Зависимость биологического действия рибонуклеаз от особенностей структуры и каталитической активности.

1.3. Взаимодействие рибонуклеаз и поликатионов с мембраной клеток.

1.4. Изменение физико-химических свойств рибонуклеаз путем их химической модификации.

1.5. Участки мембраны клеток, взаимодействующие с рибонуклеазами

1.6. Мишень РНКаз в клетках эукариот.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние химической модификации на физико-химические свойства и цитотоксичность рибонуклеазы Bacillus intermedius"

Актуальность проблемы К настоящему времени накоплен обширный материал по влиянию рибонуклеазы Bacillus intermedius на процессы жизнедеятельности клеток про- и эукариот. Показано, что рибонуклеаза В.intermedius способна вызывать различные биологические эффекты как на уровне клетки, так и на уровне организма. Она обладает противовирусным, противоопухолевым и иммуностимулирующим действием - стимулирует гуморальный и клеточный иммунитет, неспецифические факторы резистентности. Рибонуклеазы вызывают стимуляцию гемопоэза и стимуляцию пролиферации некоторых клеток высших эукариот [Куриненко, 1991]. В зависимости от концентрации РНКазы могут стимулировать или ингибировать размножение клеток микроорганизмов [Солдатова, Беляева, 1972; Добротина и др., 1992; Колпаков, Куприянова-Ашина, 1992].

Имеются экспериментальные доказательства того, что иммуностиму-ляция, стимуляция гемопоэза и пролиферации являются следствием взаимодействия фермента с клетками, в т.ч. и с иммунокомпетентными, на уровне плазматической мембраны. Использование фотоокисленной и инактивированной методом сайт-специфического мутагенеза рибонуклеазы В.intermedius позволило установить, что ряд биологических эффектов рибонуклеазы каталитически обусловлен: с наличием ферментативной активности связаны противовирусное действие рибонуклеазы, токсическое и генотоксическое действие, цитотоксичность рибонуклеазы, ростстимули-рующее действие на микроорганизмы [Куриненко, 1991; Кипенская, 1998; Ильинская, 1998].

Известна гипотеза, объясняющая механизм биологического действия нуклеаз проявлением каталитической функции РНКаз, в комплексе с аффинным и неспецифическим взаимодействием с плазматической мембраной [Куриненко, 1991].

Очевидно, что степень выраженности биологических эффектов фермента на клеточном уровне зависит от его способности к контакту с клеткой, который определяется совокупностью свойств плазматической мембраны клетки и физико-химических свойств фермента. Это предполагает, что изменение любого элемента указанной совокупности свойств, например физико-химических свойств фермента, может существенным образом отразиться на эффективности его взаимодействия с клеткой, и, следовательно, на биологической активности фермента.

Одним из основных инструментов изменения физико-химических свойств белка является его химическая модификация. Методы химической модификации функционально-активных белков успешно применяются для выяснения механизма их действия и представляют интерес как с точки зрения изучения влияния модификации на физико-химические и биологические свойства белка, так и с точки зрения решения фундаментальной проблемы биохимии - о соотношении структуры и функции белка [Овчинников, 1987]. Очевидно, что метод химической модификации особенно перспективен в этом плане для белков хорошо изученных в структурном отношении, каким и является рибонуклеаза Bacillus intermedius.

Данные, полученные при изучении зависимости биологической активности фермента от структуры методами химической модификации, могут быть с успехом использованы для развития исследований на основе сайт-специфического мутагенеза. Плодотворность такого подхода продемонстрирована получением методом сайт-специфического мутагенеза серии мутантных по HislOl форм РНКазы В .intermedius после того, как методом химической модификации была показана важность этого аминокислотного остатка для проявления биологической активности фермента.

Химическая модификация интересна и с практической точки зрения: применение химической модификации позволило создать пролонгированные ферментные препараты, препараты с измененными иммуногенными и аллергенными свойствами [Ларионова, Торчилин, 1982; Чазов и др., 1985; Максименко, 1988].

Все вышеизложенное дает основание рассчитывать на плодотворность использования методов химической модификации для изменения физико-химических свойств РНКазы В.ШегтесИт и, как следствие, изменения ее биологической активности.

Цель и задачи исследований Целью исследования явилось изменение каталитически обусловленной биологической активности гуанилспеци-фичной РНКазы В.ШегтесИт методами химической модификации.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Разработать условия модификации РНКазы В.ШегтесИт глутаро-вым альдегидом и диальдегиддекстраном, позволяющие получать продукт с высоким выходом по белку и высокой ферментативной активностью.

2. Исследовать энзиматические свойства, стабильность, гидрофоб-ность и электрофоретическую подвижность препаратов РНКазы В.ШегтесИт, модифицированных введением в молекулу фермента различных функционально-активных групп.

3. Изучить каталитически обусловленные цитотоксические свойства модифицированных препаратов РНКазы В.ШегтесИт с измененными физико-химическими и энзиматическими свойствами.

Научная новизна работы. Впервые показана возможность направленного получения модифицированных ферментов с заданным числом связей фермент - полимерный носитель с использованием носителя с одной степенью активации. Получены гидрофобизированные препараты РНКаз с высоким уровнем ферментативной активности.

Показано влияние изменения физико-химических свойств РНКазы В.ШегтесИт на каталитически обусловленную цитотоксичность фермента. Показано, что цитотоксичность РНКазы В.ШегтесИш возрастает при ее гидрофобизации - в большей степени при введении в молекулу фермента алкильных, а не ароматических радикалов. Увеличение цитотоксичности при гидрофобизации алкиламинами обусловлено не токсичностью последних, а изменением физико-химических свойств модифицированного фермента. Показано, что увеличение суммарного отрицательного заряда РНКазы В.ШегтесИт сопровождается снижением цитотоксичности фермента, тогда как увеличение суммарного положительного заряда не оказывает влияния на цитотоксические свойства. Влияния изменения Касс модифицированного фермента с З'-ГМФ на каталитически обусловленную цитотоксичность фермента не выявлено.

Результаты работы подтверждены авторским свидетельством об изобретении.

Практическое значение Разработан способ получения модифицированных форм рибонуклеазы с разным числом связей фермент - полимерный носитель при использовании носителя с одной и той же степенью активации. Разработан способ увеличения гидрофобности фермента с сохранением высокой ферментативной активности. Способы могут быть использованы для получения новых препаратов применяемых в медицине и биотехнологии, в практике научных исследований.

Полученный фотоокисленный нетоксичный препарат РНКазы В.ШегтесИш может быть использован вместо нативного фермента для стимуляции каталитически независимых биологических эффектов. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ, в том числе получено одно авторское свидетельство об изобретении.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Давыдов, Рустам Энверович

ВЫВОДЫ.

1. Разработан способ модификации рибонуклеазы В.intermedins ди-альдегиддекстраном, позволяющий оптимизировать условия модификации с помощью обобщенного формализованного параметра, включающего в себя выход модифицированного фермента по белку и стабильность натив-ного фермента при условиях модификации.

2. Разработан способ селективного фотоокисления РНКазы B.intermedius по His 101 активного центра. Фотоокисленный фермент является структурным аналогом нативной РНКазы.

3. Цитотоксические свойства РНКазы B.inermedius, модифицированной объемной декстрановой матрицей или тримером глутарового альдегида резко снижаются при сохранении высокой каталитической активности.

4. Изменение физико-химических свойств РНКазы B.intermedius оказывает влияние на каталитически обусловленную цитотоксичность. Изменение Касс фермента с З'-ГМФ вследствие модификации фермента не существенно для его цитотоксичности.

5. Увеличение суммарного положительного заряда РНКазы В. intermedins не оказывает влияния на цитотоксические свойства фермента, тогда как увеличение суммарного отрицательного заряда сопровождается их снижением.

6. Цитотоксичность РНКазы B.intermedius возрастает при ее гидро-фобизации - в большей степени при введении в молекулу фермента ал-кильных, а не ароматических радикалов. Увеличение цитотоксичности при гидрофобизации алкиламинами обусловлено не токсичностью последних, а изменением физико-химических свойств модифицированного фермента.

7. Цитотоксичность димеров и полимерных форм РНКазы B.intermedius выше цитотоксичности нативного фермента, что позволяет использовать их в качестве аналогов РНКазы BS или искусственно диме

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Данные о возможности изменения цитотоксических свойств РНКазы В.ш^егтесПиз с помощью химической модификации фермента свидетельствуют о плодотворности использованного подхода. Этот подход открывает возможность значительно расширить ассортимент препаратов РНКазы для использования их в качестве биологически активных веществ, что позволит ему успешно конкурировать со скринингом ферментов из различных природных источников.

С помощью химической модификации можно успешно дискриминировать одни биологические эффекты с сохранением других. Эта возможность наглядно продемонстрирована на примере фотоокисленной РНКазы В1 - препарат модифицированного фермента практически не обладает ци-тотоксичностью и другими каталитически обусловленными эффектами, но сохранил каталитически независимую биологическую активность [Кури-ненко, 1991].

Слаботоксичные высокоактивные препараты РНКазы (РНКаза Вь Сц, РНКаза ВьГА) представляют несомненный интерес как потенциальные противовирусные препараты. Высокий уровень РНКазной активности, который может быть достигнут с помощью высокоактивных малотоксичных препаратов фермента, может обеспечить эффективный противовирусный барьер во внутренней среде организма. Такой барьер может существенно ограничить генерализацию инфекции дефектным пострепродуктивным потомством вируса, составляющим в зависимости от вида вируса от 50% до 90% потомства вируса, чувствительного к рибонуклеазе [Максимович, Лисовая, 1969; Максимович и др., 1977].

Гидрофобизированные производные РНКазы В1 требуют более углубленных исследований как потенциальные биологически активные вещества. Их использование может оказаться перспективным в медицине и биотехнологии, так как в соответствии со следствиями, вытекающими из правила обратного действия Агпс^-ЗсЛшк'а для веществ обладающих токсическим эффектом [Мейер, Готлиб, 1940], есть основания ожидать, что положительные эффекты фермента у гидрофобизированных производных будут наблюдаться при более низких концентрациях, чем у нативного фермента. Это можно прогнозировать основываясь на том, что увеличение цитотоксичности при гидрофобизации не связано с токсичностью гид-рофобизирующих групп.

Наконец расширение спектра модифицированных препаратов фермента и более детальное исследование их структурных, энзиматических

96 свойств и биологической активности позволит сформулировать четкие критерии зависимости "структура /энзиматические свойства /биологическая активность".

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Давыдов, Рустам Энверович, Казань

1.Адам H.K. Физика и химия поверхностей.- М.: ОГИЗ, Гостехиз-дат, 1947,- 552 с.

2. Альберт А. Избирательная токсичность: Физико-химические основы терапии.- М.: Медицина, 1989.- Т.2.- 432 с.

3. Антонов В.Ф. Липиды и ионная проницаемость мембран.- М.: Наука, 1982,- 150 с.

4. Первичная структура рибонуклеазы Bacillus intermedius 7Р /Афанасенко Г.А., Дудкин С.М., Каминир Л.Б. и др. //Биоорг. химия.-1979,- Т.5, № 2.- С. 187-202.

5. Баренбойм Г.М., Маленков А.Г. Биологически активные вещества. Новые принципы поиска.- М.: Наука, 1986.- 364 с.

6. Беляева М.И., Нужина A.M. Нуклеодеполимеразы бактерий и их противоопухолевое действие //Бактериальные нуклеазы и их действие на опухолевый рост.- Казань: Изд-во КГУ, 1969.- С.49-78.

7. Березов Т.Т. Некоторые вопросы использования ферментов в терапии опухолей // Роль аспарагеназы в энзимотерапии опухолей.- М.: Медицина, 1972,- С. 5-41.

8. Бессмертная Л. И., Антонов В.К. Химические методы иммобилизации ферментов // Введение в прикладную энзимологию / ред. Березин И.В., Мартинек К. М.: Изд-во.МГУ, 1982.- С.101-133.

9. Ю.Рибонуклеаза Bacillus intermedius 7Р. Определение вторичнойструктуры в растворе методом КД /Болотина И.А., Дудкин С.М., Лугау-скас В.Ю. и др. //Биоорг. химия,- 1979,- Т.5.- С.203-209.

10. Основные биохимические свойства высокоочищенной экстра-целлюларной РНКазы Bac.intermedius /Булгакова Р.Ш., Лещинская И.Б., Балабан Н.П., Егорова Г.С. //Биохимия,- 1974,- Т.39, Вып 2,- С.299-304.

11. Булычев А.Г. Сегрегационная функция клетки и ее молекулярные механизмы //Цитология,- 1986,- Т.28, № 4.- С.З87-402.

12. Синтез производных декстрана, содержащего ионогенные, ком-плексообразующие и электронообменные группировки /Вирник А.Д., Ла-летина О.П., Пененжик М.А. и др. //Высокомолекулярные соединения.-1968.- Т.1А.- С.362-372.

13. Вознесенский В.А. Статистические методы планирования эксперимента в технико-экономических исследованиях.- М.: Финансы и статистика.- 1981.- 263 с.

14. Вудворд Д. Иммобилизованные ферменты: адсорбция и кова-лентное присоединение / в кн. Иммобилизованные ферменты и клетки.-М.: Мир.- 1988,- С.12-28.

15. Рибонуклеаза Bacillus intermedius 7Р. Очистка хроматографией на фосфоцеллюлозе и некоторые характеристики гомогенного фермента /Голубенко И.А., Балабан Н.П., Лещинская И.Б. и др. //Биохимия.- 1979.-Т.44, Вып.4.- С.640-647.

16. Голубенко И.А., Лещинская И.Б., Дудкин С.М. Рибонуклеаза Bacillus intermedius 7Р. Исследование структурно-функциональной роли остатков триптофана с помощью химической модификации //Биоорганическая химия,- 1981,- Т.7, № 8,- С.1201-1208.

17. Изучение функциональной роли гистидина 101 рибонуклеазы Bacillus intermedius 7Р /Голубенко И.А., Лещинская И.Б., Карпейский М.Я., Яковлев Г.И. //Биоорганическая химия.- 1982.- Т.8, № 8.- С.1108

18. Гублер Е.В., Генкин А.А. Применение непараметрических критериев статистики в медико-биологических исследованиях.- Д.: Медицина,- 1973.- 160 с.

19. Сравнительная характеристика биологической и иммуномодули-рующей активности некоторых ферментных препаратов микробного происхождения /Добротина Н.А., Ежова Г.П., Казацкая Ж.А. и др. //Биол. наук,- 1992,- Т.338, №.2,- С.90-96.

20. Дэвени Т., Гергей Я. Аминокислоты, пептиды и белки.- М.: Мир,- 1976.-364 с.

21. Ильинская О.Н. Биологические эффекты экзогенных бактериальных рибонуклеаз //Автореф. дисс. . докт. биол. наук. Казань, 1998.45 с.

22. Ильинская О.Н. Цитотоксичность биназы в культурах клеток животных и человека // Ферменты микроорганизмов. XI Всеросс. конф. Сборник докладов,- Казань: УНИПРЕСС, 1998. С.182-190.

23. Казанская Н.Ф., Кост О.А., Березин И.С. Свойства трипсина, модифицированного глутаровым альдегидом // Биоорг. химия.- 1975.- Т.1, №9,- С.1337-1344.

24. Калачева Н.В., Куприянов-Ашин Э.Г., Куриненко Б.М. Действие полимерной модификации на биологическую активность панкреатической рибонуклеазы // Биол. Наук.- 1992.- №2,- С.97-102.

25. Изучение субстратной специфичности и механизм действия рибонуклеазы Bacillus intermedins /Карпейский М.Я., Ханданян Л.Ж., Че-пурнова Н.К. и др. //Биоорганическая химия,- 1981.- Т.7, № 11,- С. 16691679.

26. Карпейский М.Я., Яковлев Г.И. Топохимические аспекты субстратной специфичности рибонуклеаз,- М.: Итоги науки и техники.

27. ВИНИТИ,- 1986,- Т.22, биологическая химия.- 180 с.

28. Кипенская JI.B. Биологические эффекты нативных и мутантных рибонуклеаз Bacillus intermedins //Автореф. дисс. . канд. биол. наук. -Казань, 1998,- 24 с.

29. Влияние нуклеаз на клетки и организмы животных: клеточные механизмы их противовирусного действия /Коваленко Г.А., Долгих М.П., Лапик А.С. и др. // Всес. конф. "Нуклеазы микроорганизмов и их практическое использование",- Рига, 1985.- С.19-23.

30. Коваленко Г.А. Влияние панкреатических нуклеаз на клетки и организм животных: клеточный механизм противовирусного действия. //Автореф. дисс. . канд. биол. наук. Новосибирск, 1986.- 18 с.

31. Колпаков А.И., Куприянова Ф.Г. Влияние экзогенных рибонуклеаз на размножение дрожжей Candida tropicalis //Микробиология.- 1992.-Т.61, вып.6.- С.969-974.

32. Колпаков А.И., Куприянова-Ашина Ф.Г. Биохимические аспекты симулирующего действия экзогенных РНКаз //Биол.наук.- 1992.- №.2.-С.103-107.

33. Колпаков А.И. Влияние экзогенных рибонуклеаз на размножение дрожжей рода Candida. //Автореф. дисс. . канд. биол. наук.- Казань.-1993.- 23 с.

34. Изменение функций плазматической мембраны под действием рибонуклеаз Bacillus intermedins /Колпаков А.И., Ильинская О.И., Кипен-ская Л.В. и др. // Ферменты микроорганизмов. XI Всеросс. конф. Сборник докладов.- Казань: УНИПРЕСС, 1998. С.201-210.

35. Крешков А.П. Основы аналитической химии / Качественный и количественный анализ //М.: Химия,- 1965.- Т.2.- С.215-216.

36. Экспериментальное исследование противоопухолевой эффективности РНКазы Bac.intermedius /Куриненко Б.М., Собчук Л.И., Хайбуллина С.А., Булгакова Р.Ш.//Эксперим. онкология.- 1988.- Т. 10, №6.- С.54-57.

37. Изучение токсичности РНКазы Bac.intermedius in vitro и in vivo /Куриненко Б.М., Сергеева Е.В., Собчук Л.И. и др. //Антибиотики и химиотерапия,- 1989.- Т.34, №.4,- С.266-270.

38. Куриненко Б.М. Механизмы биологического действия нуклеаз /в кн. Лещинская И.Б., Варламов В.П., Куриненко Б.М. Нуклеазы бактерий. //Казань.: Изд-во КГУ, 1991,- С.153-230.

39. Куриненко Б.М., Собчук Л.И., Сергеева Е.В. Механизм противоопухолевого действия рибонуклеазы Bacillus intermedins //Антибиотики и химиотерапия.- 1995.- Т.40, № 5.-С.12-15.

40. Куриненко Б.М., Зеленкова Н.П. Изменение размеров и морфологии клеток под влиянием бактериальной рибонуклеазы //Цитология.-1996,- Т.38, № 7.- С.667-673.

41. Ларионова Н.И., Торчилин В.П. Применение иммобилизованных физиологически активных веществ белковой природы в медицине // Введение в прикладную энзимологию / ред. Березин И.В., Мартинек К. М.: Изд-во.МГУ, 1982.- С.284-305.

42. Исследование иммобилизованных ферментов физическими методами /Лаш Ю., Козлов Л.В., Бессмертная Л.Я., Антонов В.К. //Химическая энзимология/ ред. Березин И.В., Мартинек К,- М.: Изд-во МГУ, 1983.- С.250-260.

43. Препаративное получение высокоочищенной рибонуклеазы Bac.intermedius /Лещинская И.Б., Булгакова Р.Ш., Балабан Н.П., Егорова

44. Г.С. //Прикл. биохим. микробиол.- 1974.- Т.Х, вып 2,- С.242-247.

45. Методы определения нуклеаз и родственных ферментов /Лещинская И.Б., Балабан Н.П., Капранова М.Н., Голубенко И.А. // в кн. Современные методы изучения нуклеиновых кислот и нуклеаз микроорганизмов.- Казань.: Изд-во КГУ.- 1980.-С.53-60.

46. Изучение некоторых физико-химических и энзиматических свойств полимерных производных трипсина на основе декстрана /Линденбаум Г.М., Богачева Т.И., Миргородская O.A. и др. //Прикл. биохим. микробиол.- 1977.- Т. 13.- С. 685-691.

47. Л.инденбаум Г.М., Миргородская O.A. Химическая модификация трипсина водорастворимыми декстранами // Прикл. биохим. микробиол,- 1978,- Т. 14.- С.719-723.

48. Максименко A.B. Химическая модификация ферментов медицинского назначения как инструмент повышения эффективности их действия // Биотехнология. Итоги науки и техники М.: ВИНИТИ АН СССР.-1988.- Т.8.- С.5-49.

49. Максимович М.Б., Лисовая С.П. Соотношение интер- и пострепродуктивного распространения инфекции аденовирусами в клетках амниона человека //Вопросы вирусологии.- 1969.- № 5.- С.566-569.

50. Максимович М.Б., Парфенова М.С., Зацепин М.И. Вирусы и нуклеазы //Микробиологический журнал АН УССР.- 1977.- Т.39, №.1.-С.46.

51. Маленков А.Г. Ионный гомеостаз и автономное поведение опухоли. М.: Наука, 1976,- 171 с.

52. Манойлов С.Е. Биохимические основы злокачественного роста.-Л.: Медицина, 1971.- 229 с.

53. Лабораторное руководство по хроматографическим и смежным методам / Туркова Я., Мелоун Б., Мота О. и др. под ред. О. Микеша.1. M.Мир, 1982,- Ч.И.-381 с.

54. Оптимизация условий иммобилизации кислой протеиназы из Aspergillus awamori /Можина Л.И., Самошина Н.М., Эрин А.Э. и др. //Прикл. биохимия и микробиология.- 1978.- Т.14. № 3.- С.410-413.

55. Муронец В.И., Наградова Н.К. Иммобилизованные олигомерные ферменты,- М.: Наука, 1984.- 208 с.

56. Налимов В.В., Чернова H.A. Статистические методы планирования экстремальных экспериментов.- М.: Наука.- 1965.- 340 с.

57. Нехорошкова З.М. Влияние рибонуклеазы Bacillus intermedius на имунный ответ и гемопоэз экспериментальных животных : Автореф. дисс. . канд. биол. наук.- Москва, 1988.-16 с.

58. Ныс П.С., Бирюков В.В. Интегральные критерии эффективности процесса иммобилизации ферментов //Антибиотики.- 1981.- Т.26, № 5.-С.332-337.

59. Сергеева Е.В. Токсические свойства рибонуклеазы Bacillus intermedius in vitro и in vivo //Авторефер. дисс. . канд. биол. наук. Казань,- 1991,- 17 с.

60. Сливинский Г.Г. Ростстимулирующая активность веществ и их влияние на ионный гомеостаз клеток // Автореф. дис. . канд. биол. наук. М.: НИИ по БИХС,- 1976.- 24 с.

61. Солдатова Н.Г., Беляева М.И. Действие нуклеазы Serratiasmasrcescens на кишечную палочку / в кн.:Некоторые подходы к изучению биологической роли нуклеаз.- Казань: Изд-во КГУ, 1972.- С. 53-70.

62. Стромберг А.Г., Семченко Д.П. Физическая химия.- М.: Высшая школа, 1973.- С.350-351.

63. Тенникова Т.Б., Москвичев Б.В., Самсонов Г.В. Изучение физико-химических свойств протеолитического фермента террилитина, модифицированного сополимером на основе винилпирролидона. //Биохимия.-1980.- Т.45, вып.З.- С.438-448.

64. Ханданян А.Ж., Дудкин С.М. Рибонуклеаза Bacillus intermedius. Исследование состояния остатков тирозина и триптофана с помощью разностных спектров поглощения //Биоорганическая химия.- 1979.- Т.5, №11.- С.1700-1709.

65. Синтез диальдегид- и дикарбоксилдекстрана /Хомяков К.П., Пе-нежик М.А., Вирник А.Д., Роговин З.А. //Высокомолекулярные соединения.- 1965,- Т.7, №.6.- С.1030-1034.

66. Макромолекулярные лекарственные препараты в кардиологии /Чазов Е.И., Смирнов В.Н., Мазаев A.B., Торчилин В.П. //ЖВХО им. Д.И. Менделеева.- 1985.- № 4.- С.365-372.

67. Рибонуклеаза Bacillus intermedius в синтезе олигорибонуклеоти-дов /Шарипова Ф.Р., Балабан Н.П., Рязанов С.М., Лещинская И.Б. и др. //Биоорг. химия.- 1983.- Т.9.- С.505-510.

68. Ardelt W., Mikulski S.M., Shogen К. Amino acid sequence of an antitumor protein from Rana pipiens oocytes and early embryos. Homology to pancreatic ribonucleases. //J. Biol. Chem.-1991.- V.266, N 1.- P.245-251.

69. Arnold L.J., Dagen A., Kaplen N.O. Poly(L-lisine) as an antieoplastic agent and tumor specific drug carrier //Polymers in Biology and Medicine, V.2. Targeted drugs /Ed. E.P.Goldberg.- N.-Y., 1983,- P.89-112.

70. Ball A.K., Kroja P.L., Gilles H. Localisation of ribonucleic acid in the membrane system of developing embryosof sea urchins //J. Cell Biol.-1967,- V.35.-P.8-13.

71. Bartholeyns J., Baudhuin P. Inhibition of tumor cell proliferation by dimerized ribonuclease //Proc. Nat. Acad. Sci. USA.- 1976.- V.73, N 2.- P.573-576.

72. Bartholeyns J., Zenebergh A. In vitro and in vivo antitumor effect of dimerized ribonuclease A //Eur. J.Cancer.-1979.- V.15.- P.85-91.

73. Bartholeyns J., Baudhuin P. Effect of cross-linked dimers of ribonuclease A or of lisozime of the processing of endocytosed peroxydase by hepa-tome cells //Biochem.J.- 1982,- V.292.- P.543-550.

74. Role of the N terminus in RNase a homologues: Differences in catalytic activity, ribonuclease inhibitor interaction and cytotoxicity /Boix E., Wu Y.N., Vasandani V.M. et al. //J. Mol. Biol.- 1996,- V.257, N 5,- P.992-1007.

75. Burka E.R, Schreme W., Klok C.I. Membrane-bound ribonucleic acid in mammalian erythroid cells. //Biochem.- 1967.- V.6.- P.2840-2847.

76. Burka E.R., Schickling L.F. Attachment of reticulocyte ribosomes toerythroid cell membranes in vitro //Biochem.- 1970.- V.9.- P.459-465.

77. The antitumor action of seminal ribonuclease and its quaternary conformations /Cafaro V., Delorenzo C., Piccoli R. et al. //FEBS Letters.- 1995.-V.359, N 1.- P.31-34.

78. Bull semen ribonucleases. 1. Purification and physico-chemical properties of the major component /D'Alessio G., Floridi A., De Prisco R., Pignero A., Leone E. //Eur. J. Biochem.- 1972,- V.26, N 2,- P. 153-161.

79. Seminal RNase: a unique member of the ribonuclease superfamily. /D'Alessio G., Di Donato A., Parente A., Piccoli R. //Trends Biochem Sci.-1991.- V.16, N 3.- P.104-106.

80. Deonarain M.P., Epenetos A.A. Targeting enzymes for cancer therapy: Old enzymes in new roles //British Journal of Cancer.- 1994.- V.70, N 5.-P.786-794.

81. Di Donato A., Galletti P., D'Alessio G. Selective deamidation and enzymatic methylation of seminal ribonuclease. //Biochem.- 1986.- V.25.-P.8361-8368.

82. The determinants of the dimeric structure of seminal ribonuclease are located in its N-terminal region. /Di Donato A., Cafaro V., de Nigris M. et al. //Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1993,- V.194.- P. 1440-1445.

83. Di Donato A., Cafaro V., D'Alessio G. Ribonuclease A can be transformed into a dimeric ribonuclease with antitumor activity //J. Biol. Chem.-1994.- V.269.- P.17394-17396.

84. Hints on the evolutionary design of a dimeric RNase with special bioactions /Di Donato A., Cafaro V., Romeo I. et al. //Protein Science.- 1995.1. V.4.- P.1470-1477.

85. Endo Y., Wool J.G. The site of action of -sarcine cleavage site in 28S ribosomal ribonucleic acid //Biol. Chem.- 1982,- V.257, N 15,- P.9054-9060.

86. Fields R. The measurement of amino group in proteins and peptides //Biochem.J.- 1971,- V.124.- P.581-590.

87. Finter N.B. Dye uptake methods for accessing viral cytopathogenicity and their application to interferon assays //J. Gen. Virol.- 1969.- V.9.- P.419-427.

88. Goldstein L., Manecke G. The chemistry of enzyme immobilization //Appl. Biochem. Bioeng.- 1976.- V.I.- P.23-126.

89. Hallahan T.W., Shapiro R., Vallee B.L. Dual site model for the organogenic activity of angiogenin //Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1991.- V.88.-P.2222-2226.

90. Hall J.O., Novakofski J.E., Beasley V.R. Neutral red assay modification to prevent cytotoxicity and improve reproducibility using E-63 rat skeletal muscle cells //Biotech. Histochem.- 1998,- V.73.- P.211-221.

91. Harper J.W., Vallee B.L. A covalent angiogenin/ribonuclease hybrid with a fourth disulfide bond generated by regional mutagenesis //Biochemistry.- 1989.- V.28, N 4,- P. 1875-1884.

92. RNase 1 /Jinno H., Ueda ML, Ozawa S., Ikeda T. et al. //Life Sciences.- 1996a.-V.58, N21.- P.1901-1908.

93. Levy C.C., Karpetsky T.P. Enzymes as drugs. //Ed. S. Holcenberg, J. Roberts.-N.-Y. Chichester, Brisbane, Toronto.- 1981.- P.103-166.

94. Kim J., Raines R.T. A misfolded but active dimer of bovine seminal ribonuclease //Eur. J. Biochem.- 1994,- V.224, N1.- P. 109-114.

95. Kim J.S., Soucelc J., Matousek J., Raines R.T. Catalytic activity of bovine seminal ribonuclease is essential for its immunosuppressive and other biological activities //Biochem. J.- 1995a.- V.308, Part 2,- P.547-550.

96. Kim J.S., Soucek J., Matousek J., Raines R.T. Mechanism of ribonuclease cytotoxicity //J. Biol. Chem.- 1995b.- V.270, N52,- P.31097-31102.

97. Kim J.S., Soucek J., Matousek J., Raines R.T. Structural basis for the biological activities of bovine seminal ribonuclease //J. Biol. Chem.-1995c.- V.270, N.18.- P.10525-10530.

98. Kobe B., Deisenhofer J. Mechanism of ribonuclease inhibition by ribonuclease inhibitor protein based on the crystal structure of its complex with ribonuclease A//J. Mol. Biol.- 1996,- V.264, N 5.- P.1028-1043.

99. In vivo and in vitro growth-inhibitory effect of bovine seminal ribonuclease on a system of rat thyroid epithelial transformed cells and tumors. /Laccetti P., Portella G., Mastronicola M.R. et al. //Cancer Res.- 1992.- V.52, N17,- P.4582-4586.

100. Ledoux L., Baltus E. Action de la ribonuclease sur les cellules du carcinome d'Ehrlich //Experementia.- 1954,- V.10.- P.500-503.

101. Lee F.S., Shapiro R., Vallee B.L. Tight-binding inhibition of angio-genin and ribonuclease A by placental ribonuclease inhibitor //Biochem. 1989.- V.28.- P.2354-2359.

102. Lee F.S., Vallee B.L. Structure and action of mammalian ribonuclease (angiogenin) inhibitor //Series: Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology.- 1993,- V.44.- P. 1-30.

103. Ribonuclease A variants with potent cytotoxic activity /Leland P.A., Schultz L.W., Kim B.M., Raines R.T. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1998.-V.95, N18.- P.10407-10412.

104. Libonati M., Sorrentino S. Revisiting the action of bovine ribonuclease A and pancreatic- type ribonucleases on double-stranded RNA //Mol. Cell. Biochem.- 1992,- V.l 17, N2.- P.139-151.

105. Libonati M., Bertoldi M., Sorrentino S. The activity on double-stranded RNA of aggregates of ribonuclease A higher than dimers increases as a function of the size of the aggregates //Biochem. J.- 1996.- V.318, Part 1,-P.287-290.

106. Madan T., Arora N., Sarma P.U. Ribonuclease activity dependent cytotoxicity of Asp fl, a major allergen of A.fumigatus //Mol. Cell. Biochem.1991.- V.175, N1-2.- P.21-27.

107. Bovine seminal ribonuclease destabilizes negatively charged membranes /Mancheno J.M., Gasset M., Onaderra M. et al. //Biochem. Biophys. Res. Comraun.- 1994,- V. 199, N. 1.- P. 119-124.

108. Predictive study of the conformation of the cytotoxic protein alpha-sarcin: a structural model to explain alpha-sarcin-membrane interaction /Mancheno J.M., Gasset M., Lacadena J. et al. //J. Theor. Biol.- 1995.- V.172.-P.259-267.

109. Immunosuppressive activity of angiogenin in comparison with bovine seminal ribonuclease and pancreatic ribonuclease /Matousek J., Soucek J., Riha J. et al. //Compar. Biochem. Physiol. B Biochem. & Mol. Biol.- 1995.-V.l 12, N2.- P.235-241.

110. Ribonucleases endowed with specific toxicity for spermatogenic layers /Matousek J., Kim J.S., Soucek J. et al. //Compar. Biochem. Physiol. B -Biochem.& Mol. Biol.- 1997,- V.l 18, N 4.- P.881-888.

111. Mayhew E., Weiss L. RNA at the periphery of different cell types and effect of growth rate on ionogenic groups in the periphery of cultured cells //Exper. Cell Res.- 1968,- V.50.- P.441-452.

112. Mayhew E. Electrophoretic mobility of Ehrlich ascites carcinoma cells grown in vitro or in vivo. //Cancer Res.- 1968.- V.28.- P.1590-1595.

113. Mayhew E., Weiss L. RNA in the cell periphery //Surface chemistryof biological systems /Ed. M.Blank. -N.-Y., 1969.- P.191-208.

114. Means G.E., Feeney R.E. Chemical modification of proteins //San Francisco, Holden-Day.- 1971

115. Enhanced in vitro cytotoxicity and cytostasis of the combination of onconase with a proteasome inhibitor. /Mikulski S.M., Viera A., Deptala A., Darzynkiewicz Z. //Int. J. Oncol.- 1998.- V.13.- P.633-644.

116. Murthy B.S., Sirdeshmukh R. Sensitivity of monomeric and dimeric forms of bovine seminal ribonuclease to human placental ribonuclease inhibitor//Biochem J.- 1992,- V.281, Part 2,- P.343-348.

117. Effects of protein RNase inhibitor and substrate on the quaternary structures of bovine seminal RNase /Murthy B.S., Delorenzo C., Piccoli R. et al. //Biochem.- 1996,- V.35, N 13.- P.3880-3885.

118. Cytotoxic ribonuclease chimeras. Targeted tumoricidal activity in vitro and in vivo. /Newton D., Ilercil O., Laske D.W. et al. //J Biol Chem.-1992.- V.267, N27,- P.19572-19578.

119. Expression and characterization of recombinant human eosino-philderived neurotoxin and eosinophil-derived neurotoxin-anti-transferrin receptor sFv /Newton D.L., Nicholls P.J., Rybak S.M., Youle R.J. //J. Biol. Chem.- 1994,- V.269, N43,- P.26739-26745.

120. Toxicity of an antitumor ribonuclease to Purkinje neurons. /Newton D.L., Walbridge S., Mikulski S.M. et al. //J.Neuros.- 1994,- V.14, N2.- P.538-544.

121. Expression and characterization of a cytotoxic human-frog chimeric ribonuclease: potential for cancer therapy /Newton D.L., Xue Y., Boque L. et al. //Protein Eng.- 1997,- V.10.- P.463-470.

122. Freezing of dCMP aminogidrolase in the activated conformation by glutaraldehyde /Nucci R., Raia C.A., Vaccaro C. et al. //J. Mol. Biol.- 1978.-V.124, N1.- P.133-145.

123. Papahadjopoulos D., Kimelberg H.K. Phospholipid vesi-cles(liposomes) as models for biological membranes: Their properties and interactions with cholesterol and proteins //Progr.Surface Sci.- 1973,- V.4.-P.141-232.

124. Parente A., D'Alessio G. Reacquisition of quaternary structure by fully reduced and denatured seminal ribonuclease //Eur. J. Biochem. 1985.-V.149.- P.381-387.

125. Three-dimensional structure of ribonuclease from Bacillus intermedius 7P at 3.2 A resolution / Pavlovsky A.G., Vagin A.A., Vainstein B.K. et al.//FEBS Lett.- 1983,- V.162, N.l, P. 167-170.

126. Piccoli R., DiDonato A., D'Alessio G. Co-operativity in seminal ribonuclease function. Kinetic studies //Biochem. J.- 1988.- V.253, N2.- P.329-336.

127. The antitumor action of seminal ribonuclease tested with the plasmacytoma spleen colonization assay /Piccoli R., Vescia S., Bridges S.H., D'Alessio G. //Ital. J. Biochem.- 1990,- V.39, N 4,- P.242-249.

128. The dual-mode quaternary structure of seminal RNase /Piccoli R., Tamburrini M., Piccialli G. et al. //Proc Natl Acad Sci USA.- 1992,- V.89, N 5,- P.1870-1874.

129. Antitumor action of bovine seminal ribonuclease /Pouckova P., Soucek J., Matousek J. et al. //Folia Microbiol. (Praha).- 1998.- V.43, N5,-P.511-512.

130. Privalov P.L. Scanning microcalorimeters for studying macromole-cules //Pure and Appl. Chem.- 1980.- V.52, N 2,- P.479-497.

131. Rathore D., Batra J.K. Cytotoxic activity of ribonucleolytic toxin re-strictocin-based chimeric toxins targeted to epidermal growth factor receptor //FEBS Lett.- 1997,- V.407, N 3.- P.275-279.

132. Replacing a surface loop endows ribonuclease A with angiogenicactivity /Raines R.T., Toscano M.P., Nierengarten D.M. et al. //J. Biol. Chem.-1995,- V.270, N 29.- P.17180-17184.

133. Russell A.J., Fersht A.R. Rational modification of enzyme catalysis by engineering surface charge //Nature.- 1987.- V.328.- P.496-500.

134. Cytotoxic potential of ribonuclease and ribonuclease hybrid proteins /Rybak S.M., Saxena S.K., Ackerman E.J., Youle R.J. //J. Biol. Chem.- 1991.-V.266, N 31,- P.21202-21207.

135. Enhancement of vincristine cytotoxicity in drugresistant cells by simultaneous treatment with Onconase, an antitumor ribonuclease /Rybak S.M., Pearson J.W., Fogler W.E. et al. //J. Nat. Cancer Inst.- 1996.- V.88, N 11.-P.747-753.

136. Schmid R.D. Stabilized soluble enzymes //Advances in Biochemical engineering.- 1979.- V.12.- P.41-118.

137. Interaction of a lytic polypeptide, melittin, with lipid membrane systems /Sessa G., Freer J.H., Colacicco G., Weissmann G. //J. Biol. Chem.-1969.- V.244.- P.3575-3582.

138. Shapiro R., Vallee B.L. Site-directed mutagenesis of histidine-13 and histidine-114 of human angiogenin. Alanine derivatives inhibit angio-genin-induced angiogenesis //Biochemistry.- 1989.- V.28, N 18 P.7401-7408.

139. Shapot V.S., Davidowa S. Ya. Liporibonucleoprotein as an integral part of animal cell membranes //Progr. Nucl. Acid Res. Mol. Biol.- 1971.-V.ll.- P.81-101.

140. Startorelli A.C. Combination chemotherapy with actinomycin D and ribonuclease: an example of complementary inhibition //Nature.- 1964.- V.203, N4947.- P.877-878.

141. Engineering receptor-mediated cytotoxicity into human ribonucle-ases by steric blockade of inhibitor interaction /Suzuki M., Saxena S.K., Boix E. et al. //Nat. Biotechnol.- 1999.- V.17, N 3.- P.265-270.

142. Immunosuppressive activity of bovine seminal RNase on T-cell proliferation /Tamburrini M., Scala G., Verde C. et al. //Eur. J. Biochem.-1990.- V.190.- P.145-148.

143. The principles of enzyme stabilization. Ill Effect of the length of intra-molecular cross-linkages on thermostability of enzyme /Torchilin V.P., Maksimenko A.V., Smirnov V.N. et al. //Biochim. Biophys. Acta.- 1978.-V.522.- P.277-283.

144. Wang D., Wilson G., Moore S. Preparation of cross-linked dimers of pancreatic ribonuclease //Biocemistry.- 1976.- V.15, N 3.- P.660-665.

145. Wase A., Cardenas J., Podolsky S. Some effects of ribonuclease on ascites tumor cells //Proc. Amer. Assoc. Cancer Res.- I960.- V.3.- P. 160

146. Weiss L., Mayhew E. The presence of ribonucleic acid within the periferal zones of two types of mammalian cells //Cell Physiol.- 1966.- V.68.-P.345-359.

147. Weiss L., Mayhew E. Ribonuclease susceptible charged groups at the surface of Ehrlich ascites tumour cells //Intern. J. Cancer.- 1969.- V.4.-P.625-635.

148. Weiss L., Sinks L.F. The electrokinetic surfaces of human cells of lymphoid origin and their RNase susceptibility //J. Cancer Res.- 1970.- V.30.-P.90-94.

149. Cross-linking of miosin subfragment. 1 .Nucleotide-enhanced modification by a variety of bifunctional reagents /Wells J.A., Knoeber C., Sheldon

Информация о работе

Давыдов, Рустам Энверович
кандидата биологических наук
Казань, 2000
ВАК 03.00.04

Диссертация

Влияние химической модификации на физико-химические свойства и цитотоксичность рибонуклеазы Bacillus intermedius - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы