Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение роли щелочных легких цепей миозина в быстрых скелетных мышцах кролика

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение роли щелочных легких цепей миозина в быстрых скелетных мышцах кролика"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОХИМИИ ИМ.Л.И.БЛХЛ

На правах рукописи

ШСОДАЕВА ОЛЬГА ПЕТРОВНА

удк 5п.»аз

ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ ЩЕЛОЧНЫХ ЛЕГКИХ ЦЕПЕЙ ЮЮЗИЛА В ШГГР11Х СКЕЛЕТНЫХ ШЛИЦАХ КРОЛИКА

О3.0О.О4.-биологическая хкаи

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1Э92

Работа вштднйна в лаборатории молекулярной организации биоло- " гичоскнх gtp.vkt.vd Института биохимии им.А.Н.Баха РАН

НаучныП руководитель: член-корр. РАН, профессор Б.Ф.Поглазов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, И.Б.Гусев

доктор химических каук, К.Л.Гладили«

Ведущая организация: Институт экспериментальной кардиологии Поероссийсс.ого кардиологического научного центра АМН

Защита диссертации состоится (¿й$^^^ 1592 г. Б ^О часов на заседании специализированного совета (К 002.96.01) по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте Биохимии им. А.Н.Баха РАН но адресу: 117071 Москва, Ленинский проспект, д.33, корп.2.

г •

(' диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литературы РАН (Москьа, Ленинский проспект, д.33, корп.1>

Автореферат разослан "¿3" г.

УчяннА секретарь специализированного совета доктор биологических Наук

М.И.Молчанов

Общая характеристика работы.

ГvilA^-" ' • ■ " ' """

Актуальность исследования. Выяснение молекулярного механизма мышечного сокращения является одной из фундаментальных задач современной биохимии. Этот механизм основан на взаимодействии миозина с актином, в процессе'которого миозиновая голоькн совершает циклические движения, гидролизуя при этом АТР. Однако» до сих пор еще не ясно, каким образом химическая анергия гидролиза АТР трансформируется в механическую энергию движения. Для выяснения этого вопроса нужно понять, какие изменения происходят в молекуле миозина при ее взаимодействии с молекулой актина, а следовательно, необходимо подробно изучить структурные особенности этих двух белков.

В этой. работе нас, в основном, интересует миозин, молекула которого представляет собой гексамер, состоящий из двух тяжелых и четырех легких цепей, нековалентно соединеных между собой. Тяжелые цепи на большем своем протяжении спирально закручены одна вокруг другой, образуя так называемый стержень, но на м-конце они расходятся- и образуют глобулярные головки. Именно в головках миозина локализованы актин-связывающие центры и центр гидролиза АТР. Кроме того, в области головок с тяжелыми цепями ассоциированы легкие цепи, по два цепи разных классов с каждой из головок. Являясь необходимым компонентом миозиновой молекулы, легкие, цепи в значительной мере определяют ее свойства.

Один из классов^ легких цепей получил название "существенных", так как считалось, что такие легкие цепи необходимы для проявления миозином -АТРазной активности и способности взаимодействовать с актином.

Второй класс легких цепей назвали "регуляторнымн", так как в определенных мышцах такие цепи принимают участие в регуляции взаимодействия миозина с актином ионами Са2+.

В основе данной классификации лежит функциональный подход. Однако, для скелетных мышц позвоночных существует и другая классификация, осьованная на способе отделения легких цепей от миозина. По этой классификации "существенные" легкие цепи называются "щелочными", так как отделяются от миозина при ¡>11 около 11, а "регуляторные" легкие цепи называтся "11Т1Ш

легкими цепями", поскольку их можно отделить от миозина при обработке ДТНБ в присутствии ЭДТА.

Следует обратить особое внимание на то, что в быстрых скелетных мышцах позвоночных сложилась уникальная ситуация -щелочные легкие цепи в них представлены сразу двумя типами (А1 и Л2). А1 отличается от А2 наличием дополнительного N-концевого сегмента, состоящего из 41 аминокислотного остатка, который отсутствует у А2.. Такое больше не встречается ни в одном биологическом объекте, ни в < шом другом типе мышц позвоночных (в медленных скелетных мышцах и в сердечной мышце всегда присутствуют только щелочные" легкие цепи типа А1, а в гладких мышцах - только типа ,А2).

Встает вопрос: зачем же нужны два различных типа щелочных легких цепей в быстрых скелетных мышцах позвоночных? Какое влияние они оказывают на главные свойства миозиноВой головки, такие как способность гидролизовать АТР и взаимодействовать о актином? Поиски ответа на эти вопросы и послужили темой нашей работы.

Це ль._ц j ада 'л J _ лесладо Целью настоящей работы явилось

выяснение роли полиморфизма щелочных легких цепей 'в быстрых скелетных мышцах позвоночных. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Получить изоформы субфрагмента'-1 миозина (S1),. содержащие либо щелочную легкую цепь A1 (SHA1)), либо А2 (s1(Л2)) и изучить влияние данных цепей на АТРазнуы активность S1.

2. Провести сравнительное исследование влияния щелочных легких цепей на характер тепловой денатурации si.

3. Выяснить функции щелочных легких цепей при взаимодействии нзоформ S1 с F-актином в растворе и в мншсшом волокне.

4. Исследовать влняние щелочных легких цепеП на агрегацию Филаментов F-актина.

Нлу.чни;-1_.нс>БЛ.Эна..^>ай<Ш4х. Впервые получено прямое доказательство влияния щелочных легких цепей на структуру миозиновой п>л"нки («1), -а именно на структуру ее первого домена. Показано, что миозиновис головки, содержащие разные щелочные л(.чт.по цени А1 и А2, по-разному взаимодействуют с -актином. Эти

г

проявляется в их различной ориентации относительно поверхности актинового фнламента, а также в различиях по светорассеянию н коэффициентам седиментации между филаментами Р-актина, декорированными этими головками. Кроме того, впервые показано, что только головки, содержащие Al, способны вызывать агрегацию декорированных ими актиновых филаментов. Высказано предположение, что все эти различия обусловлены способностью N-концевого сегмента Al вступать в самые различные чнмодепствня (с концом ыКозиновой головки, с С-концевоП обЛс. .¡м актина и друг с другом).

приближают нас к пониманию роли полиморфизма щелочных легких цепей в быстрых скелетных мышцах позвоночных, а также к пониманию молекулярного механизма мышечного сокращения в целом.

Апробация работы. Результаты исследований доложены на международном симпозиуме "Молекулярная организация биологических структур" (Москва,1989); на VI Всесоюзной конференции по биохимии мышц (Тбилиси, 1989), на конкурсе научных работ Института биохимии им. А.Н.Баха РАН (1991),

Публикации. По материалам диссертации опубликовало 11 печатных работ.

Структура и обьвм диссертации. Диссертация изложена на 136 страницах, включает б таблиц, 30 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы.

Материалы и' метода исследования.

Объектом исследования являлся миозин, получении« из быстрых скелетных мышц кролика и его изолированные головки <si). Миозин получали по методу Перри, модифицированному Б.Ф.Погла-зовым (Поглазов и др., 1958). К полученному раствору миозина добавляли глицерин, Трис-нс1 .буфер (pH 7,2) и KCl до конечной концентрации 40%, 25 мМ и 0,5 М соответственно. Подготовленный таким образом белок хранили при температуре -ю°с в морозильной камере в течение года.

31 получали, переваривая миозиновые Филаменты »¿-химо-трипсином (Serva) . (Weeds & Taylor,1975).

Разделение препарата si на изоформы проводили по методу, описанному Weeds & Taylor [1975], на колонке ДЭАЭ-целлюяозы Whatman 1)Е-52. Профиль

Рис.1. Хроматографическое разделение S1 на изо-фориы S1(A1)-1 и s1(л2)-2 ча колонке DEAE-целлШЮЗЫ Whatman DE-52 (1,6x20 СМ) в 50 мМ имидазол-HCl öyqiepe (pH 7,0). Скорость ЭЛЮЦИИ 14 МЛ В час, объем фракций з мл.

Наличие в Sl(Al) примеси SI(А2) и наоборот, в Si(А2) примеси S1(А1), контролировали методом электрофореза в ПААГ в присутствие 8 М мочевина (Perrie к Perry, 1970!. SHAD, свободные от примеси S1(А2), наблюдали на подъеме первого пика, a S1(A2), свободные от 31(AI) - на спаде второго пика. Эти наиболее чистые фракции каждого пика объединяли и концентрировали белок при помощи погружаемых концентрирующих ячеек СХ-30 (Millipore).

Чистоту полученных фракций изоформ 31 определяли методом электрофореза в ПААГ в присутствии SDS (Laemmli,1 £70).

Суммарную фракцию легких цепей .получали путем обработки миозина 5 М гуанидин-HC.l (Perrie 4. Perry, 1970). Тяжелые цепи осаждали этанолом и удаляли центрифугированием. Суммарные легкие цепи, находящиеся в супернатанте, освобождали от спирта диализом и лиофильно высушивали. Изолированные AI и А2 получали из суммарной фракции легких цепей путем ионообменной Хроматографии на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой Whatman DE-52 (Holt & Lowey,1975). Очищенные AI и A2 диализовали против бидиотиллята и лиофильно высушивали.

Актин получали по методу Спудича (Spudich,1971), очищали двумя циклами полимеризации-деполимеризации, полимеризовялм в 5 нМ Hgcio if использовали в форг.ю г-актина.

элюции представлен на Рис.1.

Глицеринизированные мышечные волокна получали из поясничной мышцы кролика (Szent-Qyorgyi,1949). Для получения одиночных мышечных волокон пучки разделяли на отдельные волокна и отмывали от глицерина.

Для получения теневых мышечных волокон из одиночных волокон удаляли миозин, тропонин и тропомиозин, при этом в волокне полностью сохранялась структура актиновых нитей.-'

Концентрацию всех белков определяли спектро^тометри-чески, используя »в каадом- конкретном случае соответствующий коэффициент молярной экстинкции.

АТРазную активность изоформ S1 определяли по выделению неорганического фосфата (Panusz et al.,1970).

Для моделирования "слабого" связывания si с F-актином был использован препарат 31, в котором "существенные" siij- и sn2-группы сшивались pPDM (Chalovich et al.,1983).

Флуоресцентную модификацию изоформ SI, изолированных

. по

щелочных легких цепей и актинаvSH-группам проводили 1-(йод-ацетиламиноэтил)-5-нафтиламин-1-сульфокислотой (1,5-lAEDANS) (Siema), используя соответствующие методики.

Для получения информации от метка, локализованной в щелочной легкой цепи, но в составе миозиновой головки, проводили замещение собственных щелочных легких цепей в si на Al или А2, модифицированные 1,5-IAEDANS (Wagner,1982).

Изменения, происходящие в структурном состоянии F-актина или присоединенного к нему 31 в мышечных волокнах, исследовали о помощью метода ' поляризационной микрофлуориметрии (Borovikov et al.,1982). При этом регистрировали 4 интенсивности поляризованной флуоресценции' (I): „Ц , „1х , , , где значки слева от I обозначают параллельное и перпендикулярное направление поляризации возбуждающего света относительно оси мышечного .волокна, а символы справа - направление поляризации флуоресценции.

Гомогенность препаратов s.i(Ai), si(A2) и связывание их о F-актином изучали .иетодом скоростной седиментации. Исследования проводили на аналитической ультрацентрифуге Beckman, модель Е (США) с абсорбционной сканирующей системой и мультиплексором при 20° С л скорости вращения ротора от 12000 до юооо об/мин.

Калориметрические исследования проводили на дшМюренци-алыюм сканирующей микрокалориметре ДАСМ-4 (НПО "Биоприбор" РАН) с платиновыми ячейками объемом 0,47 мл. Для выявления доменной структуры изоформ si использовали метод, "последовательного отжига" (Shnyrov et al.,1984), суть которого заключается в неоднократном повторении цикла "нагрев-охлаждение-нагрев до более высокой температуры". Данный метод позволяет разложить суммарный контур тепдопогдощения S1 аа ряд элементарных пиков, отражающих независимое плавление нескольких участков (доменов) в молекуле белка.

Вызываемую нагреванием агрегацию изоформ S1 изучали по изменению поглощения при длине волны 350 нм на спектрофотометре • Сагу 219 "Varian", снабженном термостатированным кюветодер-жателем с термопарой для определения температуры. Скорость нагрева образцов составляла 1°С в минуту.

Триптофановую флуоресценцию изоформ si измеряли на спек-трофлуориметре лабораторного изготовления с монохроматическим возбуждением при 280,4 нм.

Кинетику агрегации актиновых филаментов, , декорированных изо<1юрмами S1, регистрировали при 25° С по приросту кажущейся оптической плотности при 340 нм на программируемом спектрофотометре Hitachi uv-vis-nir и-3400 (Япония) с автоматической растяжкой фотометрической шкалы. Врекя регистрации изменения кажущейся оптической плотности было равно 5 или 10 мин.

Быструю кинотику взаимодействия изоформ St с F-актином изучали методой остановленного потока на приборе D-100 фирмы Bur-rum, снабженном многоканальным анализатором фирмы Biomation модель-850 и двухкоординатню самописцем. Изменение интенсивности светорассеяния регистрировали при 340 нм. Мертвое время смешивания компонентов было равно 3 ыс. Измерения проводились в миллисекуидном и секундном диапазонах.

Результаты и их обсуждение.

с целью воспроизведения литературных данных, а также проверки нативности полученных препаратов изоформ, мы определяли -их АТР'азную активность. Как и следовало ожидать, K+-EDTA и св2+-АТРазная активность Sl(Al) и si(A2! оказалась практически одинаковой {Табл.1).

Однако, при низкой ионной силе и низкой концентрации к-актина, актин-активируемая Мя2+-АТРазаая активность изоформ существенно различалась (Табл.1). Прн этом для разных нар исследованных препаратов активность s H Al) в 2-2,5 раза превышала активность S1(Д2). Снижение различий между изоформами по актин-активируемоЯ АТРазе и приближение активности SHAl I к активности 31(А2> в данных условиях свидетельствовало об инактивации препарата 31<А1), которая происходила при хранении препарата свыше 7 дней.

Таблица 1. АТРазная активность изоформ S1(A1) и SH<\2i (средние значения по 10 экспериментам).

Активность при 25°(J (в мкМ Р^ в мни на 1 мг S1) АТРаза_________

Sl(Al) s 1(А2)

K+rEDTA-АТРаза 3,5 ±0,20 3,5+0,20

-АТРаза 1,1 t 0,16 1,1 +0,16 Актин-активируемая

МаГ -АТРаза 0,9 + 0,20 0,37 + 0,14

На рис.2 представлена зависимость актин-антивируемой Мй2<"-АТРазной активности изоформ 81 от концентрации F-актина н координатах Лайонувера-Берка. Как видно, SKA1) н si(A2) практически не различаются по максимальной скорости реакции, однако существенно отличаются по величине кажущейся константы диссоциации комплекса 31 с F-актином. Концентрация F-актина, при которой 'скорость реакции достигала полумаксималыюй, для 31 (А1) приблизительно в 3 раза меньше, чем для si(A2). Таким образом, при низкой ионной силе в присутствии атр, si(Al) обладает болев высоким сродством к F-актину, чем 81(а2), что согласуется с .'имеющимися литературными данными (Weeds, Taylor,1975 j Wagnev et al., 1979; Chalovich et al.,1984).

Кроме того, более высокое сродство si(Al) к актину подтверждают iu-хы по реассоциации предварительно собранных комплексов изоформ 31 с актином, после введения в систему атр. На рио.З видно, что после добавления атр оптическая плотность

комплексов актина с иэоформами S1 резко падает, практически до

О

уровня неходкого актина, что свидетельствует о полной диссоциации комплексов. Затем происходит гидролиз ' АТР, сопровождающийся фазой просветления, после чего опять 4 происходит возрастание оптической" плотности," отражающее процесс

Рис. 2.

Зависимость Мя2+АТФ-аэноЙ активности SUA1) (1) и S1IA2) (2) от концентрации F-актина в координатах Лайонувера-Берка.

-1 1 г. з ч

<1

реассоцинции комплекса. Видно, что у изоформы ;,31<А1)

реапсоцнация комплекса с актином происходит примерно в два раза быстрее, чем у .ЧИА2).

Л'.чюП. .денятурацн«.. .51.. Чем же мохот быть обусловлено более

высокое сродство Sl(Al) к актину по сравнению с SUA2) ? Мы не исключали возможность того, что наличие легкой цепи Al или А2 может влиять на конформацию всей молекулы si. Для того, чтобы проверить это предположение, был проведен сравнительный анализ характера тепловой денатурации изоформ 31 самыми разными Физико-химическими методами.

Методом, который позволяет проводить прямое изучение процесса тепловой денатурации является метод дифференциальной сканирующей микрокалориметрии с использованием "последовательного отжига". Он позволяет экспериментально разлагать суммарный контур теплопоглощения белка на элементарные пики, каждый из которых соответствует плавлению отдельного структурного домена в молекуле белка. В суммарном si было обнаружено 3 таких домена с максимумами плавления при 39, 47 и 51°С (домены 1, 2 и 3 соответственно) .

Нам было интересно посмотреть, как влияют разные щелочные легкие цепи на доменную структуру S1. На рис.4 хорошо видно, что изоформы S1 не различаются по положению пиков 2-го и з-го доменов, но сильно различаются по положению пика 1-го, наиболее термолабильного домена.. В 31(А1) он плавится при более низкой температуре (36°0), чем в 81(А2) (40,5°с).

Для того, чтобы более детально охарактеризовать »тот домен, мы провели сравнительный анализ тепловой денатурации изоформ 31 другими методами, но в тех же ионных условиях и при той же скорости нагрева образцов (1°С в мин). На рис.5 представлены температурные зависимости тепловой агрегации изоформ 31. Как видно, s1<А1) агрегирует при более низкой температуре,, чем 31(А2), что совпадает с литературными данными (Mrakovoic-Zenic et al.,1981). Полумаксимальный прирост оптической плотности по результатам четырех опытов составлял для SI(Al). - 35,5 t 1°С , а для Si(а2) - 43,0 i 1,5°С. Полученные результаты свидетельствуют о различии конформации si(Al) и 31(А2), так как они отражают процесс разворачивания молекул изоформ и характер белковой агрегации, вызываемой денатурацией.

Другим методом изучения температурной денатурации белков является исследование собственной триптофановой Флуоресценции белка. Мы исследовали изменения, происходящие в положении максимума спектра триптофановой флуоресценции при нагревании

изотри 31. Изменение этого параметра для обеих изоформ 31 происходило в области температур от 40 до 50°С, то 'есть практически в области плавления 2-го домена. В области плавления 1-го домена не происходило никаких изменения. Разли-

Рис. 4.

Суммарные контуры теплопог-лощения (—) и элементарные • пики, полученные в результате "последовательного отжига" (—) для S1(A1) (А), S1 i Л 2 ) (Б)-и изолированной А1 (В). Концентрация белка 2 мг/мл. Скорость нагрева 1 И/юа Масштаб соответствует 500 Лк/К кг

чип в спектрах триптофановой флуоресценции у изоформ S1 не обнаружено. Поэтому можно сделать -вывод, что 1-й домен, конформация которого различается у изоформ, вероятно, не содержит остатков триптофана.

Хорош известно, что температурная денатурация si сопровождается инактивацией его АТРазы (Setton,1984; Setton .et al.,1988; Burke et а1.,1Э87). Мы также исследовали температур-, ную инактивацию-K+-edta, Са2+- и актин-активируемой иг2+-АТРазы ИЗофорМ S 1 .

Несмотря на то, что механизм реакции для этих АТ-Раз различен, их инактивация происходит в одной и той же температурной области - 34~48°С (Таблица 2), хотя исходные актин-активируемые активности у изоформ S1 значительно отличаются (Табл.1).

Следовательно, те области белковой молекулы,_ которые от-печамт за связывание и гидролиз ATF, по-видимому, имеют сходную кои^юрмацгю в обеих изоформах S1 и денатурируют одинаковым

На ряс .6 схематично показана структура тяжело!) цепи Э1. При обработке трипсином она расщепляется на три стабильных фрагмента с молекулярными массами 23 (аминокислотные остатки с |?350

Рис.5. и

Температурные зависимости тепловой агрегации для а1(А1) (1) ом

и 81(А2) (2). Концентрация белка 1 мг/мл. Скорость нагрева 1°С в мин., Пунктиром указаны температуры■ при которых оптическая плотность достигала половины максима- о льиого значения (Т1/2>-

Таблица 2. Параметры .температурной инактивации АТРаз у цзоформ 81.

Тип АТРазы

Область инактивации <°С>

Температура полумаксимума инактивации

31 (А1)

31(а2)

81.(А1)

31 (Л2)

к+-еота Са

актин-активиру-емая

34-48 -34-46,6

34-48

34-48 36-47

34-46

41,510,5 41,2+0,5

41,010,5

и,5±0,3 40,6+0,6

40,5+0,5

1 по 204), 50 (205-63Б) и 20 (642-809) кД. Параллельно в нашей группе было показано, что избирательная деградация среднего сегмента 50 кД приводит к исчезновению пика 1-го домена на термограммах 31- '(ЬвуПвку еЬ а!., 1990). Таким образом, первый наиболее термолабичьный домен локализован в среднем сегменте 50 кД. Но где конкретно? . Мы. показали, что.этот домен не содержит трипгофановы>. »статков и групп, отвечающих за работу миознновий АТРазы. В сегмента 50 кД имеется 3 остатка триптофана (в положениях 440, 6ю и 695), но все они локализованы в его (.:-

концевой области (Тог^, ЕЗ^щга, 1990), как и группы, связанные о работой А'ГРазы, поскольку рассщепление тяжелой цепи 31 тромбином между Ьув-бб'о и 8ег-5б1 приводит к полной инактивации АТРазы Б1 (СЬаиазергес! а1.,1986).

Следовательно, можно предположить, что первый домен представляет собой какой-то участок последовательности в N-концевой

Рис.6. Схематическое изображение первичной структуры тяжелой цепи в виде сегментов 23, 50 и 20 кД.

ТР0М5Ж

lys-560 | S№Î61

U:

23 50 M • 20

1 20Ш 5Х № К

Тф-440

Tip-510 ;

области сегмента 50 кД и образует конец миозиновой головки, с которой связываются антитела к этому сегменту (Левицкий,1991).

Мы предполагаем, что прямое взаимодействие н-концевой области Al с концом миозиновой головки сопровождается изгибанием молекулы si(Al), вследствие чего изменяется конформация первого домена. Данный домен становится более термолабильным и плавится при более низкой температуре (36°С), в отличие от si(A2), и которой А2 не способна взаимодействовать с первым до-моном (он плавится при 40,5°С) и изменять его конФормацию.

В предыдущем раздз;.е мы проанализировали один из возможных вариантов объяснения более высокого сродства 31<А1) к актину, по сравнению с в 1<А2), а именно различие в коиформационном состоянии первого домена у изоформ. Но по литературным данным я-концевая область А1 может непосредственно контактировать с актином, создавая в Э1(ла) дополнительный участок связывания актина - кроме тех, что уже имеются в тяжелой цепи вX<А2) (Рг1пс-е еЪ о1.,1981; 8иЪоЬ,1982; УататоЪо, 1983; Тгауег е\, а 1 ., 1987 ). Эти данные наводят на мысль о различном характере связывания изоформ э1 с р-акт;:;;о;>;. Можно предположить, например, что молекулы бна!) и э 1 (а2) связываются с р-актином с

разной ориентацией и что такое связывание вызывает в актиноинх филаментах разные по характеру конфирмационные изменения. Для проверки этих предположений мы использовали метод поляризационной микрофлуорометриии.

Этот метод, в отличие от большинства других, позволяет исследовать не только количество связавшихся с актином молекул 31, но и характер этого взаимодействия, а также ориентации и подвижность флуорофоров, локализованных в актине или в si.

Различия между изоформами были обнаружены при исследовании поляризованной флуоресценции метки 1,S-IAEDANS, специфически присоединенной к определенным SH-грулпам как в 31, так м в актине. В таблице 3 приведены рассчитанные для этих случаен поляризационные характеристики, отражающие ориентации флуор1 *!»■>-ра (Ф|7, угол между осью F-актина и осциллятором излучения флуорофора S) и его подвижность (н, относительное количество хаотически расположенных, флуорофоров)■

Таблица Э. Поляризационные' характеристики теневых мышечных волокон при декорировании F-актина волокон изоформами SI - SHM) и SUA2). Условия: 20 мМ Трис-HCl буфер (рН 7,21,1 мМ'М<С12

Локализация 1.5-ХАБ0АИ8 Вариант опыта град N (отн.ед.)

ей¡-группа в тяжелой цепи энап или Я1(А2> F- -актин+ЗКАП -актин+81(а2) 46,0»0,1 45,4t<M 0, 0, ,091*0,003 , 087^0,003

зн-группа Сув-177 в А1 или Сув-136 в А2 FF- -актин+31(ai) -актин+si(a2) 62,0*0,1 62,210,1 0, 0, , 17510,003 ,21010,004

ЯН-группа остатка Сув-з 7 4 в Р-актине волокон FFF- ■актин •актин+SK al ) -актит31(А2 ) А. 52,6t0,2 56,OiO,2 54,5i0,2 0,295*0,005 0,145t0,005 0,255i0,005

Как видно, метки, присоединенные к SHj-группе остатка Сув-707 в тяжелой цепи SHA1) или SKA2), различаются у связанных с р-вкгином изоформ S1 по ориентации, но не различаются по подвижности. Это говорит о том, что молекулы Sl(Al) и SKA2) по-

разному ориентированы относительно оси актинового филамента. В том случае, когда флуоресцентная метка присоединена к самой щелочной легкой цепи (к единственной an-группа в С-концевой области А1 или А2), ее подвижность у связанных с F-актином молекул ЗИМ) заметно меньше, чек у молекул SKA2). Однако самые значительные различия в подвижности флуоресцентной метки наблюдались тогда, когда она присоединялась к SH-группе остатка Cys-374 в С-коицевой области актина: связывание suai) с F-актином вызывает значительное уменьшение величины N (в 2 раза), тогда как связывание si(A2) снижает величину N менее чем на 16% (Таблица з.(. По-видимому, связывание ai(At) с F-актином волокон вызывает значительные конформационные изменения в С-концевой области актиновых молекул вблизи от Суа-374. Это вполне согласуется с литературными данными, о том, что при взаимодействии 31 с актином Al (но не А2) вступает в непосредствен^ 1 контакт именно с этой областью молекулы актина (Sutoh,1982 ; Trayer et al., 1987).

Подводя итоги этой части работы, можно заключить, что si(Al) и 81(А21, связываясь с F-актином мышечных волокон, оказываит сходное влияние на общее к'онформациокное состояние актиновых нитей в волокнах. Различия между 81(А1 )• и SHA2), обусловленные взаимодействием N-концевой области AI- с С-концевой областью актина, носят достаточно локальный характер и проявляются главным образом в тех областях, которые имеют отношение к этому взаимодействию - в Области контакта А1 о актином или поблизости от нее, а также в С-концевой области самой Al.

Изучение кинетики взаимодействия ЗЦА1) и 31(А2) о F-актином р растворех. Для изучения быстрой кинетики связывания изоформ 81 с F-актином В' растворе нами бйл применен метод остановленного потока.

На Рис.7 представлена кинетика прироста светорасоеяния после смешивания изоформ Si(Al) и S1U2) с F-актином. Как видно, в случае si(A2) начальная скорость роста светорассеяния выше, чем в случае 31(Al). Мы определили кинетические параметры взаимодействия si(Al) и si(A2) с F-актином. Изоформы Si мало различались по значению константы скорости реакции второго порядка (kjj) : <4,8*0,2).ю7 м-1, о"1 для Sl(Al) а (3,2±0,2)-'107

H

m"1, о"1 для SKA2). Значительно более заметными были различия между изоформами по значению максимального прилета интенсивности светорассеяния 1/10 при полном насыщении к-актина: 0,07640,006 для 31(А1> и о.гоо+о.опп для sI<а2). Тнким образом, изоформы 31 мало-различались по скорости их связывания с F-актином, но существенно различались по интенсивности светорассеяния декорированных ими фила ментов f-hkthhu. Меньшая интенсивность в случае F-актина, декорированного siiAi). никак не может быть обусловлена меньшим количеством присоединенных ч F-актину молекул 31<А1), поскольку нам уже было известно, что 81(А1> обладает большим сродством к актину, чем S1IA2).

îM,

Можно предположить, что обнаруженные различия в интенсивности светорассеяния декорированных изоформами SI фнламентов актина могут быть вызваны различиями в характере при,соединения молекул si(A!) и si(AZ) к F-актину. (В пользу такого предположения говорят, в частности, приведенные выше данные поляризационной микрофлуориметрии>4

Для проверки этого предположения мы исследовали седнмен-тационные свойства F-актина, декорированного Sl(Al) и SKA2).

На Рис.8 представлены седименюграммы актиновых филамен-тсв, декорированных Sl(Al) и 31(А2). Как видно, филаментн, декорированные SKA1), седиментируют быстрее, чем филаменты деко-

рированные ЗНА2). Рассчитанные значения коэффициентов седиментации составили 1в4*т s и 108*4 3 для актиновых филаментов, декорированных SUAI) и SHA2), соответственно. Вероятно, молекулы SI (Al) более плотно, чем ЗИЛ21, прижаты к поверхности актинового филамеита. В результате филаменты, декорированные 8UA1), являются более компактными, быстрее .сегментируют и обладают меньшим светорассеянием, чем филаменты, декорированные

Рис.в. Седиментограммы филаментов К-актина , декорированных ЗНА1) (А) и 31< А 2 > (Б). Р-актин - 2 кЫ, 81<А1> - 1 |.1КН. 8иа2) - 1 мкм. Скорость вращения ротора 12000 оборотов в мин; вертикальная отметка соответствует 0,2 единицам оптической плотности при 280 нм. Стрелкой показано направление седиментации. Сканирование проведено через 4 5 мин (а) и 46 мин (б) после достижения скорости ротора 12000 об/мин.

164±7S

108 M s

12000 rpm

3HA2). Это вполне согласуется с литературными данными о том, что si(Al) имеет дополнительный, отсутствующий у SKA2), контакт с актином благодаря взаимодействию N-концевой области А1 с С-концевой областью молекулы актина (Sutoh,1982; Trayer et al.,1987).

При исследовании кинетики взаимодействия 31 о

К-актином мы показали, что семо взаимодействие протекает очень быстро и завершается через 100-150 мс поел« смешиьнни.ч, пдннко прирост светорассеяния на этом не заканчивается: в секундном интервале мы наблюдали медленный, но гчоьна значительный дальнейший прирост (Рис.9). Было высказано предположение, что это обусловлено агрегацией актшювых Филаменто», декорироьинннх

Рис.9. Кинетика взаимодействия (1 мкМ) с т-актином (1 мкМ). 1/10 относительная интенсивность рассеяния. Вертикальной линией обозначен момент времени, при котором изменен масштаб по оси абсцисс. Плавная линия представляет собой рассчегную кри-. вую, построенную по экспоненциальному закону (к^гЗб 1/с, 1/1о=0,182).

ûIAo

50 100 Т(нс)

молекулами "si. О возможности таких взаимодействия между нитями F-актнна свидетельствуют имеющиеся в литературе данные об образовании пучков актиновых филаментов, декорированных 31 (Ando et al.,1985; Ando,1987), причем наиболее благоприятным условием для такой агрегации является замена Cl" на ClijCOO" (Ando,1987).

На Рис.Ю представлена кинетика прироста кажущейся оптической плотности после взаимодействия мэоформ 31 с F-актином, снятая в минутном диапазоне. Как видно, прирост в случае si ! Al) намного больше, чем в случае 31 (А2) (примерно в 6 раз).

Для детального исследования такой агрегации мы применили метод седиментационного анализа. Было проведено более 20 опытов, в которых попарно исследовались комплексы F-актина с Si (al) и s1(a2) иак в среде с низкой ионной силой, так и в присутствии 60 мМ ацетата калия. Ни в одном из опытов не было

обнаружено никакой агрегации комплексов F-актина с SKA2). Напротив, мы неоднократно наблюдали агрегаты филаментов F-актииа, полностью декорированных S1(Al I (при молярном отношении Sl(А1) к актину, равном 2). Формы проявления агрегации были достаточно разнообразными. Зачастую агрегаты были очень гетеро-генны; однако в ряде случаев мы наблюдали весьма гомогенные

Рис.Ю. Кинетика прироста кажущейся оптической плотности после сме- О.М вивания F-актина ( 2 мкМ) с 4 мкМ S1 < А1 > (кривая 1) или с 4 мкМ S1(A2) фивая 2). Кривая 3-2 мкМ F-актин без добавок. Запись начинали после QQ9 перемешивания, через 10 с после добавления изоформ si к F-актину. Условия : 10 мМ имидазол-ацетатный буфер (р!1 7,0), 1 мМ ацетата магния и 60

мМ ацетата калия л 0 4-6

U Т(мин)

агрегаты, для которых удалось определить коэффициенты седиментации (Рис.11).

Таким образом, только изоформа Sl(Al), взаимодействуя о F-актииом, способна индуцировать агрегацию, причем важнейшим условием является- полное насыщение актиновых филаментов молекулами SI(Al) а также, по-видимому, наличие небольшого количества дополнительных свободных молекул SI(Al) в растворе. Наиболее вероятной причиной агрегации нам представляется взаимодействие между N-концевыми сегментами А1 молекул 31(Al), присоединенных к разным актиновым филаментам. Взаимодействием

1 щ^м I1

и

-•!- И'. ':5;15.5!П1П>л . 568 + 33 э ^

1« т ¡111 I Ь, .¡-' |'I .-! ;

Ш 374 ±183 | !

♦ 12000 грп»

12000 г рт

36 ггнп Й 0.2

V 5

12000 грт

Рис. 11.

ванными 31(А1>. А-В - 2 мкл1» акт:™ _ ш,шдаз0л~ ИС1

К-актина ♦ * шМ 81(а2»^нмилазол-вцетатный буфер

буфер рН 7,0), 1 м«с12' 1° „,, ГНлГоок Вертикальные отметки (рН 7,0), 1 мМ (СН3СОО)2Ма, «О им СНОСОК, ьер-плот.

рованне проведено через к^м щие„ты седиментации,

об/мин. На седиментограммах ^^^Яновыми фнламенташ. рассчитанные ^ТндТП П КоэФФициеты седимен-

подобного типа можно объяснить необходимость для агрегации полнот насыщения филыментов F-актина молекулами Sl(Al): достаточно лишь представить принцип действия "застежки-молнии", когда "отсутствие всего нескольких звеньев уже препятствует полному смыкании. Не исключено также, что в агрегации описанного выше тип» существенную роль играет еще одно взаимодействие, предложенное нами выше - взаимодействие N-концевого сегмента А1 с тя-. келой цепь» s И А1). Если предположить, что такое взаимодействие может быть не только внутримолекулярным, но и межмолекулярным, то можно попытаться объяснить необходимость для агрегации избытка свободных молекул si(Al): такие молекулы, способные взаимодействовать двумя разными способами с молекулами si(Al), присоединенными к актиновым филаментам, могут, по-видимому, играть роль "мостиков", соединяющих разные актиновые филаменты, декорированные s 1(Al).

Заключение.

Проведенный нами сравнительный анализ изоформ si показал, что все наблюдаемые различия обусловлены способностью N-концевого сегмента А1, отсутствующего у А2, к взаимодействиям самого различного типа:

во-перных, М-концевая область А1 может, по-видимому, взаимодействовать с концом миозиновой головки, изменяя конфирмационное состояние 1-го, наиболее термолабильного домена в молекуле si: во-вторых. при взаимодействии SHA1) с ^-актином, N-концевая область А1 вступает в непосредственный' контакт с С-концевой областью молекулы актина, изменял характер присоединения миозиновой головки к актину;

В-третьих, мы предполагаем, что эти N-концевые области Al разных молекул 8ИА1) могут взаимодействовать между собой, вызывая агрегацию декорированных актиновых филаментов.

Выводы.

1. Различными методами проведен сравнительный анализ свойств изоформ 31, содержащих разные щелочные легкие цепи А1 и А2.

2. Методом дифференциальной сканирующей микрокалориметрии с использованием "последовательного отжига" проведено сравнение изоформ si по доменной структуру. Показано, что изофор-мы si не различаются по конформационному состоянию 2-го и

3-го домена, но различаются по положению 1-го, наиболее термолабильного домена, который у 31 (А1 > плавится с максимумом при 36°С, а У 31(А2) - при 40,5°С.

3. Методом поляризационной микрофлуоршлзтрип показано, что все наблюдаемые различия между изоформами 31 при их связывании с Р-актином мышечных волокон обусловлены тем, что м-концевая область А1 в 31 <а1> вступает в непосредственный контакт с С-концевой областью актина.

4. Методом остановленного потока исследована быстрая кинетика связывания изоформ 31 с К-актинон. Показано, что нэофорны мало различаются по скорости связывания с Р-актином. но существенно различаются по интенсивности светорассеяния декорированных ими филаментов Р-актина.

5. Методом седиментационного анализа показано, что филаменты Р-актнна, декорированные 31(А1>, седиментирувт значительно быстрее, чем филаменты, декорированные 311А2). Предполагается, что это обусловлено различным характером присоединения изоформ 81 к Р-актину, а результате чего актиновые филаменты, декорированные ЗЦА1), являются более компактными и обладают меньшим светорассеянием, чем филаменты, декорированные ЗИА2).

6. Показано, что только изоформа 31(А1), взаимодействуя с Р-актином, способна индуцировать агрегацию декорированных ею актиновых филаментов.- Предполагается, что такая агрегация обусловлена взаимодействием между Я-концевыми сегментами Л1 разных молекул 31(А1), присоединенных к разным актиновым филаментам.

7. Сделано заключение, что все наблюдаемые различия между изо-формамн 31 обусловлены способностью дополнительного и-кон-цевого сегмента -А1 вступать в разные взаимодействии, к которым А2 неспособна <с тяжелой цепью 31 в области первого домена, с С-концевой областью актина и друг с другом).

Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:

1. П.Л.Шныров, Д.И.Левицкий, Н.С.Веденкина, О.П.Николаева, п.В.Хворов, Е.Д.Пермяков, Б.Ф.Поглазов. Доменная структура субфрагмента 1 миозина// Доклады АН СССР. 1989, т.304, с.1497-1499

2. D.I.Levltaky, V.L.Shnyrov, O.P.Nikolaeva, N.L.Ooliteina, N.S.Vedenkina, N.V.Khvorov, E.A.Permyakov. ОоваЛп organl-eatlon of iaoforea of the ayoein eubfragnent 1// Int.Symp "Molecular organization of biological structures" (Moaoow, June 19-24, 1989): Abstacte.-Moscow, 1989, V.2, p. 196

3. N.L.Ooliteina, O.P.Nlkolaeva, ».I.Levitsky, Yu.S.Borovikov. Interaction of alkali lifiht chain-isoforms of ayoftin aub-fragaent 1 with F-aotin of Buacle flbere// Int. Syiap. "Molecular organization of biological etruoturea" (Moscow, June 19-24, 1989): Abetact«.-Moecow, 1989, V.2, p.204

4. О.П.Николаева, Д.И.Левицкий, В.Л.Шныров, H.С.Веденкина, Н.Л.Голицына, Е.А.Пермяков, Б.Ф.Поглазов. Влияние щелочных легких цепей на характер тепловой денатурации субфрагмента-1 миозина// VI Всесоюзная конференция .по биохимии мышц (Тбилиси, 5-7 декабря 1989 г.): Тез. докл., Тбилиси, 1989, с,91

5. Н.Л.Голицына, О.П.Николаева, Ю.С.Боровиков, Д.И.Левицкий, Б.Ф.Поглазов. Поляризационно-флуорнметрическое исследование взаимодействия изоформ субфрагмента-1 миозина с Ф-актином мышечных волокон// VI Всесоюзная конференция по биохимии мышц (Тбилиси, 5-7 декабря 1989 г.): Тез. докл., Тбилиси, 1989, о.41

6. Д.И.Левицкий, Ю.С.Боровиков, О.П.Николаева, Н.Л.Голицына, Б.Ф.Поглазов. Влияние щелочных легких цепей миозина на взаимодействие субфрагмента 1 миозина с актином в растворе и в теневом мышечном волокне// Биохимия", 1890, т.65, N.9, с.1690-1698

7. Д.И.Левицкий, Н.Л.Голицына, О.П.Николаева, Ю.С.Боровиков. Взаимодействие изоформ* субфрагмента-1 миозина, содержащих флуоресцентно меченные' щелочные легкие цепи, с актином мышечных волокон// Биохимия, 1991, т.56, N.4, с.639-647

8. Б.И.Курганов, Н.Л.Голицына, Л.Н.Моисеева, О.П.Николаева, Д.И.Левицкий. Изучение кинетики взаимодействия субфрагмента 1 миозина скелетных мышц кролика с • Ф-актином методом остановленного потока// Доклады АН СССР, 1991, т.317, м.2, С.484-488

0. D. I.Levlteky, О .P. Nlkolaeva, N. 8.Vedenkina, V.L.Shr.yrov, N.L. Ooliteina, N.V.Khvoi-ov, В. A .Permyakov, B.F.Poglazov.

The effect of alkali'liflht chains on the thermal stability of myosin subfragaent 1// Biomedical Science, 1991, V.2, N 2, p.140-147

10. Д.И.Левицкий, О.П.Николаева, Л.В.Калмыков, II.Л.Голицына, В.П.Хотченков, Б.Ф.Поглазов. Щелочная легкая цепь А1 отвечает за агрегацию актиновых филаментов, декорированных субфрагментом-3 миозина// Доклады АН СССР, ¡991, т.319, Н.б, с.1491-1495

11. N.L.Ooiitmina,, D.I.Levitaky, L.N.Moieeeva, О.P.Nikolaeva, . B.I.Kurganov. The kinetic* of the Interaction of rabbit nkeletal myosin eubfragment-l Kith F-actin: Tho rol« of alkali light chain at "atronjt" and "weak" actin-bindln*// Kinetic«// Journal of Chemical and Biochemical Kinetics, V.l, N 4, p.1-8.