Экспрессия генов гуанилспецифичных рибонуклеаз бацилл в условиях фосфатного голодания

Ульянова, Вера Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Экспрессия генов гуанилспецифичных рибонуклеаз бацилл в условиях фосфатного голодания
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Экспрессия генов гуанилспецифичных рибонуклеаз бацилл в условиях фосфатного голодания"

На правах рукописи

УЛЬЯНОВА Вера Владимировна

ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ ГУАНИЛСПЕЦИФИЧНЫХ РИБОНУКЛЕАЗ БАЦИЛЛ В УСЛОВИЯХ ФОСФАТНОГО ГОЛОДАНИЯ

03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань-2009

003481480

Работа выполнена на кафедре микробиологии Казанского государственного университета им. В. И. Ульянова-Ленина

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, доцент Вершинина Валентина Ивановна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

старший научный сотрудник Коксин Владимир Петрович (РЦПБ СПИД и ИЗ МЗ РТ, г. Казань)

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Морозова Ольга Владимировна (Институт проблем экологии недропользования АН РТ, г. Казань)

Ведущая организация:

Казанский институт биохимии и биофизики КНЦ РАН, г. Казань

Защита диссертации состоится «26» ноября 2009 г. в 43 часов на заседании диссертационного совета Д 212.081.08 при Казанском государственном университете по адресу: 420008, г.Казань, ул.Кремлевская, д. 18, главное здание, ауд. 211.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Н. И. Лобачевского при Казанском государственном университете.

Автореферат разослан «21» октября 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

3. И. Абрамова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Ферменты нуклеинового обмена в течение многих лет привлекают к себе внимание исследователей в связи с их исключительной ролью в жизни организмов и практической значимостью для человека. Рибонуклеазы выполняют важные функции в метаболизме бактериальных клеток: они не только необходимы для извлечения рибонуклеотидов из окружающей среды и элиминации ненужных внутриклеточных РНК, но и участвуют в контроле экспрессии генов путем изменения стабильности различных видов РНК. Кроме того, секретируемые рибонуклеазы могут являться для их продуцентов эффективным средством в конкурентной борьбе с другими микроорганизмами за экологическую нишу.

Рибонуклеазы применяются в генной инженерии, молекулярной биологии и биотехнологии для удаления-РНК из биологического материала, структурно-функциональных исследований нуклеиновых кислот и их комплексов с белками, разработке векторов для позитивной селекции рекомбинантов, получения стерильных трансгенных растений. Перспективным прикладным аспектом Использования микробных РНКаз является медицинский. Области их возможного применения связаны с лечением опухолей и вирусных инфекций.

Внеклеточные гуанилспецифичные рибонуклеазы обнаружены у многих видов бацилл, в том числе у Bacillus amyloliquefaciens, B.circulatis (барназоподобные РНКазы), В.intermedins, B.pumilus, B.thuringiensis (биназоподобные РНКазы). Ферменты сходны по первичной структуре, близки по физико-химическим и каталитическим свойствам. Однако исследование биосинтеза рибонуклеаз выявило значительные различия в условиях, при которых происходит их накопление в среде, что оставляет открытым вопрос о назначении этих ферментов.

Клонирование и секвенирование генов гуанилспецифичных РНКаз открыло возможность для изучения регуляции их синтеза на уровне транскрипции. Выявление регуляторных механизмов,, . отвечающих за экспрессию генов в тех или иных условиях, является одной из глобальных проблем молекулярной биологии. Бактерии способны активировать синтез определенных продуктов только в специфической экологической обстановке, либо репрессировать его, если образуемые белки препятствуют другим процессам, протекающим в данный момент в клетке. Регуляция экспрессии генов может также осуществляться как часть процесса дифференцировки и развития клеточной популяции. Информация о путях контроля экспрессии гена важна не только для установления функции кодируемого им белка, но и необходима для осуществления направленного воздействия на геном микроорганизма с целью увеличения выхода желаемого продукта.

Таким образом, знание молекулярных механизмов регуляции синтеза рибонуклеаз позволит создать фундамент для их эффективного использования в прикладных сферах и будет способствовать решению ряда обшебиологических \

3 \ ;

проблем, связанных с ролью этих ферментов в основных физиологических процессах клетки.

Целью настоящего исследования явилось выяснение механизмов регуляции экспрессии генов гуанилспецифичных рибонуклеаз бацилл в условиях фосфатного голодания.

В работе решались следующие задачи:

1. Провести поиск у различных видов бацилл ортологов рИоР, вроОА и гезй генов В.зиЪп7/5, продукты которых контролируют специфический ответ на фосфатное голодание.

2. Исследовать взаимодействие фактора транскрипции РЬоР В.шЬИНх с регуляторными областями генов гуанилспецифичных рибонуклеаз бацилл.

3. Определить потенциальные сайты связывания вроОА и ЯевО белков в промоторах генов бациллярных рибонуклеаз.

4. Изучить экспрессию генов гуанилспецифичных рибонуклеаз в нативных и дефектных по регуляторным белкам Р1ю регулона штаммах В.н/ЫШя.

Положения, выноснмые на защиту:

1. Регулятор транскрипции РЬоР В.виЫШз - типичный представитель семейства гомологичных белков, контролирующих РЬо ответ у различных видов бацилл, может быть использован в качестве модельного белка для изучения связывания с промоторами генов гуанилспецифичных рибонуклеаз.

2. Специфическое взаимодействие белка РЬоР с промоторами генов рибонуклеаз В. ШегтесИт, В.ритИия, Влкиг^1ет1$ позволяет отнести их к новым членам РЬо регулона, функционирующего у бацилл в условиях фосфатного голодания.

3. Наличие в промоторах генов гуанилспецифичных рибонуклеаз бацилл потенциальных сайтов связывания регуляторных белков Т^евО и БроОА и изменение уровня ферментативной активности в соответствующих мутантных штаммах свидетельствует о роли этих белков в экспрессии генов исследуемых РНКаз.

Научная новизна работы. Анализ распространенности среди бацилл двухкомпонентных систем трансдукции сигнала РЬоР-РЬоЯ, КезО-И^Е и многокомпонентной системы БроОА-фосфопередачи, контролирующих РЬо ответ В.янЫШз, выявил высокую консервативность регуляторов ответа и видовые особенности, присущие гистидин киназам. Впервые показано непосредственное связывание основного регулятора РЬо ответа бацилл - белка РЬоР с промоторами генов рибонуклеаз В. \ntermedim, В.ритИи.ч, ВлЬиг^гетЫ, что на молекулярном уровне подтверждает его участие в контроле транскрипции их генов. Кроме того, в регуляторных областях генов рибонуклеаз охарактеризованы потенциальные сайты связывания для БроОА и ЯеэО белков и получены приоритетные данные об участии данных факторов транскрипции в регуляции экспрессии генов гуанилспецифичных РНКаз.

Практическая ценность работы. Полученные в работе данные о механизмах контроля синтеза внеклеточных рибонуклеаз бацилл могут быть использованы при конструировании экспрессионных систем с целью получения высокоэффективных промышленных штаммов-продуцентов целевых белков. Подобные системы должны включать ген целевого белка,, под контролем промотора биназоподобной рибонуклеазы и бациллярный штамм-хозяина для его экспрессии, дефектный по негативному регулятору SpoOA. В частности этот подход позволил нам получить суперпродуцент рибонуклеазы В.intermedins, обладающей противоопухолевой и противовирусной активностью. Кроме того, выявленные в работе закономерности важны для общего понимания механизмов функционирования регуляторных систем бациллярной клетки и могут быть использованы в учебном процессе в соответствующих курсах лекций и семинарах для студентов-биологов.

Связь работы с научными программами. Исследования проводились в соответствии с планом НИР КГУ (№ гос. регистрации 01.2.006.09683 «Механизмы функциональной активности клетки») и были выполнены при финансовой поддержке ФЦНТП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники" (Госконтракты 02.434.11.3020, 02.512.11.2050 и 02.512.12.2014), фанта РФФИ 05-04-48182, гранта Правительства Республики Татарстан (2008 г.), программы Международного союза микробиологических сообществ «UNESCO-IUMS-SGM Fellowship».

Апробация работы. Основные положения диссертации представлены на ХШ Международной научной конференции «Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение» (Казань, 2005); V Республиканской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Наука. Инновации. Бизнес» (Казань, 2005); Всероссийской молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2005); 10-ой Путинской школе-конференции молодых ученых, посвященной 50-летию Пущинского научного центра РАН, «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2006); I Международной научно-практической конференции «Микробная биотехнология - новые подходы и решения» (Казань, 2007); XIV Международной конференции студентов, аспирантов .и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2007); I Всероссийском, с международным участием, конгрессе студентов и аспирантов биологов «Симбиоз Россия 2008» (Казань, 2008); Первой межуниверситетской конференции по современной биологии «Bionews» (Kazan, 2008); XIV Международной конференции, посвященной 20-летию партнерства между Казанским государственным университетом и Гиссенским университетом им. Ю. Либиха, «Microbial enzymes in biotechnology and medicine» (Kazan, 2009). 4 . V

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ.

Благодарности. Автор выражает глубокую признательность профессору Колину Харвуду (Университет Ньюкасла, Великобритания) за предоставленную возможность проведения на базе его лаборатории экспериментов по изучению взаимодействия PhoP белка B.subtilis с регуляторными областями генов гуанилспецифичных рибонуклеаз бацилл; профессору Мичико Накано (Университет здоровья и науки Орегона, США) за предоставленные для работы resD-resE мутантные штаммы, а также сердечно благодарит научного руководителя к.б.н., доцента Вершинину Валентину Ивановну за внимательное отношение к работе и всех коллег НИЛ биосинтеза и биоинженерии ферментов кафедры микробиологии КГУ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов исследования, обсуждения результатов, выводов, списка литературы, включающего 218 источника, из них 186 зарубежных, и приложений. Работа изложена на 138 страницах машинописного текста, содержит 9 таблиц и 27 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Штаммы бактерий. Escherichia coli BL21 X.DE3 (F~ ompT gal dcm Ion hsdSa (rB" mB") ШЕЗ (lacl lacUVS-ll indl sam7 ninS)), предоставленный проф. К. Харвудом (Университет Ньюкасла, Великобритания) был использован для продукции PhoP и PhoR белков B.subtilis-, B.amyloliquefaciens Н2 (проф. Р. Хартли, Национальные институты здоровья, США), B.circulans BCF247 и B.thuringiensis var. subtoxicus В388 (Центр "Биоинженерия" РАН), В.intermedins 7Р (Всероссийская коллекция промышленных организмов), B.pumilus КММ62 (ТИБОХ ДВО РАН) - для получения промоторных областей генов гуанилспецифичных рибонуклеаз. Роль регуляторных белков в контроле экспрессии генов РНКаз изучали в штаммах B.subtilis: JH642 {pheAl trpC2), JH646 (pheAl trpC2 spoOA12), JH647 [pheAl trpC2 spoOEll) и R15-13 (pheAl irpC2 abrB23 spoOA!2), полученных из Бациллярного генетического стокового центра (Государственный университет Охайо, США); LAB2506 (trpC2 pheAl resD::cat) и LAB2234 (trpC2 pheAl AresE::spc), предоставленных проф. M. Накано (Университет здоровья и науки Орегона, США).

Плазмиды pET-PhoP и pET-PhoR231 предназначены для получения белка PhoP и цитошшматического фрагмента белка PhoR B.subtilis в клетках E.coli (проф. К. Харвуд, Университет Ньюкасла, Великобритания); pMZ55, pMZ56, pMZ58, pMZ59 и pMT420 - для экспрессии генов гуанилспецифичных рибонуклеаз B.intermedius (биназа, РНКаза Bi), B.pumilus (РНКаза Ври), B.thuringiensis (РНКаза Bth), B.circulans (РНКаза Bci) и B.amyloliquefaciens (барназа, РНКаза Ва) соответственно в штаммах B.subtilis (коллекция НИЛ биосинтеза и биоинженерии ферментов КГУ).

Бактерии культивировали на L-бульоне либо бесфосфорной синтетической среде (содержание Фн - 4 мкг/мл) при 37°С с аэрацией. Контроль роста культуры производили путем измерения оптической плотности суспензии при длине волны 590 им. При необходимости в среды добавляли соответствующие антибиотики: канамицин (10 мкг/мл), спектиномицин (75 мкг/мл), хлорамфеникол (5 мкг/мл - для штамма B.subtilis LAB2506 и 10 мкг/мл - для штаммов, несущих плазмиду рМТ420), ампициллин (100 мкг/мл), а для ауксотрофных штаммов - фенилаланин и триптофан (50 мкг/мл).

Выделение хромосомной ДНК из клеток B.subtilis осуществляли с помощью набора реактивов «DNeasy Blood & Tissue Kit» («Qiagen»). Выделение плазмидной ДНК из клеток Е. coli и B.subtilis, рестрикцию плазмвд, электрофорез ДНК в агарозном геле, а также трансформацию плазмидами компетентных клеток E.coli и B.subtilis проводили стандартными методами [Sambrook and Russell, 2001].

Промоторные области генов рибонуклеаз бацилл и гена ykoL B.subtilis (позитивный контроль для EMS А анализа) амплифицировали в программируемом термостате «Techne ТС-512» в реакционной смеси с Platinum Р/х-полимеразой («Invitrogen»), хромосомной ДНК соответствующих видов бацилл и праймерами, представленными в таблице. Состав реакции и условия проведения ПЦР, оптимальные для каждой пары праймер-матрица, подобраны в данной работе. Очистку ПЦР-продуктов проводили с помощью китов «QIAquick PCR Purification Kit» или «QIAquick Gel Extraction Kit» («Qiagen»).

Таблица

Праймеры для амплификации регуляторных областей генов гуанилспецифичных рибонуклеаз бацилл и гена ykoL B.subtilis

Праймеры Промоторы генов для амплификации Последовател ьность

FBaR РНКаз Ва и Bei 5'-GAAAACGTCACATTGC-3'

RBaR 5 '-TC ATCATGTG A AGCTG-3'

FBpR РНКаз Bi, Ври Bth 5' -TT A ATCGG А АА AG ACG-3'

RBpR 5'-G A AGCTGTCCTCTTG-3'

YkoL-FOR ykoL 5TG AAATGCTGG AGACGTTTATG-3'

YkoL-REV 5 '-TTTTCTAAAGCGG АТТТС ААТА-3'

Белки РЬоР-Н!3(5 и РЬоК-Н^б В^иЫ/Ш выделяли из цитоплазмы рекомбинантного штамма Е.соП, выращенного при 30°С на Ь-бульоне с добавлением в середине логарифмической фазы роста индуктора ИПТГ (0.5 мМ). Клетки разрушали ультразвуком. Осветленный дезинтеграт клеток наносили на колонку с никель-сефарозой, уравновешенную фосфатным буфером (рН 8.0). Элюцию связавшегося белка проводили в градиенте 20-500 мМ имидазола. Полученный препарат подвергали гель-фильтрации на

сефадексе G-100. Степень чистоты и молекулярный вес белков оценивали с помощью Ds-Na-ПААГ-электрофореза, используя 4%-ый концентрирующий (рН 6.8) и 10%-ый разделяющий (рН 8.8) гели на основе трис-глицинового буфера [Laemmli, 1970].

Масс-спектрометрический анализ очищенных PhoP и PhoR белков проведен на MALDI-TOF масс-спектрометре «Voyager DE-RP» доктором Дж. Греем (лаборатория «Pinnacle», Университет Ньюкасла, Великобритания). Результаты проанализированы с помощью программы «Mascot PMF» (http://www. matrixscience.com).

О ДНК-связывающей активности PhoP белка в отношении промоторов генов гуанилспецифичных рибонуклеаз бацилл судили по изменению электрофоретической подвижности комплекса ДНК-белок - метод EMSA [Allenby et al., 2006].

Способность трансформантов к синтезу РНКазы проверяли по методу Джеффриса. Активность рибонуклеазы РНКазы в культуральной жидкости определяли модифицированным методом Анфинсена по кослоторастворимым продуктам гидролиза РНК [Лещинская с соавт., 1980]. Специфическую активность рассчитывали как отношение обшей рибонуклеазной активности к величине биомассы.

Информация о геномах бацилл, нуклеотидных и аминокислотных последовательностях рибонуклеаз и регуляторных белков извлечена из баз данных Виртуального института микробного стресса и выживания «MicrobesOnline» (http://www.microbesonline.org) и Национального центра биотехнологической информации (NCBI,

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/lproks.cgi).

Поиск ортологов регуляторных белков B.subtilis проводили с помощью средств сайта «MicrobesOnline». Филогенетические древа были построены методом ближайшего связывания (neighbour-joining) на основе выровненных с помощью программы «MUSCLE» (http://www.driveS.com/muscle') и отредактированных с помощью программы «GBlocks» (http://molerol.cmima.csic.eS/castresana/g.blocks_server.html) аминокислотных последовательностей.

Потенциальные сайты для взаимодействия регуляторных белков с промоторами генов рибонуклеаз выявляли с помощью программы «Virtual Footprint» (http://www.prodoric.de/vfp/vfp promoter.php) и визуально, используя их логотипы, представленные в базах «Prodoric» (http://www.prodoric.de) и «DBTBS» (http://dbtbs.hgc.ip).

Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета программ «Excel 2003». Рассчитывали среднеквадратичное отклонение (о), результаты считали достоверными при о < 10%. При расчете достоверности получаемых разностей использовали t-критерий Стьюдента, принимая Р < 0.05 за достоверный уровень значимости.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Ортологи phoP, spoOA и resD генов Bacillus subtilis в секвеинрованных геномах бацилл.

Известно, что функционирование Pho регулона в условиях дефицита в среде неорганического фосфата контролируется у В.subtilis тремя взаимосвязанными системами [Birkey et al., 1998] - PhoP-PhoR (основная роль в регуляции метаболизма фосфора), ResD-ResE (отвечает за модуляцию процессов аэробного и анаэробного дыхания) и многокомпонентной системой SpoOA-фосфопередачи (инициирует спорообразование). Для того чтобы оценить их роль в регуляции экспрессии генов гуанилспецифичных рибонуклеаз бацилл, на первом этапе работы было необходимо установить, присутствуют ли подобные системы у других представителей рода и насколько они могут быть функционально сходны. Для этого в секвенированных геномах бацилл мы провели поиск ортологов указанных регуляторных систем. Так как у прокариот многие гены являются ксенологами [Lerat et al., 2005; Kunin et al., 2005], было важно оценить вероятность происхождения исследуемых белков в результате горизонтального транспорта генов. Поэтому мы также сравнивали генетический контекст генов [Korbel et al., 2004; Wu et al, 2005] и сопоставляли филогенетические древа бациллярных видов, построенные на основе аминокислотных последовательностей регуляторных белков и гена 16S-pPHK [Price et ai, 2007].

Потенциальные ортологи phoP-phoR, resD-resE и spoOA генов В.subtilis были обнаружены у всех бацилл. Генетический контекст phoP-phoR генов бацилл оказался весьма сходным (рис." 1А), в то время как resD-resE и spoOA гены расположены в более вариабельных локусах. Аминокислотные последовательности PhoP белков бацилл были идентичны таковым В.subtilis на 69-88%, PhoR - на 40-71%, ResD - на 73-95%, ResE - на 52-91%, SpoOA - на 7597%. По степени идентичности аминокислотных последовательностей и сходству организации генетических локусов виды бацилл можно разделить на отдельные группы, преимущественно отражающие филогенетическое родство, что характерно только для истинных ортологов.

В совокупности полученные данные позволяют утверждать, что у различных видов бацилл имеются структурно и функционально сходные PhoP, SpoOA и ResD белки, что позволило нам использовать В.subtilis в качестве модельного организма для изучения регуляции экспрессии генов гуанилспецифичных рибонуклеаз бацилл.

2. Взаимодействие PhoP белка Bacillus subtilis с промоторами генов гуанилспецифичных рибонуклеаз бацилл.

В промоторах генов гуанилспецифичных рибонуклеаз В .intermedins. B.piimihis, B.thuringiensis ранее были обнаружены потенциальные последовательности для связывания PhoP белка В.subtilis и установлено, что

А)

К)

ВвиЬ_168 Вату Е7.В41 Вршт» 5АГй-032 В И\и АДНакшп ВСЛи"97-27

В«и.Ь 168 Вату Г2В42 Вршп_ ЗДЗД-ОЗг ВI Ъи__ ЛХНаКат В«:»т 97-27

0.02

4|----1

В.виМШз зиЬьр. БиЫШз бК. 168 '"5

B.amylol¡quefaciens РЯБ42 В.рит Ни б вАРР! 032 - ВМсЬепКогтя ОБМ 13 ВЛЬиппд/епэ!^ А1 Накат ВЛЬигтд1епз)8 з1г. 97 27 В.аМЬгааз зи. Атеэ В.сегеиз 2К В.сегеив АТСС 10987

гапб. 25 59321 .2572121)

С1£2

гапа^гчоуо^л'гзиой) сП2

¡оЫ ¡сс/

тс/Ь

рИоР

рлор рпояг

р!юР рЬоН

ЕГ^ХЕЗИЯЖЕВЕЭВ

\lioR

рЬоР^рЬ оД рЬоР рЛо/? рЬоР рЬоРг рЬоЯ

В.сегеиз АТСС 14579 — В.сегеиэ зиЬвр. суШох/э N\/H 391 98 В.Ьа1ос1игапз С 125 ---В.с!аизп КБМ К16

с1с-0/пр« СОС-МсК

сиг сне

сг> _______ . ...__ ...

1й. 2840522 .2353322)

с/<2 с/(С тс!Ь

рЬоР рНоЯ

ро/А ро/А

'тшшш г—

ти1М угаР у ¡а О

-ию*ш> 'г Г"ТХЗИ)Е>

соа £

ро/А тшМ у?а<3

—- —^ -а—ЩИ»- С13> шзэ^-

тиеМсо<21971 ттМ у[аРсоаЕ _ _ тигМ СОС1971 __тигМ^угаР соаЕ

ро/А

роЬ4

гпШМ

СО<3-Ро!Л соа-ыо! сов 1971 СОС-Ро!А СОС^а! СОС-СодЕ

рЫА

ьпкьлс -Д91*

тигМ

И-т^рмгшальный регуляторный домен

В-

.123 1Т§0РТ§Т0ЕЕ^|11АР! 91 Ь0---ОЕЕ О УА^А РЕ>ЕГ> й]

Рисунок 1. Ортологи РЬоР белков В.хиЬИ7/л' у различных видов бацилл.

Л) Филогенетическое древо, построенное на основе аминокислотных последовательностей РЬоР белков бацилл, и генетический контекст кодирующих их генов. Гены рЪоР-ркоЯ. выделены рамкой.

Б) Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей РЬоР белков бацилл. Функционально значимые аминокислоты ДНК-связывающего домена отмечены звездочкой.

Рисунок 2. Аффинная хроматография осветлённого дезинтеграга клеток E.coli, экспрессировавших PhoP-His,-, белок ß.subti/is, (А) и DS-Na-JlAAI-электрофорез белковых фракций (Б).

экспрессия их генов в рекомбинантных штаммах В.яиЬп'Ш является РЬоР-РЬоЯ-зависимой [Знаменская с соавт., 1999, Морозова с соэвт., 2001], в то время как синтез рибонуклеазы В.с'1гси\ат хотя и зависел от содержания фосфора в окружающей среде, но не подчинялся контролю со стороны РЬоР-РЬоЯ системы. Чтобы сделать окончательный вывод о непосредственном участии РЬоР белка в транскрипции генов рибонукл|1кз бацилл, было необходимо экспериментально оценить его способность Связываться с их промоторными областями.

Проведенный нами сравнительный анализ первичной структуры РЬоР белков В.яиЬИИз, B.amyloliquefacieпs, В.ритНш и ВлИигт&ежй показал, что основные различия сосредоточены в линкерной области, соединяющей N1- и С-домены белков, в то время как функционально значимые аминокислотные остатки ДНК-связывающих доменов консервативны (рис. 1Б). Это свидетельствует об универсальности взаимодействия этих регуляторов ответа с ДНК-мишенями, поэтому мы использовали РЬоР белок В.шЫШз для изучения связывания с промоторами генов гуанилспецифичных рибонуклеаз бацилл методом ЕМБА.

Получение РкоР и РкоЯ регуяяторных белков В.зиЫШз. Белки РЬоР и РЬоЯ В.аиЫШз были экспрессироваиы в индуцибельной Т7-системе, включающей конструкцию на основе рЕТ вектора и штамм-реципиент Е.соИ ВЕ21(ШЕЗ), Для оптимизации синтеза рекомбинантных белков была проведена серия экспериментов, в которой варьировали температуру выращивания продуцента, концентрацию вносимого индуктора и время индукции. Эффективным оказалось выращивание бактерий при температуре 30°С и индукция синтеза целевых белков с помощью 0.5 мМ ИПТГ в течение 3 часов. Эти условия были применены для препаративного выделения белков. В результате очистки с помощью металл-хелатной аффинной хроматографии (рис. 2) и последующей гель-фильтрации были получены электрофоретически гомогенные белки (рис. 3). Проведенный масс-спектрометрический анализ препаратов подтвердил, что они являются именно РЬоЯ и РЬоР белками б.теЬп'/«.

12 3 4 5

Рисунок 3. PhoP и PhoR белки В.subtilis, выделенные из рекомбинантных штаммов Е. coli.

Условные обозначения-. 1 неиндуцированная культура; 2-3 растворимые клеточные фракции, содержащие соответственно PhoR и PhoP белки; 4 - PhoR, 5 - PhoP.

ПЦР-амплификация промоторов генов гуанилспецифичных рибонуклеаз. Для получения регуляторных областей генов РНКаз бацилл была выделена их хромосомная ДНК и проведена амплификация необходимых участков с помощью ПЦР. Принимая во внимание сходство промоторных областей генов рибонуклеаз, для их амплификации были использованы две пары праймеров -одна для биназоподобных РНКаз, а другая - для барназоподобных РНКаз (см. табл.). Так как праймеры не были строго специфичными, потребовалась оптимизация условий проведения ПЦР. Для каждого промотора были подобраны концентрации ДНК-матрицы и ионов магния, а также температура отжига праймеров. Полученные фрагменты были очищены и определена концентрация ДНК в препаратах (рис. 4).

Рисунок 4. Промоторные области генов гуанилспецифичных рибонуклеаз бацилл и гена ykoL В.subtilis, амплифицированные с помощью ПЦР.

Условные обозначения; 1 - B.amyloiiquefaciens Н2, 2 - В.circulons BCF247, 3 - B.subtilis subsp. subtilis str. 168, 4 - B.intermedius 7P, 5 - B.pumilus KMM62, 6 - B.thuringiensis var. subtoxicus B388.

Анализ изменения электрофоретической подвижности в геле комплекса ДНК-белок, Чтобы доказать непосредственное связывание белка PhoP с промоторами генов рибонуклеаз бацилл, был проведен EMSA-анализ, в котором использовали PhoP белок в активной (фосфорилированной с помощью родственной киназы PhoR) и неактивной формах. Было показано, что регулятор транскрипции PhoP эффективно связывается с промоторами генов РНКаз Bi, Ври и Bth (рис. SA), степень взаимодействия зависит от концентрации белка. Фосфорилирование регулятора ответа белком PhoR оказывает незначительное влияние, что объясняется возможным фосфорилированием PhoP с помощью киназ E.coli [Yamamoto et al... 2005; Baek and Lee, 2007]. Промоторы генов РНКаз Ва и Bei не обладали способностью образовывать комплекс с PhoP белком (рис. 5Б).

А)

Б)

РНКаза Bi

РНКаза Ври

РНКага Bth

. лл ^

О 5 10 20 30 100 С 5 Ш 20 50 100 РНКаза Вя ykoL

PhoP

PhoP~P

0 5 Ю 20 50 100 мМ РНКаза Bei

..... _ у* гт — ** W tato

FhoP

РЪоР~Р

а 5 10 20 50 105 0 5 10 20 50 100 0 5 10 20 50 500 мМ

Рисунок 5. Изменение электрофоретической подвижности комплекса белка РЬоР с регуляторными областями генов рибонуклеаз бацилл,

А) Промоторы генов рибонуклеаз В.МегтесИш, В.ритИт и ВАкиг^гет'и. Б) Промоторы генов рибонуклеазы В.ату1оИдие/ас1ет, укоЬ Вли-ЬИИй (позитивный контроль) и рибонуклеазы В.си-си1ат.

Таким образом, полученные данные о взаимодействии PhoP белка с промоторами генов биназоподобных рибонуклеаз in vitro в совокупности с более ранними результатами по изучению экспрессии их генов в phoP-phoR мутантных штаммах B.subtilis позволяют отнести внеклеточные рибонуклеазы В.intermedins, B.pumilus и B.thuringiensis к новым членам Pho регулона бацилл. Вместе с тем открытым остался вопрос о механизмах регуляции экспрессии генов других гуанилепецифичных рибонуклеаз - РНКаз B.circidcms и B.amyloliquefaciens, промоторы которых не способны взаимодействовать с PhoP белком.

3. Сайты связывания регуляторных белков Pho регулона в промоторах генов рибонуклеаз бацилл.

Для обнаружения нуклеотидных последовательностей, определяющих регуляторные механизмы экспрессии генов гуанилепецифичных рибонуклеаз, был проведен сравнительный анализ их промоторных областей на наличие сайтов взаимодействия с регуляторными белками SpoOA и ResD B.subtilis. В промоторных областях генов РНКаз Ва и Bei было выявлено несколько

вроОА

РНКаэаВат РНКаэа_Во1 РНКа'за_В1п РНКаза_Ври РНКаза ВЪИ

т .с

ЖкЗАТАААААСТАСТАТТТТТЙАА----

-95 СвОТТООТТСАС- - ■-ССеС-СЗТТТАТТТ

-96 СбЗТТОеЩЭЗЕ----ЙСОООаТТТАТТТгаВЩЕоАТСААААбТАСТАТТТТТАДА--

-100 СТТТТТАТТТАТТГСДТСДСААОЙТТДТ------------САОТСАААААСССТСАТТТТАОСАААОААССТСТТТСТТГДСДТТТСС

-100 СТТТТТАТТТАТТ ТС А ТСДС ААО А А ТА 1----

-35

-ТТСТТТСТАТТССТ -ТТСТАТСГАТТССТ

-100 СТТТТТбТТТАСеТСАТСТАСАОАСАСТ-

-САССАУМ^АбССТСАТТТТАССАМСАТССТбТГТСИтаСДТ'ГТСС -АСОТСАААААОССТСАТТТТТТССААТСТССТиАГТСГГМСДТТСТС

РНКаза_Ват ТТСТ1 РНКааа Вех ТТСТ!

»¡СТОА^АСААТО-

- АЛААввААТС АОСТ ТС АС

ТвАТбг АААТвСбАСбТАТТССТТТС +40

рТОАТАСААТА-----------------ААААОбААТСАССТТСАС? ТЙАТЗ;

_АААТйСедеОТАТТЙСТТТЙ +40

РНКаза_В1.п TTCATgГTCGGGTGCTATAATATGДЗGTAGACAAGCATCAAGAGGA--CAGCATCCGATTTCCTTAATASGASG-ATGAAGД'rG +57 РНКаза_Ври ТТСаГДТТСОООТССТАТААТАТСЛОбТАеАСААССАТСААбАОСА--САОСАТССОАТТТССТТААТАСаАай-АТбААОАТС +57 РНКаза В1Ь ГГСАТДТОССааТССТАТААТАТСЛЕОТАСАСААССАТСААОАОСА- -СОбСАТСССАТТТССТТТтеАООАСКЗ-АТСААОДТС +57

А)

РНКаза_Ват РНКаза_Вс1 РНКаза_В1п РНКаза_Ври РНКаза ВЬЬ

ПТ тт

X, .1л ИТ л

-95 сссттвоттсАб-----ссоссстттатттттссстасатааааацтастаЗНЕЩЕ

-96 СббТТСОТТСАТб----ССООООТТТАТТТТТСбСТООАТСААААфдСТАТТТТТААД'

-100 СТТТ'ГТАТ1ТТАТ>*■ Щевйддт- -------ЖТОАААААЙсфсАТТТТАёс

-100 СТТТТТАТТТАТТТСАТСЛСААСЩТДГ---

-СЯбСАСлЦААОСС

_-35

-----аНЕтстдгтсст

- ----ТТСТДТСТАТТССТ

ЬААССТстттсгтгасдтттсс

-100 С'ГТТТТОТТТАССТСДТСТАОА&АСАСТ--------А<^ТСААААА13СС

ТТТТДеСАААЗДТ ТТТТТТССААГСТ

:стстттсгггдсдтттсс

-10 во Met

РНКаза_Ват ТТСТТТССГТССТСАТАСААТО-------------------ААААС§ААТ(^СТТСАСАТСАТСААААТеебАвеТАТТ6СТТТе +40

РНКаза_Всх ТТСТТТСОАТОСТСАТАСААТА-------------------ААААбёААТСАеСТТСАСАТСАТСААААТаСЙЗАОЙТАТТОСТТТв +40

РНКаэа_В1п ТТСДТетТСцООТОСТАТААТАТаДСаТАОАСААОСАТСААОАВбА - -САвСАТССвАТТТССТТААТАввАвС-АТйААвАТв + 57 РНКаза_Ври ГТСДтаТТССООТССТАТДАТАТ'^еТАвАСААССАТСААОАббА- -САаСАТССвАТТТССТТААТАСвАвв-АТвААОАТв +57 РНКаза ВЬЬ TTCДTД^lGCCGGTGCTATAATATGДGGTAGACAAGCATCAAGAGGA--CGGCATCCCA^I^TTCCTTTTGAGGASG-ATCAAGДTg +57

Б)

Рисунок 6. Потенциальные сайты связывания регуляторных белков РЬо регулона в промоторах генов гуанилспенифичных рибонуклеаз бацилл.

А) БроОЛ-последовательности. Б) КекО-последовательности.

Условные обозначения: сайты связывания регуляторных белков на «плюс» цепи выделены рамкой, на «минус» цепи серым цветом; предполагаемые РЬо-боксы подчеркнуты одной линией, точка начала транскрипции - дважды; сверху приведены логотипы ЗроОА- и ЯевО-боксов В.зиЫШх.

нуклеотидных последовательностей, гомологичных OA-боксу B.subtilis (рис. 6А). Они отличались от консенсусной 1-3 нуклеотидами. Расположение большинства потенциальных OA-боксов в промоторах генов РНКаз Ва и Bei практически совпадало, хотя в них были отмечены и небольшие различия. В промоторах генов гуанилепецифичных рибонуклеаз В. intermedins, B.pumilus и B.thuringiensis OA-подобных сайтов B.subtilis, обнаружено не было. Сайты, гомологичные ResD-связываЮщим последовательностям B.subtilis, были найдены в промоторах генов;1всех исследуемых РНКаз, однако количество сайтов и их расположение быдо различно (рис. 6Б). Таким образом, наличие в промоторах генов гуанилепецифичных рибонуклеаз бацилл потенциальных сайтов для связывания регуляторных белков, указывает на возможную роль данных факторов в регуляции транскрипции генов РНКаз.

4. Экспрессия генов гуанилепецифичных рибонуклеаз в нативных и дефектных по регуляторным белкам Pho регулона штаммах Bacillus subtilis.

Влияние ResD-ResE белков на экспрессию генов рибонуклеаз бацилл в клетках В.subtilis. Чтобы установить, участвуют ли регуляторные белки в контроле экспрессии генов рибонуклеаз, был исследован эффект мутаций в кодирующих их генах на активность РНКаз. Известно, что дефекты в ResD-ResE системе оказывают влияние на экспрессию генов Pho регулона в условиях фосфатного голодания [Sun et al., 1996а]. В наших исследованиях показано, что resD мутация негативно сказывается на уровне продукции биназоподобных рибонуклеаз. Специфическая активность рибонуклеаз Bi, Ври и Bth в штаммах, дефектных по ResD белку, снижается по сравнению с уровнем РНКазной активности в штамме с полноценной регуляторной системой соответственно на 89, 87 и 94% (рис. 7). Полученные результаты согласуются с данными литературы о специфической активности щелочной фосфатазы, типичного представителя Pho регулона, в resD мутанте, которая также снижается на 8090% от уровня активности в штамме дикого типа [Hulett, 1996]. Это позволяет сделать вывод о том, что белок ResD задействован в контроле экспрессии генов биназоподобных рибонуклеаз так же, как и других членов Pho регулона, т.е. является позитивным регулятором [Birkey et al., 1998; Schau et al., 2004].

Показано, что делеция гена киназы resE не приводит к утрате ферментативной активности рекомбинантными штаммами B.subtilis, несущими плазмиды с генами биназоподобных рибонуклеаз (рис. 7). Это объясняется тем, что ResD белок может быть фосфорилирован другими сенсорными киназами либо низкомолекулярными донорами фосфата, такими как ацетилфосфат [Laub and Goulian, 2007].

Отсутствие белков двухкомпонентной системы ResD-ResE не оказывает влияния на экспрессию гена РНКазы B.amyloliquefaciens и В.circulons в условиях фосфатного голодания. Однако наличие потенциальных сайтов

А)

Б.)

1,4

60000

1,2 1

й 0,8 ■■

о о.б ■ ЛГ и

0,4 0,2

0 3 6 9 12 15 18 21 24 Время, ч

О 3 6 9 12 15 18 21 24 Время, ч

Рисунок 7. Экспрессия генов биназоподобных рибонуклеаз в дефектных по ЛеБО и КсбЕ белкам рекомбинантных штаммах В.зиЬИШ.

А) Рост рекомбинантных штаммов. Б) рибонуклеазная активность.

Условные обозначения; штамм В.виЫШз 1Н642 изображен белым цветом, В.хиЫИич ЬАВ2234 (Are.sE) - серым, В.тЪШ'и ЬАВ2506 (гея Б ) - черным; РНКаза В1 кружками, РНКаза Ври - треугольниками, РНКаза ВЛ - квадратами.

связывания для белка ЯезЭ в промоторах всех гуанилспецифичных рибонуклеаз бацилл, свидетельствует о том, что данный фактор все же может регулировать экспрессию их генов, но, по-видимому, в других условиях.

Роль ЭроОА белка в регуляции экспрессии генов рибонуклеаз бацилл е клетках В.$иЫШ$. Исследование влияния БроОА белка на экспрессию генов гуанилспецифичных рибонуклеаз бацилл проводили в штаммах, несущих мутации в самом гене эроОА (образование функционального регулятора ответа практически невозможно), гене его фосфатазы ¡роОЕ (гиперактивная фосфатаза делает БроОА регулятор неактивным), а также в двойном вроОА/аЬгВ мутанте (возможность проследить АЬгВ-опосредованный путь функционирования БроОА белка).

Установлено, что мутация в гене зроОА негативно сказывается на продукции РНКазы Ва. Рибонуклеазная активность как в одиночном, так и в двойном $ро0А!аЬгВ мутанте практически отсутствовала (рис. 8). Полученный результат свидетельствует о том, что белок 5роОА является позитивным регулятором экспрессии гена рибонуклеазы В.атуЫг'цие/ааею, и действует независимо от АЬгВ белка.

Специфическая активность барназы в цюОЕ мутантном штамме, в котором основная часть БроОА белка присутствует в неактивной форме, соответствовала контролю (рис. 8). Этот результат в сравнении с тем, что получен с одиночным ¡роОА мутантом, позволяет полагать, что ген РНКазы Ва, по-видимому, активируется небольшими количествами фосфорилированного БроОА

SpoOA SpoOA/AbrB

5? ^ 400

« a 700 S I 350

11 600 ; ■ - sl 300 , ■ B

} i I

.III I I II

Ba Bci Bi Bpu Bth ! Ba Bci Bi Bpu Bth

SpoOE

aS 140

' к 3 120 an™ ■

g | ioo - J _ m, ' и г,

Mill

Ba Bci Bi Bpu Bth

Рисунок 8. Экспрессия генов рибонуклеаз бацилл в рекомбинантных штаммах B.subtilis, дефектных по SpoOA, AbrB и SpoOE белкам.

Условные обозначения: уровень активности фермента в рекомбинантном штамме B.subtilis с полноценными регуляторными белками - белые столбики, активность РНКазы в мутантных штаммах - черные столбики.

регулятора. Присутствуя в клетках в стадии замедления роста в малых количествах, активный SpoOA регулятор выполняет важные функции. Он не только способствует высвобождению вторичных метаболитов, в том числе и гидролитических ферментов и антимикробных веществ, но и принимает участие в регуляции таких важных для популяции бактерий процессов, как бактериальный «апоптоз» и формирование колоний сложного типа - биопленок [Gonzalez-Pastor et al., 2003; Verhamme et ah, 2009].

Активность рибонуклеазы Bci в исследуемых мутантных штаммах B.subtilis не отличалась от контроля (рис. 8). Следовательно, ее биосинтез не подвержен действию SpoOA белка. Отсутствие регуляции со стороны основных белков фосфатного регулона, а также альтернативного сигма В фактора [Морозова, 2000], который контролирует у B.subtilis неспецифический ответ на фосфатное голодание [Allenby et ah, 2005], свидетельствует о том, что ген фосфат-зависимой рибонуклеазы B.circulans относится к группе малоизученных генов фосфатного стимулона, неспецифически индуцируемых при истощении фосфора в окружающей среде.

Несмотря на то, что в промоторах генов гуанилспецифичных рнбонуклеаз В.intermedins, B.pumilus и B.thnringiensis сайтов, подобных OA-боксам B.subtilis, выявлено не было (рис. 6), не исключена вероятность участия регулятора ответа SpoOA в контроле экспрессии генов этих РНКаз, так как известно, что данный белок контролирует множество процессов в клетке косвенно, влияя на транскрипцию других регуляторных белков, в частности AbrB [Molle et а/., 2003].

В наших экспериментах было показано, что SpoOA белок является негативным регулятором экспрессии генов биназоподобных РНКаз, на что указывает значительное повышение РНКазной активности (в 5-6 раз) в SpoOA-дефектных штаммах (рис. 8). В двойных spoOA/abrB мутантах уровень РНКазной активности превышает контрольные значения лишь в 3 раза (рис. 8), что свидетельствует о том, что белок AbrB является позитивным регулятором. Результаты о влиянии SpoOA белка на экспрессию генов биназоподобных РНКаз согласуются с данными литературы для гена щелочной фосфатазы [Hulett, 1996] и подтверждают его AbrB-олосредованный эффект.

Эксперименты с мутантными штаммами не только подтвердили справедливость отнесения генов гуанилспецифичных рнбонуклеаз к новым членам Pho регулона, но и способствовали решению практической задачи, нацеленной на получение суперпродуцентов этих важных с практической точки зрения ферментов.

Получение суперпродуцентов бациллярных рибонуклеаз. Существуют различные методы для получения микроорганизмов, характеризующихся способностью к повышенному синтезу целевого белка, которые успешно были применены в отношении бацилл-продуцентов гуанилспецифичных рибонуклеаз. В частности, использование принципов генной инженерии и мутагенеза позволило добиться 5 и 10-кратного увеличения активности биназы по сравнению с природным продуцентом [Балабан с соавт., 1992; Знаменская с соавт., 1999]. В настоящей работе мы предлагаем иной подход, основанный на устранении негативного регулятора синтеза целевого белка. Клонировав мультикопийную плазм иду с геном биназы в SpoOA-дефектный штамм B.subtilis, нам удалось увеличить выход фермента в 30 раз по отношению к природному штамму B.intermedius 7Р. К тому же использование для получения внеклеточных целевых белков ¿роОЛ-мутантного штамма-хозяина, имеет ряд неоспоримых преимуществ, в частности нарушения в синтезе протеолитических ферментов у таких бактерий способствуют продукции полноразмерных секретируемых белков [Kodama et al., 2007]. Более того, предложенный подход может быть положен в основу конструирования систем для экспрессии других важных белковых продуктов. Подобные системы должны включать ген целевого белка под контролем промотора биназоподобной рибонуклеазы и SpoOA-дефектный штамм-хозяина.

выводы

1. Анализ секвенированных геномов бактерий рода Bacillus показал, что ортологи phoP, spoOA и resD генов B.subtilis, продукты которых контролируют специфический Pho ответ, представлены у всех бацилл, что позволило нам использовать B.subtilis в качестве модельного организма для изучения регуляции экспрессии генов гуанилспецифичных рибонуклеаз.

2. Основной регулятор Pho ответа - фактор транскрипции PhoP B.subtilis образует специфический комплекс с промоторами генов рибонуклеаз B.intermedius, B.pumilus и B.thuringiensis и не взаимодействует с промоторами РНКаз B.circulans и B.amyloliquefaciens.

3. В регуляторных областях генов гуанилспецифичных рибонуклеаз выявлены нуклеотидные последовательности, гомологичные сайтам связывания других регуляторных белков Pho регулона: ResD сайты - у всех исследуемых РНКаз, a SpoOA боксы - только у рибонуклеаз B.circulans и B.amyloliquefaciens.

4. В условиях фосфатного голодания экспрессия генов рибонуклеаз B.intermedius, B.pumilus и B.thuringiensis в рекомбинантных штаммах B.subtilis позитивно регулируется белком ResD, и негативно - белком SpoOA. Синтез рибонуклеазы B.circulans не зависит от этих регуляторов, в то время как экспрессия гена РНКазы B.amyloliquefaciens находится под позитивным контролем белка SpoOA.

5. Полученные результаты дают основание считать внеклеточные рибонуклеазы B.intermedius, B.pumilus и B.thuringiensis новыми членами фосфатного регулона, а рибонуклеазу B.circulans, в отличие от близкого структурного гомолога - фосфат-независимой РНКазы B.amyloliquefaciens, следует отнести к участникам неспецифического Pho ответа.

Публикации по теме диссертации

1. Ульянова, В. В. Роль SpoOA и AbrB белков в регуляции экспрессии гена рибонуклеазы Bacillus pumilus в рекомбинантных штаммах Bacillus subtilis I В. В. Ульянова, В. И. Вершинина, М. Р. Шарипова // Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение: материалы XIII Международной научной конференции, Казань, 4-8 апр. 2005. - Казань: Казан, гос. ун-т. - С. 86-87.

2. Ульянова, В. В. Роль белков системы SpoOA-фосфопереноса в регуляции экспрессии гена биназы в клетках Bacillus subtilis ! В. В. Ульянова, В. И. Вершинина // Наука. Инновации. Бизнес: материалы V Республиканской

научно-практической конференции молодых ученых и специалистов, Казань, 9 июн. 2005. - Казань: Экоцентр, 2005. - С. 64-65.

3. Ульянова, В. В. Роль белков системы SpoOA-фосфопереноса в регуляции экспрессии гена рибонуклеазы Bacillus intermedius в клетках Bacillus suhtilis / В. В. Ульянова, В. И. Вершинина И Актуальные аспекты современной микробиологии: тезисы Всероссийской молодежной школы-конференции, Москва, 1 -3 нояб. 2005. - С. 81.

4. Ульянова, В. В. Экспрессия гена рибонуклеазы B.thuringiensis позитивно регулируется двухкомпонентной системой ResD-ResE B.subtilis ! В. В. Ульянова, М. А. Золотова, В. И. Вершинина // Биология - наука XXI века: сб. тез. 10-ой Путинской школы-конференции молодых ученых, посвященной 50-летию Путинского научного центра РАН, Пущино, 17-21 апр. 2006. - С. 56.

5. Ульянова, В. В. Влияние SpoOA и AbrB белков на экспрессию генов гуанилспецифичных рибонуклеаз Bacillus intermedius и Bacillus pumilus в рекомбинантных штаммах Bacillus subtilis / В. В. Ульянова, В. И. Вершинина, М. А. Харитонова, М. Р. Шарипова // Микробиология. - 2007. - Т. 76, № 5. - С. 639-644.

6. Ульянова, В. В. Регуляция экспрессии генов рибонуклеаз Bacillus thuringiensis и Bacillus circulons / В. В. Ульянова, М. А. Золотова, В. И. Вершинина // Материалы докладов XIV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», Москва, 11-14 апр. 2007. - М.: Издательский центр Факультета журналистики МГУ им. М.В. Ломоносова, 2007. - С. 29-30.

7. Ульянова, В. В. Двухкомпонентная система ResD-ResE позитивно регулирует экспрессию генов гуанилспецифичных рибонуклеаз бацилл / В. В. Ульянова, М. А. Золотова, М. А. Харитонова, О. Н. Ильинская, В. И. Вершинина // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2008. -№3,-С. 23-28.

8. Ульянова, В. В. Системы, контролирующие специфический ответ бацилл на фосфатное голодание ! В.В. Ульянова, В.И. Вершинина И Ученые записки Казанского государственного университета. Серия Естественные науки. - 2008. - Т. 150, кн. 2. - С. 231-244.

9. Ульянова, В. В. Участие гуанилспецифичных рибонуклеаз Bacillus thuringiensis и Bacillus circulans в ответе клеток на фосфатное голодание / В. В. Ульянова, В. И, Вершинина // Биология: традиций и инновации в 21 веке: Сб. науч. тр. по материалам I Всероссийского, с международным участием, конгресса студентов и аспирантов биологов «Симбиоз Россия 2008», Казань, 610 июл. 2008. - Казань: Изд-во КГУ, 2008. - С. 35-36.

10. Ulyanova, V. V. Rôle of sigma В factor in régulation of binase gene expression in Bacillus subtilis cells / V. V. Ulyanova, E. G. Glazunova, V. I. Vershinina // Building the Future in Biology "Bionews": Proceedings of the First

lnteruniversity Conference on Modern Biology, Kazan, 24 Nov. 2008. - Kazan: Kazan State University, 2008,- P. 47.

11. . Ulyanova, V. V. Interaction of Bacillus subtilis PhoP regulator with promoter regions of guanyl-specific ribonuclease genes / V. V. Ulyanov'a // Microbial enzymes in biotechnology and medicine: XIV International conference devoted to the 20lh anniversary of partnership between Kazan State University and Justus-Liebig Giessen University, Kazan, 5-7 June 2009. - Kazan: Kazan State University, 2009. -P. 118-119.

Отпечатано в ООО «Печатный двор», г. Казань, ул. Журналистов, 1/16, оф. 207

Тел: 272-74-59, 541-76-41, 541-76-51. Лицензия НД№7-0215 от 01.11.2001 а Выдана Поволжским межрегиональным территориальным управлением МПТР РФ. Подписано е печать 19.10.2009 г. Усл. пл 1,3 Заказ JÉK-6772. Тираж 100 экз. Формат 60x841/16. Бумага офсетная. Печать - ризография.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ульянова, Вера Владимировна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Гуанилспецифичные рибонуклеазы бацилл: биологическая активность и практическое применение

1.1.1. Краткая характеристика белков. Биосинтез рибонуклеаз.

1.1.2. Биологическая активность рибонуклеаз.

1.1.3. Практическое использование рибонуклеаз.

1.2. Специфический Pho ответ бацилл

1.2.1. Фосфатное голодание.

1.2.2. Pho регулон.

1.2.3. Регуляторная сеть, контролирующая Pho ответ.

1.3. Двухкомпонентные системы трансдукции Pho сигнала.

1.3.1. Двухкомпонентная система PhoP-PhoR.

1.3.2. Двухкомпонентная система ResD-ResE.

1.3.3. Система SpoOA-фосфопередачи.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Экспрессия генов гуанилспецифичных рибонуклеаз бацилл в условиях фосфатного голодания"

Рибонуклеазы применяются в генной инженерии, молекулярной биологии и биотехнологии для удаления РНК из биологического материала, структурно-функциональных исследований нуклеиновых кислот и их комплексов с белками, разработке векторов для позитивной селекции рекомбинантов, получения стерильных трансгенных растений. Перспективным прикладным аспектом использования микробных РНКаз является медицинский. Области их возможного применения связаны с лечением опухолей и вирусных инфекций.

Внеклеточные гуанилспецифичные рибонуклеазы обнаружены у многих видов бацилл, в том числе у Bacillus amyloliquefaciens, B.circulans (барназоподобные РНКазы), B.intermedius, B.pumilus, B.thuringiensis (биназоподобные РНКазы). Ферменты сходны по первичной структуре, близки по физико-химическим и каталитическим свойствам. Однако исследование биосинтеза рибонуклеаз выявило значительные различия в условиях, при которых происходит их накопление в среде, что оставляет открытым вопрос о назначении этих ферментов.

Клонирование и секвенирование генов гуанилспецифичных РНКаз открыло возможность для изучения регуляции их синтеза на уровне транскрипции. Выявление регуляторных механизмов, отвечающих за экспрессию генов в тех или иных условиях, является одной из глобальных проблем молекулярной биологии. Бактерии способны активировать синтез определенных продуктов только в специфической экологической обстановке, либо репрессировать его, если образуемые белки препятствуют другим процессам, протекающим в данный момент в клетке. Регуляция экспрессии генов может также осуществляться как часть процесса дифференцировки и развития клеточной популяции. Информация о путях контроля экспрессии гена важна не только для установления функции кодируемого им белка, но и необходима для осуществления направленного воздействия на геном микроорганизма с целью увеличения выхода желаемого продукта.

В работе решались следующие задачи:

1. Провести поиск у различных видов бацилл ортологов phoP, spoOA и resD генов B.subtilis, продукты которых контролируют специфический ответ на фосфатное голодание.

2. Исследовать взаимодействие фактора транскрипции PhoP B.subtilis с регуляторными областями генов гуанилспецифичных рибонуклеаз бацилл.

3. Определить потенциальные сайты связывания SpoOA и ResD белков в промоторах генов бациллярных рибонуклеаз.

4. Изучить экспрессию генов гуанилспецифичных рибонуклеаз в нативных и дефектных по регуляторным белкам Pho регулона штаммах B.subtilis.

Положения, выносимые на защиту:

1. Регулятор транскрипции PhoP B.subtilis - типичный представитель семейства гомологичных белков, контролирующих Pho ответ у различных видов бацилл, может быть использован в качестве модельного белка для изучения связывания с промоторами генов гуанилспецифичных рибонуклеаз.

2. Специфическое взаимодействие белка PhoP с промоторами генов рибонуклеаз В. intermedins, B.pumilus, B.thuringiensis позволяет отнести их к новым членам Pho регулона, функционирующего у бацилл в условиях фосфатного голодания.

3. Наличие в промоторах генов гуанилспецифичных рибонуклеаз бацилл потенциальных сайтов связывания регуляторных белков ResD и SpoOA и изменение уровня ферментативной активности в соответствующих мутантных штаммах свидетельствует о роли этих белков в экспрессии генов исследуемых РНКаз.

Научная новизна работы. Анализ распространенности среди бацилл двухкомпонентных систем трансдукции сигнала PhoP-PhoR, ResD-ResE и многокомпонентной системы SpoOA-фосфопередачи, контролирующих Pho ответ B.subtilis, выявил высокую консервативность регуляторов ответа и видовые особенности, присущие гистидин киназам. Впервые показано непосредственное связывание основного регулятора Pho ответа бацилл — белка PhoP с промоторами генов рибонуклеаз В .intermedins, B.pumilus, B.thuringiensis, что на молекулярном уровне подтверждает его участие в контроле транскрипции их генов. Кроме того, в регуляторных областях генов рибонуклеаз охарактеризованы потенциальные сайты связывания для SpoOA и ResD белков и получены приоритетные данные об участии данных факторов транскрипции в регуляции экспрессии генов гуанилспецифичных РНКаз бацилл.

Практическая ценность работы. Полученные в работе данные о механизмах контроля синтеза внеклеточных рибонуклеаз бацилл могут быть использованы при конструировании экспрессионных систем с целью получения высокоэффективных промышленных штаммов-продуцентов целевых белков. Подобные системы должны включать ген целевого белка под контролем промотора биназоподобной рибонуклеазы и бациллярный штамм-хозяина для его экспрессии, дефектный по негативному регулятору SpoOA. В частности этот подход позволил нам получить суперпродуцент рибонуклеазы В .intermedins, обладающей противоопухолевой и противовирусной активностью. Кроме того, выявленные в работе закономерности важны для общего понимания механизмов функционирования регуляторных систем бациллярной клетки и могут быть использованы в учебном процессе в соответствующих курсах лекций и семинарах для студентов-биологов.

Связь работы с научными программами. Исследования проводились в соответствии с планом НИР КГУ (№ гос. регистрации 01.2.006.09683 «Механизмы функциональной активности клетки») и были выполнены при финансовой поддержке ФЦНТП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники" (Госконтракты 02.434.11.3020, 02.512.11.2050 и 02.512.12.2014), гранта РФФИ 05-04-48182, гранта Правительства Республики Татарстан (2008 г.), программы Международного союза микробиологических сообществ «UNESCO-IUMS-SGM Fellowship».

Апробация работы. Основные положения диссертации представлены на XIII Международной научной конференции «Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение» (Казань, 2005); V Республиканской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Наука. Инновации. Бизнес» (Казань, 2005); Всероссийской молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2005); 10-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых, посвященной 50-летию Пущинского научного центра РАН, «Биология — наука XXI века» (Пущино, 2006); I Международной научно-практической конференции

Микробная биотехнология — новые подходы и решения» (Казань, 2007); XIV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2007); I Всероссийском, с международным участием, конгрессе студентов и аспирантов биологов «Симбиоз Россия 2008» (Казань, 2008); Первой межуниверситетской конференции по современной биологии «Bionews» (Kazan, 2008); XIV Международной конференции, посвященной 20-летию партнерства между Казанским государственным университетом и Гиссенским университетом им. Ю. Либиха, «Microbial enzymes in biotechnology and medicine» (Kazan, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Ульянова, Вера Владимировна

выводы

2. Основной регулятор Pho ответа — фактор транскрипции PhoP B.subtilis образует специфический комплекс с промоторами генов рибонуклеаз B.intermedius, B.pumilus и B.thuringiensis и не взаимодействует с промоторами РНКаз B.circulans и B.amyloliquefaciens.

3. В регуляторных областях генов гуанилспецифичных рибонуклеаз выявлены нуклеотидные последовательности, гомологичные сайтам связывания других регуляторных белков Pho регулона: ResD сайты — у всех исследуемых РНКаз, a SpoOA боксы - только у рибонуклеаз B.circulans и В. amyloliquefaciens.

Заключение

Гуанилспецифичные рибонуклеазы B.amyloliquefaciens, B.intermedius, B.pumilus, B.thuringiensis, B.circulans хорошо изучены: охарактеризованы их физико-химические свойства, установлена первичная структура, исследована биологическая активность. Показано, что внеклеточные бациллярные рибонуклеазы имеют важное практическое значение. Гены этих РНКаз клонированы и секвенированы, что создает предпосылки для изучения механизмов регуляции биосинтеза ферментов на молекулярном уровне. Поскольку синтез большинства гуанилспецифичных рибонуклеаз осуществляется в условиях фосфатного голодания и является PhoP-PhoR-зависимым, мы предположили, что его регуляция может осуществляться по типу белков Pho регулона, которые не только усиливают поглощение фосфата из окружающей среды, но и способствуют его извлечению из альтернативных источников, позволяя клетке быстро адаптироваться к условиям фосфорного голодания. Известно, что Pho регулон помимо двухкомпонентной системы трансдукции сигнала PhoP-PhoR находится под контролем других регуляторных систем, а именно двухкомпонентной системы ResD-ResE, отвечающей за регуляцию процессов дыхания у бацилл, и многокомпонентной системы SpoOA-фосфопередачи, от активности которой зависит инициация процесса спорообразования. Настоящая работа посвящена установлению роли регуляторных белков, вовлеченных в специфический Pho ответ, в контроле экспрессии генов гуанилспецифичных рибонуклеаз бацилл. Знание механизмов регуляции синтеза РНКаз имеет не только теоретическую значимость, но и важно для решения практических задач, направленных на получение суперпродуцентов рибонуклеаз.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1.1. Штаммы бактерий и плазмиды

Штаммы бактерий, использованные в работе, и их краткое описание приведены в таблице 3.

Плазмиды pET-PhoP и pET-PhoR231 предназначены соответственно для экспрессии белка PhoP и цитоплазматического фрагмента (с 231 а.о. по С-конец) белка PhoR B.subtilis в клетках E.coli [Pragai et al., 2004]. ГеныphoP (722 п.о.) и phoR (1049 п.о.) находятся в них под контролем сильных сигналов транскрипции и трансляции бактериофага Т7, а образуемые белки содержат 6 остатков гистидина на своем С-конце (рис. 3). Ген устойчивости к ампициллину в данных конструкциях является маркерным. Плазмиды любезно предоставлены для работы проф. Харвудом (Университет Ньюкасла, Великобритания).

Плазмиды pMZ55, pMZ56, pMZ58, pMZ59 необходимы для экспрессии генов гуанилспецифичных рибонуклеаз В.intermedins, B.pumilus B.thuringiensis и B.circulans в штаммах B.subtilis. Полные гены РНКаз в данных конструкциях состыкованы с геном внутриклеточного ингибитора барстара, требующегося для защиты клеток от токсического действия рибонуклеаз. Плазмиды серии pMZ были сконструированы ранее в лаборатории биосинтеза и биоинженерии ферментов КГУ Л. В. Знаменской с использованием вектора pUBllO, детерминирующего устойчивость к канамицину [Знаменская с соавт., 1999]. Схема плазмиды pMZ55 представлена на рисунке 4, другие плазмиды этой серии имеют аналогичное строение.

Плазмида-шатл рМТ420 отличается от pMZ плазмид лишь тем, что при ее создании гены рибонуклеазы B.amyloliquefaciens и ее ингибитора были клонированы в вектор рС194, несущий ген устойчивости к хлорамфениколу [Hartley, 1988].

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ульянова, Вера Владимировна, Казань

1. Алексеева, И. И. Сравнительное изучение противовирусной активности панкреатических и микробных рибонуклеаз / И. И. Алексеева, Б. М. Куриненко, Г. И. Клейнер и др. // Антибиотики. 1981. - Т. 26, № 7. - С. 527-532.

2. Афанасенко, Г. А. Первичная структура рибонуклеазы Bacillus intermedius 7Р / Г. А. Афанасенко, С. М. Дудкин, Л. Б. Каминир и др. // Биоорганическая химия. 1979,- Т. 5, № 2. - С. 187-202.

3. Балабан, Н. П. Устойчивые к антибиотикам мутанты Bacillus intermedius продуценты ряда ферментов / Н. П. Балабан, В. И. Вершинина, Л. В. Знаменская, Е. Б. Чернокальская // Биологические науки. - 1992. - вып. 2.-С. 139-143.

4. Банникова, Г. Е. Выделение внутриклеточных ингибиторов бактериальных РНКаз на колонке с иммобилизованной РНКазой Bacillus intermedius / Г. Е. Банникова, В. П. Варламов // Прикл. биохимия и микробиология. 1994. - Т. 30, № 3. - С. 379-383.

5. Вершинина, О. А. Регуляция экспрессии генов гуанилспецифичных рибонуклеаз Bacillus intermedius и Bacillus pumilus : автореф. дис.канд. биол. наук : 03.00.07 / Вершинина Ольга Анатольевна. Казань, 1999. - 23 с.

6. Грибенча, С. В. Защитная активность РНКазы Bacillus intermedius у морских свинок и кроликов, зараженных уличным вирусом бешенства / С. В. Грибенча, Л. А. Поцелуева, И. Ф. Баринский и др. II Вопросы вирусологии. -2006.-Т. 51, №5.-Р. 41-46.

7. Дементьев, А. А. Полная первичная структура рибонуклеазы бактерии Bacillus thuringiensis / А. А. Дементьев, В. М. Орлов, С. В. Шляпников // Биоорганическая химия. 1993а. - Т. 19, №9. - С. 853-861.

8. Дементьев, А. А. Первичная структура и каталитические свойства внеклеточной рибонуклеазы Bacillus circulans / А. А. Дементьев, Г. П. Моисеев, С. В. Шляпников // Биоорганическая химия. 19936. - Т. 19, №11.1. С. 1065-1072.

9. Дементьев, А. А. Выделение, структурная характеристика и функциональные свойства внеклеточной рибонуклеазы Bacillus polymyxa / А.

10. A. Дементьев, М. П. Кирпичников, О. А. Миргородская и др. // Молекулярная биология. 1996. - Т. 30. - С. 1193-1202.

11. Егоров, С. Ю. Влияние РНКазы на продукцию вторичных метаболитов / С. Ю. Егоров, Р. П. Наумова, Н. Г. Захарова и др. // Микробиология. -1995. Т. 64, №5. - С. 543-546.

12. Зеленихин, П. В. Индукция апоптоза опухолевых клеток биназой / П.

13. B. Зеленихин, А. И. Колпаков, Г. В. Черепнев, О. Н. Ильинская // Мол. Биол. (Моек). 2005. - Т. 39, №3. - С. 457-463.

14. Знаменская, Л. В. Оптимизация условий культивирования Bacillus intermedins для повышения биосинтеза щелочной внеклкточной РНКазы / JI. В. Знаменская, Г. И. Клейнер, Б. Я. Паэгле и др. // Микробиология. 1980. -Т. 49, Вып. 5. - С. 722-726.

15. Знаменская, Л. В. Биосинтез внеклеточной рибонуклеазы Bacillus pumilus / JT. В. Знаменская, В. Л. Ивайловский, Е. И. Иванова и др. // Микробиология. 1994. - Т. 63, №6. - С. 986-992.

16. Знаменская, Л. В. Биосинтез внеклеточной гуанилепецифичной рибонуклеазы из Bacillus circulans / Л. В. Знаменская, О. В. Морозова, В. И. Вершинина и др. // Микробиология. 1998. - Т. 67, №5. - С. 619-625.

17. Ильинская, О. Н. Почему рибонуклеазы вызывают гибель раковых клеток / О. Н. Ильинская, А. А. Макаров // Мол. Биол. (Моск.). 2005. - Т. 39, №1. - С. 3-13.

18. Калачева, Н. В. Влияние рибонуклеаз и их модифицированных производных на функциональную активность перитонеальных макрофагов крысы / Н. В. Калачева, Б. М. Куриненко // Биомед. Химия. — 2005. — Т. 51, №3. — С. 303-310.

19. Колпаков, А. И. Изменение некоторых биологических свойств лактобацилл под влиянием экзогенной рибонуклеазы / А. И. Колпаков, Ф. Г. Куприянова-Ашина, Е. М. Горская // Антибиотики и химиотерапия. -1996. -Т. 41, № 10.-С. 16-18.

20. Колпаков, А. И. Зависимость влияния РНКазы B.intermedius на рост дрожжей от концентрации внеклеточного фермента / А. И. Колпаков, Ф. Г. Куприянова-Ашина, И. Б. Лещинская // Микробиология. 2000. - Т. 69. - Р. 478-482.

21. Колпаков, А. И. Эффект термальной обработки рибонуклеазы Bacillus intermedius на ее каталитические и биологические свойства / А. И. Колпаков, О. Н. Ильинская, О. Б. Иванченко, Н. С. Карамова // Микробиология. — 2001. -Т. 70,1. 1.-Р. 24-28.

22. Куриненко, Б. М. Механизм противоопухолевого действия рибонуклеазы Bacillus intermedius / Б. М. Куриненко, JI. И. Собчук, Е. В. Сергеева // Антибиотики и химиотерапия. — 1995а. Т. 40, №5. — Р. 12-15.

23. Куриненко, Б. М. Антивирусные свойства модифицированной рибонуклеазы B.intermedius / Б. М. Куриненко, Н. В. Калачева, П. И. Муратов // Антибиотики и химиотерапия. 19956. - Т. 40. - С. 17-19.

24. Лебеденко, Е. Н. Визуализация раковых клеток с помощью флуоресцентного белка EGFP-барназа / Е. Н. Лебеденко, Т. Г. Баландин, Э. Ф. Эдельвейс и др. // Доклады Академии наук. 2007. - Т. 414, №3. - Р. 408411.

25. Лещинская, И. Б. Современные методы изучения нуклеиновых кислоти нуклеаз микроорганизмов / И. Б. Лещинская с соавт. Казань: Изд. КГУ. -1980.- 118 с.

26. Морозова, О. В. Регуляция биосинтеза внеклеточных гуанилспецифичных рибонуклеаз Bacillus circulans и Bacillus thuringiensis : автореф. дис.канд. биол. наук : 03.00.07 / Морозова Ольга Владимировна. -Казань, 2000. 23 с.

27. Морозова, О. В. Регуляция биосинтеза внеклеточных фосфогидролаз у бацилл / О. В. Морозова, О. А. Вершинина, В. И. Вершинина и др. // Мол. Ген. Микробиол. Вирусол. 2001. Т. 2. - С. 13-19.

28. Струминская, Н. К. Внеклеточная рибонуклеаза из Bacillus pumilus / Н. К. Струминская, В. Л. Ивайловский, А. А. Дементьев и др. // Биологические науки. 1992. - №2. - С. 41-44.

29. Харитонова, М. А. Биосинтез секретируемых рибонуклеаз Bacillus intermedius и Bacillus circulans в условиях азотного голодания / М. А. Харитонова, В. И. Вершинина // Микробиология. 2009. - Т. 78, №2. - С. 220-225.

30. Шляпников, С. В. Аминокислотная последовательность и каталитические свойства внеклеточной рибонуклеазы Bacillus coagulans / С. В. Шляпников, А. А. Дементьев // ДАН РАН. 1993. - Т. 332, №3. - С. 382384.

31. Шульга, А. А. Рибонуклеаза из Bacillus thuringiensis var. subtoxicus. Структура гена и регуляция биосинтеза / А. А. Шульга, Л. В. Знаменская, О. В. Морозова и др. // Биоорг. хим. 2000. - Т. 26, №9. - С. 672-678.

32. Abdel-Fattah, W. R. Bacillus subtilis phosphorylated PhoP: direct activation of the Ecta- and repression of the EoE-responsive phoB-Ps+V promoters during Pho response / W. R. Abdel-Fattah, Y. Chen, A. Eldakak, F. M. Hulett // J.

33. Bacteriol. 2005. - Vol. 187,1. 15. - P. 5166-5178.

34. Allenby, N. E. Genome-wide transcriptional analysis of the phosphate starvation stimulon of Bacillus subtilis / N. E. Allenby, N. E. O'Connor, Z. Pragai et al. II J. Bacteriol. 2005. - Vol. 187, №23. - P. 8063-8080.

35. Allenby, N. E. E. Phosphate starvation induces the sporulation killing factor of Bacillus subtilis / N. E. E. Allenby, C. A. Watts, G. Homuth, Z. Pragai, A. Wipat, A. C. Ward, C. R. Harwood // J. Bacteriol. 2006. - Vol. 188, №14. - P. 5299-5303.

36. Antelman, H. Phosphate starvation-inducible proteins of B.subtilis. Proteomics and transcriptional analysis / H. Antelman, C. Scharf, M. Hecker // J. Bacteriol. 2000. - Vol. 182, №16. - P. 4478-4490.

37. Atalla, A. The pst operon of Bacillus subtilis is specifically induced by alkali stress / A. Atalla, W. Schumann // J. Bacteriol. 2003. - Vol. 185,1. 16. - P. 5019-5022.

38. Baek, J. H. Transcriptome analysis of phosphate starvation response in Escherichia coli /, J. H. Baek, S. Y. Lee // J. Microbiol. Biotechnol. 2007. - Vol. 17.-P. 244-252.

39. Baruah, A. Mutational analysis of the signal-sensing domain of ResE histidine kinase from Bacillus subtilis / A. Baruah, B. Lindsey, Y. Zhu, M. M. Nakano //J. Bacteriol. 2004. - Vol. 186,1. 6. - P. 1694-1704.

40. Ben-Yehuda, S. RacA, a bacterial protein that anchors chromosomes to the cell poles / S. Ben-Yehuda, D. Z. Rudner, R. Losick // Science. 2003. - Vol. 299. -P. 532-536.

41. Bi, Y. A novel strategy for regulated expression of a cytotoxic gene / Y. Bi, S. J. Rothstein, A. G. Wildeman // Gene. 2001. - Vol. 279. - P. 175-179.

42. Birck, C. The crystal structure of the phosphorylation domain in PhoP reveals a functional tandem association mediated by an asymmetric interface / C. Birck, Y. Chen, F. M. Hulett, J. P. Samama // J. Bacteriol. 2003. - Vol. 185. - P. 254-261.

43. Borneman, A. R. Divergence of transcription factor binding sites across related yeast species / A. R. Borneman, T. A. Gianoulis, Z. D. Zhang et al. // Science. 2007. - Vol. 317. - P. 815-819.

44. Britton, R. A. Genome-wide analysis of the stationary-phase sigma factor (sigma-H) regulon of Bacillus subtilis / R. A. Britton, P. Eichenberger, J. E. Gonzalez-Pastor etal. II J. Bacteriol. 2002. Vol. 184. - P. 4881-4890.

45. Buckle, A. M. Protein-protein recognition: crystal structural analysis of a barnase-barstar complex at 2.0-A resolution / A. M. Buckle, G. Schreiber, A. R. Fersht // J. Biochem. 1994. - Vol. 33. - P. 8878-8889.

46. Burbulys, D. Initiation of sporulation in B.subtilis is controlled by a multicomponent phosphorelay / D. Burbulys, K. A. Trach, J. A. Hoch // Cell. -1991.-Vol. 64.-P. 545-552.

47. Bycroft, M. Determination of the three-dimensional solution structure of barnase using nuclear magnetic resonance spectroscopy / M. Bycroft, S. Ludvigsen, A. R. Fersht, F. M. Poulsen // Biochemistry. 1991. - Vol. 30. - P. 8697-8701.

48. Cao, B. The pTA29-barnase chimeric gene transformation of Brassica campestris L. subsp. chinensis Makino var. parachinensis mediated by agrobacterium / B. Cao, C. Meng, J. Lei, G. Chen // Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. 2008. - Vol. 24, №5. - P. 881-886.

49. Castilla-LIorente, V. SpoOA, the key transcriptional regulator for entrance into sporulation, is an inhibitor of DNA replication / V. Castilla-LIorente, D.

50. Munoz-Espin, L. Villar et al. // EMBO J. 2006. - Vol. 25. - P. 3890-3899.

51. Cervin, M. A. The SpoOA sof mutations reveal regions of the regulatory domain that interact with a sensor kinase and RNA polymerase / M. A. Cervin, G. В Spiegelman //Mol. Microbiol. 1999. - Vol. 31. - P. 597-607.

52. Chen, G. SpoOA-dependent activation of an extended -10 region promoter in Bacillus subtilis / G. Chen, A. Kumar, Т. H. Wyman, C. P. Moran // J. Bacteriol. -2006.-Vol. 188, №4.-P. 1411-1418.

53. Chu, F. A novel regulatory protein governing biofilm formation in Bacillus subtilis / F. Chu, D. B. Kearns, A. McLoon et al. II Mol. Microbiol. 2008. -Vol. 68. - P. 1117-1127.

54. Condon, C. The phylogenetic distribution of bacterial ribonucleases / C. Condon, H. Putzer // Nucleic Acids Res. 2002. - Vol. 30. - P. 5339-5346.

55. Cruz Ramos, H. Fermentative metabolism of Bacillus subtilis: physiology and regulation of gene expression / H. Cruz Ramos, T. Hoffmann, M. Marino et al. II J. Bacteriol. 2000. - Vol. 182. - P. 3072-3080.

56. De Block, M. The development of a nuclear sterility system in wheat. Expression of the barnase gene under the control of tapetum specific promoters / M. De Block, D. Debrower, T. Moens // Theor. Appl. Genet. 1997. - Vol. 95. -P. 125-131.

57. Deyev, S. M. Design of multivalent complexes using the barnase-barstar module / S. M. Deyev, R. Waibel, E. N. Lebedenko et al. II Nat. Biotechnol. -2003.-Vol. 21.-P. 1486-1492.

58. Edelweiss, E. Barnase as a new therapeutic agent triggering apoptosis in human cancer cells / E. Edelweiss, T. G. Balandin, J. L. Ivanova et al. II PLoS ONE. 2008. - Vol. 3, №6. - P. e2434.

59. Eder, S. A Bacillus subtilis secreted phosphodiesterase/alkaline phosphataseis the product of a Pho regulon gene, phoD / S. Eder, L. Shi, K. Jensen \et al. II Microbiol. 1996. - Vol. 142. - P. 2041-2047.

60. Eder, S. Mutational analysis of the phoD promoter in Bacillus subtilis: implications for PhoP binding and promoter activation of Pho regulon promoters / S. Eder, W. Liu, F. M. Hulett // J. Bacteriol. 1999. - Vol. 181. - P. 2017-2025.

61. Engelberg-Kulka, H. Cannibals defy starvation and avoid sporulation / H. Engelberg-Kulka, R. Hazan // Science. 2003. Vol. 301. P. 467-468.

62. Errington, J. Regulation of endospore formation in Bacillus subtilis / J. Errington // Nature Reviews Microbiology. 2003. - Vol. 1. - P. 117-126.

63. Fawcett, P. The trancriptional profile of early to middle sporulation in Bacillus subtilis / P. Fawcett, P. Eichenberger, R. Losick, P. Youngman // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. - Vol. 97. - P. 8063-8068.

64. Ferrari, E. Effect of stage 0 sporulation mutations on subtilisin expression / E. Ferrari, S. M. H. Howard, J. A. Hoch // J. Bacteriol. 1986. - Vol. 166. - P. 173-179.

65. Fersht, A. Protein folding and stability: the pathway of folding of barnase / A. Fersht//FEBS Lett. 1993. - Vol. 325.-P. 5-16.

66. Fitch, W. M. Homology a personal view on some of the problems / W. M. Fitch // Trends Genet. 2000. - Vol. 16. - P. 227-231.

67. Frisch, C. Thermodynamics of the interaction of barnase and barstar: changes in free energy versus changes in enthalpy on mutation / C. Frisch, G. Schreiber, С. M. Johnson, A. R. Fersht // J. Mol. Biol. 1997. - Vol. 267. - P. 696-706.

68. Fujita, M. Feedback loops involving SpoOA and AbrB in in vitro transcription of the genes involved in the initiation of sporulation in Bacillus subtilis / M. Fujita, Y. Sadaie // J. Biochem. (Tokyo). 1998. - Vol. 124. - P. 98104.

69. Fujita, M. The master regulator for entry into sporulation in Bacillus subtilis becomes a cell-specific transcription factor after asymmetric division / M. Fujita, R. Losick // Genes Dev. 2003. - Vol. 17. - P. 1166-1174.

70. Fujita, M. High- and low-threshold genes in the SpoOA regulon of Bacillus subtilis / M. Fujita, J. E. Gonzalez-Pastor, R. Losick // J. Bacteriol. 2005. - Vol. 187.-P. 1357-1368.

71. Fujita, M. Evidence that entry into sporulation in Bacillus subtilis is governed by a gradual increase in the level and activity of the master regulator SpoOA / M. Fujita, R. Losick // Genes Dev. 2005. - Vol. 19. - P. 2236-2244.

72. Gardner, N. Production of male-and female-sterile plants through reproductive tissue ablation / N. Gardner, R. Felsheim, A. G. Smith // J. Plant Physiol. 2009. - Vol. 166.-P. 871-881.

73. Gelfand, M. S. Evolution of transcriptional regulatory networks in microbial genomes / M. S. Gelfand // Curr. Opin. Struct. Biol. 2006. - Vol. 16. -P. 420^429.

74. Geng, H. Regulation of respiratory genes by ResD-ResE signal transduction system in Bacillus subtilis / H. Geng, P. Zuber, M. M. Nakano // Methods in Enzymology. 2007a. - Vol. 422. - P. 448-464.

75. Geng, H. Characterization of ResDE-Dependent fnr Transcription in Bacillus subtilis / H. Geng, Y. Zhu, K. Mullen et al. II J. Bacteriol. 2007b. -Vol. 189, №5. - P. 1745-1755.

76. Goldman, M. H. Female sterile tobacco plants are produced by stigma-specific cell ablation / M. H. Goldman, R. B. Goldberg, C. Mariani // EMBO J. -1994.-Vol. 13.-P. 2976-2984.

77. Gonzalez-Pastor, J. E. Cannibalism by sporulating bacteria / J. E. Gonzalez-Pastor, E. C. Hobbs, R. Losick. // Science. 2003. - Vol. 301. - P. 510513.

78. Hahn, J. The major role of SpoOA in genetic competence is to downregulate abrB, an essential competence gene / J. Hahn, M. Roggiani, D. Dubnau // J.

79. Bacteriol. 1995. - Vol. 177, №12. - P. 3601-3605.

80. Hamon, M. A. The sporulation transcription factor SpoOA is required for biofilm development in Bacillus subtilis / M. A. Hamon, B. A. Lazazzera // Mol. Microbiol.-2001.-Vol. 42.-P. 1199-1209.

81. Hamon, M. A. Identification of AbrB-regulated genes involved in biofilm formation by Bacillus subtilis / M. A. Hamon, N. R. Stanley, R.A. Britton et al. II Mol. Microbiol. 2004. - Vol. 52. - P. 847-860.

82. Hartig, E. Bacillus subtilis ResD induces expression of the potential regulatory genes yclJK upon oxygen limitation / E. Hartig, H. Geng, A. Hartmann et al. И J. Bacteriol. 2004. - Vol. 186, №. 19. - P.6477-6484.

83. Hartley, R. W. Amino-acid sequence of extracellular ribonuclease (barnase) of Bacillus amyloliquefaciens / R. W. Hartley, E. A. Barker // Nature: New biology.-1972.-Vol. 235,1. 53.-P. 15-16.

84. Hartley, R. W. Production and purification of the extracellular ribonuclease of Bacillus amyloquefaciens (barnase) and its inhibitor (barstar) / R. W. Hartley, D. L. Rogerson // Preparatine Biochem. 1972. - Vol. 2. - P. 229-242.

85. Hartley, R. W. Barnase and Barstar. Expression of its cloned inhibitor permits expression of clones ribonuclease / R. W. Hartley // Journal of Molecular Biology. 1988. - Vol. 202. - P. 913-915.

86. Hartley, R. W. Barnase and barstar: two small proteins to fold and fit together / R. W. Hartley // Trends Biochem. Sci. 1989. - Vol. 14. - P. 450-454.

87. Hartley, R. W. Barnase and Barstar / R. W. Hartley // Ribonucleases: structures and Functions / G. D'Alessio, J. F. Riordan. Eds. Academic Press, 1997.-P. 51-100.

88. Hoch, J. A. Two-component and phosphorelay signal transduction / J. A. Hoch // Curr. Opin. Microbiol. 2000. - Vol. 3. - P. 165-170.

89. Hoch, J. A. Keeping signals straight in phosphorelay signal transduction / J. A. Hoch, К. I. Varughese // J. Bacteriol. 2001. - Vol. 183, №17. - P. 4941-4949.

90. Hoffmann, T. Ammonification in Bacillus subtilis utilizing dissimilatory nitrite reductase is dependent on resDE / T. Hoffmann, N. Frankenberg, M. Marino, D. Jahn // J. Bacteriol. 1998. - Vol. 180, № 1. - P. 186-189.

91. Homuth, G. Transcriptional control of Bacillus subtilis hemN and hemZ / G. Homuth, A. Rompf, W. Schumann, D. Jahn // J. Bacteriol. 1999. - Vol. 181. - P. 5922-5929.

92. Hulett, F. M. Sequential action of two-component genetic switches regulates the pho regulon in Bacillus subtilis / F. M. Hulett, J. K. Lee, L. Shi et al. III. Bacteriol. 1994. - Vol. 176. -P.l348-1358.

93. Hulett, F. M. The signal transduction network for PHO regulation in Bacillus subtilis / F. M. Hulett // Mol. Microbiol. - 1996. - Vol. 19. - P. 933-939.

94. Ilinskaya, O. N. Bacterial ribonuclease: mutagenic effect in microbial test-systems / O. N. Ilinskaya, О. B. Ivanchenko, N. S. Karamova // Mutagenesis. — 1995.-Vol. 10,1.3.-P. 165-170.

95. Ilinskaya, O. Bacillus intermedius ribonuclease as inhibitor of cell proliferation and membrane current / O. Ilinskaya, K. Decker, A. Koschinski et al. И Toxicology. 2001. — Vol. 156,1. 2/3.-P. 101-107.

96. Ilinskaya, O. N. Cytotoxicity of RNases is increased by cationization and counteracted by K(Ca) channels / O. N. Ilinskaya, A. Koschinski, V. A. Mitkevich et al. II Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004. - Vol. 314, I. 2. -P. 550-554.

97. Ilinskaya, O. N. Binase induces apoptosis of transformed myeloid cells and does not induce T-cell immune response / O. N. Ilinskaya, P. V. Zelenikhin, I. Yu. Petrushanko et al. II Biochemical and Biophysical Research

98. Communications. -2007. Vol. 361. - P. 1000-1005.

99. Ilinskaya, O. N. RNase-induced apoptosis: Fate of calcium-activated potassium channels / O. N. Ilinskayaa, A. Koschinski, H. Repp et al. // Biochimie. 2008. - Vol. 90,1. 5. - P. 717-725.

100. Ireton, K. spoOJ is required for normal chromosome segregation as well as the initiation of sporulation in Bacillus subtilis / K. Ireton, N. W. Gunther, A. D. Grossman // J. Bacteriol. -1994. Vol. 176. - P. 5320-5329.

101. Ireton, K. Krebs cycle function is required for activation of the SpoOA transcription factor in Bacillus subtilis / K. Ireton, S. F. Jin, A. L. Sonenshein, A. D. Grossman // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. - Vol. 92. - P. 2845-2849.

102. Jeffris, G. D. Rapid method for determining the activity of microorganisms on nucleic acids / G. D. Jeffris, W. F. Holtman, D. Guse // J. Bacteriol. 1957. - Vol. 73. - P. 61-79.

103. Jiang, M. Multiple histidine kinases regulate entry into stationary phase and sporulation in Bacillus subtilis / M. Jiang, W. Shao, M. Perego, J. A. Hoch. // Mol. Microbiol. 2000. - Vol. 38. - P.535-542.

104. Jongbloed, J. D. TatC is a specificity determinant for protein secretion via the twin-arginine translocation pathway / J. D. Jongbloed, U. Martin, H. Antelmann etal. //J. Biol. Chem. 2000. - Vol. 275.-P. 41350-41357.

105. Kearns, D. B. A master regulator for biofilm formation by Bacillus subtilis / D. B. Kearns, F. Chu, S. S. Branda et al. II Mol. Microbiol. 2005. -Vol. 55.-P. 739-749.

106. Kempe, K. Intein-mediated protein assembly in transgenic wheat: production of active barnase and acetolactate synthase from split genes / K. Kempe, M. Rubtsova, M. Gils // Plant Biotechnology Journal. 2009. - Vol. 7.1. P. 283-297.

107. Kodama, T. Effect of Bacillus subtilis spoOA mutation on cell wall lytic enzymes and extracellular proteases, and prevention of cell lysis / T. Kodama, K. Endo, K. Ara et al. //J. Biosci. Bioeng. 2007. - Vol. 103, No. 1. - P. 13-21.

108. Koonin, E. V. Orthologs, paralogs, and evolutionary genomics / E. V. Koonin II Annu. Rev. Genet. 2005. - Vol. 39. - P. 309-338.

109. Korbel, J. O. Analysis of genomic context: Prediction of functional associations from conserved bidirectionally transcribed gene pairs / J. O. Korbel, L. J. Jensen, C. von Mering, P. Bork // Nat. Biotechnol. 2004. - Vol. 22. - P. 911-917.

110. Kumar, A. Surfaces of SpoOA and RNA polymerase sigma factor A that interact at the spoIIG promoter in Bacillus subtilis / A. Kumar, C. Buckner Starke, M. DeZalia, C. P. Moran // J. Bacteriol. 2004. - Vol. 186. - P. 200-206.

111. Kunin, V. The net of life: Reconstructing the microbial phylogenetic network / V. Kunin, L. Goldovsky, N. Darzentas, C. A. Ouzounis // Genome Res. 2005. - Vol. 15. - P. 954-959.

112. Kurinenko, В. M. Effect of ribonuclease from Bacillus intermedius on human blood lymphocytes / В. M. Kurinenko, R. Sh. Bulgakova, R. E. Davydov // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1998. - Vol. 21. - P. 117-122.

113. LaCelle, M. Oxygen-controlled regulation of flavohemoglobin gene in Bacillus subtilis / M. LaCelle, M. Kumano, K. Kurita et al. II J. Bacteriol. — 1996.-Vol. 178.-P. 3803-3808.

114. Ladds, J. C. The response regulator SpoOA from Bacillus subtilis is efficiently phosphorylated in Escherichia coli / J. C. Ladds, K. Muchova, D. Blaskovic et al. II FEMS Microbiol. Lett. 2003. - Vol. 223. - P. 153-157.

115. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assemblyof the head of bacteriophage T4 / U. K. Laemmli // Nature. 1970. - Vol. 227. - P. 680-685.

116. Lannenpaa, M. Prevention of flower development in birch and other plants using a BpFULLl::BARNASE construct / M. Lannenpaa, M. Hassinen, A. Ranki et al. II Plant Cell Rep. 2005. - Vol. 24. - P. 69-78.

117. Laub, M. T. Specificity in two-component signal transduction pathways / M. T. Laub, M. Goulian // Annu. Rev. Genet. 2007. - Vol. 41. - P. 121-145.

118. Lazazzera, B. A. An exported peptide functions intracellularly to contribute to cell density signaling in B.subtilis / B. A. Lazazzera, J. M. Solomon, A. D. Grossman // Cell. 1997. - Vol. 89. - P. 917-925.

119. LeDeaux, J. R. Different roles for KinA, KinB, and KinC in the initiation of sporulation in Bacillus subtilis / J. R. LeDeaux, N. Yu, A. D. Grossman // J. Bacteriol. 1995. - Vol. 177. - P. 861-863.

120. Leich, F. Endocytotic internalization as a crucial factor for the cytotoxicity of ribonucleases / F. Leich, N. Stohr, A. Rietz et al. 11 J. Biol. Chem. 2007. - Vol. 282, №38. - P. 27640-27646.

121. Lerat, E. Evolutionary origins of genomic repertoires in bacteria / E. Lerat, V. Daubin, H. Ochman, N. A. Moran // PLoS Biol. 2005. - Vol. 3. - P. el30.

122. Leuchtenberger, S. Conditional cell ablation by stringent tetracycline-dependent regulation of barnase in mammalian cells / S. Leuchtenberger, A. Perz, C. Gatz, J. W. Bartsch // Nucleic Acids Res. 2001. -Vol. 29.-P. 1-6.

123. Lewis, R. J. Domain swapping in the sporulation response regulator SpoOA / R. J. Lewis, K. Muchova, J. A. Brannigan et al. II J. Mol. Biol. 2000. -Vol. 297.-P. 151-HQ.

124. Lewis, R. J. Dimer formation and transcription activation in the sporulation response regulator SpoOA / R. J. Lewis, D. J. Scott, J. A. Brannigan et al. II J. Mol. Biol. 2002. - Vol. 316. - P. 235-245.

125. Liu, W. Analysis of Bacillus subtilis tagAB and tagDEF expression during phosphate starvation identifies a repressor role for PhoP-P / W. Liu, S. Eder, F. M. Hulett // J. Bacteriol. 1998. - V. 180. - P. 753-758.

126. Liu, W. Comparison of PhoP binding to the tuaA promoter with PhoP binding to other Pho regulon promoters establishes a Bacillus subtilis Pho core binding site / W. Liu, F. M. Hulett // Microbiology. 1998. - Vol. 144. - P. 14431450

127. Liu, X. Catabolite regulation of the Bacillus subtilis ctaBCDEF gene cluster / X. Liu, H. W. Taber // J. Bacteriol. 1998. - Vol. 180. - P. 6154-6163.

128. Lozada-Chavez, I. Bacterial regulatory networks are extremely flexible in evolution / I. Lozada-Chavez, S. C. Janga, J. Collado-Vides // Nucleic Acids Res. 2006. - Vol. 34. - P. 3434-3445.

129. Makarov, A. A. Cytotoxic ribonucleases: molecular weapons and their targets / A. A. Makarov, O. N. Ilinskaya // FEBS Lett. 2003. - Vol. 540,1. 1/3.-P. 15-20.

130. Makarov, A. A. Binase and other microbial RNases as potential anticancer agents / A. A. Makarov, A. Kolchinsky, O. N. Ilinskaya // BioEssays. -2008. Vol. 30. - P. 781-790.

131. Mariani, C. A chimaeric ribonuclease- inhibitor gene restores fertility to male sterile plants / C. Mariani, V. Gossele, M. De Beuckeleer et al. II Nature. 1992. - Vol. 357. - P. 384-387.

132. Marino, M. Changes in protein synthesis during the adaptation of

133. Bacillus subtilis to anaerobic growth conditions / M. Marino, T. Hoffmann, R. Schmid et al. И Microbiology. 2000. - Vol. 146. - P. 97-105.

134. Molle, V. The SpoOA regulon of Bacillus subtilis / V. Molle, M. Fujita, S.T. Jensen et al. II Mol. Microbiol. 2003. - Vol. 50. - P. 1683-1701.

135. Muchova, K. Dimer-induced signal propagation in SpoOA / K. Muchova, R.J. Lewis, D. Perecko et al. II Mol. Microbiol. 2004. - Vol. 53. - P. 829-842.

136. Nakano, M. M. Two-component regulatory proteins ResD-ResE are required for transcriptional activation of fnr upon oxygen limitation in Bacillus subtilis / M. M. Nakano, P. Zuber, P. Glaser et al. II J. Bacteriol. 1996. - Vol. 178.-P. 3796-3802.

137. Nakano, M. M. A mutation in the 3-phosphoglycerate kinase gene allows anaerobic growth of Bacillus subtilis in the absence of ResE kinase / M. M. Nakano, Y. Zhu, K. Haga et al. II J. Bacteriol. 1999. - Vol. 181. - P. 70877097.

138. Nakano, M. M. Dual control of sbo-alb operon expression by the SpoO and ResDE systems of signal transduction under anaerobic conditions in Bacillus subtilis /М. M. Nakano, G. Zheng, P. Zuber // J. Bacteriol. 2000. - Vol. 182.-P. 3274-3277.

139. Nakano, M. M. Involvement of the ResE phosphatase activity in down-regulation of ResD-controlled genes in Bacillus subtilis during aerobic growth / M. M. Nakano, Y. Zhu // J. Bacteriol. 2001. - Vol. 183. - P. 1938-1944.

140. Nakano, M. M. Induction of ResDE-dependent gene expression in Bacillus subtilis in response to nitric oxide and nitrosative stress / M. M. Nakano // J. Bacteriol. 2002. - Vol. 184,1. 6.-P. 1783-1787.

141. Nanamiya, H. Deficiency of the initiation events of sporulation in

142. Bacillus subtilis clpP mutant can be suppressed by a lack of the SpoOE protein phosphatase / H. Nanamiya, K. Takahashi, M. Fujita, F. Kawamura // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000. - Vol. 279, №1. - P. 229-233.

143. Niemann, H. H. Barnase Fusion as a tool to determine the crystal structure of the small disulfide-rich protein McoEeTI / H. H. Niemann, H.-U. Schmoldt, A. Wentzel et al. I/ J. Mol. Biol. 2006. - Vol. 356. - P. 1-8.

144. Oh, M. K. Importance of spore mutants for fed-batch and continuous fermentation of Bacillus subtilis / M. K. Oh, B. G. Kim, S. H. Park // Biotechnol. Bioeng. 1995. - Vol. 47. - P. 696-702.

145. Ozanne, P. G. Phosphate nutrition of plants—a general treatise / P. G. Ozanne // The role of phosphorus in agriculture / E. Khasswenh ed. American Society of Agronomy, Madison, WI, 1980. - P. 559-585.

146. Paddon, C. J. Cloning, sequensing and transcription of an inactivated copy of Bacillus amyloliquefaciens extracellular ribonuclease (barnase) / C. J. Paddon, R. W. Hartley // Gene. 1986. - Vol. 40. - P. 231-239.

147. Perego, M. A peptide export-import control circuit modulating bacterial development regulates protein phosphatases of the phosphorelay / M. Perego // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. - Vol. 94. - P. 8612-8617.

148. Perego, M. A new family of aspartyl-phosphate phosphatases targeting the sporulation transcription factor SpoOA of Bacillus subtilis / M. Perego // J. Mol. Microbiol. 2001. - Vol. 42. - P. 133-144.

149. Phillips, Z. E. Bacillus subtilis sporulation and stationary phase geneexpression / Z. E. Phillips, M. A. Strauch // Cell Mol. Life Sci. 2002. - Vol. 59. -P. 392-402.

150. Pogliano, J. Partitioning of chromosomal DNA during establishment of cellular asymmetry in Bacillus subtilis / J. Pogliano, M. D. Sharp, K. Pogliano // J. Bacteriol. 2002. - Vol. 184.-P. 1743-1749.

151. Polyakov, К. M. The structure of substrate-free microbial ribonuclease binase and of its complexes with 3'GMP and sulfate ions / К. M. Polyakov, A. A. Lebedev, A. L. Okorokov \et al. II Acta Cryst. Section D. 2002. -Vol. 58.-P. 744-750.

152. Pragai, Z. Bacillus subtilis NhaC, an Na+/H+ antiporter, influences expression of the phoPR operon and production of alkaline phosphatases / Z. Pragai, C. Eschevins, S. Bron, C. R. Harwood // J. Bacteriol. 2001. - Vol. 183. -P. 2505-2515.

153. Pragai, Z. Regulatory interactions between the Pho and sigma B-dependent general stress regulons of Bacillus subtilis / Z. Pragai, C. R. Harwood // Microbiology. 2002. - Vol. 148. - P. 1593-1602.

154. Pragai, Z. Transcriptional regulation of the phoPR operon in Bacillus subtilis / Z. Pragai, N. E. Allenby, N. O'Connor et al. II J. Bacteriol. -2004.-Vol. 186,1. 4.-P. 1182-1190.

155. Price, M. N. Orthologous transcription factors in bacteria have different functions and regulate different genes / M. N. Price, P. S. Dehal, A. P. Arkin // PLoS Comput. Biol. 2007. - Vol. 3, № 9. - P. 1739-1750.

156. Puri-Taneja, A. CcpA causes repression of the phoPR promoter through a novel transcription start site, P(A6) / A. Puri-Taneja, S. Paul, Y. Chen, F. M. Hulett // J. Bacteriol. 2006. - Vol. 188,1. 4.-P. 1266-1278.

157. Puri-Taneja, A. Regulators of the Bacillus subtilis cydABCD Operon: Identification of a Negative Regulator, CcpA, and a Positive Regulator, ResD / A. Puri-Taneja, M. Schau, Y. Chen, F. M. Hulett // J. Bacteriol. 2007. - Vol. 189, №9.-P. 3348-3358.

158. Qi, Y. The pst operon of Bacillus subtilis has a phosphate regulatedpromoter and is involved in phosphate transport but not in regulation of the PHO regulon / Y. Qi, Y. Kobayashi, F. M. Hulett // J. Bacteriol. 1997. - Vol. 179. - P. 2534-2539.

159. Qin, Q. Construction of a transposon mediated baculovirus vector Hanpvid and a new cell line for expressing barnase / Q. Qin, Y. L. Liu, Y. Zhu et al. II J. Biochem. Mol. Biol. 2005. - Vol. 38. - P. 41-48.

160. Quisel, J. D. In vivo effects of sporulation kinases on mutant SpoOA proteins in Bacillus subtilis / J. D. Quisel, W. F. Burkholder, A. D. Grossman // Journal of Bacteriology. 2001. - Vol. 183, №22. - P. 6573-6578.

161. Robichon, D. Expression of a new operon from Bacillus subtilis, ykzB-ykoL, under the control of the TnrA and PhoP-PhoR global regulators / D. Robichon, M. Arnaud, R. Gardan et al. И J. Bacteriol. 2000. - Vol. 182. - P. 1226-1231.

162. Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual / J. Sambrook, D. W. Russell 3rd ed. - New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001. -2222 p.

163. Schau, M. Terminal oxidases are essential to bypass the requirement for ResD for full Pho induction in Bacillus subtilis / M. Schau, A. Eldakak, F. M. Hulett // J. Bacteriol. 2004. - Vol. 186,1. 24. - P. 8424-8432.

164. Schreiber, G. Energetics of protein-protein interactions: analysis of the barnase-barstar interface by single mutations and double mutant cycles / G. Schreiber, A. R. Fersht // J. Mol. Biol. 1995. - Vol. 248. - P. 478-486.

165. Semenyuk, E. G. Expression of single-chain antibody-barstar fusion in plants / E. G. Semenyuk, O. A. Stremovskiy, E. F. Edelweiss et al. II Biochimie. 2007. - Vol. 89. - P. 31-38.

166. Seredick, S. D. Lessons and questions from the structure of the SpoOA activation domain / S. Seredick, G. B. Spiegelman // Trends Microbiol. -2001.-Vol. 9.-P. 148-151.

167. Seredick, S. D. Bacillus subtilis RNA polymerase recruits the transcription factor Spo0A-P to stabilize a closed complex during transcription initiation / S. D. Seredick, G. B. Spiegelman // J. Mol. Biol. 2007. - Vol. 366. -P. 19-35.

168. Shafikhani, S. H. Postexponential regulation of sin operon expression in Bacillus subtilis / S. H. Shafikhani, I. Mandic-Mulec, M. A. Strauch et al. I I J. Bacteriol. 2002. - Vol. 184. - P. 564-571.

169. Shi, L. Decay of activated Bacillus subtilis Pho response regulator, PhoP-P, involved the PhoR-P intermediate / L. Shi, W. Liu, F. M. Hulett // Biochemistry. 1999.-Vol. 38.-P. 10119-10125.

170. Shi, L. The cytoplasmic kinase domain of PhoR is sufficient for thelow phosphate-inducible expression of PHO regulon genes in Bacillus subtilis / L. Shi, F. M. Hulett // Mol. Microbiol. 1999. - Vol. 31. - P. 211-222.

171. Shulga, A. A. Cloning of the gene encoding RNase binase from Bacillus intermedius / A. A. Shulga, К. M. Nurkiyanova, V. M. Zakharyev et al. // Nucl. Acids Res. 1992. - Vol. 20. - P. 23-25.

172. Sonenshein A. L. Control of sporulation initiation in Bacillus subtilis / A. L. Sonenshein // Current Opinion in Microbiology. 2000. - Vol. 3. - P. 561566.

173. Stanislaus, M. A. Genetically engineered self- destruction: an alternative to herbicides for cover crop systems / M. A. Stanislaus, C. L. Cheng // Weed Sci. 2002. - Vol. 50. - P. 794-801.

174. Stephenson, K. Evolution of signalling in the sporulation phosphorelay / K. Stephenson, J. A. Hoch // Mol. Microbiol. 2002. - Vol. 46. -P. 297-304.

175. Stock, A. M. Two-component signal transduction / A. M. Stock, V. L. Robinson, P. N. Goudreau // Annu. Rev. Biochem. 2000. - Vol. 69. - P. 183-215.

176. Strauch, M. A. SpoOA activates and represses its own synthesis by binding at its dual promoters / M. A. Strauch, K. A. Trach, J. Day, J. A. Hoch // Biochimie. 1992. - №7. - P. 619-26.

177. Strauch, M. A. Abh and AbrB control of Bacillus subtilis antimicrobial gene expression / M. A. Strauch, B. G. Bobay, J. Cavanagh et al. II J. Bacteriol. 2007. - Vol. 189. - P. 7720-7732.

178. Strauch, M. A. Regulation of Bacillus subtilis gene expression during the transition from exponential growth to stationary phase / M. A. Strauch 11 Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 1993. - Vol. 46. - P. 121-153.

179. Strittmatter, G. Inhibition of fungal disease development in plants by engineering controlled cell death / G. Strittmatter, J. Jansses, C. Opsomer, J. Botterma//Bio Technology.- 1995.-Vol. 13.-P. 1085-1089.

180. Sun, G. Regulators of aerobic and anaerobic respiration in Bacillus subtilis / G. Sun, E. Sharkova, R. Chesnut et al. II J. Bacteriol. 1996a. - Vol.178.-P. 1374-1385.

181. Sun, G. Three two-component signal transduction systems interact for pho regulation in Bacillus subtilis / G. Sun, M. Birkey, F. M. Hulett // Mol. Microbiol. - 1996b. - Vol. 19. - P. 941-948.

182. Thi Hoi, L. The phosphate-starvation response of Bacillus licheniformis / L. Thi Hoi, B. Voigt, B. Jurgen et al.~\ //Proteomics. 2006. Vol. 6.-P. 3582-3601.

183. Tzeng, Y. L. Phosphorylation of the SpoOB Response Regulator Phosphotransferase of the Phosphorelay Initiating Development in Bacillus subtilis / Y. L. Tzeng, X. Z. Zhou, J. A. Hoch // J. Biol. Che. 1998. - Vol. 273. - 1.37. -P. 23849-23855.

184. Van Poucke, K. Analysis of nematode-responsive promoters in sugar beet hairy roots / K. Van Poucke, M. Karimi, G. Gheysen // Meded Rijksuniv Gent Fak Landbouwkd Toegep Biol Wet. 2001. - Vol. 66. - P. 591-598.

185. Vaughn J. L. Novel DNA binding domain and genetic regulation model of Bacillus subtilis transition state regulator abrB / J. L. Vaughn, V. Feher, S. Naylor et al. II Nat. Struct. Biol. 2000. - Vol. 7. - P. 1139-1146.

186. Verhamme, D. T. DegU and SpoOA jointly control transcription of two loci required for complex colony development by Bacillus subtilis / D. T. Verhamme, E. J. Murray, N. R. Stanley-Wall // J. Bacteriol. 2009. - Vol. 191, №1. — P. 100-108.

187. Vidwans, S. J. Possible role for the essential GTP-binding protein Obg in regulating the initiation of sporulation in Bacillus subtilis / S. J. Vidwans, K. Ireton, A. D. Grossman // J. Bacteriol. 1995. - Vol. 177. - P. 3308-3311.

188. Voss, C. Production of recombinant RNase Ba and its application in downstream processing of plasmid DNA for pharmaceutical use / C. Voss, D.1.ndau, E. Flaschel // Biotechnol. Prog. 2006. - Vol. 22. - P. 737-744.

189. Wang, H.-Z. Application of Arabidopsis AGAMOUS second intron for the engineered ablation of flower development in transgenic tobacco / H.-Z. Wang, B. Hu, G.-P. Chen et al. II Plant Cell Rep. 2008. - Vol. 27. - P. 251259.

190. Wang, L. A novel histidine kinase inhibitor regulating development in Bacillus subtilis / L. Wang, R. Grau, M. Perego, J. A. Hoch // Genes Dev. — 1997. Vol. 11. - P. 2569-2579.

191. Westand, A. H. Histidine kinases and response regulator proteins in two-component signaling systems / A. H. Westand, A. M. Stock // Trends in Biochemical Sciences. 2001. - Vol. 26, №6. - P. 369-376.

192. Winstedt, L. Terminal oxidases of Bacillus subtilis strain 168: one quinol oxidase, cytochrome aa3aa3 or cytochrome bd, is required for aerobic growth / L. Winstedt, C. von Wachenfeldt // J. Bacteriol. 2000. - Vol. 182. - P. 6557-6564.

193. Wu, H. Accurate prediction of orthologous gene groups in microbes / H. Wu, F. Мао, V. Olman, Y. Xu // Proc. IEEE Comput. Syst. Bioinform. Conf. -2005. P. 73-79

194. Xu, K. In vitro selection of optimal AbrB binding sites: comparison to known in vivo sites indicates exibility in AbrB binding and recognition of three-dimensional DNA structures / K. Xu, M. A. Strauch // Mol. Microbiol. 1996. -Vol. 19.-P. 145-158.

195. Yakovlev, G. I. Mutational analyses of the active site of RNase of Bacillus intermedius (binase) / G. I. Yakovlev, G. P. Moiseyev, N. K. Struminskaya et al. IIFEBS Letters. 1994. - Vol. 354. - P. 305-306.

196. Yakovlev, G. I. Contribution of arginine-82 and arginine -86 tocatalysis of Rnases from Bacillus intermedius (binase) / G. I. Yakovlev, N. K. Struminskaya, L. V. Znamenskaya et al. H FEBS Lett. 1998. - Vol. 428. - P. 57-58.

197. Yamamoto, K. Functional characterization in vitro of all two-component signal transduction systems from Escherichia coli / K. Yamamoto, K. Hirao, T. Oshima et al. II J. Biol. Chem. 2005. - Vol. 280. - P. 1448-1456.

198. Yazynin, S. A new phagemid vector for positive selection of recombinants based on a conditionally lethal barnase gene / S. Yazynin, H. Lange, T. Mokros etal. //FEBS Lett. 1999. - Vol. 452. - P. 351-354.

199. You, L. A novel vector for direct cloning PCR fragments by positive selection based on the lethal barnase / L. You, H. Weng, Z. Chen et al. II Mol. Biol. Rep. 2009. - Vol. 36, №7. - P. - 1793-1798.

200. Zhang, X. ResD signal transduction regulator of aerobic respiration in Bacillus subtilis: ctaA promoter regulation / X. Zhang, F. M. Hulett // Molecular Microbiology. 2000. - Vol. 37,1. 5. - P. 1208-1219.

201. Zhao, H. DNA complexed structure of the key transcription factor initiating development in sporulating bacteria / H. Zhao, T. Msadek, J. Zapf et al. //Structure.-2002.-Vol. 10.-P. 1041-1050.

202. Znamenskaya, L. V. Phosphate regulation of biosynthesis of extracellular RNases of endospore-forming bacteria / L. V. Znamenskaya, L. A. Gabdrakhmanova, E. B. Chernokalskaya et al. II FEBS Letters. 1995. - Vol. 375. -P. 16-18.

Информация о работе

Ульянова, Вера Владимировна
кандидата биологических наук
Казань, 2009
ВАК 03.00.07

Диссертация

Экспрессия генов гуанилспецифичных рибонуклеаз бацилл в условиях фосфатного голодания - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы