Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Тепловая денатурация белков разной структурной организации: влияние блочных мутаций

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Тепловая денатурация белков разной структурной организации: влияние блочных мутаций"

Г' Oft » (

, гМтмстерство Общего н Профессионального Образования ■р ^ V |11 i"-' Российской Федерации

Московский Физико-Технический Институт

На правах рукописи УДК 577.322.2

РАНДЖБАР БИЖАН

ТЕПЛОВАЯ ДЕНАТУРАЦИЯ БЕЛКОВ РАЗНОЙ СТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ: ВЛИЯНИЕ БЛОЧНЫХ МУТАЦИЙ

03.00.02 - Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

МОСКВА -1997

Работа выполнена на Кафедре молекулярной биофизики Факультета физико-химической биологии Московского физико-технического института и в Лаборатории конформационной стабильности белков Института молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта РАН

доктор физико-математических наук, профессор В.И.Иванов доктор биологических наук Д.И.Левицкий

Защита состоится 17 июня 1997 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета К 063.91.10 при Московском Физико-Техническом Институте (147000 г.Долгопрудный, Московская область, Институтский пер., 9). С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского Физико-Технического Института.

Научные руководители:

доктор биологических наук А.А.Макаров кандидат биологических наук И.И.Протасевич

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Институт биоорганической химии

им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Автореферат разослан

1997 года

УЧЕНЫЙ СЕКРЕТАРЬ

ДИССЕРТАЦИОННОГО СОВЕТА

КАНДИДАТ ФИЗИКО-МАТЕМАТИЧЕСКИХ НАУК

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Организация уникальной пространственной структуры белка представляет собой одну из наиболее важных проблем молекулярной биофизики. Эта проблема не только структурная, но и термодинамическая, поскольку белок является макроскопической системой. Разрешить эту проблему нельзя без термодинамического исследования процесса структурной организации этой системы или обратного ему процесса распада структуры белка под воздействием различных факторов. Среди воздействий, которые могут привести к распаду нативной структуры белка, к его денатурации, особое место занимает температурное воздействие. Это связано с тем, что температура является интенсивным термодинамическим параметром, сопряженным с энтальпией - термодинамическим потенциалом, описывающим энергетическое состояние системы. Получить прямую информацию о тепловой денатурации белка можно лишь исследуя калориметрически распад его нативной структуры под воздействием возрастающих по интенсивности тепловых колебаний.

Стабильность белка определяет его динамику и свойства как молекулярной машины. В то время как пространственная структура белка может быть определена очень точно, вклады конкретных физических механизмов в температурную стабильность белка еще мало понятны. Многочисленные попытки установить закономерности стабилизации глобул анализом уже собранной структуры нативного белка не привели к желаемой ясности. Все это определяет актуальность изучения закономерностей стабилизации структуры белка.

Существенным свойством денатурации белков является ее способность отражать процессы, происходящие в кооперативном ансамбле глобулы, т.е. давать информацию о сумме всех взаимодействий в системе. В настоящее время вклады отдельных аминокислот в температурную стабильность белка изучаются с помощью сайт-специфического мутагенеза. Применение методов генетической инженерии для введения точечных и блочных мутаций в белковой молекуле позволяет выяснить природу взаимодействий, определяющих стабильность пространственной структуры белка, и установить взаимосвязь между структурой и функцией.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось определение закономерностей стабилизации белков разной структурной организации путем изучения влияния блочных мутаций на кокформацию и параметры тепловой денатурации однодоменных бактериальных рибонуклеаз и калмодулина, состоящего из двух глобулярных долей. В задачу работы входило: (а) изучение отличий в конформации, стабильности и каталитических свойствах барназы, биназы и гибридов, составленных из различных участков аминокислотной последовательности этих рибонуклеаз, а также отличий в энергетике комплексов рибонуклеаз с внутриклеточным белковым ингибитором барстаром; (б) исследование конформационного состояния и плавления калмодулина и его мутантов с измененным электростатическим потенциалом, в которых кластеры кислотных остатков заменены на кластеры основных остатков.

Научная новизна и практическая ценность работы. Показано, что тепловая денатурация рекомбинантных биназы, барназы и их гибридов в широком диапазоне pH является переходом между двумя состояниями. Установлены участки биназы и барназы, определяющие тип термостабильности гибрида по отношению к исходным рибонуклеазам. Впервые обнаружено, что изменения свободной энергии денатурации вследствие множественных мутаций в барназе, определенные по данным тепловой денатурации и по денатурации мочевиной, совпадают, а влияние блочных замен на стабильность барназы аддитивно. На примере комплекса биназы с барстаром определены кооперативные свойства и механизм плавления белок-белковых комплексов. Впервые продемонстрирована важная роль электростатических взаимодействий в стабильности и гибкости калмодулина, а также во взаимном влиянии его долей друг на друга. Установлена обратная зависимость между сродством к кальцию и термостабильностью, обнаружено специфическое влияние ионов какодилата на содержание а-спиралей в калмодулине. Термодинамический подход к изучению белков разной структурной организации позволил продемонстрировать роль блочных мутаций в определении закономерностей их стабилизации. Полученные результаты могут быть использованы для инженерии бактериальных рибонуклеаз, являющихся эффективными агентами против вирусов животных и растений, с целью приобретения ими желаемых новых свойств. Знание закономерностей изменения термостабильности белков важно для задач практической биотехнологии. Определение конформационной стабильности калмодулина, ключевого белка в регуляции потока информации в эукариотической клетке, важно для понимания механизма преобразования количественного сигнала кальция в качественный клеточный ответ.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на 9-й Конференции по биомолекулярной стереодинамике (Олбани, США, 1995); 4-ом Европейском симпозиуме по кальций-связывающим белкам в нормальных и трансформированных клетках (Перуджа, Италия, 1996); Международной конференции, посвященной памяти акад. A.A. Баева (Москва, Россия, 1996); 4-ом Международном симпозиуме "Рибонуклеазы: химия, биология, биотехнология" (Гронинген, Нидерланды, 1996); 1-й Международной конференции по применению биокалориметрии (Оксфорд, Англия, 1996); 10-й Конференции по биомолекулярной стереодинамике (Олбани, США, 1997).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена настраницах и включает в себя ^таблиц и;£'/рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1.1. Барназа, биназа и их гибриды: отличия к конформащш и параметрах тепловой денатурации

Барназа и биназа являются представителями семейства внеклеточных низкомолекулярных рибонуклеаз микроорганизмов. Барназа продуцируется бактериями вида В.ату!оИдие/ааеги, а биназа - В.ШегтеШт 7Р. Они отличаются между собой 17 остатками и одной делецией. Эти остатки не локализованы в какой-то определенной части белка, а рассеяны по всей молекуле, при этом число заряженных остатков практически совпадает, и замещения имеют место в основном на поверхности. Несмотря на высокую степень гомологии аминокислотных последовательностей (85%) и пространственных структур барназы и биназы, обнаружены существенные различия в их ферментативных свойствах и стабильности. Чтобы исследовать закономерности стабилизации глобулы таких высокогомологичных белков как барназа и биназа, мы использовали гибридные молехулы, составленные из различных участков аминокислотной последовательности этих рибонуклеаз, для изучения их относительной стабильности. С помощью метода "рекомбинации гомологов" (БсЬи^а ей а1., 1994) были сконструированы следующие гибриды барназы (Ва) и биназы (В1): (1-25)Ва/(2б-110)В1, (1-72)Ва/(73-110)Ш, (1-25)Ва/(26-72)1М/(73-1 !0)Ва и (1-72)В!/(73-110)Ва.

Микрокалориметрия. На рис. 1 приведены зависимости парциальной молярной теплоемкости барназы, биназы и их гибридов от температуры при рН 5,5 (а) и 2,4 (б). Обратимость процесса денатурации всех белков была

30 40 50 60 70 10 20 30 40 50

Температура, °С

Рис. 1. Зависимости парциальной молярной теплоемкости барназы (7), биназы (2) и их гибридов "26-110" (3), "73-110" (4), "1-72" (5) и "26-72" (б) от температуры при рН 5,5 (а) и рН 2,4(6).

практически полной. Парциальная теплоемкость барназы, биназы и гибридов при 25°С имеет одинаковую величину, (0,33 ± 0,05) кал/К-г, что является типичным значением для компактных глобулярных белков при этой температуре. Отношение ДНоа/ДНеп (Ц.) - критерий кооперативное™ процесса тепловой денатурации, позволяющий оценить, во сколько раз средние размеры кооперативной единицы отличаются от размеров всей глобулы белка, для всех рибонуклеаз практически равно единице, табл. 1. Таким образом, молекулы барназы, биназы и гибридов представляют собой единую кооперативную систему, и их тепловая денатурация осуществляется по принципу "все или ничего".

В отличие от биназы, выделенной из природного штамма (РгЫаэеу^сЬ е1 а!., 1987), кривые плавления рекомбинантной биназы симметричны, и ее тепловая денатурация и при рН 2,4 является переходом между двумя состояниями, хотя температуры денатурации этих препаратов не отличаются. Температура денатурации (Тй) биназы выше, чем для барназы, на 2,0°С при рН 5,5 и на 3,9°С при рН 2,4. Увеличение разницы температур денатурации биназы и барназы при уменьшении рН наблюдалось нами и ранее, однако при рНЗ,1 составляло 7,0°С (Макагоу е1 а1., 1993). Таким образом, результаты данной работы демонстрируют некоторые различия в параметрах денатурационного перехода дня барназы и биназы при кислых значениях рН по сравнению с представленными ранее. Возможно, это связано с различием методов получения и очистки изучаемых рибонуклеаз.

Следует заметить, что различия в температурах денатурации между барназой и гибридами проявляются в большей степени при рН 2,4 (рис. 1, табл. 1). При этом значении рН температура денатурации гибрида "73-110", который содержит С-концевую область биназы, на 3,2°С больше, чем у барназы, и по стабильности этот гибрид близок к биназе. В отличие от этого, Та гибридов "1-72" и "26-72", имеющих С-концевую область барназы, при рН 2,4 очень близки к Та барназы, т.е. с точки зрения термостабильности они ей подобны. Таким образом, можно предположить, что С-концевая часть молекулы гибрида определяет изменение ее термостабильности при рН 2,4 по отношению к исходным рибонуклеазам. Гибрид "26-110", С-концевая область которого такая же, как в биназе, является исключением, т.к. его Та очень близка к соответствующей для барназы. Как видно в табл. 1, введение замен Е29<5, 0315, Б44Е, 155У, К6211, С65Б, К66А в барназе (гибрид "26-72") приводит к уменьшению ее термостабильности, а замены Т79У, Б85А, 188Ь, Ь89У, <2104А, К108Я (гибрид "73-110") увеличивают термостабильность белка. Следовательно, одновременное введение обеих групп этих замен в гибрвде "26-110" может компенсировать их влияние, и тогда Та этого гибрида будет ближе к Та барназы, что мы и наблюдаем. Сравнение изменений температуры денатурации рибонуклеаз и их гибридов при понижении рН позволяет заключить, что структура С-концевой области барназы более чувствительна к изменению ионизации белка.

Сравнение термостабильности рибонуклеаз показывает, что одни гибриды стабильнее барназы, а другие - менее стабильны (табл. 1). Чтобы объяснить это различие, мы проанализировали все замены в гибридах и биназе относительно

барнззы с точки зрения их вклада в поддержание стабильности макромолекулы, используя результаты работы (Serrano et al., 1993). В этой работе была осуществлена независимая замена каждого из 17 остатков, по которым барназа отличается от биназы, и определено влияние этих замен на стабильность барназы по разности между свободными энергиями разворачивания белка дикого типа и мутантного белка AAGn-F(urea), полученными на основе данных по денатурации мочевиной при 25°С. Были определены величины AAGu-FOm») для всех 17 одиночных мутантов и показано отсутствие кооперативного эффекта, т.к. изменения стабильности барназы при заменах трех, шести и 17 остатков одновременно совпадали с суммой эффектов отдельных мутаций. Отметим, однако, что Imanaka et al. (1986) нашли, что в нейтральной протеазе из В. síearothermophilus влияние двойных мутаций на стабильность белка было кооперативным. В изученных нами гибридах по отношению к барназе имеется от 6 до 13 замен аминокислотных остатков.

Таблица 1. Параметры тепловой денатурации барназы, биназы и их гибридов'

Образец Та ДНса1 АНеГГ R

(°С) (ккап/моль) (ккал/моль)

рН 5,5

Барназа 54,3 126 126 1,00

Гибрид "73-110" 54,8 115 124 0,93

Гибрид "26-72" 53,7 129 128 1,01

Гибрид "26-110" 53,0 128 129 0,99

Гибрид "1-72" 54,6 114 112 1,02

Биназа 56,3 123 128 0,96

рН 2,4

Барназа 29,7 87 92 0,95

Гибрид "73-110" 32,9 85 91 0,93

Гибрид "26-72" 28,7 91 90 1,00

Гибрид "26-110" 31,0 84 S3 0,90

Гибрид "1-72" 29,2 82 91 0,90

Биназа 33,6 93 97 0,95

'Гибрид "73-110" = барназа (T79V, S85A, I88L, L89V, Q104A, K108R), гибрид "26-72" = барназа (E29Q, Q31S, D44E, I55V, K62R, G65S, К66А), гибрид "26-110" = барназа (E29Q, Q31S, D44E, I55V, K62R, G65S, К66А,

T79V, S85A, I88L, L89V, Q104A, K108R), гибрид " 1 -72" = барназа (AQ2, Q151, TI 6R, Н18К, К19R, E29Q, Q31S, D44E, I55V, K62R, G6SS, К66А).

Предполагая аддитивность действия этих замен, мы суммировали для них взятые из работы (Serrano et al., 1993) величины MGu-foitm) и получили значения XAAGu-F(u«a) для каждого гибрида и биназы. При проверке аддитивности изменения стабильности гибридов эти расчетные значения мы сравнили с величинами AAGu-f(T<i), полученными на основе наших калориметрических данных в соответствии с уравнением: AAGu-i-(Td) и ATíASu-fíTí), где AAGu-KTd) -разность свободной энергии разворачивания белка дикого типа и мутантного белка при Та, ЛТа - разность температур денатурации белка дикого типа и мутантного белка, a ASu-F(Td) -энтропия разворачивания белка дикого типа, равная ДНы/Тц. Для проведения сравнения мы взяли калориметрические данные, полученные при значении рН 5,5, наиболее близком к использованному Serrano et al. (1993). На рис.2 приведено соотношение между значениями AAGu-pfTd) барназы и гибридов, а также барназы и биназы, определенными калориметрически, и значениями £AAGu-F(urta), рассчитанными по результатам денатурации мочевиной. Если не принимать в расчет данные для гибрида "26-110", то между этими величинами существует линейная зависимость с коэффициентом корреляции 0,96. Эту зависимость можно представить следующим уравнением: AAGu-j<Td) = -0,06 (±0,04)+[0,99 (±0,16)xXAAGu-F(urm)] ккал/моль. Хорошее соответствие между изменениями свободной энергии денатурации вследствие мутаций в барназе, определенными с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии и по денатурации мочевиной, было также обнаружено Matouschek et al. (1994), но только в случае одиночных замен

ккал/моль

Рис. 2. Корреляция между разностями свободной энергии разворачивания барназы и гибридов, а также барназы и биназы, определенными с помощью калориметрии при рН 5,5, ДАОи-р(Та), и значениями, рассчитанными по результатам денатурации мочевиной ряда одиночных мутантов барназы, ЕДДОи-щшта) (МаЮизсЬек е1 а1., 1994): барназа (+), биназа (в), гибриды "26-110" (•), "73-110" (А,), "1-72" (♦) и "26-72" (Т).

Существенное отличие гибрида "26-ПО" от других рибонуклеаз (рис.2) позволяет предположить, что для него аддитивность влияния отдельных мутаций на стабильность белка нарушается. Аминокислотная последовательность этого гибрида включает в себя последовательности гибридов "26-72" и "73-110", для которых сохраняется аддитивность влияния мутаций на стабильность. Температуры денатурации этих гибридов при рН 5,5 близки к Та барназы, в то время как гибрид "26-110" характеризуется максимальной дестабилизацией по отношению к барназе (табл. 1). Аномальное поведение этого гибрида является результатом кооперативного эффекта присутствующих в нем двух наборов замен.

Круговой дихроизм. Известно, что в барназе и биказе имеется большое число ароматических аминокислот (ЗТгр, 7Туг, 4РЬе), и они дают существенный вклад в КД в пептидной области спектра. Мы показали, что микроокружение ароматических хромофоров в этих рибонуклеазах одинаково. Поэтому можно проводить относительное сравнение спектров КД этих белков в пептидной области. На рис. 3 представлены спектры КД исследуемых белков при рН 5,5. Видно, что в диапазоне длин волн 200-250 нм спектры КД барназы, биназы и их гибридов практически не отличаются, за исключением гибрида "26-110". Однако, в области 185-200 нм при сравнении амплитуды интенсивного положительного максимума КД при 194 нм мы обнаруживаем различия во всех белках, кроме биназы и гибрида "73-110", для которых величина этого максимума одинакова. При понижении рН до 2,4 форма и амплитуда спектров КД всех белков в области 200-250 нм остаются практически без изменений. Величина же положительного пика КД (194 нм) при переходе от рН 5,5 к 2,4 существенно уменьшается для барназы, биназы и гибридов "1-72", "73-110", "26-110", "26-72" на 42, 26, 33, 42,64 и 69%, соответственно. Величина максимума КД при 194 нм биназы больше соответствующей величины барназы, причем это

3

Рис. 3. Спектры КД барназы (7), биназы (2) и их гибридов "26-110" (3), "73-110" (4), "1-72" (5) и

'73-110"(4), "1-72" (5) и '26-72" (б) при рН 5,5.

3

190 200 210 220 230 240 X, нм

различие усиливается при понижении рН от 5,5 до 2,4, аналогично увеличению различий в температурах денатурации этих белков. Как известно, амплитуда положительного пика КД в районе 194 им в значительной степени обусловлена наличием а-спиральных участков в молекуле белка. Наибольшему значению этого пика для гибрида "26-110" соответствует и наибольшая амплитуда КД при 222 нм (рис. 3, кривая 3), которая также является мерой количества и качества структуры а-спиралей в глобуле белка. Таким образом, уменьшение величины максимума КД при 194 нм, т.е. уменьшение а-спиральности, при понижении рН от 5,5 до 2,4 сопровождается резким падением температур денатурации рибонуклеаз на 22-25°С (табл. 1), а также существенным уменьшением коэффициента седиментации, т.е. уменьшением компактности (или жесткости) глобулы (Макагоу еЬ а1., 1993). Гибриды "26-110" и "26-72", содержащие общий участок биназы 26-72, характеризуются наибольшим уменьшением а-спиральности по сравнению с другими белками при понижении рН.

Состояние третичной структуры белков анализировали по спектрам КД в ближней УФ-области. Спектры КД барназы, биназы и их гибридов в диапазоне 250-310 нм практически не отличаются и не зависят от рН. Это говорит о том, что во всех исследуемых белках локальное окружение боковых групп ароматических аминокислот одинаково и не зависит от рН. Остатки ароматических аминокислот расположены, в основном, в первой а-спирали и в р-структурной части молекулы барназы, а во второй и третьей сх-спиралях их нет. Следовательно, различие амплитуды пика КД при 194 нм барназы, биназы и гибридов при рН 5,5, как и ее уменьшение на 26-69% при переходе от рН 5,5 к 2,4, связано с изменениями, главным образом, во второй и третьей сх-спиралях. Искажения геометрии а-спиральной структуры также могут влиять на амплитуду КД.

Для сопоставления термодинамической и структурной информации мы сняли кривые плавления барназы по изменению эффекта КД от температуры в далекой (194 нм) и в ближней (280 нм) УФ-областях при рН 5,5 и 2,4 (рис. 4). Полученные температуры денатурации барназы совпадают с определенными калориметрически температурами денатурации. Рассчитанные из кривых плавления КД эффективные энтальпии денатурации также совпадают с таковыми, полученными из калориметрических данных для барназы. Резкое уменьшение величины пика КД при 194 нм при увеличении температуры обусловлено кооперативным плавлением вторичной структуры белка, а уменьшение эффекта КД при 280 нм говорит о разрушении третичной структуры. Совпадение этих кривых плавления свидетельствует о том, что при плавлении глобулы барназы изменения во вторичной и третичной структурах происходят одновременно.

Сопоставление наших результатов с полученными ранее данными по определению каталитических свойств изучаемых рибонуклеаз и их гибридов (Курбанов, 1996) показывает, что С-концевая область молекулы белка определяет не только тип ее термостабильности, но и различия свойств между барназой и биназой при гидролизе динуклеозидных субстратов. Нами обнаружено, что барназа

0,5

§ СГ

О

Рис. 4. Кривые плавления барназы при рН 2,4 (7) и рН 5,5 (2), полученные на основании температурной зависимости величины КД на длинах волн 280 нм (сплошная линия) и 194 нм (пунктир).

20 30 40 50 60 70 Температура, "С

катализирует гидролиз полинуклеотидного субстрата poly[I] почти на порядок лучше, чем биназа. Для всех гибридов значение ксш/Км на субстрате poly[I] также выше, чем у биназы. Сопоставление этих данных с термостабильностью рибоиуклеаз показывает, что активность гибридов и рибоиуклеаз на полинуклеотидном субстрате poly[I] находится в обратной зависимости от стабильности белковой глобулы. Аналогичные данные были получены при исследовании влияния замен остатков активного центра барназы на ее стабильность (Meiering et al„ 1992).

При рН 5,5 наименее стабильным является гибрид "26-110", температура денатурации которого на 1,3°С и 3,3°С меньше соответствующих величин в случае барназы и биназы. При этом для гибрида "26-110" мы нашли наибольшее значение а-спиральности. Вероятно, вызванное заменами, произведенными в гибриде "26-110", увеличение а-спиральности приводит к такому перераспределению внутримолекулярных взаимодействий, вследствии которого его стабильность снижается.

Таким образом, результаты данной работы установили аддитивность влияния блочных замен на стабильность барназы, позволили обнаружить наборы мутаций с кооперативным эффектом воздействия, а также указать участки барназы и биназы, которые определяют тип термостабильности гибрида по отношению к исходным рибонуклеазам и чувствительность структуры белка к изменению величины рН.

1.2. Термостабилыюсть и константы диссоциации комплексов биназы с белковым ингибитором барназы - барстаром

Барназа, продуцируемая бактериями вида В. amyloliquefaciens, и ее специфический внутриклеточный ингибитор, барстар (89 аминокислотных остатков), продуцируемый теми же бактериями для защиты микроорганизма от летального эффекта действия барназы, образуют стабильный, нековалентный, эквимолярный комплекс. Коэффициент диссоциации комплекса составляет -1013 М. Ранее было показано, что температура плавления барназы в ее комплексе с барстаром на 20°С выше, чем в свободном состоянии. Как мы показали в разделе 1.1., Td свободной биназы отличается от Id барназы при нейтральных рН на 2°С.

Мы предположили, что в комплексе с барстаром различие в энергетике биназы и барназы может проявиться в большей степени.

Известно, что большинство из 14 остатков барназы, взаимодействующих с барстаром, сохраняются в биназе, за исключением Ser85 и Glnl04, которые вовлечены только в ван-дер-Ваальсовы контакты в комплексе барназы с барстаром и заменяются на аланины в биназе. Такая высокая степень консервативности позволяет ожидать, что структуры комплексов барназы и биназы с барстаром должны быть очень похожи. Близость значений полученных нами констант диссоциации комплексов этих двух рибонуклеаз с барстаром и мутантным барстаром (Cys 40,82 Ala) подтверждает это предположение. Вместе с тем, определенные нами методом изотермической калориметрии значения энтальпии связывания биназы с барстаром и при рН 8,0, и при рН 6,2 на 3,5 ккал/моль меньше соответствующих значений для комплекса барназы с барстаром. Этой разнице соответствует элиминирование нескольких водородных связей и ван-дер-Ваальсовых взаимодействий в комплексе биназа-барстар. Уменьшение энтальпии образования комплекса биназа-барстар компенсируется меньшим снижением энтропии.

На рис. 5 приведена зависимость парциальной молярной теплоемкости комплекса биназы с барстаром от температуры при рН 6,2 и 8,0 (А) и то же для свободной биназы при рН 6,2 (Б). Отношение R = ДНы/ДНл Для плавления комплекса биназы с барстаром близко к двум (табл. 2). Этот факт, наряду с асимметрией пика плавления, указывает на наличие более чем одного относительно независимого кооперативного перехода. Чтобы доказать это, мы провели деконволюцию калориметрических кривых для комплекса биназа-барстар. Кривые можно разделить на два перекрывающихся перехода между двумя состояниями (табл. 3). Такие же результаты были получены при плавлении комплекса барназа-барстар (Makarov et al., 1994). Было показано, что первый деконволюциоиньш пик соответствует денатурации барстара, а второй отражает плавление барназы. Ранее при рН 6,2 не наблюдалось достоверно регистрируемого

А

Рис. 5. (А) Зависимость парциальной молярной теплоемкости комплекса биназы с барстаром от температуры при рН 6,2 (1) и 8,0 (2).

Б

о

(Б) Зависимость

10

парциальной молярной теплоемкости биназы от температуры при рН 6,2.

о

30 40 30 60 70 80 90 Температура, "С

Таблица 2. Параметры тепловой денатурации биназы, барстара и их комплексов

Образец Та <°С) ЛНса! (кхал/моль) АНе,Г (ккал/моль) И

Биназа + барстар рН 6,2 рН 8,0 81,2 83,4 155 156 72 85 2,15 1,84

Биназа рН 6,2 рН 8,0 55,3 54,6 95 59 101 104 0,94 0,57

Барстар 1мМ ДТТ рН 6,2 73,3 (73,0)' 53 76 0,70

'Температура плавления барстара по данным КД.

Таблица 3. Термодинамические параметры переходов, полученные путем деконвотоции функции избыточной теплоемкости комплекса биназа-барстар

рн Т, АН, Ъ ДН2

(°С) (ккал/моль) (°С) (ккал/моль)

6,2 73,3 70 80,3 99

8,0 75,7 62 82,8 111

теплового эффект» денатурация свободного барстара. При добавлении дитиотрейтола (ДТТ) нам удалось зарегистрировать кривую плавления барстара и определить параметры его денатурации (табл. 2). Равенство Та барстара в комплексе и в свободном состоянии (табл. 2,3) подтверждает вывод о том, что первый деконволюционный пик соответствует денатурации барстара. Тогда второй деконволюционный пик отражает плавление биназы. Температура плавления комплекса биназа-барстар при рН 6,2 на 5,7°С выше, чем температура плавления комплекса барназа-барстар, хотя температуры денатурации свободных рибонуклеаз в этих условиях различаются на 1,7°С. Температура денатурации биназы в комплексе с барстаром на 25-28°С выше, чем для свободной биназы (табл. 2,3), и на 5-10°С выше, чем температура плавления барназы в комплексе с барстаром. Таким

образом, отличие биназы от барназы по термостабильности в комплексе с барстаром значительно усиливается по сравнению со свободным состоянием.

Существенное увеличение температуры денатурации биназы и барназы при связывании барстара может происходить по следующей причине. Если зона контакта рибонуклеазы с барстаром, которая включает активный центр, является областью начального разворачивания глобулы при тепловой денатурации, то стабилизация этого района взаимодействием с ингибитором должна приводить к повышению температуры денатурации фермента, что мы и наблюдаем. Отметим, что кристаллографические данные свидетельствуют об уменьшении подвижности боковых групп аминокислот обоих белков в зоне взаимодействия рибонуклеазы с барстаром (ОиПЫ ее а1., 1993).

2. Тепловая денатурация и конформация апо-калмодулнна и его мутантов с измененным электростатическим потенциалом

Из рассмотрения данных по бактериальным рибонуклеазам можно заключить, что в результате блочных замен происходят изменения во вторичной структуре балка и изменяется его термостабильность. Далее мы провели исследование существенно отличающегося от рибонуклеаз как по структуре, так и по функции бежа - калмодулина, кальций-связывающего белка, обнаруженного во всех эукариотических клетках. Его молекула содержит втрое большее количество а-спиральных участков и имеет форму гантели с двумя глобулярными долями, соединенными длинной спиралью.

В работе использовали синтетический калмодулин (ЭупСаМ), который представляет собою белковый гибрид, полученный из калмодулина млекопитающих и растений и способный активировать все Са2*-калмодулин-зависимые ферменты. Для исследования роли электростатических взаимодействий в стабилизации молекулы калмодулина мы использовали три его мутанта, в которых блоки кислотных остатков были заменены на блоки основных остатков. В 8упСаМ8 82ЕЕЕ84 заменены на 82ККК84 в центральной спирали, а в 8упСаМ12А И ШЕЕ 120 заменены на 118ККК120 в С-концевой доле. В БупСаМ18А присутствуют обе группы этих мутаций. Эти модификации изменяют электростатический потенциал в определенных участках белковой молекулы и расположены вне участков связывания кальция.

Сканирующая калориметрия апо-БупСаМ. На рис. 6А представлена зависимость парциальной молярной теплоемкости не содержащего кальция БупСаМ от температуры в 50 и 10 мМ Ыа-какодилатном буфере, рН 7,5. Эти условия были выбраны нами в связи с тем, что рентгеносгруктурный анализ СаМ выполнялся в основном в 50 мМ какодилатном буфере, а ранние калориметрические исследования тепловой денатурации калмодулина теленка проведены в 10 мМ какодилатном буфере (ТваИгоуа & Рпуа1оу, 1985). Обе кривые плавления асимметричны, с выраженным плечом при более низких температурах, сходным с ранее полученным для апо-СаМ теленка. Однако общая термостабильность апо-БупСаМ примерно на 7°С выше таковой для апо-СаМ теленка.

Плавление насыщенного кальцием ЭупСаМ не выявило пика теплопоглощения

о

е

2

CL

О

50 45 40 35 30 25

20 40 60 80 Temperature (°С)

100

о £

3.

Г

«а

О

Рис. 6. (А) Зависимость парциальной молярной теплоемкости апо-БупСаМ от температуры в 10 мМ (пунктирная линия) и 50 мМ (сплошная линия) Ка-какодилатпом буфере, рН 7,5.

(В) Компьютерная деконволюция избыточной теплоемкости апо-БупСаМ в 50 мМ какодилатном буфере, рН 7,5: экспериментальные результаты (сплошная линия), деконво-люционные пики и их сумма (пунктирные линии).

20 40 60 80 Temperature (°С)

до температуры 124°С, близкой к высокотемпературному пределу работы микрокалориметра ДАСМ-4. Это обстоятельство не позволило нам изучить влияние мутаций на параметры тепловой денатурации насыщенного кальцием SynCaM. Парциальная молярная теплоемкость ano-SynCaM при 20°С (Срм), равная (31,0 ±1,5) кДж/К-моль, не зависит от молярности буфера и близка к таковой для апо-СаМ из мозга теленка. Эта величина, рассчитанная на грамм белка и рапиая 1,9 Дж/К-г, выше средней величины парциальной удельной теплоемкости глобулярных белков при 20°С - 1,3 Дж/К-г. Это может служить указанием на большую гибкость апо-SynCaM по сравнению с другими небольшими белками. Из данных рентгеноструктурного анализа, ЯМР и малоуглового рентгеновского рассеяния следует, что длинная центральная а-спиралъ, соединяющая две глобулярные доли, обладает высокой гибкостью в растворе. Очевидно, что такая структура придает дополнительную гибкость глобулярным долям калмодулина относительно друг друга. В соответствии с подходом Привалова и Махатадзе (1990), мы рассчитали парциальную теплоемкость полностью развернутого и экспонированного в растворитель ano-SynCaM, используя значения теплоемкостей отдельных аминокислот и допуская аддитивность их величин. Теплоемкость денатурированного ano-SynCaM близка к этой расчетной величине, что говорит о том, что подвергшийся тепловой денатурации ano-SynCaM полностью развернут.

13

Калориметрические кривые плавления апо-ЗупСаМ демонстрируют высокую степень обратимости, которая не зависит от концентрации белка, но зависит от температуры, до которой раствор белка был нагрет во время первого сканирования. Если нагрев остановить сразу же после окончания пика теплопоглощения, то наблюдается практически полная обратимость (не менее 95%).

Общий тепловой эффект, т. е. энтальпия плавления, ДНы, апо-БупСаМ при двух концентрациях буфера приведена в табл. 4. Асимметрия кривой плавления и протяженный температурный диапазон процесса денатурации указывают на наличие нескольких кооперативных переходов. Поэтому мы провели деконволюцию калориметрической кривой для апо-БупСаМ. Кривая может быть представлена в виде двух перекрывающихся переходов между двумя состояниями (рис. 6В). Согласно Цалковой и Привалову (1985) и КиЬошша е1 а1. (1995), первый деконволюционный пик соответствует плавлению С-концевой доли, а второй отражает разворачивание №концевой доли. Подтверждение этому соотнесению мы нашли в величинах гидропатических индексов долей. Эти индексы для Ы- и С-концевых долей (-5,0 и -7,4, соответственно), рассчитанные по их первичной структуре по методу Ку1е & БооШЬ (1982), показывают большую гидрофильность С-концевой доли, т. е. ее большую доступность для растворителя и, следовательно, меньшую стабильность. Максимумы пиков первого, и второго переходов для апо-БупСаМ (табл. 4) по сравнению с таковыми для апо-СаМ теленка сдвинуты, соответственно, на 11,7 и 7,2°С в сторону более высоких температур. Такое различие сдвигов температур переходов неудивительно, поскольку практически все аминокислотные замены в БупСаМ по сравнению с СаМ теленка расположены в С-концевой доле и центральной а-спирали. Кроме того, параметры плавления низкотемпературного пика, как и в случае СаМ теленка, более чувствительны к

Таблица 4. Параметры тепловой денатурации апо-БупСаМ и его мутантов

(Ыа-какодилатный буфер, рН 7,5)

первый переход второй переход

образец r 20 ^ P AH cal т\ АН} Tt АН t

(кДж/К. (кДж/ (°С) (кДж/ (°С) (кДж/

моль) моль) моль) моль)

10 мМ буфер

SynCaM 31,4 275 47,7 111 61,2 184

SynCaM8 29,0 267 42,9 107 61,1 183

SynCaM 12А 31,5 243 43,4 93 58,5 170

SynCaM 18А 38,0 232 40,1 98 50 мМ буфер 65,5 149

SynCaM 30,6 306 41,2 128 62,0 196

SynCaM8 27,5 320 50,1 136 64,7 200

SynCaM 12A 29,5 300 40,0 109 60,0 195

SynCaM 18A 35,3 221 34,1 99 62,8 123

ионной силе среды, чем параметры Ы-концевой доли (табл. 4). Поэтому и структура С-концевой доли должна быть более чувствительна к мутациям, изменяющим электростатический потенциал белка, чем структура И-концевой доли.

Сканирующая калориметрия мутантов апо-БупСаМ. На рис. 7 приведены результаты калориметрического плавления не содержащих кальция мутантов 5упСаМ8, БупСаМ12А и БупСаМ18А. Все калориметрические кривые плавления мутантов были полностью обратимы. Обратимость не зависит от концентрации белка, но зависит от температуры, до которой раствор белка был прогрет при первом нагреве таким же образом, как и для апо-БупСаМ. Кривые плавления мутантов и апо-8упСаМ различаются по форме. Хотя асимметрия кривых сохраняется, выраженное плечо в левой части кривой плавления, полученное для апо-БупСаМ, значительно уменьшается. Кроме того, амплитуда главного максимума при плавлении апо-БупСаМ18А в 50 мМ буфере резко снижается (Рис. 7).

Парциальная молярная теплоемкость апо-ЭупСаМПА при 20°С близка х соответствующим величинам для апо-5упСаМ (табл. 4). Таким образом, замена кислотного кластера 118-120 на основной не влияет на гибкость белка. Величина Ср20

0 20 40 60 80 100 Temperature (°С)

0 20 40 60 80 100 Temperature (°С)

Е £

0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100

Temperature ("С) Temperature (1С)

Рис. 7. Зависимость парциальной молярной теплоемкости мутантов ano-SynCaM от температуры в 10 мМ (пунктирная линия) и 50 мМ (сплошная линия) Иа-какодилатном буфере, рН 7,5: ano-SynCaM8 (A), ano-SynCaM12A (В), ano-SynCaM 18А (С). (D) Компьютерная деконволюция избыточной теплоемкости ano-SynCaM 12А в ЮмМ какодилатном буфере, рН7,5: экспериментальные результаты (сплошная линия), деконволюционные пики и их сумма (пунктирные линии).

и, соответственно, уровень структурной гибкости у ano-SynCaM8 является самым низким среди всех калмодулинов, а для ano-SynCaMI8A эти параметры наивысшие.

Теплоемкости денатурированных мутантов ano-SynCaM близки к рассчитанным по Привалову и Махатадзе (1990). Следовательно, денатурированные мутанты, подобно ano-SynCaM, полностью развернуты. Таким образом, различия термодинамических параметров денатурации ano-SynCaM и его мутантов отражают различия в их нативных состояниях.

Величины энтальпии денатурации ano-SynCaM8 и ano-SynCaM 12А близки к соответствующим значениям для ano-SynCaM, а для ano-SynCaM 18А они ниже, особенно в 50 мМ буфере. Это свидетельствует о том, что молекула ano-SynCaM18A свернута в меньшей степени по сравнению с другими калмодулинами. Деконволхоция кривых тепловой денатурации мутантов также дает два перекрывающихся перехода "все или ничего" (рис. 7D, табл. 4). Параметры перехода для мутантов (температура перехода, Tt; энтальпия перехода, ДН>), особенно для первого перехода, отличаются от таковых для SynCaM, Это доказывает, что электростатические взаимодействия играют значительную роль в стабилизации нативпой структуры ano-SynCaM.

Замена кислотного кластера 82-84 основным в SynCaM (SynCaM8, табл. 4, данные для 50 мМ буфера) приводит к повышению температуры первого перехода на 8,9°С, а второго - на 2,7°С. При замене кислотного кластера 118-120 на основной (SynCaM 12А), как Tt1, так и Tt2 становятся несколько ниже, чем для SynCaM. В случае SynCaM 18А, содержащего обе эти мутации, ТИ значительно снижается (на 7°С) по сравнению с SynCaM, а Ti2 равна таковой для SynCaM. Из этого сравнения следует, что влияние одновременной замены двух кислотных кластеров в SynCaM 18А не является суммой раздельных эффектов каждой из замен в SynCaM8 и SynCaM 12А. Эти данные в качественном отношении согласуются с различиями в электростатической энергии стабилизации мутантов SynCaM по сравнению с SynCaM, рассчитанными Weber et al. (1989).

С этой точки зрения мы проанализировали различия между температурами перехода второго и первого деконволюционных пиков (ДТ|, табл. 4) для SynCaM и его мутантов, чтобы оценить влияние мутаций на различие в термостабильности N-и С-концевых долей. Замена кластера 118-120 в SynCaM (данные для 50 мМ буфера) не влияет на различие в термостабильности долей (ДТ| равно, соответственно, 20°С и 20,8°С для ano-SynCaM 12А и ano-SynCaM). Эта величина снижается для ano-SynCaM8 (ДТ,= 14,6°С) и возрастает для ano-SynCaM 18А (ДТ( = 28,7°С), что указывает на возрастание взаимного влияния долен друг на друга в ano-SynCaM8 и на его уменьшение в ano-SynCaM 18А относительно ano-SynCaM. Это согласуется с нашими данными по теплоемкости нативного состояния мутантов SynCaM (табл. 4): чем ниже ATt, тем ниже удельная теплоемкость и, следовательно, структурная гибкость.

Температурная зависимость энтальпии перехода. Анализ данных по плавлению С- и N-концевых долей (табл. 4) показывает, что вызванное мутациями изменение температуры перехода сопровождается изменением соответствующих величин энтальпии перехода. Чтобы установить существует ли четкая корреляция между

этими параметрами, мы построили график зависимости энтальпии перехода от Т| для плавления апо-ЭупСаМ и его мутантов в 50 мМ буфере (рис, 8), Сходные зависимости были получены при плавлении калмодулинов в 10 мМ буфере. Точки для всех белков (кроме второго перехода для 8упСаМ18А) ложатся на две прямые линии, соответствующие двум переходам. Эти данные показывают, что электростатические мутации влияют на параметры тепловой денатурации апо-БупСаМ и его мутантов, подобно влиянию рН на параметры тепловых переходов в мультидоменных белках.

Тот факт, что у всех калмодулинов обнаружена одинаковая температурная зависимость энтальпии первого перехода (рис. 8), т. е. для С- концевой доли, позволяет предположить, что и глобулярная структура этой доли должна быть одной и той же у апо-БупСаМ и его мутантов. Аналогичный вывод может быть сделан и в отношении Л-концевой доли БупСаМ, 5упСаМ8 и 5упСаМ12А (рис. 8). Величина энтальпии второго перехода для апо-8упСаМ18А значительно ниже ожидаемой для температуры второго перехода, которая близка к таковой для апо-ЭупСаМ (рис, 8). Из этого мы делаем вывод о том, что один домен в М-концевой доле апо-5упСаМ18А имеет глобулярную структуру, подобную его структуре в апо-БупСаМ, в то время как второй домен в этой доле в нативном состоянии полностью или частично развернут. Это согласуется с нашими данными об увеличении гибкости для мутанта ЗупСаМ18А по сравнению с БупСаМ (табл.4). Таким образом, перераспределение зарядов в С-концевой доле и центральной

200

15 Е

3 150

х

<1

100

30 40 50 60 70

ГС)

Рис. 8. Зависимость энтальпии денатурации апо-ЗупСаМ и его мутантов от температуры денатурации для первого (открытые символы) и второго (заполненные символы) деконволюционного пика плавления (50 мМ Ка-какодилатный буфер, рН 7,5): апо-ЗупСаМ (О,•), апо-БупСаМв (□, И), апо-8упСаМ12А (А, А), апо-8упСаМ18А (О, ♦).

спирали ano-SynCaM приводит к существенным конформационлым изменениям в N-концевой доле,несмотря на отсутствие устойчивых прямых контактов между этими долями, что был о продемонстрировано методом ЯМР (Kuboniwa et al., 1995).

Спектры кругового дихроизма синтетических калмодулинов. Спектры КД SynCaM и его мутантов в дальней УФ-обласш (в среде, не содержащей кальция, и в присутствии 1 мМ хлорида кальция) в 50 ыМ какодилатном буфере, рН 7,5 представлены на рис. 9. Общий вид спектров КД сходен для всех синтетических калмодулинов и эти спектры имеют вид, характерный для а-спиральных бачков с двумя минимумами при 208 и 222 нм. На рис.9 видно, что добавление Саг+ оказывает небольшое влияние на спектры КД SynCaM, SynCaMS и SynCaM 18А. Только в случае SynCaM 12А добавление кальция приводит к заметному увеличению амплитуды полос КД.

Амплитуды экстремумов спектров КД позволяют сделать вывод о высоком содержании а-спиралей во всех изученных калмодулинах, кроме SynCaM 18А. Эллиптичность полипептидной цепи при 222 нм обычно считается индексом ее а-спиральности (Chen et al., 1972), а точность абсолютного определения степени спиральности по КД составляет около 5% для белков с высоким содержанием спиральных участков. Мы применили этот подход для оценки доли а-спиралей в калмодулинах (табл. 5). Наибольший процент а-спиралей обнаружен в 50 мМ буфере в SynCaM8 (72-73%) и в SynCaM (60-63%). Это сравнимо со значением 63%, полученным из данных рентгеноструктурного анализа кристаллов Са2+-СаМ с разрешением 1,7 А. Существенно ниже оказалось содержание а-спиралей в ano-SynCaM 18А (16% в 50 мМ буфере), а добавление кальция повышало его до 19%. Кальций понижает различия в содержании а-спиралей в SynCaM и его мутантах SynCaM8 и SynCaM12A (табл. 5). Полученные результаты показывают, что замена в

о Е

"D

Е и

6> ф

2,

т

о

-2

200 210 220 230 240 250 Wavelength (nm)

0

Рис. 9. Спектры КД БупСаМв (I), вупСаМ (2), БупСаМ!2А (3) и 5упСаМ18А (4) в дальней УФ-области в 50 мМ какодилатном буфере, рН 7,5; спектр КД БупСаМ (5) в 50 мМ НЕРЕ5 буфере, рН 7,5. Сплошные линии - апо-калмодулины, пунктирные линии - в присутствии 1 мМ СаСЬ.

SynCaM кластера кислотных аминокислот 82-84 основными аминокислотами приводит к увеличению содержания спиральных участков, а замещение другого кислотного кластера 118-120 на основной снижает а-спиральность белка. Однако, одновременная замена обоих кластеров в SynCaM не компенсирует их воздействие на спиральность, а наоборот, снижает ее более чем в три раза. Итак, из данных КД следует, что мутации оказывают очень сильное влияние на а-спирали, и при одновременной замене двух кислотных кластеров на основные эффекта аддитивности по спектрам КД не обнаружено.

Необходимо отметить, что абсолютная величина КД при 222 нм обусловлена как общим содержанием а-спиралей в белке, так и степенью их деформации. Наиболее вероятно, что мутации приводят как к изменению количества а-спиральных участков, так и к геометрическим искажениям структуры а-спиралей калмодулинов. Ранее было показано, что центральная а-спираль калмодулина (остатки 65-92) может быть легко деформирована.

В то время как эффект кальция на вторичную структуру калмодулина относительно невелик, влияние молярности какодилатного буфера, напротив, значительно сильнее (табл. 5). Содержание а-спиралей в SynCaM, SynCaM8 и SynCaM 12А значительно выше в 50 мМ буфере, чем в 10 мМ. Эти данные ясно свидетельствуют о наличии в калмодулинах участков, чувствительных к ионам какодилата, которые вызывают возрастание доли спиральной конформации. Это же подтверждается и значительным снижением содержания а-спиралей в ano-SynCaM при замене какодилатного буфера на HEPES (рис. 9, кривые 2 и 5; табл. 5). Bayley & Martin (1992) обнаружили, что 2-метил-2,4-пентандиол (MPD), применяемый вместе с какодилатом для кристаллизации калмодулина, также вызывает увеличение а-спиральности в СаМ. Из наших данных следует, что влияние какодилата на вторичную структуру белка значительно сильнее, чем влияние MPD. Этим подтверждается вывод Bayley & Martin (1992) о том, что конформация калмодулина содержит в водном растворе меньше а-спиральных участков, чем это предполагается по данным ректгеноструктурното анализа кристаллов, выращенных в маточном растворе, содержащем 50 мМ какодилат и MPD.

О локальной структуре и окружении боковых групп ароматических аминокислот белка можно судить по спектрам КД в ближней УФ-области. Изученные калмодулины ие содержат триптофана и имеют только один С-концевой тирозин (Туг 138) и девять фенилаланинов. В ближней УФ-области спектры КД всех апо-калмодулинов имеют идентичную форму и равные величины экстремумов. Хорошо видны острые отрицательные минимумы КД при 262,7 и 269,1 нм, характерные для фенилаланинов. Единственный тирозин дает широкую положительную полосу в спектре КД вблизи 280 нм.

Из данных рентгеноструктурного анализа следует, что в Са2*-СаМ присутствуют следующие а-спиральные участки: остатки 5-19, 29-37, 45-55 в N-концевой доле и 102-111, 118-128, 138-146 в С-концевой доле (спиральность в этих областях составляет 44%), а также длинная центральная а-спираль 65-92, соединяющая обе доли (спиральность равна 19%). Недавно методом

Таблица 5. Расчет содержания а-спиралей в 5упСаМ и его мутантах, Гц, из

[0]222* (Ыа-какодилатный буфер, рН 7,5)

50 мМ буфер 10 мМ буфер

образец Са2+-свободный Са2+- насыщенный Са2+-свободный Са2+- насыщенный

SynCaM 0,60 (0,30") 0,63 0,40 (0,32") 0,45

SynCaM8 0,72 0,73 0,50 0,50

SynCaM 12А 0,45 0,54 0,32 0,38

SynCaM18A 0,16 0,19 0,28 0,23

'Расчет проводили по уравнению: fk = -([0]222 + 2340)/30300 (Chen et al„ 1972).

"Содержание а-спиралей в апо-БупСаМ в НЕРЕБ буфере, рН 7,5.

ЯМР-спектроскопии была определена трехмерная структура не содержащего Са2+ калмодулина в растворе (КиЬош\уа е1 а!., 1995) и выявлены а-спиральные участки, идентичные обнаруженным ранее методом рентгеноструктурного анализа. Остатки ароматических аминокислот присутствуют в одних и тех же участках полипетидных цепей природных и синтетических калмодулинов, и все они (кроме РЬе99) расположены в а-спиралях 5-19 (РЬе12, РЬе16 и РЬе19), 138-146 (Туг138 и РЬе141) и на концах центральной а-спирали 65-92 (Р))е65, РЬе68, РЬе89 и РЬе92). Постоянство спектров КД всех калмодулинов в ближней УФ-области позволяет сделать вывод о том, что локальная структура ароматических остатков и локальное окружение их боковых групп не изменяются в результате мутаций в ЗупСаМ, хотя вторичная структура подвергается значительным трансформациям (табл. 5). Можно предположить, что в 8упСаМ18А, где содержание а-спиральных участков наименьшее, разрушены четыре а-спирали, не содержащие ароматических остатков (29-37, 45-55, 102-111 и 118-128), а также центральная часть а-спирали 65-92.

Таким образом, мутации, влияющие на электростатический потенциал молекулы, приводят к нарушениям вторичной структуры БупСаМ при сохранении трехмерной структуры белка в областях расположения ароматических аминокислот. Наиболее вероятно, что БупСаМ и его мутанты различаются как по содержанию а-спиральных участков, так и по степени деформации а-спиралей. Данные по температурной зависимости энтальпии перехода (рис. 8) указывают на то, что мутанты БупСаМ образуют гидрофобные ядра в^и С-концевых долях, сходные с таковыми в 8упСаМ. Таким образом, изменения вторичной структуры не влекут за собой изменения гидрофобных взаимодействий, и спектры КД в ближней УФ-области скорее отражают деформацию а-спиралей, чем изменение их количества. В случае БупСаМ18А значительное снижение энтальпии денатурации вместе с малой степенью а-спиральности (табл. 4,5) служит доказательством разрушения а-спиральных участков.

Исследования калмодулина в различных лабораториях выявили ряд противоречий, т. к. полученные экспериментальные данные несколько различались. Яркой иллюстрацией этого служит относительное несоответствие структурных данных, полученных методами рентгеноструктурной дифракции или ЯМР, результатам исследования спектров КД. При сравнении выявляется различие в содержании а-спиралей. Поэтому калмодулин считали "плохим" белком, не подчиняющимся общим правилам, применяющимся при интерпретации спектров КД. В данной работе мы продемонстрировали сильное влияние молярности какодилата на структуру белка. Это позволяет предположить либо влияние ионной силы, либо специфическое действие иона какодилата. Мы склонны ко второй интерпретации, поскольку замена какодилата на НЕРЕЗ снижает количество участков в спиральной конформации.

На5есЬ е1 а1. (1991) показали, что К-концевая доля вупСаМ обладает более низким сродством к кальцию, чем С-концевая. Таким образом, наши данные указывают на обратную зависимость между сродством к кальцию и термостабильностью. Мы показали, что молекула апо-5упСаМ в растворе обладает большей гибкостью, чем другие малые белки. Замена в БупСаМ блоков кислотных остатков на блоки основных аминокислот продемонстрировала роль электростатических взаимодействий в гибкости и стабильности этого белка. Гибкость апо-ЭупСаМ не меняется после замены блока в С-концевой доле и снижается в результате замены блока в центральной а-спирали, что подтверждает ее роль в поддержании гибкости молекулы. Одновременная замена обоих блоков в мутанте 5упСаМ18А приводит к значительному повышению гибкости калмодулина. Анализируя параметры плавления 5упСаМ18А и его спектры КД, мы пришли к выводу, что один домен в М-концевой доле в нативном состоянии развернут. Этим объясняется самая высокая гибкость и самое низкое содержание а-спиралей в мутанте 5упСаМ18 А.

Итак, перераспределение зарядов в С-концевой доле и центральной а-спирали апо-ЭупСаМ приводит к существенным конформационным изменениям в Ы-концевой доле, несмотря на отсутствие устойчивых прямых контактов между двумя долями в молекуле апо-СгМ, что было продемонстрировано методом ЯМР (КиЬош\уа ег а1., 1995). Наши данные показывают, что обе доли не являются независимыми и взаимодействия между ними обусловлены электростатическим потенциалом молекулы. Драматический эффект, наблюдаемый для двойного мутанта ЗупСаМ18А, указывает на дальнодействующее влияние электростатических взаимодействий на конформацию всей молекулы.

выводы

1) Методами микрокалориметрии и кругового дихроизма изучено влияние блочных мутаций на конформацию и параметры тепловой денатурации бактериальных рибонуклеаз и кальций-связывающего белка калмодулина.

2) Показано, что тепловая денатурация рекомбинантных биназы, барназы и их гибридов является переходом между двумя состояниями. Установлены участки барназы и биназы, определяющие тип термостабильности гибрида по отношению к исходным рибонуклеазам и чувствительность структуры белка к изменению величины рН.

3) Продемонстрировано, что изменения свободной энергии денатурации вследствие мутаций в барназе, определенные по данным тепловой денатурации и по денатурации мочевиной, совпадают, и влияние блочных замен на стабильность барназы аддитивно. Исключением является гибрид "26-1)0", для которого обнаружен кооперативный эффект воздействия мутаций.

4) Обнаружено, что различия в свойствах биназы и барназы усиливаются в комплексе с белковым ингибитором барстаром. Установлена возможность регуляции термостабильности рибонуклеаз за счет образования комплехса с барстаром.

5) Показано, что тепловая денатурация не содержащего кальция калмодулина и его мутантов, в которых блоки кислотных остатков заменены на блоки основных остатков, состоит из двух переходов между двумя состояниями, отражающих плавление двух долей белка. Установлена обратная зависимость между сродством долей к кальцию и их термостабильностью, обнаружено специфическое влияние ионов какодилата на содержание а-спиралей в белке.

6) Установлена важная роль электростатических взаимодействий в стабильности и гибкости апо-калмодулина. Показано, что две его глобулярные доли не являются независимыми и взаимодействия между ними обусловлены электростатическим потенциалом молекулы.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1) Yakovlev G.I., Moiseyev G.P., Protasevich I.I., Ranjbar В., Kirpichnikov M.P., Gilli R.M., Briand C.M., Hartley R.W., Makarov A.A. "Dissociation constants and thermal stability of complexes of Bacillus iniermedius RNase and the protein inhibitor of Bacillus amyloliquefaciens RNase". // FEBS Letters. 1995. V. 366. P. 156-158.

2) Protasevich I.I., Ranjbar В., Yakovlev G.I., Makarov A.A. "Thermostability of protein complexes with different inhibitors". //J. Biomol. Struct. Dyn. 1995. V. 12. P. al92.

3) Ranjbar В., Protasevich I., Lobachov V., Makarov A., Gilli R., Briand C., Lafitte D., HaiechJ. "Differential scanning calorimetric and circular dichroism studies of calcium-free calmodulin and its mutants". // In: Proceedings of the IV European Symposium on Calcium Binding Proteins in Normal and Transformed Cells, R. Donato, Ed., Perugia, Italy. 1996. P. 141-142.

4) Schulga A.A., Kurbanov F.T., Levichkin I.V., Ranjbar В., Protasevich I.I., Kirpichnikov M.P. "Interbreeding of related proteins: the study of hybrid growth hormones and RNases". // In: Abstracts of the International Bayev Memorial Conference, Moscow, Russia. 1996. P. 278.

5) Schulga A.A., Kurbanov F.T., Ranjbar В., Protasevich I.I., Makarov A.A., Kirpichnikov M.P. "Mapping of functionally and structurally important regions in bacterial ribonucleases: study of himeric barnase/binase proteins". II In: Abstracts of the 4th International Meeting "Ribonucleases: Chemistry, Biology, Biotechnology", Groningen, The Netherlands. 1996. P. S1P14.

6) Gilli R., Protasevich I., Lafitte D., Ranjbar В., Haiech J., Makarov A., Briand C. "Microcalorimetric study of calmodulin: thermal denaturation and interaction with calcium". И In: Abstracts of the First International Conference on the Applications of Biocalorimetry, Oxford, UK. 1996. P. 07.

7) Protasevich I., Ranjbar В., Lobachov V., Makarov A., Gilli R., Briand C., Lafitte D., Haiech J. "Influence of electrostatic mutations on conformation and thermal denaturation parameters of apocaJmodulin". // J. Biomol. Struct. Dyn. 1997. V. 14. P. a207.

8) Ранджбар Б., Протасевич И.И., Шульга А.А., Курбанов Ф. Т., Лобачев, В.М., Кирпичников М.П., Макаров А.А. "Барназа, биназа и их гибриды: отличия в конформации и параметрах тепловой денатурации". // Молекулярная биология. 1997. Т. 31. С. 492-499.

9) Protasevich I., Ranjbar В., Lobachov V., Makarov A., Gilli R., Briand С., Lafitte D., Haiech J."Conformation and thermal denaturation of apocalmodulin: role of electrostatic mutations". // Biochemistry. 1997. V. 36. P. 2017-2024.