Тепловая денатурация различных изоформ тропомиозина в отсутствие и в присутствии F-актина

Кремнева, Елена Валериевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Тепловая денатурация различных изоформ тропомиозина в отсутствие и в присутствии F-актина
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Тепловая денатурация различных изоформ тропомиозина в отсутствие и в присутствии F-актина"

На правах рукописи

КРЕМНЕВА Елена Валериевна

}

Тепловая денатурация различных изоформ тропомиозина в отсутствие и в присутствии Р-актина

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2005

Работа выполнена в лаборатории молекулярной организации биологических структур Института биохимии им. А. Н. Баха РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Д. И. Левицкий

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор С. С. Шишкин доктор физико-математических наук А. К. Цатурян

Ведущая организация:

Биологический факультет МГУ им. М. В. Ломоносова

Защита состоится « /3 » декабря 2005 года в часов на заседании диссертационного совета К 002.247.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук в Институте биохимии имени А. Н. Баха РАН по адресу: 119071 Москва, Ленинский проспект, 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы по адресу: 119071 Москва, Ленинский пр-т. 33, корп. 2

Автореферат разослан « 51 » октября 2005 года

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

'ШЪЧИЬ

ОБШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В основе биологической подвижности всего живого лежит всего несколько молекулярных механизмов. В случае эукариотических клеток наиболее распространенной считается актомиозиновая система подвижности, основанная на взаимодействии миозина и актина. Именно это взаимодействие ответственно за сокращение мышц и многие процессы клеточной подвижности.

Мышцы представляют собой высоко специализированные органы, состоящие из пучков мышечных волокон. Зрелое мышечное волокно практически полностью заполнено миофибриллами, сформированными из системы перекрывающихся толстых и тонких нитей, образованных сократительными белками. В структуре миофибриллы выделяют систему одинаковых повторяющихся элементов, так называемых саркомеров. Саркомер ограничен с двух сторон Z-дисками. К этим дискам с обеих сторон прикрепляются тонкие актиновые нети. В середине саркомера располагается система толстых нитей, построенных из другого сократительного белка - миозина.

В ходе сокращения миозин взаимодействует с актином и начинает тянуть нити актина к центру саркомера. Вследствие такого движения уменьшается длина каждого саркомера и всей мышцы в целом, не изменяя при этом длины актиновых и миозиновых нитей. В основе молекулярного механизма сокращения мышц лежат структурные изменения, происходящие в миозиновой головке при гидролизе АТР и при взаимодействии с актиновым филаментом. В процессе этого взаимодействия происходит превращение химической энергии гидролиза АТР в механическую энергию движения. Для регуляции этого взаимодействия в мышцах существуют специальные белковые системы [цит. по Поглазов, Левицкий, 1982].

Необходимость существования системы регуляции сократительной активности объясняется тем, что мышца не могла бы выполнять свои функции, если бы она постоянно находилась в сокращенном состоянии. Регуляция взаимодействия миозиновых и актиновых филаментов в мышце осуществляется ионами Са2+. Иначе говоря, основная задача регуляторных систем состоит в отслеживании изменения концентрации Са2+ внутри клетки (с 10*7 до 10'5 М). Регуляторные белки могут располагаться либо на тонких, либо на толстых филаментах. В поперечнополосатых и сердечных мышцах основным является акгиновый тип регуляции, главную роль в котором играют тропомиозин и тропонин, ассоциированные с тонким (актиновым) филаментом. В состоянии расслабления, когда

кешБЧПРШУнЯОД&адого Са в БИБЛИОТЕКА j CneratftortfY/ I 9»

мышце очень мала, тропомиозин закрывает сайты связывания миозина на актиновом филаменге, стерически блокируя взаимодействие миозина с актином. Связывание Са2+ с тропониновым комплексом позволяет сдвинуть тропомиозин из этого положения, что делает возможным связывание миозина с актином, приводящее к генерации силы. Эта теория получила название «механизма стерического блокирования». Суть его состоит в том, что структурная единица «7 мономеров актина-тропомиозин-тропонин» находится в динамическом равновесии между тремя разными состояниями, которые отражены в различном расположении нити тропомиозина на актиновом филаменте. Эти состояния принято обозначать как «blocked» (связывание миозина с актином невозможно), «closed» (разрешено только «слабое» связывание) и «орел» (осуществляется изомеризация акгомиозинового комплекса и переход «слабого» связывания в «сильное») [McKillop & Geeves, 1993; Vibert et al., 1997]. Таким образом, тропомиозин (ТМ) играет ключевую роль в регуляции сокращения поперечнополосатых и сердечных мышц. Помимо этого, во всех типах мышц и во многих немышечных клетках эукариот ТМ связан с актином, сильно повышая кооперативность актиновых филаментов. Однако многие особенности структурного состояния ТМ на поверхности актиновых филаментов остаются до сих пор неясными. Одним из подходов, применяемых для выяснения таких особенностей, является исследование характера тепловой денатурации ТМ непосредственно на поверхности актиновых филаментов с использованием метода дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) в сочетании с другими методами [Levitsky et al., 2000].

Цель и задачи работы. Целью данной работы было исследование с помощью различных методов характера тепловой денатурации разных изоформ ТМ в отсутствие и в присутствии актина, включая мышечные ТМ с мутациями в молекулах и немышечные ТМ различной длины, а также влияние на него других регуляторных белков. В соответствии с указанной целью были поставлены следующие задачи:

1. Методом ДСК изучить влияние актина и тропонина на тепловую денатурацию ТМ.

2. Исследовать влияние кардиомиопатических мутаций (D175N и E180G) в ТМ на характер его тепловой денатурации в отсутствие и в присутствии F-актина.

3. Используя дрожжевые ТМ различной длины, изучить влияние структуры ТМ на характер его тепловой денатурации.

4. Используя ТМ фибробластов в сравнении с гладкомышечным ТМ, изучить влияние замен участков, кодируемых определенными экзонами, на характер тепловой денатурации ТМ.

5. Провести сравнительный анализ тепловой денатурации связанного с актином ТМ, исследуемой методом ДСК, и температурных зависимостей диссоциации ТМ с поверхности актинового филамента, исследуемых по изменениям светорассеяния. На основании такого анализа представить механизм тепловой денатурации связанного с

| актином ТМ.

' Научная новизна. Разработаны новые подходы на основе сочетания метода

ДСК с измерениями температурных зависимостей светорассеяния для регистрации изменений характера тепловой денатурации ТМ, происходящих в результате его связывания с F-актином. Это позволило впервые описать механизм тепловой денатурации ТМ в присутствии F-актина, а также впервые объяснить существенную разницу в физиологических эффектах двух кардиомиопатических мутаций в молекуле ТМ, D175N и E180G. Помимо этого, методом ДСК в сочетании с другими методами (КД, светорассеяние) впервые проведены исследования тепловой денатурации немышечных ТМ фибробластов и дрожжей.

Научно-практическая ценность. Работа имеет важное значение для дальнейших исследований влияния различных факторов, таких как точечные мутации или изменения целых участков в молекуле ТМ, на тепловую денатурацию ТМ в отсутствие и в присутствии актина. Разработаны калориметрические подходы, позволяющие регистрировать плавление белков с 'низкой кооперативностью. Представлена модель, хорошо описывающая денатурацию ТМ в присутствии F-актина. На основе комплексов ТМ, актина и различных компонентов тропонинового комплекса было смоделировано состояние «blocked» и проведены его исследования методом ДСК.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на Международных симпозиумах «Биологическая подвижность» (г. Пущино Московской области, 2001; 2004), на Ш-м Съезде Биохимического Общества (г. Санкт-Петербург, 2002), на 31-й, 32-й, 33-й и 34-й Европейских мышечных конференциях (г. Люнтерен, Голландия, 2002; г. Монпелье, Франция, 2003; о. Эльба,

Италия, 2004; г. Дебрецен, Венгрия, 2005), на 49-м Ежегодном Съезде Биофизического общества (г. Лонг-Бич, Калифорния, США, 2005), и на конкурсе лучших научных работ, выполненных в Институте биохимии им. А. Н. Баха в 2003 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (6 глав), описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения (4 главы), выводов и списка цитируемой литературы (/S3источников). Диссертация изложена на /¿^"страницах, содержит ¿/Ъ рисунков и 3 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературы.

В обзоре литературы рассмотрены современные представления о механизме и регуляции мышечного сокращения и о белках, участвующих в этом процессе. Основное внимание уделено тропомиозину (ТМ) - его структуре и функциям, а также анализу имеющихся в литературе данных о его тепловой денатурации.

Материалы и методы исследования.

Актин выделяли из ацетонового порошка скелетных мышц и очищали двумя циклами полимеризации-деполимеризации [Spudich & Watt, 1971]. За час до использования мономерный G-актин полимеризовали, добавляя MgCl2 до конечной концентрации 5 мМ, и использовали в F-форме. Для калориметрических экспериментов F-актин стабилизировали добавлением фторида алюминия до конечной концентрации 0,5 мМ или 1,5-кратного молярного избытка фаллоидина. Гладкомышечный ТМ из мускульных желудков утки, ТМ и тропонин из скелетных мышц кролика были любезно предоставлены проф. Н.Б. Гусевым (кафедра биохимии Биологического факультета МГУ). При получении рекомбинантных ТМ использовались клоны гладкомышечного ТМ, мутантных дрожжевых и фибробластных ТМ (ТМ5а и ТМ5Ь), любезно предоставленные д-ром Р. Майтумом (Dr. R. Maytum, Department of Biosciences, University of Kent at Canterbury, Великобритания). Все эти клоны трансформировались в клетки BL-21 (pLys), затем

осуществлялась экспрессия и очистка белков [Maytum et al., 2001, 2004] Для получения полностью восстановленных ТМ препарат белка инкубировали в присутствии 20 мМ Р-меркапроэтанола ((3-МЭ) 60 мин при 60°С, затем 10 мин при 70°С [Kremneva et al., 2004]. Концентрации белков определяли спектрофотометрически, используя коэффициенты поглощения Е1%290лт= 6,6 см'1 для актина, Е>%гШт= 1,9 см"1 для гладкомышечного ТМ, E1%276nm = 3,1 см"1 и E1%280nm = 4,7 см"1 для скелетного ТМ и тропонина, соответственно, Е1%280пт= 1,41 см"1 и 1,61 см'1 для рекомбинантного гладкомышечного ТМ (SmTm) и фибробластных ТМ 5а/5Ь, соответственно, E1%278nm= 1,38 см"' и E1%2gonm= 1,2 см'1 для дрожжевых ТМ1 и ТМ2, соответственно.

Калориметрические исследования проводили на дифференциальном адиабатическом сканирующем микрокалориметре ДАСМ-4М (Институт биологического приборостроения РАН, г. Пущино) с капиллярными платиновыми ячейками объемом 0.47 мл. Измерения проводили при скорости нагрева 1 градус в минуту в диапазоне температур от 12 до 100°С. Базовую линию записывали, помещая в рабочую и контрольную ячейки используемый в опыте буфер. После охлаждения ячеек до 5°С из рабочей ячейки отбирали буфер и помещали в нее препарат белка в том же буфере. Для проверки обратимости тепловой денатурации исследуемых белков, после первого сканирования и последующего охлаждения образцов проводили их повторное сканирование. Тепловая денатурация ТМ была обратима, тогда как актин плавился необратимо. В некоторых случаях для выявления пиков с низкой кооперативностью применялся слегка измененный метод ДСК. Для этого калориметрические измерения проводились двумя способами: стандартным и модифицированным, когда тот же белок помещен в ячейку сравнения, а буфер - в опытную ячейку. Далее из кривой, полученной стандартным образом, вычиталась кривая, полученная модифицированным способом; это позволяло избежать артефактов, вызываемых вычитанием инструментальной базовой линии, и удвоить белковый сигнал. Затем результирующую кривую делили на два для получения реального значения этого сигнала. Для обработки и анализа кривых теплопоглощения изученных белков использовали пакеты программного обеспечения „Origin 1,16" и „Origin 7,0" фирмы „MicroCal" (США). Процедура деконволюции проводилась с использованием программы «Origin 1,16» (MicroCal).

Вискозиметрические измерения проводили при 18,5°С с использованием капиллярного вискозиметра Освальда. Относительную вязкость (t|rC|) вычисляли как отношение времен протекания белка и буфера.

Спектры кругового дихроизма (КД) в дальнем ультрафиолете определяли на дихрографе Mark V (Jobin Yvon) при 20°С. Температурные зависимости средней остаточной эллиптичности при 222 nm (В222) регистрировали в интервале от 10°С до 60°С при скорости нагрева 1°С/мин; рабочая концентрация ТМ составляла 0,1 мг/мл.

Сродство ТМ к актину определяли методом соосаждения при 20°С F-актин (10 цМ) смешивали с ТМ (0-3 цМ) до конечного объема 100 ц1. Затем пробы центрифугировали при 100000 g в течение 20 мин (Beckman TL100A), осадок растворяли в исходном объеме буфера и анализировали содержание белков в супернатанте и осадке методом SDS-электрофореза в 13.5 % ПААГ.

Температурные зависимости диссоциации комплекса TM-F-актин регистрировали по изменениям светорассеяния при угле в 90° [Wegner, 1979; Levitsky et al., 2000; Kremneva et al., 2004]. Эксперименты проводили при длине волны 350 нм на флуоресцентном спектрофотометре Сагу Eclipse (Vanan, Австралия), оборудованном температурным блоком, позволяющим поддерживать постоянную скорость нагрева (такую же, как в калориметрических экспериментах, т. е. 1 градус в минуту) и контролировать температуру в ячейках.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Взаимодействие скелетного тропомиозина с актином и тропоиином.

На первом этапе работы методом ДСК были проведены исследования тепловой денатурации ТМ из скелетных мышц кролика и его комплексов с Б-актином и тропонином.

1.1. Тепловая денатурация скелетного ТМ. При тепловой денатурации ТМ скелетных мышц удается выявить два хорошо различимых тепловых перехода, при этом низкотемпературный переход (с максимумом при 42,8°С) отражает денатурацию С-концевой части молекулы ТМ с восстановленной БН-группой остатка Суз-190, а высокотемпературный переход (с максимумом при 53,8°С) соответствует плавлению Ы-концевой части молекулы ТМ. Известно, что образование дисульфидного мостика

6 40

о. и 20

C190S а-ТМ

между SH-группами остатков Cys-190 двух соседних мономеров ТМ увеличивает термостабильность С-концевого участка ТМ. В результате тепловой переход С-концевого участка начинает совпадать по положению с тепловым переходом N-

концевого участка молекулы ТМ и почти накладывается на него (рис. 1).

Рис. 1. Температурные зависимости избыточного теплопоглощения (Ср) и их деконволюционный анализ для сшитого скелетного а-ТМ (А), восстановленного а-ТМ (Б) и рекомбинантного а-ТМ с восстановленный мутацией C190S (В). Концентрация всех

vrt а-™ Д Б ТМ - 20 цМ. Скорость нагрева 1К/мин.

Съемки кривых тепловой денатурации ТМ при различных 1 скоростях нагрева показали, что В термограммы белка не зависят от заданной скорости и практически не /А /г\ ! меняются при повторном прогреве

/ \ / \ Í препарата. Таким образом, плавление

1 ТМ является полностью обратимым и 20 зо 40 50 60 70 термодинамически равновесным

TeMnepaiypa (°С) процессом. В результате для анализа

кривых ТМ может быть использован деконволюционный подход. Термограмма восстановленного ТМ может быть разложена на два независимых перехода (калориметрических домена) с максимумами при 42.7°С и 50.0°С, составляющих 52% и 48% от полной калориметрической энтальпии ТМ, соответственно (рис. 1Б). В случае ТМ со сшитыми SH-группами на термограмме также были выявлены два домена, но при более высоких температурах -50 и 54.3°С (рис. 1А). Для проверки предположения, что сшивка по остаткам Cys-190 приводит к сдвигу максимума пика, мы провели исследование тепловой денатурации ТМ с заменой цистеина на серии (C190S а-ТМ). Этот мутантный ТМ потерял способность к образованию сшивок между цепями, а профиль его тепловой денатурации стал очень похож на 1ермограмму восстановленного ТМ (рис. 1В).

1.2. Взаимодействие ТМ с актином. Исследование комплексов, образованных ТМ скелетных мышц и актином, показало, что в присутствии актина заметно

изменяется характер тепловой денатурации ТМ (рис. 2А), что выражается в возникновении нового теплового перехода с максимумом при 48°С, соответствующего денатурации связанного с актином ТМ (рис. 2Б). При этом взаимодействие ТМ с актином не оказывало влияния на тепловую денатурацию Р-актина, стабилизированного фаллоидином или фторидом алюминия, который денатурировал при температурах выше 70°С.

Рис. 2. Кривые ДСК для комплекса скелетного ТМ с Р-акшном (А) и для области денатурации ТМ в присутствии (1) и в отсутствие (2) Р-актина (Б). Для сравнения показаны тепловые переходы свободного ТМ (16 цМ) (2) и Р-актина (24 цМ) (3), стабилизированного фторидом алюминия.

Для выявления изменений в денатурации ТМ, вызванных связыванием с актином, мы применяли систему повторных нагревов и охлаждений непосредственно в ячейках калориметра. Первый прогрев проводился до 65°С и показывал плавление связанного с актином ТМ. Затем, сразу после охлаждения до 5°С, препарат подвергался повторному нагреву до 90°С. При этом профиль денатурации связанного с актином ТМ вплоть до 65°С был идентичен первому прогреву, тем самым подтверждая обратимость денатурации ТМ. Дальнейший нагрев приводил к необратимой денатурации актина. В течение третьего прогрева наблюдалось плавление свободного ТМ.

При разложении кривой, полученной при первом прогреве, выявлены 3 отдельных перехода (рис. 3). Два из них (калориметрические домены 1 и 2) соответствуют плавлению свободного ТМ, а новый пик АТ с максимумом при 46.6°С появляется лишь в присутствии актина и соответствует плавлению связанного с актином ТМ.

Температура (°С)

200

150

100

■и. 501-

"о

£ оь

"—1 200 ь

О 150

100

1- прогрев й А

3-й прогрев Б

1 1 "*Г" г г..... ]

Рис. 3. Деконволюционный анализ калориметрических кривых комплекса восстановленного рекомбинантного чЛ а-ТМ с Р-актнном, стабилизированным фаллоидином, полученных при первом (А) и третьем (Б) прогревах. Сплошная линия -экспериментальная кривая после вычитания инструментальной и «химической» базовых линий. Пунктиром показаны отдельные тепловые переходы (калориметрические домены), полученные при обработке экспериментальных данных по модели «поп-1\го-51а1е». Концентрация ТМ - 15 цМ, Б-актина - 46 цМ.

Эксперименты, проведенные при разных концентрациях ТМ и постоянной концентрации актина, показали, что вызываемый актином пик АТ формируется, главным образом, из наименее термостабильного домена ТМ, а именно из С-концевой части ТМ с восстановленными вН-группами остатков Суз-190.

1.3. Регулируемый актиновый филамент. Прежде чем приступить к

калориметрическому исследованию комплекса Р-актин-ТМ-тропонин (Тп), мы определили величину функциональной активности этого комплекса; она составила 0.78, что свидетельствовало об эффективной сборке регулируемого актинового филамента.

30 40 50 60

Температура (°С)

Рис. 4. Эффект тропонина (Тп) на тепловую денатурацию связанного с актином скелетного ТМ в присутствии 1 мМ ЕОТА (А) или 0.5 мМ Са2+(Б). Концентрации белков: ТМ - 25 цМ, Р-актин - 35 цМ, Тп - 25 рМ. Для сравнения показаны кривые ТМ (1), Тп (2) и их комплекса (ТМ-Тп), полученные в отсутствие (3) или в присутствии (4) Р-актина. Область температур выше 70°С, соответствующая денатурации актина, стабилизированного фторидом алюминия, не показана.

20 30 40 50 60

Температура (°С)

Исследование комплекса ТМ Тп показало, что его термограмма представляет собой простую суперпозицию кривых, соответствующих изолированным ТМ и Тп. Добавление актина приводит к существенному изменению тепловой денатурации комплекса ТМ-Тп (рис. 4), отражающемуся в значительном увеличении кооперативности высокотемпературного перехода. Эти данные свидетельствуют о том, что при добавлении тропонина к связанному с F-актином ТМ образуется качественно новый комплекс белков, обладающий кооперативным тепловым переходом с максимумом при 51,7°С в отсутствие Са2+ (рис. 4А) и при 50,3°С в присутствии Са2+ (рис. 4Б). В отсутствие кальция, т.е. в условиях, соответствующих состоянию «blocked», такой комплекс обладает наиболее выраженным кооперативным переходом, который отражает плавление комплекса ТМ-Тп, связанного с актином. Для упрощения анализа полученных результатов была исследована тепловая денатурация связанного с актином ТМ в присутствии изолированных компонентов тропонинового комплекса. Показано, что ни тропонин I (Tnl), ни тропонин Т (ТпТ), ни их эквимолярный комплекс не обладают кооперативными тепловыми переходами в интервале температур от 5 до 100°С. В отсутствие актина ТпТ и Tnl (добавленные как по отдельности, так и одновременно) не оказывали заметного влияния на тепловую денатурацию ТМ. В то же время, в присутствии F-актина добавление ТпТ или эквимолярной смеси TnT+Tnl заметно

увеличивали термостабильность связанного с актином ТМ и кооперативность его теплового перехода (рис. 5).

Рис. 5. Кривые ДСК связанного с актином ТМ в отсутствие (1) и в присутствии ГпТ (2), Тп! (3) или ТпТ+Тп1 (4). Концентрация белков. Г-актин (стабилизированный фторидом алюминия) - 24 цМ, ТМ - 16 цМ, Тп1 - 16 цМ, ТпТ - 10 цМ. Область температур выше 70°С не показана.

1 2

1 0

о 04

зо

40 50 60

Температура (°С)

Таким образом, метод ДСК позволяет выявить конформационные изменения связанного с актином ТМ, сопряженные с переходом регулируемого актинового

филамента из состояния «closed» (при наличии Тп и ионов Са2+) в состояние

«blocked» (при наличии Тп в отсутствие Са2+ или при наличии Tnl и ТпТ). Эти

изменения выражаются в заметном увеличении кооперативности тепловой денатурации связанного с актином ТМ.

2. Эффекты кардиомиопатических мутаций в тропомиозине.

Несомненный интерес представляет исследование влияния мутаций в ТМ на его структуру и свойства. Из литературы известно, что две сходные и близко расположенные кардиомиопатические РНС мутации в сердечном а-ТМ, 0175Ы и Е18(Ю, резко отличаются друг от друга по своим физиологическим эффектам: мутация D175N вызывает лишь легкую сердечную недостаточность, тогда как мутация Е18(Ю зачастую приводит к летальному исходу. Причины столь большой разницы в физиологических эффектах этих двух мутаций до настоящего времени были совершенно непонятны. Мы впервые исследовали влияние этих мутаций в скелетном а-ТМ (сходном с сердечным а-ТМ) на тепловую денатурацию ТМ.

2.1. Влияние РНС мутаций на тепловую денатурацию рекомбинантного ТМ. Сравнение мутантных форм ТМ (0175Ы-ТМ и Е18(Ю-ТМ) с ТМ дикого типа ТМ) показало, что в отсутствие актина тепловая денатурация восстановленного 0175М-ТМ не отличается от таковой для \vt-TM, а в случае Е18(Ю-ТМ единственное существенное отличие заключается в том, что максимумы калориметрических

доменов сдвинуты в область более низких температур (на 1°С для М-концевого домена 2 и на 3,2°С для С-концевого домена 1 (рис. 6 А, В).

Рис. 6. Кривые ДСК для восстановленных 0175Ы-ТМ и Е1800-ТМ, полученные в отсутствие (А, В) и в присутствии (Б, Г) Р-актина. Пунктиром показаны

отдельные тепловые переходы (калориметрические домены) 1 и 2, а также пик АТ, соответствующий связанному с актином ТМ.

Р175М-ТМ>

Е18(Ю-ТМ|

без актина В

20 30 40 50 60 20 30 40 50 60 Температура (°С)

2.2. Сродство ТМ к актину. Связывание с актином восстановленных \vt-TM и его мутантнш форм 01751«1-ТМ я Е1800-ТМ исследовали методом соосажденна. Эти данные обрабатывались при помощи уравнения Хнляа и из них определялись концентрации свободного ТМ, при которых половина молекул ТМ находится в комплексе с актином (К«*). Полученные результаты (коэффициенты Кущ, равные 0,1« цМ для \vt-TM, 041 цМ для Ш75Ы-ТМ и 0,6« цМ для Е18(Ю-ТМ) свидетельствуют о том, что обе ИНС мутации приводят к некоторому снижению сродства ТМ к актину, прячем этот эффект выражен немного сильнее в случае Е180&ТМ. Однако столь малая разница между 0175№ТМ и Е180<3-ТМ в их сродстве к актину вряд ли может обменить значительные различна в физиологических эффектах этих мутаций.

2.3. Тепловая денатурация муяюнтных форм ТМ в их комплексах с актинам. В целом результаты, полученные для 0175Ы-ТМ в комплексе с актином при молярном соотношении ТМ/акпга, равном 1:6 (т.е. когда почти все молекулы ТМ связаны с Р-аютином), совпадают с данными, полученными для ТМ дикого типа (Таблица 1). 7

Таблица 1. Ьлоршетрпеспе параметры тешювой денатурация рекомбиванттюго сгсдсгаого ТМ («Л), Э175№ТМ и Е1800-ТМ в присутствия Р-агпша. Все параметры получены методом деконволюшкмпюго анализа кривых ДСК для 1-го прогрева крмпвюта восстановленного ТМ с актином, спбшшзнроваитш фаллоцдином, и дня 3-е» прогрева после необратимой денатурации Р-аггана. Концентрация ТМ - 7.5 цМ; Р-огпяа - 46

Домев 2 Переход АТ или домея 1 Полная

Наппный (Ы-кояцевая область ТМ) (С-ковдевая область ТМ) эяпльпяя

Р-ажтин т. СО АН (Кот ножной ДН«*) Т.СС) ДН (% от ПОЛНОЙ ДНо|) ДН* (Ы/тЫ)

VI + 51.6 ±0.2 32 45.6 ±02 68 880 ±80

- 50.0 ± 0.2 48 42.7 ±02 52 580 ±50

0175Ы + 50.1 ±02 26 45.6 ±0.2 74 700 ±60

- 50.1 ±02 55 42.9 ±0.2 45 530 ±50

Е18СЮ + 492 ±02 55 41.4 ±02 45 640*60

- 49.0 ±02 74 40.0 ±02 26 500 ±50

В обоях случаях индупнрусмый активом новый тепловой переход AT возникает на термограмме ори 45,6% (рис. 6Б, Таблица I). Напротив, E180G-TM, находясь в комплексе с F-акпшом, сильно отличается от wt-TM и от D175N-TM (рве. 6Б.Г. Таблица 1). В этом случае индуцируемый актином тепловой переход AT возникает на термограмме при 41,4*С, т.е. при гораздо более низкой температуре, чем в случае wt-TM и D175N-TM в тех же условиях (45,6"С), и составляет только 4554 от обшей энгалыши по сравнению с ~ 70% для wt-TM и D175N-TM (Таблица 1).

Таким обрезом, полученные результаты указывают на то, что E180Q-TM существенным образом отличается от wt-TM и D175N-TM по характеру тепловой денатурации в присутствии акпша. Это можно объяснить более низкой стабильностью домена 1 в E180G-TM. В результате стабилизация этого С-концевопо домена, вызванная взаимодействием с актином, мете выражена, чем в случае wt-TM и D175N-TM. Изучение температурных зависимостей светорассеяния, отражающих процесс вызываемой нагреванием диссоциации ТМ с поверхности агпшового филаменп, выявило дополнительные отличия E180G-TM от D175N-TM и ТМ дикого типа (рис.7). Вызванная нагревом диссоциация D175N-TM с поверхности актиновых филаментов очень похожа на диссоциацию ТМ дикого типа (температурный диапазон диссоциации, близкий к интервалу пика AT, составляет в обоях случаях 43-47 °С), за исключением того, что в случае Dl 75N-TM диссоциация представляет собой меяее кооперативный процесс. С другой стороны, E180G-TM диссоциирует с поверхности актива при значительно более низкой температуре (в диапазоне 38-45 °С) и демонстрирует низкую кооперативное» процесса (рис. 7).

Рис. 7. Нормализованные температурные зависимости светорассеяния комплексов wt-TM (A), D175N-TM (Б) и E180G-TM (В) с F-агпгеом, полученные при различных соотношениях TM/amm. Концентрация акпша - 46 рМ. Скорость нагрева 1 °СЛшн.

Сравнение процессов денатурации и диссоциация показывает хорошую

38 36 40 42 44 46 48 90

Температура (°С)

корреляцию между значениями максимума калориметрического пика AT (Tm) и температурой, при которой интенсивность светорассеяния снижается на 50% (Tdiss). Таким образом, изменения в тепловой денатурации ТМ, вызванные взаимодействием с актином (т. е. появление пика AT) связаны с диссоциацией ТМ с поверхности актиновых филаментов.

Важно отметить, что, в отличие от D175N-TM и wt-TM, диссоциация E180G-ТМ с поверхности актиновых филаментов и его денатурация начинаются при температурах, очень близких к температуре тела (37°С). Эти данные впервые позволяют объяснить существенную разницу в физиологических эффектах мутаций D175N и E180G. При повышении температуры тела всего на пару градусов (например, при простуде или при интенсивной мышечной деятельности) ТМ с мутацией E180G (но не D175N) начинает диссоциировать с поверхности актина и денатурировать, что и приводит, видимо, к поражению сердечной мышцы.

3. Предполагаемый механизм тепловой денатурации тропомиозипа в присутствии F-актина.

Сравнение результатов, полученных методами ДСК и светорассеяния, показало хорошую корреляцию между значениями Тт и Т<ц,5. Обе эти величины зависят от молярного соотношения ТМ/актнн и возрастают при увеличении концентрации ТМ, в то время как тепловая денатурация свободного ТМ не зависит от концентрации белка [Levitsky et al., 2000]. Это означает, что вызванная нагревом диссоциация ТМ с поверхности актиновых филаментов зависит от концентрации белка и предшествует его тепловой денатурации. Результаты исследований на различных изоформах ТМ показали, что влияние актина на их тепловую денатурацию зависит от разницы между температурой диссоциации (Td,ss) и температурой денатурации свободного TM (Тт). Вызванные актином изменения максимальны в том случае, когда ТМ денатурирует в отсутствие актина при значительно более низких температурах, чем Tdlss. Например, такие изменения (т. е. появление на термограмме хорошо выраженного кооперативного пика AT) особенно ярко проявляются в случае гладкомышечного ТМ, денатурация которого в отсутствие актина происходит на 4°С ниже, чем его диссоциация от актина. С другой стороны, этот эффект менее выражен или минимален для тех ТМ, которые диссоциируют от актина при температурах близких или даже ниже температуры денатурации свободного ТМ. Примером таких ТМ является рекомбинантный дрожжевой ТМ 2. Добавление актина почти не влияет на

тепловую денатурацию этого белка, так как его диссоциация происходит на 3,6°С раньше, чем денатурация свободного ТМ.

На основании этих данных нами предложен следующий механизм тепловой денатурации ТМ в присутствии Р-актина. Актин защищает ТМ, находящийся на его поверхности, от тепловой денатурации, которая начинается только при диссоциации ТМ от актина. Новый кооперативный тепловой переход (АТ), возникающий только в присутствии актина, отражает тепловую денатурацию тех частей (калориметрических доменов) ТМ, денатурация которых в отсутствие актина происходит при температурах ниже Т^. В присутствии актина эти домены денатурируют при более высокой температуре и в очень узком температурном интервале, что и приводит к возникновению нового кооперативного теплового перехода.

4. Влияние структуры тропомиозина на характер его тепловой денатурации.

Мы применили разработанный нами подход (комбинацию метода ДСК и измерений температурных зависимостей светорассеяния) к исследованию тепловой денатурации ТМ различной длины, используя для этой цели целый набор экспрессированных в Е. соИ рекомбинантных «сверхкоротких» дрожжевых ТМ с различным количеством актин-связывающих участков (повторяющихся сегментов из

40 остатков в аминокислотной последовательности ТМ) (рис. 8).

Рис. 8. Схематическое представление структуры рекомбинантных

дрожжевых ТМ с различным количеством актин-связывающих сайтов (повторяющихся сегментов носледовательнтсти). Исследуемые сегменты 2 и 3 обозначены светлосерым цветом.

4.1. Влияние сегментов 2 и 3 на тепловую денатурацию дрожжевых ТМ. В Таблице 2 представлены результаты анализа тепловой денатурации рекомбинантных дрожжевых ГМ - ТМ 1, ТМ 2 и их мутантных форм с определенными добавленными (-(-) или удаленными (Д) сегментами последовательности. Хорошо видно, что любые такие изменения в структуре ТМ приводили к резкому изменению термостабильносги белка, при этом все манипуляции, кроме удаления сегмента 2, приводили к ее

снижению. А в случае удаленного сегмента 2 (ТМ 1А2 и ТМ 2Д2) наблюдалось значительное увеличение термостабильности белка в отсутствие актина (на 3,8°С для ТМ 1Д2 и на 4,5°С для ТМ 2Д2).

Методом соосаждения было показано, что при комнатной температуре все используемые мут антные формы дрожжевых ТМ, кроме ТМ 1АЗ и ТМ 1А23, хорошо связываются с Р-актином. В случае ТМ 1Д23 связывание с актином осуществлялось примерно на 50%, а при использовании ТМ 1АЗ оно вообще не наблюдалось.

Таблица 2. Параметры тепловой денатурации рекомбинантных дрожжевых ТМ в присутствии или в отсутствие Р-актина, а также вызванной нагревом диссоциации комплексов ТМ-актин. Концентрация всех ТМ - 10 цМ, Р-актина - 46 рМ. Ошибки в определении величины Тт не превышали ±0,2°С, при определении АНа\ - ±10%. Значения Т,|1ЬЬ определялись из данных светорассеяния и ошибки не превышали ±0,2°С. Параметр ДТ\а, т е ширина теплового перехода на половине высоты пика, представляет собой параметр, отражающий кооперативность перехода. Параметры Тт (+А) и Тт (-А), А#са| (+А) и ЛЯСЭ| (-А), ЛГ|д (<-Л) и ДГ1/2 (-А) соответствуют значениям Тт, ДЯса| и ДГ1/2, измеренным в присутствии и в отсутствие Р-актина, соответственно Эффект актипа (т.е. вызываемое актином увеличение кооперативное™ плавления ТМ) определялось при помощи следующей формулы:

{Д#са|(+А) / АТ\п (+А)} -{АТ\п (-А) / ДЯса](-А)}.

ТМ Та(+А) "С °с 7-т(-А), °С Г„(+А>-Гт(-А), •с Д7-ш(+А),°С ЛЯы(+А), кЛ/то) Эффект актина (отв. ед.)

7л»-Г„(- А), 'С АГщ (-А),°С АЯС„(-Л), кЛ/то1

ТпИпЗ 38.4 38.4 37.2 1.2 2.8 505 2 1

1.2 4.1 360

ТтТпЗ+2 36 36.1 34.7 1.3 2.2 495 2.2

1.4 3.8 385

Тш1пЗД2 36.2 35.5 41 -4.8 90 715 1

-5.5 7.1 550

Тгп1пЗДЗ 36.4 N0 36.2 0.2 4.8 420 1

- 4.9 425

Тт1пЗД23 34.4 34.3 30.8 3.6 3.5 415 1.5

3.5 3.4 280

Тш2пЗ 37.8 36.1 39.7 -1.9 6.6 350 1.3

-3.6 6.6 260

Тт2пЗД2 44.2 42.5 44.2 0 4.4 340 2.1

-1.7 5.8 215

Сравнивая максимумы температуры денатурации ТМ в отсутствие актина (Тт(-А)) и Та,55 для комплексов ТМ-актин, можно заключить, что изменения в сегментной структуре ТМ приводят к изменению связей внутри молекулы ТМ и меняют характер его взаимодействия с актином при нагревании. Например, отсутствие сегмента 3 (т. е. смещение сегментов 4 и 5 вдоль поверхности актина на участок, соответствующий сегменту 3) приводит к тому, что такой ТМ либо вообще не взаимодействует с актином (ТМ 1ДЗ), либо прочность связей между ТМ и актином резко снижается при нагреве (ТМ 2) и он диссоциирует при температуре ниже максимума денатурации свободного ТМ. Похожая картина наблюдается и в случае удаления сегмента 2 (ТМ 1Д2): такой ТМ диссоциирует от актина при низких температурах, соответствующих началу области денатурации свободного ТМ. Однако дополнительное введение сегмента 2 приводит к противоположному эффекту. Вместо снижения, происходит усиление актинового эффекта, и он практически соответствует результатам, полученным для ТМ 1. Еще большее усиление эффекта происходит при удалении сегментов 2 и 3 (ТМ 1Д23). Таким образом, не только количество, но и относительное расположение различных сегментов (актин-связывающих участков) в структуре молекулы ТМ играет существенную роль в прочности взаимодействия ТМ с актином при повышении температуры.

4.2. Особенности тепловой денатурации немышечных ТМ. Тепловая денатурация мышечных ТМ была ранее подробно исследована многими авторами. В то же время, до сих пор никто не изучал методом ДСК тепловую денатурацию немышечных ТМ. Мы провели такие исследования, используя для этих целей рекомбинантные а-ТМ фибробласгов ТМ5а и ТМ5Ь в сравнении с гладкомышечным а-ТМ (БшТМ) (Рис. 9).

... -,

БтТш : Га Т 2а |_3__.]_4 ' 5 ТбЬТ~7 I 8 9(1 ] Рис- 9- Схематическое

____1 представление структуры

гладкомышечного а-ТМ

ТМ5а ¡¡¡¡К! з 1 4 ; 5 I 6Ь ] 7 I 8 I 94" 1

ТМ5Ь ЕШРЛ Т~Л1 [5 I 6а 1 7 ]_8_1 Ж"1 (втТт) и двух немышечных

изоформ ТМ фибробластов

(ТМ5а и ТМ5Ь) Показаны участки, кодируемые определенными экзонами (белым цветом изображены участки, кодируемые консервативными экзонами)

Фибробластные ТМ5а и ТМ5Ь короче ЯшТгп на участок, кодируемый экзоном 2 (рис. 9). При этом ТМ5а отличается от йтТт только в Ы-концевой области, что

позволяет исследовать влияние немышечного экзона 1Ь на характер тепловой денатурации всей молекулы ТМ. Между собой ТМ5а и ТМ5Ь различаются только в области участка, кодируемого экзоном 6 (рис. 9). Соответственно при их сравнении можно оценить влияние альтернативного сплайсинга этого экзона (6Ь/6а) на структурные свойства всей молекулы ТМ.

4.2.1. Тепловая денатурация рекомбинантных ТМ: метод ДСК Оба фибробластных ТМ (ТМ5а и ТМ5Ь) денатурировали при более высокой температуре, чем ЭтТт (Тт = 34,6°С). Смещение области денатурации составляло ~5°С для ТМ5а (Тт = 39,3°С), и ~8°С для ТМ5Ь (Тт = 42,7°С). Таким образом, замена экзона 6Ь в ТМ5а на экзон 6а в ТМ5Ь заметно увеличивала термостабильность немышечного ТМ. При этом калориметрическая энтальпия плавления обоих фибробластных ТМ была существенно ниже, чем в случае втТт и составляла -60 % от энтальпии гладкомышечного ТМ. Еще одно важное отличие состояло в том, что оба фибробластных ТМ помимо главного узкого теплового перехода демонстрировали широкий переход с очень низкой кооперативностью при 55-65°С (рис. 10). Для обнаружения этого перехода был использован модифицированный метод ДСК, описанный в «Материалах и методах». Деконволюционный анализ полученных термограмм показал, что каждая кривая может быть разложена на три отдельных

тепловых перехода (калориметрических домена).

Рис. 10. Температурные зависимости избыточного теплопоглощения (Ср) для БтТш, ТМ5а и ТМ5Ь. Концентрация всех ТМ - 1,2 мг/мл. Скорость нагрева 1 °С/мин.

Анализ доменной структуры показал, что наиболее тсрмостабильный третий домен соответствует плавлению Ы-концевой части ТМ, кодируемой экзонами 1а и 2а у вшТт и экзоном 1Ь в случае ТМ5а и ТМ5Ь. Таким образом, основные отличия в тепловой денатурации этих ТМ заключаются в том, что термостабильность второго и третьего домена гораздо выше для ТМ5а и ТМ5Ь, чем для втТт, а их калориметрическая энтальпия гораздо ниже, чем эптальпия ЯтТш, главным образом из-за значительного снижения энтальпии главного второго

Темпершура (°С)

перехода. Исходя из этих различий, возникает вопрос: что является источником столь существенной разницы в энтальпии плавления между ЯтТт и фибробластными ТМ? Для ответа на этот вопрос были использованы дополнительные методы исследования.

4.2.2. Исследование концевых взаимодействий: вискозиметрия. Прочность концевых взаимодействий между димерами ТМ может быть измерена по вязкости раствора; при этом известно, что область контакта очень чувствительна к ионной силе. В присутствии 100 мМ КС1 относительная вязкость сходна для ТМ5а и втТт.

/ Характер снижения вязкости и энтальпии (АНса]) с увеличением ионной силы был

примерно одинаков для всех исследуемых ТМ, тем самым доказывая, что { калориметрическая энтальпия сильно зависит от концевых взаимодействий между

молекулами ТМ Однако при этом величина ДНса1 для обоих фибробластных ТМ всегда была значительно ниже, чем для ЭтТт. Это означает, что концевые взаимодействия между молекулами ТМ не могут объяснить столь существенные различия в калориметрической энтальпии между БшТш и фибробластными ТМ.

4.2.3. Тепловая денатурация рекомбинантных ТМ: метод кругового дихроизма (КД). Спектры КД всех исследуемых ТМ (8шТш, ТМ5а и ТМ5Ь) были идентичны друг другу и демонстрировали два минимума при 208 и 222 нм,

характерные для полностью а-спиральной структуры ТМ. Таким образом, немышечные ТМ не отличались от БтТМ по содержанию а-спиралей. Тепловое разворачивание а-спиральной структуры ТМ исследовали, измеряя температурные зависимости эллиптичности при 222 нм (рис. 11). Плавление всех исследованных ТМ было полностью обратимо.

Рис. 11. Температурные зависимости тепловой денатурации втТт, ТМ5а и ТМ5Ь, измеренные методом КД (А). Скорость нагрева 1 °С/мин, концентрация белка во всех случаях - 0,1 мг/мл. (Б) Профили первой производной от данных, представленных на рисунке (А).

При сравнении профилей разворачивания ТМ5а и ЭшТ ш были обнаружены значительные различия, заключающиеся в низкой кооперативное™ изменений эллиптичности ТМ5а. Профиль плавления ТМ5Ь также существенно отличался от 8шТш, демонстрируя дополнительные изменения в эллиптичности задолго до основного пика при 41,2°С и после него (рис. 11). Таким образом, разворачивание ТМ5а и ТМ5Ь заметным образом отличается от 8шТш. В целом данные, полученные методом КД, находятся в хорошем соответствии с данными ДСК. Оба этих метода показывают существенную разницу в тепловой денатурации между мышечными и немышечными ТМ.

4.2.4. Исследование методом ДСК тепловой денатурации связанного с актином рекомбинантного ТМ. В случае вшТт вызываемый актином сдвиг теплового перехода (т. е. разница в температурах максимумов Тт между пиками 2 и 3 на рис. 12) составлял 3,8°С, а в случае ТМ5а и ТМ5Ь он был выражен слабее и составлял 3°С и 1,4°С, соответственно (рис. 12). Однако вызванное актином увеличение энтальпии тепловой денатурации для ТМ5а и ТМ5Ь было гораздо больше,

чем для втТт.

Рис. 12. Кривые ДСК для втТт (А), ТМ5а (Б) и ТМ5Ь (В) в их комплексах с Р-актином. Пунктиром показаны пики 3 - кривые, полученные при повторных прогревах комплексов после нагрева до 90°С (т. е. после необратимой денатурации Р-актина), соответствующие денатурации свободного ТМ. Пики 1 и 2, полученные в присутствии актина, соответствуют избытку свободного ТМ и связанному с актином ТМ, соответственно. Концен фация белков: ЭшТт - 10 цМ, ТМ5а и ТМ5Ь - 15 цМ, Р-актина - 46 цМ.

Для корректного вычисления размера данного увеличения, мы измерили энтальпию пика 2 (вызванного взаимодействием с актином) (ЛН2) и определили энтальпию той части свободного ТМ, которая непосредственно участвует во взаимодействии с актином (ДН3-ДН1). В результате оказалось, что при взаимодействии с актином энтальпия

Температура (°С)

тепловой денатурации увеличивалась на 220-240 М/то1 для ТМ5а и ТМ5Ь, и только на 125 к1/то1 в случае БтТт (Таблица 3).

Таблица 3. Параметры тепловых переходов, наблюдаемых методом ДСК для втТт, ТМ5а и ТМ5Ь в присутствии Р-актина (рис. 12) и вызванной нагревом диссоциации комплексов ТМ-актин. Концентрации белков: втТт - 10 цМ; ТМ5а и ТМ5Ь - 15 цМ, Р-актин - 46 рМ.

ГШ(°С) АЯ„1 (Ы-шоГ1)

__. Тмн_____

ТМ---——--—

<°С) Г, Тг Тз АН, АН2 АЯз ДЯ2-(ДЯ3-ЛЯ,)

втТт 38.5 33.8 38.3 34.5 120 685 680 125

ТМ5а 43.2 38.7 43 40 65 575 400 240

ТМ5Ь 43.9 40.3 44.4 43 60 530 370 220

4.2.5. Вызванная нагревом диссоциация комплекса ТМ-актин. Изменения в тепловой денатурации ТМ (т. е. появление пика 2), вызванные взаимодействием с актином, связаны с его диссоциацией с поверхности актинового филамента. Оба фибробластных ТМ, ТМ5а и ТМ5Ь, диссоциируют от актина при более высокой температуре (ТЙ1И~ 43.5°С), чем БтТт (Т^ = 38.5°С).

4.2.6. Суммарный анализ различий в тепловой денатурации гладкомышечного и фибробластных ТМ. Нам впервые удалось обнаружить глобальные различия в характере тепловой денатурации между мышечными и немышечными изоформами ТМ, вызванные различной' экзонной структурой Ы-концевых фрагментов молекулы. На основании полученных данных мы полагаем, что замена мышечных Ы-концевых экзонов 1а и 2а на немышечный экзон 1Ь оказывает существенное влияние на тепловую денатурацию всей молекулы ТМ. В результате значительная часть молекулы немышечного ТМ плавится с очень низкой кооперативностью в широком температурном диапазоне. Такая денатурация не вносит свой вклад в энтальпию кооперативного теплового перехода и ее крайне трудно зарегистрировать методом ДСК. Этим можно объяснить значительное снижение калориметрической энтальпии немышечных ТМ фибробластов по сравнению с гладкомышечным ТМ. Однако в присутствии актина тепловая денатурация ТМ определяется, согласно предложенному нами механизму, главным

образом диссоциацией ТМ с поверхности актинового филамента. В результате те части молекулы немышечного ТМ, которые в отсутствие актина плавились некооперативно при температурах ниже Tdiss, разворачиваются сразу после диссоциации в достаточно узком температурном диапазоне и с достаточно высокой коперативностью, внося свой вклад в энтальпию теплового перехода. Этим и объясняется заметное повышение энтальпии денатурации немышечных ТМ в присутствии актина.

Выводы.

1. Методом дифференциальной сканирующей калориметрии впервые исследовано одно из структурных состояний тропомиозина, расположенного на актиновом филаменте, - состояние «blocked», которое реализуется в комплексе, состоящем из актина, тропомиозина и тропонина. Показано, что при переходе в это состояние заметно увеличивается кооперативность тепловой денатурации связанного с актином тропомиозина.

2. Предложен механизм тепловой денатурации тропомиозина в присутствии F-актина. Согласно этому механизму, влияние актина на тепловую денатурацию тропомиозина зависит от разницы между температурой полумаксимальной диссоциации комплекса тропомиозин-Р-актин и температурой денатурации свободного тропомиозина. Эффект актина на тепловую денатурацию тропомиозина (значительное увеличение термостабильности белка) выражен ярче всего для тех белков, которые денатурируют в отсутствие актина при более низких температурах, чем температура полу максимальной диссоциации комплекса

3. Методом дифференциальной сканирующей калориметрии в сочетании с измерениями температурных зависимостей диссоциации комплексов тропомиозин-актин исследовано влияние двух кардиомиопатических мутаций в молекуле тропомиозина, DI75N и EI80G, на тепловую денатурацию связанного с актином тропомиозина. В результате удалось впервые объяснить существенную разницу в физиологических проявлениях этих мутаций, одна из которых (D175N) вызывает лишь легкую сердечную недостаточность, а другая (E180G) зачастую приводит к летальному исходу. При повышении температуры (например, при простуде или при интенсивной мышечной деятельности) тропомиозин с мутацией E180G (но не с

мутацией В175Ы) диссоциирует с поверхности актиновых филаментов и денатурирует, что и приводит, по-видимому, к серьезному поражению сердечной' мышцы.

4. При исследованиях тепловой денатурации «сверхкоротких» рекомбинантных дрожжевых тропомиозинов показано, что термостабильность белка и прочность его связывания с актином зависят не только от длины тропомиозина, т. е. от количества актин-связывающих участков - повторяющихся сегментов в аминокислотной последовательности тропомиозина, но и от взаимного расположения этих сегментов в молекуле белка.

5. Впервые проведены исследования тепловой денатурации немышечных тропомиозинов фибробластов. Обнаружены существенные различия в характере тепловой денатурации между мышечными и немышечными изоформами тропомиозина, обусловленные различиями в структуре М-концевой части молекулы белка. Показано, что замена И-концевых участков, кодируемых мышечными экзонами 1а и 2а на участок, кодируемый немышечным экзоном 1Ь, оказывает существенное влияние на тепловую денатурацию всей молекулы тропомиозина, заметно увеличивая термостабильность белка и значительно снижая калориметрическую энтальпию его тепловой денатурации.

9 Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ, РФФИ-МАС,

Программы поддержки ведущих научных школ РФ, Программы «Молекулярная и f> клеточная биология» Президиума РАН и Welcome Trust.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1 Kremneva E.V., Nikolaeva О.Р., Gusev N.B. Levitsky D.I. (2001) Thennal unfolding of actin-bound tropomyosin: effects of myosin and troponin. Abstracts of International Symposium "Biological Motility New Trends in Research" (Pushchino, Moscow region, 20-26 August 2001), p. 80-81

2 Kremneva E.V , Nikolaeva O.P., Gusev N.B., Levitsky D. I. (2002) Effects of troponin on the thermal unfolding of actin-bound tropomyosin Journal of Muscle Research and Cell Motility, v. 23, № 1, p. 23.

3. Кремнева E.B., Николаева О.П., Гусев Н.Б., Левицкий Д.И (2002) Влияние тропонина на тепловую денатурацию связанного с актином тропомиозина. Тезисы научных докладов III Съезда Биохимического Общества (г Санкт-Петербург, 26 июня -1 июля 2002 г), С. 85.

4. Кремнева Е В , Николаева О.П., Гусев Н.Б., Левицкий Д.И. (2003) Влияние тропонина на тепловую денатурацию связанного с актином тропомиозина. Биохимия, т. 68, № 7, С. 976984.

5. Kremneva E.V., Boussouf S., Maytum R., Levitsky D., Geeves M. (2003) A new insight into the mechanism of thermal unfolding of actin-bound tropomyosin by using tropomyosin human cardiomyopathy mutants. J Muscle Res. and Cell Motil., v. 24, № 4-6, p. 345.

6. Kremneva E.V., Boussouf S., Maytum R., Geeves M.A., Levitsky D.I. (2004) Effects of two cardiomyopathy mutations in tropomyosin on the thermal unfolding of actin-bound tropomyosin Abstracts of International Symposium "Biological Motility" (Pushchino, Moscow region, May 23-June 1,2004), p. 224-225.

7. Kremneva E, Maytum R., Nikolaeva O., Levitsky D., Geeves, M. (2004) Effects of actin binding on the thermal unfolding of yeast and fibroblast tropomyosin constructs. J. Muscle Res and Cell Motil., v. 25, № 3, p. 259.

8. Kremneva E., Boussouf S., Nikolaeva O., Maytum R., Geeves M.A., Levitsky D.I. (2004) Effects of two familial hypertrophic cardiomyopathy mutations in a-tropomyosin, Aspl75Asn and Glul80Gly, on the thermal unfolding of actin-bound tropomyosin. Biophys J., v. 87,№ 6, p. 39223933.

9. Levitsky D.I., Kremneva E., Nikolaeva O., Maytum R., Geeves M.A. (2005) Thermal unfolding of actin-bound tropomyosin. Biophys J, v. 88 (Abstracts of 49th Annual Meeting of Biophysical Society, Long Beach, С A, USA, February 12-16, 2005, poster 657).

Подписано к печати 1С. 05 Тираж (Заказ 120

Отпечатано в отделе оперативной печати физического факультета МГУ

РНБ Русский фонд

2006-4 18700

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кремнева, Елена Валериевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ Введение

Обзор литературы

1) Структура мышцы и основы мышечного сокращения.

2) Миозин.

3) Актин.

4). Молекулярный механизм подвижности.

5) Регуляция мышечного сокращения.

5.1. Миозиновый тип регуляции.

5.2. Актиновый тип регуляции.

6) Регуляторные белки тонкого филамента.

6.1. Тропомиозин.

6.1.1. Сходство и различие тропомиозинов из скелетных, сердечных и гладких мышц.

6.1.2 Немышечные тропомиозины.

6.1.3. Миопатии, связанные с мутациями в тропомиозине.

6.2. Тропонин.

6.2.1. Тропонин С

6.2.2. Тропонин I

6.2.3. Тропонин Т

7) Применение метода дифференциальной сканирующей калориметрии для структурных исследований мышечных белков.

7.1. Миозин.

7.2. Актин

7.3. Тропомиозин.

7.4. Тропонин.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалы и методы исследования.

1) Получение препаратов белков

1.1. Получение субфрагмента 1 миозина из скелетных мышц кролика.

Получение миозина. Разглицеринизация миозина. Получение субфрагмента 1 миозина (S1)

1.2. Выделение актина из скелетных мышц кролика.

Получение ацетонового порошка Выделение актина из ацетонового порошка

1.3. Приготовление препарата гладкомышечного тропомиозина

1.4. Приготовление препаратов скелетного тропомиозина и скелетного тропонина

1.5. Стабилизация F-актина фторидом алюминия

1.6. Экспрессия и очистка рекомбинантных ТМ.

1.7. Получение окисленных и восстановленных препаратов ТМ.

2) Используемые методы исследования

2.1. Определение АТРазной активности миозина

2.2. Градиентный электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии SDS

2.3. Исследования термодинамических характеристик белков методом дифференциальной сканирующей калориметрии.

Стандартный метод измерения.

Модифицированный метод измерения для некооперативных тепловых переходов.

2.4. Вискозиметрический метод.

2.5. Метод кругового дихроизма.

2.6. Соосаждение ТМ с F-актином.

2.7. Исследование диссоциации комплекса ТМ с актином методом светорассеяния.

Результаты и их обсуждение.

1) Взаимодействие скелетного тропомиозина с актином и тропонином.

1.1. Тепловая денатурация скелетного ТМ.

1.2. Взаимодействие ТМ с актином.

1.3. Регулируемый актиновый филамент.

2) Эффекты кардиомиопатических мутаций в тропомиозине.

2.1. Влияние FHC мутаций на тепловую денатурацию рекомбинантного ТМ.

2.2. Сродство ТМ к актину.

2.3. Тепловая денатурация мутантных форм ТМ в их комплексах с актином.

3) Предполагаемый механизм тепловой денатурации тропомиозина на поверхности актиновых филаментов.

4) Влияние структуры тропомиозина на характер его тепловой денатурации.

4.1. Влияние сегментов 2 и 3 на тепловую денатурацию дрожжевых ТМ.

4.2. Особенности тепловой денатурации немышечных ТМ.

4.2.1. Тепловая денатурация рекомбинантных ТМ: метод ДСК.

4.2.2. Исследование концевых взаимодействий: вискозиметрия.

4.2.3. Тепловая денатурация рекомбинантных ТМ: метод кругового дихроизма.

4.2.4. Исследование методом ДСК тепловой денатурации связанного с актином рекомбинантного ТМ.

4.2.5. Вызванная нагревом диссоциация комплекса ТМ-актин.

4.2.6. Суммарный анализ различий в тепловой денатурации гладкомышечного и фибробластных ТМ.

Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Тепловая денатурация различных изоформ тропомиозина в отсутствие и в присутствии F-актина"

В основе молекулярного механизма сокращения мышц лежат структурные изменения, происходящие в миозиновой головке при гидролизе АТР и при взаимодействии с актиновым филаментом. В процессе этого взаимодействия происходит превращение химической энергии гидролиза АТР в механическую энергию движения. Для регуляции этого взаимодействия в мышцах существуют специальные белковые системы. Необходимость существования системы регуляции сократительной активности объясняется тем, что мышца не могла бы выполнять свои функции, если бы она постоянно находилась в сокращенном состоянии. Регуляция взаимодействия миозиновых и актиновых филаментов в мышце осуществляется ионами Са2+. Иначе говоря, основная задача регуляторных систем состоит в отслеживании изменения концентрации Са2+ внутри клетки (с 10"7 до 10~5 М). Регуляторные белки могут располагаться либо на тонких, либо на толстых филаментах. В поперечнополосатых и сердечных мышцах основным является актиновый тип регуляции, главную роль в котором играют тропомиозин и тропонин, ассоциированные с тонким (актиновым) филаментом. В состоянии расслабления, когда концентрация свободного Са2+ в мышце очень мала, тропомиозин закрывает сайты связывания миозина на актиновом филаменте, стерически блокируя взаимодействие миозина с актином. Связывание Са2+ с тропониновым комплексом позволяет сдвинуть тропомиозин из этого положения, что делает возможным связывание миозина с актином, приводящее к генерации силы. Таким образом, тропомиозин (ТМ) играет ключевую роль в регуляции сокращения поперечнополосатых и сердечных мышц. Помимо этого, во всех типах мышц и во многих немышечных клетках эукариот ТМ связан с актином, сильно повышая кооперативность актиновых филаментов. Однако многие особенности структурного состояния ТМ на поверхности актиновых филаментов остаются до сих пор неясными. Одним из подходов, применяемых для выяснения таких особенностей, является исследование характера тепловой денатурации ТМ непосредственно на поверхности актиновых филаментов с использованием метода дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) в сочетании с другими методами [Levitsky et al., 2000].

Важно отметить, что до настоящего времени метод ДСК применялся исключительно для изучения мышечных изоформ ТМ, тогда как тепловая денатурация его немышечных изоформ оставалась совершенно неизученной. Неясным оставался также вопрос о том, как именно происходит тепловая денатурация ТМ на поверхности актиновых филаментов и как влияют на нее различные модификации белка. В связи с этим, целью данной работы было исследование методом ДСК в сочетании с другими методами характера тепловой денатурации разных изоформ ТМ в отсутствие и в присутствии актина, включая мышечные ТМ с мутациями в молекулах и немышечные ТМ различной длины, а также влияние на него других регуляторных белков. В соответствии с указанной целью были поставлены следующие задачи:

1. Методом ДСК изучить влияние актина и тропонина на тепловую денатурацию ТМ.

Научная новизна и практическая значимость.

Разработаны новые подходы на основе сочетания метода ДСК с измерениями температурных зависимостей светорассеяния для регистрации изменений характера тепловой денатурации ТМ, происходящих в результате его связывания с F-актином. Это позволило впервые описать механизм тепловой денатурации ТМ в присутствии F-актина, а также впервые объяснить существенную разницу в физиологических эффектах двух кардиомиопатических мутаций в молекуле ТМ, D175N и E180G. Помимо этого, методом ДСК в сочетании с другими методами (КД, светорассеяние) впервые проведены исследования тепловой денатурации немышечных ТМ фибробластов и дрожжей. Работа имеет важное значение для дальнейших исследований влияния различных факторов, таких как точечные мутации или изменения целых участков в молекуле ТМ, на тепловую денатурацию ТМ в отсутствие и в присутствии актина.

Обзор литературы.

В основе биологической подвижности всего живого лежит всего несколько молекулярных механизмов. В случае эукариотических клеток наиболее распространенной считается актомиозиновая система подвижности, основанная на взаимодействии миозина и актина. Именно это взаимодействие ответственно за сокращение мышц и многие процессы клеточной подвижности. Таким образом, мышцы являются высоко специализированными органами, способными за счет гидролиза АТР генерировать механические усилия и обеспечивать перемещение животных в пространстве.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Кремнева, Елена Валериевна

Выводы.

1. Методом дифференциальной сканирующей калориметрии впервые исследовано одно из структурных состояний тропомиозина, расположенного на актиновом филаменте, — состояние «blocked», которое реализуется в комплексе, состоящем из актина, тропомиозина и тропонина. Показано, что при переходе в это состояние заметно увеличивается кооперативность тепловой денатурации связанного с актином тропомиозина.

2. Предложен механизм тепловой денатурации тропомиозина в присутствии F-актина. Согласно этому механизму, влияние актина на тепловую денатурацию тропомиозина зависит от разницы между температурой полумаксимальной диссоциации комплекса тропомиозин-Р-актин и температурой денатурации свободного тропомиозина. Эффект актина на тепловую денатурацию тропомиозина (значительное увеличение термостабильности белка) выражен ярче всего для тех белков, которые денатурируют в отсутствие актина при более низких температурах, чем температура полумаксимальной диссоциации комплекса.

3. Методом дифференциальной сканирующей калориметрии в сочетании с измерениями температурных зависимостей диссоциации комплексов тропомиозин— актин исследовано влияние двух кардиомиопатических мутаций в молекуле тропомиозина, D175N и E180G, на тепловую денатурацию связанного с актином тропомиозина. В результате удалось впервые объяснить существенную разницу в физиологических проявлениях этих мутаций, одна из которых (D175N) вызывает лишь легкую сердечную недостаточность, а другая (E180G) зачастую приводит к летальному исходу. При повышении температуры (например, при простуде или при интенсивной мышечной деятельности) тропомиозин с мутацией E180G (но не с мутацией D175N) диссоциирует с поверхности актиновых филаментов и денатурирует, что и приводит, по-видимому, к серьезному поражению сердечной мышцы.

5. Впервые проведены исследования тепловой денатурации немышечных тропомиозинов фибробластов. Обнаружены существенные различия в характере тепловой денатурации между мышечными и немышечными изоформами тропомиозина, обусловленные различиями в структуре N-концевой части молекулы белка. Показано, что замена N-концевых участков, кодируемых мышечными экзонамиТа и 2а на участок, кодируемый немышечным экзоном lb, оказывает существенное влияние на тепловую денатурацию всей молекулы тропомиозина, заметно увеличивая термостабильность белка и значительно снижая калориметрическую энтальпию его тепловой денатурации.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кремнева, Елена Валериевна, Москва

1. Гусев Н.Б. (1998). Внутриклеточные Са-связывающие белки. Соросовскийобразовательный журнал, 5:2-16

2. Гусев Н.Б. (2000). Молекулярные механизмы мышечного сокращения.

3. Соросовский образовательный журнал, 6(8): 24-32

4. Кремнева Е.В., Николаева О.П., Гусев Н.Б., Левицкий Д.И. (2003) Влияниетропонина на тепловую денатурацию связанного с актином тропомиозина. Биохимия, 68: 976-984

5. Левицкий Д.И. (1987). Структурные особенности и функциональная рольмолекул миозина. В книге «Структура и функции белков сократительных систем» (под ред. Пинаев, Г. П.), Л. Наука, 5-31

6. Левицкий Д.И. (1991) Структура миозиновой головки. Биохимия, 56: 1539-1566

7. Левицкий Д.И. (2004). Применение метода дифференциальной сканирующейкалориметрии для структурно-функциональный исследований мышечных белков (обзор). Успехи биол. химии, 44: 133-170

8. Левицкий Д.И., Бобков А.А., Голицына Н.Л., Николаева О.П., Павлов Д.А.,

9. Поглазов Б.Ф. (1996). Калориметрические исследования стабильных комплексов субфрагмента 1 миозина с аналогами аденозинтрифосфата и фосфата. Биофизика, 41 (1): 64-72

10. Левицкий Д.И., Николаева О.П., Орлов В.Н., Павлов Д.А., Пономарев М.А.,

11. РостковаЕ.В. (1998). Дифференциальная сканирующая калориметрия миозина и актина. Биохимия, 63 (3): 391-394

12. Левицкий Д.И., Хайтлина С.Ю., Гусев Н.Б. (1995). Белки актомиозиновойсистемы подвижности. В книге "Белки и пептиды", 1: 249-293, (под ред. Иванова Б.Т., Липкина В.М.), Наука, Москва

13. Морозова Л.А., Гусев Н.Б., Шныров В.Л. Пермяков Е.А. (1988) Изучениефизико-химических свойств тропонинов I и Т из сердечных и скелетных мышц методами белковой флуоресценции и калориметрии. Биохимия, 53: 531-540

14. Поглазов Б.Ф., Билуши В., Баев А.А. (1958). О сульфгидрильных группахмиозиновой аденозинтрифосфатазы. Биохимия, 23 (2): 269-284

15. Поглазов Б.Ф., Левицкий Д.И. (1982). Книга Миозин и биологическаяподвижность, (под ред. Кретович, В. Л.), Наука, Москва

16. Татунашвили Л.В., Привалов П.Л. (1984) Калориметрические исследованияденатурации G-актина. Биофизика, 29: 583-585

17. Филатов В.Л., Катруха А.Г., Буларгина Т.В., Гусев Н.Б. (1999). Тропонин:

18. Строение, свойства и механизм функционирования. Биохимия, 64 (9): 11551174

19. Хворов Н.В., Левицкий Д.И., Букатина А.Е., Шныров В.Л., Поглазов Б.Ф. (1990).

20. Калориметрические доказательства двух конформационных состояний комплекса субфрагмента-1 миозина с нуклеотидами. Доклады АН СССР, 315 (3): 745-748

21. Basi G.S. and Storti R.V. (1986) Structure and DNA sequence of the tropomyosin Igene from Drosophila melanogaster. J Biol Chem. 261(2): 817-27

22. Bertazzon A. and Tsong T.Y. (1990) Effects of ions and pH on the thermal stability of

23. Thin and Thick filaments of skeletal muscle: high-sensitivity differential scanning calorimetric study, Biochemistry, 29: 6447-6452

24. Bertazzon A. and Tsong T.Y. (1990) Study of effects of pH on the stability of domainsin myosin rod by high-resolution differential scanning caloiimetry. Biochemistry, 29: 6453-6459

25. Bobkov A.A., Khvorov N.V., GolitsinaN.L., Levitsky D.I. (1993) Calorimetriccharacterization of the stable complex of myosin subfragment 1 with ADP and beryllium fluoride. FEBS Letters. 332: 64-66

26. BogatchevaN.V. and Gusev N.B. (1995) Interaction of smooth muscle calponin withphospholipids. FEBS Lett. 371: 123-12622

Информация о работе

Кремнева, Елена Валериевна
кандидата биологических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.04

Диссертация

Тепловая денатурация различных изоформ тропомиозина в отсутствие и в присутствии F-актина - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы