Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональное картирование молекул барназы и биназы методом гибридных генов

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональное картирование молекул барназы и биназы методом гибридных генов"

1 НОЯ 1935

На правах рукописи УДК. 577. 113.5

КУРБАНОВ ФЕРУЗ ТУРСУНПУЛАТОВИЧ

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ КАРТИРОВАНИЕ МОЛЕКУЛ БАРНАЗЫ II БИНАЗЫ МЕТОДОМ ГИБРИДНЫХ ГЕНОВ

03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации иа соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -1996

Работа выполнена в лаборатории дизайна и инженерии белков Центра "Биоинженерия" РАН

Научные руководЕггели:

чл.-корр. РАН, доктор биол. наук, проф. М П. Кирпичников канд. биол. наук A.A. Шульга

Официальные оппоненты:

доктор биол. наук A.A. Тоневицкий доктор хим. наук В.П. Варламов

Ведущая организация:

Институт биоорганической химия им. ММ. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита состоится " /■Ь " ноября 1996 года в _ часов на заседании

Диссертационного совета Д 200.30.01 лри Институте биологии гена РАН по адресу: 117334, Москва, ул. Вавилова, дом 34/5

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардга РАН

Автореферат разослан " октября 1996 г.

Ученый секретарь Диссертационногосоаета л

кандидат фармацевтических наук—'¡ilOeJ?)Ü оС/^Л С. Грабовская

V

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последние годы успешно развиваются структурно-функциональные исследования низкомолекулярных (молекулярная масса 12-13 кДа) внеклеточных рибонуклеаз из рода Bacillus. Внеклеточные РНКазы микроорганизмов относятся к классу циклизующих гуанилспецнфичных ферментов, характеризуются высокой степенью гомологии первичной и пространственных структур и обладают заметным функциональным сходством. Семейство этих белков являются идеальной моделью для изучения взаимосвязей структура - функция и структура - стабильность, а также при изучении основных принципов сворачивания белков.

Наиболее изученными среди рибонуклеаз микроорганизмов являются РНКазы барназа Bacillus amyloliquefaciens (Ва) и биназа Bacillus irttermedius 7Р (Bi), трехмерные структуры которых известны с высокой степенью разрешения (1,4-2А). Эти РНКазы являются близкими природными гомологами, продуктами естественного мутагенеза (гомология первичной структуры составляет 85%). Белки имеют очень сходную вторичную и третичную структуры, а основные цепи практически идентичны. Однако, обнаружены серьезные различия в их ферментативных свойствах и стабильности. Изучение точечных мутантов барназы с заменами в тех позициях аминокислотной последовательности, где эти РНКазы различаются, не дало исчерпывающего ответа на вопрос, какие из этих аминокислотных остатков (а. о.) определяют индивидуальные свойства биназы или барназы. Дополнительная информация может быть получена при использовании иного подхода к изучению структурно-функциональных отношений в гомологичных белках. Этот подход связан с созданием гибридных белков на основе высокогомологичных родственных белков. Функциональную значимость аминокислотных остатков, по которым эти родственные белки различаются, можно установить, исследуя свойства гибридных белков и белков дикого типа.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось создание и изучение свойств гибридных белков, составленных из различных частей молекул РНКаз барназы (Ва) и биназы (Bi). Исходя из поставленной цели были сформулированы следующие задачи: а) получение генов гибридных РНКаз на основе генов Ва и Bi; б) разработка высокоэффективной системы экспрессии РНКаз Ва, Bi и гибридных РНКаз, и их очистка; в) изучение каталитических свойств и термостабильности биназы, барназы и гибридных РНКаз; г) разработка системы экспрессии и лабораторного метода очистки природного ингибитора барстара.

Научная новизна и практическая ценность работы. Разработан оригинальный метод рекомбинации гомологов. Этот метод применен для создания набора гибридных

генов на основе генов РНКазы Bacillus amyloliquefaciens (Ва) и Bacillus itrtermedius 7Р (Bi). Разработана стабильная система экспресии гибридных РНКаз, биназы, барназы и природного ингибитора барназы - барстара, основанная на использовании промотора РНК-полимеразы фага Т7. Разработаны оригинальные схемы очистки бактериальных РНКаз и ингибитора - барстара при выделении из штаммов E.coli. Уточнены физико-химические свойства рекомбинангной биназы. Проведено сравнительное изучение каталитических свойств и термостабильиости гибридных РНКаз, биназы и барназы. Впервые экспериментально показано, что С-концевая последовательность РНКазы определяет каталитические параметры фермента при расщеплении динуклеозидмонофосфатов.

Апробация работы. Материалы исследований по теме диссертации доложены на следующих российских и международных конференциях: 3-ем Международном симпоузиме "Рибонуклеазы: химия, биология и биотехнология" (Италия, 1993г.), VI-ой Конференции Российской Федерации "Новые направления биотехнологии" (Пущиио, 1994г.), Международном симпозиуме по биотехнологии (США, 1995г.), Международной конференции памяти акад. A.A. Баева (Москва, 1996г.) и 4-ом Международном симпозиуме "Рибонуклеазы: химия, биология, биотехнология" (Нидерланды, 1996г.)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано семь печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на страницах

машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа содержит таблиц и рисунков.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

За последнее время был достигнут значительный прогресс в понимании структурно-функциональных основ биокатализа и фолдинга белка. Стоит хотя бы упомянуть цикл классических работ Метьюза и др. (Matthews, В.Н., 1986) на лизоциме фага Т4, где были успешно картированы а. о., влияющие на стабильность, и было продемонстрировано, что одиночные замены, уменьшающие напряжение в структуре белка, повышают его стабильность. В ранних работах Фершта и др. (Fersht A.R., 1987) при изучении тирозил-тРНК-сиигетазы, чья пространственная структура к тому времени была известна, с помощью заранее запланированных мутаций удалось не только улучшить субстратную специфичность фермента, но и впервые получить убедительные экспериментальные доказательства справедливости фундаментального механизма ферментативного катализа - механизма

стабилизации переходного состояния субстрата за счет повышенного сродства фермента именно к этому состоянию. Однако, несмотря на впечатляющие достижения в области изучения молекулярных механизмов биокатализа и белкового фолдинга, представляется, что основные открытия в этой области нас еще ждут впереди.

Барназа и биназа являются представителями семейства внеклеточных низкомолекулярных РНКаз микроорганизмов. Эти два белка состоят из одной полипептидной цепи, содержащей 110 (Ва) и 109 (В[) аминокислот, и отличаются между собой 17 заменами и одной делецией. Эти замены не локализованы в какой-то определенной части белка, а разбросаны по всей длине молекулы (в тексте приводится нумерация а. о. по последовательности барназы) . Шесть из ник находятся в а-спиралях: (01п1511е, ТЬг16Л^, Ия^Ьув, Ьув19Аг£, аи2901п, СЬШБег), четыре в 0-цепях: (Пе55Уа1, Бег85А1а, 11е88Ьеи, 1.еи89Уа1) и шесть в петлях и поворотах: (А5р4401и, ЬуэбгАгй, Ьу$66А1а, Ткг79Уа1, 01п104А1а, Lysl08Aгg). Две замены локализованы в центральном положении двух гидрофобных ядер белков. Четыре замены расположены рядом с остатками, которые вовлечены в связывание гуанилового основания в гуанил связывающей петле. И одна замена находится около каталитического остатка Ив 102. Методом рентгено-струкггурного анализа определена пространственная структура как РНКазы Ва, так и В1, и показана идентичность их трехмерных структур. Однако, несмотря на высокую степень гомологии по аминокислотной последовательности (85%) и одинаковую пространственную организацию эти РНКазы отличаются по некоторым физико-химическим свойствам. Изучение термостабильности ферментов методом адиабатической сканирующей микрокалориметрии показало, что температура денатурации барназы меньше, чем для биназы. Причем по имевшимся к началу работ данным это различие увеличивалось с 2,5°С при рН 5 до 7°С при рН 3. Кроме того ранее предполагали существование в молекуле биназы при кислых значениях рН двух независимо плавящихся регионов. Были показаны также определенные отличия и в кинетических характеристиках ферментов. Так активность биназы относительно субстрата ОрИр в 25 раз выше, чем у барназы, а на гомополинуклеотидном субстрате ро1у[1] активность биназы в 10 раз меньше, чем активность барназы. И это несмотря на то, что замены не затрагивают непосредственно остатков активного центра, которые высококонсервативны во всем семействе бактериальных РНКаз. Картирование аминокислотных замен, которые обуславливают различия в кинетике и термостабильности барназы и биназы, имеет немалый научный интерес и существенно дополнит наши представления о структурно-функциональной организации белковой молекулы.

Обычно при изучении влияния первичной структуры белка на его пространственную организацию и функцию используется подход, связанный с введением в последовательность белка одиночных замен или группы точечных замен, и дальнейшим изучением модифицированного белка. Такой подход был в частности использован Ферштом и др. (Fersht A.R, 1993,) для картирования аминокислотных замен, обуславливающих различие свойств Ва и Bi. В результате этой работы удалось картировать остатки, повышающие стабильность, но определить замены, определяющие кинетические свойства Ва и Bi оказалось невозможным. При исследовании структурно-функциональных взаимоотношений в высокогомологичных белках перспективным представляется использование подхода, заключающегося в конструировании и изучении белковых химер, составленных из различных фрагментов аминокислотной последовательности изучаемых белков. В результате могут быть исследованы кооперативные лффекты замены нескольких а. о. в белке. В данной работе показано использование подхода, связанного с созданием гибридных генов, для картирования аминокислотных остатков, определяющих различия в ферментативной активности и термостабильности РНКаз Ва и Bi.

1. Получение генов гибридных РНКаз методом рекомбинации гомологов и классической рекомбинацией in vitro.

Разработанный нами метод получения генов гибридных белков основан на использовании корректирующей 3'-5' экзонуклеазной активности термостабильной Vent-ДНК-полимеразы. Метод применим при условии, что в распоряжении исследователя имеются два гомологичных гена - донорный и акцепторный. При использовании Vent-полимеразы в однонаправленной ПЦР, матрицей в которой служит ДНК гена-донора, образуется набор фрагментов различной длины. Этот набор используется в качестве смеси праймеров в реакции направленного мутагенеза по методу Кункеля, матрицей в этой реакции служит ДНК гена-акцептора. В результате в гене-акцепторе происходит ряд замен протяженных участков на гомологичные участки из гена-донора (Рис. 1). Метод рекомбинации гомологов был применен нами для создания набора гибридных генов на основе генов РНКаз Bacillus aniyloliquejacierts (барназа) и Bacillus intermedius 7Р (биназа). Следует отметить, что в паре генов Ва и Bi нет одинаковых рестриктных сайтов, находящихся в идентичных положениях кодирующих частей генов. Это обстоятельство делает невозможным конструирование гибридных белков с использованием рестриктных сайтов.

Одноцепочечная урациловая матрица

bar* барназа М13шр18

бнназа

bar* барназа

отжиг

3'-

биназа

bar* барназа

Хромосомный фрагмент , бинзза ,_

В» 5

|пцр

Вт 3

ПЦР

Вт 3

ll Одноцепачечные ^ ПЦР-фрагменты различной длнны

бнназа

bar* барназа

Набор гетеродуплексных молекул

синтез второй цепи, I Трансформация в dvt-Hmg+

лнгирование

пггамм Л. coli

I ~

Набор гибридных генов баршва/бнназа

Рис. ! Получение гибридных генов барназа/биназа; I—получение копии гена биназы из 5 кВ фрагмента хромосомы при помощи ПЦР, И — однонаправленная ПЦР, III —направленный мутагенез по методу Кункеля.

Рекомбинантная плазмида рМТ416 была любезно предоставлена проф. Р.Хартли (NIH, Bethesda, USA). Пятикилобазный фрагмент хромосомной ДНК штамма Bacillus intermedius 7Р, содержащий ген РНКазы биназы был взят из коллекции лаборатории дизайна и инженерии белков (Центр "Биоинженерия" РАН, Москва).

Ген барназы субклонировали в вектор М13тр18 вместе с геном специфического белкового ингибитора барстара, функция которого заключается в предохранении клетки-реципиента от летального действия РНКазы. Урацилсодержащую ДНК матрицу MI3 получали путем трансфекции штамма Е. coli CJ236 рекомбинантным фагом М13. Одноцепочечный фрагмент

ДНК, кодирующий биназу, получали методом ПЦР (Рис. 1). Вначале традиционным способом при помощи двух праймеров Bin5 (5 'СAAAAGCCGCCGTCATTААТACGTTTG3 ') и Bin3 (5'TCGTTATCGAATACGTGTGAAAG3'), которые комплементарны, соответственно, 5' и 3' концам гена биназы, кодирующего зрелый полипептид, был амплифицирован двухцепочечный фрагмент ДНК, который использовали в дальнейшем в качестве матрицы для наработки одноцепочечной копии фрагмента в однонаправленной ПЦР. Продукт однонаправленной ПЦР использовали в качестве праймера в реакции направленного мутагенеза по Кункелю (Kunkel R., 1987). Гетсродуплексными молекулами ДНК трансформировали dut+ ung+ штамм кишечной палочки XLl-Blue и выделяли из них ДНК. Фрагмент ДНК с геном РНКазы очищали и переклонировали в вектор рМТ416 по сайтам EcoRJ и Xbal. ДНК 25 произвольно выбранных клонов секвенировали по методу Сенгера с помощью праймера, имеющего место посадки недалеко от 5'-конца гена РНКазы в области сигнального пептида. Поскольку ген биназы и гибридных РНКаз насчитывает немногим более 330 п.н., за один эксперимент удавалось определить полную первичную структуру РНКаз. Только в одном из клонов последовательность барназы была полностью заменена на таковую биназы. В остальных случаях были обнаружены гибридные гены, представляющие собой ген барназы, в котором участки нуклеотидной последовательности различной протяженности на З'-конце гена были заменены на гомологичные участки из гена биназы. Из 25 секвенированных генов гибридными оказались 12 (Рис. 2). Следующие сегменты молекулы барназы оказались заменены в результате мутагенеза на гомологичные сегмешы молекулы биназы:

1-110, 7-110, 12-110,21-110,26-110,30-110, 37-110,67-110,73-110, 90-110,93-110,101-110. В опыте по созданию генов гибридных РНКаз мы обнаружили только один тип гибридов, а именно гибриды, составленные из N-концевой последовательности барназы и С-концевой последовательности биназы. Нам представлялось интересным иметь набор гибридов, в которых аминокислотная последовательность биназы распространялась с 5'конца гена, а также "мозаичные" гибриды с заменами в середине гена. Метод рекомбинации гомологов позволяет решить эту проблему, если на стадии однонаправленной ПЦР взять праймер к 5'-концу гена биназы: "Bin5", и при получении урацилсодержащей матрицы использовать вектор с обратной ориентацией полилинкера, например - М13шр19. Однако в нашей работе применение этого метода было оправдано лишь на начальном этапе работы, когда нужно было получить представительный набор гибридов, которые равномерно перекрывают всю длину молекулы барназы. Гибридные молекулы следующего поколения с

биназа ИВ "7-110" I ■ "12-110" I-

"24-110" £

"28-110" С

"37-110" С

"67-110" С

"72-110" Г

"90-110" £

"loi-no" £

барназа Ц

О

| [ бариаза

бипаза

1/25

1/25

1/25

3/25

1/25

1/25 '

1/25

1/25 2/25 1/25

1 12/25

20

40

60

80

100

Рис. 2 Структура гибридов барназа/биназа. Черными прямоугольниками обозначены участки аминокислотной последовательности биназы, белыми — барназы. Слева приведены названия гибридов (цифрамиы обозначены номера а, о., ограничивающих фрагменты последовательности биназы), справа — частоты встречаемости гибридных вариантов по результатам анализа 25 произвольно выбранных клонов.

"инвертированным" порядком расположения аминокислотной последовательности было проще получить традиционным методом рекомбинации по рестрикционным сайтам.

1.2 Получение "мозаичного" и "инвертированного" гибрида

В гене биназы имеется сайт для расщепления рестриктазой Eco RV, а значит он присутствует и во всех гибридах с сегментом гена биназы, содержащим этот сайт. Таким образом, если в ген барназы ввести Eco RV- сайт, то при помощи простой рекомбинации можно получить "мозаичный" (представляет собой последовательность барназы со следующими заменами: GIu29GIn, Gln31Ser, Asp44G!u, Ile55Val, Lys62Arg, Gly65Ser, Lys66Ala. A) и "инвертированный" (биназа с заменами: Val78Ttir, Ala84Ser, Leu87Ile, Val88Leu, Alal03Gln, ArglQ7Lys) гибридные гены. Урацилсодержащую ДНК-матрицу фага

M13mpl8, несущую ген барназы, получали описанным выше способом, а затем при помощи праймера "RV-Ba"(5'GTATAGTTGATATCCGC3') методом олигонуклеотид-направленного мутагенеза по Кункелю вводили Eco R.V сайт в ген барназы. Клоны отбирались по способности РФ ДНК расщепляться рестрикгазой Eco-RV. Одноцепочечную ДНК отобранных клонов затем секвенировали по методу Сенгера. Ген барназы с введенным EcoRV сайтом переносили обратно в вектор рМТ41б. После этого вектора с генами барназы и биназы вырезали по сайтам EcoRI/EcoRV и рекомбинировали.

2.1 Конструирование векторов для экспрессии генов внеклеточных рнбонуклеаз:

pGEMEX/Ba, pGEMEX/Bi, pGEMEX/Hybr.

Для экспрессии генов внеклеточных бациллярных РНКаз мы решили использовать векторную систему pGEMEX-1 ("Promega", USA). Этот экспрессионный вектор несет полноразмерный ген 10 бактериофага Т7. Непосредственно между стоп-кодоном и терминатором гена 10 встроен полилинкер с рядом уникальных сайтов рестрикции, в том числе и сайтом Hind Ш. В месте инициирующего кодона, включая его, имеется сайт рестрикции Nde I. Замещение части гена 10, заключенного между ресгрикционными сайгами Nde I и Hind Ш, на ген РНКзы давало возможность использовать для экспрессии последнего все необходимые регуляторные элементы транскрипции и трансляции гена 10. Поскольку продукт гена 10 при репликации фага накапливается внутриклеточно в значительных количествах, можно было надеяться также и на суперпродукцию РНК азы в присутствии ингибитора. Схема конструирования экспрессионного вектора приведена на Рис. 3. В результате, как можно убедиться из рисунка/в полученной экспрессионной кассете непосредственно перед геном РНКазы лежат последовательно два промотора: промотор РНК полимеразы фага Т7 и синтетический toc-промотор. Однако, toc-промотор в многокопийиых векторах часто оказывается дерепрессирован, это приводит к конститутивному синтезу целевого белка, что не желательно в случае экспрессии токсичных для К coli белков. Поэтому на основе pGEMEX-1 был также сконструирован вектор, где ген РНКазы следует непосредственно за промотором РНК полимеразы фага Т7. Методом олигонуклеотид-направленного мутагенеза по Кункелю с использованием праймера "Ва-Nde" (5'GCTTTGTTTCATATGATTrTC3') непосредственно перед сигнальной последовательностью щелочной фосфатазы PhoA вводили сайт для расщепления рестриктазой Nde I. Клоны отбирали по расщеплению эндонуклеазой рестрикции Nde I. Затем РФ ДНК вектора M13mpl 8 расщепляли по сайгам Nde I/Hind Ш, и вставку длиной 950 п. о., содержащую ген РНКазы выделяли и клонировали в вектор pGEMEX-1.

Т7*прошотор

геяЮ фага T7

Hindll!

Me!

T

pGEMEX-1

К del AatH

-Агар*

1.) Ndel, Klenow, АаШ

2.) Aaffl, Hindm

PhoACimaia T bar4'

pBílO

Ampr

1.)KcoRI, Klenow

2.)НМШ

"П-npoM^optac

.Цитирование ч f

РЬоА-бшдоа

bar*

HindlII

pGEMEX/Bí

Ndel AatH

HindlII

Аирг

Рис. 3 Схема конструирования векторов для экспрессии биназы и гибридных РНКаз в Я. соИ.

2.2 Экспрессия генов барназы, биназы и гибридных РНКаз.

Для экспрессии гена РНКзы рекомбинантный вектор pGEMEX/Bi переносили в специальный штамм E.coli BL21(DE3)(pLysS), содержащий хромосомную копию гена РНК-полимеразы фага Т7 под контролем lacUVS промотора. При индукции lacUVS промотора с помощью IPTG начиналась экспрессия Т7 Р1Ж-полимеразы. Выходы РНКазы при использовании рекомбинантного вектора pGEMEX/Bi с двумя промоторами: Т7 и tac составляли 30-60 мг с 1 литра культуры. Применение рекомбинантного вектора pGEMEX/Bi-Nde, в котором последовательность щелочной фосфатазы следует непосредственно за промотором РНК полимеразы фага Т7, существенно не увеличили выходов биназы и других РНКаз и составляли на богатых средах 40-50 мг/литр культуры. Но при выращивании на бедных средах экспрессия с вектора pGEMEX/Bi-Nde происходила и без индукции IPTG, в то время как при использовании конструкции pGEMEX/Bí на бедных средах РНКаза экспрессировалась только после добавления IPTG. По-видимому, когда клетки растут на бедных средах количество 1ас-репрессора оказывается достаточным для полной репрессии

как 1асСГУ5 промотора так, и {ас-промотора. Надо отметить, что штамм Е.соИ ВЬ21(ОЕЗ), не содержащий дополнительной плазмиды направляющей синтез лизоцима фага Т7, не

может быть использован для экспрессии РНКаз по той простой причине, что его невозможно протрансформировать соответствующими плазмидными векторами. Вызвано это, видимо тем, что в штамме ВЬ21(ОЕЗ) синтезируется в единицу времени избыточное количество РНКазы, которое не может бьггь полностью ингибировано барстаром. В результате происходит гибель клеток.

Следует заметить, что не вся РНКаза, секрегирующаяся в кудьтуральную жидкость и освобождающаяся из периплазматического пространства, имеет нативный Тч'-конец. В культуральной жидкости обнаруживается также РНКаза с дополнительными семью а. о., принадлежащими С-концевой последовательности сигнального пептида щелочной фосфатазы РЬоА (неопубликованные данные К. Панова и А. Дементьева, ИМБ РАН). Интересно отметить, что соотношение правильно и неправильно процессированных форм РНКаз варьирует от белка к белку. Так в случае барназы дикого типа и гибридных РНКаз, у которых И-концевая последовательность от барназы, неправильно процессированньш белок составляет не более 30% от общего содержания РНКазы, а для биназы и "инвертированного" гибрида, у которых на К-конце располагается последовательность биназы, - составляет 50% и 60%, соответственно. Это указывает на то, что аминокислотная последовательность на Я-конце секретируемого белка влияет на эффективность работы сигнальной пепгидазы Е.соИ.

Было определено также влияние концентрации индуктора 1РТО на уровень синтеза РНКазы при использовании как вектора рОЕМЕХ/В!, так и вектора рОЕМЕХ/ВьШе при выращивании на богатых средах. Обнаружили, что при концентрациях индуктора выше 0,02 мМ 1РТС количество секретируемой РНКазы не зависит от концентрации добавляемого в среду индуктора. Биосинтез РНКазы происходит в стационарной фазе роста и максимум концешрации РНКазы приходится примерно на 18 час культивирования клеток после начала индукции. Большая часть (примерно 80%) рибонуклеазной активности обнаруживалась в среде роста.

2.3 Выделение гомогенного препарата РНКаз.

На ранних этапах работы для очистки РНКаз использовали метод обращеняо-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ). Это позволяло отделиться от неправильно процессированной формы и получать гомогенные препараты с высокой степенью чистоты. Однако, в ходе физико-химических исследований было обнаружено, что

довольно жесткие условия выделения (высокая концентрация органического растворителя и низкие значения pH) приводили к снижению на несколько порядков кинетических параметров кс ферментов, и способствовали появлению димеров в очищенных образцах РНКаз. По-видимому, присутствие "органики" не позволяет белку принять правильную конформацию и способствует образованию димера. Поэтому нами был разработан новый метод очистки РНКаз. Вначале РНКазу адсорбировали на фосфоцеллюлозе PI1 путем перемешивания в объеме. После элюции буфером с высокой ионной силой и диализа использовали катионообменную хроматографию на колонке Mono-S (Pharmacia, Sweden). Фракцию, содержащую правильно процессированную РНКазу, собирали и диализовали. В разработанной нами схеме очистки РНКаз, во-первых, достигается разделение правильно и неправильно процессированных форм РНКаз (за счет дополнительной положительно заряженной аминокислоты Lys у неправильно процессированной формы). И, во-вторых, при используемых условиях очистки (водные буфера, небольшое давление) не встает вопроса о правильности и полноте фолдинга белка. Очищенные таким способом препараты рибонуклеаз, как показал опыт, полностью пригодны для изучения РНКаз физико-химическими методами.

3.1 Определение кинетических параметров на субстратах GpU и GpC.

Внеклеточные РНКазы бацилл относятся к классу циклизующих РНКаз (К.Ф. 3.1.27.1), которые осуществляют гидролиз полинуклеотидных цепей по двухстадийному механизму, включающему реакцию трансфосфорилирования с образованием нуклеозид-2'3'-циклофосфатов и последующим их расщеплением до соответствующих производных 3'-фосфорной кислоты. Исследуемые РНКазы гуанилспецифичны по отношению к низкомолекулярным субстратам, таким как 2',3'-циклофосфаты и динуклеозидмонофосфаты. При переходе же к высокомолекулярным субстратам РНКазы Ва и Bi с заметной скоростью катализируют расщепление не только poly[I], но и ро1у[А] и poly[U], хотя эффективность гидролиза polyfl] этими ферментами существенно выше, то есть РНКазы в этом случае гуанилпредпочтительны. Определенные нами кинетические параметры гидролиза субстратов GpU и GpC биназой, барназой и гибридными РНКазами: при условиях, описанных в литературе, представлены в таблицах 1 и 2. Гибрид "26-110" = Биназа (1Q2,114Q, R15T, К17Н, R18K); Гибрид "1-72" = Биназа (V78T, A84S, L87I, V88L, A103Q, R107K); Гибрид "26-72" = Барназа (E29Q, Q31S, D44E, I55V, K62R, G65S, К66А); Гибрид "73-110" = Барназа (T79V, S85A, I88L, L89V, Q104A, K108R)

Таблица 1.

Кинетические параметры реакции гидролиза динуклеозида GpU гибридными РНКазами. pH 5,8; t = 25°C; I (ионная сила) = 0,1М.

Рибонуклеаза км kMI/KM

(с") (мкМ) (М-1с~')

Барназа 0,4±0,04 230±30 1,8х103

Гибрид "73-110" 4,2±0,02 260tt30 1,6х104

Гибрид "26-73" 1,2+0,2 290±50 4,1х103

Гибрид "26-110" 4,1+0,3 180±20 2,3x104

Гибрид "1-72" 1,0+0,1 215±30 4,6x10®

Биназа 4,3±0,4 150+20 2,8x10"

Таблица 2.

Кинетические параметры реакции гидролиза динуклеозида GpC гибридными РНКазами. pH 5,8; t = 25°C; 1 = 0,IM.

Рибонуклеаза Км

(с"') (мкМ) (М-'с-1)

Барназа 0,4±0Д 220+50 1.9Х103

Гибрид "73- 110" 5,1+0,6 160+40 3,2х104

Гибрид "26-73" 0,5±0,1 150+40 З.ЗхЮ3

Гибрид "26-110" 6,2±0,9 220±60 2,8x104

Гибрид " 1 - 72" 1,0±0,1 270±60 3,7x10*

Биназа 5,4±0,8 120+30 4,5x1с)4

Значения ки1 и Км для барназы, определенные в нашей работе совпадают с литературными данными. Однако значения каталитических параметров для рекомбинакгной биназы дикого типа отличны от данных, полученных для биназы, выделенного из природного штамма Bacillus intermedius 7Р (Карпейский М.Я. и др., 1981). Для субстратов GpU и GpC различие между барназой и биназой обусловлено в основном разницей в 10 раз каталитической константы кс«, в то время как константы Михаэлиса Км отличаются не сильно. Обращает на себя внимание различие каталитических констант у гибридов. Из представленных результатов следует, что природа С-концевой части молекулы определяет к какому типу относится гибридная молекула - к биназоподобной или к барназоподобной. Такой результат,

на первый взгляд, кажется само собой разумеющимся, поскольку основные остатки, формирующие область активного центра: Hisl02, Arg87 и Glu73, локализованы на С-конце ферментов. His 102 и Glu73 действуют как общекислотная и общеосновная каталитическая группа при расщеплении РНК. А положительно заряженная боковая группа Arg87 взаимодействует с фосфорной группой субстрата. Однако, как уже было сказано, мутации в гибридных молекулах не затрагивают а.о., которые по современным представлениям играют важную роль в катализе, тем не менее, его эффективность на динуклеозидных субстратах изменяется чуть ли не на порядок величины. Таким образом, здесь мы имеем дело с опосредованным влиянием аминокислотного окружения на механизм катализа. То, что именно С-концевая последовательность определяет различия свойств между Ва и Bi при гидролизе динуклеозидных субстратов, показано нами впервые.

На С-конце молекул барназы и биназы локализованы следующие аминокислотные замены (нумерация аминокислот приведена по последовательности барназы): это Thr79Val, Ser85Ala, He88Leu, Leu89Val, Glnl04Ala и LyslOSArg. По структурным данным Пзг79 в барназе полностью экспонирован в растворитель и находится достаточно далеко от активного центра. По литературным данным (Fersht A.R. et aL, 1993) замена Thr79Val в барназе увеличивает только на ЗА площадь гидрофобной поверхности. Остатки 11е88 и Leu89 в Ва также как и остатки Leu87 и Val88 в структуре Bi расположены в гидрофобных ядрах молекул и не существенны при катализе. На основе рентгенографических данных по структуре барназы и комплекса биназы с 3'GMP нами было проведено компьютерное моделирование с помощью программы молекулярной графики FRODO. Argl07 в Bi в отличие от Lysl08 в Ва может образовать контакты с карбоксильной группой С-конца молекулы, но оба этих остатка в пространственных структурах находятся далеко от активного центра. Если в структуре биназы сделать замену Ala84Ser, то боковая группа серина потенциально может образовать водородную связь с N(7) атомом второго основания субстрата. О такой возможности свидетельствуют результаты анализа структуры комплекса барназы с тетрануклеотидом d(CGAC) (Buckle А., 1994), где постулируется наличие водородной связи между боковой группой Ser85 и N(7) атомом аденинового основания. В работе (Wodak S., 1996), посвященной исследованию эффекта связывания нуклеотидного субстрата на рК» каталитических групп барназы, отмечается влияние Ser85 и Glnl04 на состояние ионизации субстрата. При замене Alal03Gta в структуре биназы,боковая группа глутамина может образовать через молекулу воды водородную связь с N(2) атомом

гуанилового основания. Таким образом, из проанализированных шести замен, расположенных в С-концевой части молекулы, только две могут влиять на параметры реакций гидролиза, катализируемых барназой и биназой: это- Ser85Ala и Glnl04Ala. Однако, каким образом эти замены определяют индивидуальные каталитические свойства РНКаз не совсем понятно. Поскольку замены в С-конце молекул РНКаз наиболее сильно влияют именно на каталитическую константу ко, то, по всей видимости, остатки в этой части молекулы вовлечены в образование переходного состояния фермент-субстратного комплекса. Можно предположить, что структура барназы более комплементарна к исходному состоянию субстрата. Если это так, то образование переходного состояния, сопровождающееся изменением геометрии субстрата и ухудшением соответствия, приведет к уменьшению энергии связывания и, как следствие, к уменьшению к«,!, что мы и наблюдаем в эксперименте. Однако проверить это предположение на основании имеющихся на настоящий момент данных по структурам комплексов барназы с 3'GMP (Gufflet J., 1993) и биназы с 3'GMP (Pavlovsky A.G., 1988), барназы с d(GpC) (Baudet, К., 1991) и барназы с d(CGAC) (Buckle А., 1994) невозможно, поскольку для этого требуется структура комплекса фермента с аналогами переходного состояния субстрата.

3.2 Кинетические параметры на гомополирибоиуклеотидных субстратах.

Определение кинетических констант стадии транеэтерификации на гомололирибонуклеотидах проводили при условиях, описаннных в работе (Engelborghs et al., 1995). Измеренные в нашей работе константы для барназы на субстрате poly[A] в пределах ошибки эксперимента совпадают с литературными данными. Из результатов, представленных в таблице 3, следует, что каталитические свойства РНКаз Ва и Bi на субстрате poly[A] различаются не сильно. В тоже время на субстрате polyfl] наблюдается значительное различие в каталитических константах при незначительной разнице в величине Км (таблица 4). Барназа катализирует гидролиз полинуклеотидного субстрата почти на порядок лучше, чем бииаза. Однако, для гибридных РНКаз на субстрате poly[I] нет четкого разделения на биназоподобные и барназоподобные, как это наблюдается в случае динуклеотидных субстратов.

Гибрид "26-110" = Биназа (1Q2,114Q, R15T, К17Н, R18K); Гибрид "1-72" = Биназа (V78T, A84S, L87I, V88L, A103Q, R107K); Гибрид "26-72" = Бариаза (E29Q, Q31 S, D44E, I55V, K62R, G65S, К66А), Гибрид "73-110" = Барназа (T79V, S85A, 188L, L89V, Q104A, K108R)

Таблица 3.

Кинетические параметры на субстрате ро!у|А]. рН 6,2; 1 = 25°С; 1 = 0,1М.

Рибонуклеаза ^кпт Км к^/Км

(с") (мкМ)

Барназа 42+2 280+17 1,5x10*

Гибрид "73-110" 53+2 90±10 5,9х105

Гибрид "26-73" 102+8 310±50 3,3х105

Гибрид "26-110" 107+2 102±9 1,05х106

Гибрид " 1 - 72" 77±3 290±25 2,6x10*

Биназа 88+4 113+15 7,7x10^

Таблица 4

Кинетические параметры на субстрате ро!у[1], рН 6,2; I = 25"С; 1 = 0,1М.

Рибонуклеаза ^кэг

(с-1) (нкМ) (Ммс~1)

Барназа 1413+40 130+30 1,1x10'

Гибрид "73-110" 940150 170+26 5,5x10е

Гибрид "26-73" 1517+130 137±15 1,1х107

Гибрид "26-110" 459+80 150+42 3,1x10"

Гибрид " 1 - 72" 1012±75 100+20 1,0х107

Биназа 141±10 80±10 1,8х106

Обращает на себя внимание тот факт, что для всех гибридов на субстрате ро1у[1] значение ксз,/Км выше, чем у биназы. Как будет показано ниже, термостабильность гибридных РНКаз меньше, чем у биназы. Таким образом, активность гибридов на полинуклеотидных субстратах находится в обратной зависимости от стабильности белковой молекулы. Данные аналогичные нашим были получены при исследовании влияния замен остатков активного центра барназы на стабильность (Ме^ешц Е. е\ а1., 1992). По-видимому, определенная локальная нестабильность белковой молекулы необходима для продуктивного связывания субстрата и эффективного катализа.

По ферментативным свойствам наиболее интересен гибрид -*73-110", который как бы объединяет в себе качества двух РНКаз: на дмнуклеотидном субстрате он ведет себя так же, как и биназа, а на полинуклеотидном субстрате ро1у[1] его активность подобна барназе.

Таким образом, этот гибридный белок, сохраняя полезные свойства одного фермента, приобретает новые качества другого. Следовательно, подход связанный с созданием гибридных белков можно применять для направленного улучшения определенных свойств ферментов. Этот подход может иметь широкое применение в медицине, для которой наиболее привлекательно получение белковых гибридов, где одна молекула сочетает в себе биохимические функции нескольких белков.

4. Изучение термостабильности гибридных РНКаз.

Эта часть работы была выполнена совместно с Б. Ранжбаром (Лаборатория конформационной стабильности белков и физических методов анализа, ИМБ РАН).

Параметры тепловой денатурации барназы, биназы и гибридных белков определяли методом дифференциальной адиабатической сканирующей микрокалориметрии. Калориметрические измерения проводили при двух значениях рН: 2,4 и 5,5. На Рис.4 представлены зависимости парциальной теплоемкости от температуры для барназы, биназы и гибридных РНКаз при рН 2,4 и рН 5,5. Видно, что для всех без исключения белков максимумы пиков теплопоглощения смещаются в низкотемпературную область при переходе к более низким значениям рН. Обратимость процесса денатурации белков при рН 2,4 составляла 96%, а при рН5,5 - 89%. По-видимому понижение процента обратимости при рН 5,5 происходит вследствие агрегации белковых молекул. Значения калориметрических энтальпий денатурации (ДНи,), температур денатурационного перехода (Та) и эффективных энтальпий денатурации (ДНафф) для барназы, биназы и гибридных белков представлены в таблицах 5 и 6. Как можно убедиться из таблиц, значения А11(а.., и АН,фф практически совпадают и их отношение близко к единице, а это означает, что молекулы барназы, биназы и гибридных РНКаз в области значений рН 2,4 и 5,5 представляют собой единую кооперативную систему и их тепловая денатурация осуществляется по принципу "все или ничего". Для молекул биназы и барназы температуру денатурационного перехода определяли также и методом кругового дихроизма (КД). Значения температур плавления, полученные двумя разными методами, совпали с большой точностью. Поэтому можно говорить о достоверности полученных результатов. Из таблиц видно, что температура плавления биназы на 2°С выше чем у барназы при рН 5,5 и на 4°С при рН 2,4. Введение мутаций в молекулу барназы либо слабо влияет на стабильность белка, либо приводит к ее уменьшению. Единственным исключением является гибрид '73-110", температура плавления которого в сравнении с барназой возрастает более чем на 3°С при рН 2,4.

Ol

О

30 40 50 60 70 10 20 30 40 50

Температура С

Рис 4, Зависимость парциальной мольвой теплоемкости от температуры 1 — биназы; 2 — барназы; 3 —гибрида "26— 110"; 4 —гибрида "73— 110"; 5 —гибрида "1-72"; б-гибрида "26-72". А: в 10 мМ ЫаОАс, рН 5,5; В; в 10 мМ глицин, рН 2,4.

Таблица 5.

Параметры тепловой денатурации при рН 2,4

Рибонуклеаза Td АН^, (ккал/моль) АН,фф (ккал/моль) R

Барназа 29,7 87,0 94,0 0,93

Гибрид "73-110" 32.9 85,0 91,0 0,93

Гибрид "26-72" 28,7 90,5 90,1 1,00

Гибрвд "26-110" 31,0 82,1 99,9 0,82

Гибрид "1-72" 29,2 81,0 94,2 0,86

Биназа 33,6 92,7 97,1 0,96

Гибрид "26-110" = Биназа (1Q2, U4Q, R15T, К17Н, R18K); Гибрид "1-72" = Биназа (V78T, A84S, L871, V88L, A103Q, R107K); Гибрид "26-72" = Барназа (E29Q, Q31S, D44E, I55V, K62R, G65S, КббА); Гибрид "73-110- = Барназа (T79V, S85A, I88L, L89V, Q104A, K108R)

о £ тз

"Е

о

8»

"О

£ X

о

190 200 210 220 230 240 Длина волны, нм.

Рис. 5 Спектры кругового дихроизма 1 —гибрида "26—110"; 2 —гибрида "26 — 72"; 3 —биназы;; 4—гибрида "73—110"; 5 —гибрида "1 — 72" и б —барназы в 10мм ЫаОАс, рН 5,5

Таблица 5.

Параметры тепловой денатурации при рН 5,5

Рибонуклеаза т„ ДН™ (ккал/моль) АНэфф (ккал/моль) К.

Барназа 54,3 126,0 126,1 1,00

Гибрид "73-110" 54,8 115,2 126,4 0,91

Гибрид "26-72" 53,7 129,0 128,2 1,01

Гибрид "26-110" 53,0 127,7 138,9 0,92

Гибрид "1-72" 54,6 114,3 112,4 1,02

Биназа 56,3 122,1 128,0 0,96

На Рис. 5 представлены КД-спектры биназы, барназы и гибридных белков при рН 5,5. При более низком значении рН=2,4 спектры имеют тот же характер, но по абсолютной величине эллиптичность спектров меньше, чем эллиптичность спектров при рН 5,5 (данные не представлены). Большой положительный пик при 194 нм для всех без исключения белков

на 30-70% меньше, чем соответствующий пик при pH 5,5. В поглощении пика при 194 нм основной вклад дают ос-спиральные участки глобулы белка и, возможно, при подкислении раствора происходит разбалтывание или даже разрушение некоторых участков а-спиралей. Из Рис. 5 видно, что у гибрида "26-110" высота пика при 194 нм наибольшая, а значит и процент спиральности выше, чем у остальных гибридов. Как нам кажется, именно с этим связано наблюдаемое уменьшение в термостабильности этого гибрида (при pH 5,5 температура денатурационного перехода (Та) для этого гибрида на 1,3°С ниже, чем у барназы). Известно, что гидрофобные ядра молекул Ва и Bi образованы совместной упаковкой а-спиралей и ß-цепей (Fersht A.R., 1992). Улучшение качества а-спиралей делает их менее пластичными и это вносит возмущения в гидрофобное ядро молекулы, что неблагоприятно влияет на ее термостабильность.

5. Характеризация рекомбинантной биназы, выделенной из клеток E.coli.

В процессе выполнения данной работы нами были уточнены физико-химические свойства рекомбинантной биназы. Поскольку интерес к этому ферменту с годами не ослабевает, нам показалось логичным свести все данные, относящиеся к нему, в одном месте и провести критический их анализ.

Изучение термостабильности рекомбинантной биназы методом адиабатической сканирующей микрокалориметрии показало, что при кислых значениях pH кривая плавления биназы симметрична и не содержит второго пика. По-видимому, ассиметрия кривой плавления биназы, выделенной из природного штамма Bacillus intermedius 7Р, можно объяснить либо недостаточной степенью очистки белка, либо неспецифической олигомеризацией белка при низкой ионной силе и кислых значениях pH. В Табл. 7 приведены термодинамические параметры тепловой денатурации, полученные в нашей работе и описанные в литературе (Protasevich I.I. et aL, 1987).

Таблица 7

Параметры тепловой денатурации рекомбинантной и природной биназы.

Условия, Препарат рибонуклеазы Та АП,М (ккал/моль) АНэфф (ккал/моль) R

рН=2,4; Биназа рекомб. 33,6 92,7 97,1 0,96

рН=2,4 Биназа'природн. 33,1 109,3 67,5 1,62

рН=5,5 Биназа рекомб. 56,3 122,1 128,0 0,96

рН=5,5 Биназа природн 56,5 117,9 110,7 1,09

Обращает на себя внимание значение величины R, которая равна отношению калориметрической и эффективной энтальпий денатурации и является критерием кооперативности процесса тепловой денатурации. Ранее на основании того, что значение R для биназы было больше единицы, делали заключение о разделении молекулы на относительно независимо плавящиеся области (энергетические домены). Для рекомбинантной биназы при рН 2,4 мы получили значение R=0,96, а это значит, что не только в нейтральных, но также и в кислых областях рН молекула биназы представляет собой единую кооперативную систему и ее тепловая денатурация осуществляется по принципу "все или ничего". Значения температур денатурации рекомбинантной биназы при рН 2,4 и рН 5,5 совпадают с температурой плавления биназы, выделенной из природного штамма.

Каталитические параметры рекомбинантной биназы на динуклеозидных субстратах GpU и GpC определялись нами в тех же условиях, что и в других работах (Карпейский МЯ. и др., 1981) и приведены в таблице 8. Из таблицы видно, что значение kca/Км для рекомбинантной биназы в 5 раз выше на субстрате GpC и в 3 раза - на субстрате GpU, чем у природного фермента. Кинетические параметры на гомололинуклеотидных субстратах определялись в работе при более низком значении ионной силы буфера, так как при проведении ферментативных реакций в условиях, описанных в литературе, наблюдалось агрегирование молекул субстрата ро1у[1]. Однако вне зависимости от условий проведения реакции значения к^, и Км зля рекомбинатной биназы (Табл. 3 и 4) совпадают с данными из работы (Yakovlev G.I. et al. 1994). В заключение хотелось бы все-таки подчеркнуть, что различия в каталитических свойствах рекомбинантного и природного ферментов не носят принципиальный характер и обусловлены скорее погрешностями в приготовлении препаратов для физико-химических исследований.

Таблица 8.

Кинетические параметры рекомбинантной и природной биназы.

к,„ Км

(с"') (мкМ)

GpU; Биназа рекомб. 4,3±0,4 150+20 2,8x104

GpU Биназа природн. 1,6 220 7,8x103

GpC Биназа рекомб. 5,4+0,8 120±30 4,5x10"

GpC Биназа природн 1,8 190 1x104

6. Разработка экспрессионнон системы и лабораторного метода очистки природного ингибитора барназы - барстара и его мутанта барстар (Cys40,82Ala).

Гены внутриклеточного природного ингибитора барназы - барстара и барстара-А (Цис40,82Ала) были любезно предоставлены в виде плазмид рМТ316 и рМТб43, соответственно, проф. Р.Хартли (NIH, Bethesda, USA). Как и в случае РНКаз для наработки барстара использовали вектор pGEMEX-1 (Рис. 3) и штамм Escherichia coli BL21(DE3). Выходы для барстара дикого типа составляли 100-150 мг/литр, а для барстара (Cys40,82Ala) - 200-300 мг/литр ночной культуры. Следует отметить, что экспрессия белка происходила без индукции IPTG. По-видимому, в данном случае даже минимальных количеств РНК-полимеразы фага Т7 было достаточно для эффективного синтеза мРНК.

При разработке нового лабораторного регламента выделения барстара мы, стремясь к получению белка с максимальной степенью очистки, видоизменили ряд стадий очистки. Поскольку обработка клеток ацетоном может далее повлиять на свойства белка, для разрушения клеток мы использовали ультразвук. Нуклеиновые кислоты отделяли от лизата добавлением полиэтиленимина, а затем проводили дробное высаливание белков сульфатом аммония при 40% и 80% от насыщения. Фракцию 40-80% использовали в дальнейших этапах очистки, которые состояли в гель-фильтрации на колонке Superose 12 Prep grade (Pharmacia, Sweden) и анионнообменной хроматографии на колонке Mono-Q HR10/10 (Pharmacia, Sweden). Гомогенность препарата проверяли на диск-электрофорезе в ПААГ в денатурирующих условиях.

В настоящее время совместно с Лабораторией конформационной стабильности белков и физических методов анализа (ИМБ РАН) ведутся работы по исследованию термостабильности комплексов барстара и гибридных РНКаз.

ВЫВОДЫ

1. Разработан оригинальный метод конструирования гибридных генов - метод рекомбинации гомологов. При помощи этого метода получены гены гибридных РНКаз на основе генов барназы и биназы.

2. Разработаны эффективные экспрессионные системы для гибридных РНКаз, барназы, биназы и природного ингибитора барназы - барстара.

3. Для четырех гибридных РНКаз, барназы и биназы определены кинетические параметры в реакциях расщепления динуклеотидных субстратов GpU и GpC и гомополирибонуклеотидов poly[I] и ро1у[А].

4. Определены термодинамические параметры тепловой денатурации гибридных РНКаз, барназы и биназы.

5. Впервые показано, что С-концевая область молекул бациллярных РНКаз (остатки с 72 по 110) определяют индивидуальные свойства этих ферментов на динуклеозидных субстратах.

6. Продемонстрирована обратная корреляция между стабильностью и активностью РНКазы на субстрате ро1у[1].

7. Показано, что замена любого участка в биназе на гомологичный участок из молекулы барназы приводит к существенному увеличению активности гибридного белка на пол инуклеотвдном субстрате polyjTj.

8. Уточнены физико-химические свойства рекомбинантной биназы.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. А.А.Шульга, A.JLОкороков, К.И.Панов, Ф.Т.Курбанов, Б.К.Чернов, К.Г.Скрябин, М.П.Кирпичников (1994): "Суперэкспрессия РНКазы В. intermedins (биназы) в E.coli"-Мол. биология т.28, № 2, стр.453-463.

2. A.A.Schulga, I.V.Levichkm, F.T.Kurbanov, A.L.Okorokov. G.E.Pozmogova, MP.Kirpichnikov (1994): "An approach to construction of hybrid polypeptide molecules- homolog recombination method"- Nucl. Acids Res. V.22, № 18, p.3808-3810.

3. И.В.Левичкин, Ф.Т.Курбанов, АА.Шульга, М.П.Кирпичников (1994): "Новый подход к конструированию гибридных генов"- VI Конференция Российской Федерации "Новые направления биотехнологии", тезисы докладов, Пущино, стр.86.

4. И.В.Левичкин, А.А.Шульга, Ф.Т.Курбанов, М.П.Кирпичников (1995): "Новый способ конструирования гибридных генов-метод рекомбинации гомологов"- Мол. Биология т.29, № 5, стр.983-991.

5. A.A.Schulga, I.Y. Levichkin, F.T.Kurbanov, M.P.Kirpichnikov (1995): "An approach to construction of hybrid proteins"- 1995 Miami Biotecnology Winter Symposia, abstracts Miami, USA, (vol.6), p.9.

6. А А.Шульга, Ф.Т.Курбанов, И В.Левичкин, Б.Ранджбар, И.И.Протасевич, М.П.Кирпичников (1996): "Близкородственное "скрещивание" белков: изучение гибридных гормонов роста и РНКаз"- Международная конференция, посвященная памяти акад. А А.Баева, тезисы докладов, Россия, стр. 105.

7. A.A.Schulga, F.T.Kurbanov, B.Ranjbar, I.I.Protasevich, A.A.Makarov, M.P.Kirpichnikov (1996): "Mapping of functionally and structurally important regions in bacterial ribonucleases: study of himeric barnase/binase proteins"- 4"1 International Meeting "Ribonucleases: Chemistry, biology, Biotechnology", abstracts, The Netherlands, pp.SlP14.