Структура головки миозина и функции его легких цепей

Левицкий, Дмитрий Иванович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структура головки миозина и функции его легких цепей
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Структура головки миозина и функции его легких цепей"

и 11.;

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК Институт биохимии им. А. Н. Баха

На правах рукописи

Дмитрий Иванович ЛЕВИЦКИЙ

УДК 547.963; 577.363

Структура головки миозина

1 о

и функции его легких цепей

03.00.04 — биологическая химия

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук к форме научного доклада

Москва —

1991

Работа выполнена в Институте биохимии им. А. Н. Баха РАН п в Институте физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского МГУ.

Официальные оппоненты:

доктор биологических на\к В. В. Леднев

доктор биологических наук, профессор В. В. Мосолов

доктор биологических наук Н. Б. Гусев

Ведущая организация: Институт экспериментальной кардиологии Всесоюзного кардиологического научного центра АМН ^^

Защита состоится « » 1992 г. п часов

на заседании Специализированного Совета Д.002.96.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте биохимии им. А. Н. Баха Российской Академии Наук но адресу: 117071, Москва, Ленинский проспект, 33, Институт биохимии им. А. Н. Баха РАН, корпус 2.

С материалами диссертации можно ознакомиться в библиотеке биологической литературы РАН (М')ски^, Ленинский проспект, 33, корпус 1).

Автореферат разослан « Л/*

1992 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета, доктор биологических наук

Т. А. Валуева

- •■; " ' общая характеристика' работы " 'Актуальность проблемы. В основе .молекулярного механизма сокращения и многих иных проявлений биологической " подвижности лежцт взаимодействие двух белков - миозина и актина, . сопровождаемое гидролизом АТР. Молекулы большинства известных-миозинов состоят из двух тяжелых цепей и четырех легких цепей. Тяжелые цепи образуют стержневую часть молекулы, ответственную за ■ образование биполярных миозиновых филаментов, и две глобулярные головки, с которыми ассоциированы легкие- цепи (по две, с кэядой головкой). Головки являются наиболее важными в функциональном отношении частями, молекулы миозина: в них находятся ' активные центры миозиновой АТРазы (по одному в каждой головке) и'именно они •' вступают в непосредственное взаимодействие с актином.'- •' .

До недавнего времени считалось, что элементарный, двигательный .•• акт происходит за счет перемещения всей миозиновой ..головки,-прккреплэнной к актину, и обусловлен конформационтши изменениями/в "шарнирном участке.", соединяющем головки со стеряаювой, частью, молекулы миозина, или в самой стержневой части.1 Однако г. последнее время . появляются- данные, заставляющие вносить существенные , поправки в гипотезу о молекулярном механизме подвижности. Так, В'. клетках простейших организмов .были обнаружены т.н. "одноголосие ■ миозины Iя - глобулярные белки, лишенные . стеркневой части и ', состоящие практически из одной миозиновой головки, но- способные/ при этом взаимодействовать с актинон, гидроллзовать АТР-:я. участвовать в процессах внутриклеточной подвижности. ■ Крокэ того, было показано," что изолированные головки мшэчнсго киозина (субфрагмент-1 миозина, si); прикрепленные к, поверхности стекла' или нитроцеллюлозной пленки, в присутствии АТР -способны вызывать направленное перемещение актиновых фяламантов со • скоростью 1-2 мкм/сек, близкой к скорости сокращения кыяцы ' (около 6 мкм/сек) (ToyoBhima et al., 1987; Taklguehi. et al., 1990). Эти данные позволяют сделать ванный вывод о том, что участки, ответственные за генерацию движения, находятся в шлекулэ миозина на только внэ: головки, но и внутри нее. Это- в .свою очередь заставляет предположить существование в миозиновой . головка отдельных структурных доменов, взаимодействие между которыми обеспечивает высокую внутримолекулярную подвижность головки при ее функциониро- . вашот. К * настоящему времени имеется ряд данных, косвенно

указывающих на возможность наличия в головке миозина отдельных структурных доменов. Это данные электронно-микроскопических наблюдений миозина (Walker Sc Triniok, 1998; 1989) и закристаллизованного SI (Winkelmann et al., 1985; 1991), а также данные о сегментальной подвижности S1 в растворе (Highemith & Eden, 1986). Важность проблемы существования доменной структуры в головках миозина связана с тем, что именно междоменные взаимодействия в головке могут играть ключевую роль в осуществлении двигательных процессов при взаимодействии миозина с актином. В связи с этим особо актуальным становится получение прямых доказательств существования в миозиновой головке истинных структурных доменов. Однако до настоящего времени таких доказательств не было получено.

Другой актуальный вопрос, связанный с работой миозиновой головки, - функции легких цепей миозина. В каждой головке молекулы миозина с тяжелой цепью ассоциированы две разные легкие цепи с молекулярной массой около 20 кД: одна "щелочная" (или "существенная") и одна "регуляторная". Существует 2 формы щелочных легких цепей (AI и А2), которые различаются наличием в AI дополнительного N-концевого сегмента из 40-41 аминокислотного остатка, богатого пролином, лизином и аланином. Как правило, миозины из разных объектов содержат одну из втих форм щелочных легких цепей - либо типа AI, либо типа А2. Исключением является миозин из быстрых скелетных мышц позвоночных, содержащий А1 и А2 одновременно и зачастую даже в двух, головках одной молекулы. В связи с этим такой миозин представляет собой удобный объект для изучения роли полиморфизма щелочных легких цепей: препарат изолированных головок (субфрагмент-1 миозина, S1) можно разделить на изоформы, содержащие либо А1, либо А2 (S1 (А1) и S1(А£), соответственно), и сравнивать их свойства. Такой подход был разработан достаточно давно (Weeds & Taylor, 1975); однако, несмотря на многочисленные проведенные исследования молекулярный механизм функционирования дополнительного N-концевого сегмента AI яри взаимодействии миози-новых головок с актином остается до сих пор неясным.

"Регуляторные" легкие цепи в некоторых типах мышц и в ряде немышечных клеток полностью оправдывают свое название, принимая непосредственное участие в регуляции взаимодействия миозина с актином ионами Са^ (т.н. регуляция миозинового типа). Так, в мышцах большинства беспозвоночных связывание Са2+ с рогуляторными

легкими цепями необходимо для активации миозиновой АТРазы актином, и для запуска мышечного сокращения. В гладких мышцах и в немышечных клетках позвоночных такая регуляция осуществляется путем фосфорилирования регуляторных легких цепей ' специфическим ферментом - Са2+-кзльмодулин-зависимой киназой легких цепей миозина. Напротив, в скелетных мышцах и в сердце позвоночных Са^-регу-ляция сокращения осуществляется иным путем, при помощи тропонин-тропомиозиновой системы, ассоциированной с акишовнми филаменТами. В то же время аналогичные "регуляторным" легкие. цепи миозина скелетных и сердечной мышц (т.н. ДТНБ-легкие цепи или Jffiy .также спосоОны связывать Са2+ и фосфорилируются в процессе сокращения Са2+-кальмодулин-зависимой киназой легких цепей миозина, однако непосредственного участия в регуляции запуска сокращения мышц они уже нэ принимают и явно ■ выполняют иные, неясные до ста пор функции. Вопрос о функциях "регуляторных" легких цепей миозина скелетных мышц (ДГНБ-легких цепей) требует разрешения.

Цель и задачи исследования. Работа посвящена изучению доменной структуры головки и функций легких цепей в молекуле миозипп из быстрых скелетных мышц кролика. Основное внимание Сило удалено решению следующих вопросов:-

1) Получить доказательства существования в миозиновой головке истинной доменной структуры.

2) Идентифицировать домены, т.е. выявить их соответствие определенным участкам первичной структуры.

3) Изучить изменения, происходящие в доменной структуро миозиновой головки при связывании И гидролизе АТР.

4) .Выяснить функции -дополнительного N-кснцевого сегмента ' щелочной легкой цепи А1 при взаимодействии миозина с актином путем сравнительного анализа свойств изоформ S1, содержащих разные щелочные легкие цепи а1 и AZ.

5) Исследовать влияние связывания Са2+ с "рвгуляторннми" легкими цепями миозина (ДТНБ-легкими целями) и фосфорилирования этих легких цепей на свойства миозина и на характер присоединения миозиновых головок к актину.

Объект и основные метода исследования.

Главным объектами исследования являлись миозин из быстрых скелетных мышц кролика и ого изолированные головки - субфрагмонт-1 миозина (S1). Для различных целей использовала разнне препарата

- А -

Б1. Препарат Б1, обычно получаемый при протеолизе миозина химо-трипсином в присутствии ЭДТА, содержит интактные щелочные легкие цепи А1 и А2, но не содержит ДТНБ-легких цепей; в ряде экспериментов его разделяли на изофорш, содержащие разные щелочные легкие цепи А1 и А2 (Б1 Щ) и 31 (Л2), соответственно), и сравнивали их свойотва. Препарат , получаемый при протеолизе миозина папаи-ном в присутствии %г+, содержит интактше ДТНБ-легкие цепи. В ряде случаев использовали также тяжелый меромиозин (ШМ), получаемый при протеолизе миозина химотрипсином при высокой ионной силе в присутствии Са2+; этот активный фрагмент миозина сохраняет обе го-, ловки, содержащие интактные ДТНБ-легкие цепи и присоединенные при помощи "шеек" к области субфрагмента-2 стержневой части миозина.

Помимо известных и широко распространенных биохимических методов исследования (электрофорез в ПААГ в присутствии ДЦС На или 8 М мочевины, определение АТРазной активности, спектрофотометри-ческие исследования и т.д.) в работе использовались также методы, достаточно редко применяющиеся в данной области исследований, а зачастую и уникальные. Исследования методом дифференциальной сканирующей микрокалориметрии с использованием "последовательного отжига" проводились в Институте теоретической и- экспериментальной биофизики РАН совместно с д.б.н. В.Л.Шныровым. • Исследования мышечных волокон методом поляризационной микрофлуориметрии проводились в Институте цитологии РАН (Санкт-Петербург) совместно с д.о.н. Ю.С.Боровиковым. Исследования температурных зависимостей положения спектров флуоресценции Б1 проводились в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН совместно с к.б.н. Н.С.Ведешсиной и д.б.н. Е.А.Пермяковым. Электронно-микроскопические исследования миозиновых минифиламентов проводили в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН совместно с д.б.н. З.А.Подлубной. Исследования методом седиментационного анализа проводили в Институте физико-химической биологии им. А.-Н.Белозерского МГУ совместно с П.В.Калмыковым. Изучение быстрой кинетики взаимодействия 31 с актином методом остановленного потока проводили в Институте биохимии им. А.Н.Баха РАН совместно с д.х.н. Б.И.Кургановым и к.б.н. Л.Н.Моисеевой.

Научная новизна работа. Впервые получены прямые доказательства существования в головке миозина истинной доменной структуры. В головке было обнаружено 3 структурных домена, т.е. независимо

уложенных области, разворачивающихся при тепловой денатурации._ кооперативно и независимо друг от друга. Проведена идентификация доменов, т.е. выявлено их соответствие определенным участкам первичной структуры тяжелой цепи миозиновой головки." На основании анализа собственных экспериментальных результатов и многочисленных литературных данных предложена модель доменного строения миозиновой головки.

Впервые получены прямые подтвервдешя гипотезы о том, что в процессе АТРазной реакции миозиновая головка может находиться в одном из двух главных конформационных состояний. Показано, что при переходе из одного состояния в другое головка миозина подвергается глобальной конформационной перестройке, сопровокдающзйся полным изменением доменной структуры.

Показано, что миозиновые головки, содержащие разные щелочные легкие цепи А1 и А2, по-разному взаимодействуют с актином. Это проявляется в их различной ориентации относительно поверхности актинового филамента, а такг:е в различиях по светорассеянию и коэффициентам седиментации мзкду филаменташ Р-актина, декорированным! этими головками. Кроме того, впервые показано, что только головки, содержащие А1, способны вызывать агрегацию декорировагашх ими ситиновых филаментов. Высказано предположение, что все вти различия обусловлены способностью Н-копцевого сегмента А1 вступать в разные взаимодействия (как с актшзон, так и-друг с другом).

Обнаружено влияние связывания Са2+ с ДТНБ-лэгкимя цепяй! и фос'форнлирования 5тих легких цепей на '. характер присоединения миозиновых головок к ахтиновым фнлачентам. Оно проявляется в изменении характера тех ¡информационных перестроек," которые происходят' в актшовых филамэнтвх при связывании с ней головок миозина»

Впервые показало, что фосфорилированш ДТНБ-легких цепей миозина оказывает существенное влияние на ориентацию головок мпо-пина в миозиновых филамэнтах мыззечшпс волокон и на конфорлащюнноо состояниэ ствола филамента, образованного сторззгевыш! чаотями молекул миозина. Такое влияние особенно сильно проявляется в присутствии ионов когда головки прижаты к поверхности миозинового филамента.

Впервые изучено влияние фосфорилированпя легких цепей миозина на свойства миозиновых мшшфшгаментов. Показано, что фосфорилиро-ваниа ДТНБ-легких цепей влияет на кинетические параметры вктин-ак-

тивируомой ы§г+-АТРазной реакции минифиламентов совершенно иначе, чем на соответствующие параметры реакции обычных крупных миозино-еых филаментов. Обнаружена способность миозиновых минифиламентов образовывать хорошо упорядоченные ансамбли за счет взаимодействий между головками разных молекул миозина на концах минифиламентов. Показано, что фо сформирование ДТНБ-легких цепей значительно усиливает такие взаимодействия. Высказано предположение, что именно этим и обусловлено необычное влияние фосфорилирования легких цепей на кинетические параметры актин-активируемой АТРазной реакции миозиновых минифиламентов.

Практическая значимость работы. Полученные данные расширяют представления о структурной организации и особенностях функционирования головок миозина, приближают нас к пониманию молекулярного механизма мышечного сокращения и иных проявлений биологической подвижности, основанных на взаимодействии миозина с актином, и стимулируют дальнейшие исследования в атом направлении.

Результаты работы могут быть использованы при чтении курсов лекций по биохимии и биофизике, мышечного сокращения и биологической подвижности.

Апробация работы н публикации. Основные результаты работы были представлены и обсуждены на следующих конференциях, съездах и симпозиумах: I Всесоюзном' биофизическом съезде (Москва, 1982); VII - IX Всесоюзных симпозиумах по биофизике и биохимии биологической подвижности (мышечное сокращение) (Тбилиси, 1983; ' Пущино, 1987; Тбилиси, 1990); 1У-У1 Всесоюзных конференциях по биохимии мышц (Ленинград, 1981; Тбилиси, 1985; 1989); IV Всесоюзной школе по проблемам биологической подвижности (Ленинград, 1985); Всесоюзной школе "Актуальные проблемы биохимии в приложении к задачам биотехнологии, сельского хозяйства и медицины" (Ульяновск, 1988); XII, XIV, XVI, XIX и XX Европейских конференциях по мышечному сокращению и клеточной подвижности (Венгрия, Сегед, 1933; •ФРГ, Ульм, 1985; Франция, Монпелье, 1986; Бельгия, Ерюссоль, 1990; Великобритания, Оксфорд, 1991); Международном симпозиуме "Молеку-' лярная организация биологических структур" (Москва, 1989).

По матершлам диссертации опубликовано 50 работ в отечественной и зарубежной научной печати: монография (в соавторстве с Б.Ф.Поглазовым), 3 обзора, 27 статей, 19 тезисов в материалах

съездов, симпозиумов и конференций. Главные результаты работа и, сделанные на их основе выводы изложены в обобщенном виде в представленном докладе.

СТРУКТУРА шозиновои ГОЛОВКИ Анализ данных литературы

Первичная структура субфраглента-1 лхюзияа и локализация 0 ней функционально вахных участков. Субфрагмент-1 миозина (Э1) представляет собой изолированные миозиновне головки, получаемые при расщеплении молекулы миозина протеолитическими фермэнтами. Препараты Э1 различаются в зависимости от условий протеолиза и используемых протеиназ, однако длл всех них характерно-сохранение таких главных свойств миозина, как АТРазная активность и способность взаимодействовать с актином. Наиболее часто используемый препарат Б1, получаемый в результате протеолиза миозина химо-трипсином в присутствии ЭДТА при комнатной температуре, состоит из тяжелой цепи с молекулярной массой 95 кД (809 аминокислотных остатков) и ассоциированной с ней щелочной легкой це^ч (А1 или А2). Такой утрачивает область "шейки" (не менее 50 остатков), соединящей головку со стержневой частью молекулы миозина, а также регуляторнув легкую цепь (ДТНБ-легкую' цепь), ассоциированную с этой областью. Для тяжелой цепи Э1 характерна четко вырззганная сегментальная структура. Трипсин и многие другие протеипазы расцепляют ее на 3 фрагмента с молекулярными массами 23 кД (остатки 1-204), 50. кД (остатки 205-636) .и 20 кД (остатки 642-809).

На рис. 1А схематически изображена первичная структура рякелой цепи в виде 3 сегментов и локализация в ней участков а' -рупп, важных для связывания и гидролиза АТР в активном центре 1ТРазы 51. В и-концавом сегменте 23 кД это участки шследователь-гости в области остатков Тгр-130 и Еег-180, а такгга Е-ачавогруппа ютатка Ьув-83. В среднем сегменте 50 кД это участок в области ег-324 и участок в с-концевой области этого сегмента, расщепление оторого тромбином между Ьуа-561 и Бег-562 вызывает полную инакти-ацию АТРазы Э1. В С-концевом сегменте 20 кД такие участки окализованы в и-концевой области сегглента (до 719-го остатка); роме того, в этом сегменте локализованы две "существенные" н-группы ен, и бн2 остатков Сув-707 я Сув-697, модкфизцая кото-ах сильно отражается на АТРазной активности 81.

- в -1Î0 154

____„ . ( C/sßHi)

ЯП 180 185 \ 1

Gly-Glu.-Ser-Gly-Ala - Gly - Lys -Thr ' _Asp¡

?0J( 70? 710

<Ile-Ara-Ile-Cys(Sli1)-Ar3-lys-Gl^

Б.

ЛЕ32 ¡--------------■) 6«1

-Gly - G ly - G ly - G ly - Lys -I- Lys - Gly -G ly - Lys - Lys-!- Lys- G ly-

Glu-8

CyS-522\ CyS-TOr(SHi)

/ Ar '*2ÎSiJl8r-ii9S r

1 23K ,H 50 К ^ 1 20 К 1

i % i

Lys-'184 (Lys-189)

Cîs-SW // Cys-63?(SH2)

< 5-4ÏÂJ

Все 3 триптических фрагмента тяжелой цепи S1 в изолированном., состоянии способны взаимодействовать с актином. На рис. 1Б схематически изображена локализация участков связывания актина в тяжелой цепи S1. Один из них находится в С-концевой области сегмента 23 кД; ключевая роль в связывании актина этим участком отводится последовательности остатков 143-147 с высоким положительным зарядом (Dan-Goor & Mühlrad, 1991)- В сегменте БО кД это участок в С-концевой области сегмента и один из остатков ■ Arg (не идентифицирован), способный сшиваться с актином. В сегменте 20 кД с актином связываются N-концевая область и участок в рбластй "существенной"'SH1-группы остатка Сув-707. Кроме того, важную роль в связывании актина играет последовательность остатков 632-643 между сегментами 50 кД и 20 кД, состоящая из остатков Ьув и Gly (Chaussepied & Morales, 1988).

Таким образом, области аминокислотной побледоватёльяости, принимающие участие в связывании и гидролизе АТР и в связывании актина, распределены вдоль всей тяжелой цепи si, имеются во всех 3 ее сегментах и зачастую перекрываются. Представляется совершенно очевидным, что в пространстве эти области должны находиться достаточно близко друг к другу. В результате исследований St . методом бифункциональных сшивок оказалось,■ что Это действительно так.

На рис. 1В схематически представлены идентифицированные к настоящему времени внутримолекулярные сшивки в тягелой цепа ■S1, осуществляемые бифункциональными реагентами с небольшой дгашой образуемой связи (до 1,5 нм). Все такие' сшивки, осуществляются через "существенные" SH-группы БН1 (Сув-707) или SHg (Сув-697),

Рис. I. Схематическое изображение первичной структуры тяжелой цепи S1 в виде сегментов 23 кД, 60 кД и 20 кД.

A) - Локализация участков и груш, ваших для связывания и гидролиза АТР в активном центре АТРазы S1;

Б) - Локализация участков связывания актина (заштрихованы). В последовательности остатков 632-643 пунктиром отмечена область можду сегментами 50 кД и 20 кД, не сохраняющаяся при яротеолязе 31 трипсином;

B) - Сшибки амипокислотных остатков в тяжелой цепи S1 бифункциональными реагентами. Сплоинсй линией показаны сшивки, образующиеся в отсутствие нуклоотидов, пунктиром сшивки, образующиеся только в присутствии М^-АТ? или Mg-ADP. Сверху - сшивки, осуществляемые через sn.-rpyraiy; снизу - сшивки, осуществляемые через SH.,-группу.

расположенные в сегменте 20 кД. БН1-группа сшивается с остатком 01и-88 в сегменте 23 кД и с областью остатков 487-495 в С-конце-вой части сегмента 50 кД, а в присутствии нуклеотида (м§-атр или Мй-АИР) - с БН-группой остатка Суз-522 в С-концевой области сегмента 50 кД. БН2-группа сшивается с аминогруппой Ьув-184 (или Ъув-189) "в С-концевой области сегмента 23 кД, с остатком Аг§-239 в л-концевой области сегмента 50 кД, а в присутствии нуклеотидов - с БН-группой остатка Сув-540 в С-концевой области сегмента 50 кД. Таким образом, все эти области тяжелой цепи Б1 ( сегмент 23 кД, небольшая и-концевая область и С-концевая половина в сегманте 50 кД, и М-концевая половина сегмента 20 кД, содержащая "существенные" БН-группы) в пространстве действительно находятся достаточно близко друг от друга и формируют, по-видимому, единый домен, содержащий большинство функционально вакных участков в молекуле Б1.

Локализация ■различных групп, и участков на поверхности лиоэи-новой головки. Для оценки пространственного положения различных групп и участков в миозиновой головке применяется метод электронной микроскопии. При этом используются 2 главных подхода. Один из них основан на применении специфических антител к различным участкам последовательности, а другой (т.н. авидин-биотиновый метод) - на высоком сродстве белка нвидина к низкомолекулярному витамину-коформенту биотину: биотип, связанный с атр или с различными реагентами, специфически присоединяли к определенным участкам ыио-виновой головки, после чего добавляли авидан и исследовали его локализацию на поверхности головки. Оба подхода позволяют оценить положение различных участков вдоль длинной оси миозиновой головки в плоскости электронномикроскопического снимка. За точку отсчета принимают место соединения головки со стержневой частью молекулы миозина, расположенное на расстоянии около 20 нм от конца миозиновой головки вдоль ее длинной оси. Рассчитанные таким образом расстояния приведет на рис. 2.

Антитела к изолированному фрагменту 50 кД тяжелой цепи 81 окрашивают конец миозиновой головки дапке^пагш & ъоиеу, 1906;' 1Иуап1Б1п о1 а1., 1988), а антитела к изолированному фрагменту 23 кД - область головки, удаленную на 14-18 нм от места соединения головки со старашем (ЩуагЦеМ е1 а1., 1988). Щелочная легкая цепь А2 локализована в узкой части головки и имеет компактную форму (ее н- и С-концы сОликены) (Ка^ь & Ьокеу, 1989); дополнительный

41-членный я-ж>нцевой сегмент А1, отсутствующий у А2, является, более вытянутым и достигает верхней половины головки (Токипа^а е! а1., 1987). Регуляторгош легкие цепи (ДГНБ-легкие цепи) ассоциированы с миозином прямо в области соединэнйя головки со стержневой частью молекулы (Ка-ЬЬ & Ьовдеу, 1989). Важно отметить, что почти все функционально важные участки (области остатков Ьув83 и Сув707, участок связывания АТР и участки связывания актина, расположенные в первичной структуре Б1 поблизости от участков между сегментами 23 и 50 кД и между 50 и 20 кД) локализованы в одной и той же области миозиновой головки - на расстоянии 13-16нм ор места соединения головки со стержнем (рис. 2). По-видимому, в этой области находится функционально важный домен, в формировании которого принимают участие все 3 сегмента тяжелой цепи 81 (23, БО'и 20 кд).

Рис. 2. Схематическое изображение локализации различных групп и участков на поверхности миозиновой головки вдоль ео длинной оси.

5 ОиЕ«

; so'KM -go «ва ■ 2ЭкВа '£0Оа - АТР [ЛИР)

---Lys-U, Суа-70Т (SHi)

---N-eowii тя^с?лси цепи SI

--Н-конец AHj(Ai)

-с-ишц aui(al) к«и лц$(дг) •-Я-ковец ЛЦ,(А2)

- -It-к С-ынцы ЛЧгСаТМБ-ЛЦ)

песто сееЭнвеиия rtAotxa со стержневой частью миогйн»

Таким образом, анализ литературных данных свидетельствует о том, что все участки тяжелой цепи миозиновой голошеи, важные для связывания и гидролиза АТР и для взапмодэйствия о актином,

находятся близко друг от друга в одной и той же области , головки, на удалении 13-16 нм от места ее соединения со стержнем, и формируют, видимо, единый функциональный домен. Является ли он отдельным структурным доменом в миозиновой головке? Для ответа на атот вопрос следует, в первую очередь, доказать существование в миозиноьой головке истинной доменной структуры. Несмотря на наличие косвенных и зачастую весьма противоречивых данных (например, в литературе часто называют "доменами" сегменты тяжелой цепи 81, с молекулярными массами 23, 60 и 20 кД), прямых подтверждений существования в миозиновой головке отдельных структурных доменов до сих пор не было.

Изучение доменной структуры миозиновой головки

Согласно физико-химическому определению, главной чертой домена в глобулярном белке является то, что его структура сворачивается и разворачивается кооперативно по принципу "все или ничего", со значительными изменениями энтальпии и энтропии (Рг1уа1оу,- 1982) В соответствии с этим определением домены можно выявлять при исследовании методом дифференциальной сканирующей калориметрии индуцируемого нагреванием разворачивания белка как независимо уложенные области молекулы, которые разворачиваются кооперативно и независимо друг от друга (Рг1уа1оу, 1982; Пфайль, Привалов, 1982). Однако до недавнего времени при калориметрических исследованиях не удавалось выявить в отдельных независимо плавящихся участков (Бате^ша а1., 1983; ВехЧагиоп & Гвопй, 1989; БЬгхуег & КатаШ, 1990).

Мы проводили калориметрические исследования тепловой денатурации изолированных головок миозина (31), используя метод "последовательного отжига". Этот метод, основанный на неоднократном повторении цикла "нагрев-охлаждение-нагрев до более высокой температуры", позволяет экспериментально разлагать общий контур тешюпоглощения белка на ряд пиков, соответствующих плавлению отдельных структурных доменов в молекуле белка, т.е. участков, которые плавятся кооперативно и независимо друг от друга (энпугоу et аХ, 1984). Применив метод "последовательного отжига",' мы выявили в молекуле Б1 три таких домена. При низкой ионной силе пики, соответствующие этим доменам, имели максимумы около 39-40°С, 47-48°С и 51°С (домены 1,2 и 3, соответственно) (рис. 3).

Рис. 3.' Разложение методом "последовательного Отжига" суммарного контура теплопоглощения

S1 ( -) на элементарные пики

(- — -), соответствующие плавлению отдельных доменов в молекуле S1.

10 МЧ Нерев-КОН (pH 7,3),. 1 mM MgCl2, 17,5 pM S1 (2 mg/ml) Скорость нагрева 1° в минуту. Вертикальная отметка соответствует 500 Дж/ °К«кг.

Л—_I-i—-L.

50 40 5Ü

Таким образом, были получены прямые подтверждения существования в молекуле Э1 истинной доменной структуры.

Для подробного изучения доменной структуры головки миозина мы исследовали, помимо обычного Б1, получаемого при протёолизе миозина химотрипсином, ряд иных препаратов. Во-первых, разделив препарат Э1 на две изоформи, содеркащие разные щелочные легкие цепи А1 и А2, мы сравнили их доменные структуры. Оказалось, что изоформи 51 нэ различаются по состоянию доменов 2- и 3,'но существенно различаются по состоянию домена 1, который плавится с максимумом при 36°С у Э1 (А1) и при 40,5°С у Б1 (¿2). Таким образом; дополнительный я-концевой сегмент А1 в Б1 (А1) оказывает влияние на койформащюнноа состояние самого термолабильного первого домена Б1.

Расщеплешге тяжелой цепи Б1 трипсином на фрагменты 23, БО и 20 кД не оказывало существенного влияния на доменную структуру Э1. Й таком расщепленном Б1 сохранялись те. ле три'Домена. Единственным отличием было то, что саьшй термолабильвый домен 1 в этом препарате плавился при более высокой тешературе . (с максимумом ~ 42°С вместо 39-40°С). По-видимому это было вызвано триптической деградацией и-концеюго дополнительного сегмента щелочной легкой цепи А1, влияющего в интактном 81 на конформацшо первого домена.

Подобная трехдоменная структура была обнаружена в препаратах, которые в отличие от обычного Э1 сохраняют "шайку" головки и содержат интактные ДТНБ-легкие цепи: в 1^-51, получаемом при протеолизе миозина папаином. в присутствии и в головках;

тяжелого меротляозина. Однако в этих препаратах интенсивность пика

домена 3 была в 2-2,5 раза выше, чем в обычном Б1, утрачивающем область "шейки" и не содержащем ДТНБ-легких цепей. Мы 'сделали вывод, что область "шейки", соединяющей головку со стержневой частью молекулы миозина, и ассоциированные с ней ДТНБ-легкие цепи принимают участив в формировании самого термостабильного домена 3.

На рис. 4А представлена кривая теплопоглощения для тепловой денатурации изолированного комплекса С-концевого фрагмента .20 кД тяжелой цепи Б1 со щелочной легкой цепью (А2 или деградированная трипсином А1), полученного после расщепления Б1 трипсином. Эта кривая представлена двумя отдельными пиками. Один из них (с максимумом при 42°С) отражает плавление щелочных легких цепей, которые в изолированном состоянии денатурируют именно в этой области температуры (рис. 4Б1. Другой пик (с максимумом около 53°С) отражает плавление фрагмента 20 кД тяжелой цепи Б1 и коррелирует по положению с пиком домена 3 в молекуле 21 (рис. 3). Исходя из этого, мы сделали вывод, что примыкающий к области "шейки" С-концевой сегмент 20 кД тяжелой, цепи Б1 также принимает участие в формировании домена 3 в миозиновой головке.

Рис. 4. Кривые теплопоглощения ( —) и йх разложение на отдельные пики методом "последовательного отжига" (---) для:

А) • изолированного комплекса С-конце-вого фрагмента 20 кД тяжелой цапи '51 со щелочной легкой цепью (1,8 мг/мл); Б) - изолированных щелочных легких цепей миозина (4 мг/мл). Условия- п

как на рис. 3. Вертикальная отметка соответствует 100 КДж/ К»моль.

кО

т(°с)

Из литературы известно, что средний сегмент тяжелой цепи Б1 с молекулярной массой 50 кД отличается повышенной чувствительностью к денатурации: при достаточно мягких денатурирующих воздействиях (таких, как обработка Б1 метанолом в ■ небольших концентрациях, кратковременное нагревание до 40°С или длительная инкубация при 35°С) он необратимо денатурирует (денатурация сопровождается инактивацией АТРазы Б!) и при последующем нротеолизе 31 трипсином

деградирует до'мелких фрагментов (Витке & Sivaramakrishnan-, -198б;._ Витке et al., 1997; Setton & Muhlrad, 19S4; Setton et al.; -1983). Мы показали, что такая избирательная денатурация и последующая деградация трипсином среднего сегмента 50 кД в тякелой цепй S1 приводит к полному исчезновению пика теплопоглощения первого, самого термолабильного домена; при этом домены 2 и 3--Оставались практически неизменными. Был сделан вывод, что домен 1 представляет собой участок последовательности, расположенный где-то в среднем сегменте 50 кД тяжелой цепи, si.

Следует отметить, что первый пик теплопоглощения на . терло-грамме S1 (рис. 3) является комплексным: помимо плавления 'участка, расположенного в сегменте 50 кД тяжелой цепи S1 (домен 1.),.. он включает плавление щелочных легких цепей, которые депатурируют в этом ив температурном интервале (рис. 4). Полное исчезновение этого пика после избирательной денатурации сегмента - 50 кД обусловлено, видимо, тем, что она проводится в условиях, вызывающих диссоциацию щелочных легких цепей, которые в полированном состоянии плавятся с очень низкой неоперативностью (рчс. 4Б).

Итак, результаты калориметрического анализа различных препаратов позволяют заключить, что в формировании самого тэрг.гаотабиль-ного третьего домена миозиновой' головки принимают участие С-концовой сегмент 20 кД тяжелой цепи S1 и пригасающая к нему область "шейки" головки с' ассоциированной ДТНБ-легксй цепью, а самый термолабилышй первый домен образован участком последовательности, локализованным в среднем сегменте 50 хсД. тяжелой цепи S1. Для более детальной идентификации доменов миозиновой головки (т.е. для выяснеш!я их соответствия определенным участкам первичной структуры) мн исследовали тепловую денатурацию S1 другими методами, но в тех ке условиях и при той же скорости нагрева ' (1°С/кин), что и при калориметрических исследованиях.

На рис. 5 приведены температурные зависимости положения максимума спектра флуоресценции S1 для собственной трштофаповой флуоресценции S1 (рис. 5А) и для флуоресценции метки 1,5-IAEDANS (Н-йодоацотил-N' - (5-сульфо-1 -нафтил )-этплендиашн), предварительно специфически присоединенной к "существенной" SH^-группе остатка Суе-707 в С-концевом сегменте 20 кД тяжелой цепи S1 (рис. 5Б). Изменения этого параметра (Лтах ) отражают изменения кон+ормации, происходящие при тепловой денатурации S1 в областях локализация

флуорофоров. Как видно из рис. 5, сдвиг спектра флуоресценции в более коротковолновую область происходит в обоих случаях в одном и том же температурном интервале, главным образом от 40 С до 50 С,

Рис. б. Температурные зависимости положения максимума спектра флуоресценции интактного Б1 ( —о—) и Б1 после избирательной денатурации и деградации . сегмента 50 кД )■

А) - триптофановая флуоресценция;

Б) - флуоресценция метки 1,5-1АЕБАНЗ, связанной С БН1-группой остатка Сув-707 в тяжелой цепи Б1.

Флуоресценцию возбуждали в обоих случаях при 280,4 нм.

Условия нагревания - как на рис. 3.

4821—1

т.е. в области плавления второго калориметрического домена (рис. 3). Плавление первого калориметрического домена (температуры до 40°С) не сопровождается изменениями положения спектра триптофа-новой флуоресценции (рис. 5А). Более того, избирательная денатурация и последуидая деградация трипсином среднего сегмента 50 кД в тяжелой цепи Э1, приводящая к исчезновению первого калориметрического домена, но оказывала никакого влияния на температурную зависимость положения максимума спектра трилтофановой флуоресценции Б1 (рис. 5А). Результаты этого эксперимента позволяют сделать

два важных вывода: во-первых, домен 1 не содержит, скорее всего,, остатков триптофана; во-вторых, как триптофановые остатки, так и остаток Сув-707, к БН1-группе которого была присоединена флуоресцентная метка, содержатся во втором домене.

Тепловая денатурация домена 1 (рис.3) коррелирует с инактивацией АТРазы 51 (рис. 6), которая происходит в температурном интервале 34-48°С (50Я инактивации при температуре около 41 °0) для всех исследованных АТРазннх активностей Б1 (К+-ЭДТА-, Са2+- и актин-эк-тивируемая Ме^+-АТРазная активности). Несмотря на то, что изофорш с разными щелочными легкими цепями А1 и А2 различаются по конформационному состоянию этого домена, они не различаются по температурной зависимости инактивации АТРазы. По-видимому, домен 1 содержит один из АТР-связывагащих участков в первичной последовательности Б1, конформация которого одинакова у изоформ ЗГ.

Рис. 6, Температурная за- /а 1пп висимость тепловой игакти- 1ии вации К -ЭДТА-АТРазы Б1. Условия нагревания - как 50 на рис. 3. По достижении соответствующей темпэрату- ' ры аликвотн белка (30 Ц1) 60 охлавдали до комнатной температуры и измеряли К -ЭДТА-АТРазную активность 40 по выделению р^ в среде,

содержащей (0,04 мг/мл), о0 50 мМ трис-Н01 • буфер (рН 7,6); 0,5 М КС1, Б„мМ ЭДТА, 1 Ш АТР, при 25 С. . 0 За 10ОД принимали исходную 25 30 35 40 45 50

активность 31, равную ' . Т(°р)

3,62 мкмоля р^мг-мзш. . 1-4

Доиенная модель строения шозйновоЗ головки

Суммируя результаты проведенных экспериментов и сопоставлял их с литературными данными, можно представить локализацию демонов в первичной структуре миозиновой головки (рио. 7).

Наиболее тармолабильный домен 1 локализован, скорее всего, в среднем сегменте 50 кД тяжелой цепи з1, и не содоротт остатков триптофана. Из 5 тркптофаностх остатков, имэщихся в Э1, 3 остатка находятся в сегменте 50 кД, причем все они локализованы в его '

С-концевой области (рис. 7). Поэтому представляется наиболее вероятным, что домен 1 образован участком последовательности в N-концевой половине сегмента 50 кД. По-видимому, этот домен содержит один из АТР-связыващшс участков в первичной последовательности si - область вокруг остатка Ser-324 в N-концевой части сегмента 50 кД (рис. 1А).

Домен 2 образован, скорее всего, различными частями всех трех сегментов тяжелой цепи S1: сегментом 23 кД, С-концевой областью сегмента 50 кД, содержащей остатки триптофана, и N-концевой областью сегмента 20 кД, содержащей "существенную" SH-rpymiy SH1 (остаток Сув-707). Все эти участки расположены в пространстве близко друг от друга, о чем свидетельствуют данные внутримолекулярных сщвок, осуществляемых бифункциональными реагентами (рис. 1В). По-видимому, в состав домена 2 входит также небольшой участок в Н-концевой области сегмента 50 кД, содержащий остаток Arg-239, который в отсутствие нуклеотидов сшивается с БН2-группой остатка Oys-697 в сегменте 20 кД (рис. 1В). Судя по всему, именно калориметрический домен 2 соответствует домену, содержащему большинство функционально вахных участков в миозиновой головке, существование которого было постулировано выше при анализе данных литературы.

Самый термостабильный калориметрический домен 3 в S1 соответствует, скорее всего, С-концевой части сегмента 20 кД (после остатка Оув-707). Примыкающая к ней в миозиновой головке область "Шейки" с ассошшроввшшми ДТНБ-легкими цепями также принимает участие в образовании этого домена (в препаратах Mg-S1 и тяжелого меромиозина). По-видимому, в формировании домена 3 принимают участие и щелочные легкие цепи, ассоциированные своей С-концевой частью, общей для А1 и А2, с С-концевой областью сегмента 20 кД тяжелой цепи SI (Burke et al., 1983). Не исключено, однако, что эти легкие цепи образуют в головке отдельный небольшой домен, который плавится с максимумом около 40°С (рис. 4) и совпадает по положению с пиком домена 1 в S1 (рис. 3). При последующем нагревании щелочные легкие цепи диссоциируют от тяжелой цопи S1 (Hamai & Konrio, 1989), что препятствует получению однозначного ответа на вопрос об их роли в формировании домена'3 при помощи калориметрического анализа.

Тго-510

Тгр-112^Тг{э-130 Тгр-МО/ Тгр-595

УШШШШ.

Суг-бЭ?

Ш/ЖЖЖ;

23 кБ

50 к!)

!_1_

20КБ "шейка"

[~]-Зомен 1

I 1-ЭоиенЗ

J_и

200

^00

600

200

Рис. 7. Схема предполагаемого расположения доменов в первичной структуре миозиновой головки. Показано положение всех остатков триптофана и "существенных" БН-групп бн^ и БН£ в тяжелей цепи 51.

Номера остатков соответствуют аминокислотной последовательности тяжелой цепи Б1 (Топ^ & Е1а1п§а, 1990).

Схема, представленная на рис. 7, показывает предполагаете соотношения между доменами и различными частями аминокислотной последовательности в тяжелой цепи головки миозина. Согласно этой схеме, домен 1 соответствует приблизительно.протяженности остатков 300-430 в сегменте 50 кД; домен 2 Образован остатками 1-300 (весь сегмент 23 кД + остатки 205-300 в сегменте 50 кД) и..430-610 (С-концевая часть сегмента 50кД + 1}-концевая часть сегмента.20кД); домен 3 в головке миозина образован С-концевой частью сегмента- 20 кД тяжелой цепи (остатки 710-809) вместе с примыкающей. к ней областью "шейки", содержащей ассоциированные.ДТНБ-легкие цепи. . Из представленной схемы следует, что домены в. миозиновой головке вовсе не соответствуют непосредственно фрагментам. 23 кД, 50 кД, й 20 кД тяжелой цепи Б1, получаемым при расщеплении • трипсином. Поэтому мы считаем неправомочным употребление тержна "домены" для обозначения этих фрагментов, до сих пор часто встречающееся в литературе.

На рис. 8 представлена предполагаемая пространственная модель доменного строения миозиновой головки, построенная. на основании ина.пиза результатов проведенных экспериментов и литературных данных. Согласно этой модели, домен 1 соответствует концу миозадювой головки, - это большая петля, образованная последовательностью в и-концевой части сегмента 50 кД тякелой цепи 51, которая но взаимодействует с другими сегментами тякелой цена 81

Домен 2 соответствует самой широкой средней части головки; он образован взаимодействующими друг с другом различными частями всех 3 сегментов тяжелой цепи (23, 50 и 20 кД) и содержит большинство функционально важных центров - активный центр АТРазы и актин-связыващие центр! (см. рис. 2). Домен 3 соответствует узкой части

Эомен 1

Рис. 8.

Предполагаемая модель доменного строения головки миозина. Заштрихован дополнительный и-кон-цевой сег-. мент щелочной легкой цепи А1, отсутствующий у А2. ЛЦ - легкие цепи.

/^-гЗкЯ-БОкВ

Эомен 3

щелочная ЛЦ (А1)

20 кТ)"'шейка"

БТНБ-ЛЦ

головки; он образован С-концевой областью сегмента 20 кД тяжелой цепи и примыкающей к ней областью "шейки". Вероятно, в формировании этого домена участвуют и легкие цепи: С-концевая область щелочной легкой цепи (общая для А1 и А2), ассоциированная с С-концевой областью сегмента 20 кЦ тяжелой цепи , и ДТНВ-легкая цепь, ассоциированная с тяжелой цепью в _области "шейки" головки. Что касается дополнительного н-концевого сегмента А1, то его участие в формировании домена .3 кажется маловероятным. По-видимому, он

способен взаимодействовать непосредственно с областью домена 1 на. конце головки, изменяя его конформационное состояние. Такое взаимодействие вполне можно представить в пространстве, учитывая способность головки миозина сильно изгибаться (в- предложенной модели изгиб не изображен; он происходит, скорее всего, в области между доменами 2 и 3).

Интересно сравнить предложенную нами модель с опубликованной только что доменной моделью молекулы S1, построенной на основа трехмерной реконструкции электронномикроскопических изображений кристаллизованного S1 (Winkelmarm et al., 1991). Авторы ВЫЯВИЛИ в молекуле Mg-si три отчетливо различающихся морфологических домена: большой домен на одном конце молекулы S1, занимавший = 60% общего объема молекулы и отделенный отчетливой перетяжкой от центрального домена (г 30% объема молекулы), из которого выступает еще один маленький узкий домен, занимающий всего =10% объема молекулы. Мы полагаем, что большой морфологический домен соответствует в нашей модели доменам 1 и 2, не разделенным морфологически, а центральный и маленький морфологические домены - калориметрическому домену 3. Следует отметить, что авторы использовали препарат Mg-si, содержащий "шейку" головки л ДТШ-дегкие цепи; поэтому- камтс^ наиболее вероятным, что самый маленький морфологический домен соответствует скорее всего узкому участку "шейки" или ДТНБ-легкой цепи, выступа-юсим из центрального домена (по нашей модели - из домена 3), Таким образом, между двумя моделями нет существенных противоречий.

Изменения доданной структур81 31» вызываеше связыванием нуклеотидов*

Надо отметить, что представленная выше предполагаемая доменная модель построена для головки миозина, не содержащей в активном центре АТР или продуктов ее гидролиза. В то гэ время известно, что в процессе гидролиза АТР миозиновая головка подвергается конфирмационным изменениям (Worita, 1967; Werber et al.,1972). 5fg24-ATPB3-ная реакция миозина имеет сложный многостадийный характер; в ходе реакции миоэияовая головка (или st) проходит чорез ряд промежуточных состояний - "1 -АТР, si-adp-Fj, S1-adp, рязличагацихся по интенсивности трлптофановой флуоресценции SJ (Bagehaw & Trenthara,

*0то исследование проводилось совместно с Н.В.Хворовым

1974; Johneon & Taylor, 1978). Имеется гипотеза о том, что в процессе АТРазной реакции при комнатной температуре миозиновая головка может находиться в одном из двух конформационных состояний, одно из которых характерно для S1 без нуклеотида и для комплекса S1-ADP, а другое - для промежуточных комплексов S1-ATP и si-ADP-Pi (Shrlver, 1984; 1986). Предполагается, что генерация движения при взаимодействии миозина с актином связана с переходом прикрепленной к актину миозиновой головки из одного конформационного состояния в другое. Эта гипотеза, основанная преимущественно на косвенных данных, подразумевает наличие значительных структурных различий между двумя главными конформационными состояниями мис^ивой головки. Для ее подтверждения необходимо иметь прямые доказательства того, что связывание нуклеотидов изменяет структуру всей миозиновой головки. С целью получения таких доказательств мы исследовали доменную структуру различных комплексов S1 с нуклеотидами. При этом мы не могли использовать АТР по следупцим причинам: сам по себе гидролиз АТР в S1 сопровождается мощным поглощением тепла; кроме того, в этом случае мы столкнулись бы с одновременным существованием в растворе целого ргда промежуточных комплексов. Поэтому мы использовали различные стабильные аналоги комплексов S1 с АТР и продуктами ее гидролиза. Так, вместо АТР использовали ее нерасщепляемый аналог б'-аденшмл имидодифосфат (AMPPNP), а вместо промежуточного комплекса 31-adp-p.j - его стабильный аналог, komukkc'si с ADP и анионом ванадага (vi). Кроме того, мы исследовали комплекс S1-1DP, а также S1, в котором adp прочно удерживается в активном центре АТРазы S1 путем ковалентной сшивки "существенных" SH-групп ЕН1 я SH2 р-фэнилендималеимидом (рРШ). Последний препарат (pPDH-S1 ), ПРОЯВЛЯЮЩИЙ, ПОДОбНО S1-ATP И SI-ADP-Vp "слабое" связывание с актином (Chalovioh et al., 1983), также принято считать стабильным структурным аналогом промежуточного комплекса АТРазной реакции Si-ADP-pi (Burke et al., 1976).

в таблице 1 приведены главные термодинамические ' параметры тепловой денатурации s1 и его различных комплексов с нуклеотидами, полученные при калориметрических исследованиях: температура перехода Td (положение максимума пика кривой теплопоглощения) и энтальпия перехода Днт (площадь под пиком теплопоглощения). Как видно, только образоваЙие комплексов si-aiippnp и si-adp-vi вызывает резкое изменение характера тепловой денатурации si: оно приво-

Таблица I. Термодинамические параметры тепловой денатурации Б1 и комплексов Э1 с нуклеотидами.

Препарат Тд (°С) АНф (КДж/моль)

Б1 Б1-А1)Р рРБМ-Б1 Б1-АЫРГКР Б1-АБР-У1 47,2 + 0,1 47,8 + 0,1 45,4 + 0,1 53,2 + 0,1 56,1 + 0,1 1130 + 30 1200 + 30 1120 + 30 1460 + 40 1330 + 40

дит к значительному сдвигу кривой теплопоглощения Б1 в сторону (Золей высоких температур и к увеличению энтальпии денатурации, а также к изменению характера перехода, который становится значительно более кооперативном. Этот эффект был полностью обратим: удаление У.^ из Б1 при разложении комплекса Б1-АБР-У.£ под действием УФ-облучения приводило к возвращению кривой теплопоглошения 51 в исходное положение с максимумом около 47°С и к восстановлению Форм кривой, характерной для 51 без нуклеотидов.

Методом "последовательного отжига" было показано, что молекулы Б1 в комплексах 51-анррнр и имеют сходные доменные структуры, которые, однако, коренным образом отличаются от доменной структуры Б1 в отсутствие нуклеотидов. На ряс. 9 представлена доменная структура Б1 в комплексе Б^АДР-У.^ было выявлено 2 дота-' на, которые не имели ничего общего с тремя дошна«я1 31 в отсутствие нуклеотидов (см. рис. 3). В го не время связывание АИР с 31 или удерживание абр в 51 путем спнвки ррш не приводило к существенным изменениям трехдоменной структура 31. •

Таким образом, все исследованные препараты ком> разделить на 2 группы с различными термодинамическими параметра?-!« тепловой денатурации и с соверяшшю разной доменной структурой: к одной группе относятся свободный от нуклеотидов б1, комплекс 81-апр и ррбм-б1, а к другой - комплексы б1-аярркр и в1-аб?-71. Внутри каждой группы наблюдаются некоторые незначительные различия мезду препаратами, однако они несравнимы с глобальными различиями мезду препаратами из разных групп. Полученные данные являются первым прямым подтверждением неоднократно высказывавшихся предположений о даух главных информационных состояниях молекулы 51 в цикле гадро.-г

лиза ATP, одно из которых имеет место при отсутствии нуклеотидов в. активном центре АТРазы si и в комплексе si-±dp, а другое - в комплексах s1-атр и si-adp-Pj.

Рис. • 9. Разложение методом "последовательного отжига" суммарного контура тешюпоглощения (-)

81 в комплексе 31-АВР-У1 на элементарные пики

(--- соответствующие

плавлению отдельных доменов в молекуле Б1.

К добавляли 0,25 мы АИР и 0,25 мМ Остальные условия - как на рис. 3. Вертикальная

отметка соответствует Б00 Дк/ °К.кг.

АО so Т(0С) 60

Полученные данные позволяют сделать еще один важный вывод: сшитый ррш S1 - функциональный аналог промежуточных комплексов АТРазной реакции S1-atp и si-adp-p.. (он проявляет, подобно этим комплексам, "слабое" связывание с актином), который принято считать также структурным аналогом этих комплексов, в действительности таковым не является. По-видимому, "слабое" связывыание с актином обусловлено изменениями в области участка "сильного" связывания, вызванными • либо локальной модификацией этой области в pPDli-si, либо изменением структуры всей миозиновой головки в комплексах S1-ATP или S1-ADP-Pj.

В свете предложенной доменной модели (рис. 8) можно следующим образом представить характер тех изменений, которые происходят в строении миозиновой головки при связывании с ней нуклеотидов. Связывание A DP или ее удерживание в головке при сшивке ррш вызывают, по-видимому, лишь .локальные конформациошше изменения ь домене

2 - в области активного центра АТРазы и в актин-связываюцем центре. В то ке время можно предположить, что в процессе АТРазной реакции образование промежуточных комплексов м-АТР или M-ADF-P^ (где М - миозиновая головка) сопровождается глобальными изменениями в строении головки, затрагивающими все три домена и взаимоотношения между ними. Самые значительные изменения происходят, по-видимому, в домене 2, который объединяется с доменом 1 (а отчасти, возможно, и с доменом 3).

ФУНКЦИИ ЛЕГКИХ ЦЕПЕЙ МИОЗИНА

Головки миозина, полностью лишенные как регуляторных, так и щелочных легких цепей, сохраняют способность гидролизовать АТР и взаимодействовать с актином (Sivaramakriehnan & Burke, 1982; Wagner & Giniger, 1981). Следовательно, легкие цепи не являются абсолютно необходимыми для проявления этих свойств миозина и несут иные функции, выяснению которых посвящена данная глава.

Щелочные легкие цепи*

Для выяснения функций дополнительного N-концевого сегмента щелочной легкой цепи А1 мы сравнивали свойства изоформ S1, содержащих разные щелочные легкие цепи AI и А2 ( S1(А1) и S1(A2), соответственно). Выше указывалось, что изоформы S1 различаются по кон-формационному состоянию самого термолабильного домена 1, что обусловлено, как мы предположили, непосредственным взаимодействием N-концевого сегмента А1 в S1(AI) с областью этого домена. В данном разделе приведены данные сравнительного анализа взаимодействия изоформ S1 с филзментами Р-актина.

Известно, что изоформы S1 не различаются по АТРазной активности в отсутствие актина, однако в присутствии Р-актина Mg2+-ATPa3a S1 (А1)' активируется актином сильнее, чем Mg2+-ATPa3a S1(A2); при анализе кинетических параметров актинактивируемой АТРазной реакции было показано, что это происходит за счет повышенного сродства S1(А1) К F-актину (Weeds & Taylor, 1975; Chalovich et al., 19B4). Можно предположить, что S1(А1) и S1(A2) взаимодействуют с Р-акти-ном по-разному. Для проверки этого предположения мы исследовали

Эта часть работу ьиполнэна совместно с О.П.НиколаэвоЙ

связывание изоформ Б1 с Р-вктином разными методами. Поскольку различия между Б1(А1) и 51(А2) в актин-активируемой Иег+-АГРазной активности наблюдаются только при низкой ионной силе (до 25-30 мМ) мы проводили эксперименты именно в этих условиях.

Метод поляризационной ликрофлуоршетрии, основанный на измерениях поляризованной флуоресценции непосредственно в мышечных волокнах, позволяет исследовать характер присоединения миозиновых головок к актиновым филаментам (например, ориентацию и подвижность присоединенных головок), а также характер тех изменений, которые происходят при этом в Р-актине волокон. В данном исследовании мы использовали преимущественно теневые волокна (одиночные глицеркни-зированные мышечные волокна, сохраняющие интактные филаменты р-ак-тина после предварительной экстракции миозина, тропомиозина и тро-понина). После связывания Б1 (А1) или ВЦА2) с Р-актином волокон мы исследовали поляризованную флуоресценцию различных, флуорофоров, находящихся либо в Б1, либо в Р-актине, и рассчитывали поляризационные характеристики, отрвжагацие ориентацию и подвижность исследуемых флуорофоров. Такие характеристики существенно зависят от того, где локализован флуорофор. Например, происходящие при связывании Б1 с р-актином изменения поляризованной флуоресценции трип-тофоновых остатков или родамина, связанного с фаллоидином, присоединенным к Р-актину волокон, отражают, как правило, общие жотфор-мащюнлые изменения актиновых филаментов (изменения их гибкости, шага спирали и т.д.). При исследованиях этих флуорофоров мы не обнаружили разницы между 51 (А1) и Б1(А2): обе изоформы Б1, связываясь с р-актином волокон, одинаково увеличивали рассчитанный параметр в1п2в (где 9 - угол между осью актинового филамепта и осью волокна); т.е. вызывали одинв'ковое изменение общего конформа-циоююго состояния Р-актина. Различия между (А1) и Б1(А2) были обнаружены при исследовании поляризованной флуоресценции метки 1,5-1А1Ш№3, специфически присоединенной к определенным БН-группам как в 51, так и в актине. В таблице 2 приведены рассчитанные для этих случаев поляризационные характеристики, отражающие ориентацию флуорофора (<$£, угол между осью Р-акгина и .осциллятором излучения флуорофора в) и его подвижность (Я, относительное количество Хаотически расположенных флуорофоров).

Таблица 2. Поляризационные характеристики теневых мышечных волокон при декорировании Р-актина волокон изоформами S1 - S1(А1) и S1(A2) Условия: 20 мН трис-НСД буфер (рН 7,2), 1 мМ MgClg.

Локализация флуоро-фора (1,5>-1АЕОАНЗ) Вариант опыта ФЕ, град. N (отн. ед.)

БН1-группа в тяжелой цепи Б1 (А1 ) ИЛИ Б1 (А2) ï-актин + si(а1 ) р-актил + S1(А2) 46,8 ± 0,1 45,4 ± 0,1 0,091 ± 0,003 0,087 + 0,003

БН-группа Суб-177 в А1 ИЛИ Суз-136 В А2 Р-актин + S1(а1 ) f-эктин + S1 (А2 ) 62,0 + 0,1 62,2 + 0,1 0,175 i 0,003 0,210 + 0,004

гн-группа остатка Суе-374 в Р-актине волокон р-актин F-актин + S1 (А1 ) р-актин + S1(А2 ) 52,6 + 0,2 56,0 + 0,2 54,5 + 0,15 0,295 +' 0,005 0,145 + 0,005 0,255 + 0,005

Как видно, метки, присоединенные к БН1-группе остатка Сув-707 в тяжелой цепи Б1(А1 ) или 51(А2), различаются у связанных с Р-ак-тином изоформ 31 по ориентации, но не различаются по подвижности. Это говорит о том, что молекулы Б1 (А1) и 31(А2) (или по крайней мере их области, содержащие БН,-группу) по-разному ориентированы относительно оси октанового филамента. В том случае, когда флуоресцентная метка присоединена к самой щелочной легкой цепи (к единственной БН-группе в С-концевоЙ области А1 или А2), ее подвижность у связанных с р-актином молекул Б1(А1) заметно меньше, чем у молекул Б1(А2). Однако самые значительные различия в подвижности флуоресцентной метки наблюдаются тогда, когда она присоединена к БН-группе остатка Сув-374 в С-концовой области актина: связывание Б1(А1) с р-актином вызывает значительное уменьшение величины N (в 2 раза), тогда как связывание Б1(А2) снижает величину N менее чем на 1556 (Табл. 2). По-видимому, связывание Б1 (А1) с р-актином волокон вызывает значительные конформационные изменения в С-концевой области актиновых молекул поблизости от Сув-374. Это вполне согласуется с литературными данными о том, что при взаимодействии Б1 с актином А1 (но не А2) вступает в непосредственный контакт именно с этой областью молекулы актина (Э^оИ, 1982; Тгауег е1; а!., 1987).

Таким образом, обе изоформы Б1, связываясь с Р-актином, оказывают сходное влияние на общее конфюрмационное состояние актиновых фмламентов в волокнах; локальные различия между Б1(А1) и Б1 (А2) обусловлены, по-видимому, взаимодействием 1)-концевой области А1 в Б1(А1) с С-концевой областью актина. Такое взаимодействие приводит, в свою очередь, к снижению подвижности С-концевой области самой А1 в Б1(А1) и к изменению ориентации всей молекулы Б1(А1) (или по крайней мере ее области, содержащей БН1-группу) относительно поверхности актинового филамента.

Метод остановленного потока был применен нами для исследования быстрой кинетики взаимодействия изоформ Б1 с Р-актином в растворе. На рис. 10 представлена кинетика прироста светорассеяния после смешивания Б1(А1) и Б1(А2) с Р-актином. Как видно, в случае Б1(А2) светорассеяние возрастает более интенсивно, чем в случае Б1(А1). Мы определили кинетические параметры взаимодействия Б1(А1) и Б1(А2) с Р-актином. Изоформы 51 мало различались по скорости их

Рис. 10. Кинетика взаимодействия . si(А1) (кривая 1) и S1(А2) (кривая 2) с Р-актином.

Условия: 10 мМ имидазол-HCl (pH 7,0), 2 mM Mg012, 5mM KCl, 0,1 mU OTT, 4(1« S1(A1) ИЛИ S1(a2), 2 цм Р-актин. Изменение интенсивности светорассеяния регистрировали при 340 нм. Мертвое время'прибора составляло 3 мс.

о.ю

0 05

¿0 ms

связывания с Р-актином: рассчитанные значения константы скорости реакции второго порядка к13- составили (4,8 + 0,2) 107 М-1, с-1 для 81 (А1 ) и (3,2 + 0,2) 107 М"1.'с"1 для Б1(А2). В то же время между ' изоформами 51 были обнаружены существе1шые различия по значению максимального прироста интенсивности светорассеяния при

полном насыщении р-актина: 0,076 + 0,006 для Б1(А1) и 2,0 + 0,006

для б1(А2).

Можно предположить, что обнаруженные различия в интенсивности светорассеяния декорированных изоформами S1 филаментов F-актина могут быть вызваны различиями в характере присоединения молекул S1(А1) и S1(А2) к Р-актину. В пользу такого предположения говорят, в частности, приведенные выше данные, полученные методом поляризационной микрофлуориметрии. Для проверки этого предположения мы исследовали седиментационные свойства филаментов Р-актина, декорированных S1(А1) или S1(А2), и показали, что филаменты, декорированные S1(А1), седиментируют быстрее, чем филаменты, декорированные S1(А2). Рассчитанные значения коэффициентов седиментации (при молярном отношении S1 к актину, равном 1:2) составили 164 + 7 S и 108 + 4 s для актиновых. филаментов, декорированных S1(А1) и S1(А2) соответствешю. Вероятно, молекулы S1 (А1) более плотно,чем S1(A2), прижаты к поверхности актинового филамента. В результате декорированные S1(А1) актиновые филаменты являются более компактными, быстрее седиментируют и обладают меньшим светорассеянием, чем филаменты, декорированные S1(A2). По-видимому, все это обусловлено тем, что 31(А1) имеет дополнительный, отсутствующий у S1(A2), контакт с актином благодаря взаимодействию Н-концевого сегмента А1 с С-концевой областью молекулы актина.

Метод седилегтационного анализа не только позволил нам выявить различия между S1(А1) и S1(А2) в коэффициентах седиментации декорированных ими актиновых филаментов, но помог также обнаружить новое свойство, характерное только для S1(A1), - способность индуцировать агрегацию актиновых филаментов. Одним из необходимых условий такой агрегации было полное насыщение филаментов Р-актина молекулами S1 (А1). Агрегация происходила только тогда, когда молярная концентрация S1 (А1) хотя бы ненамного (на 10-20$) превышала молярную концентрацию актина. Поэтому мы не случайно использовали при описанных выше исследованиях седиментационных свойств комплексов Р-актина с изоформами S1 не полностью насыщенные изоформами S1 филаменты Р-актина.

Формы проявления агрегации были достаточно разнообразны. Зачастую агрегаты были очень гетерогенны; однако в ряде случаев мы наблюдали весьма гомогенные агрегаты, для которых удавалось определить коэффициенты седиментации (один из таких достаточно характерных случаев агрегации приведен на рис. 11 а). Иногда часть актиновых филаментов, декорированных S1(A1), не подвергалась arpera-

ции (как на рис. 11 а); в других случаях агрегировали все декорированные актиновые филаменты. Размеры образующихся агрегатов различались в разных опытах: их коэффициенты седиментации варьировали обычно от 300-600 S до 1600 S, а в некоторых случаях агрегаты осаждались очень быстро, в самом начале центрифугирования. Что касается комплексов F-актина с S1(A2), то в этом случае всегда наблюдали достаточно гомогенные декорированные актиновые филаменты с коэффициентами седиментации от 120 до 160 S, без каких-либо следов агрегации (рис.116). Рис. II. Седиментограммы фила-ментов F-актина, декорированных S1(А1) (а) и S1(А2) (б), и агрегатов, образуемых актиновыми филаментами, декорированными S1(A1) (а).

Условия: 10 мМ имидазол-HCl! (рН 7,0), 1 гаЫ MgCl2, 4 ЦМ •-S1 (А1 ) ИЛИ S1 (А2), 2 (J.M F-актин Вертикальные отметки соответствуют 0,2 единицам оптической плотности при 2S0 нм. Стрелкой показано направление седиментации. Сканирование проведено через 9 мин 30 с (а) и через 36 мин (б) после достижения скорости 12 ООО об/мин. На седимен-тограммах указаны коэффициенты седиментации, рассчитанные для агрегатов, образуемых актиновыми филаментами, декорировании- .. миБ1(А1) (а), и для филамен-,тов, декорированных S1(А2) (б).

Надо отметить, что агрегация актияовых филаментов сопровождается ростом светорассеяния, в результате чего светорассеяние комплексов F-актина с S1(А1) становится значительно выше, чем у комплексов Р-актина с S1(А2). Этот процесс, однако, происходит довольно медленно, в секундном и даже в минутном временном интервале, т.е. значительно медленнее, чем само взаимодействие изоформ si / •

с Р-актином, которое заканчивается в пределах 100 мс. Именно это позволило нам, используя метода быстрой кинетики, выявить различия в светорассеянии между филаментами р-актина, полностью насыщенными Б1(А1) И Б1(А2).

Поскольку агрегация актиновых филаментов происходит только после полного насыщения р-актина молекулами Б1(А1), можно предположить, что она обусловлена взаимодействиями между молекулами Б1(А1), присоединенными к разным актиновым филаментам. Наиболее вероятно, что такие взаимодействия происходят между 1)-концевыми сегментами разных молекул 31(А1). В этом случае легко объяснить необходимость для агрегации полного насыщения актиновых филаментов молекулами Б1(А1): достаточно лишь представить принцип действия "застежки-молнии", когда отсутствие всего нескольких звеньев уже препятствует полному смыканию.

Таким образом, можно заключить, что влияние дополнительного Н-концевого сегмента щелочной легкой цепи А1 на свойства головки миозина обусловлено способностью этого сегмента вступать в различные взаимодействия: 1) дополнительное взаимодействие с тяжелой цепью головки, приводящее к изменению конформационного состояния самого термолабилыюго домена 1 на конце головки; 2) при взаимодействии головки с актином - дополнительное взаимодействие с С-концовой областью актина, изменяющее характер присоединения мио-зиновой головки к актину и делающее его более прочным; 3) взаимодействие друг с другом, приводящее к агрегации актиновых филаментов, декорированных Б1(А1).

ДТНБ-легкие цепи

Эти легкие цепи миозина скелетных мышц (названные так потому, что их можно отделить от миозина при обработке ДТНБ в присутствии ЭДТА) относятся к классу регуляторннх легких цепей, принимающих непосредственное участие в регуляции, взаимодействия миозина с актином при запуске мышечного сокращения (т.н. регуляция миозино-вого типа). Такая регуляция осуществляется путем связывания Са~+ с рогуляторными легкими цепями (в мышцах большинства беспозвоночных) или путем их ковалентного фосфорилирования (в гладких мышцах и в немин,'очных клетках позвоночных). В скелетных мышцах позвоночных регуляция сокращения осуществляется иным путем - при помощи

тропонин-тропомиозиновой системы,. ассоциированной с актиновыми филаментами (т.н. регуляция актинового типа), а регуляция миозино-вого типа отсутствует. Таким образом, ДТНБ-легкие цепи не являются истинно регуляторными и несут иные функции. При этом они сохраняют главные свойства, характерные для истинных регуляторных легких цепей: находясь в головках миозина, они спосбны связывать Са2+ с высокой чувствительностью, а в процессе сокращения мышц они подвергаются ковалентному фосфорилированию по остатку Бег в К-концевой области, осуществляемому специфическим ферментом - Са2+-кальмоду-лин-зависимой киназой легких цепей миозина, и дефосфорилированию, осуществляемому специфической фосфатазой. Оба процесса (как связывание Са2+ с ДТНБ-легкими цепями, так и их фосфорилирование) происходят в скелетных мышцах позвоночных значительно медленнее, чем само одиночное сокращение мышечного волокна, которое начинается и заканчивается за 50-100 мс; именно поэтому-, как принято считать, они не могут регулировать запуск сокращения. Однако, поскольку эти свойства у ДТНБ-легких цепей присутствуют, они должны выполнять какие-то функции, до сих пор остававшиеся неясными.

Влитие Са?Л на взаимодействие в! с Т-акшцол теневых хьшеч-инг волокон. Мы исследовали влияние связывания Са* с ДТНБ-лег-кими цепями на характер присоединения миозиновых головок к актину, используя описанный выше метод поляризационной микрофлуориметрии. При этом использовали теневые мышечные волокна, лишенные миозина, тропонина и тропомиозина, к которым добавляли разные препараты Б1-- содержащие и не содержащие ДТНБ-легкие цепи (Мё-Б1 и ЭДТА-Б1, соответственно). Конформациошше перестройки, происходящие в Р-ак-тине волокон вследствие присоединения к нему молекул Б1, регистрировали по изменению анизотропии поляризованной триптофановой флуоресценции (Р_[_/Рц) теневых волокон. Оказалось, что связывание с ?-актином волокон М§-Б1 в отсутствие Са2+ увеличивает анизотропию флуоресценции, а в присутствии Са2+ - уменьшает ее; в то же время связывание с актином ЭДТА-Б1, не содержащего ДТНБ-легких цепей, уменьшало анизотропию флуоресценции независимо от присутствия или отсутствия Са2+ (рис. 12). Это значит, что связывание Са2+ с ДТНБ-легкими цепями коренным образом изменяет характер конформационных йерестроек актина, вызываемых взаимодействием- головок миозина с актином. Этот вывод был подтвержден в последующих экспериментах, где вместо Мр-Б1 использовали тяжелый меромиозин с штэктными

ДТНБ-легкими цепями, а кроме триптофановой флуоресценции исследовали поляризованную (флуоресценцию родамина, связанного с фаллоиди-ном, специфически присоединенным к Р-актину мышечных волокон. При этом было рассчитано, что головки миозина, связываясь с Р-актином волокон в присутствии и в отсутствие Са^+, по-разному влияют на гибкость актиновых филаментов, уменьшая ее в отсутствие Са2+ и увеличивая в присутствии Са2+. Было высказано предположение, что связывание Са2+ с ДТНБ-легкими цепями изменяет характер присоединения миозиновых головок к Р-актину, что в свою очередь приводит к изменению характера происходящих при этом конформационных перестроек Р-актина. Это предположение было впоследствии подтверждено в экспериментах с использованием тяжелого меромиозина, модифицированного флуоресцентной меткой 1,5-1АЕЮА№ по ЗН.,-группе в головках: при связывании.головок с р-актином в присутствии Са2+ подвижность метки была значительно ниже, чем в отсутствие • Са2+ (Воготакоу еЪ а1., 1987). Рис. 12. Изменения анизотропии поляризованной триптофановой флуоресценции (Р^/Рц) теневых мышечных волокон, индуцированные связыванием м§-51 (1) или ЭДТА-Б1 (2) с Р-актином волокон при разных концентрациях Са . Условия: ЗОмМ трис-Н01 (рН 7,5) 1шМ Н§С12, бОгпМ К01, 2,5 МГ/МЛ Не-Э1 или ЭДТА-Э1. Степень поляризации триптофановой флуоресценции (Р) регистрировали при ориентации волокна параллельно (Рц) и перпендикулярно (Р±) плоскости поляризации возбуждающего света.

Рассматривая данные, представленные на рис. 12, можно заметить в действии ДТ1Ш-легких цепей некоторую аналогию с регулятор-ными легкими цепями миозина из запирательных мышц моллюсков, которые в отсутствие препятствуют активации АТРазы миозина актином и сокращению мышц, а связывание Са^+ снимает их ингибиругадеэ действие: в отсутствие Са^+ ДТНБ-легкие цепи оказывают определен-

нов влияние на характер взаимодействия.миозина с актином, а связы-2+

ваше Ca это их влияние устраняет, поскольку вызывает такой же по характеру эффект, что и удаление ДТНБ-легких цепей из головок миозина.

Как видно из рис. 12, изменение характера структурных перестроек актина при связывании Mg-Si происходит в области концентрации Са2+ от 10 до 10~G M. В то же время известно, что в этих условиях (в присутствии 1-2 мМ Mg2+) для эффективного связывания Са^+ с ДТНБ-легкими цепями в головках миозина требуются более высокие концентрации свободного Ca (порядка 10 M) (Bagehaw & Reed, 1977; Bremel & Weber, 1975; Holroyds et al., 1979; Wikman-Coffelt, 19S0). Из этого следует, что в той области концентраций Са2+, где происходят изменения характера структурных перестроек

актина, лишь очень незначительная доля всех молекул Mg-Si может 2+

связать Ca ; и тем не менее столь малого количества связавших 2+

Са молекул оказывается достаточным, чтобы полностью изменить характер структурных перестроек актина при связывании Mg-si (по-видимому, из-за высокой кооперативное™ таких изменений). Если учесть, что к моменту запуска сокращения только 3-5£ головок миозина в мышечном волокне успевают связать Ca2+ (Robertson et al., 1981 ), то мокно предположить, что даже столь незначительного количества связавших Са^+ головок миозина монет оказаться вполне достаточно, чтобы они, связавшись с актином, смогли изменить конфор-мацию актиновых нитей (например, перевести их. из "выключенного" состояния во "включенное"; мы предполагаем, что такие изменения конформации F-актина могут играть существенную роль в молекулярном механизме сокращения мышц). Таким образом, не исключено, что связывание Са2+ d ДТНЕ-легкими цепямй играет определенную роль не только при длительных тетанических сокращениях, когда ДТНБ-лагкие цепи во всех головках миозина связывают Са2+, но даже при запуске одиночных сокращений мышечных волокон, когда только незначительная доля всех головок успевает связать Са2+.

Итак, хотя в скелетных мшцах позвоночных связывание Са2+ с ДТНБ-легкими цепями миозина и не принимает, видимо, непосредственного участия в регуляции запуска сокращения, оно оказывает влияние lia характер взаимодействия миозина с актином и на характер тех конформациошмх перестроек актиновых филаментов, которые происходят при этом взаимодействии.

Влияние фосфорилирования ДТНБ-легшт цепей ш взаилодействие головок лиозина с F-ашшюл исследовали в подобных экспериментах, методом поляризационной микрофлуориметрии. Для этого использовали тяжелый меромиозин (нмм) либо с полностью дефосфорилированными, либо с полностью фосфорил!грованными ДТНБ-легкими цепями, который добавляли к теневым мышечным волокнам в присутствии или в отсутствие Са^+ и регистрировали изменения, происходящие в F-актине во-"локсн. Связывание с р-актином волокон головок НММ с дефосфорилиро-ванными ДТНБ-легкими цепями вызывало такой же эффект, что и связывание Mg-S1 (рис. 12): в отсутствие Са2+ оно увеличивало анизотропию поляризованной триптофановой флуоресценции, а в присутствии Са2+. уменьшало ее. Связывание с Р-актином фосфорилированного НММ вызывало прямо противоположный по характеру эффект: оно сильно снижало анизотропию поляризованной триптофановой флуоресценции в

. Рх/Рм (огн.еЭ.)

Рис. 13. Изменения ■ анизотропии троптофановой флуо-ресценщш (Р_|_/Рц) теневых мышечных волокон, индуцированные связыванием с Р-ак-тином волокон ШМ с фосфори-лированными ДТНБ-легкими цепями (2 мг/мл) в отсутствие Са'"+ (при рСа 8) ив присутствии Са2+ (при рСа = Б). Стрелкой указано время добавления КШ. Остальные условия - как на рис. 12.

п, р,

отсутствие Са и слегка увеличивало ее в присутствии Са (рис. 13). Таким образом, (росфорилирование ДТНБ-легких цепей, как и связывание с ниш Сал+, коренным образом изменяет характер тех кон-формационных перестроек, которые происходят в F-актине при связывании с ним головок НШ.

2 +

Интересно от?,ютить, что при низких концентрациях Са (при рСа 5. 8) фосфорилирование ДТНБ-легких цепей вызываэт такой-же по характеру э№кт (снижение анизотропии флуоресценции), что и свя-

1,251,20 -1,15 -1,10-

НММ

+Са

а*

_L_I_I_L

О d 2 3 Бремя (.часы)

зывание Са2+ с дефосфорилировэнными ДТНБ-легкими цепями (ср. рис. 12 и 13). При расчетах поляризационных параметров различных флуоресцентных меток, присоединенных к головкам ШМ или к Р-актину волокон, было впоследствии показано, что фосфорилирование ДТНБ-легких цепей и связывание с ними Са2+ вызывают сходные изменения в характере присоединения головок НММ к Т-актину волокон и в характере происходящих при этом структурных перестроек Р-актина (Borovikov et al., 1987; Kakol et al., 1987). Можно предположить, что при низких концентрациях Са2+ в мышечном волокне фосфорилирование ДТНБ-легких цепей выполняет те же функщш, что и увеличение концентрации Са2+, т.е. повышает количество головок миозина, вступающих во взаимодействие с р-актином, и изменяет характер этого взаимодействия. В пользу такого предположения говорят данные, полученные на мышечных волокнах при низких концентрациях Са2+ (около 1 |iiM), достаточных для активации киназы легких цепей миозина, но недостаточных для полного сокращения (в этих условиях волокна развивали напряжение, составляющее всего 10-20$ от максимального): фосфорилирование ДТНБ-легких цепей существенно увеличивало в таких условиях силу развиваемого волокнами изометрического натяжения, однако не оказывало на нее влияния после повышения концентрации Са до 10 цм, когда волокна развивали максимальное напряжение (Percechini et al., 1985; Sweeney'& Stull, 1986).

Таким образом, полученные данные позволяют говорить о том, что связывание Са2+ с ДТНБ-легкими цепями и • их фосфорилирование оказывают существенное влияние на взаимодействие миозиновых головок с актином при сокращении мышечных волокон, изменяя характер этого взаимодействия и характер тех конформационных перестроек, которые происходят при этом в актйновых филаментах.

Влияние фосфорилированиа ДТНБ-легких цепей на конфоржщш лиовина в толстых Humsa шшечньа волокон исследовали описанным выше методом поляризационной мнкрофлуориметрии. В этих экспериментах использовали одиночные глицеринизированные мышечные волокна, которые предварительно растягивали до длины саркомера 3,6-3,8 мкм (чтобы исключить перекрытие миозиновых и актйновых филаментов) и обрабатывали 0,6 М KI для разрушения актйновых филаментов. Такие растянутые и обработанные KI волокна не содержали актйновых филаментов, но сохраняли интактныо миозиновые филамчнты (толстые нити)

Фосфорилирование ДТНБ-легких цепей миозина проводили прямо в волокнах, инкубируя их с киназой легких цепей миозина в присутствии Са^+ и АТР, и исследовали его влияние на поляризованную флуоресценцию, регистрируя ее до и после фосфорилирования, причем измерения проводили в присутствии 5 мМ MgCi2 или в отсутствие MgOlg. При этом измеряли поляризованную флуоресценцию грипгофановых остатков миозина и флуоресцентной метки 1,5-IAEDANS, ковалентно связанной с SH1-группой в головках молекул миозина. В таблице 3 представлены значения анизотропии поляризованной флуоресценции (Рц/Р^), рассчитанные для волокон с дефосфорилированными и с полностью фосфорили-рованными ДТНБ-легкими цепями, в присутствии или в отсутствие' ионов Mg2t Как видно, фосфорилирование вызывает заметные изменения анизотропии поляризованной флуоресценции для обоих флуорофоров, причем самые сильные изменения наблюдаются при измерениях в присутствии Mg2+ (в этом случае анизотропия флуоресценции связанной метки увеличивается более чем в 3 раза!). Это значит, что фосфорилирование ДТНБ-легких цепей существенно изменяет (особенно сильно - в присутствии Mg2+) конформационное состояние областей молекулы миозина, несущих остатки триптофана и флуоресцентную метку.

Для того, чтобы лучше понять характер происходящих в результате фосфорилирования конформационных изменений миозина, мы рассчитали поляризационные характеристики, отражающие ориентацию (ФЕ) и подвижность (N) обоих флуорофоров. Оказалось, что в случае флуоресцентной метки, связанной с миозиновыми головками, фосфорилирование оказывало незначительное влияние на подвижность метки, но в присутствии Mg2+ сильно изменяло ее ориентацию относительно оси волокна. Это значит, что фосфорилирование легких цепей изменяет ориентацию головок миозина в миозиновых филаментах (или по крайней мере их областей, содержащих SH1-грушу, к которой была присоединена флуоресцентная метка), причем такие изменения наиболее отчетливо проявляются в присутствии Mg2+.

В случае триптофановой флуоресценции фосфорилирование легких цепей миозина сникало подвижность и изменяло ориентацию остатков триптофана (величина n уменьшалась, а величина ФЕ увеличивалась на 5-6°). В серии дополнительных экспериментов нам удалось показать, что остатки триптофана в головках миозина ориентированы неупорядоченно и не вносят заметного вклада в создание высокой анизотропии триптофановой флуоресценции миозиновых филамонтов; такая анизотро-

- за -

Таблица Э. Влияние фосфорилирования легких цепей и ионов на

анизотропию (Рц/Р[_) поляризованной триптофановой флуоресценции и флуоресценции 1,5-1АЕ1Х/ШЗ, связанной с БН1-группами головок миозина, в растянутых и обработанных К1 глицеришзированных мышечных волокнах. Условия измерения: 20 мМ фосфатный буфер (рН 7,0), 80 мМ КС1, 5 мМ МйС12 (или без 1^С1г). Каждое значение Р^/Р^ получено в результате не менее 30 измерений, проведенных на 6-8 волокнах.

Флуорофор Степень фосфорилирования ДТНБ-легких цепей Присутствие Гц

Остатки 0 - 5 % - 2 10 + 0,01

триптофана 0 - 5 % + 2 26 + 0,01

95 ± 5 % - 1 97 + 0,01

95 ± 5 % + 1 83 + 0,01

1 ,5-1АИ>.ШЗ, 0 - 5 % - 2 83 + 0,02

связанный с 0 - 5 % + 2 64 ± 0,02

головками мо- 95 ± 5 % - 3 3 ь + 0,04

лекул миозина 95 ± 5 % + 10 63 ± 0,04

пия создается, главным образом, хорош ориентированными остатками триптофана, расположенными в стволе миозинового филамента, образованном стержневыми частями молекул миозина. 'В стержневой части миозина имеется только 4 остатка триптофана, по 2 остатка в каждой тяжелой цепи - Тгр-1375 и Тгр-14бо (Маейа et а1., 1987), расположенные в гя-концевой области легкого меромиозина поблизости от "шарнирного участка", соединяющего его с областью субфрагмонта-2. Таким образом, вызываемые фосфорилированием легких цепей изменения поляризованной триптофановой флуоресценции мышечных волокон отражают, вероятно, те структурные перестройки, которые происходят в стволах миозиновых филаментов достаточно близко от* "шарнирного участка".

Из литературы известно, что "поперечные мостики" (области субфрагмента-2, несущие головки миозина) обладают определенной подвижностью относительно поверхности миозинового филамента, однако в присутствии %2+ в миллимолярных концентрациях они всегда плотно прижаты к стволу филамонта (1?е1з1ег е*. а!., 1983;

Persechini к Powe, 1984). Исходя из этого, полученные данные можно интерпретировать так: в условиях, когда головки миозина плотно прижаты к поверхности миозинового филамента (т.е. в присутствии Mg2+ в высоких концентрациях), фосфорилирование ДТНБ-легких цепей миозина существенно изменяет ориентацию миозиновых головок и вызывает структурные изменения в стволе миозинового филамента. По-видимому, такие изменения обусловлены тем, что в "прижатом" состоянии головки одной молекулы миозина в филаменте вступают в непосредственное взаимодействие со стержневой частью соседней молекулы в области, близкой к "шарнирному" участку между субфрагмен-том-2 и легким меромиозином. О возможности такого взаимодействия говорят, в частности, полученные нами ранее данные о взаимодействии изолированных стержневых частей и головок миозина в растворе при соосаждении. Предложенная интерпретация позволяет объяснить, почему фосфорилирование ДГНБ-легких цепей, ассоциированных -с головками молекул миозина, вызывает изменения не только в самих головках, но и в стволах миозиновых филаментов.

Влияние фосфорилирования ДТНБ-легких цепей на свойства лиозинових литфиалетов.

Одним из спорных вопросов, связанных с ролью фосфорилирования ДТНБ-легких допей в скелетных мышцах позвоночных, долгов время являлся вопрос о его влиянии на активацию актином Mg2+-ATPa3H миозина. В отличие от миозина из гладких мышц, АТРаза которого вообще не активируется F-актином до тех пор, пока не будут фосфорилирова-нн регуляторше легкие цепи, для активации F-актином АТРэзы миозина из скелетных мышц фосфорилирование легких цепей не требуется. Имеющиеся данные о влиянии такого фосфорилирования на степень активации F-актином Mg2+-ATPa3H миозина из скелетных мышц весьма противоречивы: по данным одних авторов оно несколько увеличивает степень активации (Femrick, 1980; FersecMni & Stull, 1984), ПО данным других - несколько снижает'ее (Kakol et ai., 1982) или не влияет на нее вообще (Morgan et al., 1976). Как выяснилось, противоречия были обусловлены тем, что характер влияния фосфорилирования легких цепей на активность актин-активируемой Mg2+-ATPa3U миозина из скелетных мышц существенно зависит от ионной силы (CtepkowEki et al., 1985): При НИЗКИХ концентрациях KCl (25 mM) фосфорилирование приводило к повышению активности па 60-80$, при

повышении концентрации KCl эффект заметно снижался, а при концентрациях KCl Солее ЮОгаМ фосфорилирование приводило уже к снижению активности на 20-25$. Исходя из этих данных, следует ожидать, что стимулирующее действие фосфорилирования ДТНБ-легких цепей на актин-активируемую %г+-АТРазу миозина должно наиболее ярко проявляться в растворах с очень низкой ионной силой, при полном отсутствии KCl. Однако в таких условиях миозин обычно подвергается сильной агрегации и гелеобразованию, что делает подобные исследования практически невозможными. Для того, чтобы исследовать влияние фосфорилирования легких цепей на актин-активируемую АТРазу миозина в этих условиях, мы использовали миозиновые минифиламенты.

Минифиламенты, впервые описанные в 1980 году (Reieler et al., 1980), представляют собой хорошо упорядоченные короткие филаменты длиной »0,3 мкм, состоящие всего из 16-18 молекул миозина (для сравнения: обычные миозиновые филаменты содержат более 350 молекул), и имеют четко выраженную биполярную структуру (все головки молекул миозина находятся на концах минифиламента), соответствующую, по-видимому, центральной зоне миозиновых филаментов. Важными достоинствами минифиламентов являются их высокая гомогенность и способность существовать в растворах с низкой ионной силой, не подвергаясь дальнейшей агрегации. Благодаря этим свойствам минифиламенты являются очень удобным объектом для исследования свойств миозина при низкой ионной силе, в отсутствие KCl.

Мы получили минифиламенты из миозинов с •дефосфорилированными и с полностью фосфорилированными ДТНБ-легкими цепями и сравнили их свойства. Оказалось, что фосфорилирование действительно оказывает очень сильное влияние на активность актин-активируемой Mg2+-ATPa3H минифиламентов: для разных пар исследованных препаратов активность фосфорилированных минифиламентов в 3-4 раза превышала активность дефосфюрилированных минифиламентов.

Методом седиментационного анализа было показано, что гомогенные миозиновые минифиламенты (коэффициент седиментации ~ 27 S) при добавлении KCl становятся гетерогенными, а в присутствии ЮОшН К01 превращаются в обычные филаменты с коэффициентом седиментации 580 S. Параллельно, с повышением концентрации KCl снижается разница между фосфорилированными и дефосфорилированными минифиламен-тами в актин-активируемой Hg2+-ATTaaHofl активности, которая уже в присутствии БО мМ KCl не превышает БОЯ. Таким образом, использова-

ние миозиновых минифиламентов позволило подтвердить предположение о том,' что стимулирующее действие фосфорилирования легких цепей на актин-активируемую АТРазу структурированного миозина наиболее ярко проявляется при низкой ионной силе, в отсутствие KCl, когда мини-фил вменты сохраняют свою исходную интактную структуру.

Рис. 14. Зависимость Mg2+-ATPa3-ной активности минифиламентов миозина (0,1 мкМ) с дефосфорили-рованными (1) и с фосфорилиро-ванными (2) ДТНБ-легкими цепями от концентрации Р-актина в координатах Лайнуивера-Берка.

Условия: трис-цитратный буфер (35 мМ трис, 10 мМ лимонная кислота), 4 мМ MgCl2; pH 8,Оj 25°С.

Изображение зависимости скорости актин-активируемой АТРазной реакции минифиламентов от концентрации актина в двойных обратных координатах (рис. 14) позволяет определить основные кинетические параметры реакции - максимальную скорость (VM) и кажущуюся константу диссоциации комплекса минифиламентов с Р-актином (Kd), отражающую сродство минифиламентов к Р-актину. Оказалось, что фос-форилирование ДТНБ-легких цепей оказывает очень сильное влияние на максимальную скорость реакции, увеличивая Ум в 3,5 раза, и несколько снижает сродство минифиламентов к Р-актину (значения к^ составляли 0,28 |iM и 0,21 для фосфорилированных и дефосфорили-рованных минифиламентов, соответственно) (рис. 14). Некоторое понижение сродства минифиламентов к Р-актину под действием фосфорилирования легких цепей было подтверждено и при седиментационных исследованиях: в отсутствие АТР с Р-актином соосаждалось меньше (на 10-15%) фосфорилированных минифиламентов, чем дефосфорилиро-ванных минифиламентов.

Интересно отметить, что фосфорилирование ДТНБ-легких цепей влияет на кинетические параметры актин-активируемой Mg2+-ATPa3Hoft реакции миозиновых минифиламентов совершенно иначе (точнее - прямо

противоположно), чем на соответствующие параметры реакции обычных филаментов миозина, где оно вообще не влияет на Ту и значительно увеличивает сродство миозина к актину (Pemriok, 1980; Perseohini & Stull, 1984). Такое необычное влияние фосфорилирования ДТНБ-легких цепей на кинетические параметры актин-активируемой Mg2+-ATPa3H0ft реакции миозиновых минифиламентов можно объяснить столь же необычными свойствами минифиламентов, обнаруженными при электронно-микроскопических и седиментационных исследованиях. Было показано, что в присутствии 4 мМ Mgci2 (т.е. в тех же условиях, что и при исследованиях взаимодействия минифиламентов с Р-актином) мйнифила-менты проявляют способность к самосборке В высокоупорядочешше ансамбли. Последние представляли собой пучки минифиламентов 'длиной около 0,3 мкм, собранные либо в периодические линейные структуры, похожие на миофибриллы, либо в гексагональные решетки, в узлах которых располагаются головки миозиновых молекул. Все эти ансамбли образовывались за счет взаимодействия между миозиновыми головками, расположенными на концах минифиламентов. Фосфорилирование легких цепей практически не оказывало влияния на характер самосборки, но значительно увеличивало количество образующихся ансамблей. Кроме того, нам удавалось в ряде случаев обнаружить в препаратах минифиламентов быстро седиментирующие гомогенные фракции, причем в препаратах, полученных из фосфорилированного миозина, эти фракции се-диментировали в 2-3 раза быстрее, чем в препаратах, полученных из дефосфорилированного миозина. Все это привело, нас к заключению, что в препаратах миозиновых минифиламентов имеет место взаимодействие между головками молекул миозина, принадлежащих к разным минифиламентам, и что фосфорилирование ДТНБ-легких цепей значительно усиливает это взаимодейств1Й.

В то же время в литературе имеются данные о том, что изолированные головки миозина (S1) при низкой ионной силе и pH 8,0, в присутствии ионов Mg2+ (т.е. в условиях, близких к тем, в которых мы исследовали взаимодействие миозиновых минифиламентов с .актинон и наблюдали упорядоченную самосборку минифиламентов) способиу взаимодействовать мекду собой с . образованием димеров (Morel fc Garrigoe, 1982), причем %2+-А!РРазная активность таких димеров более чем в 3 раза превышает активность мономерного S1 (Baohouohi et al., 1985). С учетом этих данных можно предложить следующее объяснение необычного влияния фосфорилирования ДТНБ-легких цепей

на кинетические параметры актин-активируемой АТРазноЙ реакции мио-зиновых минифиламентов. Значительное увеличение скорости реакции, вызываемое фосфорилированием, вполне возможно обусловлено тем, что В препаратах фэсфорилированных минифиламентов количество взаимодействующих между собой миозиновых головок значительно выше, чем в препаратах дефосфорилированных минифиламентов. Некоторое снижение сродства миозиновых минифиламентов к Р-актину-, вызываемое фосфори-лированием, обусловлено, по-видимому, тем, что взаимодействие между миозиновыми головками снижает их доступность для Р-актина.

Таким образом, своеобразное влияние фосфорилирования ДТНБ-легких цепей миозина на взаимодействие миозиновых минифиламентов с Р-актином связано, по-видимому, с характерными свойствами минифи-ламентов, обусловленными особенностями их структуры.

ВЫВОДЫ

1. Методом дифференциальной сканирующей микрокалориметрии с применением "последовательного отжига" получены прямые доказательства существования в головке миозина истинной доменной структуры. В головке выявлены 3 структурных домена (области, которые при тепловой денатурации плавятся кооперативно и независимо друг от друга). Проведена идентификация доменов, т.е. выявлено их соответствие определенным участкам первичной структуры.

2. На основании анализа экспериментальных результатов и литературных данных предложена пространственная модель доменной организации миозинсвой головки. Согласно этой модели, самый термо-лабилышй первый домен соответствует концу гоАовки; второй домен соответствует средней широкой части головки, а самый термостабильный третий домен - узкой части головки, включая "шейку" головки, несущую ассоциированную регуляторную легкую цепь (ДТНБ-легкую цепь) и соединяющую головку со стержневой частью молекулы миозина.

3. Показано, что образование комплексов изолированных миозиновых головок (субфрагмент-1 миозина, . s1 ) с АВР в присутствии аниона ванадата и с amppnp (стабильных аналогов промежуточных комплексов АТРазной реакции s1 - s1-adp-pi и Si-АТР) вызывает глобальные конформационные перестройки в молекуле s1, сопровождающиеся значительным увеличением термостабильности и полным изменением доменной структуры S1. При этом связывание adp с s1 не вызывает ъсущостЕенных изменений доменной структуры s1. Полученные данные

являются прямым подтверждением гипотезы о том, что в процессе АТРазной реакции молекула S1 может находиться в одном из двух главных конформационных состояний, одно из которых характерно для si без нуклеотида и для комплекса S1-ADP, а другое - для промежуточных КОМПЛеКСОВ S1-ATP и SI-ADP-P^.

4. Методами седиментационного анализа, быстрой кинетики, дифференциальной сканирующей калориметрии и поляризационной микро-флуориметрии проведено сравнение свойств изоформ S1, содержащих, разные щелочные легкие цепи А1 и А2. Обнаружены различия между изоформами S1 в конформационном состояшш наиболее термолабильного первого домена, которые, как предполагается, обусловлены непосредственным взаимодействием дополнительного N-концевого сегмента А1 с областью этого домена в St. Показано, что изоформы S1 различаются по характеру присоединения к Р-актину; это проявляется в различиях по светорассеянию и скорости седиментации между филаментами F-ак-тина, декорированными этими изоформами. Обнаружена способность изоформы S1(А1) индуцировать агрегацию декорированных ею актиновых филамонтов. Высказано предположение, что все наблюдаемые различия между изоформами S1 обусловлены способностью дополнительного N-концевого сегмента At вступать в разгшз взаимодействия, к которым А2 неспособна (с тяжелой цепью S1 в области первого домена, с с-гкоицевой областью актина и друг с другом).

5. Методом поляризационной микрофлуориметрии исследовано влияние связывания Са2+ с ДТНБ-легкими цепями .миозина и фосфорили-рования этих легких цепей на характер взаимодействия миозиновых головок с р-актином теневых мышечных волокон. Показано, что связывание Са2+ с ДТНБ-легкими цепями коренным образом изменяет характер конформационных перестроек, происходящих в актиновых филамен-тах при связывании с ними головок миозина; подобный оф!ект в отсутствие Са вызывает фосфорилирование ДТНБ-легких цепей миозина. Высказано предположение, что такие изменения, индуцируемые ДТНБ-легкими цепями миозина, могут играть существенную роль в молекулярном механизме мышечного сокращения.

6. Методом поляризационной микрофлуориметрии исследовано влияние фосфорилировашя ДТНБ-легких цепей миозина на конформаци-бшюе состояние молекул миозина в толстых нитях рлицеринизирован-шх мышечных волокон. Показано, что фосфорилирование ДТНБ-легких цепей влияет на ориентацию головок миозина в миозиновых филаментах

и на конформационное состояние ствола филамента, образованного стержневыми частями молекул 'миозина. Такое влияние особенно сильно проявляется в присутствии ионов Mg2+, когда головки плотно прижаты к стволу миозинового филамента. Предполагается, что в этом случае головки одной молекулы миозина в филаменте вступают в непосредственное взаимодействие со стержневой частью соседней молекулы.

7. Изучено влияние фсгсфорилирсвания ДТНБ-легких цепей миозина на свойства миозиновых минифиламентов. Показано, что такое фосфорилирование влияет на кинетические параметры актин-активируе-мой Mg2+-ATP83Hoft реакции минифиламентов совершенно иначе, чем на соответствующие параметры реакции обычных крупных миозиновых фила-ментов. Обнаружена способность миозиновых минифиламентов к самосборке за счет взаимодействий между головками разных молекул миозина на концах минифиламентов, приводящей к образованию хорошо упорядоченных ансамблей. Показано, что фосфорилирование ДТНБ-лег-ких цепей значительно усиливает такие взаимодействия между миози-новыми головкам!. Высказано предположение, что именно этим обусловлено необычное влияние фосфорилирования ДТНБ-легких цепей на кинетические параметры актин-активируемой .АТРазной реакции миозиновых минифиламентов

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Левицкий Д.И., Поглазов В.Ф. Зависимость АТФазной активности субфрагмента 1 миозина от содержания в нем ДТНБ-легких цепей и ионов %2+. - Доклады АН СССР. 1980. Т.251. № 2. С.490-493

2. Боровиков Ю.С., Левицкий Д.И., Кириллина В.П., Поглазов Б.Ф._ ДТНБ-легкая цепь управляет конформационными перестройками Ф-актина, индуцированными субфрагментом 1 миозина. - Доклады АН СССР. 1981. Т. 259. № 3. С. 732-735.

В. Borovikov Yu.S., Levitekii .D.I., Kirillina V.P., Poglazov B.P. Effect of Ca2+ binding to 5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoio aoid) light ohaine on conformational oiiangeB.of F-aotin oaueed by myosin subfragment-1. - Europ. J. Bioohem. 1982. v.125. J6 2. p.343-347.

4. Поглазов Б.Ф., Левицкий Д.И. Миозин и биологическая подвижность. Изд-во "Наука". Москва, 1982.. 160 С..

5. Левицкий Д.И., Гришин М.Н., Поглазов Б.Ф. Взаимодействие изолированных головок и хвостов миозина при соосаждении. - Тез. докл. I Всесоюзного биофизического съезда. Москва,1982. Т.2. С.27.

)

6. Levitsky D.I., Shuvalova Ъ.А., Poglazov В.P. DieBocia-tion of LCg from rabbit skeletal muscle myosin, induced by DTNB and EDTA treatments: effeot of LC^ phosphorylation. - J. Musole Res. and Cell Motility. 1984. v. 5. J6 2. p. 205.

7. Боровиков Ю.С., Левицкий Д.И. Высокая чувствительность к ионам Са2+ конформационных изменений Ф-актина, индуцируемых субфрагментом 1 миозина. - Биохимия. 1984. Т. 49. й Б. С.767-771.

8. Borovikov Yu.S., Levitsky D.I. Fluoreeoenoe polariza-

24-

tion study on Ca -sensitivity of conformational ohanges in F-ao-tin induoed by the formation of F-aotin - subiragment-1 oomplex.-J. General Physiol. Biophys. 1935. v. 4. p. 457-464.

9. Шувалова Л.А., Левицкий Д.И., Калмыков П.В., Поглазов Б.Ф. Влияние фосфорилировашя легких цепей-2 миозина из скелетных мышц кролика на агрегацию миозина в отсутствие КС1. - Тез. докл. V Всесоюзной конференции по биохимии мышц.- Тбилиси.- 1985. С. 119-120.

10. Боровиков Ю.С., Конколь П., Щченсна Д., Кириллина В.П., Левицкий Д.И. Фосфорилирование легких цепей миозина из скелетных мышц кролика влияет на характер конформационных изменений Ф-акти-на, индуцируемых тяжелым моромиозином. - Биохимия. 1986. т. 51. JS 4. С. 691-694.

11. Боровиков Ю.С., Конколь И., Левицкий Д.К. Сшивка БН-. групп в головках миозина изменяет характер конформационных перестроек Ф-актина, индуцированных субфрагментом 1 миозина или тяжелым моромиозином. - Доклады АН СССР. 1986. т.- 287. Л 1. 0.216-219.

12. Kakol I., Borovikov Yu.S., Levitsky Б.I. Design of molecular mechanism of modification of aotin-myosin interaction in skeletal musole by phosphorylation of myosin. - J. Musole Res. and Cell Motility. 1986. v. 7. № 1. p.64.

13. Подлубная 3.A., Левицкий Д.И., Шувалова Л.А., Поглазов Б.Ф. Упорядоченная самосборка миозиновых мшшфиламентов: влияние Mgs+ и фосфорилирования легких цепей миозина. - Доклада АН СССР. 1985. т. 290. И 4. о. 1015-1017.

14. Левицкий Д.И. Легкие цепи миозина и их роль в регуляции мышечного сокращения. - Успехи биологической химии. 1966.

Т. 27. С. 74-101.

15. Левицкий Д.И. Структурные особенности и функциональная роль молекул миозина. - В кн.: "Структура и функции белков сократительных систем", (под ред. Г.П.Пинаева). Изд-во "Наука". Ленинград, 1987. С. 5-31.

16. Levitsky D.I., Podlubnaya Z.A., Shuvalova L.A.,

Poglazov В.P. Unusual properties of myosin minifilaments: ordered

Belf-assembly in the ргевепое of Mg and efieot of LCj-phosphory-lation on aotin-aotivated ATPasa. - J. Musole Res. and Cell Motility. 1987. v. 8. Л 1. p. 68.

17. Podlubnaya Z.A., Levitsky D.I., Shuvalova L.A., Poglazov B.P. Ordered assemblies of myosin minifilamentB. -J. Mol. Biol. 1987. v. 196. Л 3. p. 729-732.

18. Levitsky D.I., Shuvalova L.A., Poglazov B.F.

The effeot of myosin light chain phosphorylation on the aotin-stimulated АТРаве aotivity of myoBin minifilaments. - PEBS Letters. 1987. v. 221. Ji 1 . p. 77-80.

19. Kakol I., Borovikov Yu.S., Szozesna D., Xirillina Y.P., Levitsky D.I. Conformational ohanges of P-aotin in myosin-free ghost single fibre induced by either phosphorylated or dephospho-rylated heavy meromyosin. - Bioohim. et biophys. aota. 1987.

v. 913. h 1. p. 1-9.

20. Левицкий Д.И., Шувалова Л.А., Калмыков П.В., Поглазов Б.Ф. Влияние фосфоршшрсвания легких цепей миозина на взаимодействие миозиновых минифиламэнтов с Ф-актином. - Биохимия.. 1987. т. 52.

Л 5. С. 813-824.

21. Боровиков Ю.С., Левицкий Д.И., Шувалова Л.А., Лебедева Н.Н., Поглазов Б.Ф. Изменения структурного состояния миозиновых нитей в глицершшзированных волокнах скелетных мышц кролика, индуцируемые фосфорилированием легких цепей миозина. - Биохимия. 1987. -т.52. 12. С. 2061-2065.

22. Borovikov Yu.S., Levitsky D.I. The effeot of myosin

light chain phosphorylation and Mg on the conformation of myosin in thiok filaments of glycerinated fibers of rabbit skeletal muscle. - Europ. J. Bioohem. 1989. v. 183. J6 1 . p. 83-88.

23. Levitsky D.I., Shnyrov V.I., Nikolaeva O.P., Goliteina N.b., Vedenkina U.S., Khvorov N.V., Permyakov E.'A. Domain organi-. Eation of iBofonns of the myosin Bubfragment-1. - Internet. Symposium "Moleoular organization of biologioal Btruotures" (Moboow, 1989). Abetraots. Мовоои, 1989. Part 2. p. 196.

24. Khvorov N.V., Lsviteky D.I.., Kalmykov P.Y., Poglazov B.P. The unusual aggregation of myoein eubfragment 1 induoed by • eeleotive denaturation of 50-kDa segment in its heavy chain. -Intern. Symposium "Moleoular organization of biologioal structures" (Moboow, 1989). Abet. Moboow, 1989. Part 2. p. 195.

25. Шннров В.Л., Левицкий Д.И., Веденкина H.C., Николаева О.П., Хворов Н.В., Пермяков Е.А., Поглазов Б.Ф, Доменная структура субфрагмента 1 миозина. - Доклада АН СССР. 1989. т.'304. й 6.

о. 1497-1499.

26. Lovitsky D.I.-, Khvorov N.Y., Shnyrov V.L., Yedenkina N.S., Permyakov E.A., Poglazov B.P.' Domain Btruoture of myoein Bubiragment-1. Seleotive denaturation of the 50 kDa segment, -■PEBS Letters. 1990. v. 264. A 2. p. 176-178.

27. Левицкий Д.Mi, Боровиков Ю.С., Николаева О.П., Голицына' Н.Л., Поглазов Б.Ф. Влияние щелочных легких, цепей миозина на взаимодействие субфрагмента 1 миозина с актином в раотворе и в теневом мышечном волокне. - Биохимия. 1990. т.55. JS 9.

С. 1690-1699. -

28. Хворов Н.В., Левицкий Д.И., Букатина А.Е., Шныров В.Л., Поглазов Б.Ф. Калориметрические доказательства двух конформацион-ных состояний комплекса суСфр8Гмента-1 миозина с нуклеотидами. -Доклады АН СССР. 1990. т. 315. * 3. С. 745-748.

. 29. Leviteky D.I., Khvorov НУ. , Shnyrov V.L., Bukatina A.E., Vedenkina U.S., Permyakov E.A., Poglazov B.P. Nucleotide induoed • changes in domain struoture of myosin eubfragment 1. - In: "Musole and Motility" ( G.Mareohal, U.Carraro, Eds.). Interoept Ltd. j Andover, 1990. ,p. 311-315.

30. ■ Левицкий Д.И., Голицына Н.Л., Николаева О.П., Боровиков Ю.С. Взаимодействие изоформ субфрагмента-) миозина, содержащих флуоресцентно меченые щелочные легкие цепи, с актином мышечных Волокон. - Биохимия. 1991. т.'56.. * 2. С. 374-382.

Информация о работе

Левицкий, Дмитрий Иванович
доктора биологических наук
Москва, 1991
ВАК 03.00.04

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Структура головки миозина и функции его легких цепей ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Структура головки миозина и функции его легких цепей"

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структура головки миозина и функции его легких цепей
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия